WO2014136814A1 - 新規ｃｔｌエピトープ５連結ペプチド - Google Patents

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智史 深谷
年弘 長田
浩志 和田
照洋 宇津木
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    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide useful as a cancer antigen peptide. More specifically, the present invention relates to a novel cancer antigen peptide obtained by linking five peptides having HLA-A-restricted CTL-inducing ability, and a pharmaceutical composition using the same.
  • Cancer is the leading cause of death among Japanese people, and about 350,000 people die annually, and is still a serious disease.
  • Established cancer treatments mainly include surgical resection, anticancer drug treatment, and radiation therapy.
  • therapies have problems such as recurrence, reduced quality of life (QOL), and lack of treatment options for advanced cancers that cannot be treated as described above.
  • Cancer immunotherapy has long been awaited as a new treatment, and clinical research on cancer peptide vaccines began around the world in 1990 when epitope peptides in human tumor antigens became identifiable. It was. However, according to the analysis results of clinical research results with peptide alone administration or combination therapy, the response rate is only 2.7% (1,000 non-patent documents 1) among 1,000 or more administration cases, and it is pointed out that it is difficult to put it to practical use. ing.
  • cancer peptide vaccine therapy cellular immunity by epitope-specific cytotoxic T lymphocytes (hereinafter abbreviated as CTL), which are considered to be the main effector cells, is HLA-restricted.
  • CTL epitope-specific cytotoxic T lymphocytes
  • cancer peptide vaccines have been developed only for patients with HLA-A2 or HLA-A24, which have a large number of patients.
  • Non-Patent Document In cancer peptide vaccine therapy, it is known that in addition to the activation of CTL, which is cellular immunity, the production of immunoglobulin, which is humoral immunity, is induced, thereby contributing to a life-prolonging effect (Non-Patent Document). 6).
  • the present invention provides a cancer antigen peptide that can be administered to a wide range of cancer patients as a cancer peptide vaccine without requiring an HLA type test and without being limited to patients having a specific HLA type.
  • the purpose is to provide.
  • CTL induction is restricted to any of the HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26, or HLA-A3 supertypes, or a plurality of the above HLA-A restrictions.
  • a CTL epitope 5-linked peptide obtained by linking 5 peptides selected from CTL epitope peptides reported to have an ability via a linker, without requiring an HLA type test and a specific peptide CTLs and immunoglobulins specific to the CTL epitope peptide constituting the peptide can be administered to a wide range of cancer patients without being limited to patients with HLA type, and further by administering the CTL epitope 5-linked peptide Has been found to be strongly induced, and the present invention has been completed.
  • the present invention has the following features.
  • CTL epitope peptides peptide represented by SEQ ID NO: 1 (PEP1), peptide represented by SEQ ID NO: 2 (PEP2), peptide represented by SEQ ID NO: 3 (PEP3), represented by SEQ ID NO: 4 Peptide (PEP4), peptide represented by SEQ ID NO: 5 (PEP5), peptide represented by SEQ ID NO: 6 (PEP6), and peptide represented by SEQ ID NO: 7 (PEP7),
  • An epitope 5 linking peptide wherein five peptides, which may be selected in duplicate from the group consisting of:
  • the above epitope 5-linked peptide having one or more characteristics selected from the following (1) to (12): (1) includes a sequence in which PEP5 and PEP2 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (2) includes a sequence in which PEP2 and PEP4 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (3) includes a sequence in which PEP4
  • PEP5 and PEP2, PEP6 and PEP5, or PEP4 and PEP6 contain sequences adjacent to each other via a linker at the N-terminal in order from the N-terminal side, and / or PEP7 at the C-terminal in order from the N-terminal side
  • Epitope 5 linking peptide according to [1] comprising a sequence in which PEP3 and PEP3, PEP4 and PEP3, PEP6 and PEP3, PEP1 and PEP3, PEP5 and PEP2, PEP4 and PEP2, or PEP5 and PEP3 are adjacent via a linker.
  • [3] Epitope 5 linking peptide of [2] comprising a sequence selected from the following (a) to (p): (a) PEP5-PEP2-PEP4-PEP7-PEP3; (b) PEP5-PEP2-PEP7-PEP3-PEP4; (c) PEP4-PEP6-PEP5-PEP7-PEP3; (d) PEP5-PEP2-PEP4-PEP6-PEP3; (e) PEP5-PEP2-PEP4-PEP1-PEP3; (f) PEP4-PEP5-PEP2-PEP7-PEP3; (g) PEP7-PEP3-PEP4-PEP5-PEP2; (h) PEP5-PEP7-PEP3-PEP4-PEP2; (i) PEP6-PEP1-PEP4-PEP5-PEP2; (j) PEP6-PEP5-PEP1-PEP4-PE
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising the epitope 5-linked peptide of any one of [1] to [5] or the CTL of [6] as an active ingredient.
  • a method for treating cancer comprising administering the epitope 5-linked peptide according to any one of [1] to [5] or the CTL of [6] to a cancer patient.
  • a method for immunizing a subject against cancer comprising administering to the subject the epitope 5-linked peptide of any one of [1] to [5] or the CTL of [6].
  • a cancer antigen that can be administered to a wide range of cancer patients as a cancer peptide vaccine without requiring an HLA type test and without being limited to patients having a specific HLA type.
  • Peptides can be provided.
  • the CTL epitope 5-linked peptide of the present invention can be used for a wide range of cancer patients without requiring an HLA type test, such as HLA-A2 positive patient group, HLA-A24 positive patient group, HLA-A26 positive patient group, HLA-A3 super It can be administered to a group of type-positive patients and can treat and / or prevent cancer or a disease caused thereby in the patient.
  • the tumor antigen constituting the CTL epitope 5-linked peptide of the present invention is recognized in a plurality of cancer types, the CTL epitope 5-linked peptide of the present invention treats or prevents various cancer types.
  • administration of the epitope 5-linked peptide of the present invention can strongly induce CTL epitope peptide-specific CTLs and immunoglobulins compared to the case where mixed CTL epitope peptides are administered in equal amounts. Yes, and can activate anti-tumor immunity more efficiently.
  • FIG. 1 shows the results of induction of epitope-specific CTL in a mouse model administered with an epitope 5 linking peptide (*: indicates not yet examined).
  • FIG. 2 shows the measurement results of serum epitope-specific IgG antibody titer in a mouse model administered with an epitope 5-linked peptide.
  • Epitope 5 Linking Peptide The “epitope 5 linking peptide” of the present invention is obtained by linking five peptides selected from CTL epitope peptides derived from the same and / or different tumor antigen molecules in a linear manner via a linker and one molecule. Means the peptide.
  • a “CTL epitope peptide derived from a tumor antigen molecule” is a peptide produced when a tumor antigen is decomposed in a tumor cell, and is bound to an HLA class I molecule and presented on the cell surface. And / or can induce and / or activate tumor-specific CTLs. “Inducing tumor-specific CTL” means to differentiate and / or proliferate a CTL that specifically recognizes a CTL epitope peptide derived from a tumor antigen molecule in vitro or in vivo. “Activating tumor-specific CTL” means that CTL recognizes an antigen presented by an HLA class I molecule to produce interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ).
  • CTL epitope peptide derived from a tumor antigen molecule may be simply referred to as “CTL epitope peptide”.
  • a known CTL epitope peptide can be used, and includes the following: PEP1: KLVERLGAA (SEQ ID NO: 1 [WO 0l / Ol1044]); PEP2: ASLDSDPWV (SEQ ID NO: 2 [WO 02/010369]); PEP3: LLQAEAPRL (SEQ ID NO: 3 [WO 00/12701]); PEP4: DYSARWNEI (SEQ ID NO: 4 [Japanese Patent Laid-Open No.
  • PEP5 VYDYNCHVDL (SEQ ID NO: 5 [WO 00/12701]); PEP6: LYAWEPSFL (SEQ ID NO: 6 [Japanese Patent Laid-Open No. 2003-000270]); PEP7: QIRPIFSNR (SEQ ID NO: 7 [Cancer lmmunol. Lmmunother. 2007, 56 (5), 689-698]).
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 1 is represented by “PEP1”
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 2 is “PEP2”
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 3 is represented by “PEP3”
  • SEQ ID NO: 4 The peptide represented by SEQ ID NO: 5 is called “PEP5”
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 6 is called “PEP6”
  • the peptide represented by SEQ ID NO: 7 is called “PEP7”. is there.
  • each amino acid sequence of PEP1, PEP2, PEP3, PEP4, PEP5, PEP6, and PEP7 has an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, inserted, deleted, and / or added,
  • a peptide having a CTL inducing ability and an immunoglobulin production inducing ability equivalent to or higher than those of the original peptide can also be used as the “CTL epitope peptide”.
  • “plurality” means 1 to 3, preferably 1 to 2.
  • Such peptides include, for example, peptides substituted with an amino acid having properties similar to the original amino acid (ie, obtained by conservative amino acid substitution).
  • PEP1, PEP2, PEP3, PEP4, and PEP5 are HLA-A2, PEP2, PEP4, PEP5, and PEP6 are HLA-A24, PEP2, PEP4, PEP5, and PEP7 are HLA-A3 supertypes, and , PEP2 and PEP5 are respectively restricted to HLA-A26 and can induce and / or activate CTL.
  • the genes encoding these CTL epitope peptides have been confirmed to be expressed in multiple cancer types (Yang D et al., Cancer Res. 1999, 59: 4056-63, Harashima N et al., Eur J. Immunol. 2001, 31 (2), 323-32).
