CN112111462A - 烯醇化酶eno1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供两株分泌烯醇化酶ENO1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号分别为：CCTCCNO:C2020150和CCTCCNO:C2020151，保藏日期为：2020年9月6日。本发明还提供由上述的杂交瘤细胞株产生的烯醇化酶ENO1单克隆抗体，在制备抑制宫颈癌迁移或宫颈癌细胞增殖的药物中的应用。本发明首次将ENO1基因克隆入真核表达载体，表达和纯化出ENO1蛋白。应用ENO1蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤技术成功制备并筛选出高效价ENO1mAb，并测序获得其可变区基因序列。本发明的ENO1mAb具有较好的安全性和抗宫颈癌效果，有望应用于临床肿瘤治疗。

Description

烯醇化酶ENO1单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及烯醇化酶ENO1单克隆抗体及其应用。

背景技术

宫颈癌是妇科最常见恶性肿瘤，晚期及复发性宫颈癌的治愈率低。宫颈癌等肿瘤细胞以有氧糖酵解作为获能的主要手段，糖酵解还可以为肿瘤生长提供合成代谢中间产物。因此，在肿瘤细胞中，参与糖酵解过程的酶类的表达水平显著高于正常细胞。在大多数癌症细胞和恶性肿瘤细胞中，糖酵解酶的表达增加，活性增强，促进肿瘤糖酵解代谢。

烯醇化酶(ENO)是糖酵解途径中的关键酶之一，可催化2-磷酸甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸转化，同时还参与糖异生过程。在哺乳动物中，ENO有三种亚型：α-，β-和γ-烯醇酶，α-烯醇酶(ENO1)在大多数组织中广泛表达。ENO1在细胞质中大量表达，发挥糖酵解限速酶的作用，通常在大多数癌症和恶性肿瘤细胞中过表达。ENO1是一种多功能蛋白，还作为纤维蛋白溶解酶原的结合受体，在细胞膜表面表达。

抗体以其独特的生物学活性在肿瘤治疗中得到广泛应用。单克隆抗体是由单一克隆的杂交瘤细胞产生，仅识别单一抗原表位的特异性抗体，具有高特异性、治疗效果显著、产生的交叉反应或副作用少、易于修饰改造、体内存在周期较长等特点。抗体治疗是肿瘤免疫治疗最重要的策略之一，治疗卵巢癌和乳腺癌的单克隆抗体制剂已经应用于临床。因此，开发特异性强的ENO1单克隆抗体具有重要的临床价值。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了烯醇化酶ENO1单克隆抗体及其应用。

申请人课题组前期通过蛋白质组学筛选到宫颈癌组织高表达ENO1，用ShRNA干扰沉默ENO1基因的表达可明显降低宫颈癌细胞的成瘤能力及侵袭转移能力；MichelaCapello等同样用ShRNA干扰沉默ENO1基因的表达，发现其可抑制胰腺癌细胞的糖酵解；说明抑制ENO1表达可以阻断糖酵解，从而起到治疗肿瘤的作用。虽然应用shRNA干扰ENO1表达可抑制肿瘤生长，但RNA干扰技术受到病毒载体和运输系统的限制。

本发明提供两株分泌烯醇化酶ENO1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株H1-CTC和杂交瘤细胞株H5-CTC，将其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，其保藏编号分别为：CCTCC NO:C2020150和CCTCC NO:C2020151，保藏日期为：2020年9月6日。

本发明应用杆状病毒表达载体，表达和纯化出ENO1蛋白。应用ENO1蛋白免疫BALB/c小鼠，将小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0制备杂交瘤细胞。

本发明还提供由上述的杂交瘤细胞株产生的烯醇化酶ENO1单克隆抗体。

作为优选，编码所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为序列表中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6。

在得到上述杂交瘤细胞株的基础上，提取RNA，逆转录获得cDNA。然后，以cDNA为模板，借助5’-RACE试剂盒，采用通用引物和3’-基因特异性引物一起扩增抗体的重链和轻链可变区基因，然后，胶回收PCR产物的靶片段，将胶回收获得的基因片段与pUC19载体进行无缝连接，转化入E.coli的Sterllar^TM感受态细胞中，涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上筛选转化菌落。挑取单克隆菌落进行扩大培养后，提质粒，进行PCR法鉴定目的基因，并通过测序获得其可变区基因序列。

本发明还提供上述单克隆抗体的制备方法，是将上述的杂交瘤细胞株细胞种植到动物腹腔产生腹水而获得的。

作为优选，向小鼠腹腔注射液体石蜡，1-2周后，每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，离心，收集中间层淡黄色腹水，获得单克隆抗体。

本发明还提供FA-SS-PLGA-ENO1mAb纳米颗粒，是采用以下方法制备得到的：通过PLGA的羧基及胱胺的氨基发生缩合反应生成PLGA-Cys，进一步利用叶酸的羧基端与PLGA-Cys另一端氨基发生缩合反应，生成FA-SS-PLGA共聚物，通过双乳溶剂挥发法包裹ENO1 mAb进入FA-SS-PLGA纳米颗粒。

应用上述方法制备了叶酸修饰的PLGA纳米颗粒，该纳米颗粒表面修饰的叶酸识别宫颈癌细胞的叶酸受体，包裹ENO1 mAb，从而将ENO1 mAb靶向运输入肿瘤细胞，拮抗胞浆内ENO1，可抑制肿瘤细胞糖酵解、克隆形成和增殖能力。

本发明还提供PLGA-ENO1mAb纳米颗粒，是通过双乳溶剂挥发法包裹ENO1 mAb进入PLGA纳米颗粒制备得到的。

本发明还提供上述的烯醇化酶ENO1单克隆抗体，或，FA-SS-PLGA-ENO1mAb纳米颗粒，或，PLGA-ENO1mAb纳米颗粒，在制备抑制宫颈癌迁移或宫颈癌细胞增殖的药物中的应用。

本发明通过糖酵解相关试剂盒、增殖实验和平板克隆形成实验评价纳米颗粒体外对宫颈癌细胞糖酵解、增殖能力和细胞克隆形成能力的影响。发现叶酸(FA)修饰的PLGA纳米颗粒介导ENO1 mAb-H1进入宫颈癌Hela细胞后，可以抑制细胞糖酵解、抑制肿瘤细胞增殖、降低肿瘤成瘤性。

