CN112661852A - 针对乙肝病毒的双特异性抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对乙肝病毒的双特异性抗体,以及相关的核苷酸序列、表达载体和宿主细胞。本发明还提供了包含所述双特异性抗体的药物组合物以及相应的制药用途。
Description
技术领域
本发明涉及病毒免疫领域。更具体地,本发明涉及一种针对乙型肝炎病毒的双特异性抗体及其应用。
背景技术
乙型肝炎病毒感染,尤其是慢性HBV感染是全球最为重要的公共卫生问题之一(Dienstag JL.Hepatitis B virus infection.N Engl J Med 2008;359(14):1486-1500)。慢性HBV感染可导致慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(Liver cirrhosis,LC)和原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)等一系列肝脏疾病(Liaw YF,Chu CM.Hepatitis B virus infection.Lancet 2009;373(9663):582-592)。据报道,目前全球约有超过3.5亿的慢性乙型肝炎病毒感染者,这些感染者最终死于HBV感染相关肝脏疾病的风险可达15%-25%,全球每年超过100万人死于此类疾病。
直到目前,临床上对慢性乙型肝炎的治疗仍面临着过多的困扰。虽然治疗的总体目标是明确的,即逐渐地长期抑制或消除HBV,继而消除肝细胞凋亡坏死及纤维化,延缓和预防疾病的进展等,但在实施过程中还存在着许多困难和争议。HBV的持续存在和复制是导致病情进行性发展的主要原因,因此抗病毒治疗是关键手段,尽管核苷(酸)类似物有了长足的发展,但由于HBV的突变变异,HBV DNA可能与宿主基因的整合以及重组共价封闭DNA(cccDNA)难以清除等因素,以致抗病毒治疗存在着不彻底性。
基于免疫学手段发展新的治疗慢性HBV感染的药物是此领域的重要研究方向之一。慢性HBV感染的免疫治疗通常通过主动免疫治疗(其对应药物形式如疫苗等)和被动免疫治疗(其对应药物形式如抗体等)等两种方式来进行。主动免疫治疗是指,通过施用治疗性疫苗(包括蛋白疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗等),刺激慢性HBV感染者机体主动产生针对HBV的细胞免疫应答(CTL效应等)或/和体液免疫应答(抗体等),从而达到抑制或清除HBV的目的。被动免疫治疗(以抗体为例)则是指,向HBV感染者被动施用具有治疗特性的抗体,并利用抗体介导的病毒中和作用阻断HBV感染新生肝细胞,或利用抗体介导的免疫清除作用清除体内病毒和被感染的肝细胞,从而起到治疗的效果。目前,从预防性乙型肝炎疫苗免疫应答者或HBV感染恢复者血清/血浆中纯化获得的Anti-HBs多克隆抗体,即高效价的乙肝免疫球蛋白(HBIG)已广泛应用于阻断HBV的母婴垂直传播、预防慢性HBV感染者肝移植后的HBV再感染、以及预防意外暴露于HBV的人群的感染。然而,其存在例如高效价血浆来源较少、价格昂贵、性质不稳定、潜在的安全性问题等诸多局限性。
因此迫切需要研发一种安全有效和相对可控的生物制品替代人乙肝免疫球蛋白。因单克隆抗体具有特异性强,灵敏度高且易扩大生产等优点,故需研发针对乙肝表面抗原(乙型肝炎表面抗原,HBsAg)的抗体,以期能够安全有效地阻止HBV感染及其相关的肝炎、肝硬化及肝癌的进程。
此外,由于疾病的多因素性,单一靶点治疗往往不能满足临床的需求。双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体,其能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁,产生导向性的效应功能,在免疫治疗中具有广阔的应用前景。
使用双特异性抗体重定向免疫效应细胞T细胞以便靶向杀死肿瘤细胞已经显示出了可观的临床前和临床前景(参见,例如,Topp等人,2012,Blood 120:5185-87;Bargou等人,2008,Science 321:974-77)。迄今为止所开发的双特异性抗体含有对用于T细胞募集和活化的CD3具有特异性的第一结合位点和所靶向的疾病相关联抗原如CD19的第二结合位点(Bassan,2012,Blood 120:5094-95)。双特异性抗体使CD3+T细胞与所靶向的疾病细胞直接接触并且诱导细胞介导的细胞毒性(Bassan,2012)。已经报告抗-CD3X抗-CD 19双特异性抗体可在患有MRD+ALL的大约70%成年患者中以极低浓度来产生完全并且持久的分子缓解(Topp等人,2012,Blood 120:5185-87)。此外,免疫效应细胞重定向BsAb不限于T细胞。包含针对NK细胞抗原CD16a和肿瘤相关的抗原(例如,CD19、CD22、CD33)的scFv的双特异性杀灭衔接子也显示出有效的抗癌活性(例如,Miller,Hematology Soc Hematol Educ Pogram2013:247-53)。由此可见,包含特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域以及特异性识别治疗靶标抗原的第二功能域的双特异性抗体设计可增强免疫细胞对治疗靶标的识别,增加免疫细胞与靶标的接触时间,有效增强免疫细胞对肿瘤等靶标的杀伤作用。