  • the five peptides selected from PEP1, PEP2, PEP3, PEP4, PEP5, PEP6, and PEP7 are each linked in a linear manner via a linker.
  • the linker may be any linker that can be cleaved when the epitope 5-linked peptide is administered to a living body and allows the linked CTL epitope peptides to be separated individually.
  • an ester bond, an ether bond, an amide examples include a bond, a sugar chain linker, a polyethylene glycol linker, and an amino acid linker.
  • amino acid linkers include arginine dimer, lysine dimer, glycine dimer, glycine pentamer, glycine hexamer, alanine-alanine-tyrosine (AAY), isoleucine-leucine-alanine (ILA), arginine-valine-lysine -Arginine (RVKR) etc. are illustrated, Preferably it is an arginine dimer.
  • the selected CTL epitope peptides, and the order of their ligation, were administered to human HLA-A transgenic mice with epitope 5 ligated peptides synthesized in a given combination and given ligation order, and each CTL epitope peptide specific in vivo The presence or absence of CTL induction can be evaluated and determined.
  • the epitope 5-linked peptide of the present invention has one or more characteristics selected from the following (1) to (12): (1) includes a sequence in which PEP5 and PEP2 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (2) includes a sequence in which PEP2 and PEP4 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (3) includes a sequence in which PEP4 and PEP6 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (4) includes a sequence in which PEP6 and PEP3 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (5) includes a sequence in which PEP4 and PEP1 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (6) includes a sequence in which PEP1 and PEP3 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (7) includes a sequence in which PEP4 and PEP2 are adjacent in order from the N-terminal side through a linker; (8) includes
  • the epitope 5 linking peptide of the present invention is (I) In order from the N-terminal side to the N-terminal, PEP5 and PEP2, PEP6 and PEP5, or PEP4 and PEP6, Includes sequences that are adjacent via a linker, and / or (II) In order from the N-terminal side to the C-terminal, PEP7 and PEP3; PEP4 and PEP3; PEP6 and PEP3; PEP1 and PEP3; PEP5 and PEP2; PEP4 and PEP2; or PEP5 and PEP3 Contains adjacent sequences via a linker.
  • the epitope 5-linked peptide of the present invention comprises or consists of a sequence selected from the following (a) to (p) (wherein “-” represents a linker): (a) PEP5-PEP2-PEP4-PEP7-PEP3; (b) PEP5-PEP2-PEP7-PEP3-PEP4; (c) PEP4-PEP6-PEP5-PEP7-PEP3; (d) PEP5-PEP2-PEP4-PEP6-PEP3; (e) PEP5-PEP2-PEP4-PEP1-PEP3; (f) PEP4-PEP5-PEP2-PEP7-PEP3; (g) PEP7-PEP3-PEP4-PEP5-PEP2; (h) PEP5-PEP7-PEP3-PEP4-PEP2; (i) PEP6-PEP1-PEP4-PEP5-PEP2; (j) P
  • the epitope 5 linking peptide of the present invention is preferably 2 types, more preferably 3 types, more preferably 4 types, and most preferably 5 types of CTL epitope peptides among the 5 types of linked CTL epitope peptides.
  • CTLs specific for CTL epitope peptides can be induced and / or activated, and immunoglobulin production specific for each CTL epitope peptide can be induced.
  • immunoglobulin means IgG, IgM, IgA, IgD.
  • the epitope 5 linked peptide of the present invention can be produced by a conventional liquid phase synthesis method, a peptide synthesis method such as a solid phase synthesis method, a peptide synthesis by an automatic peptide synthesizer, etc.
  • a peptide synthesis method such as a solid phase synthesis method
  • a peptide synthesis by an automatic peptide synthesizer etc.
  • amino acids are prepared in which functional groups other than the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group to be bound are protected for each amino acid, and between the ⁇ -amino group and ⁇ -carboxyl group of each amino acid are prepared.
  • the peptide bond formation reaction is performed in Usually, the carboxyl group of the amino acid residue located at the C-terminus of the peptide is bound to the solid phase via an appropriate spacer or linker.
  • the amino-terminal protecting group of the dipeptide obtained above is selectively removed to form a peptide bond with the ⁇ -carboxyl group of the next amino acid. Such operations are continuously performed to produce a peptide having a side group protected, and finally, all the protecting groups are removed and separated from the solid phase.
  • the details of the types of protecting groups, the protecting method, and the peptide bonding method are described in detail in the above-mentioned documents.
  • the peptide may be produced by a gene recombination method using a nucleic acid encoding the epitope 5-linked peptide of the present invention, a phage display method, or the like.
  • DNA encoding the epitope 5-linked peptide of the present invention is inserted into an appropriate expression vector, the vector is introduced into an appropriate host cell, the cell is cultured, and the cell is cultured from inside or outside the cell. Recovering the peptide of interest.
  • the vector is not limited, but is a vector such as a plasmid, a phage, a cosmid, a phagemid, or a virus.
  • Host cells for introducing the vector are bacteria such as E. coli and Bacillus subtilis, yeast cells, insect cells, animal cells (for example, mammalian cells), plant cells, and the like.
  • Transformation or transfection into these cells Includes, for example, calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, particle gun method, PEG method and the like.
  • the method for culturing the transformed cells is carried out according to the usual method used for culturing host organisms.
  • DNA encoding a peptide sequence that allows secretion of the peptide from the cell is bound to the 5 ′ end of the DNA encoding the target peptide.
  • the target peptide accumulated in the cells can be recovered. In this case, the cells are physically or chemically destroyed, and the target peptide is recovered using protein purification techniques.
  • the produced peptide can be obtained by a conventional method, for example, gel filtration chromatography, ion exchange column chromatography, affinity chromatography, reverse phase column chromatography, HPLC chromatography, ammonium sulfate fractionation, ultrafiltration, immunoadsorption method. It is possible to recover or purify by, for example.
  • Cytotoxic T lymphocytes Using the epitope 5-linked peptides of the present invention, CTLs specific for CTL epitope peptides and damaging cancer cells can be obtained in vitro.
  • In vitro methods for inducing CTL using a CTL epitope peptide are known (for example, JP-A-2006-14637), and these techniques can also be used in the present invention.
  • dendritic cells DC are induced by culturing plate-adhered cells in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy individuals or cancer patients in the presence of cytokines such as GM-CSF and IL-4. .
  • Antigen-presenting cells are prepared by pulsing the dendritic cells with the epitope 5-linked peptide of the present invention, followed by X-ray irradiation.
  • the peripheral blood mononuclear (PBMC) derived from a healthy person or the same cancer patient may be pulsed with the epitope 5-linked peptide of the present invention and then irradiated with X-rays.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • IL-4 IL Culture in the presence of cytokines such as -7.
  • antigen-presenting cells obtained by pulsing the epitope 5-linked peptide of the present invention as described above are added and restimulated, and further cultured in the presence of cytokines such as IL-2.
  • any medium that can survive T lymphocytes may be used.
  • RHAM ⁇ medium Kawai, K., Sasaki, T., Saijo-Kurita, K., Akaza, H., Koiso, K., and Ohno, T., Cancer Immunol. Immunother. 35, 225-229, 1992 LAK medium
  • AIMV medium GIBCO BRL, Life Technologies, INC.
  • RPMI1640 medium with various cytokines such as IL-2 and fetal calf serum (FCS) Can do.
  • Culture conditions may follow conditions well known to those skilled in the art.
  • the culture temperature is 33 ° C. to 41 ° C., preferably 37 ° C.
  • An inert gas containing air or an appropriate concentration of oxygen and an appropriate concentration of carbon dioxide gas (for example, 5% CO 2 ) for maintaining the pH of the medium at about 7.4 can be used as the gas phase.
  • the culture is preferably performed for 4 to 10 days, more preferably 7 days.
  • CTLs induced by such culture are preferably two, more preferably three, more preferably four, most preferably About 5 types of CTL epitope peptides, CTL specific to each CTL epitope peptide is included, and cancer cells can be specifically damaged.
  • compositions The epitope 5-linked peptide of the present invention can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition used for cancer immunotherapy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more of the above epitope 5-linked peptides as active ingredients. By including multiple types of epitope 5-linked peptides, a higher effect can be obtained.
  • the gene encoding PEP1, PEP2, PEP3, PEP4, PEP5, PEP6, and PEP7 contained in the epitope 5-linked peptide of the present invention is recognized in a plurality of solid cancers and blood cancers.
  • solid cancer include brain tumor, lung cancer, breast cancer, thyroid cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, esophageal cancer, stomach cancer, GIST, pancreatic cancer, colon cancer, and rectum.
  • Cancer anal cancer, kidney cancer, liver cancer, biliary tract cancer, head and neck cancer, bladder cancer, prostate cancer, malignant melanoma, skin cancer, tongue cancer, osteosarcoma, chondrosarcoma, fiber
  • examples include sarcoma, liposarcoma, angiosarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma.
  • examples of hematological cancers include leukemia, malignant lymphoma, myeloma and the like. Therefore, the epitope 5-linked peptide of the present invention is useful for the treatment or prevention of these cancers.
  • “treatment or prevention of cancer” means prevention of cancer occurrence / recurrence, suppression of cancer progression / aggravation, and improvement of cancer pathology.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can contain various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutically acceptable pharmaceutical materials.
