CN117264066B - 一种eno1抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ENO1抗体及其应用，所述抗体包括分别如SEQ ID NO：1、2、3所示的氨基酸序列的重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3；以及分别如SEQ ID NO：9、10、11所示的氨基酸序列的轻链可变区LCDR1、LCDR2、LCDR3。本发明同时公开了编码所述抗体的核酸分子、含有所述核酸分子的载体和宿主细胞，经实验证明本发明的抗体对骨关节炎、骨质疏松及类风湿性关节炎具有良好的治疗效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种ENO1抗体及其应用。
背景技术
ENO1(α-烯醇化酶，烯醇化酶-1)是一种多功能蛋白，它的功能与细胞定位有关。位于细胞表面的ENO1是蛋白复合物(包括uPA受体、整合素和细胞骨架蛋白)的一部分，可促进肿瘤细胞的侵袭和转移；位于细胞质可参与糖酵解过程；此外，ENO1还可表达在细胞核中，与c-myc启动子结合，负向调控c-myc的表达，发挥抗肿瘤作用。
研究表明，ENO1的移位受到MAP激酶信号传导通路的调节，这表明细胞表面上ENO1表达的增加可能在炎症疾病中起到重要作用，已在不同自身免疫和炎性疾病中发现抗ENO1的自身抗体。抗体以其独特的生物学活性在疾病治疗中得到广泛应用。因此，研发新的抗ENO1的抗体对于实现ENO1相关疾病的检测和治疗具有重要的作用。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种抗ENO1的单克隆抗体及其在治疗疾病中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗ENO1的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括具有与SEQ ID NO:1、2、3所示的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的任何变体；
以及具有与SEQ ID NO:9、10、11所示的氨基酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的轻链可变区LCDR1、LCDR2、LCDR3，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的任何变体。
进一步，所述HCDR1、HCDR2、HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2、3所示；
所述LCDR1、LCDR2、LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:9、10、11所示。
进一步，所述单克隆抗体还包括具有与SEQ ID NO:4、5、6、7所示的氨基酸序列至少90％、至少92％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的任何变体；
以及具有与SEQ ID NO:12、13、14、15所示的氨基酸序列至少90％、至少92％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3、LFR4，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的任何变体。
进一步，所述重链可变区框架区HFR1、HFR2、HFR3、HFR4的氨基酸序列分别如SEQID NO:4、5、6、7所示；
所述轻链可变区框架区LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12、13、14、15所示。
进一步，所述单克隆抗体重链可变区具有与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的VH，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的任何变体；
所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的VL，或其具有一个或多个保守氨基酸取代的任何变体。
进一步，所述单克隆抗体的VH具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体的VL具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
进一步，所述单克隆抗体还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。
进一步，所述单克隆抗体的重链亚型为IgG2。
进一步，所述IgG2包括IgG2a、IgG2b。
进一步，所述单克隆抗体的重链亚型为IgG2a。
进一步，所述单克隆抗体的轻链亚型为κ。
本发明的第二方面提供了如下任一项所述的物质：
(1)核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段；
(2)载体，所述载体包括(1)中所述的核酸分子；
(3)宿主细胞，所述宿主细胞包括(1)中所述的核酸分子或(2)中所述的载体；
(4)药物偶联物，所述药物偶联物包括本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段；
(5)一种检测ENO1的产品，所述产品包括本发明第一方面所述的单克隆抗体或其功能片段。
进一步，(1)中编码HCDR1、HCDR2、HCDR3的核酸分子具有与SEQ ID NO:17、18、19所示的核苷酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列；
