BR112016008254B1 - Peptídeo que consiste em 4 epítopos de ctl ligados, composição de ctl, e composição farmacêutica - Google Patents

Abstract

PEPTÍDEO TENDO 4 EPÍTOPOS DE CTL LIGADOS. Esta invenção refere-se a um peptídeo antigênico do câncer que pode ser administrado a uma faixa ampla de pacientes com câncer na forma de uma vacina de peptídeo para o câncer sem a necessidade de tipificação de HLA e não obstante dos tipos de HLA dos pacientes. Tal peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados é obtido por ligação de 4 peptídeos de epítopo de CTL selecionados dentre peptídeos de epítopo de CTL derivados de moléculas de antígeno tumoral que são relatados como tendo a capacidade de indução de CTL por intermédio de ligantes.

Description

Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se a um novo peptídeo que é útil como um peptídeo antigênico do câncer. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um novo peptídeo antigênico do câncer tendo 4 peptídeos ligados capazes de indução de respostas de CTL restritas a HLA-A e uma composição farmacêutica utilizando o mesmo.

Antecedentes da Técnica

[002] Câncer é a causa principal de morte no Japão. Aproximadamente 350.000 pacientes morrem de câncer a cada ano, e o câncer ainda é uma doença séria atualmente. Os métodos de tratamento para o câncer que foram estabelecidos são resseção cirúrgica, tratamento com fármaco anticâncer, e tratamento com radiação. Entretanto, tais estratégias de tratamento são problemáticas em termos de, por exemplo, reincidência, declínio na qualidade de vida (QOL), e carência de opções de tratamento no caso de cânceres em estágio avançado que não podem ser tratados com as estratégias descritas acima.

[003] A imunoterapia contra o câncer (vacinas contra o câncer) foi esperada como uma nova técnica terapêutica por um longo período de tempo, e estudos clínicos sobre vacinas de peptídeo para o câncer foram iniciados em todo o mundo em 1990 quando peptídeos de epítopo em antígenos de tumor humano tornam-se identificáveis. De acordo com os resultados de análise dos estudos clínicos conduzidos por intermédio da administração de um peptídeo sozinho ou em combinação com outros agentes, entretanto, a taxa de resposta é tão baixa quanto 2,7% entre 1.000 ou mais casos (Rosenberg SA et al., Nature Med., 2004, 10 (9): 909 - 15). Assim, dificuldade na aplicação prática foi apontada.

[004] Entretanto, estudos clínicos envolvendo o uso de vacinas de peptídeo particulares para o câncer foram encaminhados por um longo período de tempo no Japão, e as realizações de tais estudos foram gradualmente articuladas. Nos últimos anos, uma estratégia de administração de um peptídeo de câncer múltiplo ao invés de um único tipo de peptídeo contra o câncer foi tentada, com o objetivo de melhorar o efeito para tratamento. Por exemplo, as respostas imunes do tipo HLA e específicas de um paciente são examinadas antecipadamente, de modo a implementar um tratamento contra o câncer sob medida usando vacinas de peptídeo compreendendo selecionar peptídeos adequados múltiplos a serem administrados, e efeitos de segurança e antitumorais destes foram verificados. Através da administração de vacinas de peptídeo feitas sob medida sozinhas ou em combinação com fármacos anticâncer, mais especificamente, efeitos clínicos excelentes e segurança foram obtidos em casos de tumor cerebral, câncer de cérvix uterina, câncer de próstata, e câncer pancreático (Terasaki, M. et al., J. Clin. Oncol., 2011, 29 (3): 337 - 44; Noguchi, M. et al., Cancer Immunol. Immunother., 2010, 59 (7): 1001 - 9; Yanagimoto, H. et al., Cancer Sci., 2007, 98 (4): 605 - 11).

[005] A imunidade mediada por célula consistindo em linfócitos T citotóxicos específicos de epítopo (daqui em diante, abreviado como "CTL"), que são considerados como sendo as principais células efetoras no tratamento contra o câncer usando vacinas de peptídeo, é restritiva de HLA. Consequentemente, o desenvolvimento de vacinas de peptídeo para câncer exclusivamente alvejando pacientes com um tipo de HLA particular, especificamente tipo HLA-A2 ou HLA-A24, foi tentado por causa do grande número de pacientes com este.

[006] Entretanto, os japoneses com tais dois tipos de HLA respondem por aproximadamente 40% e 60%, respectivamente (Sette, A. et al., Immunogenetics, 1999, 50 (3 - 4): 201 - 12). Desvantajosamente, pacientes com outros tipos de HLA não podem ganhar benefícios de vacinas de peptídeo para o câncer. Além disso, o tempo de início do tratamento seria postergado por causa de tipificação de HLA realizada antes do início do tratamento, e isto aumentaria a sobrecarga nos pacientes. Consequentemente, pesquisa e desenvolvimento de vacinas de peptídeo para câncer que são aplicáveis a todos os pacientes com câncer sem tipificação de HLA são desejados.

[007] Com respeito ao tratamento contra o câncer usando vacinas de peptídeo, além de ativações de CTLs como uma da imunidade mediada por célula, induções da produção de imunoglobulinas conhecidas como a imunidade humoral é conhecido como sendo atribuível para benefício de sobrevivência (Noguchi, M. et al., Cancer Biol. Ther., 2011, 10 (12):1266 - 79).

Sumário da Invenção Objetivos a serem Obtidos pela Invenção

[008] Um objetivo da presente invenção é fornecer um peptídeo antigênico do câncer que pode ser administrado como uma vacina de peptídeo para o câncer a uma faixa ampla de pacientes com câncer e que pode induzir fortemente imunoglobulinas, não obstante dos tipos de HLA dos pacientes.

Meios para Obter os Objetivos

[009] Os presentes inventores obtiveram um peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados por ligação, por intermédio de ligantes, de 4 peptídeos selecionados dentre peptídeos de epítopo de CTL relatados como sendo capazes de indução de resposta de CTL restrita ao supertipo HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26, ou HLA-A3 ou uma pluralidade de respostas de CTL restritas a HLA-A. Os presentes inventores conduziram estudos concentrados sobre tal peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados de modo a obter os objetivos acima. Como um resultado, eles descobriram que um peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados compostos de 13 tipos particulares de peptídeos selecionados dentre peptídeos de epítopo de CTL derivados de molécula de antígeno tumoral conhecidos podem ser administrados a uma faixa ampla de pacientes com câncer sem a necessidade de tipificação de HLA e não obstante dos tipos de HLA dos pacientes. Eles também descobriram que a administração de tal peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados pode fortemente induzir imunoglobulinas, além de CTLs específicos para peptídeos de epítopo de CTL que compõem tal peptídeo. Isto tem levado à conclusão da presente invenção.

[0010] Especificamente, a presente invenção tem as características seguintes.

[0011] Um peptídeo tendo 4 epítopos ligados, em que os 4 peptí- deos de epítopo são selecionados, opcionalmente redundantemente, do grupo consistindo em peptídeos de epítopo de CTL: o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 1 (PEP1); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 2 (PEP2); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 4 (PEP4); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 5 (PEP5); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 6 (PEP6); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 7 (PEP7); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 8 (PEP8); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 9 (PEP9); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 10 (PEP10); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 13 (PEP13); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 15 (PEP15); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 17 (PEP17); e o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 18 (PEP18), ligado por intermédio de ligantes, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados opcionalmente compreende outras sequências de peptídeo consistindo em aminoácido hidrofílicos, e o peptídeo tendo 4 epítopos ligados tem uma ou mais características selecionadas das características (1) a (5) abaixo: (1) o peptídeo compreende PEP2 no C-terminal (exceto para o peptídeo compreendendo PEP7 e PEP8 no N-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante); (2) o peptídeo compreende PEP4 no C-terminal; (3) o peptídeo compreende PEP10 no C-terminal; (4) o peptídeo compreende PEP6 e PEP5 no C-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante; e (5) o peptídeo compreende PEP5, PEP6, PEP9, e PEP18.

[0012] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com , que compreende 4 peptídeos não redundantes selecionados dentre PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17, e PEP18.

[0013] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com ou tendo qualquer uma das características selecionadas das características (1) a (5) abaixo: (1) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopo de CTL selecionados dentre PEP1, PEP7, PEP8, e PEP13, e PEP2 é disposto no C-terminal do peptídeo (exceto para o peptídeo compreendendo PEP7 e PEP8 no N-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante); (2) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopo de CTL, PEP5, PEP6, e PEP9, e PEP4 é disposto no C-terminal do peptídeo; (3) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopo de CTL selecionados dentre PEP1, PEP13, PEP15, PEP17, e PEP18, e PEP10 é disposto no C-terminal do peptídeo; (4) o peptídeo compreende 2 peptídeos de epítopo de CTL, PEP1 e PEP7, e PEP6 e PEP5 são sucessivamente dispostos no C- terminal em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante; e (5) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopo de CTL, PEP5, PEP6, e PEP18, e PEP9 é disposto no C-terminal do peptídeo.

[0014] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a, que compreende uma sequência selecionada das sequências seguintes, em que "-(L)-" representa um ligante: - PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4; - PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4; - PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4; - PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4; - PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4; - PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4; - PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10; - PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10; - PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9; - PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9; - PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5; e - PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5.