  • Usable pharmaceutical carriers include stabilizers, bactericides, buffers, isotonic agents, chelating agents, pH adjusters, surfactants, fillers, extenders that are commonly used depending on the dosage form of the preparation.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an adjuvant known to be used for vaccine administration.
  • Adjuvants include bacterial preparations such as Complete Freund's adjuvant (CFA), Incomplete Freund's adjuvant (IFA), alum, Lipid A, monophosphoryl lipid A, BCG (Bacillus-Calmette-Guerrin), and bacterial component preparations such as tuberculin, keyholes Examples include natural high molecular substances such as limpet hemocyanin and yeast mannan, muramyl tripeptide, muramyl dipeptide or derivatives thereof, alum, nonionic block copolymer, and the like. Can be used in combination.
  • Adjuvants may be used in admixture with the pharmaceutical composition of the present invention, or simultaneously administered as an emulsion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a known tumor antigen molecule-derived CTL epitope peptide or a peptide comprising the same, or a peptide linking them (hereinafter referred to as “known tumor antigen molecule”). Or a combination of one or more of them.
  • CTL epitope peptides derived from known tumor antigen molecules include WT-1 p126-134, modified (M236Y) WT-1 p235-243, NY-ESO-1 p157-165, modified (T210M) gp100 p209-217, survivin-2B p80-88, Her-2 / neu p63-71, VEGFR2 p169-177, MART-1 p26-35, Glypican-3 p298-306, SPARC p143-151, etc. It is not a thing.
  • the epitope 5-linked peptide of the present invention and a known tumor antigen molecule-derived CTL epitope peptide or the like may be in a single-drug formulation, or a formulation comprising the epitope 5-linked peptide of the present invention as an active ingredient,
  • the preparation containing a known tumor antigen molecule-derived CTL epitope peptide or the like as an active ingredient may be in a separate preparation form.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be selected in the form of preparation according to the administration form.
  • Typical preparation forms include solutions, emulsions, liposome preparations, fat emulsions, inclusion bodies such as cyclodextrins, suspensions, ointments, creams, transdermal absorption agents, transmucosal absorption agents, tablets, rounds Preparation of capsules, capsules, powders, powders, granules, fine granules, syrups and the like are possible, but not limited thereto. These are further classified into oral preparations, parenteral preparations, nasal preparations, vaginal preparations, suppositories, sublingual preparations, inhalants, eye drops, ear drops, etc. according to the route of administration. It can be molded or prepared. In addition to being able to be used as a solution formulation, it can be lyophilized and stored, and after use, dissolved in a buffer solution containing water or saline, etc. It is also possible.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain CTL induced in vitro using the epitope 5-linked peptide of the present invention as an active ingredient.
  • Such a pharmaceutical composition is preferably in the form of a parenteral agent.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a wide range of cancer patients, for example, HLA type positive patient groups selected from the group consisting of HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26 and HLA-A3 supertypes. It is possible, and treatment can be started without requiring an HLA type test before the start of treatment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises two or more, preferably three or more, more preferably four or more, more preferably 5 constituting an epitope 5-linked peptide contained as an active ingredient.
  • CTL specific for a CTL epitope peptide of a species can be induced and / or activated, and immunoglobulin production specific for the CTL epitope peptide can be induced.
  • Induction of immunoglobulin production by administration of epitope 5-linked peptide contained as an active ingredient is the production of immunoglobulin observed when CTL epitope peptides contained in epitope 5-linked peptide are administered individually without being linked. Remarkably higher than induction, therefore, the epitope 5-linked peptide in the present invention can efficiently treat or prevent cancer in cancer patients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises oral administration, intravenous administration, arterial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, sublingual administration, intraperitoneal administration, rectal administration, transdermal administration, transmucosal administration, nasal administration Administration can be by administration, vaginal administration, ophthalmic administration, aspiration administration, and the like.
  • each pharmaceutical composition is the same or different. Can be administered simultaneously or non-simultaneously.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be adjusted as appropriate according to factors such as the condition / severity of the cancer to be treated, the age, weight, etc. of each individual patient.
  • a pharmaceutical composition comprising 0.000 lmg to 1000 mg, preferably O.00 lmg to 100 mg, more preferably O.01 mg to 50 mg, which can be administered once every several days, weeks or months preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains CTL induced in vitro using the epitope 5-linked peptide of the present invention as an active ingredient, 2 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 8 per kg body weight per day Is preferably administered at intervals of 1 to 2 weeks.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also be administered to cancer patients in combination with pharmaceuticals generally used for cancer chemotherapy.
  • alkylating agents such as cyclophosphamide, temozolomide, bendamustine, tegafur / uracil combination agent, tegafur / gimeracil / oteracil potassium combination agent, antimetabolite such as methotrexate, gemcitabine, platinum preparation such as cisplatin, oxaliplatin, Plant alkaloid preparations such as irinotecan, eribulin, paclitaxel, docetaxel, vincristine, anticancer antibiotics such as doxorubicin, bleomycin, actinomycin D, imatinib, sunitinib, gefitinib, sorafenib, everolimus, trastuzumab, bevacizumab, bevacizumab, bevacizumab, bevacizumab Molecular target therapeutic agents such
  • Example 1 Synthesis and Purification of Peptides CTL epitope peptides and epitope 5-linked peptides were synthesized by a solid phase synthesis method (Fmoc method) using a commercially available peptide synthesizer Prelude (Protein Technologies, Inc.). The obtained various synthetic peptides were purified by YMC-Pack Pro C18 column (YMC Co., Ltd.) and HPLC system (Gilson), freeze-dried and stored in a cool and dark place, and used for the examples shown below. did.
  • the amino acid sequence of the synthesized CTL epitope peptide is shown in Table 1, and the amino acid sequence of the epitope 5-linked peptide is shown in Table 2.
  • WT1 (SEQ ID NO: 8) was synthesized as a control peptide that binds to HLA-A2
  • Her2 (SEQ ID NO: 9) was synthesized as a control peptide that binds to HLA-A24.
  • Example 2 Induction of Epitope Peptide-Specific CTL in Mouse Model and Detection of CTL by ELISPOT Method
  • Epitope 5-linked peptide is prepared at 2 mg / mL to 4 mg / mL in Otsuka distilled water (Otsuka Pharmaceutical Factory), and B Braun Injekt syringe Filled. After filling an equal amount of Incomplete Freund's adjuvant (IFA) into another syringe, both syringes were connected with a GP syringe connector, and an epitope 5 linked peptide solution and IFA were mixed well to prepare an emulsion.
  • IFA Incomplete Freund's adjuvant
  • HLA-A2.1 transgenic, HLA-A24 transgenic (Taconic) was administered twice a total of 100 ⁇ L once a week around the ridge of a mouse.
  • HLA-A2.1 transgenic, HLA-A24 transgenic (Taconic) was administered twice a total of 100 ⁇ L once a week around the ridge of a mouse.
  • inguinal lymph nodes were collected from the mice.
  • lymph node cell suspension at 5 ⁇ 10 6 cells / mL with Complete Medium (RPMI-1640, 10% heat-inactivated FBS, 100 U / mL Penicillin, 100 ⁇ g / mL Streptomycin, 50 ⁇ M 2-Mercaptoethanol) CTL epitope peptide (final concentration 10 ⁇ g / mL), recombinant mouse IL-15 (final concentration 100 ng / mL), recombinant mouse IL-21 (final concentration 100 ng / mL) were added, and seeded on a 24-well plate at 1 mL / well. The cells were cultured for 8 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • the cells were collected and seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well on an anti-IFN- ⁇ antibody-immobilized plate attached to Murine IFN- ⁇ ELISpot Kit (GEN-PROBE). Subsequently, spleen cells prepared from syngeneic mouse spleen and irradiated with 30 Gy X-rays were seeded as antigen-presenting cells in the same well at 1 ⁇ 10 5 cells / well, and then the target CTL epitope peptide or negative control peptide (final concentration 10 ⁇ g / mL), and incubated overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator. The next day, IFN- ⁇ producing cell spots were colored according to the package insert.
  • the number of IFN- ⁇ producing cell spots was quantified with an ELISPOT analyzer (Immunospot S6, Cellular Technology Ltd.). Induction of CTL epitope peptide-specific CTL, the number of IFN- ⁇ producing cell spots in the target CTL epitope peptide added well obtained by the test was significantly higher than that in the negative control peptide added well (Student's t-test, p ⁇ 0.05), it was judged as positive. Note that WT1 or Her2 was used as the negative control peptide.
  • ⁇ average number of IFN- ⁇ producing cell spots in target CTL epitope peptide added well
  • ⁇ average number of IFN- ⁇ producing cell spots in negative control peptide added well
  • ⁇ 10 ⁇ ⁇ ⁇ 100 is represented as positive
  • 100 ⁇ ⁇ ⁇ 200 is represented as medium positive
  • 200 ⁇ ⁇ is represented as strong positive.
  • Fig. 1 shows the results of examination of CTL induction specific to CTL epitope peptide.
  • 5 ligations with a ligation sequence such as TPV18 did not show two or more types of CTL induction.
  • Example 3 Preparation of CTL Epitope Peptide Immobilized Beads Peptides were immobilized on xMAP Multi-Analyte COOH Microspheres (Luminex corporation, hereinafter referred to as beads) by the following procedure. After washing the beads with MES buffer (0.1 M MES-NaOH, pH 7.0), the supernatant was removed by centrifugation. After repeating this twice, the beads were suspended in 75 ⁇ L of MES buffer.