然而,针对乙型肝炎病毒进行基于T细胞/NK细胞重导向的双特异性抗体设计尚无报道。因此,本领域存在对于针对乙型肝炎病毒的双特异性抗体的需求。
发明内容
为解决上述技术问题,在一个方面中,本发明提供了一种针对乙肝病毒的双特异性抗体,其包含:
1)特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域;以及
2)特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域。
在一个优选实施方式中,所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
在进一步的实施方式中,当所述免疫细胞为NK细胞时,免疫细胞表面抗原为CD16a;当所述免疫细胞为T细胞时,免疫细胞表面抗原为CD3、CD2、CD5、CD28和/或CD44。在一个优选实施方式中,免疫细胞表面抗原为CD16a或CD3。
在一个优选实施方式中,所述特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域是通过筛选得到的高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。
在进一步的实施方式中,所述筛选方法包括以下步骤:
a)采用超高流速流式分选系统分离接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞,并制备成单细胞样本;
b)采用Single Cell RT-PCR技术克隆每个样本中抗体相关基因,体外重组表达相应抗体;
c)经过功能表位测定、亲和力测定和/或中和HBV活性测定,筛选出高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。
在另一方面中,本发明提供了一种编码本发明所述双特异性抗体的核苷酸序列,其包含:编码特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域的核苷酸序列;以及编码特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域的核苷酸序列。
在另一方面中,本发明提供了包含本发明所述核苷酸序列的表达载体。在一个优选实施方式中,所述表达载体包含所述核苷酸序列,以及与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。在一个优选实施方式中,所述载体包括pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)和/或pDHFR。
在另一个方面中,本发明提供了包含本发明所述表达载体的宿主细胞。在一个实施方式中,所述宿主细胞为真核细胞。在一个优选实施方式中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
在另一个方面中,本发明提供了一种药物组合物,其包含本发明所述的双特异性抗体,以及药学上可接受的载体或佐剂。
在另一个方面中,本发明提供了本发明所述的双特异性抗体在制备治疗或预防乙型肝炎的药物中的应用。
本发明的以上各技术方案具有以下有益的技术效果:
1、本发明的双特异性抗体可同时识别乙肝病毒表面抗原和免疫细胞表面抗原,实现免疫细胞对乙肝病毒的靶向杀伤。
2、本发明的双特异性抗体作为桥梁连接免疫细胞和乙肝病毒,可增加免疫细胞与病毒的接触时间,有效增强免疫细胞对病毒的杀伤作用。由于同时结合了两种抗原,本发明的双特异性抗体可有效激活免疫细胞,拉近免疫细胞与病毒的距离,增加效靶比,增强免疫细胞的杀病毒能力。
3、本发明的双特异性抗体选择经筛选的抗HBsAg单克隆抗体作为特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域,其具有高亲和力、高活性等优势,能够强化对HBsAg的识别和后续免疫作用;且所述抗体是从移植乙肝疫苗的志愿者跨越血液中HBsAg特异的记忆性B细胞中克隆获得的全人源抗体,其具有较鼠源,嵌合和人源化抗体更低的免疫原性。
4、本发明的双特异性抗体不仅能够特异性识别/结合HBsAg,能够中和HBV的毒力,而且能够在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平,能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。此外,本发明的双特异性抗体可潜在提高CD8+和CD4+两个群体细胞在肝脏组织中的浸润,同时潜在上调IFN等杀伤效应分子的表达量。因此,本发明的双特异性抗体具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
下面将结合具体实施方式和实施例对本发明的技术方案进行详细描述,但是本领域技术人员将理解,下列具体实施方式和实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的范围进行任何限定。根据具体实施方式和实施例的下列详细描述,本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