[0015] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a, em que o ligante é um ligante de aminoácido.

[0016] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a, em que o ligante de aminoácido é um dímero de arginina ou trímero de arginina composto de dois ou três resíduos de arginina ligados um ao outro.

[0017] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a, em que a outra sequência de peptídeo consistindo em aminoácidos hidrofílicos é ligada ao N-terminal.

[0018] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a, em que a outra sequência de peptídeo consistindo em aminoácidos hidrofílicos é composta de um trímero de arginina ou tetrâmero de arginina composto de três ou quatro resíduos de arginina ligados um ao outro.

[0019] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a, que consiste na sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, ou SEQ ID NO: 66.

[0020] Um CTL obtido estimulando-se linfócitos do sangue periférico usando o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a .

[0021] Uma composição farmacêutica compreendendo, como um ingrediente ativo, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a ou o CTL de acordo com .

[0022] Uma composição farmacêutica compreendendo dois ou mais peptídeos selecionados dentre os peptídeos tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a .

[0023] A composição farmacêutica de acordo com ou , que é um agente imunoterapêutico.

[0024] Um método para o tratamento de câncer compreendendo administrar o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com qualquer um de a, o CTL de acordo com , ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer um de a a um paciente com câncer.

[0025] A descrição inclui parte ou todo o conteúdo como divulgado nas descrições e/ou desenhos dos Pedidos de Patente Japoneses Nos 2013-218524 e 2014-155132, que são documentos de prioridade do presente pedido.

Efeitos da Invenção

[0026] A presente invenção pode fornecer um peptídeo antigênico do câncer que pode ser administrado a uma faixa ampla de pacientes com câncer como uma vacina de peptídeo para o câncer e que pode induzir fortemente imunoglobulinas, não obstante dos tipos de HLA dos pacientes.

[0027] O peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados de acordo com a presente invenção pode ser administrado a uma faixa ampla de pacientes com câncer sem a necessidade de tipificação de HLA. Exemplos de tais pacientes incluem aqueles que são pacientes positivos de HLA-A2, pacientes positivos de HLA-A24, pacientes positivos de HLA-A26, e pacientes positivos do supertipo HLA-A3. O peptídeo como descrito acima pode ser usado para o tratamento e/ou prevenção de câncer ou doenças causadas desse modo de tais pacientes. Além disso, a expressão dos antígenos tumorais que constituem o peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados de acordo com a presente invenção é observada em uma pluralidade de tipos de cânceres. Consequentemente, o peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados de acordo com a presente invenção pode ser usado como uma composição farmacêutica (e mais especificamente, como um agente imunoterapêutico) para o tratamento e/ou prevenção de uma variedade de cânceres. Através da administração do peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção, além disso, CTLs e imunoglobulinas específicos de peptídeo de epítopo de CTL podem ser induzidos mais fortemente, em comparação com a administração de uma mistura de uma quantidade equivalente de peptídeos de epítopo de CTL, e imunidade antitumoral pode ser mais eficientemente ativada.

Breve Descrição dos Desenhos

[0028] A Fig. 1-1 mostra os resultados de HPLC para os peptídeos tendo 4 epítopos ligados obtidos no exemplo 1 (TPV06, TPV10, TPV12, TPV21, TPV26, TPV30, TPV35,TPV37, TPV39, TPV40, TPV41, TPV43, e TPV45).

[0029] A Fig. 1-2 é uma continuação da Fig. 1-1.

[0030] A Fig. 1-3 é uma continuação da Fig. 1-2.

[0031] A Fig. 1-4 é uma continuação da Fig. 1-3.

[0032] A Fig. 1-5 é uma continuação da Fig. 1-4.

[0033] A Fig. 1-6 é uma continuação da Fig. 1-5.

[0034] A Fig. 1-7 é uma continuação da Fig. 1-6.

[0035] A Fig. 2-1 mostra os resultados de espectrometria de massa (MS) para os peptídeos tendo 4 epítopos ligados obtidos no exemplo 1 (TPV39, TPV40, TPV41, TPV43, e TPV45).

[0036] A Fig. 2-2 é uma continuação da Fig. 2-1.

[0037] A Fig. 2-3 é uma continuação da Fig. 2-2.

[0038] A Fig. 3-1 mostra os resultados de indução de CTL específica de epítopo em modelos de camundongo aos quais o peptídeo tendo 4 epítopos ligados foi administrado (*: não examinado). A Fig. 31 mostra ainda os resultados de avaliação obtidos clivando-se o peptídeo tendo 4 epítopos ligados com imunoproteassomas humanos e inspecionando-se a clivagem do C-terminal do peptídeo de epítopo PEP2 ou PEP10 identificado.

[0039] A Fig. 3-2 é uma continuação da Fig. 3-1.

[0040] A Fig. 3-3 é uma continuação da Fig. 3-2.

[0041] A Fig. 3-4 mostra os resultados de indução de CTL específica de epítopo em modelos de camundongo aos quais o peptídeo tendo 4 epítopos ligados compreendendo uma sequência de peptídeo de resíduos de arginina no N-terminal ou peptídeo tendo 4 epítopos ligados compreendendo um trímero de arginina como um ligante de peptídeo-peptídeo foi administrado (*: não examinado). A Fig. 3-4 mostra ainda os resultados de avaliação obtidos clivando-se o peptídeo tendo 4 epítopos ligados com imunoproteassomas humanos e inspecionando-se a clivagem do C-terminal do peptídeo de epítopo PEP2 ou PEP10 identificado.

[0042] A Fig. 4-1 mostra os resultados de ensaio do título de anticorpo de IgG específico de epítopo em soros de modelos de camundongo aos quais o peptídeo tendo 4 epítopos ligados foi administrado.

[0043] A Fig. 4-2 é uma continuação da Fig. 4-1.

[0044] A Fig. 4-3 mostra os resultados de ensaio do título de anti corpo de IgG específico de epítopo em soros de modelos de camundongo aos quais o peptídeo tendo 4 epítopos ligados compreendendo uma sequência de peptídeo de resíduos de arginina no N-terminal ou peptídeo tendo 4 epítopos ligados compreendendo um trímero de arginina como um ligante de peptídeo-peptídeo foi administrado.

Modalidades para Realizar a Invenção

[0045] Daqui em diante, a presente invenção é descrita em mais detalhe.

1. Peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados

[0046] Na presente invenção, o "peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados" significa 4 peptídeos selecionados dentre peptídeos de epítopo de CTL derivados das mesmas moléculas de antígeno tumoral e/ou diferentes linearmente ligadas por intermédio de ligantes como uma única molécula.

[0047] O "peptídeo de epítopo de CTL derivado de moléculas de antígeno tumoral" é um peptídeo que resulta da decomposição de antígenos tumorais dentro de células tumorais, e ele é ligado à molécula de classe I de HLA e apresentado na superfície celular. Assim, é ele reconhecido por um CTL específico de tumor e/ou ele pode induzir e/ou ativar CTLs específicos de tumores. "Indução de CTLs específicos de tumores" refere-se à diferenciação e/ou proliferação de CTLs que especificamente reconhecem peptídeos de epítopo de CTL derivados de moléculas de antígeno tumoral in vitro ou in vivo. Além disso, "ativação de CTL específico de tumor" refere-se à produção de interferon-y (IFN-y) e/ou exibição de atividade citotóxica por meio da liberação de substâncias citotóxicas ou semelhantes quando CTL reconhece um antígeno apresentado pela molécula de classe I de HLA. O "peptídeo de epítopo de CTL derivado de uma molécula de antígeno tumoral" usado aqui é ocasionalmente referido como um "peptídeo de epítopo de CTL."

[0048] Como peptídeos de epítopo de CTL derivados de moléculas de antígeno tumoral, aqueles mostrados abaixo são conhecidos: PEP1: KLVERLGAA (SEQ ID NO: 1 [WO 200l/0l1044]); PEP2: ASLDSDPWV (SEQ ID NO: 2 [WO 2002/010369]); PEP3: ALVEFEDVL (SEQ ID NO: 3 [WO 2002/010369]); PEP4: LLQAEAPRL (SEQ ID NO: 4 [WO 2000/12701]); PEP5: DYSARWNEI (SEQ ID NO: 5 [JP H11-318455 A (1999)]); PEP6: VYDYNCHVDL (SEQ ID NO: 6 [WO 2000/12701]); PEP7: LYAWEPSFL (SEQ ID NO: 7 [JP 2000-000270 A]); PEP8: DYLRSVLEDF (SEQ ID NO: 8 [WO 2001/011044]); PEP9: QIRPIFSNR (SEQ ID NO: 9 [WO 2008/007711]); PEP10: ILEQSGEWWK (SEQ ID NO: 10 [WO 2009/022652]); PEP11: VIQNLERGYR (SEQ ID NO: 11 [WO 2009/022652]); PEP12: KLKHYGPGWV (SEQ ID NO: 12 [WO 1999/067288]); PEP13: RLQEWCSVI (SEQ ID NO: 13 [WO 2002/010369]); PEP14: ILGELREKV (SEQ ID NO: 14 [WO 2002/010369]); PEP15: DYVREHKDNI (SEQ ID NO: 15 [WO 2005/071075]); PEP16: HYTNASDGL (SEQ ID NO: 16 [WO 2001/011044]); PEP17: NYSVRYRPGL (SEQ ID NO: 17 [JP 2000-000270 A]); PEP18: RYLTQETNKV (SEQ ID NO: 18 [JP 2007-145715 a]); e PEP19: TFDYLRSVL (SEQ ID NO: 19 [WO 2001/011044]).