  • MES buffer 0.1 M MES-NaOH, pH 7.0
  • Example 4 CTL Epitope Specific IgG Antibody Titer Measurement
  • Epitope 5-linked peptide of the present invention was prepared at 2 mg / mL with Otsuka distilled water (Otsuka Pharmaceutical Factory) and filled into a B Braun Injekt syringe. After filling another syringe with an equal amount of IFA, both syringes were connected with a GP syringe connector, and the epitope 5 linked peptide solution and IFA were mixed well to prepare an emulsion. This was administered to CBF1 mice (C57BL / 6 ⁇ Balb / c F1) around the ridge part 100 ⁇ L once a week for a total of 3 times.
  • CBF1 mice C57BL / 6 ⁇ Balb / c F1
  • the CTL epitope peptide-immobilized beads diluted with immunoblock were dispensed into a 96-well filter plate, washed with wash buffer, and then mouse serum sample diluted 200-fold with immunoblock was added at 100 ⁇ L / well. The plate was incubated for 90 minutes with stirring at 600 rpm in a 30 ° C. incubator. After washing 3 times with wash buffer, 100 ⁇ L / well of biotinylated-anti-mouse IgG IgG (H + L) (Vector Laboratories) diluted 500 times with immunoblock was added and incubated for 60 minutes at 30 ° C. and 600 rpm stirring conditions.
  • CTL epitope-specific IgG antibody titer measurement results are as shown in FIG.
  • a negative control group (hereinafter referred to as “hereinafter referred to as a negative control group”) prepared by preparing an emulsion in which an equal amount of IFA and Otsuka distilled water (Otsuka Pharmaceutical Factory) was mixed and administered to mice on the same schedule as the CTL epitope peptide mixture and epitope 5-linked peptide This shows how many times the production of the IgG antibody was induced as compared to the serum CTL epitope-specific IgG antibody titer measurement result (abbreviated as IFA group).
  • the CTL epitope-specific IgG antibody production induction was not observed in the mixture administration group compared to the IFA group.
  • an epitope 5-linked peptide when administered, strong CTL epitope-specific IgG antibody production induction is observed at a high frequency, and the IgG production amount is several tens to one hundred times or more depending on the administered epitope 5-linked peptide. , Turned out to be significantly induced.
  • the 5 ligation of the ligation order such as TPV17, multiple CTL epitope-specific IgG antibody production induction was not observed.
  • the present invention can provide an excellent life prolonging effect as compared with cancer peptide vaccine therapy composed of known CTL epitope peptides and mixtures thereof. Therefore, the epitope 5-linked peptide of the present invention can improve the therapeutic results as compared to cancer peptide vaccine therapy composed of known CTL epitope peptides and mixtures thereof, and can be used for the treatment of cancer or diseases resulting therefrom. It can be suitably used as a therapeutic and / or prophylactic agent and cancer peptide vaccine.

Abstract

　HLA型検査を必要とすることなく、かつ特定のHLA型を有する患者に限定されることなく、がんペプチドワクチンとして幅広いがん患者に投与することが可能ながん抗原ペプチドの提供。　CTL誘導能を有することが報告されている、腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチド群より選択された５つのCTLエピトープペプチドをリンカーを介して連結して得られたCTLエピトープ5連結ペプチド。

Description

新規ＣＴＬエピトープ５連結ペプチド
　本発明は、がん抗原ペプチドとして有用な新規ペプチドに関する。より詳細には、本発明はHLA-A拘束性にCTL誘導能を有するペプチドを５つ連結してなる新規がん抗原ペプチド、及びそれを利用した医薬組成物に関する。
　がんは日本人の死亡原因の第1位を占め年間約35万人が死亡しており、今なお重篤な疾患である。確立されているがん治療法としては主に外科的切除、抗がん剤治療、および放射線療法がある。しかしながら、かかる療法には再発、クオリティ・オブ・ライフ（QOL）の低下、さらには先に述べた治療法が受けられない進行がんである場合の治療選択肢が無い等の問題がある。
　がん免疫療法(がんワクチン療法)は長い間新たな治療法として待望されており、ヒト腫瘍抗原におけるエピトープペプチドが同定可能になった1990年からがんペプチドワクチン臨床研究が世界中で開始された。しかし、ペプチド単独投与もしくは併用療法での臨床研究成果の解析結果によると、1,000例以上の投与例のうち、奏効率僅か2.7％(非特許文献１)であり、実用化の難しさが指摘されている。
　一方、日本においても長きにわたり独自のがんペプチドワクチンを用いた臨床研究が継続的に行われ、徐々にその成果が明らかにされてきた。近年では、治療成績向上を目指す工夫のひとつとして、１種のがんペプチドを投与するのではなく、複数種のがんペプチドを投与する戦略もとられ始めている。例えば、患者のHLAタイプおよび特異的免疫応答をあらかじめ検査することにより、投与するペプチドを複数種選択するテーラーメイド型のがんペプチドワクチン療法が実施されており、安全性および抗腫瘍効果が確認されている。具体的にはテーラーメイド型ペプチドワクチン単独投与や抗がん剤との併用により脳腫瘍、子宮頸がん、更には前立腺がん、すい臓がんにおいて優れた臨床効果並びに安全性が達成されている(非特許文献２、３、４)。
　がんペプチドワクチン療法において、主要なエフェクター細胞と考えられているエピトープ特異的細胞傷害性Tリンパ球（以下、CTLと略称する）による細胞性免疫はHLA拘束性であり、特定のHLA型、具体的には対象患者数の多いHLA-A2またはHLA-A24を有する患者のみを対象としたがんペプチドワクチン開発が実施されてきた。
　しかしながらこれら2種のHLA型保有割合は日本人においてそれぞれ約40％、60％(非特許文献５)であり、これら2種以外のHLA型を有する患者はがんペプチドワクチンの恩恵を受けることができない問題点がある。さらには治療開始前にHLA型検査を要すことが、治療の開始時期を遅延させ，患者負担を増大させる一因となっている。以上より、HLA型検査を必要とせず、全てのがん患者に適応可能ながんペプチドワクチンの開発・研究が望まれている。
　またがんペプチドワクチン療法において、細胞免疫であるCTLの活性化に加えて、液性免疫である免疫グロブリン産生が誘導されることにより、延命効果に寄与することが知られている（非特許文献６）。
Rosenberg SA et al., Nature Med. 2004, 10(9): 909-15 Terasaki M et al., J Clin Oncol. 2011, 29(3):337-44 Noguchi M et al., Cancer lmmunol. lmmunother. 2010, 59(7):1001-9 Yanagimoto H et al.，Cancer Sci. 2007, 98(4): 605-11 Sette A et al., Immunogenetics. 1999, 50(3-4):201-12 Noguchi M et al., Cancer Biol. Ther. 2011, 10(12):1266-79
　本発明は、HLA型検査を必要とすることなく、かつ特定のHLA型を有する患者に限定されることなく、がんペプチドワクチンとして幅広いがん患者に投与することが可能ながん抗原ペプチドを提供することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、HLA-A2、HLA-A24、HLA-A26またはHLA-A3スーパータイプのいずれか、又は上記の複数のHLA-A拘束性にCTL誘導能を有することが報告されているCTLエピトープペプチドより選択された５つのペプチドをリンカーを介して連結して得られたCTLエピトープ5連結ペプチドが、HLA型検査を必要とすることなく、かつ特定のHLA型を有する患者に限定されることなく幅広いがん患者に投与可能であり、さらに当該CTLエピトープ5連結ペプチドを投与することによって、当該ペプチドを構成するCTLエピトープペプチドに特異的なCTL及び免疫グロブリンが強く誘導されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は、以下の特徴を有する。