具体实施方式
如上所述,本发明提供了一种针对乙肝病毒的双特异性抗体,其包含:
1)特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域;以及
2)特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域。
双特异性抗体
如本发明所用,术语“抗体”是指,通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε,并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR)),其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。
双特异性抗体(bispecificantibody,BsAb)是具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶标周围,介导特异性杀伤作用的新型人工抗体。通过BsAb介导免疫细胞杀死肿瘤细胞/病毒是当前肿瘤/病毒免疫治疗应用研究的热点,其主要作用机理是BsAb能同时结合肿瘤/病毒相关抗原和免疫细胞上的靶分子,直接触发免疫效应细胞对肿瘤/病毒的特异性杀伤。
双特异性抗体的制备是本领域众所周知的,且主要包括化学偶联法、双杂交瘤融合法以及重组基因制备等方法,每一种制备方法都会产生其独特的结构。化学偶联法最早出现于上世纪80年代,其原理是通过化学偶联剂(如邻苯二马来酰亚胺)将两个完整IgG或两个F(ab’)2抗体片段偶联成一种BsAb。双杂交瘤融合法是通过细胞融合的方法将两株不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞株,然后通过常规的杂交瘤筛选法克隆靶细胞。利用杂交-杂交瘤方法制备的双特异性抗体随机性较大,效率较低,但是BsAb生物活性较好,抗体结构比较稳定。利用基因工程技术制备双特异性抗体是目前最常用的制备方法,其制备原理为利用基因工程技术对传统抗体进行基因工程方面的改造,从而形成各种形式的双特异性抗体。
免疫细胞和免疫细胞表面抗原
如本文所用,术语“免疫细胞”俗称白细胞,包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等,也特指能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等。淋巴细胞是免疫系统的基本成分,在体内分布很广泛,主要是T细胞、B细胞受抗原刺激而被活化、分裂增殖、发生特异性免疫应答。除T细胞和B细胞外,还有K淋巴细胞和NK细胞,共四种类型。T细胞是一个多功能的细胞群。除淋巴细胞外,参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞。
在一个优选实施方式中,所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
如本文所用,术语“免疫细胞表面抗原”是指免疫细胞表面上能被特异性抗体(如单克隆抗体)所识别的表面分子。由于表面抗原是在淋巴细胞分化过程中产生的,故又称为分化抗原。
在进一步的实施方式中,当所述免疫细胞为NK细胞时,免疫细胞表面抗原为CD16a;当所述免疫细胞为T细胞时,免疫细胞表面抗原为CD3、CD2、CD5、CD28和/或CD44。在一个优选实施方式中,免疫细胞表面抗原为CD16a或CD3。
CD16a(FcγRIIIA)是一种跨膜结构的IgG Fc受体,有190AA的胞外区和25AA的胞内区,属于Ig超家族成员,主要分布于NK细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞表面。抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是抗体的一种重要的效应功能,当抗体与靶标(比如肿瘤细胞)结合以后,抗体的Fc端可通过Fc受体(CD16a)与NK细胞结合并激活NK细胞,后者通过释放颗粒酶及穿孔素等将靶细胞杀死。CD16a介导NK细胞和单核巨噬细胞的ADCC作用,在特异性和非特异性免疫中具有重要作用,是机体清除免疫复合物和肿瘤细胞的关键受体。因此以CD16a分子为靶标的双特异性抗体对于引导NK细胞可能具有优势。
CD3分子通过盐桥与T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)相连,参与T细胞的信号转导,主要用于标记胸腺细胞、T淋巴细胞及T细胞淋巴瘤。CD3存在于外周血T细胞和部分胸腺细胞表面。与TCR形成TCR-CD3复合体分子,将抗原信号传递到细胞内。
针对上述表面抗原类型的抗体及其制备是本领域众所周知的,例如抗CD16a抗体,抗CD3抗体等。
乙肝病毒表面抗原和单克隆抗体抗体筛选
如本文所用,术语“乙肝病毒表面抗原”(HBsAg)是乙肝病毒的外壳蛋白,本身不具有传染性,但它的出现常伴随乙肝病毒的存在,所以它是已感染乙肝病毒的标志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。在感染乙肝病毒后2~6个月,当丙氨酸氨基转移酶升高前2~8周时,可在血清中测到阳性结果。急性乙型肝炎患者大部分可在病程早期转阴,慢性乙型肝炎患者该指标可持续阳性。HBsAg是乙肝病毒单克隆抗体的重要识别目标抗原。