[0049] PEP1, PEP2, PEP3, PEP4, PEP5, PEP8, PEP10, PEP12, PEP13, PEP14, e PEP15 são restritos por HLA-A2 e CTLs depois podem ser induzidos e/ou ativados. PEP2, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP12, PEP13, PEP15, PEP16, PEP17, PEP18, e PEP19 são restritos por HLA-A24 e CTLs depois podem ser induzidos e/ou ativados. PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP9, PEP10, PEP11, PEP12, PEP13, PEP15, e PEP16 são restritos pelo supertipo HLA-A3 e CTLs depois podem ser induzidos e/ou ativados. Além disso, PEP2 e PEP6 são restritos por HLA-A26 e CTLs depois podem ser induzidos e/ou ativados. A expressão de genes que codificam tais peptídeos de epítopo de CTL é observada em uma pluralidade de tipos de cânceres (Yang, D. et al., Cancer Res., 1999, 59: 4056 - 63; Harashima, N. et al., Eur. J. Immunol., 2001, 31 (2), 323 - 32).

[0050] Vários tipos de peptídeos tendo 4 epítopos de CTL ligados que são obtidos ligando-se linearmente 4 tipos de peptídeos de epítopo de CTL selecionados dentre 13 tipos particulares dos peptídeos de epítopo de CTL descritos acima por intermédio de ligantes como uma única molécula podem servir como os "peptídeos tendo 4 epítopos de CTL ligados" de acordo com a presente invenção. Três de CTLs mais específicos para peptídeos de epítopo de CTL relevantes podem ser induzidos e/ou ativados. Peptídeos que podem não ser diretamente avaliados em termos de indução específica de peptídeo de epítopo de CTL (isto é, PEP2 e PEP10) podem ser submetidos ao experimento de clivagem com imunoproteassomas (Exemplo 3), de modo a determinar a ocorrência de indução de CTL específica de peptídeo de epítopo. Em geral, proteínas antigênicas que são incorporadas em células apresentadoras de antígeno são conhecidas como sendo clivadas com proteassomas ou imunoproteassomas, e tal procedimento é conhecido como sendo indispensável para as proteínas antigênicas incorporadas para apresentar antígenos mediados por HLA (por exemplo, Rock K.L., York, I.A., Goldberg, A.L., Nat. Immunol., 2004, 5(7): 670 - 677). É necessário que peptídeos de epítopo de CTL sejam clivados em sítios adequados, de modo a permitir que tais peptídeos de epítopo liguem-se a bolsos de HLA. É necessário que aminoácidos C terminais dos peptídeos de epítopo de CTL sejam determinados como um resultado da clivagem com proteassomas ou imunoproteassomas (Rock K.L., York, I.A., Goldberg, A.L., Nat. Immunol., 2004, 5(7): 670 - 677). Foi presumido que peptídeos de epítopo de CTL seriam apresentados por células dendríticas quando peptídeos tendo 4 epítopos ligados foram administrados a seres humanos. Na base de tal presunção, padrões de clivagem dos peptídeos tendo 4 epítopos ligados foram analisados in vitro usando imunoproteassomas expressados em células dendríticas em níveis altos. Quando peptídeos de epítopo de CTL aparecem como um resultado da clivagem com imunoproteassomas, pode ser determinado que CTL específico para tais peptídeos de epítopo é induzido.

[0051] Na presente descrição, 4 tipos de peptídeos de epítopo de CTL selecionados dentre 13 tipos particulares dos peptídeos de epítopo de CTL são selecionados, opcionalmente redundantemente, dentre o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 1 (PEP1), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 2 (PEP2), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 4 (PEP4), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 5 (PEP5), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 6 (PEP6), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 7 (PEP7), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 8 (PEP8), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 9 (PEP9), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 10 (PEP10), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 13 (PEP13), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 15 (PEP15), o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 17 (PEP17), e o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 18 (PEP18).

[0052] Na presente invenção, um peptídeo tendo uma sequência de aminoácido tendo substituição, inserção, supressão, e/ou adição de um ou uma pluralidade de aminoácidos na sequência de aminoácido de PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17, ou PEP18 e tendo a capacidade para induzir CTL e a capacidade para induzir produções de imunoglobulina equivalentes a ou mais altas do que aquelas do peptídeo original pode ser usado como um "peptídeo de epítopo de CTL." O termo "pluralidade" usado aqui refere-se a 1 a 3, e preferivelmente 1 ou 2. Um exemplo de tal peptídeo é um peptídeo obtido por substituição de aminoácidos tendo propriedades similares àqueles do aminoácido original (isto é, um peptídeo obtido por substituição de aminoácido conservativa).

[0053] O peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados de acordo com a presente invenção compreende 4 peptídeos de epítopo que são selecionados, opcionalmente redundantemente, dentre PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17, e PEP18 linearmente ligados por intermédio de ligantes.

[0054] Qualquer ligante pode ser usado, contanto que ele seja clivado na administração de um peptídeo tendo 4 epítopos de CTL ligados a um organismo, e os peptídeos de epítopo de CTL ligados podem ser separados um do outro. Exemplos destes incluem uma ligação éster, uma ligação éter, uma ligação amida, um ligante de cadeia de açúcar, um ligante de polietilenoglicol, e um ligante de aminoácido. Exemplos de sequências de aminoácido usadas como ligantes de aminoácido incluem um dímero de arginina, um trímero de arginina, um tetrâmero de arginina, um dímero de lisina, um trímero de lisina, um tetrâmero de lisina, um dímero de glicina, um trímero de glicina, um tetrâmero de glicina, um pentâmero de glicina, um hexâmero de glicina, uma alanina-alanina-tirosina (AAY), isoleucina-leucina-alanina (ILA), e arginina-valina-lisina-arginina (RVKR), com um dímero ou trímero de arginina sendo preferível.

[0055] Peptídeos de epítopo de CTL a serem selecionados e os arranjos destes podem ser determinados administrando-se um peptídeo tendo 4 epítopos ligados obtidos sintetizando-se epítopos em combinações dadas e em uma ordem dada a camundongos transgênicos de HLA-A humano e avaliando-se a ocorrência de indução de CTL específica de peptídeo de epítopo de CTL in vivo.

[0056] Preferivelmente, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção tem uma ou mais características selecionadas das características (1) a (5) abaixo: (1) o peptídeo compreende PEP2 no C-terminal (exceto para o peptídeo compreendendo PEP7 e PEP8 no N-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante); (2) o peptídeo compreende PEP4 no C-terminal; (3) o peptídeo compreende PEP10 no C-terminal; (4) o peptídeo compreende PEP6 e PEP5 no C-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante; e (5) o peptídeo compreende PEP5, PEP6, PEP9, e PEP18.

[0057] Mais preferivelmente, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção tem uma característica selecionada das características (1) a (5) abaixo: (1) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopo de CTL selecionados dentre PEP1, PEP7, PEP8, e PEP13 e, no C-terminal, PEP2 (exceto para o peptídeo compreendendo PEP7 e PEP8 no N- terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante); (2) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopo de CTL, PEP5, PEP6, e PEP9, e, no C-terminal, PEP4; (3) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopo de CTL selecionados dentre PEP1, PEP13, PEP15, PEP17, e PEP18 e, no C- terminal, PEP10; (4) o peptídeo compreende 2 peptídeos de epítopo de CTL, PEP1 e PEP7, e PEP6 e PEP5 no C-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante; e (5) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopo de CTL, PEP5, PEP6, e PEP18, e, no C-terminal, PEP9.

[0058] Ainda preferivelmente, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção compreende ou consiste em uma sequência selecionados dentre as sequências seguintes, em que "-(L)" representa um ligante: - PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4 (TPV01); - PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4 (TPV02); - PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4 (TPV03); - PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4 (TPV04); - PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4 (TPV05); - PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4 (TPV06); - PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV07); - PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV08); - PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV09); - PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2 (TPV10); - PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV11); - PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV12); - PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV13); - PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2 (TPV14); - PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2 (TPV15); - PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2 (TPV16); - PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV17); - PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV18); - PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV19); - PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV20); - PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV21); - PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV22); - PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV23); - PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV24); - PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10 (TPV25); - PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10 (TPV26); - PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV27); - PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10 (TPV28); - PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV29); - PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10 (TPV30); - PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10 (TPV31); - PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV32); - PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10 (TPV33); - PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10 (TPV34); - PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9 (TPV35); - PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9 (TPV36); - PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5 (TPV37); e - PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5 (TPV38).