［１］　以下のCTLエピトープペプチド：配列番号1で表されるペプチド（PEP1）、配列番号2で表されるペプチド（PEP2）、配列番号3で表されるペプチド（PEP3）、配列番号4で表されるペプチド（PEP4）、配列番号5で表されるペプチド（PEP5）、配列番号6で表されるペプチド（PEP6）、及び、配列番号7で表されるペプチド（PEP7）、
からなる群より、重複して選択されてもよい５つのペプチドがリンカーを介してそれぞれ連結されてなる、エピトープ5連結ペプチドであって、
以下の（1）～（12）より選択される一又は複数の特徴を有する、上記エピトープ5連結ペプチド：
(1) リンカーを介してN末端側より順にPEP5とPEP2が隣り合う配列を含む；
(2) リンカーを介してN末端側より順にPEP2とPEP4が隣り合う配列を含む；
(3) リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP6が隣り合う配列を含む；
(4) リンカーを介してN末端側より順にPEP6とPEP3が隣り合う配列を含む；
(5) リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP1が隣り合う配列を含む；
(6) リンカーを介してN末端側より順にPEP1とPEP3が隣り合う配列を含む；
(7) リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP2が隣り合う配列を含む；
(8) リンカーを介してN末端側より順にPEP1とPEP4が隣り合う配列を含む；
(9) リンカーを介してN末端側より順にPEP5とPEP1が隣り合う配列を含む；
(10) リンカーを介してN末端側より順にPEP6とPEP5が隣り合う配列を含む；
(11) C末端にPEP2を含む；ならびに、
(12) C末端にPEP3を含む。
［２］　N末端にN末端側より順に、PEP5とPEP2、PEP6とPEP5、又は、PEP4とPEP6がリンカーを介して隣り合う配列を含む、ならびに/あるいは、C末端にN末端側より順に、PEP7とPEP3、PEP4とPEP3、PEP6とPEP3、PEP1とPEP3、PEP5とPEP2、PEP4とPEP2、又は、PEP5とPEP3がリンカーを介して隣り合う配列を含む、［１］のエピトープ5連結ペプチド。
［３］　以下の(a)～(p)より選択される配列を含む、［２］のエピトープ5連結ペプチド：
(a)PEP5-PEP2-PEP4-PEP7-PEP3；
(b)PEP5-PEP2-PEP7-PEP3-PEP4；
(c)PEP4-PEP6-PEP5-PEP7-PEP3；
(d)PEP5-PEP2-PEP4-PEP6-PEP3；
(e)PEP5-PEP2-PEP4-PEP1-PEP3；
(f)PEP4-PEP5-PEP2-PEP7-PEP3；
(g)PEP7-PEP3-PEP4-PEP5-PEP2；
(h)PEP5-PEP7-PEP3-PEP4-PEP2；
(i)PEP6-PEP1-PEP4-PEP5-PEP2；
(j)PEP6-PEP5-PEP1-PEP4-PEP2；
(k)PEP4-PEP5-PEP1-PEP6-PEP3；
(l)PEP7-PEP2-PEP4-PEP5-PEP3；
(m)PEP4-PEP2-PEP7-PEP5-PEP3；
(n)PEP7-PEP2-PEP5-PEP4-PEP3；
(o)PEP5-PEP2-PEP7-PEP4-PEP3；または、
(p)PEP5-PEP2-PEP4-PEP3-PEP7；
なお、式中「-」はリンカーを示す。
［４］　リンカーがアミノ酸リンカーである、［１］～［３］のいずれかのエピトープ5連結ペプチド。
［５］　アミノ酸リンカーが、アルギニンを２個連結したアルギニンダイマーである、［４］のエピトープ5連結ペプチド。
［６］　［１］～［５］のいずれかのエピトープ5連結ペプチドを用いて、末梢血リンパ球を刺激することにより得られるCTL。
［７］　［１］～［５］のいずれかのエピトープ5連結ペプチド、又は、［６］のCTLを有効成分として含有する、がんを治療又は予防するための医薬組成物。
［８］　免疫療法剤である、［７］の医薬組成物。
［９］　［１］～［５］のいずれかのエピトープ5連結ペプチド、又は［６］のCTLをがん患者に投与することを含む、がんの治療方法。
［１０］　［１］～［５］のいずれかのエピトープ5連結ペプチド、又は、［６］のCTLを被験者に投与することを含む、がんに対する被験者の免疫方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-047271号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、HLA型検査を必要とすることなく、かつ特定のHLA型を有する患者に限定されることなく、がんペプチドワクチンとして幅広いがん患者に投与することが可能ながん抗原ペプチドを提供することができる。
　本発明のCTLエピトープ5連結ペプチドは、HLA型検査を必要とすることなく幅広いがん患者、例えばHLA-A2陽性患者群、HLA-A24陽性患者群、HLA-A26陽性患者群、HLA-A3スーパータイプ陽性患者群に投与することが可能であり、当該患者におけるがん又はそれに起因する疾患を治療及び／又は予防することができる。また、本発明のCTLエピトープ5連結ペプチドを構成する腫瘍抗原は、複数のがん種において発現が認められていることから、本発明のCTLエピトープ5連結ペプチドは多様ながん種を治療又は予防するための医薬組成物（より詳細には免疫療法剤）として使用できる。さらに、本発明のエピトープ5連結ペプチドを投与することにより、構成されるCTLエピトープペプチドを混合して等量投与した場合と比べて、CTLエピトープペプチド特異的なCTL及び免疫グロブリンを強く誘導することが可能であり、抗腫瘍免疫をより効率的に活性化することができる。
図１は、エピトープ5連結ペプチド投与マウスモデルにおける、エピトープ特異的CTL誘導結果を示す（＊：未検討であることを示す）。 図２は、エピトープ5連結ペプチド投与マウスモデルにおける、血清中エピトープ特異的IgG抗体価の測定結果を示す。
　以下に本発明をさらに具体的に説明する。
１．エピトープ5連結ペプチド
　本発明の「エピトープ5連結ペプチド」は、同一及び／又は異なる腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチドから選ばれる５つのペプチドを、リンカーを介して直鎖状に連結して１分子としたペプチドを意味する。
　「腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチド」は、腫瘍抗原が腫瘍細胞内で分解されて生じるペプチドであり、HLA クラスＩ分子と結合して細胞表面上に提示されることにより、腫瘍特異的なCTLに認識される、ならびに／あるいは、腫瘍特異的なCTLを誘導する及び／又は活性化することができる。「腫瘍特異的なCTLを誘導する」とは、in vitro又はin vivoにおいて、腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチドを特異的に認識するCTLを分化及び／又は増殖させることを意味する。また、「腫瘍特異的なCTLを活性化する」とは、CTLがHLAクラスＩ分子により提示された抗原を認識することにより、インターフェロン－γ（IFN-γ）を産生することを意味する。本明細書においては、「腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチド」を単に、「CTLエピトープペプチド」と呼ぶ場合がある。
　本発明において使用するCTLエピトープペプチドとしては、公知のものを使用することができ、以下のものが挙げられる：
PEP1：KLVERLGAA（配列番号１［WO 0l/Ol1044］）；
PEP2：ASLDSDPWV（配列番号２［WO 02/010369］）；
PEP3：LLQAEAPRL（配列番号３［WO 00/12701］）；
PEP4：DYSARWNEI（配列番号４［特開平11-318455号公報］）；
PEP5：VYDYNCHVDL（配列番号５［WO 00/12701］）；
PEP6：LYAWEPSFL（配列番号６［特開2003-000270号公報］）；
PEP7：QIRPIFSNR（配列番号７［Cancer lmmunol. lmmunother. 2007，56(5), 689-698］）。
　本明細書中、配列番号１で表されるペプチドを「PEP1」、配列番号２で表されるペプチドを「PEP2」、配列番号３で表されるペプチドを「PEP3」、配列番号４で表されるペプチドを「PEP4」、配列番号５で表されるペプチドを「PEP5」、配列番号６で表されるペプチドを「PEP6」、配列番号７で表されるペプチドを「PEP7」とそれぞれ呼ぶ場合がある。
　本発明においては、PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5、PEP6、及びPEP7の各アミノ酸配列において、一又は複数のアミノ酸が置換、挿入、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、元のペプチドと同等又はそれ以上のCTL誘導能、免疫グロブリン産生誘導能を有するペプチドも、「CTLエピトープペプチド」として使用することができる。ここで「複数」とは１～３個、好ましくは１～２個である。このようなペプチドとしては、例えば、元のアミノ酸と類似した特性を有するアミノ酸で置換された（すなわち、保存的アミノ酸置換により得られた）ペプチドが挙げられる。
　PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、及び、PEP5はHLA-A2に、PEP2、PEP4、PEP5、及び、PEP6はHLA-A24に、PEP2、PEP4、PEP5、及び、PEP7はHLA-A3スーパータイプに、ならびに、PEP2、及び、PEP5はHLA-A26に、それぞれ拘束されCTLを誘導、及び／又は活性化することできる。また、これらのCTLエピトープペプチドをコードする遺伝子は、複数のがん種において発現が確認されている（Yang D et al., Cancer Res. 1999, 59: 4056-63、Harashima N et al., Eur. J. Immunol. 2001, 31(2), 323-32）。
　PEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5、PEP6、及びPEP7から選択された（重複して選択されてもよい）５つのペプチドは、リンカーを介してそれぞれ直鎖状に連結される。
　リンカーは、エピトープ5連結ペプチドが生体に投与された際に切断され、連結されたCTLエピトープペプチドが個々に分離されることを可能とするものであればよく、例えば、エステル結合、エーテル結合、アミド結合、糖鎖リンカー、ポリエチレングリコールリンカー、アミノ酸リンカーなどが挙げられる。アミノ酸リンカーとして用いられるアミノ酸配列としては、アルギニンダイマー、リジンダイマー、グリシンダイマー、グリシンペンタマー、グリシンヘキサマー、アラニン-アラニン-チロシン（AAY）、イソロイシン-ロイシン-アラニン（ILA）、アルギニン-バリン-リジン-アルギニン（RVKR）等が例示され、好ましくはアルギニンダイマーである。
