CN104830902A - 单克隆抗体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法及其应用，所述制备方法包括以下步骤：步骤一，B细胞的获取、富集与纯化；步骤二，标记抗原与特异性B细胞的结合；步骤三，抗原特异性B细胞的获取；步骤四，扩增抗体可变区基因；步骤五，构建表达载体；步骤六，重组抗体表达与纯化：以纯化后的表达载体DNA转染对数生长期的293T细胞，离心除去细胞碎片，离心液采用蛋白G柱纯化，获得重组单克隆抗体溶液。本发明获得的重组单克隆抗体浓度升高显著，降低了成本，适合工业上的大规模生产应用。本发明获得的单克隆抗体能够特异性中和丙型肝炎E1抗原，可以用于制备预防和治疗丙型肝炎的药物。

Description

单克隆抗体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种单克隆抗体的制备方法及应用。

背景技术

抗体的主要功能是与抗原(包括外来的和自身的)相结合，从而有效地清除侵入机体内的微生物、寄生虫等异物，尤其是单克隆抗体，由于其高度均一、针对某一特定抗原表位，因此，广泛用于免疫学分析、放射免疫显像和免疫导向治疗等领域。

单克隆抗体的发展经历了四个阶段，分别为：鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。

鼠源性单克隆抗体：鼠杂交瘤单克隆抗体主要是将来源于免疫接种过的小鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，继而筛选出既能无限增殖又能分泌抗体的鼠杂交融合细胞，进而进行筛选、抗体制备和抗体纯化。

嵌合性单克隆抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)等。

人源化单克隆抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段(互补决定区，CDR)与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。

全人源单克隆抗体：其抗体的可变区和恒定区都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。全人源抗体制备的相关技术主要有：人杂交瘤技术、EBV转化B淋巴细胞技术、噬菌体显示技术、转基因小鼠抗体制备技术和单个B细胞抗体制备技术等。

由人源化和全人源抗体制备的人源化和全人源抗体药物因其具有高亲和力、高特异性、毒副作用小的特点，克服了动物源抗体及嵌合抗体的各种缺点，已经成为了治疗性抗体药物发展的必然趋势。

CN103045607A(公开日为2013年04月17日)公开了一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)传染病病原体抗原的制备：以常规方法在真核或原核细胞中生产并纯化重组传染病病原体抗原蛋白；(2)抗体的标记：将上步纯化的重组传染病病原体抗原蛋白以荧光或生物素标记；(3)B细胞的获取、富集与纯化：从传染病患者或疫苗免疫者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；(4)标记抗原与特异性B细胞的结合：将步骤(2)中标记的重组传染病病原体抗原蛋白与步骤(3)中的B细胞进行特异性结合；(5)抗原特异性B细胞的获取：根据标记，以流式细胞仪筛选、分离出上步中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；(6)扩增抗体可变区基因：采用特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；(7)构建表达载体：将上步所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA；(8)重组抗体表达与纯化：以上步纯化后的表达载体DNA转染真核细胞，培养使其获得表达后经分离纯化得重组抗体。

虽然上述现有技术公开了一些传染病病原体全人源化抗体的制备方法，能够满足一定的需要，但这些仍存在一定的缺陷：获得的重组抗体浓度偏低，成本高，不适合工业上的大规模生产应用。

因此，对于传染病病原体全人源化单克隆抗体存在进一步的优化需求，这也是该技术领域内的研究热点和重点之一，更是本发明得以完成的动力和出发点所在。

发明内容

为了克服现有技术存在的传染病病原体全人源化单克隆抗体浓度偏低的技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，从而完成了本发明。

本发明涉及两个方面，具体而言，涉及一种单克隆抗体的制备方法及应用。

第一方面，本发明涉及一种单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，B细胞的获取、富集与纯化：从传染病患者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；

步骤二，标记抗原与特异性B细胞的结合：将以荧光或生物素标记标记的传染病病原体抗原蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合；

步骤三，抗原特异性B细胞的获取：根据标记，以流式细胞仪筛选分离出上一步骤中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；

步骤四，扩增抗体可变区基因：采用特异性的混合引物，应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；

步骤五，构建表达载体：将上一步骤所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，成功连接后转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA；

步骤六，重组抗体表达与纯化：以纯化后的表达载体DNA转染对数生长期的293T细胞，离心除去细胞碎片，离心液采用蛋白G柱纯化，装柱后用两轮PBS洗涤，用0.3-0.45mol/L的柠檬酸钠溶液洗脱，获得重组抗体溶液。

优选的，所述柠檬酸钠的浓度为0.33-0.40mol/L。

进一步优选的，所述柠檬酸钠的浓度为0.37mol/L。

第二方面，本发明涉及上述单克隆抗体在特异性中和丙型肝炎E1抗原方面的应用，比如制备预防和治疗丙型肝炎的药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的重组抗体溶液的重组抗体浓度为376ng/mL，而CN103045607A中经过实际检测为198ng/mL，本发明的重组抗体浓度升高显著，降低了成本，适合工业上的大规模生产应用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