在一个优选实施方式中,所述特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域是通过筛选得到的高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。
在进一步的实施方式中,所述筛选方法包括以下步骤:
a)采用超高流速流式分选系统分离接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞,并制备成单细胞样本;
b)采用Single Cell RT-PCR技术克隆每个样本中抗体相关基因,体外重组表达相应抗体;
c)经过功能表位测定、亲和力测定和/或中和HBV活性测定,筛选出高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。
核苷酸序列、表达载体和宿主细胞
本发明还提供了编码本发明的双特异性抗体的核苷酸序列以及相应核酸分子。核酸可以包括DNA和/或RNA。在一个优选方面中,本发明提供了这样的核酸,其编码如上定义的本发明的双特异性抗体。
在另一个方面中,本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体),其包含根据本发明的核苷酸序列。在某些优选的实施方式中,本发明的载体是例如质粒,粘粒,噬菌体等。在某些优选的实施方案中,所述载体能够在受试者(例如哺乳动物,例如人)体内表达本发明的双特异性抗体。在一个优选实施方式中,所述表达载体包含所述核苷酸序列,以及与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。在一个优选实施方式中,所述载体包括pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)和/或pDHFR。
可以选择或构建合适的载体,其包含合适的调节序列,包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及其他合适序列。适当地,载体可以是质粒,病毒例如噬菌体或噬菌粒、或腺病毒、AAV、慢病毒等。关于进一步的细节,参见例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Sambrook和Russell,2001,ColdSpring Harbor Laboratory Press。用于操作核酸的许多已知技术和规程,例如核酸构建体的制备、诱变、测序、将DNA导入细胞和基因表达,以及蛋白质分析在Current Protocolsin Molecular Biology,第二版,Ausubel等人(编者),John Wiley&Sons,1986;ShortProtocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocolsin Molecular Biology,Ausubel等人(编者),John Wiley&Sons,第四版,1999中详细描述。
在另一个方面中,本发明提供了一种宿主细胞,其包含根据本发明的核苷酸序列或根据本发明的载体。用于在各种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌、酵母和转基因植物和动物。本领域可用的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NS0小鼠黑素瘤细胞、YB2/0大鼠骨髓瘤细胞、人胚肾细胞、人胚视网膜细胞以及许多其他细胞。
药物组合物和制药用途
本发明的双特异性抗体可用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝),用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力,以及用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
因此,在另一个方面中,本发明提供了一种药物组合物,其包含本发明所述的双特异性抗体,以及药学上可接受的载体或佐剂。在一个优选的实施方式中,本发明的药物组合物还可包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方式中,所述另外的药学活性剂是用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的药物,例如其它抗病毒试剂,例如干扰素类药物,如干扰素或聚乙二醇干扰素。
在另一个方面中,本发明提供了本发明所述的双特异性抗体在制备治疗或预防乙型肝炎的药物中的应用。所述药物用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝),用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力,和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