本发明首先应用杆状病毒表达载体，表达和纯化出ENO1蛋白。其次，应用所纯化的ENO1蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤技术成功制备并筛选出高效价的ENO1单克隆抗体(ENO1mAb)，并经测序获得编码抗体可变区基因序列。进而，通过ENO1 mAb对宫颈癌细胞的迁移、侵袭能力的抑制作用评价，筛选出有较强抗宫颈癌SiHa细胞迁移侵袭能力的ENO1 mAb。最后，制备靶向肿瘤细胞的纳米颗粒，介导ENO1 mAb进入细胞，拮抗胞浆内ENO1，抑制糖酵解，抑制宫颈癌Hela细胞增殖、克隆形成和迁移侵袭的作用。

本发明首次将ENO1基因克隆入真核表达载体，表达和纯化出ENO1蛋白。应用ENO1蛋白免疫小鼠，通过杂交瘤技术成功制备并筛选出高效价ENO1 mAb，并测序获得其可变区基因序列。本发明的ENO1 mAb具有较好的安全性和抗宫颈癌效果，有望应用于临床肿瘤治疗。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明ENO1蛋白在昆虫细胞sf9中的表达纯化示意图。

图2为本发明ENO1 mAb纯化示意图。

图3为本发明ENO1 mAb-H1～H5对宫颈癌SiHa细胞迁移能力的影响示意图。

图4、图5为本发明不同ENO1 mAb-H1～H5对宫颈癌SiHa细胞侵袭能力的影响示意图。

图6为ENO1 mAb-H5杂交瘤细胞图。

图7为本发明PLGA共聚物修饰前后的核磁氢谱图。

图8为本发明不同PLGA纳米颗粒扫描电镜及动态光散射图。

图9为本发明PLGA纳米颗粒对ENO1 mAb-H1的包封率和载药率示意图。

图10为本发明FITC标记的不同PLGA纳米颗粒细胞摄取实验示意图。

图11为本发明ENO1 mAb-PLGA纳米颗粒体外对Hela细胞糖酵解水平的影响示意图。

图12为本发明ENO1 mAb-PLGA纳米颗粒对Hela细胞的增殖抑制作用示意图。

图13为本发明PLGA纳米颗粒负载ENO1 mAb对Hela细胞克隆形成能力的影响示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了如图1-13所示的一种烯醇化酶ENO1 mAb制备方法及其应用。

实施例1 ENO1单克隆抗体ENO1 mAb的制备

1.运用基因工程的方法构建了融合蛋白ENO1表达质粒rBacmid-ENO1。

(1)将ENO的基因序列交由公司根据相应的密码子偏好(优化GC含量等)进行优化，优化后在序列N端添加Kozak和RS序列，在C端添加MAT-tag标签后，通过NcoI/XhoI酶切位点送公司合成到杆状病毒载体质粒pFastBac1上，得到重组质粒MAT-pFastBac1-ENO1。

优化后的ENO1的序列为：

>ENO1基因序列(1349bp)

Kozak序列；

NcoI酶切位点；

RS序列；

ENO1序列；

MAT-tag序列；“---”XhoI酶切位点

>ENO1蛋白序列(444AAs,48.32kDa)

ENO1序列；

MAT-tag序列

(2)制备E.coli DH10Bac^TM感受态细胞。

(3)将MAT-pFastBac1-ENO1转化到E.coli DH10Bac^TM感受态细胞中，涂于LB平板(含卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)和四环素(10μg/ml))，37℃培养24h以上。取出平板观察有无蓝白菌落出现。挑取白色菌落并用接种环重新划线，在37℃下培养超过24h后，进行表型鉴定，重复三次，挑取单个白色菌落接种于5ml LB液体培养基中进行培养，收集菌体后按照Bac-to-Bac昆虫/杆状病毒表达系统手册提取重组质粒。

(4)重组质粒的鉴定。应用M13通用引物对重组质粒进行PCR鉴定，设空质粒Bacmid作为对照。PCR反应体系(10μl)为5μl 2×Fast Taq Mastermix、0.4μl Forward Primer:M13-F(10μM)、0.4μl Reverse Primer:M13-R(10μM)、1μl模板(rBacmid-ENO1)、3.2μlddH₂O。PCR程序为预变性95℃-6min、变性95℃-30s、退火55℃-30s、延伸72℃-2min、30个循环次数、总体延伸72℃-5min、16℃保持。PCR扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为rBacmid-ENO1。

(5)验证正确后，扩大培养，大量提取重组质粒并检测浓度，得率为700μg/100ml。

2.ENO1蛋白的表达和纯化

将验证好的重组质粒rBacmid-ENO1转染Sf9昆虫细胞，按照Cellfectin IIReagent转染试剂说明书进行，分别取3μg重组质粒rBacmid-ENO1和8μl转染试剂于300μl无血清培养基中室温孵育30min后，轻轻混合两溶液并于室温静置20min。转染Sf9细胞后5h，将培养基换成含10％FBS的培养基继续培养。72h以后，转染细胞出现明显的细胞病变效应。出现病变的细胞和对照相比，表现出肿胀、变圆、漂浮等典型的细胞病变特点，通过进一步传代，细胞表现出相同的变化。收集细胞及上清液，800rpmg离心5min后，收集病变细胞上清即得到P1代重组病毒液。

通过用不同量的P1代病毒液(30μl、150μl和300μl)感染Sf9细胞48h/72h来扩增病毒，获得的P2代病毒液用于表达测试，以确定最佳的感染复数(MOI)。通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况，发现分子量在48KD左右有明显的特异蛋白表达条带，说明ENO1蛋白在Sf9细胞的上清液中大量表达，沉淀中蛋白相对较少(见图1A)。最终确定最佳表达条件为30μl P2病毒液(以MOI＝1接种病毒)感染Sf9细胞72h(见图1B)。

以最佳表达条件放大到200ml，收集细胞上清，用镍柱亲和层析法纯化带MAT标签的目的蛋白。所需纯化试剂如下：结合缓冲液(pH7.8)：称取3.8gNa₃PO₄、14.61g NaCl，加去离子水充分溶解混匀，用浓盐酸和氨水调节pH至7.8，定容至500ml。洗脱缓冲液(pH6.0)：称取3.8gNa₃PO₄、14.61g NaCl，加去离子水充分溶解混匀，用浓盐酸和氨水调节pH至6.0，定容至500ml。咪唑洗脱缓冲液：配制5M咪唑洗脱缓冲液(17.02g咪唑+50ml洗脱缓冲液)，用洗脱缓冲液梯度稀释5M咪唑洗脱缓冲液，分别得到30mM、40mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM的咪唑洗脱缓冲液。