　選択されるCTLエピトープペプチド、及びその連結順序は、所定の組合せ及び所定の連結順序で合成したエピトープ5連結ペプチドをヒトHLA-Aトランスジェニックマウスに投与し、in vivoにおいて各CTLエピトープペプチド特異的なCTL誘導の有無を評価し決定することができる。
　好ましくは、本発明のエピトープ5連結ペプチドは、以下の(1)～(12)より選択される一又は複数の特徴を有する：
(1)リンカーを介してN末端側より順にPEP5とPEP2が隣り合う配列を含む；
(2)リンカーを介してN末端側より順にPEP2とPEP4が隣り合う配列を含む；
(3)リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP6が隣り合う配列を含む；
(4)リンカーを介してN末端側より順にPEP6とPEP3が隣り合う配列を含む；
(5)リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP1が隣り合う配列を含む；
(6)リンカーを介してN末端側より順にPEP1とPEP3が隣り合う配列を含む；
(7)リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP2が隣り合う配列を含む；
(8)リンカーを介してN末端側より順にPEP1とPEP4が隣り合う配列を含む；
(9)リンカーを介してN末端側より順にPEP5とPEP1が隣り合う配列を含む；
(10)リンカーを介してN末端側より順にPEP6とPEP5が隣り合う配列を含む；
(11)C末端にPEP2を含む；ならびに、
(12)C末端にPEP3を含む。
　好ましくは、本発明のエピトープ5連結ペプチドは、
(I)N末端にN末端側より順に、
PEP5とPEP2、
PEP6とPEP5、又は、
PEP4とPEP6、
がリンカーを介して隣り合う配列を含む、ならびに／あるいは、
(II)C末端にN末端側より順に、
PEP7とPEP3;
PEP4とPEP3;
PEP6とPEP3;
PEP1とPEP3;
PEP5とPEP2;
PEP4とPEP2;又は、
PEP5とPEP3
がリンカーを介して隣り合う配列を含む。
　さらに好ましくは、本発明のエピトープ5連結ペプチドは、以下の(a)～(p)より選択される配列を含むか、あるいは当該配列からなる（式中「－」はリンカーを示す）：
(a)PEP5-PEP2-PEP4-PEP7-PEP3；
(b)PEP5-PEP2-PEP7-PEP3-PEP4；
(c)PEP4-PEP6-PEP5-PEP7-PEP3；
(d)PEP5-PEP2-PEP4-PEP6-PEP3；
(e)PEP5-PEP2-PEP4-PEP1-PEP3；
(f)PEP4-PEP5-PEP2-PEP7-PEP3；
(g)PEP7-PEP3-PEP4-PEP5-PEP2；
(h)PEP5-PEP7-PEP3-PEP4-PEP2；
(i)PEP6-PEP1-PEP4-PEP5-PEP2；
(j)PEP6-PEP5-PEP1-PEP4-PEP2；
(k)PEP4-PEP5-PEP1-PEP6-PEP3；
(l)PEP7-PEP2-PEP4-PEP5-PEP3； 
(m)PEP4-PEP2-PEP7-PEP5-PEP3；
(n)PEP7-PEP2-PEP5-PEP4-PEP3；
(o)PEP5-PEP2-PEP7-PEP4-PEP3；または、
(p)PEP5-PEP2-PEP4-PEP3-PEP7。
　本発明のエピトープ5連結ペプチドは、連結された５種のCTLエピトープペプチドのうち、好ましくは２種、さらに好ましくは３種、より好ましくは４種、最も好ましくは５種のCTLエピトープペプチドについて、各CTLエピトープペプチドに特異的なCTLを誘導、及び／又は、活性化することができ、ならびに各CTLエピトープペプチドに特異的な免疫グロブリン産生を誘導することができる。なお、ここで「免疫グロブリン」とは、IgG, IgM, IgA, IgDを意味する。
２．エピトープ5連結ペプチドの製造
　本発明のエピトープ5連結ペプチドは、慣用の液相合成法、固相合成法などのペプチド合成法、自動ペプチド合成機によるペプチド合成などによって製造することができる(Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990) Vol.12, p.1-19;S tewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p.5132、「新生化学実験講座１ タンパク質IV」（1992）日本生化学会編，東京化学同人）。ペプチド合成は、各アミノ酸の、結合しようとするα－アミノ基とα－カルボキシル基以外の官能基を保護したアミノ酸類を用意し、それぞれのアミノ酸のα－アミノ基とα－カルボキシル基との間でペプチド結合形成反応を行う。通常、ペプチドのC末端に位置するアミノ酸残基のカルボキシル基を適当なスペーサー又はリンカーを介して固相に結合しておく。上で得られたジペプチドのアミノ末端の保護基を選択的に除去し、次のアミノ酸のα－カルボキシル基との間でペプチド結合を形成する。このような操作を連続して行い側基が保護されたペプチドを製造し、最後に、すべての保護基を除去し、固相から分離する。保護基の種類や保護方法、ペプチド結合法の詳細は、上記の文献に詳しく記載されている。
　あるいは、本発明のエピトープ5連結ペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組換え法やファージディスプレイ法などによって、ペプチドを製造してもよい。
　遺伝子組換え法は、本発明のエピトープ5連結ペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクター中に挿入し、適当な宿主細胞にベクターを導入し、細胞を培養し、細胞内から又は細胞外液から目的のペプチドを回収することを含む。ベクターは、限定されないが、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルスなどのベクターである。ベクターを導入するための宿主細胞は、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等であり、これらの細胞への形質転換又はトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、PEG法等を含む。形質転換細胞を培養する方法は、宿主生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。本発明のペプチドの回収を容易にするために、発現によって生成したペプチドを細胞外に分泌させることが好ましい。そのために、その細胞からのペプチドの分泌を可能にするペプチド配列をコードするDNAを目的ペプチドをコードするDNAの5'末端側に結合する。あるいは、細胞内に蓄積された目的ペプチドを回収することもできる。この場合、細胞を物理的又は化学的に破壊し、タンパク質精製技術を使用して目的ペプチドを回収する。
　製造されたペプチドは、常法により、例えば、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLCなどのクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、免疫吸着法などにより、回収又は精製することができる。
３．細胞障害性Ｔリンパ球
　本発明のエピトープ5連結ペプチドを用いて、CTLエピトープペプチドに特異的であり、がん細胞を傷害するCTLをin vitroにて取得することができる。CTLエピトープペプチドを用いたCTLのin vitroにおける誘導方法は公知であり（例えば、特開2006－14637号公報）、本発明においてもこれらの手法を利用することができる。例えば、健常人又はがん患者由来の末梢血単核球（PBMC）中のプレート接着細胞をGM-CSF、IL-4等のサイトカインの存在下で培養して樹状細胞（DC）を誘導する。この樹状細胞に、本発明のエピトープ5連結ペプチドをパルスした後、Ｘ線照射を行うことにより、抗原提示細胞（stimulator）を調製する。DCが使用できない場合は、健常人または同じがん患者由来の末梢血単核 (PBMC)に本発明のエピトープ5連結ペプチドをパルスした後、Ｘ線照射を行ったものを用いてもよい。次いで、健常人由来の末梢血単核球（PBMC）又はがん患者由来の末梢血単核球（PBMC）又は所属リンパ節リンパ球（responder）を加えて、IL-2, IL-4, IL-7等のサイトカイン存在下で培養する。その後さらに、本発明のエピトープ5連結ペプチドを上述の通りパルスして得た抗原提示細胞を加えて再刺激を行い、IL-2等のサイトカイン存在下にてさらに培養する。
　CTLの誘導に用いる細胞培養用培地としては、Tリンパ球が生存できる任意の培地を用いればよい。例えば、RHAMα培地（Kawai, K., Sasaki, T., Saijo-Kurita, K., Akaza, H., Koiso, K., and Ohno, T., Cancer Immunol. Immunother. 35, 225-229, 1992中に記載されたLAK medium）、AIMV培地（GIBCO BRL, Life Technologies, INC.）、またはRPMI1640培地などに、IL-2等の各種サイトカインやウシ胎仔血清(FCS)などを添加したものを用いることができる。
　培養条件は当業者に周知の条件に従えばよい。例えば、培養温度を33℃～41℃、好ましくは37℃とする。また空気若しくは適当な濃度の酸素と、培地のpHを約7.4に保つために適当な濃度の炭酸ガス（例えば5％CO2）とを含む不活性ガスを気相として用いることができる。培養は、４～１０日間が好ましく、７日間がより好ましい。このような培養を行うことにより誘導されてきたCTLは、エピトープ5連結ペプチドを構成する5つのCTLエピトープペプチドのうち、好ましくは２種、さらに好ましくは３種、より好ましくは４種、最も好ましくは５種のCTLエピトープペプチドについて、各CTLエピトープペプチドに特異的なCTLを含み、がん細胞を特異的に傷害することができる。
４．医薬組成物
　本発明のエピトープ5連結ペプチドは、がんの免疫療法に使用する医薬組成物の有効成分として利用することができる。
　本発明の医薬組成物には、上記エピトープ5連結ペプチドのうち１又は複数種を有効成分として含めることができる。複数種のエピトープ5連結ペプチドを含めることによって、より高い効果を得ることができる。
　本発明のエピトープ5連結ペプチドに含まれるPEP1、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5、PEP6、及びPEP7をコードする遺伝子は、複数の固形がん及び血液がんにおいて発現が認められている。固形がんとしては、例えば、脳腫瘍、肺がん、乳がん、甲状腺がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、食道がん、胃がん、GIST、膵がん、大腸がん、直腸がん、肛門がん、腎がん、肝がん、胆道がん、頭頸部がん、膀胱がん、前立腺がん、悪性黒色腫、皮膚がん、舌がん、骨肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、血管肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫等が挙げられる。血液がんとしては例えば、白血病、悪性リンパ腫、骨髄腫等が挙げられる。従って、本発明のエピトープ5連結ペプチドはこれらのがんの治療又は予防に有用である。ここで「がんの治療又は予防」とは、がんの発生／再発を予防する、がんの進行／増悪を抑制する、がんの病態を改善することを意味する。