本发明的双特异性抗体或者本发明的药物组合物的施用方式可以是传统的施用途径,包括但不限于,口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如,粉剂、药膏或滴剂),或鼻腔途径。本发明的双特异性抗体可通过本领域已知的多种方法给药。但是,对于许多治疗用途而言,优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射,皮下注射,腹膜内注射,肌内注射)。技术人员应理解,给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中,本发明的双特异性抗体通过静脉输注或注射给予。
本发明的双特异性抗体或者本发明的药物组合物可以配制成多种剂型,例如液体、半固体和固体剂型,例如溶液剂(例如注射剂)、分散剂或悬浮剂、片剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、丸剂、糖浆剂、粉剂、脂质体、胶囊剂和栓剂。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
例如,一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如,可通过下述方法来制备无菌注射溶液:在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段,以及任选地,同时掺入其他期望的成分(包括但不限于,pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂,等渗剂、防腐剂、稀释剂,或其任何组合),随后过滤除菌。此外,可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如,通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中,例如无菌无热原水。
此外,本发明的双特异性抗体可以以单位剂量形式存在于药物组合物中,以便于施用。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用,也可以与另外的药学活性剂(例如其它抗病毒试剂,例如干扰素类药物,如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。在某些优选的实施方式中,将本发明的双特异性抗体与其它抗病毒试剂联合使用,以预防和或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病。本发明的双特异性抗体可以和此类抗病毒试剂同时、分开或连续给药。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明双特异性抗体。“预防有效量”是指,足以预防,阻止,或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量。“治疗有效量”是指,足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明抗体或抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化:待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄,体重和性别,药物的施用方式,以及同时施用的其他治疗等等。
可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如,可以单次给药,可以在一段时间内多次给药,或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
本发明双特异性抗体的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.025到50mg/kg,更优选0.1到50mg/kg,更优选0.1-25mg/kg,O.1-10mg/kg。应注意的是,剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外,本领域技术人员理解,对于任一特定患者,特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整;此处给出的剂量范围只用于举例说明目的,而不限定本发明药物组合物的使用或范围。
实施例
以下结合实施例来对本发明进行进一步的说明,但不应将其理解为对本发明的限制。
实施例不包括对传统方法的详细描述,如:PCR反应、限制性酶切反应、将基因插入到质粒载体、将质粒引入宿主细胞的方法等。这样的方法对于本领域普通技术人员是众所周知的,并且在许多出版物中都有所描述,例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold spring HarborLaboratory Press。且下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1抗HBsAg单克隆抗体制备和筛选