纯化步骤：将固化Ni²⁺树脂轻轻颠倒混匀，取2ml树脂加入层析柱，待其自然沉降；用3ml超纯水冲洗树脂；用3ml结合缓冲液平衡树脂。取2ml细胞上清液加入层析柱；用6ml结合缓冲液洗柱；用4ml的洗脱缓冲液洗柱，直至流出液的A280<0.01；用6ml不同浓度的咪唑洗脱缓冲液由低浓度到高浓度依次洗脱结合的蛋白，分步收集并进行SDS-PAGE电泳。

结果发现用200mM和400mM的咪唑洗脱缓冲液可洗脱出目的蛋白，最终得到1.44mgENO1蛋白，纯度为90％。

以最佳表达条件放大到1L，收集Sf9细胞的上清液并用镍柱亲和层析纯化带MAT标签的目的蛋白，纯化条件同上。最终得到纯度和浓度均较高的ENO1蛋白(7.5mg ENO1蛋白，浓度为0.7mg/ml、纯度大于90％(见图1C)。

图1为本发明ENO1蛋白在昆虫细胞sf9中的表达纯化示意图。其中，A图：ENO1蛋白在Sf9细胞的上清液中大量表达。B图：ENO1蛋白在Sf9细胞中的不同表达条件。C图：经不同浓度的咪唑洗涤缓冲液梯度洗脱ENO1蛋白的结果。MW，marker；IN，上样蛋白；FT：流穿液；W，洗脱液(W1，30mM咪唑洗脱缓冲液；W2，40mM咪唑洗脱缓冲液；W3，50mM咪唑洗脱缓冲液)；E，不同浓度的咪唑洗脱缓冲液(E1-E9分别为100mM-900mM的咪唑洗脱缓冲液)；2μg，大量富集后得到ENO1蛋白。

3.ENO1 mAb的制备

(1)动物免疫

初次免疫，将ENO1蛋白(5μg/ml)与弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化，然后经背部皮下多点注射雌性BALB/c小鼠，50μg/只；间隔两周后进行二次免疫，将ENO1蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混匀，充分乳化后，在小鼠足底和背部皮下多点注射，50μg/只；两周后进行三次免疫，仅免疫ENO1蛋白，不给予佐剂，在腹腔内多点注射，50μg/只。末次免疫一周后，以断尾法采集小鼠的血液，3000rpm离心15min，分离得血清，应用间接ELISA法，测定血清中抗体效价(以ENO1蛋白为抗原包被反应板孔)。加强免疫：为了增加抗体的滴度，在进行细胞融合前3天，进过尾静脉途径再次免疫50μg ENO1蛋白抗原。

(2)骨髓瘤细胞SP2/0的复苏及培养

1)将骨髓瘤细胞SP2/0冻存管从液氮中取出，立即在37℃水浴中摇动快速解冻，然后用含有75％无水乙醇的棉球擦拭冻存管，并将细胞悬液吸入15ml离心管中，补完全培养基至10ml，800rpm/min，离心5min，去上清。

完全培养基的配方为：DMEM高糖培养基中加入胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素至终浓度为10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

2)将细胞沉淀重悬于5ml DMEM高糖完全培养基中，将其接种到25cm²培养瓶中，并在37℃、5％CO₂培养箱中孵育。

3)细胞密度能达到80％时，加0.25％胰蛋白酶1.5ml至培养瓶中。在显微镜下观察，当细胞从梭性变为圆形半透明时，倒出胰蛋白酶并加入15ml完全培养基，用吸管反复吹打细胞，平分到3个培养瓶中，在培养箱中培养。

完全培养基的配方与上同。

(3)饲养细胞的制备

未免疫的BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞用作饲养细胞。

在进行细胞融合的前1天，颈椎脱臼法处死小鼠，用PBS缓冲液反复吹打冲洗小鼠腹腔，并用注射器抽取小鼠腹腔内含有大量巨噬细胞的冲洗液，800rpm离心5min，弃上清。将细胞沉淀重悬于制备的HAT选择培养基中，计数细胞，并将细胞浓度调至2×10⁵/ml。按100μl/well加入96孔板中培养。18-24h后观察细胞生长状态，当细胞贴壁紧密、生长成单层细胞后，可用于细胞融合。

(4)免疫脾细胞的制备

通过ELISA预先测定加强免疫后的BALB/c小鼠血清的抗体滴度，选择具有最高滴度的小鼠，无菌分离脾细胞以制备高滴度的单克隆抗体。

(5)细胞融合

当骨髓瘤细胞生长至对数期时，反复吹打细胞瓶壁上的细胞，以800rpm离心5min，并将细胞沉淀重悬于DMEM高糖培养基后细胞计数。取1×10⁷个SP2/0细胞与1×10⁸个脾细胞在50ml离心管中混合，用无血清DMEM高糖培养基洗涤两遍，以800rpm离心5min后，弃去上清液。轻弹管底，彻底使两种细胞混合。取1ml预热的聚乙二醇(PEG)，在30s内匀速加入细胞悬液中，轻轻摇动混匀后，置于37℃、90s。在1min内匀速加入1ml 37℃预热的DMEM高糖培养基，在第2min内匀速加入10ml 37℃预热的DMEM高糖培养基，轻轻摇动混匀。1000rpm离心10min，弃上清。用10ml含10％FBS的1％HAT选择培养液重悬细胞沉淀，切记不能用力吹打。将融合细胞悬液也按100μl/孔加入上述含有饲养细胞的96孔板中，并在37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(6)阳性克隆的筛选与克隆化

1)克隆的筛选

一般培养3-4天后，未融合的骨髓瘤细胞会死亡，此时存活细胞是融合细胞；在第7天，将融合细胞的培养基与HAT选择培养液进行半量换液；10-14天时取少量的融合细胞的上清液进行抗体效价筛选，应用已制备的ENO1蛋白作为抗原进行筛选，然后加入等量的HAT选择培养液；第14天时将HAT选择培养液替换为HT培养液来培养筛选出来的杂交瘤细胞，同时将杂交瘤细胞从96孔中转移到24孔板内扩大培养。在随后传代培养的过程中，将HT培养液逐渐替换为RPMI 1640完全培养基来继续培养杂交瘤细胞。

2)杂交瘤细胞株的亚克隆

①在细胞培养10-14天时，筛选出与ENO1抗原反应的克隆，挑选OD值高的孔中的细胞采用有限稀释法进行培养。观察每个孔中细胞的生长状态，标出存在单个克隆的杂交瘤细胞孔并进行HAT选择培养液半量换液。