[0059] O peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados de acordo com a presente invenção pode compreender ainda uma sequência de peptídeo consistindo em aminoácidos hidrofílicos. Tal sequência de peptídeo pode ser adicionada ao N-terminal e/ou ao C-terminal do peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados, e ela é preferivelmente adicionada ao N-terminal. Tal sequência de peptídeo consiste em 1 a 15, preferivelmente 2 a 10, e mais preferivelmente 3 a 5 aminoácidos hidrofílicos selecionados do grupo consistindo em arginina, histidina, lisina, treonina, tirosina, serina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, e ácido glutâmico. Por exemplo, um trímero de arginina (RRR) ou tetrâmero de arginina (RRRR) pode ser usado como tal sequência de peptídeo. Exemplos de peptídeos tendo 4 epítopos de CLP ligados compreendendo tais sequências de peptídeo adicionadas a estes incluem RRR-TPV06, RRRR-TPV06, TPV06-RRR, TPV06-RRRR, RRR-TPV10, RRRR-TPV10, TPV10-RRR, TPV10-RRRR, RRR-TPV12, RRRR-TPV12, TPV12-RRR, TPV12-RRRR, RRR-TPV21, RRRR- TPV21, TPV21-RRR, TPV21-RRRR, RRR-TPV26, RRRR-TPV26, TPV26-RRR, TPV26-RRRR, RRR-TPV30, RRRR-TPV30, TPV30-RRR, TPV30-RRRR, KKK-TPV06, KKKK-TPV06, TPV06-KKK, TPV06-KKKK, KKK-TPV10, KKKK-TPV10, TPV10-KKK, TPV10-KKKK, KKK-TPV12, KKKK-TPV12, TPV12-KKK, TPV12-KKKK, KKK-TPV21, KKKK-TPV21, TPV21-KKK, TPV21-KKKK, KKK-TPV26, KKKK-TPV26, TPV26-KKK, TPV26-KKKK, KKK-TPV30, KKKK-TPV30, TPV30-KKK, TPV30-KKKK, HHH-TPV06, HHHH-TPV06, TPV06-HHH, TPV06-HHHH, HHH-TPV10, HHHH-TPV10, TPV10-HHH, TPV10-HHHH, HHH-TPV12, HHHH- TPV12, TPV12-HHH, TPV12-HHHH, HHH-TPV21, HHHH-TPV21, TPV21-HHH, TPV21-HHHH, HHH-TPV26, HHHH-TPV26, TPV26-HHH, TPV26-HHHH, HHH-TPV30, HHHH-TPV30, TPV30-HHH, TPV30- HHHH, RRKK-TPV12, RKRK-TPV12, RHRH-TPV12, RRHH-TPV12, KKHH-TPV12, e KHKH-TPV12, com KKK-TPV06, KKKK-TPV06, KKK- TPV10, KKKK-TPV10, KKK-TPV12, KKKK-TPV12, KKK-TPV21, KKKK- TPV21, KKK-TPV26, KKKK-TPV26, KKK-TPV30, KKKK-TPV30, HHH- TPV06, HHHH-TPV06, HHH-TPV10, HHHH-TPV10, HHH-TPV12, HHHH-TPV12, HHH-TPV21, HHHH-TPV21, HHH-TPV26, HHHH- TPV26, HHH-TPV30, HHHH-TPV30, RRKK-TPV12, RKRK-TPV12, RHRH-TPV12, RRHH-TPV12, KKHH-TPV12, e KHKH-TPV12 sendo preferível, e RRR-TPV06, RRRR-TPV06, RRR-TPV10, RRRR-TPV10, RRR-TPV12, RRRR-TPV12, TRRR-TPV21, RRRR-TPV21, RRR- TPV26, RRRR-TPV26, RRR-TPV30, e RRRR-TPV30 sendo mais preferível. Um peptídeo compreendendo tal sequência de peptídeo é conhecido como tendo solubilidade melhorada em um solvente aquoso (Abdelkrim Alileche et al., Peptides 38, 2012, 302 - 311; JP 2006 - 188507 A). Com a adição de tal sequência de peptídeo ao peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados de acordo com a presente invenção, um grau de solubilidade do peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados em um solvente aquoso pode ser melhorado.

[0060] No peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção, CTLs específicos do peptídeo de epítopo de CTL podem ser induzidos e/ou ativados em pelo menos três tipos, e preferivelmente quatro tipos de peptídeos de epítopo de CTL dos 4 tipos ligados de peptídeos de epítopo de CTL. Além disso, a produção de uma imunoglobulina específica para cada peptídeo de epítopo de CTL pode ser induzida. Na presente invenção, o termo "imunoglobulinas" refere-se a IgG, IgM, IgA, ou IgD.

[0061] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção pode ser um sal de adição de ácido ou um sal de adição de base. Exemplos de ácidos que são geralmente usados para formar sais de adição de ácido incluem ácidos orgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido iodídrico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil sulfônico, ácido carboxílico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético, e ácido trifluoroacético. Exemplos de sais de adição de base incluem sais induzidos de bases inorgânicas, tais como hidróxido de amônio, hidróxido alcalino, hidróxido de metal alcalino terroso, carbonato, e bicarbonato.

2. Produção de um peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados

[0062] O peptídeo tendo 4 epítopos de CLP ligados de acordo com a presente invenção pode ser produzido por técnicas comuns, por exemplo, síntese de peptídeo, tal como síntese de fase líquida ou síntese de fase sólida, ou síntese de peptídeo envolvendo o uso de um sintetizador de peptídeo automático (Kelley et al., Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K. eds., Plenum Press NY., 1990, Vol. 12, páginas 1 - 19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, 1989, W. H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 1985, 82: p. 5132, "Shin Seikagaku Jikken Kouza (New Biochemical Experiment) 1, Protein IV, 1992, the Japanese Biochemical Society (ed.), Tokyo Kagaku Doujin). A síntese de peptídeo é realizada preparando-se aminoácidos em que grupos funcionais exceto grupos a- amino e grupos a-carboxila a serem ligados dos aminoácidos são protegidos e formam ligações de peptídeo entre grupos a-amino e grupos a-carboxila dos aminoácidos. Em geral, um grupo carboxila de um resíduo de aminoácido localizado no C-terminal de um peptídeo é ligado a uma fase sólida por intermédio de um espaçador ou ligante adequados. Um grupo protetivo no término amino do dipeptídeo obtido acima é seletivamente removido e uma ligação de peptídeo é formada entre o término amino e o grupo a-carboxila do resíduo de aminoácido subsequente. Este procedimento é continuado para produzir um peptídeo com um grupo lateral protegido, e todos os grupos protetivos são removidos e separados da fase sólida no final. Tipos de grupo protetivo, métodos para proteger os mesmos, e métodos de ligação de peptídeo são descritos em detalhe nos documentos mencionados acima.

[0063] Alternativamente, um peptídeo pode ser produzido por intermédio de recombinação genética, exibição de fago, ou outras técnicas com o uso de um ácido nucleico que codifica o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção.

[0064] Uma técnica de recombinação genética compreende inserir o DNA que codifica o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção em um vetor de expressão adequado, introduzindo o vetor em células hospedeiras adequadas, cultivando as células, e recuperando os peptídeos-alvo das células ou do fluido extracelular. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a, plasmídeo, fago, cosmídeo, fagomídeo, e vetores virais. Vetores são introduzidos em células hospedeiras, tais como células hospedeiras bacterianas (por exemplo, E. coli e Bacillus subtilis), células de levedura, células de inseto, células animais (por exemplo, células mamíferas), e células vegetais. A transformação ou transfecção em tais células é realizada por intermédio, por exemplo, do método do fosfato de cálcio, eletroporação, lipofecção, o método de biolística, ou o método de PEG. Células transformadas são cultivadas de acordo com uma técnica convencional para cultura de organismo hospedeiro. De modo a facilitar a recuperação do peptídeo de acordo com a presente invenção, é preferível que um peptídeo gerado por intermédio de expressão seja secretado extracelularmente. Para esta finalidade, o DNA que codifica uma sequência de peptídeo que permite secreção de peptídeo das células é ligado ao lado terminal 5’ do DNA que codifica um peptídeo alvo. Alternativamente, um peptídeo alvo acumulado nas células pode ser recuperado. Em um tal caso, células são fisicamente ou quimicamente quebradas e um peptídeo alvo é recuperado por intermédio de uma técnica de purificação de proteína.

[0065] O peptídeo assim obtido pode ser recuperado ou purificado por intermédio de uma técnica convencional, por exemplo, técnicas de cromatografia, tais como cromatografia de filtração em gel, cromatografia em coluna de troca de íon, cromatografia de afinidade, cromatografia em coluna de fase reversa, ou HPLC, fracionamento de sulfato de amônio, ultrafiltração, ou imunoadsorção.