1.1 HBsAg重组B细胞的制备
通过分离注射过乙肝疫苗志愿者的外周血的淋巴细胞,用CD19-PE/Cy5,IgG-PE,HBsAg-biotin,Streptavidin-FITC荧光抗体分离HBsAg+CD19+IgG+B细胞。将MoFlo XDP超速流式细胞分选系统分选的每个HBsAg+CD19+IgG+B细胞注入96-孔单细胞PCR板中,确保每个PCR孔中一个细胞。然后加入裂解液,液氮速冻后,存储于-80℃冰中备用。
1.2 RT-PCR和巢氏PCR克隆抗体可变区基因及基因表达
取冻于-80℃冰箱中的96-孔单细胞PCR板,在冰上使其慢慢融化,加入逆转录酶合成cDNA。采用巢氏PCR的方法扩增其含有的抗体基因。轻重链成对的PCR条带回收后测序。分析其序列后特异性PCR扩增抗体可变区条带,并引入限制性酶切位点。扩增抗体可变区PCR产物与抗体恒定区连接后插入表达载体pcDNA3.1(+)。
1.3抗HBsAg单克隆抗体基因表达
成对的抗体轻链和重链质粒瞬时转染无血清培养基培养的Freestyle 293F细胞,转染7天后收集细胞上清,ProteinA纯化细胞上清中IgG抗体。由此获得多株不同的抗HBsAg单克隆抗体。
1.4抗HBsAg单克隆抗体HBsAg亲和力测定
取一定浓度的单克隆抗体与系列倍比稀释的抗原HBsAg混合,4℃过夜,从而保证反应达到平衡。抗原抗体复合物转入到包被HBsAg酶标板中,37℃孵育1小时。洗涤后加入HRP标记的羊抗人κ链抗体孵育1小时。洗涤后TMB显色450nm波长测定各孔的吸收率,计算抗体的亲和力。
1.5抗HBsAg单克隆抗体体外中和HBV活性的鉴定
采用HepaRG细胞测定各株抗HBsAg单克隆抗体的中和HBV感染HepaRG细胞的能力。用抗HBsAg单克隆抗体(1μg)和HBV(1×106拷贝)预孵育,再加到DMSO和氢化可的松诱导分化的HepaRG细胞,测定其中和HBV活性的能力。感染第7天测定细胞培养上清中HBsAg的含量和细胞中HBV-DNA拷贝数。
综合上述1.4和1.5部分的测定结果,选取高亲和力、高活性的抗HBsAg单克隆抗体株用于后续双特异性抗体制备。
实施例2抗HBsAg-抗CD3双特异性抗体的制备和表征
2.1抗HBsAg-抗CD3双特异性抗体的构建和表达
用PCR方法分别合成抗HBsAg抗体的轻重链可变区基因,以长引物PCR的方法引入该抗体的重链linker ASTKGPSVFPLAP和轻链linker TVAAPSVFIFPP并串联起来。再以限制性内切酶Age I和限制性内切酶SalI酶切并回收含抗CD3抗体的重链的哺乳动物细胞表达质粒CMV/R-IgGl。重组试剂盒重组含抗CD3抗体的重链的哺乳动物细胞表达质粒CMV/R-IgGl和含重链linker ASTKGPSVFPLAP的抗HBsAg抗体PCR产物片段。同样再以限制性内切酶Age I和限制性内切酶Bsiw I酶切并回收含抗CD3抗体的轻链的哺乳动物细胞表达质粒CMV/R-IgKappa,重组试剂盒重组含抗CD3抗体的重链的哺乳动物细胞表达质粒CMV/R-IgKappa和含轻链linker TVAAPSVFIFPP的抗HBsAg抗体PCR产物片段。在Freestyle 293F细胞系中表达抗HBsAg-抗CD3双特异性抗体。
2.2双特异性抗体构型分析
如下对以上制备的双特异性抗体进行构型分析。
取80μL双特异性抗体,加入20μL 5x loading buffer,混匀,100℃煮沸10分钟,作为变性组。
另取80μL双特异性抗体,加入20μL 5x loading buffer,混匀,不作处理,作为非变性组。
将两组样品跑10%的SDS-PAGE胶检测双特异性抗体构型,具体步骤如下:
1)分离胶和浓缩胶的制备:配置10%的分离胶和5%的浓缩胶。配制成分离胶后,将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水。室温放置聚合30-40分钟。待分离胶聚合后,用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分,制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面,插入样品模子;待浓缩胶聚合后,小心拔出样品模子。
2)加样,用移液枪取处理过的样品溶液10μL,小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内,将标记(marker)加入到其中一个槽内。
3)电泳,将电泳槽放置电泳仪上,接通电源,正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时,关电源,把电泳缓冲液倒回瓶中。
4)染色,将胶剥离后,放于加有R250染色液的染色皿中,染液漫过胶即可,置于摇床上,转速约为45r/min,时间约1小时,完成后染液倒掉并用水洗掉染液。
5)脱色,取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里,脱色液漫过胶即可,置于摇床上,转速约为45r/min,时间约1小时,本底色脱净,条带清晰可见即可,完成后倒掉脱色液。
6)拍照,将脱色后的胶置于透明文件夹中,把胶上面的气泡赶出,放于扫描仪上,拍照。