②当细胞的密度达到整个孔底面积的1/3时，取适量细胞培养上清进行抗体效价检测，筛选出呈单克隆且抗体效价高的细胞孔。

③选择呈单克隆生长、抗体效价高、形态状态良好的细胞孔，陆续移入24孔板和25cm²细胞培养瓶中进行扩大培养，定期检测细胞培养上清进行抗体检测，以保证杂交瘤细胞的抗体效价稳定，并取出一部分进行液氮冻存。最后当所有的细胞上清的抗体阳性率达到100％时，即可确定为杂交瘤细胞株。共获得5株杂交瘤细胞株，分别命名为ENO1 mAb-H1至ENO1 mAb-H5，随后，进行杂交瘤细胞的冻存。

(7)单克隆抗体ENO1 mAb的大量制备

选用动物体内诱生法。

提前将500μl液体石蜡腹腔注射入小鼠体内。扩大培养杂交瘤细胞，收集细胞悬液，并进行细胞计数。1-2周后，腹腔注射500μl 5×10⁵个杂交瘤细胞悬液，轻轻按压小鼠腹腔，使杂交瘤细胞均匀分散在小鼠腹腔内。每天观察记录小鼠的腹水情况，当小鼠腹部明显变大时，用无菌注射器在下腹部将腹水抽出，间隔三天左右，当腹水再生时，用同样的方法抽取腹水。将腹水置于4℃，以3000rpm离心15min，以除去细胞和脂肪，收集中间层的淡黄色腹水，分装后临时保存于-20℃冰箱。

(8)ENO1 mAb的粗提

1)取出-20℃保存的腹水，用4倍体积的0.06M醋酸缓冲液(pH 5.0)稀释，用1MNaOH微调pH至4.5。

2)在搅拌下逐滴加入辛酸(终浓度为33μl/ml)，待充分混匀后再加入下一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。

3)高速冷冻离心机，4℃条件下12000rpm，离心30min，收集上清液。

4)上清液用0.45μm滤器过滤1次，向滤液中加入1/10体积的10×PBS(0.1MpH7.4)，并用1M NaOH调pH至7.4。

5)根据每毫升上述腹水混合液加入0.277g固体硫酸铵，在冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，4℃下缓慢搅拌30min，放置4℃冰箱继续静置至少60min。

6)高速冷冻离心机12000rpm，4℃离心30min，弃上清，收集沉淀并完全溶解于腹水体积1/2的1×PBS中，进行重悬。

7)将重悬后抗体溶液移入透析袋(MW3500kDa)中，4℃、1×PBS中透析72h，每隔12h换一次透析液。

8)收集透析袋中抗体溶液，4℃、12000rpm离心30min，收集上清，-20℃保存。

(9)ENO1 mAb的纯化

1)上样前先用去离子水冲洗纯化系统管路和Protein A柱，将酒精冲洗完全。接着改用10倍柱体积的结合缓冲液(20mM PB缓冲液+2M NaCl，pH 7.0)预处理平衡Protein A柱，直至A280、A260、电导稳定。

2)将待纯化的ENO1 mAb与结合缓冲液按体积比为1:2进行稀释，用0.45μm的滤器过滤除杂后从上样孔推入至Protein A柱。

3)用结合缓冲液使ENO1单克隆抗体挂柱，直至单抗完全从柱上流过，A280、A260、电导稳定。

4)用2-5倍柱体积的0.1M柠檬酸洗脱液对挂在柱上的ENO1单克隆抗体进行洗脱，收集洗脱液。

5)洗脱完全后用去离子水冲洗纯化系统管路及Protein A柱，将系统彻底冲洗干净。

6)用20％乙醇充满系统管路及Protein A柱，以免系统被污染，最后将预装柱保存于4℃冰箱。

7)将收集到的ENO1 mAb进行抗体浓度测定及SDS-PAGE电泳分析，收集纯化后的ENO1 mAb分装保存于-20℃冰箱。抗体浓度为16mg/ml。SDS-PAGE电泳结果见图2。经SDS-PAGE验证显示，ENO1 mAb纯化效果较好，无明显杂带，蛋白分子量约为50KDa和25KDa，符合抗体重链和轻链大小。

图2为本发明ENO1 mAb纯化示意图。

其中，图A：ENO1 mAb-H1杂交瘤细胞株制备的单抗。M，蛋白分子量marker；1，辛酸-硫酸铵法粗提纯后的蛋白；2-3，Protein A柱纯化后蛋白。图B：ENO1 mAb-H5杂交瘤细胞株制备的单抗。M，marker；1，辛酸-硫酸铵法粗提纯后的蛋白；2，Protein A柱纯化时流穿峰蛋白；3，Protein A柱纯化蛋白。

(10)ENO1单克隆抗体的亚类鉴定(ELISA)

1)用PBS缓冲液稀释ENO1蛋白直至终浓度为0.5μg/ml，将96孔板作为抗原包被板，100μg/well，并使其在4℃放置过夜。

2)第二天，倾倒包被液，用PBST(PBS+Tween 20)洗板3次；加5％BSA的PBS缓冲液200μl/well，37℃封闭2h。

3)PBST洗涤液洗板3次，将100μl杂交瘤细胞的培养上清液加入各孔中，在37℃下孵育1h。

4)PBST洗涤液洗板3次，加入100μl稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，在37℃下孵育90min，PBST洗涤液洗板3次。

5)加入100μl底物显色液，于37℃孵育15min后，加入50μl终止液，以终止反应。在波长为450nm和630nm的酶标仪上测量OD值，并记录数据。

表1 ENO1 mAb的亚类鉴定结果

(11)ENO1 mAb效价测定(ELISA)

采用ELISA间接法测定纯化得到ENO1 mAb的效价，抗原为ENO1蛋白，每孔包被5μg/ml抗原，100μg/well，阴性对照是免疫前的小鼠血清，空白是PBS缓冲液。当P/N>2.1时即判定为阳性，超过一半重复孔呈现阳性反应的抗体最高稀释度为其抗体效价。根据计算得出5种抗体的效价为1：64000。而且这五个杂交瘤细胞株经体外连续传代培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好，稳定分泌抗体。

表2 ENO1 mAb效价测定滴度水平的检测结果

总结：本申请人用上述纯化的ENO1蛋白免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术成功制备并筛选出5个稳定分泌高效价ENO1 mAb的杂交瘤细胞株，应用体内诱生法诱导腹水产生抗体，用辛酸-硫酸铵法进行粗纯化，再进一步用Protein A柱纯化，最终得到高纯度的ENO1mAb，分别命名为：ENO1 mAb-H1，ENO1 mAb-H2，ENO1 mAb-H3，ENO1 mAb-H4，ENO1 mAb-H5。经SDS-PAGE验证显示，ENO1 mAb纯化效果较好，无明显杂带，蛋白分子量约为50KDa和25KDa，符合抗体重链和轻链大小，见图2。