编码LCDR1、LCDR2、LCDR3的核酸分子具有与SEQ ID NO:25、26、27所示的核苷酸序列至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列。
进一步，编码HCDR1、HCDR2、HCDR3的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17、18、19所示，编码LCDR1、LCDR2、LCDR3的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25、26、27所示。
进一步，编码HFR1、HFR2、HFR3、HFR4的核酸分子具有与SEQ ID NO:20、21、22、23所示的核苷酸序列至少90％、至少92％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列；
编码LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的核酸分子具有与SEQ ID NO:28、29、30、31所示的核苷酸序列至少90％、至少92％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列。
进一步，编码HFR1、HFR2、HFR3、HFR4的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:20、21、22、23所示，编码LFR1、LFR2、LFR3、LFR4的核酸分子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:28、29、30、31所示。
进一步，编码VH的核酸分子具有与SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列；
编码VL的核酸分子具有与SEQ ID NO:32所示的核苷酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少93％、95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的核苷酸序列。
进一步，编码VH的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，编码VL的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示。
进一步，(2)中所述的载体具有与抗体可操作的连接的信号肽。
进一步，所述载体还包括用于控制表达的元件。
进一步，所述载体还包括有助于其进入细胞的材料。
进一步，(3)中所述的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
进一步，所述原核细胞包括大肠杆菌。
进一步，所述真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞。
进一步，所述动物细胞包括哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞。
进一步，(4)中所述的药物偶联物还包括可检测标记物、药物、毒素、细胞因子和/或酶。
进一步，(5)中所述的产品还包括用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。
进一步，用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐。
进一步，所述产品包括试剂盒、试纸条。
进一步，所述试剂盒包括连接有信号产生化合物的抗体的缀合物。
本发明的第三方面提供了一种衍生物，所述衍生物包括在本发明第一方面所述的单克隆抗体或本发明第二方面所述的核酸分子上连接诊断试剂、治疗试剂。
进一步，所述诊断试剂包括荧光标记、放射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。
进一步，所述治疗试剂包括细胞因子、化学治疗剂、放射治疗剂、抗炎剂、激素、抗体Fc片段、TLR激动剂、含CpG的分子或免疫共刺激分子。
本发明的第四方面提供了如下任一项所述的方法：
(1)一种制备本发明第一方面所述的单克隆抗体的方法，所述方法包括：培养本发明第二方面所述的宿主细胞，回收单克隆抗体；
(2)一种检测样本中ENO1的方法，所述方法包括：使本发明第一方面所述的抗ENO1的单克隆抗体与待测样本接触，从而检测待测样本中ENO1的水平。
进一步，(1)中所述的方法还包括纯化所述的单克隆抗体。
本发明的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质或本发明第三方面所述的衍生物。
进一步，所述药物组合物还包括免疫调节剂。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：
(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质或本发明第三方面所述的衍生物在检测ENO1中的应用；
(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质或本发明第三方面所述的衍生物在制备诊断ENO1相关疾病的产品中的应用；
(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的物质、本发明第三方面所述的衍生物或本发明第五方面的药物组合物在制备预防和/或治疗ENO1相关疾病的药物中的应用。
进一步，所述ENO1相关疾病包括肿瘤、代谢性疾病和/或免疫疾病。
进一步，所述ENO1相关疾病选自代谢性疾病和/或免疫疾病。
进一步，所述免疫疾病包括骨关节炎、类风湿关节炎。