下述实施例涉及丙型肝炎病毒E1蛋白人源单克隆抗体的制备，由如下步骤组成：

步骤一，丙型肝炎病毒E1蛋白是病毒的主要保护性抗原，针对E1蛋白的中和性单克隆抗体可用于丙型肝炎和肝癌患者的治疗，筛选克隆丙肝病毒E1中和性单克隆抗体具有重大的临床应用价值；首先挑选了23个丙型肝炎康复患者用于筛选中和单克隆抗体，经过对这23个丙型肝炎患者血清中和抗体的筛选，其中的一例患者的血清试验证明可以中和97％以上的中国丙型肝炎1b和2a的假病毒株，最终确定从这例患者中筛选丙型肝炎病毒高度保守的中和抗体，于是从这例患者的外周血采用密度梯度离心分离纯化单核细胞；

步骤二，重组E1抗原蛋白在真核或原核细胞中采用常规方法生产纯化，纯化后的E1抗原蛋白直接耦合到荧光素异硫氰酸酯(FITC)，之后在低温下与B细胞特异性的结合，最后以流式细胞仪分离单个标记的B细胞于96孔板中；

步骤三，RT-PCR扩增重链和轻链的可变区基因：cDNA合成在96孔板15ul反应体系中进行，采用150纳克的随机六聚体引物，0.5微升的10mM的dNTP混合物，及50U逆转录酶，反转录反应在42℃下进行10分钟，25℃下为10分钟，50℃60分钟，最后94℃5分钟；IgH，Igλ和Igκ轻链可变区基因采用巢式PCR分别扩增，PCR反应在96孔板50微升体系中，每孔含20nM的每个引物或引物组合(所用系列引物参见专利文献CN103045607A中的表1所示)，300nM dNTP和1.2U HotStar Taq DNA聚合酶，巢式PCR扩增45个循环，94℃30秒，59℃30秒，72℃下为55秒；

步骤四，进行人源抗体瞬时表达载体的构建：在克隆之前，PCR产物首先采用PCR纯化试剂盒进行纯化，之后采用相应的限制性内切酶消化，之后克隆入含有多克隆位点的Igγ，Igκ或Igλ轻链的恒定区的载体中，连接反应的总体积为10微升，含1U T4DNA连接酶、7.5微升纯化的PCR产物和25ng的线性化载体；成功连接后转化活化的大肠杆菌株，正确克隆的鉴定采用PCR扩增法，根据预期片段大小确定克隆的成功与否，含有正确克隆的细菌在培养液中培养16小时，离心收集细菌采用质粒DNA纯化试剂盒纯化DNA；

步骤五，重组抗体的高效表达与纯化：采用磷酸钙共沉淀法瞬时转染对数生长期的293T细胞，20微克的表达载体DNA与CaCl₂混合至终浓度250mM，孵育室温下搅拌10分钟，之后沉淀混合物均匀地分布于培养皿中，12小时后，用10ml无血清DMEM洗涤细胞，然后收集上清液，并用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析重组抗体的抗原特异性，离心除去细胞碎片，重组抗体采用蛋白G珠纯化，每25毫升细胞培养上清液中加入25μl蛋白G珠，在4℃的条件下旋转14小时，离心后去除上清液，将蛋白G珠装柱后用两轮PBS洗涤，用0.37mol/L的柠檬酸钠洗脱重组抗体，之后采用ELISA方法测定重组抗体的浓度，其浓度为376ng/mL(CN103045607A中的制备方法获得的重组抗体经过相同方法检测为198ng/mL)。另外，经病毒中和活性实验测定，本发明方法获得的单克隆抗体中和谱与同一丙肝病人血清的一致，证明本发明获得的单克隆抗体能够特异性中和丙型肝炎E1抗原，因此，本发明获得的单克隆抗体可以用于制备预防和治疗丙型肝炎的药物。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (4)

1.一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一，B细胞的获取、富集与纯化：从传染病患者外周血分离单核的B细胞，采用密度梯度离心纯化；

步骤二，标记抗原与特异性B细胞的结合：将以荧光或生物素标记的传染病病原体抗原蛋白与步骤一中的B细胞进行特异性结合；

步骤三，抗原特异性B细胞的获取：根据标记，以流式细胞仪筛选分离出上一步骤中抗原特异性的单个B细胞，即单个标记的B细胞；

步骤四，扩增抗体可变区基因：应用单细胞巢式RT-PCR从所述单个标记的B细胞中克隆轻链和重链的可变区基因；

步骤五，构建表达载体：将上一步骤所克隆的轻链和重链可变区基因插入包含人轻链和重链恒定区基因的载体，构建人源抗体真核高效表达载体，再转化活化的大肠杆菌株，培养含有正确克隆的细菌，离心收集细菌并采用质粒DNA纯化试剂盒纯化表达载体DNA；

步骤六，重组抗体表达与纯化：以纯化后的表达载体DNA转染对数生长期的293T细胞，离心除去细胞碎片，离心液采用蛋白G柱纯化，装柱后用两轮PBS洗涤，用0.3-0.45mol/L的柠檬酸钠溶液洗脱，获得重组抗体溶液，即可。

2.如权利要求1所述的一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠的浓度为0.33-0.40mol/L。

3.如权利要求2所述的一种单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸钠的浓度为0.37mol/L。

4.权利要求1-3任一项所述制备方法获得的单克隆抗体在制备预防和治疗丙型肝炎药物中的应用。