3. Linfócitos T citotóxicos

[0066] Com o uso do peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção, CTLs específicos do peptídeo de epítopo de CTL que danificam células do câncer podem ser obtidos in vitro e/ou ex vivo. Um método para induzir CTL usando um peptídeo de epítopo de CTL in vitro e/ou ex vivo é conhecido (por exemplo, JP 2006-14637 A), e tal técnica pode ser utilizada na presente invenção. Por exemplo, células de adesão à placa nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) derivadas de indivíduos saudáveis ou pacientes com câncer são cultivadas na presença de citocinas, tais como GM-CSF ou IL-4, de modo a induzir células dendríticas (DCs). Depois que as células dendríticas foram pulsadas com o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção, raios X são aplicados a estas, de modo a preparar células apresentadoras de antígeno (estimuladores). Quando DCs não podem ser usadas, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) derivadas de indivíduos saudáveis ou dos mesmos pacientes com câncer podem ser pulsadas com o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção, raios X podem ser aplicados a estas, e os resultantes podem ser usado. Subsequentemente, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) derivadas de indivíduos saudáveis ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) derivadas de pacientes com câncer ou linfócitos nos linfonodos relevantes (isto é, responsores) são adicionadas e depois cultivadas na presença de citocinas, tais como IL- 2, IL-4, ou IL-7. Posteriormente, as células apresentadoras de antígeno obtidas por intermédio da pulsação descrita acima são estimuladas novamente com a adição do peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção e cultivadas ainda na presença de citocinas, tais como IL-2.

[0067] Qualquer meio em que linfócitos T podem sobreviver pode ser usado como um meio de cultura celular usado para indução de CTL. Por exemplo, um meio preparado adicionando-se várias citocinas (por exemplo, IL-2) e soro de bezerro fetal (FCS) ao meio RHAMα (meio LAK descrito em Kawai, K., Sasaki, T., Saijo-Kurita, K., Akaza, H., Koiso, K., e Ohno, T., Cancer Immunol. Immunother., 35, 225 - 229, 1992), meio AIMV (GIBCO BRL, Life Technologies, INC.), ou meio RPMI 1640 podem ser usados.

[0068] A cultura pode ser conduzida sob condições bem conhecidas na técnica. Por exemplo, a temperatura da cultura é em 33 °C a 41 °C, e preferivelmente 37 °C. Um gás inerte contendo ar ou oxigênio de concentração adequada e dióxido de carbono de concentração adequada (por exemplo, 5 % de CO2) para ajustar o pH do meio para cerca de 7,4 pode ser usado como uma fase gasosa. A cultura é preferivelmente conduzida por 4 a 10 dias, e mais preferivelmente 7 dias ou 8 dias. Alguns CTLs induzidos por intermédio de tal cultura são peptídeo de epítopo de CTL específico para cada um de pelo menos três tipos, e preferivelmente quatro tipos de peptídeos de epítopo de CTL entre os quatro tipos de peptídeos de epítopo de CTL que constituem o peptídeo tendo 4 epítopos ligados, e assim eles podem especificamente danificar as células do câncer.

4. Composição farmacêutica

[0069] O peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção pode ser usado como um ingrediente ativo de uma composição farmacêutica usada para imunoterapia contra o câncer.

[0070] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode conter, como um ingrediente ativo, um ou mais dos peptídeos tendo 4 epítopos ligados. Incluindo-se uma pluralidade dos peptídeos tendo 4 epítopos ligados, efeitos mais fortes podem ser esperados. Além disso, a composição farmacêutica resultante pode exercer versatilidade mais alta, de modo que ela possa ser administrada como uma vacina de peptídeo para o câncer a uma faixa mais ampla de pacientes com câncer, não obstante dos tipos de HLA dos pacientes.

[0071] Genes que codificam PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17, e PEP18 incluídos no peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção são observados para serem expressados em uma pluralidade de tipos de cânceres sólidos e cânceres sanguíneos. Exemplos de cânceres sólidos incluem tumor cerebral, câncer pulmonar, câncer de mama, câncer da tireoide, câncer da cérvix uterina, câncer de corpo uterino, câncer ovariano, câncer esofágico, câncer gástrico, tumor estromal gastrointestinal (GIST), câncer pancreático, câncer de cólon, câncer de reto, câncer anal, câncer renal, câncer de fígado, câncer do trato biliar, câncer de cabeça e pescoço, câncer de bexiga, câncer de próstata, melanoma maligno, câncer de pele, câncer lingual, osteossarcoma, condrossarcoma, fibrossarcoma, lipossarcoma, angiossarcoma, rabdomioblastoma, e leiomiossarcoma. Exemplos de cânceres sanguíneos incluem leucemia, linfoma maligno, e mieloma. Consequentemente, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção é útil para o tratamento e/ou prevenção de tais cânceres. O termo "tratamento e/ou prevenção de câncer" usado aqui refere-se à prevenção do desenvolvimento/reincidência de câncer, supressão da progressão/exacerbação do câncer, ou a melhora das condições do câncer.

[0072] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode conter materiais farmaceuticamente aceitáveis, tais como vários portadores orgânicos ou inorgânicos comuns. Exemplos de portadores farmacêuticos que podem ser usados incluem estabilizadores, antibacterianos, tampões, agentes isotolizantes, agentes quelantes, ajustadores de pH, tensoativos, enchedores, espessantes, aglutinantes, umectantes, desintegrantes, agentes ativos de superfície, lubrificantes, agentes suavizantes, diluentes, e excipientes que são geralmente usados de acordo com a forma de administração de preparações farmacêuticas relevantes. Preparações farmacêuticas são preferivelmente preparadas na forma de formulações suplementadas com tais portadores de acordo com técnicas convencionais.

[0073] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode conter um adjuvante que é conhecido como sendo usado no momento da administração da vacina. Exemplos de adjuvantes incluem adjuvante Completo de Freund (CFA), adjuvante Incompleto de Freund (IFA), alume, lipídeo A, monofosforil lipídeo A, preparações bacterianas tais como BCG (Bacillus-Calmette-Guerrin), ácidos nucleicos tais como CpG-DNA e dsRNA, preparações de componentes bacterianos tais como tuberculina, polímeros que ocorrem naturalmente, tais como hemocianina de lapa californiana e manoproteína de levedura, muramil-tripeptídeo, muramil-dipeptídeo, ou um derivado de qualquer um destes, alume, copolímeros em bloco não iônicos, e citocinas tais como interleucina 2 (IL-2), fator estimulante de colônia de granulócito e macrófago (GM-CSF), interferon-α (IFN-α), e interferon-β (IFN-β). Estes adjuvantes podem ser usados sozinhos ou em combinações de dois ou mais. Adjuvantes podem ser administrados simultaneamente com a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção na forma de uma mistura ou como uma emulsão.

[0074] Além do peptídeo tendo 4 epítopos ligados, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode compreender um ou mais de um peptídeo de epítopo de CTL conhecido derivado de moléculas de antígeno tumoral, um peptídeo contendo o mesmo, ou um peptídeo compreendendo os peptídeos de epítopo de CTL ligados um ao outro (daqui em diante, referidos como "peptídeos de epítopo de CTL conhecidos derivados de moléculas de antígeno tumoral"). Exemplos de peptídeos de epítopo de CTL conhecidos derivados de moléculas de antígeno tumoral incluem, mas não são limitados a, WT-1 p126 - 134, WT-1 modificado (M236Y) p235 - 243, NY-ESO-1 p157 - 165, gp100 modificado (T210M) p209 - 217, survivin-2B p80 - 88, Her-2/neu p63 - 71, VEGFR2 p169 - 177, MART-1 p26 - 35, Glypican-3 p298 - 306, e SPARC p143 - 151. Neste caso, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção e os peptídeos de epítopo de CTL conhecidos derivados de moléculas de antígeno tumoral podem ser preparados na forma de uma preparação de agente único. Alternativamente, uma preparação compreendendo, como um ingrediente ativo, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção pode ser separada de uma preparação compreendendo, como um ingrediente ativo, os peptídeos de epítopo de CTL conhecidos derivados de moléculas de antígeno tumoral.

[0075] A forma de dosagem da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser selecionada de acordo com a forma de administração. Exemplos representativos de formas de dosagem incluem, mas não são limitados a, preparações líquidas, emulsões, preparações de lipossoma, emulsões de lipídeo, complexos de inclusão de ciclodextrina, suspensões, unguentos, cremes, agentes transdermicamente absorvidos, agentes transmucosamente absorvidos, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, fármacos em pó, grânulos, grãos finos, e xaropes. De acordo com a via de administração, tais formas de dosagem são classificadas ainda como, por exemplo, preparações orais, preparações parenterais, preparações transnasais, preparações transvaginais, supositórios, formulações sublinguais, inalantes, colírios, ou gotas para ouvidos, e tais preparações podem ser combinadas, moldadas, ou preparadas de acordo com técnicas convencionais. Além da aplicação na forma de preparações líquidas, tal preparação pode ser submetida à liofilização, de modo a tornar a preparação farmacêutica armazenável. Quando tal preparação farmacêutica deve ser usada, ela pode ser dissolvida com a ajuda de, por exemplo, um tampão contendo água e solução salina fisiológica, de modo a ajustar a concentração desta a um nível adequado.

[0076] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode compreender, como um ingrediente ativo, CTLs induzidos in vitro e/ou ex vivo com o uso do peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção. Tal composição farmacêutica está preferivelmente na forma de um agente parenteral.