进一步，所述代谢性疾病选自骨质疏松。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种ENO1抗体及其应用，所述抗体对ENO1具有较高的亲和活性，对骨质疏松、骨关节炎、类风湿性关节炎等具有良好的治疗效果。
附图说明
图1是ENO1蛋白的表达图；
图2是ENO1蛋白洗脱条件图；
图3是抗ENO1单抗的蛋白纯度鉴定图；
图4是ENO1单抗的亚型图；
图5是23G5的KD值检测图；
图6是左侧胫骨平台软骨下内侧骨矢状图；
图7是小鼠骨关节炎参数图，其中，7A是骨密度图，7B是骨体积/组织体积分数图，7C是孔隙率图，7D是结构模型指数图，7E是骨小梁厚度图，7F是骨小梁数目图，7G是骨小梁分离图，7H是骨小梁模式因素图；
图8是HE和Safranin O染色图；
图9是大鼠的股骨干远端micro-CT图；
图10是大鼠骨质疏松参数图，其中，10A是骨体积/组织体积分数图，10B是骨小梁数目图，10C是骨小梁厚度图，10D是骨小梁分离度图，10E是骨密度图；
图11是大鼠关节炎评分图；
图12是大鼠滑膜组织中炎症因子mRNA相对水平图，其中，12A是TNF-αmRNA相对水平图，12B是IL-6mRNA相对水平图，12C是IL-1βmRNA相对水平图，12D是IL-17mRNA相对水平图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明提供了一种抗ENO1的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区HCDR1、HCDR2、HCDR3；和轻链可变区LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在本发明中，单克隆抗体(monoclonal Ab，mAB，单抗)是指具有单一分子组成的抗体分子，获自一群基本相同的抗体。抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链由可变区(VH)以及第一、第二、第三和任选存在的第四恒定区(分别为CH1、CH2、CH3、CH4)组成；哺乳动物轻链由可变区(VL)和恒定区组成。抗体呈Y形，其中Y的茎部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每个臂包括与单一轻链的可变区和恒定区结合的单一重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区一般含有三个高度可变的环，称为互补决定区(complementaritydeterminingregion；CDR)，轻链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3。轻链和重链的可变区还包括框架区(framework region；FR)，轻链FR包括LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，重链FR包括HFR1、HFR2、HFR3和HFR4。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但呈现出各种效应功能。基于抗体重链恒定区的氨基酸序列来对抗体分类。通常，抗体的种类由重链决定。例如哺乳动物的轻链分类为λ或κ，重链一共有五种，分别用希腊字母α、δ、ε、γ和μ来命名，相对应组成的抗体就称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中，人的γ可以进一步细分为γ1、γ2、γ3、γ4等亚类，分别对应IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四个亚型，小鼠γ可以进一步细分为γ1、γ2a、γ2b、γ3等亚类，分别对应IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3四个亚型。
本发明的抗体具有一个或多个保守氨基酸取代的任何变体，所述变体是指由于亲本抗体序列中一个或多个氨基酸残基的添加、缺失和/或取代而在氨基酸序列上与亲本抗ENO1抗体氨基酸序列不同并且保留亲本抗ENO1抗体的至少一种所期望的活性的分子。所期望的活性可以包括特异地结合抗原的能力、降低、抑制或中和动物中ENO1活性的能力和在基于细胞的测定中抑制ENO1介导的信号传导的能力。在一个实施例中，变体在亲本抗体的一个或多个高变区和/或构架区中包含一个或多个氨基酸取代。例如，变体可以在亲本抗体的一个或多个高变区和/或构架区中包含至少一个，或约一个至约十个，或约两个至约五个取代。变体保留了结合ENO1变体的能力，可以具有更强的结合亲和力、增强的降低、抑制或中和动物中ENO1活性的能力，和/或增强的在基于细胞的测定中抑制ENO1介导的信号传导的能力。
本发明提供了如下任一项所述的物质：
(1)核酸分子，所述核酸分子编码上述单克隆抗体或其功能片段；
(2)载体，所述载体包括(1)中所述的核酸分子；
(3)宿主细胞，所述宿主细胞包括(1)中所述的核酸分子或(2)中所述的载体；
(4)药物偶联物，所述药物偶联物包括上述单克隆抗体或其功能片段；
(5)一种检测ENO1的产品，所述产品包括上述单克隆抗体或其功能片段。
在本发明中，载体是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以引起所述蛋白质表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体可以含有多种用于控制表达的元件，包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。另外，载体可以含有复制起点。术语复制起点是指当在载体中存在时其起始复制的序列。复制起点可被复制起始因子或替代地被DNA解螺旋酶识别。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。
