CN102757492A - 全人乙肝表面蛋白单克隆抗体及其在制备预防hbv感染药物中的用途 - Google Patents

全人乙肝表面蛋白单克隆抗体及其在制备预防hbv感染药物中的用途 Download PDF

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郭亚军
戴建新
李博华
樊克兴
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Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4和全人乙肝表面蛋白单克隆抗体C9G9，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。本发明还公开了上述两种抗体在制备预防HBV感染药物中的用途。

Description

全人乙肝表面蛋白单克隆抗体及其在制备预防HBV感染药物中的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了全人乙肝表面蛋白单克隆抗体制备预防HBV感染中的用途。
背景技术
乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)是双链DNA病毒，引起慢性乙型肝炎，而导致肝硬化和肝癌的发生。全球大约有三亿五千万HBV感染者，而这也成为世界公共健康问题。最近几十年，乙肝疫苗的研制成功，给乙肝的预防带来了很大的希望。然而，确有少部分人接种乙肝疫苗却不能激发免疫系统产生抗乙肝抗体，这一部分人群一旦接触到乙肝的高危因素，只能注射人乙肝免疫球蛋白来预防。但人免疫球蛋白成分相对复杂，使用的危险因素相对不确定性，限制了人乙肝免疫球蛋白的使用。因此迫切需要开发一种人源的，危险因素相对可控的生物制品替代人乙肝免疫球蛋白。
发明内容
本发明公开了一种全人乙肝表面蛋白(HBsAg)单克隆抗体A2E2，C9G9，其抗体序列是来源于人体单个B细胞，其中抗体A2E2重链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，抗体A2E2轻链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4其中抗体C9G9重链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，抗体A2E2轻链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，抗体在体外有良好的针对乙肝病毒(HBV)的中和保护活性。
本发明还公开了全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，C969的制备方法及体外中和活性的鉴定。具体地，分离乙肝疫苗接种志愿者外周血PBMC，荧光标记的抗原和抗体CD19，IgG(？)，HBSAg染色，利用流式细胞术分选HBSAg特异性B细胞(CD19+IgG+HBSAg+)制备成单细胞。单细胞RT-PCR技术克隆抗体κ链和H链可变区序列。PCR产物测序后，抗体κ链和H链可变区基因分别克隆入IgG-AbVec质粒和Igκ-AbVec质粒，并在CHO细胞系中表达得到全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，C9G9。
抗体中和作用测定的步骤为HBV(2X104copy)抗体分别与cIg，A2E2，C969，HBIG(lug)预孵育1h，然后加入培养好的HepaRG细胞系(培养基中含4％PEG8000)过夜培养，次日洗三次，换新鲜的培养基。在第2，4，6天检测HBV-DNA和HBsAg。HBV-DNA检测使用SMITEST kit(GenomeScience Laboratories，Tokyo，Japan)。HBsAg测定收集培养上清，用ELISA kit(R&D)检测。
抗体中和作用测定结果表明，本发明公开的全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，C9G9在体外能有效地阻断HBV的复制，因此具有良好的中和乙肝病毒的能力，可作为预防HBV感染药物。
附图说明
图1，流式CD19+IgG+HBsAg B cell分析
图2，单细胞RT-PCR抗体H，K链PCR扩增
图3，抗体表达质粒图谱
图4，全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，C9G9与HBsAg特异性结合曲线
图5，抗体保护HepaRG细胞免受HBV感染
具体实施方式
以下结合实施例、实验例进一步对本发明进行说明，这些实施例、实验例不应理解为对本发明的限制。
实施例1 HBSAg特异性单个B细胞的制备
具体地，分离乙肝疫苗接种志愿者外周血PBMC，荧光标记的抗原和抗体CD19，IgG，HBSAg染色，利用流式细胞术分选HBSAg特异性B细胞(CD19+IgG+HBSAg+)制备成单细胞。(图1)
实施例2 单细胞RT-PCR技术克隆抗体κ链和H链可变区序列。
(Thomas Tller(2008)Efficient generation of monoclonal antibodies from singlehuman B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.Journal ofImmunological Methods 329：112-124)。PCR产物测序后，抗体κ链和H链可变区基因分别克隆入IgG-AbVec质粒和Igκ-AbVec质粒，并在CHO细胞系中表达(图2，图3)。其中抗体A2E2重链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，抗体A2E2轻链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4其中抗体C9G9重链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，抗体A2E2轻链可变区核苷酸序列、氨基酸序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8.
实施例3 抗体中和作用测定
HBV(2X104copy)抗体分别与cIg，A2E2，C9G9，HBIG(lug)预孵育1h，人后加入培养好的HepaRG细胞系(培养基中含4％PEG8000)过夜培养，次日洗三次，换新鲜的培养基。在第2，4，6天检测HBV-DNA和HBsAg。HBV-DNA检测使用SMITEST kit(Genome Science Laboratories，Tokyo，Japan)。HBsAg测定收集培养上清，用ELISA kit(R&D)检测。(图4，图5)
Figure ISA00000482121900011
Figure ISA00000482121900021
Figure ISA00000482121900041

Claims (4)

1.一种全人乙肝表面蛋白单克隆抗体A2E2，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2和SEQID NO：4。
2.一种全人乙肝表面蛋白单克隆抗体C9G9，其重链、轻链可变区氨基酸序列分别为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。
3.权利要求1或2任一所述的全人乙肝表面蛋白单克隆抗体的制备方法，包括分离乙肝疫苗接种志愿者外周血PBMC，利用流式细胞术分选HBSAg特异性B细胞制备成单细胞；单细胞RT-PCR技术克隆抗体κ链和H链可变区序列，PCR产物测序后，抗体κ链和H链可变区基因分别克隆入IgG-AbVec质粒和Igκ-AbVec质粒，并在CHO细胞系中表达得到。
4.权利要求1或2任一所述的全人乙肝表面蛋白单克隆抗体在制备预防HBV感染药物中的用途。
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