2.3双特异性抗体特异性结合HBsAg蛋白的能力检测
将重组HBsAg蛋白及对照蛋白cIg包被酶联免疫板,经封闭液封闭后,分别加入空白组、不同浓度的对照蛋白cIg及表达纯化的不同浓度的抗HBsAg-抗CD3双特异性抗体孵育,洗板后加入山羊抗人kappa-HRP,TMB显色液显色,酶标仪在450nm波长下读值。依据抗体浓度及对应的OD值绘制图以分析双特异性抗体特异性结合HBsAg蛋白的能力。
2.4双特异性抗体影响HBsAg的定量检测
用William E培养基培养HepaRG细胞,加入2%DMSO培养四周,每三天换液。四周后,诱导分化好的HepaRG细胞呈现典型的肝细胞样小簇,并从非分化的HepaRG细胞中分离出来,DMSO诱导继续培养两周后,细胞约有一半呈现肝细胞样变化。诱导分化好的HepaRG细胞继续用含有10%胎牛血清William E培养基100单位/mL青霉素、100μg/mL链霉素、5g/mL重组人胰岛素、5×105mol/L氢化可的松钠盐继续培养,备用。
纯化并除菌的抗体(1μg/mL)与2×106HBV DNA拷贝数的病毒量室温孵育1小时。加入DMSO诱导分化好的HepaRG细胞中,并加入PEG8000,终浓度为4%,37℃孵育过夜。第二天换液,用磷酸盐缓冲液洗涤三次,加入新鲜的配制好的William E培养基,继续培养。收集感染后第6天的细胞上清,采用罗氏公司生产的电化学发光免疫分析仪及其配套试剂产品定量检测HBsAg。
2.5双特异性抗体影响HBV DNA拷贝数的定量检测
按照HBVDNA荧光定量PCR试剂盒说明书检测感染后第6天的细胞中HBV DNA拷贝数,步骤如下:
(1)准备工作:将样品处理液A置于70℃加热5-10min,融化后混匀备用;在样品处理液B中加无水乙醇6mL,混匀备用;在样品处理液C中加无水乙醇16mL,混匀备用;在去抑制剂中加入700μL灭菌DEPC处理水,溶解后混匀备用;
(2)核酸提取:吸取20μL去抑制剂于0.5mL离心管中;加入100μL样品,用带滤芯吸嘴反复吹打3次;加入100μL样品处理液A,振荡混匀,瞬时离心数秒后置于70℃条件下反应10min;将作好标记的核酸提取柱放入2ml离心管中,将上一步中所有液体移入核酸提取柱。离心10000rpm×1min;将提取柱放入一新的2mL离心管中,加入500μL样品处理液B,离心10000rpm×1min;将提取柱放入一新的2mL离心管中,加入500μL样品处理液C,离心10000rpm×1min;将提取柱放入一新的2mL离心管中,离心14000rpmx1min;将提取柱放入一新的2mL离心管中,小心将50uL灭菌纯水加在柱面中央,静置1min;离心10000rpm×1min。取2mL离心管中的收集液12μL做PCR反应模板。按照HBVDNA荧光定量PCR试剂盒说明书检测荧光值。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,但本领域技术人员将理解:根据已经公开的所有教导,可以对细节进行各种修改和变动,并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (10)
1.一种针对乙肝病毒的双特异性抗体,其包含:
1)特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域;以及
2)特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域。
2.权利要求1所述的双特异性抗体,其中所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。
3.权利要求2所述的双特异性抗体,其中当所述免疫细胞为NK细胞时,免疫细胞表面抗原为CD16a;当所述免疫细胞为T细胞时,免疫细胞表面抗原为CD3、CD2、CD5、CD28和/或CD44。
4.权利要求1所述的双特异性抗体,其中所述特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域是通过筛选得到的高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。
5.权利要求4所述的双特异性抗体,其中所述筛选方法包括以下步骤:
a)采用超高流速流式分选系统分离接种乙肝疫苗的志愿者外周血中HBsAg特异的记忆性B细胞,并制备成单细胞样本;
b)采用Single Cell RT-PCR技术克隆每个样本中抗体相关基因,体外重组表达相应抗体;
c)经过功能表位测定、亲和力测定和/或中和HBV活性测定,筛选出高亲和力、高活性抗HBsAg单克隆抗体株。
6.一种编码权利要求1所述双特异性抗体的核苷酸序列,其包含:编码特异性识别免疫细胞表面抗原的第一功能域的核苷酸序列;以及编码特异性识别乙肝病毒表面抗原的第二功能域的核苷酸序列。
7.包含权利要求6所述核苷酸序列的表达载体。
8.包含权利要求7所述表达载体的宿主细胞。
9.一种药物组合物,其包含权利要求1所述的双特异性抗体,以及药学上可接受的载体或佐剂。
10.权利要求1所述的双特异性抗体在制备治疗或预防乙型肝炎的药物中的应用。
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