载体可以是重组表达载体或克隆载体。本发明提供了载体(例如表达载体)，其含有编码抗ENO1中和抗体的本发明提供的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子和/或至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒，包括但不限于pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos。
在本发明中，宿主细胞实际上可以是表达载体可用的任何细胞。包括原核细胞、真核细胞，所述原核细胞包括但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠内菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺杆菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如绿脓杆菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。
真核细胞包括但不限于原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞，所述动物细胞包括哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞；其中，哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、癌细胞。
本发明提供了一种衍生物，所述衍生物包括在上述单克隆抗体或上述核酸分子上连接诊断试剂、治疗试剂；
所述诊断试剂在本领域中是已知的，其与蛋白质(包括抗体)连接的方法同样是已知的，包括但不限于荧光标记、放射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。
其中，荧光标记包括但不限于Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5，6-FAM、异硫氰酸荧光素、HEX、6-JOE、Oregon Green488、Oregon Green 500、OregonGreen 514、Pacific Blue、REG、罗丹明绿、罗丹明红、Renographin、ROX、TAMRA、TET、四甲基罗丹明和/或Texas Red。
放射性同位素包括但不限于砹211、14碳、51铬、36氯、57钴、58钴、铜67、152Eu、镓67、3氢、碘123、碘125、碘131、铟111、59铁、32磷、铼186、铼188、75硒、35硫、锝99m(technicium)和/或钇90。
顺磁性离子包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和/或铒(III)的离子。
所述治疗试剂包括但不限于细胞因子、化学治疗剂、放射治疗剂、抗炎剂、激素、抗体Fc片段、TLR激动剂、含CpG的分子或免疫共刺激分子。
其中，细胞因子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、TNFα、GM-CSF、INFα、IFNβ和IFNγ。
化学治疗剂包括但不限于顺铂(CDDP)、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、喜树碱、异环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安(busulfan)、亚硝基脲(nitrosurea)、更生霉素、柔红霉素(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicomycin)、丝裂霉素、依托泊甙(VP 16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受体结合剂、紫杉醇、吉西他滨(gemcitabien)、诺维本(navelbine)、法尼基蛋白(farnesyl-protein)转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)、5-氟脲嘧啶、长春新碱、长春花碱和甲氨蝶呤。
另一类治疗剂是毒素，包括但不限于霍乱毒素、肉毒杆菌毒素、百日咳毒素、蓖麻毒蛋白A和B链以及其他天然毒素和合成毒素。
抗炎剂包括但不限于NSAID、类固醇类、瑞帕霉素、英夫利昔单抗和地尼白介素(ontak)。
TLR激动剂是刺激或打开免疫系统的化合物。TLR9的天然激动剂是细菌和病毒中常见的DNA的组分。TLR7和TLR8的天然激动剂是病毒中发现的RNA模式。在识别其天然DNA和RNA激动剂后，TLR7、8和9各自引发不同级联的保护性免疫应答。TLR激动剂包括寡脱氧核苷酸、透明质酸片段、咪喹莫特、薰草菌素C、脂质A、loroxibine、LPS、单磷酰脂质A(monophosphoryl lipda A)、肉豆蔻醚、雷西莫特(resiquimod)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)鞭毛蛋白、HKLM、PAM3CSK4和聚肌胞苷酸(polyI：C)。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述单克隆抗体、上述物质或上述衍生物。
所述药物组合物还包括免疫调节剂。
在本发明中，免疫调节剂是指调节免疫应答的物质、试剂、信号传导途径或其组分。免疫应答的调节、修饰或调制是指免疫细胞自身或其细胞活性发生改变。这种调节包括对免疫系统的刺激或抑制，其表现为各种细胞类型数量的增加或减少，以及这些免疫细胞活力的增强或降低，或免疫系统内可能发生的其他变化。
所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