实施例2 ENO1 mAb-H1可变区基因钓取

(1)设计引物

根据抗体库(IMGT)中已知的小鼠重链和轻链恒定区基因序列，发现IgG1、IgG2a和IgG2b中重叠的序列，并设计出重链和轻链3’-末端基因特异性引物各一条，重链3’-末端基因特异性引物：GATTACGCCAAGCTTgctggacagggatccagagttcc；轻链3’-末端基因特异性引物：GATTACGCCAAGCTTcacgactgaggcacctccagatgttaactg，可供三类抗体使用。

(2)合成RACE-Ready cDNA

准确吸取4μl 5×First-Strand Buffer、0.5μl DTT(100mM)和1μl dNTPs(20mM)混合在一个微量离心管中，混匀后，在室温下放置。从ENO1杂交瘤细胞中用RNA纯化试剂盒(Thermo，#K0731)提取mRNA，准确吸取1.0-10μl RNA、1μl 5’-CDS Primer A和0–9μl无菌H₂O混合在单独的微量离心管中；对照组选用1μl小鼠心脏提取的总RNA(1μg/μl)。在离心机中短暂旋转管，以混匀上述液体。将管置于72℃水浴锅中3min，然后将管冷却至42℃并保持2min。冷却后，14,000rpm离心1min，以收集底部的内容物。每管加入1μl SMARTer II AOligonucleotide。配制混合溶液：准确吸取5.5μl Buffer Mix from Step、0.5μl RNaseInhibitor(40U/μl)和2μl SMARTScribe Reverse Transcriptase(100U)。每管加入混合液，使每个cDNA合成反应的总体积为20μl。通过轻轻吹打混合管内容物，并短暂旋转管以收集底部的内容物。将管置于42℃下水浴锅中孵育90min。再将管加热至70℃10min。用Tricine-EDTA缓冲液稀释第一链cDNA合成反应产物：若RNA浓度<200ng总RNA时，则加入10μl Tricine-EDTA；若RNA浓度>200ng总RNA时，则加入90μl Tricine-EDTA。得到5’-RACE-Ready cDNA样品，保存于-20℃。

(3)cDNA末端快速扩增(RACE)

对于每个50μl PCR反应体系如下：2.5μl 5’-RACE-Ready cDNA、5μl 10×UPM、1μl5’-Primer、15.5μl PCR-Grade H₂O、25μl 2×SeqAmpTM Buffer和1μl SeqAmp DNAPolymerase。采用降落式PCR扩增，依次使用下述PCR程序开始热循环。一定要选择正确的周期数。降落式PCR：基因特异性引物Tm>70℃。

PCR程序：

Stage 1：94℃，30s；72℃，2min；5个循环；

Stage 2：94℃，30s；70℃，30s；72℃，2min；5个循环；

Stage 3：94℃，30s；68℃，30s；72℃，2min；25个循环。

(4)RACE产物纯化

在琼脂糖/EB凝胶上进行5’-RACE-Ready cDNA样品的电泳。使用缓冲系统为含有1×TAE(40mM Tris(pH 8.0)+1mM EDTA)。在UV灯下找到目标片段的位置，并使用干净的刀片尽可能地去除非目的DNA片段，获得目的片段的凝胶，用吸水纸吸干，并将其转移至一称量过重量的干净的离心管中，测量凝胶切片的重量。每100mg琼脂糖，加入200μl NT1缓冲液。将样品置于50℃孵育5-10min。每2-3min颠倒混匀一次，直到凝胶切片完全溶解为止。将吸附柱放入2ml收集管中，并将700μl样品加入吸附柱中。以11,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体，将柱子放回收集管中。向吸附柱中加入700μl NT3缓冲液，以11,000rpm离心1min，弃去收集管中的液体，将柱子放回收集管中。以11,000rpm离心1min，以完全除去NT3缓冲液，丢弃收集管中的液体，并将柱子放至一新的收集管中。加15-30μl NE缓冲液于吸附柱中，11,000rpm离心1min来收集管中的液体。

(5)RACE产物的无缝连接

连接体系(10μl)如下：1μl Lineareized pRACE vector(pUC19)、7μl Gel-purified RACE product和2μl In-Fusion HD Master Mix。在50℃水浴锅中孵育15min并转移到冰上。

(6)RACE产物的转化

取2.5μl RACE无缝连接产物，加入50μl E.coli的Sterllar^TM感受态细胞中，混匀(DNA量不超过50ng，浓度太高，转化率反而不好)，冰水浴30min。置于42℃水浴90s，迅速转移至冰水浴中90s，不能摇动。加500μl SOC培养基于离心管中，37℃，54rpm培养45min(使细菌表达DNA编码的抗生素抗性基因)。将200μl转化的感受态细胞涂布到LB(Amp终浓度100μg/mL)平板上(低浓度)。再将余下的350μl细胞悬液，750rpm离心5min，去掉150μl的上清，余下100μl细胞悬液再涂LB平板(100μg/mlAmp)，37℃孵育12～16h后观察菌落的生长情况。观察LB平板上菌落生长情况，挑取单克隆菌落3个，于LB液体培养基中(100μg/ml Amp)，37℃180rpm孵育12-16h。

(7)重组质粒的鉴定

用灭菌的10μl枪头尖端，将阳性克隆菌落(2～3个)挑取至5ml LB(Amp+)液体培养基中，37℃培养12～16h。保存菌种，800μl菌液+200μl 50％甘油，保存于-80℃。剩余1～3ml菌液用于质粒提取，琼脂糖凝胶电泳进行验证。PCR验证(需设阴性对照)；选择对PCR阳性的重组克隆菌(20μl质粒)，送公司进行基因测序，测序引物采用的是pUC19载体上的固有序列M13F/R引物。

结果：分别有600-800bp大小的片段从重组质粒中扩增出来，提示PCR验证成功，送公司进行序列测定。本发明选用5’-RACE法扩增抗体的重链和轻链可变区基因，测得ENO1mAb-H1和ENO1 mAb-H5重链和轻链可变区的基因序列(见表4、表5)。

表3 ENO1-H1重链和轻链可变区序列

H1重链可变区序列中，由H1重链高变区1、H1重链高变区2和H1重链高变区3将H1重链骨架1-4分别隔开。H1轻链可变区序列中，由H1轻链高变区1、H1轻链高变区2和H1轻链高变区3将H1轻链骨架1-4分别隔开。