　本発明の医薬組成物は、医薬上許容される製剤素材として慣用の各種有機又は無機担体物質などを含むことができる。利用できる医薬担体としては、製剤の投与形態に応じて通常使用される、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、無痛化剤、希釈剤あるいは賦形剤等を例示でき、これらを常法により添加した配合剤として調製されるのが好ましい。
　また、本発明の医薬組成物は、ワクチンの投与に際して使用することが知られているアジュバントを含むことができる。アジュバントとしては、Complete Freund’s adjuvant（CFA）、Incomplete Freund’s adjuvant（IFA）、ミョウバン、Lipid Ａ 、モノホスホリルリピドＡ 、BCG（Bacillus-Calmette-Guerrin） 等の細菌製剤、ツベルクリン等の細菌成分製剤、キーホールリンペットヘモシアニンや酵母マンナン等の天然高分子物質、ムラミルトリペプチドまたムラミルジペプチドまたはそれらの誘導体、アラム（alum）、非イオン性ブロックコポリマー等を挙げることができ、これらの１種又は２種以上を組合せて用いることができる。アジュバントは本発明の医薬組成物と混和状態、またはエマルジョンとして同時に投与して用いてもよい。
　さらに、本発明の医薬組成物は、上記エピトープ5連結ペプチドに加えて、公知の腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチド又はそれを含むペプチド、あるいはそれらを連結したペプチド（以下、「公知の腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチド等」と記載）を、１又は複数組み合わせて含んでいてもよい。公知の腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチドとしては、例えばWT-1 p126-134, modified (M236Y) WT-1 p235-243, NY-ESO-1 p157-165, modified (T210M) gp100 p209-217, survivin-2B p80-88, Her-2/neu p63-71, VEGFR2 p169-177, MART-1 p26-35, Glypican-3 p298-306, SPARC p143-151等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。この場合、本発明のエピトープ5連結ペプチドと公知の腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチド等とは、一剤型の製剤形態でもよいし、本発明のエピトープ5連結ペプチドを有効成分として含む製剤と、公知の腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチド等を有効成分として含む製剤とが別個の製剤形態であってもよい。
　本発明の医薬組成物は、投与形態に応じて製剤形態を選択することができる。代表的な製剤形態としては、溶液剤、乳剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリン等の包接体、けん濁剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤等の作製も可能であるが、これらに限定されない。これらはさらに投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形ないし調製することができる。また、溶液製剤として使用できる他に、凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
　また、本発明の医薬組成物は、上記本発明のエピトープ5連結ペプチドを用いてin vitroにて誘導されたCTLを有効成分として含んでもよい。このような医薬組成物は非経口剤の形態であることが好ましい。
５．治療方法
　本発明の医薬組成物は、幅広いがん患者、例えばHLA-A2、HLA-A24、HLA-A26およびHLA-A3スーパータイプからなる群から選択されるHLAタイプ陽性患者群に投与することが可能であり、治療開始前にHLA型検査を要することなく治療を開始することができる。
　本発明の医薬組成物はがん患者に投与することによって、有効成分として含有されるエピトープ5連結ペプチドを構成する２種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、さらに好ましくは５種のCTLエピトープペプチドに特異的なCTLを誘導、及び／又は、活性化することができ、並びに、当該CTLエピトープペプチドに特異的な免疫グロブリン産生を誘導することができる。有効成分として含有されるエピトープ5連結ペプチドの投与による免疫グロブリン産生の誘導は、エピトープ5連結ペプチドに含まれるCTLエピトープペプチドを連結することなく個々に混合して投与した場合に認められる免疫グロブリン産生の誘導よりも顕著に高く、したがって、本発明におけるエピトープ5連結ペプチドは、がん患者におけるがんを効率的に治療又は予防することができる。
　本発明の医薬組成物は、経口投与、静脈投与、動脈投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、舌下投与、腹腔内投与、直腸内投与、経皮投与、経粘膜投与、経鼻投与、経膣投与、経眼投与、吸引投与等によって投与することができる。複数種のエピトープ5連結ペプチド、また、公知の腫瘍抗原分子由来のCTLエピトープペプチド等を有効成分として含む製剤がそれぞれ別個の医薬組成物として製剤されている場合、各医薬組成物は同じ、又は別個の投与経路にて、同時、又は非同時に投与することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、治療するがんの状態／重篤度、個々の患者の年齢、体重等の要因に応じて適宜調整することができるが、エピトープ5連結ペプチドの量にして、0.000lmg～1000mg 、好ましくはO.00lmg～100mg、より好ましくはO.01mg～50 mgを含む医薬組成物を、これを数日、数週または数ヶ月に1 回、反復投与することが好ましい。また、本発明の医薬組成物が有効成分として、本発明のエピトープ5連結ペプチドを用いてin vitroにて誘導されたCTLを含む場合には、１日につき体重１kg当たり、2x106～2x108個のCTLを、1週間～2週間の間隔で投与することが好ましい。
　本発明の医薬組成物は、がん化学治療に一般的に用いられる医薬品と併用してがん患者へ投与することも可能である。例えば、シクロホスファミド、テモゾロミド、ベンダムスチン等のアルキル化剤、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、メソトレキセート、ゲムシタビン等の代謝拮抗剤、シスプラチン、オキサリプラチン等のプラチナ製剤、イリノテカン、エリブリン、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン等の植物アルカロイド製剤、ドキソルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンD等の抗がん性抗生物質、イマチニブ、スニチニブ、ゲフィチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、モガムリズマブ等の分子標的治療剤、ビカルタミド、エストラムスチン、エキセメスタン等のホルモン療法製剤等が挙げられる。これらの医薬品は、本発明の医薬組成物と同じ、又は別個の投与経路にて、同時、又は非同時に投与することができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
実施例１　ペプチドの合成・精製
　CTLエピトープペプチド、及びエピトープ5連結ペプチドは、市販のペプチド合成機Prelude（Protein Technologies, Inc.）を用いて、固相合成法(Fmoc法)にて合成した。得られた各種合成ペプチドはYMC-Pack Pro C18カラム（YMC Co., Ltd.）及びHPLCシステム（Gilson）にて精製し、凍結乾燥後冷温暗所にて保存し、以降に示す実施例に供した。
　合成したCTLエピトープペプチドのアミノ酸配列を表１に、エピトープ5連結ペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。
　なおHLA-A2に結合する対照ペプチドとしてWT1 (配列番号8)、HLA-A24に結合する対照ペプチドとしてHer2（配列番号9）をそれぞれ合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２　マウスモデルにおけるエピトープペプチド特異的CTLの誘導とELISPOT法によるCTLの検出
　エピトープ5連結ペプチドを大塚蒸留水（大塚製薬工場）にて2mg/mLないし4mg/mLに調製し、B Braun Injektシリンジに充填した。別のシリンジに等量のIncomplete Freund’s adjuvant（IFA）を充填後、両シリンジをGPシリンジコネクタで接続し、エピトープ5連結ペプチド溶液とIFAをよく混合させることでエマルジョンを調製した。これをマウス（HLA-A2.1 transgenic，HLA-A24 transgenic (Taconic)）の尾根部周辺に100μLずつ週１回、計２回投与した。最終投与１週間後、マウスより鼠径部リンパ節を回収した。リンパ節細胞懸濁液をComplete Medium(RPMI-1640,10% heat-inactivated FBS,100U/mL Penicillin,100μg/mL Streptomycin,50μM 2-Mercaptoethanol)にて5×106cells/mLに調製し、標的CTLエピトープペプチド（最終濃度10μg/mL）、recombinant mouse IL-15（最終濃度100ng/mL）、recombinant mouse IL-21（最終濃度100ng/mL）をそれぞれ加え1mL/wellで24 well plateへ播種後、37℃、5%CO2インキュベーター内で８日間培養した。８日後、細胞を回収しMurine IFN-γ ELISpot Kit（GEN-PROBE）添付のanti IFN-γ抗体固相化プレートに1×105cells/wellで播種した。続けて、同系マウス脾臓より調製し30GyのＸ線を照射した脾臓細胞を同一wellへ抗原提示細胞として1×105cells/well播種後、標的CTLエピトープペプチド、またはnegative control ペプチド（最終濃度10μg/mL）を加え、37℃、5%CO2インキュベーター内で一晩インキュベートした。翌日、キットの添付文書に従いIFN-γ産生細胞スポットを発色させた。IFN-γ産生細胞スポット数はELISPOTアナライザー（Immunospot S6,Cellular Technology Ltd.）にて定量した。CTLエピトープペプチド特異的CTLの誘導は、当該試験により得られた標的CTLエピトープペプチド添加ウェルのIFN-γ産生細胞スポット数が、negative controlペプチド添加ウェルのそれに比し有意に高い（Student’s t-test, p<0.05）場合、陽性と判断した。なお、negative controlペプチドとしては、WT1またはHer2を用いた。さらに、CTL誘導強度を可視化する目的で、（標的CTLエピトープペプチド添加ウェルの平均IFN-γ産生細胞スポット数）-（negative controlペプチド添加ウェルの平均IFN-γ産生細胞スポット数）＝ Δとした時、10≦Δ<100の場合を陽性、100≦Δ<200の場合を中陽性、200≦Δの場合を強陽性として表した。