在本发明中，药学上可接受的是指该组合物足以实现治疗效果并无不良副作用，此外，可以根据疾病的类型，患者的年龄，体重，健康状况，性别和药物敏感性较容易地确定给药途径，给药方式，给药频率，疗程，与本发明公开的组合物结合或联合使用的药物，以及医学中已知的其他因素。药学上可接受的载体包括但不限于粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和食用香料。对于注射制剂可包括缓冲剂，防腐剂，镇痛剂，增溶剂，等渗剂和稳定剂。对于局部给药的制剂，载体可包括基础物，赋形剂，润滑剂和防腐剂。
本发明所公开的组合物可以与上述药学上可接受的载体组合配制成各种剂型。例如，对于口服给药，可以将药物组合物配制成片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆或糯米纸囊剂。对于可注射制剂，可将药物组合物置于可作为单次剂量或多次剂量容器的安瓿瓶中。药物组合物还可以配制成溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊和长效制剂。
另一方面，适用于药物制剂的载体，赋形剂和稀释剂的实例包括但不限于乳糖，右旋糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯胶，海藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。此外，药学制剂可以进一步地包括填充剂，抗凝剂，润滑剂，保湿剂，调味剂和防腐剂。
本发明提供了上述单克隆抗体、上述物质、上述衍生物或上述药物组合物在制备预防和/或治疗ENO1相关疾病的药物中的应用。
ENO1相关疾病是存在表达ENO1的细胞的疾病或病症。
所述ENO1相关疾病包括肿瘤、代谢性疾病和/或免疫疾病。
其中，肿瘤包括但不限于肝癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌、子宫内膜癌。
免疫疾病包括但不限于类风湿性关节炎、骨关节炎、系统性红斑性狼疮、哮喘、炎症性肠道疾病、多发性硬化、克罗恩氏病、胃炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎和移植物对抗宿主疾病。
代谢疾病包括但不限于骨质疏松、糖尿病、高血脂症、痛风、维生素D缺乏病、蛋白质-能量营养不良症。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例1ENO1蛋白的表达和纯化
1、ENO1蛋白的表达
用接种环直接取冻存的大肠杆菌EN0-1/Rosetta，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时，摇床37℃、300rpm。挑取一个单菌落，转到3ml LB培养基中，37℃，280rpm，培养3-5小时，测得OD600＝0.6-0.7，SDS-PAGE实验证明筛选最佳的IPTG诱导浓度比例1：6000和诱导时间3h(图1)。
2、ENO1蛋白的纯化
Ni金属螯合亲和柱的挂Ni、预平衡处理，变性蛋白加入适宜体积Ni-NTA His-BindResins(3-5mg/ml柱容量，保守地可按2mg/ml估算，按蛋白含量估算)，室温颠倒地结合1h，装柱，收集流穿液备检。取部分蛋白，确定洗涤条件和洗脱的pH值。采用0、20、50、500mM洗脱一次，直到无蛋白洗脱。所有洗脱液洗脱后立即调节pH至8.0，收集所有流穿液SDS-PAGE分析，实验结果表明：0、500mM咪唑洗脱，循环上样3h效果好(图2)。
实施例2ENO1mAb的制备
1、动物免疫
将ENO1蛋白(100μg/ml)与弗氏完全佐剂等体积混合，然后经背部皮下多点注射雌性BALB/c小鼠；间隔三周后进行二次免疫，将ENO1蛋白(200μg/ml)与弗氏不完全佐剂等体积混匀，在BALB/c小鼠背部皮下多点注射；三周后进行三次免疫，与第二次免疫方案相同，三周后进行四次免疫，与第三次免疫方案相同，采集BALB/c小鼠的血液，应用间接ELISA法，测定血清中抗体滴度。冲击免疫为中(500μg/ml)ENO1静脉注射。
2、BALB-C小鼠胸腺细胞(滋养细胞)
将小鼠从75％酒精中取出，用眼科剪剪开小鼠腹部的皮肤，暴露腹部取脾脏，取出完整脾脏，剪去其周围的脂肪或组织，拍照。将胸腺在100目筛网上用无齿镊轻轻研磨，用培养基冲洗细胞过筛网到大平皿中，获得胸腺细胞悬液，将细胞悬液转移至50ml离心管中。离心、洗涤：1200rpm，5min，用移液管吸弃上清，加入20ml ImEm培养液轻轻吹匀，重悬。
3、免疫后小鼠脾细胞
用眼科剪剪开小鼠腹部的皮肤，暴露腹部取脾脏，用另一眼科剪剪开小鼠腹膜，取出完整脾脏，剪去其周围的脂肪或组织。将脾脏在100目筛网上用无齿镊轻轻摩擦，用培养基冲洗细胞过筛网到大平皿中，获得脾脏细胞悬液，将细胞悬液转移至50ml离心管中，取20μl细胞悬液进行细胞计数。
4、SP2/0细胞培养
用移液管弃去DmEm-H培养液，加入10ml ImDm培养液浸泡，轻轻拍打培养瓶使细胞脱落，收集细胞悬液至50ml离心管，取20μl细胞计数，离心、洗涤：1200rpm，5min，用移液管吸弃上清，加入20ml培养液轻轻吹匀，重悬。
5、脾细胞与SP2/0细胞混合
SP2/0的细胞悬液转移至已弃上清的脾细胞离心管中轻轻吹匀，重悬脾细胞与SP2/0混合：1200rpm，5min，离心，用移液管吸弃上清，将50ml离心管于掌中轻轻摩擦至底部细胞充分混合均匀，准备45℃温水于保温瓶中，用前加入些许冰块，调整温度至38℃，将50ml离心管至于温水中，缓缓加入1ml PEG，边加边轻轻摇匀，随后缓缓加入10ml ImDm培养液，合计5min。离心：1200rpm，5min，移液管吸弃上清，加入胸腺细胞悬液，轻轻混合均匀，1200rpm，5min，离心，用移液管吸弃上清，加入24ml ImDm培养液，重悬。将混合细胞与培养基(2ml细胞悬液+1ml HAT+2ml ImDm培养液+10ml HyClone高级进口血清+25ml 2.5％甲基纤维素)，上下颠倒50ml离心管20min，至管内完全均匀。