表4 ENO1-H5重链和轻链可变区序列

H5重链可变区序列中，由H5重链高变区1、H5重链高变区2和H5重链高变区3将H5重链骨架1-4分别隔开。H5轻链可变区序列中，由H5轻链高变区1、H5轻链高变区2和H5轻链高变区3将H5轻链骨架1-4分别隔开。

实施例3 ENO1 mAb的抗肿瘤作用评价

采用细胞划痕实验和Transwell小室实验检测五个ENO1 mAb(ENO1 mAb-H1至ENO1mAb-H5)对宫颈癌SiHa细胞迁移、侵袭能力的影响。细胞划痕迁移实验结果显示：与对照组相比，H1单克隆抗体抑制宫颈癌SiHa细胞迁移的效果最好(p<0.01)，其次是H5(p<0.01)，H2、H3、H4的作用不明显，见图3，用五种单克隆抗体与细胞共培养24h后，观察各组细胞的迁移率变化。Transwell小室实验检测不同单克隆抗体对SiHa细胞侵袭能力的抑制作用，结果发现：相比空白对照组，H1抗体治疗对SiHa细胞的侵袭能力抑制作用最明显(p<0.01)，其次为H5(p<0.01)，见图4。Transwell小室上铺基质胶后检测五个单克隆抗体对SiHa细胞侵袭能力的影响，发现不同单克隆抗体对SiHa细胞侵袭能力的抑制作用趋势和迁移结果相一致：相比空白对照组，H1抗体治疗对SiHa细胞的迁移能力抑制作用最明显(p<0.01)，其次为H5(p<0.01)，见图5。经上述研究，本申请人筛选出了具有较好抗肿瘤细胞侵袭迁移作用的ENO1 mAb-H1，将杂交瘤细胞株ENO1mAb-H1(其分类命名为：杂交瘤细胞株H1-CTC)于2020年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:C2020150；杂交瘤细胞株ENO1 mAb-H5(其分类命名为：杂交瘤细胞株H5-CTC)于2020年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO:C2020151。

图6为ENO1 mAb-H5杂交瘤细胞图。

实施例4 ENO1mAb纳米颗粒的制备

由于单克隆抗体具有分子量较大、组织穿透力弱的缺点，单克隆抗体无法进入细胞而发挥阻断ENO1活性的作用。为了解决该问题，本申请人制备靶向宫颈癌细胞的纳米颗粒，包裹ENO1 mAb，实现ENO1 mAb的胞内递送，从而研究其抑制糖酵解途径效应和抗肿瘤作用。具体合成步骤如下：

1.PLGA-Cys的合成

(1)聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)的活化

称取PLGA-COOH 1g(0.025mmol)完全溶解于10ml二氯甲烷中。同时，分别称取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)48mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)29mg溶解于2ml二氯甲烷中。将完全溶解的PLGA-COOH转移至25ml圆底烧瓶中，加入完全溶解的EDC和NHS，室温下缓慢搅拌反应24h。反应产物用冰无水乙醚沉淀，13000rpm离心10min，沉淀用二氯甲烷复溶，冰乙醚再次沉淀，反复沉淀3次后真空干燥。真空干燥后产物即为PLGA-NHS，于-20℃保存备用。

(2)PLGA-Cys的制备

称取活化好的PLGA-NHS 1.5g(0.0375mmol)溶于10ml二甲基甲酰胺(DMF)中。称取胱胺二盐酸盐(MW 225.19)84.5mg(0.375mmol)置于300μl N,N-二异丙基乙胺(DIEA)中，提前进行脱盐处理。称取二环己基碳二亚胺(DCC，MW 206.33)77mg(0.375mmol)溶于2ml DMF中。将脱盐处理后的胱胺二盐酸盐及DCC溶液分别缓慢加入到PLGA溶液中，室温氮气保护下搅拌反应24h。反应产物用0.45μm有机滤膜过滤，滤液用冰无水乙醚沉淀，10000rpm离心10min，收集沉淀。沉淀用二氯甲烷进行复溶，并用冰无水乙醚再次沉淀，反复2-3次后收集沉淀，真空干燥处理，干燥后的产物保存于-20℃备用。称取15mg产物溶于DMSO-d6中进行核磁氢谱分析。称取适量的产物溶于二氯甲烷中进行傅里叶红外光谱分析。

2.FA-SS-PLGA的合成

(1)叶酸(Folic acid，FA)的活化

称取662mg叶酸(MW 441.4)(1.5mmol)完全溶解于18ml无水DMSO中。称取EDC1.437g(7.5mmol)、NHS 863.17mg(7.5mmol)完全溶解于2ml DMSO中。在氮气保护下，将完全溶解的EDC、NHS溶液加入含叶酸溶液的50ml圆底烧瓶中，避光缓慢搅拌反应24h。24h后用0.45μm有机滤器过滤反应溶液，去除副产物二环己基脲。滤液用冰无水乙醚和甲醇混合物进行沉淀，最终得到黄色沉淀产物，避光条件下，过夜冷冻真空干燥，干燥产物避光保存于4℃冰箱备用。

(2)FA-SS-PLGA的合成

称取PLGA-Cys 200mg溶解于7ml DMF中。称取FA-NHS 15mg溶解于2ml DMF中，DCC10mg溶于1ml DMF中。将上述FA-NHS溶液和DCC溶液分别缓慢加入含有PLGA-Cys溶液的圆底烧瓶中，并加入10μl DIEA，室温氮气保护下，避光搅拌反应24h。反应结束后用适量冰无水乙醚沉淀，10000rpm离心10min，得黄色沉淀。用二氯甲烷复溶沉淀，冰无水乙醚再沉淀，重复2-3次后用冰甲醇洗涤，离心收集黄色沉淀，真空干燥，-20℃保存。称取15mg产物溶于DMSO-d6中进行核磁氢谱分析。称取适量的产物溶于二氯甲烷中进行傅里叶红外光谱分析。

3.PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒的制备方法

(1)空白PLGA纳米颗粒的制备

200mg PLGA(50:50，MW 4万)完全溶解于4ml二氯甲烷中。向上述PLGA溶液中加入4ml去离子水(PLGA溶液：ddH₂O＝1:1(v/v))，在冰浴下经超声细胞破碎仪超声乳化形成初乳。将初乳缓慢倒入50ml 2％PVA水溶液中(PLGA溶液：PVA溶液＝1:12.5(v/v))，经纳米匀质机形成复乳。将上述复乳转移到250ml圆底烧瓶中，磁力搅拌器上500rpm搅拌过夜，完全挥发二氯甲烷。高速冷冻离心机4℃，12000rpm离心20min，弃上清，沉淀用去离子水重悬以完全去除PVA，重复三次，收集沉淀，真空干燥。