5. Método de tratamento

[0077] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada a uma faixa ampla de pacientes com câncer, tais como pacientes que são positivo para tipos de HLA selecionados do grupo consistindo em HLA-A2, HLA-A24, HLA-A26, e supertipo HLA-A3, e o tratamento pode ser iniciado sem conduzir a tipificação de HLA antes do tratamento.

[0078] Quando a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é administrada a um paciente com câncer, CTLs específicos para pelo menos três, e preferivelmente quatro tipos de peptídeos de epítopo de CTL que constituem o peptídeo tendo 4 epítopos ligados como um ingrediente ativo da composição farmacêutica podem ser induzidos e/ou ativados. Além disso, a produção de imunoglobulinas específicas para peptídeos de epítopo de CTL relevantes pode ser induzida. O nível de indução de produção de imunoglobulina na administração do peptídeo tendo 4 epítopos ligados como um ingrediente ativo é significantemente mais alto do que o nível de indução de produção de imunoglobulina observada na administração de uma mistura de peptídeos de epítopo de CTL que devem ser contidos no peptídeo tendo 4 epítopos ligados mas não são ligados um ao outro. Consequentemente, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção pode eficazmente tratar e/ou impedir o câncer em um paciente com câncer.

[0079] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada por intermédio de, por exemplo, administração oral, administração intravenosa, administração intra- arterial, administração intramuscular, administração subcutânea, administração intracutânea, administração sublingual, administração intraperitoneal, administração intrarretal, administração transdérmica, administração transmucosa, administração transnasal, administração transvaginal, administração transocular, ou aspiração. Quando preparações compreendendo, como ingrediente ativos, uma pluralidade de peptídeos tendo 4 epítopos ligados ou peptídeos de epítopo de CTL conhecidos derivados de moléculas de antígeno tumoral são preparadas na forma de composições farmacêuticas separadas, tais composições farmacêuticas podem ser administradas simultaneamente ou não simultaneamente por intermédio da mesma via ou por intermédio de vias separadas.

[0080] A dosagem da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser adequadamente ajustada de acordo com fatores tais como as condições/severidade do câncer a ser tratado, a idade do paciente, ou o peso corpóreo do paciente. Por exemplo, uma composição farmacêutica contendo o peptídeo tendo 4 epítopos ligados em uma quantidade de 0,0001 mg a 1000 mg, preferivelmente 0,001 mg a 100 mg, e ainda preferivelmente 0,01 mg a 50 mg, pode ser repetidamente administrada uma vez a cada vários dias, várias semanas, ou vários meses. Quando a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende, como ingredientes ativos, CTLs induzidos in vitro e/ou ex vivo com o uso de o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção, é preferível que 2 x 106 a 2 x 108 CTLs sejam administrados por kg do peso corpóreo todo dia em intervalos de 1 a 2 semanas.

[0081] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada a um paciente com câncer em combinação com produtos farmacêuticos que são geralmente usados para quimioterapia contra o câncer. Exemplos de tais produtos farmacêuticos incluem: agentes alquilantes, tais como ciclofosfamida, temozolomida, e bendamustina; antimetabólitos, tais como tegafur- uracila, tegafur-gimeracil-oteracila potássico, metotrexato, e gencitabina; fármacos contendo platina, tais como cisplatina e oxaliplatina; preparações de alcaloide vegetal, tais como irinotecano, eribulina, paclitaxel, docetaxel, e vincristina; antibióticos carcinostáticos, tais como doxorrubicina, bleomicina, e actinomicina D; fármacos moleculares-alvejados, tais como imatinibe, sunitinibe, gefitinibe, sorafenibe, everolimus, trastuzumabe, bevacizumabe, rituximabe, cetuximabe, panitumumabe, e mogamulizumabe; agentes de terapia hormonal, tais como bicalutamida, estramustina, e exemestano; e agentes imunoestimuladores, tais como lentinan, Picibanil, e Krestin. Tais produtos farmacêuticos podem ser administrados simultaneamente ou não simultaneamente com a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção por intermédio da mesma via ou por intermédio de vias separadas.

[0082] Daqui em diante, a presente invenção é descrita em mais detalhe com referência aos exemplos, embora a presente invenção não seja limitada a estes exemplos.

Exemplos Exemplo 1: Síntese e purificação de peptídeo

[0083] Os peptídeos de epítopo de CTL e os peptídeos tendo 4 epítopos ligados foram sintetizados usando um sintetizador de peptídeo comercialmente disponível (Prelude, Protein Technologies, Inc.) pelo método de síntese de fase sólida (Fmoc). Especificamente, resina Alko- PEG foi deixada adsorver os aminoácidos com grupos ativos protetivos, uma solução de desbloqueio foi injetada nesta, de modo a remover os grupos protetivos, aminoácidos com grupos ativos protetivos foram injetados nesta, e eles foram deixados reagir entre si, de modo a sintetizar os dipeptídeos. Repetindo-se tal procedimento, peptídeos compreendendo sequências de interesse foram sintetizados. Grupos protetivos de peptídeo foram removidos conduzindo-se uma reação em uma solução não protetiva contendo 2,5% de triisopropilsilano, 2,5% de água, e 95% de ácido trifluoroacético por 2 horas. Com a adição de éter frio ao filtrado resultante, peptídeos foram recuperados na forma de precipitados. Os vários peptídeos sintéticos resultantes foram purificados usando a coluna C18 YMC-Pack Pro (YMC Co., Ltd.) e o sistema de HPLC (Gilson) com uma solução aquosa de 0,1% de TFA e acetonitrila como uma fase móvel. Depois do processo final de purificação, a pureza e o peso molecular dos peptídeos foram analisados pelos sistemas de LC-MS (Waters Acquity UPLC system, micromass ZQ). Os peptídeos foram liofilizados, armazenados em temperatura fria no escuro, e depois submetidos aos exemplos descritos abaixo. As Tabelas 1-1 a 1-8 mostram os dados espectrais de MS dos peptídeos tendo 4 epítopos ligados (TPV01 a TPV45). As Figuras 1-1 a 1-7 mostram os dados de LC de TPV06, TPV10, TPV12, TPV21, TPV26, TPV30, TPV35, TPV37, TPV39, TPV40, TPV41, TPV43, e TPV45. As Figuras 2-1 a 2-3 mostram os dados de MS de TPV39, TPV40, TPV41, TPV43, e TPV45. Tabela 1-1 Dados de MS Tabela 1-2 Tabela 1-3 Tabela 1-4 Tabela 1-5 Tabela 1-6 Tabela 1-7 Tabela 1-8 "ND" indica "não detectado"

[0084] A Tabela 2 mostra as sequências de aminoácido dos peptídeos de epítopo de CTL sintetizados, e as Tabelas 3 e 4 mostram as sequências de aminoácido dos peptídeos tendo 4 epítopos ligados. Os peptídeos tendo 4 epítopos ligados mostrados na tabela 4 são todos preparados por, em TPV12, TPV06, e TPV26 mostrados nas tabelas 3, adicionando uma sequência de peptídeo consistindo em resíduos de arginina ao N-terminal, e usando um trímero de arginina como um ligante entre peptídeos.

[0085] WT1 (SEQ ID NO: 20) foi sintetizado como um peptídeo de controle que liga-se a HLA-A2 e Her2 (SEQ ID NO: 21) foi sintetizado como um peptídeo de controle que liga-se a HLA-A24. Tabela 2 Peptídeos de epítopo de CTL Tabela 3 Tabela 4 "RRR-" e "RRRR-" são sequências de peptídeo adicionadas aos términos N, que compreendem 3 resíduos de arginina e 4 resíduos de arginina, respectivamente.

Exemplo 2: Induções de CTLs específicos de peptídeo de epítopo em modelo de camundongo e detecção de CTLs usando ELISPOT