6、阳性克隆的筛选与克隆化
待克隆化的阳性融合细胞，可先转入24孔板扩大培养后再克隆，也可边扩大边从96孔板取样直接克隆。用吸管将细胞群吹打分散，制成悬液，按前述方法精确计数活细胞数。从96孔板直接取样克隆，计数取样只用1滴悬液，用另一支滴管加无血清培养液9滴作10倍稀释，计数。用HT培养液将细胞稀释至每毫升5、30和50个细胞各40ml。每种杂交瘤细胞用一块备好的含饲养细胞的96孔板，每个稀释度32孔，每孔加细胞悬液0.1ml，每孔应含0.5、3和5个细胞。由于计数和加样的误差，往往偏高或偏低。如从96孔板直接取细胞克隆时，应在克隆完后立即把孔中和稀释管中剩余细胞全部转入24孔中扩大培养，以备失败时重新克隆。在37℃，5％-7％培养箱中培养7天左右，镜检，标出所有板孔的细胞群落数。采样，进行抗体检测。将单克隆阳性孔细胞先转入24孔，后在培养瓶中扩大培养，然后冻存。共获得4株杂交瘤细胞株，分别命名为ENO1mAb(17G12、12A11、21A3和23G5)，随后，进行杂交瘤细胞的冻存。
7、杂交瘤细胞的培养
杂交瘤细胞以含有12％FBS、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM-H完全培养液，在37℃、5％CO2，大批量培养杂交瘤细胞收集上清时，一般稳定传代15-20次后，需重新复苏一批新细胞；一般使用1:2比例传代，于传代后24h换液，48h后长满再传代。
8、无血清杂交瘤上清的收集
杂交瘤扩大培养至T175瓶中，每次约30瓶；传代后第2天换液，48h后长到约75-90％满后，移去完全培养基，改换无血清培养基约20ml/瓶；次日每天用1mol/L的无菌NaOH调节液体的PH至7.0-7.5左右，并添加新鲜无血清培养基2-3ml；待贴壁细胞逐渐减少，细胞活度下降至40％-50％时，3000rpm，10min离心，收集无血清杂交瘤上清。
9、抗体纯化
将预装柱上面盖子旋开，用蠕动泵滴PBS赶走气泡，PBS平衡大约20个柱体积。上完样后取1ml的流穿于1.5ml的EP管中，用PBS洗杂，调流速至1ml/min(1ml柱子)，洗杂至少5个柱体积，即5ml PBS，测OD280；管中加入75μl的1MTris-HCl(pH 9.0)中和buffer。用0.1MGlycine-HCl(pH 2.7)洗脱buffer洗脱柱子，调流速1ml/min，接洗脱下来的液体，立即混合，使洗脱下来的抗体立即恢复PH值至7.0左右，每管测OD280。当OD值小于0.1时则可以停止接液。将洗脱下来的抗体混合，将混合后蛋白取10μl留样；将浓缩好的抗体放入20倍体积的预先预冷的PBS中4℃，搅拌透析，每次透析4h，透析3次；透析好的抗体离心，12000rpm，离心15min。0.22μm滤器过滤除菌，分装，以避免反复冻融。将收集到的ENO1mAb进行抗体浓度测定及SDS-PAGE电泳分析。经SDSPAGE验证显示，ENO1mAb纯化效果较好，无明显杂带，符合抗体重链和轻链大小(图3)。
10、抗体亚类的检测
用PBS将捕获抗体稀释为1μg/ml，100μl/孔加入96孔酶标板，4℃孵育16h；弃去包被抗体，加入含1％BSA的PBS封闭液，300μl/孔，37℃封闭酶标板4h；弃去封闭液，用含0.05％Tween-20的PBS洗板三次，300μl/孔，1min/次×5次；按设计加入待测样品，100μl/孔，37℃孵育1.5h；分别加入HRP标记的各种类型二抗(HRP标记的羊抗鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、κorλ，1：2000稀释)，100μl/孔，37℃孵育1h；PBS再洗涤2次；加入TMB显色，100μl/孔，37℃孵育30min；加入2M H2SO4，50μl/孔。酶标仪测定四种抗体(17G12、12A11、21A3、23G5)亚型，其对应的亚型为(IgG2b、IgG1、IgG1、IgG2a)(图4)。
11、非竞争性ELISA检测抗ENO1单抗对重组ENO1的亲和力
在采用非竞争性ELISA法(Beatty法)可测定各单抗的亲和常数Ka。首先优化ENO1抗原包被浓度梯度和抗体系列稀释的梯度浓度，最终确定正式试验条件为：以不同浓度梯度的ENO1抗原(0.593、0.395、0.2633、0.1755、0.117、0.078、0.000g/ml)包被，采用四种单抗稀释浓度(32000、16000、8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、3.9、1.95、0.98、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03、0.0125、0ng/ml)。此条件下针对未标记的ENO1单抗进行测定，绘制抗体OD值为纵坐标，抗体浓度对数为横坐标的反应曲线，可以在各个ENO1包被浓度下均能得到较好的典型S型反应曲线，计算出待检测抗体解离常数KD，其中，23G5KD＝3.729x10-9(图5)。
12、ENO1单抗23G5测序
采用培养23G5杂交瘤细胞总RNA提取试剂盒进行RNA的抽提，提取的RNA溶液于-70℃保存。对提取的RNA进行反转录，末端修复，然后进行接头连接和PCR扩增纯化得到NGS文库，文库库检合格后用于上机测序。对构建好的文库进行高通量测序，每个样品测6G数据。二代高通量测序仪器测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，称之为raw data或raw reads，结果以FASTQ文件格式存储，包含reads的序列以及碱基的测序质量。对raw data进行数据过滤，从而获得clean data用于后续分析。使用Trinity-v2.11.0软件对Clean Reads进行无参组装。使用igblast进行比对分析，小鼠的免疫数据库来自IMGT。然后对fmt7文件进行整理和过滤。使用Change-O的子模MakeDb.py，ParseDb.py及ConvertDb.py进行分析。对数据进行分析整理得到单克隆抗体轻链和重链的序列，并根据序列得到可变区氨基酸序列，23G5抗体的序列如表1所示。