(2)PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒的制备

200mg PLGA(50:50，MW 4万)溶于4ml二氯甲烷。向上述PLGA溶液中加入4mlENO1mAb水溶液(总计6mg)，在冰浴下经超声破碎仪乳化形成流动性良好的初乳。将初乳缓慢倒入50ml 2％PVA水溶液中，经纳米匀质机乳化形成乳白色复乳。将上述复乳转移到250ml圆底烧瓶中，室温下于通风橱中500rpm搅拌过夜，完全挥发二氯甲烷。4℃，12000rpm离心20min，收集上清，通过BCA法测定上清中抗体浓度，用于后续计算纳米颗粒的包封率及载药率。

包封率(EE％)＝(ENO1mAb投入量-ENO1mAb未包封量)/ENO1mAb投入量×100％

载药率(DL％)＝(ENO1mAb投入量-ENO1mAb未包封量)/纳米颗粒总质量×100％

得到白色沉淀用去离子水洗重悬洗涤三次，收集沉淀，真空冷冻干燥后-20℃保存。

(3)用与步骤(1)和(2)同样的方法制备FA-SS-PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒。

4.纳米颗粒的物理表征

该纳米颗粒表面修饰的叶酸识别宫颈癌细胞的叶酸受体，从而靶向将ENO1 mAb运输入肿瘤细胞。核磁氢谱结果显示FA-SS-PLGA共聚物偶联成功，见图7，其中，共聚物中PLGA的特征质子峰为δ1.482ppm、δ4.870ppm、δ5.232ppm，共聚物结构中含二硫键部分的化学位移为δ2.8-3.0ppm、δ3.126ppm、δ3.340ppm，共聚物中叶酸结构中芳香环的特征质子峰分别如图中的f(δ6.657ppm)、g(δ7.670ppm)、h(δ8.670ppm)，核磁氢谱结果显示FA-SS-PLGA共聚物偶联成功。图A：PLGA；图B：PLGA-Cys；图C：FA-SS-PLGA；图A溶剂为氘代氯仿，图B和图C溶剂为氘代二甲基亚砜。

通过扫描电镜和动态光散射仪进行粒径测量，结果显示空白PLGA纳米颗粒、PLGA-ENO1-H1纳米颗粒及FA-SS-PLGA-ENO1-H1纳米颗粒均呈圆形，平均粒径在200nm以下，粒径大小基本均一，稳定性良好。多分散系数PDI均小于0.25，呈窄峰分布，见图8，a：空白PLGA纳米颗粒扫描电镜图；b：PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒扫描电镜图；c：FA-SS-PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒扫描电镜图(5.0kv，X30000)；d：PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒动态光散射图。

PLGA纳米颗粒抗体包封率(EE)和载药率(DL)检测：使用BCA测定试剂盒，酶标仪560nm处测得吸光度(OD值)，代入标准方程计算上清液中ENO1 mAb-H1浓度，计算未包封的ENO1 mAb量，按照包封率公式计算载药纳米颗粒的包封率；沉淀真空冷冻干燥后称重，按照载药率公式计算载药率。结果显示PLGA-ENO1 mAb-H1纳米颗粒的包封率为74.39±1.54％，载药率为8.86％；FA-SS-PLGA-ENO1 mAb-H1纳米颗粒的包封率为70.48±1.01％，载药率为5.25％，见图9。

FITC标记的PLGA纳米颗粒与宫颈癌Hela细胞共孵育4h，通过荧光显微镜观察纳米颗粒的摄取情况，结果显示PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒及FA-SS-PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒均可进入胞内，且经叶酸修饰后可增加细胞摄取纳米颗粒，见图10，a、b：PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒；c、d：FA-SS-PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒；a、c，普通光学显微镜观察；b、d，荧光显微镜观察。

实施例5 ENO1mAb纳米颗粒抑制糖酵解及抗肿瘤作用评价

本申请人通过糖酵解相关试剂盒测定了ENO1 mAb-PLGA纳米颗粒对宫颈癌Hela细胞糖酵解水平的影响，结果显示作用24h后糖酵解产物丙酮酸含量及乳酸含量均下降，FA-SS-PLGA-ENO1 mAb-H1纳米颗粒、PLGA-ENO1 mAb-H1纳米颗粒、三溴丙酮酸(3-BrPA)组与阴性对照组比较均有统计学差异(p<0.05)，见图11，ENO1 mAb纳米颗粒作用于宫颈癌Hela细胞后，糖酵解相关试剂盒测定细胞内糖酵解水平。图A：丙酮酸含量；图B：乳酸含量。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。初步表明包封ENO1 mAb的纳米颗粒可体外抑制宫颈癌Hela细胞的糖酵解。

进一步研究包封ENO1 mAb的PLGA纳米颗粒对宫颈癌Hela细胞作用24h后，对细胞增殖的抑制作用。结果显示FA-SS-PLGA-ENO1 mAb-H1纳米颗粒抑制效果强于PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒(p<0.05)，且细胞存活率呈现剂量依赖性，见图12，通过MTT实验检测ENO1mAb-PLGA纳米颗粒对宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用。*p<0.05，***p<0.001。

为了观察ENO1 mAb对肿瘤干细胞的作用，通过平板克隆形成实验观察负载ENO1mAb的PLGA纳米颗粒对宫颈癌Hela细胞克隆形成能力的影响。结果显示FA-SS-PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒、PLGA-ENO1 mAb-H1纳米颗粒、3-BrPA治疗组克隆形成率与PBS对照组比较均有显著差异，见图13，其中，通过平板克隆实验检测PLGA纳米颗粒负载ENO1 mAb对Hela细胞克隆形成能力的影响。*p<0.05，**p<0.01。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施案例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 烯醇化酶ENO1单克隆抗体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1349