　CTLエピトープペプチド特異的CTL誘導の検討結果を図１に示した。図１の通り、エピトープ5連結ペプチドのいずれかの配列がPEP5-RR-PEP2、若しくはPEP4-RR-PEP2であるか、又はエピトープ5連結ペプチドのC末端がPEP3である、エピトープ5連結ペプチドが、少なくとも３種以上のCTL誘導を示した。一方、TPV18のような連結順序の５連結体では、２種以上のCTL誘導を示さなかった。
　以上の結果より、既知CTLエピトープペプチドを、アルギニンダイマーを介し連結したエピトープ5連結ペプチドをマウスに投与しても、全てのCTLエピトープペプチドに対して必ずエピトープ特異的CTLが誘導できるわけではないことが明らかとなった。
実施例３　CTLエピトープペプチド固相化ビーズの調製
　xMAP Multi-Analyte COOH Microspheres(Luminex corporation、以下ビーズという）に、以下の手順でペプチドを固相化した。MES buffer（0.1M MES-NaOH,pH7.0）でビーズを洗浄後、遠心分離により上清を除去した。これを二回繰り返した後、75μLのMES bufferでビーズを懸濁した。そこへ、1mg/mLに調製したCTLエピトープペプチド溶液を100μL加え、さらに10mg/mL EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride）を5μL加えよく混合した後、30℃、暗所で一晩反応させた。翌日、遠心分離により上清を除去した後、1M Tris-HClを125μL加え、30℃、暗所で30分間インキュベートした。上清除去後、wash buffer(PBS(-),0.05% Tween20)二回洗浄後、イムノブロック（DSファーマバイオメディカル）に懸濁することで、CTLエピトープペプチドの固相化を完了した。
実施例４　CTLエピトープ特異的IgG抗体価測定
　本発明のエピトープ5連結ペプチドを大塚蒸留水（大塚製薬工場）にて2mg/mLに調製し、B Braun Injektシリンジに充填した。別のシリンジに等量のIFAを充填後、両シリンジをGPシリンジコネクタで接続し、該エピトープ5連結ペプチド溶液とIFAをよく混合させることでエマルジョンを調製した。これをCBF1マウス（C57BL/6×Balb/c F1）尾根部周辺に100μLずつ週１回、計３回にわたり投与した。最終投与１週間後、マウスより採血し血清サンプルを得た。対照群として、PEP2、PEP3、PEP4、PEP5、PEP7の各ペプチド混合物（各1mg/mL）を用いてエマルジョンを調製し、エピトープ5連結ペプチドと同じスケジュールにて投与した（mixture投与群）。
　96ウェルフィルタープレートに、イムノブロックで希釈したCTLエピトープペプチド固相化ビーズを分注しwash bufferで洗浄後、イムノブロックで200倍希釈したマウス血清サンプルを100μL/well添加した。プレートを30℃インキュベーターにて600rpmで攪拌しながら、90分間インキュベートした。wash bufferで3回洗浄後、イムノブロックで500倍希釈したbiotinylated-anti-mouse IgG (H+L)(Vector Labolatories)を100μL/well添加し、30℃、600rpm攪拌条件にて60分間インキュベートした。wash bufferで3回洗浄後、イムノブロックで500倍希釈したStreptavidin,R-phycoerythrin conjugate(Invitrogen)を100μL/well添加し、30℃、600rpm攪拌条件にて30分間インキュベートした。wash bufferで3回洗浄後、wash bufferを100μL/well添加しビーズを懸濁後、Bio-Plex Suspension Array System(BIO-RAD)で各ビーズ特異的に結合したPE色素の平均蛍光強度を測定した。
　CTLエピトープ特異的IgG抗体価測定結果は図２に示した通りである。なお、図２にはIFAと大塚蒸留水（大塚製薬工場）を等量混合したエマルジョンを調製し、CTLエピトープペプチド混合物やエピトープ5連結ペプチドと同じスケジュールにてマウスへ投与した陰性対照群（以下、IFA群と略称する）の血清中CTLエピトープ特異的IgG抗体価測定結果に比し、何倍の当該IgG抗体の産生が誘導されたかを示した。
　図２の通り、mixture投与群においてはIFA群に比し、CTLエピトープ特異的IgG抗体産生誘導は認められなかった。一方、エピトープ5連結ペプチドを投与した場合は高い頻度で強いCTLエピトープ特異的IgG抗体の産生誘導が認められ、さらに当該IgG産生量は、投与されたエピトープ5連結ペプチドによっては数十倍から百倍以上、顕著に誘導されることが判明した。一方、TPV17のような連結順序の５連結体では、複数のCTLエピトープ特異的IgG抗体産生誘導は認められなかった。
　以上の結果は、エピトープ5連結ペプチドを投与することにより、当該エピトープ5連結ペプチドを構成するCTLエピトープペプチドを混合して投与するよりも抗腫瘍免疫が強く賦活化されていることを示す。
　がんペプチドワクチン治療を受けたがん患者におけるCTLエピトープペプチド特異的なIgG産生の誘導は、エピトープペプチド特異的CTLの誘導と共に延命効果に寄与する。したがって、本発明は既知のCTLエピトープペプチドやその混合物から構成されるようながんペプチドワクチン療法に比べ優れた延命効果がもたらすことができる。したがって本発明のエピトープ5連結ペプチドは、既知のCTLエピトープペプチドやその混合物から構成されるようながんペプチドワクチン療法に比べ治療成績を向上させることが可能となる、がんまたはそれに起因する疾患の治療剤および／または予防剤、がんペプチドワクチンとして好適に用いることができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 　以下のCTLエピトープペプチド：配列番号1で表されるペプチド（PEP1）、配列番号2で表されるペプチド（PEP2）、配列番号3で表されるペプチド（PEP3）、配列番号4で表されるペプチド（PEP4）、配列番号5で表されるペプチド（PEP5）、配列番号6で表されるペプチド（PEP6）、及び、配列番号7で表されるペプチド（PEP7）、
    からなる群より、重複して選択されてもよい５つのペプチドがリンカーを介してそれぞれ連結されてなる、エピトープ5連結ペプチドであって、
    以下の（1）～（12）より選択される一又は複数の特徴を有する、上記エピトープ5連結ペプチド：
    (1) リンカーを介してN末端側より順にPEP5とPEP2が隣り合う配列を含む；
    (2) リンカーを介してN末端側より順にPEP2とPEP4が隣り合う配列を含む；
    (3) リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP6が隣り合う配列を含む；
    (4) リンカーを介してN末端側より順にPEP6とPEP3が隣り合う配列を含む；
    (5) リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP1が隣り合う配列を含む；
    (6) リンカーを介してN末端側より順にPEP1とPEP3が隣り合う配列を含む；
    (7) リンカーを介してN末端側より順にPEP4とPEP2が隣り合う配列を含む；
    (8) リンカーを介してN末端側より順にPEP1とPEP4が隣り合う配列を含む；
    (9) リンカーを介してN末端側より順にPEP5とPEP1が隣り合う配列を含む；
    (10) リンカーを介してN末端側より順にPEP6とPEP5が隣り合う配列を含む；
    (11) C末端にPEP2を含む；ならびに、
    (12) C末端にPEP3を含む。
  2. 　N末端にN末端側より順に、PEP5とPEP2、PEP6とPEP5、又は、PEP4とPEP6がリンカーを介して隣り合う配列を含む、ならびに/あるいは、C末端にN末端側より順に、PEP7とPEP3、PEP4とPEP3、PEP6とPEP3、PEP1とPEP3、PEP5とPEP2、PEP4とPEP2、又は、PEP5とPEP3がリンカーを介して隣り合う配列を含む、請求項１に記載のエピトープ5連結ペプチド。
  3. 　以下の(a)～(p)より選択される配列を含む、請求項２に記載のエピトープ5連結ペプチド：
    (a)PEP5-PEP2-PEP4-PEP7-PEP3；
    (b)PEP5-PEP2-PEP7-PEP3-PEP4；
    (c)PEP4-PEP6-PEP5-PEP7-PEP3；
    (d)PEP5-PEP2-PEP4-PEP6-PEP3；
    (e)PEP5-PEP2-PEP4-PEP1-PEP3；
    (f)PEP4-PEP5-PEP2-PEP7-PEP3；
    (g)PEP7-PEP3-PEP4-PEP5-PEP2；
    (h)PEP5-PEP7-PEP3-PEP4-PEP2；
    (i)PEP6-PEP1-PEP4-PEP5-PEP2；
    (j)PEP6-PEP5-PEP1-PEP4-PEP2；
    (k)PEP4-PEP5-PEP1-PEP6-PEP3；
    (l)PEP7-PEP2-PEP4-PEP5-PEP3； 
    (m)PEP4-PEP2-PEP7-PEP5-PEP3；
    (n)PEP7-PEP2-PEP5-PEP4-PEP3；
    (o)PEP5-PEP2-PEP7-PEP4-PEP3；または、
    (p)PEP5-PEP2-PEP4-PEP3-PEP7。
    なお、式中「-」はリンカーを示す。
  4. 　リンカーがアミノ酸リンカーである、請求項１～３のいずれか１項に記載のエピトープ5連結ペプチド。
  5. 　アミノ酸リンカーが、アルギニンを２個連結したアルギニンダイマーである、請求項４に記載のエピトープ5連結ペプチド。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のエピトープ5連結ペプチドを用いて、末梢血リンパ球を刺激することにより得られるCTL。
  7. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のエピトープ5連結ペプチド、又は、請求項６に記載のCTLを有効成分として含有する、がんを治療又は予防するための医薬組成物。
  8. 　免疫療法剤である、請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のエピトープ5連結ペプチド、又は、請求項６に記載のCTLをがん患者に投与することを含む、がんの治療方法。
  10. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のエピトープ5連結ペプチド、又は、請求項６に記載のCTLを被験者に投与することを含む、がんに対する被験者の免疫方法。
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