表1抗体序列
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实施例3ENO1单抗23G5对骨关节炎小鼠的治疗效果研究
膝盖前交叉韧带切除术(Anterior cruciate ligament transection，ACLT)的骨关节炎小鼠模型的构建：小鼠用右美托咪啶(0.25mg/kg)和氯胺酮(25mg/kg)肌内注射麻醉，常规备皮消毒左侧膝关节，取髌旁内侧切口显露膝关节，显露髌骨后将髌骨向外侧脱位，尽量屈曲膝关节显露ACLT，在直视下切断前交叉韧带，彻底止血，将髌骨复位，1号丝线逐层闭合关节腔。假手术组仅切开缝合左侧膝关节，未切断前十字韧带。
6周龄雄性C57B6N小鼠(n＝25)购置于北京维通利华实验动物技术有限公司。经2周适应环境后，将小鼠随机分为5组，每组5只：①正常组，未腹腔注射；②假手术组，未腹腔注射；③低剂量23G5单抗ACLT模型组，ACLT后腹腔注射单抗23G5(2.5mg/kg)；④中剂量23G5单抗ACLT模型组，ACLT后腹腔注射单抗23G5(10mg/kg)；⑤高剂量23G5单抗ACLT模型组，ACLT后腹腔注射单抗23G5(40mg/kg)。
治疗7周后，micro-CT扫描显示：与对照组相比，其通过腹膜内注射不同剂量(2.5、10和40mg/kg)后小鼠左侧胫骨平台的软骨下骨显著改善(图6)。此外，Micro-CT定量分析显示，高、中和低剂量23G5单抗对骨密度(BMD)、骨体积/组织体积分数(BV/TV)、孔隙率(PO)、结构模型指数(SMI)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和骨小梁模式因素(Tb.Pf)发挥拮抗作用(图7)。进一步通过HE和番红O染色以评价单抗23G5对小鼠胫骨内侧平台关节软骨的影响。与对照组相比，腹腔注射单抗23G5(2.5、10和40mg/kg)显著减少关节软骨的破坏(图8)。
实施例4ENO1单抗23G5对骨质疏松大鼠的治疗效果研究
骨质疏松大鼠模型(OVX)的建立：40只10周龄SD雌性大鼠(体重230-250g)，给予充足的食物和水，适应性喂养一周后，所有大鼠接受异氟烷吸入，联合腹腔注射10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉。无菌条件下，30只大鼠接受双侧卵巢切除手术(OVX)，构建去卵巢诱导的骨质疏松动物模型；10只大鼠切除双侧卵巢周围同体积脂肪组织(假手术，Sham)。
将40只大鼠分为5组：①假手术组(n＝10)：Sham大鼠接受100μl PBS治疗；②OVX组(n＝10)：OVX大鼠接受100μl PBS治疗；③OVX+低剂量组(n＝10)：OVX大鼠接受低剂量23G5单抗治疗(2.5mg/kg比例的23G5单抗溶于100μl PBS)；④OVX+中剂量组(n＝10)：OVX大鼠接受中剂量23G5单抗治疗(10mg/kg比例的23G5单抗溶于100μl PBS；⑤OVX+高剂量组(n＝10)：OVX大鼠接受高剂量23G5单抗治疗(40mg/kg比例的23G5单抗溶于100μl PBS)。所有大鼠通过腹腔注射，每周1次，持续8周。
治疗8周后，micro-CT扫描显示：OVX组(PBS处理)股骨远端的骨小梁形态中断、稀疏；而OVX+23G5组中随着23G5抗体浓度逐渐增加后，这种糟糕的状况获得了明显改善(图9)。
此外，相较于PBS处理组的OVX大鼠，OVX+23G5组处理组的大鼠相关参数包括骨体积/组织体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨密度(BMD)的值明显提高；相反，骨小梁分离度(Tb.Sp)的值明显降低(图10)。
实施例5ENO1单抗23G5对类风湿关节炎大鼠的治疗效果研究
选取8-12周龄Wistar大鼠，体重180±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
类风湿关节炎(CIA)大鼠构建方法如下：乳化：将鸡II型胶原(4mg/ml)和完全弗式佐剂(CFA)(4mg/ml)1:1进行混合，用10ml针筒反复抽吸，充分乳化(至少30分钟)，数小时后，滴少许乳化剂到水面上，如果30s乳剂不会迅速扩展，则为乳化完全。首次免疫：将乳化剂转移至1ml注射器，在距离Wistar大鼠尾根部2cm处，避开血管，进行多点皮下注射，每只大鼠共注射乳化剂100μl。记作第0天。二次免疫：首次免疫7d后，进行加强免疫，将鸡II型胶原(4mg/ml)和非完全弗式佐剂(4mg/ml)1:1进行混合，具体方法同上。
在第33d，36d，39d，42d，48d和51d时，23G5单抗处理组CIA大鼠的关节炎评分低于Model组(p<0.05)，说明CIA大鼠体内被23G5单抗作用后，CIA大鼠关节炎症状减轻，同时，随着23G5单抗作用的剂量的提高，CIA大鼠关节炎症状减轻，说明ENO1单抗能降低CIA大鼠炎症的抑制作用并且显示剂量依赖(图11)。
Model组中CIA大鼠滑膜组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17分泌增高，23G5单抗处理后CIA大鼠滑膜组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17mRNA表达量显著低于Model组(p<0.01或0.05)，提示CIA大鼠体内被23G5单抗作用后，CIA大鼠关节滑膜组织炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17分泌减少。提示23G5单抗能抑制CIA大鼠滑膜组织分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17分泌减少，且有剂量依赖作用(图12)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (27)