[0086] Os peptídeos tendo 4 epítopos ligados foram dissolvidos em água destilada (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) em 2 mg/mL ou 4 mg/mL, e a solução resultante foi enchida na seringa B Braun Injekt. Depois que a quantidade equivalente de adjuvante Incompleto de Freund (IFA) foi enchida em uma outra seringa, estas seringas foram conectadas uma à outra usando um conector de seringa GP, e uma solução dos peptídeos tendo 4 epítopos ligados foi completamente misturada com IFA para preparar uma emulsão. A emulsão foi semanalmente administradas em quantidades de 100 μL cada na proximidade da base da cauda dos camundongos (camundongos transgênicos HLA-A2,1 e transgênicos HLA-A24 (Taconic)), e as administrações foram realizadas duas vezes no total. Linfonodos inguinais foram corrigidos dos camundongos 1 semana depois da administração final. Uma suspensão celular de linfonodo foi ajustada para 5 x 106 células/mL usando Meio Completo (RPMI-1640, 10% de FBS inativada por calor, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, e 50 μM de 2-mercaptoethanol), o peptídeo-alvo de epítopo de CTL (concentração final: 10 μg/ml), IL-15 de camundongo recombinante (concentração final: 100 ng/mL), e IL-21 de camundongo recombinante (concentração final: 100 ng/mL) foram adicionados, estas células foram semeadas sobre uma placa de 24 reservatórios em 1 ml/reservatório, e foram cultivadas em uma incubadora a 37 °C, 5 % de CO2 por 8 dias. Posteriormente, as células foram coletadas e semeadas em uma placa imobilizada de anticorpo anti-IFN-Y incluída no kit ELISpot de IFN—Y de Murino (GEN-PROBE) em 1 x 105 células/reservatório. Subsequentemente, esplenócitos obtidos do baço de camundongo singênico e irradiados com Raios X 30-Gy foram plaqueados na mesma placa em 1 x 105 células/reservatório como células apresentadoras de antígeno, o peptídeo-alvo de epítopo de CTL ou o peptídeo de controle negativo (concentração final: 10 μg/mL) foram adicionados, e incubados em uma incubadora a 37 °C, 5 % de CO2 durante a noite. No dia seguinte, pontos que indicam a existência de células produtoras de IFN- Y foram coloridos de acordo com as instruções do fabricante. O número de pontos de célula produtora de IFN-y foi quantificado usando um analisador ELISPOT (Immunospot S6, Cellular Technology Ltd.). A indução de CLT específico de peptídeo de epítopo de CTL foi avaliada como positiva quando o número de pontos de célula produtora de IFN- Y nos reservatórios suplementados com os peptídeos alvos de epítopo de CTL foi significantemente mais alto do que aquele observado nos reservatórios suplementados com os peptídeos de controle negativo (teste t de Student, p < 0,05). WT1 ou Her2 foi usado como o peptídeo de controle negativo. De modo a visualizar o nível de indução de CTL, os resultados da equação seguinte foram designados como "Δ" (o número médio de pontos de célula produtora de IFN-Y em reservatórios suplementados com os peptídeos alvos de epítopo de CTL) - (o número médio de pontos de célula produtora de IFN-Y em reservatórios suplementados com os peptídeos de controle negativo). Os resultados são reapresentados como positivos no caso de 10 < Δ < 100; meio positivo no caso de 100 < Δ < 200; e fortemente positivo no caso de 200 < Δ.

[0087] As Figuras 3-1 a 3-4 mostram os resultados de avaliação da indução de CTL específica de peptídeo de epítopo de CTL. Quando o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção tem uma ou mais características selecionadas dentre as características <1> a <3> abaixo, como mostrado nas Figuras 3-1 a 3-4, pelo menos 3 tipos de CTLs dos 4 tipos de peptídeos de epítopo de CTL ligados foram induzidos. < 1> O peptídeo compreende PEP4 no C-terminal. < 2> O peptídeo compreende PEP6 e PEP5 no C-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir do N-terminal por intermédio de um ligante. < 3> O peptídeo compreende PEP5, PEP6, PEP9, e PEP18.

[0088] Quando uma sequência de peptídeo consistindo em resíduos de arginina foi adicionada ainda ao N-terminal ou quando um ligante de peptídeo-peptídeo foi um trímero de arginina, como mostrado na Fig. 3-4, CTL foi satisfatoriamente induzido como descrito acima.

[0089] No caso de peptídeos tendo 4 epítopos ligados tendo a ordem de ligação mostrada em CPV01 a CPV16, entretanto, a indução de CTL não foi observada em três ou mais peptídeos, como mostrado nas Figuras 3-1 a 3-3.

[0090] Especificamente, mesmo se os peptídeos tendo 4 epítopos de CLP ligados fossem compostos de 4 tipos de peptídeos de epítopo selecionados de 13 tipos particulares de peptídeos de epítopo (PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17, e PEP18) (isto é, CPV14, CPV15, e CPV16), a indução de CTL não foi observada em três ou mais peptídeos nos peptídeos tendo 4 epítopos de CLP ligados.

Exemplo 3: Prognóstico da posição de clivagem de peptídeo com imunoproteassomas 20S humanos (i20S)

[0091] Amostras de clivagem de peptídeos tendo 4 epítopos ligados foram preparadas na maneira descrita abaixo. Especificamente, peptídeos tendo 4 epítopos ligados foram diluídos a 66,7 μg/mL com um tampão de reação (20 mM de HEPES-KOH, pH 7,8, 2 mM de MgAc2, 2 mM de ditiotreitol), e o resultante foi dispensado em tubos de reação em quantidades de 300 μL por tubo. Imunoproteassomas 20S humanos (R&D systems) foram adicionados a este em quantidades de 2 μg por tubo, as misturas foram agitadas, e os resultantes foram depois submetidos à incubação com agitação a 37°C por 1, 2, ou 4 horas. Posteriormente, ácido acético foi adicionado em quantidades de 30 μL por tubo, de modo a terminar as reações enzimáticas, e as amostras foram liofilizadas em um congelador a -80°C imediatamente.

[0092] Subsequentemente, as amostras de clivagem obtidas dos peptídeos tendo 4 epítopos ligados foram aplicadas aos sistemas de LC/MS-MS (Acquity UPLC system, Waters; Synapt G2 HDMS, Waters), de modo a realizar a análise abrangente dos pesos moleculares dos fragmentos de peptídeo. Com o uso de programa analítico (MassLynx, ver. 4.1, SCN712, Waters), as amostras foram analisadas, e os fragmentos de peptídeo foram identificados. Os peptídeos tendo 4 epítopos ligados foram avaliados como sendo cliváveis durante o desenvolvimento de qualquer um de um peptídeo em que o peptídeo de epítopo foi clivado, um peptídeo compreendendo resíduos de arginina adicionados ao N-terminal do peptídeo de epítopo, ou um peptídeo compreendendo um dímero de arginina adicionado ao N-terminal do peptídeo de epítopo, como um resultado da clivagem com imunoproteassomas.

[0093] Os resultados de análise conduzidos com o uso dos imunoproteassomas mostrados nas Figuras 3-1 a 3-4 demonstram que dois tipos de peptídeos de epítopo de CTL, PEP2 e PEP10, são necessários estar localizados nas posições mais próximas ao C- terminal do peptídeo tendo 4 epítopos ligados, de modo a determinar os aminoácidos C terminais dos peptídeos de epítopo de CTL de interesse. Consequentemente, é preferível que PEP2 ou PEP10 seja ligado ao C- terminal do peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção.

Exemplo 4: Preparação de contas imobilizadas de peptídeo de epítopo de CTL

[0094] Peptídeos foram imobilizados sobre Microesferas de COOH xMAP Multi-Analyte (Luminex Corporation; daqui em diante referida como "contas") na maneira descrita abaixo. As contas foram lavadas com tampão de MES (MES-NaOH 0,1 M; pH 7,0), e o sobrenadante depois foi removido por centrifugação. Este processo de lavagem foi repetido duas vezes e as contas foram depois colocadas em suspensão em 75 μL de um tampão de MES. Uma solução de peptídeo de epítopo de CTL (100 μL, 1 mg/mL) e 5 μL de EDC a 10 mg/mL (cloridreto de 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) foram adicionados à suspensão de pérola, seguido por mistura completa. Posteriormente, a reação foi realizada a 30°C no escuro durante a noite. Depois da remoção do sobrenadante por centrifugação no dia seguinte, 125 μL de Tris-HCl 1 M foram adicionados, e a incubação foi realizada a 30°C no escuro por 30 minutos. Depois que o sobrenadante foi removido novamente, as contas foram lavadas duas vezes com um tampão de lavagem (PBS(-), 0,05% de Tween 20) e foram colocadas em suspensão em Immunoblock (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Assim, a imobilização do peptídeo de epítopo de CTL foi concluída.

Exemplo 5: Medição de título de anticorpo de IgG específico de epítopo de CTL

[0095] Os peptídeos tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção foram dissolvidos em água destilada (Otsuka Phar-maceutical Factory Inc.) em 2 mg/mL, e a solução resultante foi enchida em uma seringa B Braun Injekt. Depois que a quantidade equivalente de IFA foi enchida em uma outra seringa, estas seringas foram conectadas uma à outra usando um conector de seringa GP, e uma solução dos peptídeos tendo 4 epítopos ligados foi completamente misturada com IFA para preparar uma emulsão. A emulsão foi semanalmente administrada em quantidades de 100 μL cada na proximidade da base da cauda de camundongos CBF1 (C57BL/6xBalb/c F1), e a administração foi realizada três vezes no total. O sangue foi coletado dos camundongos 1 semana depois da administração final para obter amostras de soro. Como amostras de controle, emulsões foram preparadas usando misturas de 4 tipos de peptídeos selecionados dentre PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, e PEP18 (1 mg/mL cada), e as emulsões resultantes foram administradas de acordo com o mesmo programa como com o peptídeo tendo 4 epítopos ligados (o grupo administrado com mistura).