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aattcaccat ggctatgagc atcctgaaga tccacgcccg cgagatcttc gatagccgcg 60

gaaaccccac cgtggaagtg gacctgttca ccagcaaggg cctgtttcga gccgctgtgc 120

catccggtgc tagtaccggc atttacgagg ccctggaact gcgagacaac gacaagaccc 180

gctacatggg caagggagtg tccaaggccg tggagcacat caacaagacc atcgctccag 240

ccctggtgtc caagaagctg aacgtgaccg agcaggagaa gatcgacaag ctgatgatcg 300

agatggacgg caccgagaac aagagcaagt tcggcgccaa cgctatcctg ggagtgtccc 360

tggccgtgtg caaagccgga gccgtggaaa aaggagtgcc attgtaccgc catatcgccg 420

atctggccgg aaacagcgaa gtgatcctgc cagtgccagc cttcaacgtg atcaacggcg 480

gaagtcacgc cggaaacaag ctggccatgc aggagttcat gatcctgcca gtgggagccg 540

ctaacttccg agaagctatg cgcattggag ccgaggtgta ccacaacctg aagaacgtga 600

tcaaggagaa gtacggcaag gacgccacaa acgtgggaga cgaaggcgga ttcgccccaa 660

acatcctgga gaacaaggag ggcctggagc tgctgaagac agctatcggc aaggccggat 720

acaccgacaa ggtggtgatc ggaatggacg tggccgctag cgagttcttc cgcagcggca 780

agtacgacct ggacttcaag agccccgacg atccaagccg ctacatcagc ccagatcagc 840

tggccgacct gtacaagagc ttcatcaagg actaccccgt ggtgtccatc gaggacccct 900

tcgaccagga cgattgggga gcttggcaga agttcaccgc tagcgccgga atccaagtgg 960

tgggagacga tctgaccgtg accaacccaa agcgcatcgc caaggccgtg aacgagaaga 1020

gttgcaattg cctgctgctg aaggtcaacc agatcggcag cgtgaccgag agtctgcagg 1080

cttgcaagct ggctcaggct aacggttggg gagtgatggt gtcccaccgt agcggagaga 1140

ccgaggatac cttcatcgcc gatctggtcg tgggcttgtg cacaggacag attaagaccg 1200

gagccccgtg tcgtagcgag cgtctggcca agtacaacca gctgctgcgc atcgaggagg 1260

aactgggaag caaggccaag ttcgccggac gaaacttccg caacccactg gctaaggccc 1320

acaatcaccg ccataagcac tagctcgag 1349

<210> 2

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Met Ser Ile Leu Lys Ile His Ala Arg Glu Ile Phe Asp Ser

1 5 10 15

Arg Gly Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu Phe Thr Ser Lys Gly Leu

20 25 30

Phe Arg Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala

35 40 45

Leu Glu Leu Arg Asp Asn Asp Lys Thr Arg Tyr Met Gly Lys Gly Val

50 55 60

Ser Lys Ala Val Glu His Ile Asn Lys Thr Ile Ala Pro Ala Leu Val

65 70 75 80

Ser Lys Lys Leu Asn Val Thr Glu Gln Glu Lys Ile Asp Lys Leu Met

85 90 95

Ile Glu Met Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala

100 105 110

Ile Leu Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala Val Glu Lys

115 120 125

Gly Val Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Asp Leu Ala Gly Asn Ser Glu

130 135 140

Val Ile Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His

145 150 155 160

Ala Gly Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly

165 170 175

Ala Ala Asn Phe Arg Glu Ala Met Arg Ile Gly Ala Glu Val Tyr His

180 185 190

Asn Leu Lys Asn Val Ile Lys Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn

195 200 205

Val Gly Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn Lys Glu

210 215 220

Gly Leu Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Gly Lys Ala Gly Tyr Thr Asp

225 230 235 240

Lys Val Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Phe Arg Ser

245 250 255

Gly Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Asp Asp Pro Ser Arg Tyr

260 265 270

Ile Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Leu Tyr Lys Ser Phe Ile Lys Asp

275 280 285

Tyr Pro Val Val Ser Ile Glu Asp Pro Phe Asp Gln Asp Asp Trp Gly

290 295 300

Ala Trp Gln Lys Phe Thr Ala Ser Ala Gly Ile Gln Val Val Gly Asp

305 310 315 320

Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg Ile Ala Lys Ala Val Asn Glu

325 330 335

Lys Ser Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln Ile Gly Ser Val

340 345 350

Thr Glu Ser Leu Gln Ala Cys Lys Leu Ala Gln Ala Asn Gly Trp Gly

355 360 365

Val Met Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Thr Phe Ile Ala

370 375 380

Asp Leu Val Val Gly Leu Cys Thr Gly Gln Ile Lys Thr Gly Ala Pro

385 390 395 400

Cys Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg Ile Glu

405 410 415

Glu Glu Leu Gly Ser Lys Ala Lys Phe Ala Gly Arg Asn Phe Arg Asn

420 425 430

Pro Leu Ala Lys Ala His Asn His Arg His Lys His

435 440

<210> 3

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatgtgcaac ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattttg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga gtggttgggc tacataacct acagtggtat cactacctac 180

aacccatctt tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaacaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc cctatttgct 300

tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctcca 336

<210> 4

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctacaga ggccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatggattc 300

acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa 333

<210> 5

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgtgcaac ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60

acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattttg cctggaactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga gtggttgggc tacataacct acagtggtat cactacctac 180

aacccatctt tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaacaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc cctatttgct 300

tactggggcc aagggactct ggtcactgtc tctcca 336

<210> 6

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60

atctcctgca gagccagcga aagtgttgat tattatggca ttagttttat gaactggttc 120

cagcagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180

ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240

cctatggagg aggatgatat tgtaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300

acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333

Claims (8)

1.两株分泌烯醇化酶ENO1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株H1-CTC和杂交瘤细胞株H5-CTC，其保藏编号分别为：CCTCC NO:C2020150和CCTCC NO:C2020151，保藏日期为：2020年9月6日。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株产生的烯醇化酶ENO1单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的烯醇化酶ENO1单克隆抗体，其特征在于：编码所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为序列表中SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5，编码所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为序列表中SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6。

4.权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于：是将权利要求1所述的杂交瘤细胞株细胞种植到动物腹腔产生腹水而获得的。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤如下：向小鼠腹腔注射液体石蜡，1-2周后，每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，离心，收集中间层淡黄色腹水，获得单克隆抗体。

6.FA-SS-PLGA-ENO1mAb纳米颗粒，其特征在于：是采用以下方法制备得到的：通过PLGA的羧基及胱胺的氨基发生缩合反应生成PLGA-Cys，进一步利用叶酸的羧基端与PLGA-Cys另一端氨基发生缩合反应，生成FA-SS-PLGA共聚物，通过双乳溶剂挥发法包裹ENO1 mAb进入FA-SS-PLGA纳米颗粒。

7.PLGA-ENO1mAb纳米颗粒，其特征在于：是通过双乳溶剂挥发法包裹ENO1 mAb进入PLGA纳米颗粒制备得到的。

8.权利要求2所述的烯醇化酶ENO1单克隆抗体，或，权利要求6所述的FA-SS-PLGA-ENO1mAb纳米颗粒，或，权利要7所述的PLGA-ENO1mAb纳米颗粒，在制备抑制宫颈癌迁移或宫颈癌细胞增殖的药物中的应用。

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