1.一种抗ENO1的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区具有如SEQID NO:8所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链亚型为IgG2。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述IgG2包括IgG2a、IgG2b。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链亚型为IgG2a。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链亚型为κ。
7.如下任一项的物质：
（1）核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体；
（2）载体，其特征在于，所述载体包括（1）中所述的核酸分子；
（3）宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括（1）中所述的核酸分子或（2）中所述的载体；
（4）药物偶联物，其特征在于，所述药物偶联物包括权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体；
（5）一种检测ENO1的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的物质，其特征在于，（2）中所述的载体具有与抗体可操作的连接的信号肽。
9.根据权利要求8所述的物质，其特征在于，所述载体还包括用于控制表达的元件。
10.根据权利要求8所述的物质，其特征在于，所述载体还包括有助于其进入细胞的材料。
11.根据权利要求7所述的物质，其特征在于，（3）中所述的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；
所述原核细胞包括大肠杆菌。
12.根据权利要求11所述的物质，其特征在于，所述真核细胞包括原生生物细胞、动物细胞、植物细胞或真菌细胞。
13.根据权利要求12所述的物质，其特征在于，所述动物细胞包括哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞。
14.根据权利要求7所述的物质，其特征在于，（4）中所述的药物偶联物还包括可检测标记物、药物、毒素、细胞因子和/或酶。
15.根据权利要求7所述的物质，其特征在于，（5）中所述的产品还包括用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。
16.根据权利要求15所述的物质，其特征在于，用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐。
17.根据权利要求15所述的物质，其特征在于，所述产品包括试剂盒、试纸条。
18.根据权利要求17所述的物质，其特征在于，所述试剂盒包括连接有信号产生化合物的抗体的缀合物。
19.一种衍生物，其特征在于，所述衍生物包括在权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体或权利要求7所述的核酸分子上连接诊断试剂、治疗试剂。
20.根据权利要求19所述的衍生物，其特征在于，所述诊断试剂包括荧光标记、放射性同位素、化学发光分子、顺磁性离子或自旋捕获试剂。
21.根据权利要求19所述的衍生物，其特征在于，所述治疗试剂包括细胞因子、化学治疗剂、放射治疗剂、抗炎剂、激素、抗体Fc片段、TLR激动剂、含CpG的分子或免疫共刺激分子。
22.如下任一项的方法：
（1）一种制备权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求7-13任一项所述的宿主细胞，回收单克隆抗体；
（2）一种非诊断目的的检测样本中ENO1的方法，其特征在于，所述方法包括：使权利要求1-6任一项所述的抗ENO1的单克隆抗体与待测样本接触，从而检测待测样本中ENO1的水平。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，（1）中所述的方法还包括纯化所述的单克隆抗体。
24.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体、权利要求7-18任一项所述的物质或权利要求19-21任一项所述的衍生物。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括免疫调节剂。
26.根据权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
27.如下任一项的应用：
（1）权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体、权利要求7-18任一项所述的物质或权利要求19-21任一项所述的衍生物在非诊断目的的检测ENO1中的应用；
（2）权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体、权利要求7-18任一项所述的物质或权利要求19-21任一项所述的衍生物在制备诊断骨关节炎、类风湿关节炎或骨质疏松的产品中的应用；
（3）权利要求1-6任一项所述的单克隆抗体、权利要求7-18任一项所述的物质、权利要求19-21任一项所述的衍生物或权利要求24-26任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗骨关节炎、类风湿关节炎或骨质疏松的药物中的应用。
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