[0096] As contas imobilizadas de peptídeo de epítopo de CTL diluídas com Immunoblock foram dispensadas em reservatórios de uma placa de filtro de 96 reservatórios. As contas dispensadas foram lavadas com um tampão de lavagem, e, subsequentemente, 100 μL de amostras de soro de camundongo diluídas 200 vezes com Immunoblock foram adicionados em cada um dos reservatórios. A placa foi incubada por 90 minutos a 30°C com mistura a 600 rpm. Depois das três vezes de lavagem de placa com um tampão de lavagem, 100 μL de anti-IgG de camundongo biotinilado (H+L) (Vector Laboratories) diluído 500 vezes com Immunoblock foram adicionados em cada reservatório, e a placa foi incubada por 60 minutos a 30°C com mistura a 600 rpm. Depois das três vezes de lavagem de com um tampão de lavagem, 100 μL de conjugado de estreptavidina-R-ficoeritrina (Invitrogen) diluído 500 vezes com Immunoblock foram adicionados em cada reservatório, e a placa foi incubada por 30 minutos a 30 °C com mistura a 600 rpm. Depois das três vezes de lavagem de placa com um tampão de lavagem, 100 μL de um tampão de lavagem foram adicionados em cada reservatório para colocar em suspensão as contas, e a intensidade de fluorescência média de PE que especificamente ligou-se a contas relevantes foi medida usando o Bio-Plex Suspension Array System (BIO-RAD).

[0097] Os resultados de medição do título de anticorpo de IgG específico de epítopo de CTL são como mostrados nas Figuras 4-1 a 43. As Figuras 4-1 a 4-3 mostram o grau da produção de anticorpo de IgG específico de epítopo de CTL comparado com aquele dos camundongos do grupo de controle negativo (daqui em diante abreviado como o "grupo IFA"). Os resultados obtidos do grupo IFA ao qual uma emulsão preparada misturando-se quantidades equivalentes de IFA e água destilada (Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.) foi administrada foram comparados com os resultados obtidos de acordo com o mesmo programa de tratamento como aquele da mistura de peptídeo de epítopo de CTL ou do peptídeo tendo 4 epítopos ligados.

[0098] Como mostrado nas Figuras 4-1 a 4-3, a indução da produção de anticorpo de IgG específico de epítopo de CTL foi fraca e a frequência desta foi baixa no grupo de mistura-misturado. Quando o peptídeo tendo 4 epítopos ligados foi administrado, ao contrário, indução forte de produção de anticorpo de IgG específico de epítopo de CTL foi observada frequentemente. Além disso, a quantidade de produção de IgG foi descoberta ser significantemente mais alta (por exemplo, várias dezenas de vezes a várias centenas de vezes mais alta do que aquela observada no grupo IFA) dependendo do tipo do peptídeo tendo 4 epítopos ligados administrados.

[0099] Estes resultados demonstram que a administração do peptídeo tendo 4 epítopos ligados pode ativar mais fortemente a imunidade antitumoral do que a administração de uma mistura de peptídeos de epítopo de CTL que constituem o peptídeo tendo 4 epítopos ligados.

[00100] Para um paciente com câncer que foi tratado com uma vacina de peptídeo para o câncer, a indução da produção de IgG específica de peptídeo de epítopo de CTL e a indução de CTL específico de peptídeo de epítopo são ambas eficazes para o prolongamento da vida. Consequentemente, os efeitos de prolongamento da vida obtidos pela presente invenção são superiores àqueles obtidos por tratamento contra o câncer usando vacinas de peptídeo compreendendo peptídeos de epítopo de CTL conhecidos ou misturas destes. Portanto, o peptídeo tendo 4 epítopos ligados de acordo com a presente invenção pode ser adequadamente usado como um agente terapêutico e/ou preventivo para cânceres ou doenças causadas desse modo e vacinas de peptídeo para o câncer que podem fornecer efeitos de tratamento superiores comparado com o tratamento contra o câncer usando vacinas de peptídeo compreendendo peptídeos de epítopo de CTL conhecidos ou misturas destes.

[00101] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patente citados aqui são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

Claims (14)

1. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, caracterizado pelo fato de que os 4 peptídeos de epítopo são selecionados do grupo que consiste em peptídeos de epítopo de CTL: o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 1 (PEP1); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 2 (PEP2); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 4 (PEP4); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 5 (PEP5); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 6 (PEP6); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 7 (PEP7); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 8 (PEP8); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 9 (PEP9); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 10 (PEP10); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 13 (PEP13); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 15 (PEP15); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 17 (PEP17); e o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 18 (PEP18), ligado por intermédio de ligantes, e o peptídeo consistindo em 4 epítopos ligados tem uma ou mais características selecionadas das características (1) a (5) abaixo: (1) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopos de CTL selecionados entre PEP1, PEP7, PEP8 e PEP13, e em que PEP2 está disposto no C-terminal do peptídeo, exceto para o peptídeo compreendendo PEP7 e PEP8 no N-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir de o N-terminal por meio de um ligante; (2) o peptídeo compreende PEP4 no C-terminal; (3) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopos de CTL selecionados de PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 e PEP18, e em que PEP10 está disposto no C-terminal do peptídeo; (4) o peptídeo compreende 2 peptídeos de epítopo de CTL, PEP1 e PEP7, e em que PEP6 e PEP5 estão sucessivamente dispostos no C-terminal em tal ordem a partir do N-terminal através de um ligante ; e (5) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopos de CTL, PEP5, PEP6 e PEP18, e em que PEP9 está disposto no C-terminal do peptídeo.

2. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, caracterizado pelo fato de que os 4 peptídeos de epítopo são selecionados do grupo que consiste em peptídeos de epítopo de CTL: o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 1 (PEP1); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 2 (PEP2); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 4 (PEP4); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 5 (PEP5); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 6 (PEP6); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 7 (PEP7); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 8 (PEP8); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 9 (PEP9); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 10 (PEP10); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 13 (PEP13); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 15 (PEP15); o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 17 (PEP17); e o peptídeo como mostrado na SEQ ID NO: 18 (PEP18), ligado por intermédio de ligantes, e o peptídeo consistindo em 4 epítopos ligados tem uma ou mais características selecionadas das características (1) a (5) abaixo: (1) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopos de CTL selecionados entre PEP1, PEP7, PEP8 e PEP13, e em que PEP2 está disposto no C-terminal do peptídeo, exceto para o peptídeo compreendendo PEP7 e PEP8 no N-terminal sucessivamente disposto em tal ordem a partir de o N-terminal por meio de um ligante; (2) o peptídeo compreende PEP4 no C-terminal; (3) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopos de CTL selecionados de PEP1, PEP13, PEP15, PEP17 e PEP18, e em que PEP10 está disposto no C-terminal do peptídeo; (4) o peptídeo compreende 2 peptídeos de epítopo de CTL, PEP1 e PEP7, e em que PEP6 e PEP5 estão sucessivamente dispostos no C-terminal em tal ordem a partir do N-terminal através de um ligante ; e (5) o peptídeo compreende 3 peptídeos de epítopos de CTL, PEP5, PEP6 e PEP18, e em que PEP9 está disposto no C-terminal do peptídeo, e em que o peptídeo consistindo em 4 epítopos ligados compreende ainda outra sequência peptídica consistindo em aminoácidos hidrofílicos, que está ligada ao N-terminal e em que a referida outra sequência peptídica consistindo em aminoácidos hidrofílicos é composta por um trímero de arginina ou tetrâmero de arginina composto por três ou quatro resíduos de arginina ligados entre si.

3. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os referidos 4 epítopos ligados são selecionados redundantemente a partir do grupo que consiste em PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17, e PEP18.

4. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende 4 peptídeos não redundantes selecionados dentre PEP1, PEP2, PEP4, PEP5, PEP6, PEP7, PEP8, PEP9, PEP10, PEP13, PEP15, PEP17 e PEP18.

5. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência selecionada das sequências seguintes, em que "-(L)-" representa um ligante: - PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP4; - PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP6-(L)-PEP4; - PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP4; - PEP6-(L)-PEP9-(L)-PEP5-(L)-PEP4; - PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP4; - PEP5-(L)-PEP9-(L)-PEP6-(L)-PEP4; - PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP7-(L)-PEP8-(L)-PEP2; - PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP13-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP8-(L)-PEP7-(L)-PEP2; - PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP18-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP1-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP18-(L)-PEP15-(L)-PEP1-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP10; - PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP13-(L)-PEP10; - PEP17-(L)-PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP17-(L)-PEP15-(L)-PEP10; - PEP13-(L)-PEP15-(L)-PEP17-(L)-PEP10; - PEP6-(L)-PEP18-(L)-PEP5-(L)-PEP9; - PEP6-(L)-PEP5-(L)-PEP18-(L)-PEP9; - PEP1-(L)-PEP7-(L)-PEP6-(L)-PEP5; e - PEP7-(L)-PEP1-(L)-PEP6-(L)-PEP5.

6. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante de aminoácido.

7. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ligante de aminoácido é um dímero de arginina ou trímero de argi- nina composto de dois ou três resíduos de arginina ligados um ao outro.

8. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, ou SEQ ID NO: 66.

9. Composição de CTL, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 3 tipos de CTLs obtidos estimulando-se linfócitos do sangue periférico usando o peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que cada um dos pelo menos 3 tipos de CTLs é específico para um peptídeo de epítopo de CTL que constitui o peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados.

10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende, como um ingrediente ativo, o peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou a composição de CTLs, como definida na reivindicação 9, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende dois ou mais peptídeos selecionados dentre os pep- tídeos que consistem em 4 epítopos ligados, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.

12. Peptídeo que consiste em 4 epítopos ligados, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

13. Composição de CTLs, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.

14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer.