CN106565840B - 抗乙肝表面抗原的抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗乙肝表面抗原(HBsAg)的抗体(特别是人源化抗体)，编码它们的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物。此外，本发明还涉及所述抗体和药物组合物的用途。本发明的抗体和药物组合物可用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，或用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
Description
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是治疗乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus,HBV)感染的领域。具体而言，本发明涉及抗乙肝表面抗原(HBsAg)的抗体(特别是人源化抗体)，编码它们的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物。所述药物组合物可用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，或用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。因此，本发明进一步涉及，所述抗体(特别是人源化抗体)及其变体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，或用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
背景技术
乙型肝炎病毒感染，尤其是慢性HBV感染是全球最为重要的公共卫生问题之一(Dienstag JL.Hepatitis B virus infection.N Engl J Med 2008Oct 2；359(14):1486-1500)。慢性HBV感染可导致慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(Liver cirrhosis,LC)和原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)等一系列肝脏疾病(Liaw YF,Chu CM.Hepatitis B virus infection.Lancet 2009Feb 14；373(9663):582-592)。据报道，目前全球约有20亿人曾经感染过HBV，现约有3.5亿的慢性乙型肝炎病毒感染者，这些感染者最终死于HBV感染相关肝脏疾病的风险可达15％-25％，全球每年超过100万人死于此类疾病(Dienstag JL.，同上；和Liaw YF等，同上)。
当前针对慢性HBV感染的治疗药物主要可分为干扰素类(Interferon，IFNs)和核苷/核苷酸类似物(nucleoside or nucleotide,NAs)(Dienstag JL.，同上；Kwon H,LokAS.Hepatitis B therapy.Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011May；8(5):275-284；和Liaw YF等，同上)。前者包括普通干扰素(IFN)和聚乙二醇干扰素(Peg-interferon,Peg-IFN，又称为长效干扰素)，主要通过整体增强患者免疫能力来达到抑制HBV和治疗CHB的效果；后者主要包括拉米夫定(lamivudine，LMV)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)、恩替卡韦(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine,LdT)、替诺福韦(Tenofovir)等5种，主要通过直接抑制HBV的聚合酶活性来抑制HBV复制。对于HBV感染者(例如CHB患者)来说，上述药物的单独或联合治疗，已能较为有效地抑制体内病毒复制，大幅降低HBV DNA水平；特别地，52周或延长的此类治疗后，患者体内HBV DNA水平低于检测下限(病毒学应答)的应答率可达40-80％(Kwon H等，同上)。然而，上述药物的单独或联合治疗均不能完全清除感染者体内的HBV病毒，其导致的HBsAg阴转或HBsAg血清学转换(感染者体内HBV病毒彻底清除的标志)的应答率通常小于5％(Kwon H等，同上)。因此，针对HBV感染者发展创新的、能更为有效地清除HBV病毒、尤其是清除HBsAg的治疗方法和药物是迫切而必要的。
基于免疫学手段发展新的治疗慢性HBV感染的药物是此领域的重要研究方向之一。慢性HBV感染的免疫治疗通常通过被动免疫治疗(其对应药物形式如抗体等)和主动免疫治疗(其对应药物形式如疫苗等)等两种方式来进行。被动免疫治疗(以抗体为例)是指，向HBV感染者被动施用具治疗特性的抗体，并利用抗体介导的病毒中和作用阻断HBV感染新生肝细胞，或利用抗体介导的免疫清除作用清除体内病毒和被感染的肝细胞，从而起到治疗的效果。目前，从预防性乙型肝炎疫苗免疫应答者或HBV感染恢复者血清/血浆中纯化获得的Anti-HBs多克隆抗体，即高效价的乙肝免疫球蛋白(HBIG)已广泛应用于阻断HBV的母婴垂直传播、预防慢性HBV感染者肝移植后的HBV再感染、以及预防意外暴露于HBV的人群的感染。然而，将HBIG直接用于HBV感染者(例如CHB患者)的治疗无明显疗效，且其存在例如高效价血浆来源较少、价格昂贵、性质不稳定、潜在的安全性问题等诸多局限性。主动免疫治疗则是指，通过施用治疗性疫苗(包括蛋白疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗等)，刺激慢性HBV感染者机体主动产生针对HBV的细胞免疫应答(CTL效应等)或/和体液免疫应答(抗体等)，从而达到抑制或清除HBV的目的。目前尚无明确显著有效的、可用于治疗慢性HBV感染的主动免疫治疗药物/疫苗。
因此，针对HBV感染者发展创新的、能更为有效地治疗HBV感染的治疗方法和药物是迫切而必要的。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)选自下列的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)中的一个或多个(例如1个，2个或3个)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:3，或者与SEQ ID NO:3相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:4，或者与SEQ ID NO:4相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个或6个置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:5，或者与SEQ ID NO:5相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个或2个置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)选自下列的轻链可变区(VL)CDR中的一个或多个(例如1个，2个或3个):
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，或者与SEQ ID NO:6相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，或者与SEQ ID NO:7相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如，1个，2个，3个或4个置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或者与SEQ ID NO:8相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个或4个置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含的鼠源氨基酸残基不超过20个，不超过15个，不超过14个，不超过13个，不超过12个，不超过11个，不超过10个，不超过9个，不超过8个，不超过7个，不超过6个，不超过5个，不超过4个，不超过3个，不超过2个，或不超过1个，或者其不包含鼠源氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的FR区包含的鼠源氨基酸残基不超过20个，不超过15个，不超过14个，不超过13个，不超过12个，不超过11个，不超过10个，不超过9个，不超过8个，不超过7个，不超过6个，不超过5个，不超过4个，不超过3个，不超过2个，或不超过1个，或者其不包含鼠源氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明抗体的重链可变区的氨基酸序列与选自下列的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：
如SEQ ID NOs:11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278和279所示的重链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明抗体的重链可变区选自如SEQ ID NOs:11-92和263-279任一项所示的重链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明抗体的轻链可变区的氨基酸序列与选自下列的轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：
如SEQ ID NOs:186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307和308所示的轻链可变区；
在某些优选的实施方案中，本发明抗体的轻链可变区选自如SEQ ID NOs:186-214和298-308任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含如上文所定义的重链可变区和如上文所定义的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含:
(1)如SEQ ID NO:11所示的VH和如SEQ ID NO:186所示的VL；
(2)如SEQ ID NO:16所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(3)如SEQ ID NO:14所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(4)如SEQ ID NO:72所示的VH和如SEQ ID NO:201所示的VL；
(5)如SEQ ID NO:71所示的VH和如SEQ ID NO:199所示的VL；
(6)如SEQ ID NO:17所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(7)如SEQ ID NO:31所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(8)如SEQ ID NO:69所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(9)如SEQ ID NO:44所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(10)如SEQ ID NO:73所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；
(11)如SEQ ID NO:32所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(12)如SEQ ID NO:77所示的VH和如SEQ ID NO:206所示的VL；
(13)如SEQ ID NO:45所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(14)如SEQ ID NO:74所示的VH和如SEQ ID NO:209所示的VL；
(15)如SEQ ID NO:47所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(16)如SEQ ID NO:91所示的VH和如SEQ ID NO:205所示的VL；
(17)如SEQ ID NO:73所示的VH和如SEQ ID NO:205所示的VL；
(18)如SEQ ID NO:36所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(19)如SEQ ID NO:36所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(20)如SEQ ID NO:55所示的VH和如SEQ ID NO:192所示的VL；
(21)如SEQ ID NO:46所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(22)如SEQ ID NO:74所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；
(23)如SEQ ID NO:92所示的VH和如SEQ ID NO:200所示的VL；
(24)如SEQ ID NO:76所示的VH和如SEQ ID NO:204所示的VL；
(25)如SEQ ID NO:42所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(26)如SEQ ID NO:48所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(27)如SEQ ID NO:20所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(28)如SEQ ID NO:49所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(29)如SEQ ID NO:18所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(30)如SEQ ID NO:24所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(31)如SEQ ID NO:19所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(32)如SEQ ID NO:25所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(33)如SEQ ID NO:21所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(34)如SEQ ID NO:27所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(35)如SEQ ID NO:22所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(36)如SEQ ID NO:29所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(37)如SEQ ID NO:12所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(38)如SEQ ID NO:30所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(39)如SEQ ID NO:33所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(40)如SEQ ID NO:34所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(41)如SEQ ID NO:35所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(42)如SEQ ID NO:23所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(43)如SEQ ID NO:75所示的VH和如SEQ ID NO:203所示的VL；
(44)如SEQ ID NO:40所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(45)如SEQ ID NO:37所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(46)如SEQ ID NO:13所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(47)如SEQ ID NO:15所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(48)如SEQ ID NO:38所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(49)如SEQ ID NO:41所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(50)如SEQ ID NO:39所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(51)如SEQ ID NO:43所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(52)如SEQ ID NO:78所示的VH和如SEQ ID NO:205所示的VL；
(53)如SEQ ID NO:72所示的VH和如SEQ ID NO:205所示的VL；
(54)如SEQ ID NO:26所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(55)如SEQ ID NO:28所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(56)如SEQ ID NO:55所示的VH和如SEQ ID NO:194所示的VL；
(57)如SEQ ID NO:70所示的VH和如SEQ ID NO:198所示的VL；
(58)如SEQ ID NO:55所示的VH和如SEQ ID NO:195所示的VL；
(59)如SEQ ID NO:55所示的VH和如SEQ ID NO:197所示的VL；
(60)如SEQ ID NO:55所示的VH和如SEQ ID NO:196所示的VL；
(61)如SEQ ID NO:90所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(62)如SEQ ID NO:51所示的VH和如SEQ ID NO:188所示的VL；
(63)如SEQ ID NO:54所示的VH和如SEQ ID NO:190所示的VL；
(64)如SEQ ID NO:83所示的VH和如SEQ ID NO:208所示的VL；
(65)如SEQ ID NO:79所示的VH和如SEQ ID NO:190所示的VL；
(66)如SEQ ID NO:85所示的VH和如SEQ ID NO:190所示的VL；
(67)如SEQ ID NO:62所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(68)如SEQ ID NO:62所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(69)如SEQ ID NO:66所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(70)如SEQ ID NO:66所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(71)如SEQ ID NO:64所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(72)如SEQ ID NO:64所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(73)如SEQ ID NO:67所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(74)如SEQ ID NO:67所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(75)如SEQ ID NO:65所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(76)如SEQ ID NO:63所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(77)如SEQ ID NO:82所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(78)如SEQ ID NO:82所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(79)如SEQ ID NO:60所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(80)如SEQ ID NO:60所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(81)如SEQ ID NO:56所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(82)如SEQ ID NO:56所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(83)如SEQ ID NO:61所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(84)如SEQ ID NO:61所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(85)如SEQ ID NO:57所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(86)如SEQ ID NO:57所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(87)如SEQ ID NO:58所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(88)如SEQ ID NO:58所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(89)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(90)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:193所示的VL；
(91)如SEQ ID NO:68所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(92)如SEQ ID NO:53所示的VH和如SEQ ID NO:191所示的VL；
(93)如SEQ ID NO:55所示的VH和如SEQ ID NO:199所示的VL；
(94)如SEQ ID NO:55所示的VH和如SEQ ID NO:200所示的VL；
(95)如SEQ ID NO:53所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(96)如SEQ ID NO:52所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(97)如SEQ ID NO:84所示的VH和如SEQ ID NO:210所示的VL；
(98)如SEQ ID NO:84所示的VH和如SEQ ID NO:212所示的VL；
(99)如SEQ ID NO:50所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(100)如SEQ ID NO:80所示的VH和如SEQ ID NO:207所示的VL；
(101)如SEQ ID NO:88所示的VH和如SEQ ID NO:214所示的VL；
(102)如SEQ ID NO:52所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(103)如SEQ ID NO:89所示的VH和如SEQ ID NO:212所示的VL；
(104)如SEQ ID NO:81所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(105)如SEQ ID NO:84所示的VH和如SEQ ID NO:211所示的VL；
(106)如SEQ ID NO:86所示的VH和如SEQ ID NO:190所示的VL；
(107)如SEQ ID NO:87所示的VH和如SEQ ID NO:213所示的VL；
(108)如SEQ ID NO:72所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；
(109)如SEQ ID NO:72所示的VH和如SEQ ID NO:306所示的VL；
(110)如SEQ ID NO:72所示的VH和如SEQ ID NO:200所示的VL；
(111)如SEQ ID NO:91所示的VH和如SEQ ID NO:300所示的VL；
(112)如SEQ ID NO:91所示的VH和如SEQ ID NO:200所示的VL；
(113)如SEQ ID NO:263所示的VH和如SEQ ID NO:192所示的VL；
(114)如SEQ ID NO:264所示的VH和如SEQ ID NO:205所示的VL；
(115)如SEQ ID NO:264所示的VH和如SEQ ID NO:192所示的VL；
(116)如SEQ ID NO:264所示的VH和如SEQ ID NO:201所示的VL；
(117)如SEQ ID NO:264所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；
(118)如SEQ ID NO:265所示的VH和如SEQ ID NO:205所示的VL；
(119)如SEQ ID NO:265所示的VH和如SEQ ID NO:201所示的VL；
(120)如SEQ ID NO:265所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；
(121)如SEQ ID NO:266所示的VH和如SEQ ID NO:205所示的VL；
(122)如SEQ ID NO:266所示的VH和如SEQ ID NO:192所示的VL；
(123)如SEQ ID NO:267所示的VH和如SEQ ID NO:298所示的VL；
(124)如SEQ ID NO:268所示的VH和如SEQ ID NO:299所示的VL；
(125)如SEQ ID NO:269所示的VH和如SEQ ID NO:301所示的VL；
(126)如SEQ ID NO:270所示的VH和如SEQ ID NO:302所示的VL；
(127)如SEQ ID NO:271所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；
(128)如SEQ ID NO:272所示的VH和如SEQ ID NO:303所示的VL；
(129)如SEQ ID NO:273所示的VH和如SEQ ID NO:304所示的VL；
(130)如SEQ ID NO:274所示的VH和如SEQ ID NO:305所示的VL；
(131)如SEQ ID NO:275所示的VH和如SEQ ID NO:200所示的VL；
(132)如SEQ ID NO:276所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；
(133)如SEQ ID NO:277所示的VH和如SEQ ID NO:307所示的VL；
(134)如SEQ ID NO:278所示的VH和如SEQ ID NO:308所示的VL；
或者
(135)如SEQ ID NO:279所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合HBsAg，中和HBV的毒力，和/或降低HBV DNA和/或HBsAg在受试者体内的血清水平。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、双抗体(diabody)、双特异性抗体、多特异性抗体。特别优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段为scFv抗体。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是IgG类别的。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可以为IgG1或IgG2或IgG4类别的。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含根据本发明的分离的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的载体。
在另一个方面，提供了制备根据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养根据本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在另一个方面，本发明提供了检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HBV的方法，其包括：使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测HBsAg蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HBV。
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，以及用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有根据本发明的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物还可包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的药物，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素。
在另一个方面，提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，其用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的药物组合物。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1A-1B显示了实施例1的20株人源化抗体的序列信息，其中，图1A展示了人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列；图1B展示了人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列；“.”表示该位置的氨基酸残基与抗体B-S3-45的相应位置的氨基酸残基相同。
图2显示了编码scFv抗体的重组载体(pCGMT-scFv)的示意图，其中scFv抗体的结构为：NH2-VH-linker-VL-COOH。
图3显示了展示scFv抗体的噬菌体与抗原HBsAg的ELISA检测结果。结果显示，展示本发明scFv抗体的噬菌体均具有ELISA检测反应活性；所构建的20个人源化scFv抗体均能够与抗原HBsAg结合。
图4显示了，对B-S3-45抗体的HCDR3的第一位氨基酸残基(H95)进行单点突变的PCR策略的示意图。
图5A-5I显示了展示含有CDR区单点突变的scFv抗体的噬菌体与抗原HBsAg的ELISA检测结果，其中，横坐标表示scFv抗体中的单点突变的位置和类型(例如，“H31-R”表示，根据Kabat编号系统的位置H31上的氨基酸残基被突变为R)，纵坐标表示展示含有单点突变的scFv抗体的噬菌体与抗原HBsAg的反应性。图5A-5I的实验结果显示，可以对抗体B-S3-45的CDR区的氨基酸残基进行单点突变，而不破坏抗体对抗原HBsAg的结合亲和力。
图6A-6J显示了实施例3的115株人源化抗体的序列信息，其中，图6A-6E展示了人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列；图6F-6J展示了人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列；“.”表示该位置的氨基酸残基与抗体B-S3-45的相应位置的氨基酸残基相同。
图7A-7W显示了测定125株人源化抗体与抗原HBsAg的结合活性的ELISA的检测结果，其中，横坐标表示抗体浓度(log10 ng/ml)，纵坐标表示光强(log10 RLU)。结果显示，测试的所有人源化抗体均具有良好的抗原结合活性，其对抗原HBsAg的亲和力优于6D11-mAb和6D11-cAb，或至少与6D11-mAb和6D11-cAb相当。
图8A-8G显示了36株人源化抗体对HBV病毒的中和活性的测定结果，其中，横坐标表示抗体浓度(log10 ng/ml)，纵坐标表示光强(log10 RLU)。结果显示，测试的所有人源化抗体均具有良好的病毒中和活性，其对HBV的中和活性优于嵌合抗体6D11-cAb，且部分中和抗体甚至具有与6D11-mAb相当的中和活性。
图9A-9B显示了用不同人源化抗体治疗小鼠后小鼠血清中HBsAg水平的变化情况，其中，横坐标表示注射人源化抗体后的天数，纵坐标表示小鼠血清中的HBsAg水平(log10IU/ml)。结果显示，测试的所有人源化抗体在动物体内均具有良好的病毒清除能力，其清除动物体内的HBsAg的能力优于嵌合抗体6D11-cAb。
图10显示了用于测定人源化抗体162的等电点的毛细管等电聚焦电泳法(cIEF)的实验结果。结果显示，人源化抗体162的pI值为7.78(范围：7.03-7.87)，碱性峰的含量为0.99％，主峰的含量为55.87％，酸性峰的含量为43.14％。
图11显示人源化抗体116，110，153和138毛细管电泳结果。
图12显示了用于测定人源化抗体162的稳定性的差式扫描量热法(DSC)的实验结果。
图13显示人源化抗体116，110，153和138差式扫描量热法(DSC)的实验结果。
图14A-14F显示了人源化抗体162在不同储存条件下的pH值(图14A-14C)和蛋白浓度(图14D-14F)的变化情况。结果显示，人源化抗体162在不同缓冲液，不同温度下储存4周后，pH值(图14A-14C)和蛋白浓度(图14D-14F)未发生显著改变。
图14G-14I显示了人源化抗体162在不同储存条件下的流体动力学直径的变化情况。结果显示，溶解于不同缓冲液的人源化抗体162在5℃条件下是稳定的；并且，与缓冲液1和3相比，溶解于缓冲液2(pH 6.0)的人源化抗体162更稳定。
图14J-14L显示了经历不同储存条件的人源化抗体162样品的SEC-HPLC检测结果。结果显示，在不同储存条件(不同缓冲液，不同温度，不同储存时间)下，含有人源化抗体162的样品的主峰均大于85％。这说明，人源化抗体162是稳定的。
图15.显示了162、116，110，153和138加速稳定性测试后的还原型SDS-PAGE和非还原型SDS-PAGE胶图。结果显示，162、116，110，153和1385个分子在加速稳定测试后均保持稳定。
图16显示了溶解在含有5％蔗糖和0.02％PS80的25mM组氨酸溶液(pH 6.0，缓冲液2)中的人源化抗体162的粘度的测定结果。结果显示，在该缓冲体系中，人源化抗体162在150mg/ml浓度下的粘度为9.66cp(1cP＝1mPa.s)，在160mg/ml浓度下的粘度为11.73cp。
图17.显示了溶解在含有5％蔗糖和0.02％PS80的25mM组氨酸溶液(pH 6.0，缓冲液2)中的人源化抗体116、110、153分子的粘度的测定结果。
图18显示了单次静脉注射CHO-HBsAg和/或人源化抗体162后，各组的雄性食蟹猴血清中CHO-HBsAg和人源化抗体162的平均血药浓度随时间变化的曲线图。
图19显示了单次静脉注射3mg/kg的CHO-HBsAg后每一只食蟹猴血清(第1组)中CHO-HBsAg的血药浓度随时间变化的曲线图。
图20显示了单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体162后，每一只食蟹猴血清(第2组)中人源化抗体162的血药浓度随时间变化的曲线图。
图21显示了接受3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体162后，每一只食蟹猴血清(第3组)中CHO-HBsAg的血药浓度随时间变化的曲线图。
图22显示了接受3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体162后，每一只食蟹猴血清(第3组)中人源化抗体162的血药浓度随时间变化的曲线图。
图23显示了接受3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体116、110和153后，每组食蟹猴血清(第3组)中CHO-HBsAg的血药浓度平均值随时间变化的曲线图。
图24显示了接受20mg/kg的人源化抗体116、110和153后，每组食蟹猴血清中人源化抗体116、110和153的血药浓度随时间变化的曲线图。
图25显示了接受3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体116、110和153后，每组食蟹猴血清中人源化抗体116、110和153的血药浓度随时间变化的曲线图。
序列信息
SEQ ID NO：1
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SEQ ID NO：3
SGYHWN
SEQ ID NO：4
YI SYDGSDHYNPSLEN
SEQ ID NO：5
GFDH
SEQ ID NO：6
RSSQSLVHSYGDTYLH
SEQ ID NO：7
KVSNRFS
SEQ ID NO：8
SQNTHVPYT
SEQ ID NO：9
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SEQ ID NO：10
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SEQ ID NO：11
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SEQ ID NO：79
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SEQ ID NO：80
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPITSGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGSDHYNPSLENRVSITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：81
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSITSGYHWNWIRQFPGNELEWIGYISYDGSDHYNPSLENRITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：82
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSITNGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGTILYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：83
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISSGYHWNWIRQFPGNRLEWIGYISYDGSDHYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：84
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSITSGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGSDHYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：85
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISSGYHWNWIRQFPGNRLEWMGYISYDGSDHYNPSLENRISITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：86
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSITSGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGSDHYNPSLENRITITRDTSKNQFSLKLRSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：87
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSITSGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGSDHYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：88
QVQQQESGPGQVKPSQTLSLTCAVSGYPISSGYHWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSDHYNPSLENRITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：89
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSITSGYHWNWIRQFPGNKLEWMGYISYDGSDHYNPSLENRITITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：90
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISSGYHWNWIRQFPGNELEWIGYISYDGSDHYNPSLENRITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：91
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：92
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISHGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：93
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS
SEQ ID NO：94
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT
SEQ ID NO：95
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT
SEQ ID NO：96
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS
SEQ ID NO：97
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT
SEQ ID NO：98
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT
SEQ ID NO：99
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIS
SEQ ID NO：100
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGGSIT
SEQ ID NO：101
EVQLQESGPGLVKASQTLSLTCAVSGYSIS
SEQ ID NO：102
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT
SEQ ID NO：103
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT
SEQ ID NO：104
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIS
SEQ ID NO：105
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS
SEQ ID NO：106
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT
SEQ ID NO：107
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS
SEQ ID NO：108
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS
SEQ ID NO：109
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT
SEQ ID NO：110
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT
SEQ ID NO：111
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT
SEQ ID NO：112
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS
SEQ ID NO：113
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT
SEQ ID NO：114
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS
SEQ ID NO：115
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT
SEQ ID NO：116
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYPIT
SEQ ID NO：117
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT
SEQ ID NO：118
QVQQQESGPGQVKPSQTLSLTCAVSGYPIS
SEQ ID NO：119
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT
SEQ ID NO：120
SGYHWN
SEQ ID NO：121
RGYHWN
SEQ ID NO：122
HGYHWN
SEQ ID NO：123
NGYHWN
SEQ ID NO：124
YGYHWN
SEQ ID NO：125
RDYHWN
SEQ ID NO：126
RWYHWN
SEQ ID NO：127
NFYHWN
SEQ ID NO：128
RYYHWN
SEQ ID NO：129
WIRQFPGNKLEWIG
SEQ ID NO：130
WVRQFPGNKLEWIG
SEQ ID NO：131
WIQQFPGNKLEWIG
SEQ ID NO：132
WIRQLPGNKLEWIG
SEQ ID NO：133
WIRQFPGKKLEWIG
SEQ ID NO：134
WIRQFPGKGLEWIG
SEQ ID NO：135
WIRQFPGNKLVWMG
SEQ ID NO：136
WIRQFPGKSLEWIG
SEQ ID NO：137
WIRQFPGKRLEWMG
SEQ ID NO：138
WIRQFPGNELEWIG
SEQ ID NO：139
WIRQFPGNRLEWIG
SEQ ID NO：140
WIRQFPGNRLEWMG
SEQ ID NO：141
WIRQFPGNKLEWMG
SEQ ID NO：142
YISYDGSDHYNPSLEN
SEQ ID NO：143
YISYDGSVFYNPSLEN
SEQ ID NO：144
YISYDGSILYNPSLEN
SEQ ID NO：145
YISYDGTILYNPSLEN
SEQ ID NO：146
YISYDGTVLYNPSLEN
SEQ ID NO：147
YISYDGNVLYNPSLEN
SEQ ID NO：148
YISYDGTSLYNPSLEN
SEQ ID NO：149
YISYDGSVLYNPSLEN
SEQ ID NO：150
YISYDGNILYNPSLEN
SEQ ID NO：151
YISYDGTNLYNPSLEN
SEQ ID NO：152
YISYDGSNLYNPSLEN
SEQ ID NO：153
YISYDGTVHYNPSLEN
SEQ ID NO：154
YISYDGTIRYNPSLEN
SEQ ID NO：155
YISYDGSVLYNPSLKS
SEQ ID NO：156
YISYDGSVLYNPSLKG
SEQ ID NO：157
YIAYDGVQSYNPSLKG
SEQ ID NO：158
YIGYDGAVQYNPSLKS
SEQ ID NO：159
YISYNGSVLYNPSLKS
SEQ ID NO：160
YISYDGSRLYNPSLKS
SEQ ID NO：161
RITITRDTSKNQFSLILRSVTAEDTAIYYCAS
SEQ ID NO：162
RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS
SEQ ID NO：163
RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTARYYCAS
SEQ ID NO：164
RITISRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYFCAS
SEQ ID NO：165
RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS
SEQ ID NO：166
RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS
SEQ ID NO：167
RVSITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCAS
SEQ ID NO：168
RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS
SEQ ID NO：169
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO：170
RVSISRDISKNQFFLKLSSVTAADTAVYFCAS
SEQ ID NO：171
RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO：172
RVSITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS
SEQ ID NO：173
RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCAS
SEQ ID NO：174
RVTITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAKYYCAS
SEQ ID NO：175
RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCAS
SEQ ID NO：176
RISITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCAS
SEQ ID NO：177
RITITRDTSKNQFSLKLRSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO：178
RITITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS
SEQ ID NO：179
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCAS
SEQ ID NO：180
GFDH
SEQ ID NO：181
GFDY
SEQ ID NO：182
GFDT
SEQ ID NO：183
WGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：184
WGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：185
WGQGTMLTVSS
SEQ ID NO：186
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSNQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：187
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：188
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：189
DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：190
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：191
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHLPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：192
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：193
DVVMTQTPLSLPVNLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：194
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQNAKTPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：195
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQNARVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：196
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNSYVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：197
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTIPPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：198
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQNSMAPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：199
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGPTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSKRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：200
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGPTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：201
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHTYGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：202
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGSTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：203
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHRYGTTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：204
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGATYLHWYLQKPGQSPQLLIYKASQRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：205
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：206
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGPTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCGQNAHLPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：207
DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：208
DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：209
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGRTYLHWYLQKPGQSPQLLIYRSSHRNSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：210
DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：211
DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVDTEDLGVYFCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：212
DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：213
DVVMTQSPLSLPVTLGEQASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：214
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYFCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：215
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISC
SEQ ID NO：216
DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISC
SEQ ID NO：217
DVVMTQTPLSLPVNLGEPASISC
SEQ ID NO：218
DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISC
SEQ ID NO：219
DVVMTQSPLSLPVTLGEQASISC
SEQ ID NO：220
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC
SEQ ID NO：221
WYLQKPGQSPKLLIY
SEQ ID NO：222
WYLQKPGQSPQLLIY
SEQ ID NO：223
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC
SEQ ID NO：224
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC
SEQ ID NO：225
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
SEQ ID NO：226
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC
SEQ ID NO：227
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC
SEQ ID NO：228
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVDTEDLGVYFC
SEQ ID NO：229
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYFC
SEQ ID NO：230
FGGGTKLEIKR
SEQ ID NO：231
FGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：232
RSNQSLVHSYGDTYLH
SEQ ID NO：233
RSSQSLVHSYGDTYLH
SEQ ID NO：234
RSSQSLVHPYGPTYLH
SEQ ID NO：235
RSSQSLVHTYGNTYLH
SEQ ID NO：236
RSSQSLVHPYGSTYLH
SEQ ID NO：237
RSSQSLVHRYGTTYLH
SEQ ID NO：238
RSSQSLVHPYGATYLH
SEQ ID NO：239
RSSQSLVHPYGRTYLH
SEQ ID NO：240
KVSNRFS
SEQ ID NO：241
KVSKRNS
SEQ ID NO：242
KASQRNS
SEQ ID NO：243
RSSHRNS
SEQ ID NO：244
SQNTHVPYT
SEQ ID NO：245
SQNTHLPYT
SEQ ID NO：246
GQNAKTPYT
SEQ ID NO：247
GQNARVPYT
SEQ ID NO：248
SQNSYVPYT
SEQ ID NO：249
SQNTIPPYT
SEQ ID NO：250
GQNSMAPYT
SEQ ID NO：251
GQNAHLPYT
SEQ ID NO:252-262，引物序列,见表5
SEQ ID NO：263
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：264
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：265
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISYGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：266
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITYGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：267
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISSGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：268
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTVSVDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：269
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTTEDSAVYYCSSGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：270
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCASGFDHWGHGTLVTVSS
SEQ ID NO：271
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQYPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVAISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：272
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLSCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKGRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：273
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWLGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：274
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISEDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：275
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISSGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISMDTSKNHFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：276
QVQLQESGPGRVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：277
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLFNPSLKSRVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGPGTQVTVSS
SEQ ID NO：278
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLSCAVSGYSISSGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTIGVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：279
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISRGYHWNWIRQFPGKGLEWIGYISYDGSVLYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLRSVTDEDSAVYYCASGFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:280
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT
SEQ ID NO:281
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLSCAVSGYSIS
SEQ ID NO:282
QVQLQESGPGRVKPSQTLSLTCAVSGYSIS
SEQ ID NO:283
WIRQYPGKGLEWIG
SEQ ID NO:284
WIRQFPGKGLEWLG
SEQ ID NO:285
YISYDGSVLFNPSLKS
SEQ ID NO:286
RVTITRDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCAS
SEQ ID NO:287
RVTITRDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO:288
RVTISVDRSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO:289
RVTVSVDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCAS
SEQ ID NO:290
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTTEDSAVYYCSS
SEQ ID NO:291
RVAISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO:292
RVTISEDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO:293
RVTISMDTSKNHFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO:294
RVTIGVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS
SEQ ID NO:295
RVTISVDTSKNQFSLKLRSVTDEDSAVYYCAS
SEQ ID NO:296
WGHGTLVTVSS
SEQ ID NO:297
WGPGTQVTVSS
SEQ ID NO：298
DVVMTQSPISLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGSTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：299
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGSTYLHWYLQKPGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：300
DVVMTQSPLSLSVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGPTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDYTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：301
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDYTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：302
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGPTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTEFTLKISRVEAEDVGAYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：303
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPFGPTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：304
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLAHPYGSTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：305
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTRLEIKR
SEQ ID NO：306
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGPTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：307
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGPTYLHWYLQKPGQSPQLLVYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ ID NO：308
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHPYGSTYFHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDGGVYYCSQNTHVPYTFGQGTKLEIKR
SEQ:ID:NO.309
DVVMTQSPISLPVTLGEPASISC
SEQ:ID:NO.310
DVVMTQSPLSLSVTLGEPASISC
SEQ:ID:NO.311
WYLQKPGQPPQLLIY
SEQ:ID:NO.312
WYLQKPGQSPQLLVY
SEQ:ID:NO.313
GVPDRFSGSGSGTDYTLKISRVEAEDVGVYYC
SEQ:ID:NO.314
GVPDRFSGSGSGTEFTLKISRVEAEDVGAYYC
SEQ:ID:NO.315
GVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC
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FGQGTRLEIKR
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表1：人源化抗体的重链可变区及其CDR和FR的氨基酸序列编号
表2：人源化抗体的轻链可变区及其CDR和FR的氨基酸序列编号
发明详述
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基，其通常可包括，轻链可变区中的残基24-34{LCDR1}、50-56{LCDR2}、89-97{LCDR3}以及重链可变区中的残基31-35{HCDR1}、50-65{HCDR2}、95-102{HCDR3}(参见例如，Kabat等，Sequences of Proteins of lmmunological lnterest，第五版，PublicHealth Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991))，或者轻链可变区中的残基26-32{Ll}、50-52{L2}、91-96{L3}以及重链可变区中的残基26-32{H1}、53-55{H2}、96-101{H3}(参见，Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
如本文中所使用的，术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力低于完整的结合位点。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Hus ton等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
如本文中所使用的，术语“单链抗体-Fc”或“scFv-Fc”意指，将scFv连接至抗体的Fc片段而形成的工程抗体。如本文中所使用的，术语“Fc片段”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
例如，可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射小鼠或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。可将免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，以增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以是弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂，如PEG，使其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中优选含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等特征。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如MOP-21或MC-11小鼠肿瘤衍生株(THE Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA)，和SP-2/0或X63-Ag8-653细胞株(American Type CultureCollection,Rockville,Md.USA)。另外也有研究报道，利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗(Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)。生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如，免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，可利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)描述的Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。
如本文中所使用的，术语“抗原表位”和“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO 03/48731中。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的抗体)以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，HBsAg)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中使用的，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。当给受试者施用异源抗体时，异源抗体在受试者体内的免疫原性是不想要的，因为此类免疫原性将导致受试者的免疫系统/免疫细胞对异源抗体的排斥作用，从而导致异源抗体在受试者体内的功效下降或者在受试者体内引起不想要的副作用。因此，在施用给人受试者之前，通常需要对异源抗体(例如鼠源抗体)进行改造，以尽可能减小其免疫原性。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly etal.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人鼠嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如鼠源抗体)，而抗体的重链和轻链可变区来自第二抗体(例如人抗体)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，人源免疫球蛋白(受体抗体)的全部或部分CDR区被一非人源抗体(供体抗体)的CDR区替换后得到的抗体或抗体片段。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、中和病毒能力和/或清除病毒能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、中和病毒能力和/或清除病毒能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物抗体。
人源化抗体既能够保留非人源供体抗体(例如鼠源抗体)的预期性质，又能够有效降低非人源供体抗体(例如鼠源抗体)在人受试者中的免疫原性，因此，是特别有利的。然而，由于供体抗体的CDR与受体抗体的FR之间的匹配问题，人源化抗体的预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、中和病毒能力和/或清除病毒能力)通常低于非人源供体抗体(例如鼠源抗体)。因此，为了使人源化抗体尽可能保留供体抗体的性质(包括例如，特异性、亲和性、反应性、中和病毒能力和/或清除病毒能力)，在一些情况下，可以将人源化抗体中构架区(FR)的某些氨基酸残基替换为相应的非人源供体抗体的氨基酸残基。
此外，为了进一步提高人源化的程度，以尽可能地减少非人氨基酸残基引起的免疫原性，在一些情况下，可以对人源化抗体中来源于供体抗体的CDR区的部分氨基酸残基进行替换，例如将其替换为相应的人源免疫球蛋白CDR区的氨基酸残基，或其他氨基酸残基。
此外，为了进一步完善或优化人源化抗体的性能，还可以对人源化抗体的重链和轻链可变区中的部分氨基酸残基进行替换，例如将其替换为既非来源于受体抗体，也非来源于供体抗体的氨基酸残基。
尽管本领域的研究人员已对抗体的人源化展开了深入的研究，并取得了一些进展(参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；and Clark,Immunol.Today 21:397 402(2000))，但是，如何对某一供体抗体进行充分的人源化，以使得所产生的人源化抗体既具有尽可能高的人源化程度，又能够尽可能地保留供体抗体的预期性质，现有技术并没有提供详尽的指导。技术人员需要针对具体供体抗体进行摸索、探究和改造，付出大量的创造性劳动才有可能获得，既具有高人源化程度(例如至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的人源化程度)、又保留具体供体抗体的预期性质的人源化抗体。
在本申请中，发明人首先开发了具有优良性质的鼠源抗体(其重链和轻链可变区分别如SEQ ID NO:1和2所示)：该鼠源抗体不仅能够特异性识别/结合HBsAg，能够中和HBV的毒力，而且能够在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。因此，该鼠源抗体具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，对该鼠源抗体进行了深入的研究和改造，从而开发了该鼠源抗体的人源化抗体：本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(人源化程度可高达97％)，而且具有与鼠源抗体和人鼠嵌合抗体(其具有与鼠源抗体完全相同的重链和轻链可变区)基本上相同的(或甚至更优良的)预期性质(包括但不限于，HBsAg结合活性，中和HBV的活性，清除体内的HBV DNA或HBsAg的活性，或清除体内的HBV和被HBV感染的细胞的活性等)。
因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)是极为有利的，其不仅保留了亲本鼠源抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力；而且具有极高的人源化程度(人源化程度可高达97％)，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。本发明的抗体(特别是人源化抗体)具有重大的临床价值。
在本申请中，本发明抗体的预期性质包括，特异性结合HBsAg的活性，中和HBV的活性，清除体内的HBV DNA或HBsAg的活性，和/或，清除体内的HBV和被HBV感染的细胞的活性。根据本发明的人源化抗体保留了亲本鼠源抗体的上述预期性质中的一项或多项，优选保留了亲本鼠源抗体的所有上述预期性质。
在本申请中，还对本发明的亲本鼠源抗体和人源化抗体进行了进一步的改造，例如对其CDR和FR中的部分氨基酸残基进行置换(例如保守置换)。此类置换例如可以(1)降低抗体对蛋白水解的敏感性；(2)降低抗体对氧化作用的易感性；(3)改变(例如增强)抗体对抗原的结合亲和力；(4)改变(例如增强)抗体中和HBV的活性；(5)改变(例如增强)抗体清除HBV的活性；(6)进一步提高抗体的人源化程度，降低抗体的免疫原性；或(7)改变抗体的其它生物化学特点或功能特性；而仍然保留抗体的预期性质。此类置换可以存在于CDR区和/或FR区中，并且可以是单个氨基酸置换或多个氨基酸置换。
如本文中所使用的，术语“人源化程度”是用于表示人源化抗体中非人源氨基酸残基的数量的指标。人源化抗体的人源化程度例如可通过下述来进行计算：人源化程度＝(FR区氨基酸个数-FR区保留的非人源氨基酸个数)/FR区氨基酸个数×100％。
如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能够显著降低或完全抑制目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或其抗原结合片段。通常而言，中和抗体能够识别并结合目标病毒，并且阻止目标病毒进入/感染受试者的细胞。本发明的抗体即是中和抗体。
然而，应当理解的是，在本申请中，抗体的中和病毒的能力并不直接等同于抗体的清除病毒的能力。如本文中所使用的，“中和病毒”是指，通过抑制目标病毒进入/感染受试者的细胞的过程，从而中和目标病毒的毒力(即，显著降低或完全抑制目标病毒的毒力)。如本文中所使用的，“清除病毒”是指，机体内的目标病毒(无论其是否感染了细胞)被从机体中消除，从而机体朝向未被病毒感染之前的状态转变(例如，病毒的血清学检测结果转变为阴性)。因此，在一般情况下，中和抗体并不一定具备清除病毒的能力。然而，在本申请中，发明人出人意料地发现，本发明的抗体不仅具有中和HBV的能力，而且具有清除病毒的能力(即，能够清除体内的HBV DNA和/或HBsAg，清除体内的HBV和被HBV感染的细胞)，从而具有重大的临床价值。
如本文中所使用的，术语“分离的”是指，经人工手段从天然状态下获得。如果自然界中出现某一种“被分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变或从天然环境下离分出该物质，或二者情况均有发生。比如，对于某一活体动物体内天然存在的某种未被分离的多聚核苷酸或多肽而言，从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为“分离的”。术语“分离的”不排除人工或合成的物质的存在，也不排除不影响物质活性的其它不纯物质的存在。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”和“保守氨基酸置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。此外，如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，HBV感染或与HBV感染相关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。在本申请中，本发明的抗体具有中和HBV的能力，从而可用于预防/阻止未患病受试者或其细胞感染HBV。此外，本发明的抗体具有清除HBV的能力(即，能够清除体内的HBV DNA和/或HBsAg，清除体内的HBV和被HBV感染的细胞)，从而可用于治疗患病受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本发明的抗体
在本申请中，发明人首先开发了具有优良性质的鼠源抗体(其重链和轻链可变区分别如SEQ ID NO:1和2所示)：该鼠源抗体不仅能够特异性识别/结合HBsAg，能够中和HBV的毒力，而且能够在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。因此，该鼠源抗体具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，对该鼠源抗体进行了深入的研究和改造，从而开发了该鼠源抗体的人源化抗体：本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(人源化程度可高达97％)，而且具有与鼠源抗体和人鼠嵌合抗体(其具有与鼠源抗体完全相同的重链和轻链可变区)基本上相同的(或甚至更优良的)预期性质(包括但不限于，HBsAg结合活性，中和HBV的活性，清除体内的HBV DNA或HBsAg的活性，或清除体内的HBV和被HBV感染的细胞的活性等)。
因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)是极为有利的，其不仅保留了亲本鼠源抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力；而且具有极高的人源化程度(人源化程度可高达97％)，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。本发明的抗体(特别是人源化抗体)具有重大的临床价值。
因此，在一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)选自下列的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)中的一个或多个(例如1个，2个或3个)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:3，或者与SEQ ID NO:3相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:4，或者与SEQ ID NO:4相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个或6个置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:5，或者与SEQ ID NO:5相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个或2个置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)选自下列的轻链可变区(VL)CDR中的一个或多个(例如1个，2个或3个):
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，或者与SEQ ID NO:6相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，或者与SEQ ID NO:7相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如，1个，2个，3个或4个置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或者与SEQ ID NO:8相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个或4个置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR1为SEQ IDNO:3，或者与SEQ ID NO:3的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个或3个置换)：
(01)位于H31的R，Y，H，或N；
(02)位于H32的Y，F，W，或D；
(03)位于H34的N，或L；
(04)位于H35的Y，H，或P；和
(05)位于H35A的I，S，P，G，或H；
其中(01)-(05)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR1为SEQ IDNO:3，或者与SEQ ID NO:3的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个或2个置换)：
(01)位于H31的R，Y，H，或N(优选，R或Y)；和
(02)位于H32的Y，F，W，或D(优选，W或D)；
其中(01)-(02)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR1为SEQ IDNO:3，或者与SEQ ID NO:3的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个或2个置换)：
(01)位于H31的R或Y；和
(02)位于H32的W；
其中(01)-(02)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR1的序列选自如下：
SGYHWN(SEQ ID NO:3)；
RGYHWN(SEQ ID NO:121)；
HGYHWN(SEQ ID NO:122)；
NGYHWN(SEQ ID NO:123)；
RDYHWN(SEQ ID NO:125)；
RWYHWN(SEQ ID NO:126)；
YGYHWN(SEQ ID NO:124)；
NFYHWN(SEQ ID NO:127)；和
RYYHWN(SEQ ID NO:128)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR1的序列选自如下：
SGYHWN(SEQ ID NO:3)；
RWYHWN(SEQ ID NO:126)；
HGYHWN(SEQ ID NO:122)；
YGYHWN(SEQ ID NO:124)；
RGYHWN(SEQ ID NO:121)；
NGYHWN(SEQ ID NO:123)；和
RDYHWN(SEQ ID NO:125)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR1的序列选自如下：
SGYHWN(SEQ ID NO:3)；
RWYHWN(SEQ ID NO:126)；
YGYHWN(SEQ ID NO:124)；和
RGYHWN(SEQ ID NO:121)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR2为SEQ IDNO:4，或者与SEQ ID NO:4的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个置换)：
(06)位于H50的R，G，L，F，S，或V；
(07)位于H51的V，M，L，T，F，或C；
(08)位于H52的D，A，G，V，F，或P；
(09)位于H53的P，N，S，E，L，F，K，或I；
(10)位于H54的V，T，N，L，A，S，I，或F；
(11)位于H55的I，H，S，F，C，E，L，或V；
(12)位于H56的N，A，M，L，Q，G，F，T，P，V，或R；
(13)位于H57的任意天然存在的氨基酸；
(14)位于H58的S，T，F，W，Y，V，G，E，L，Q，或R；
(15)位于H61的S，A，L，或D；
(16)位于H62的G，E，或R；
(17)位于H63的H，或F；
(18)位于H64的L，A，I，T，G，K，或V；和
(19)位于H65的G，R，S，W，H，D，A，或Y；
其中(06)-(19)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR2为SEQ IDNO:4，或者与SEQ ID NO:4的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个，4个，5个或6个置换)：
(08)位于H52的A，或G；
(09)位于H54的N；
(12)位于H56的N，A，T，或V；
(13)位于H57的V，I，S，N，Q，或R；
(14)位于H58的S，F，L，Q，或R；
(18)位于H64的K；和
(19)位于H65的G，或S；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR2为SEQ IDNO:4，或者与SEQ ID NO:4的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，或3个置换)：
(12)位于H56的T；
(13)位于H57的V，I，或N(优选V或N)；和
(14)位于H58的L；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR2的序列选自如下：
YISYDGSDHYNPSLEN(SEQ ID NO:4)；
YISYDGSVFYNPSLEN(SEQ ID NO:143)；
YISYDGSILYNPSLEN(SEQ ID NO:144)；
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)；
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)；
YISYDGNVLYNPSLEN(SEQ ID NO:147)；
YISYDGTSLYNPSLEN(SEQ ID NO:148)；
YISYDGSVLYNPSLEN(SEQ ID NO:149)；
YISYDGNILYNPSLEN(SEQ ID NO:150)；
YISYDGTNLYNPSLEN(SEQ ID NO:151)；
YISYDGSNLYNPSLEN(SEQ ID NO:152)；
YISYDGTVHYNPSLEN(SEQ ID NO:153)；
YISYDGTIRYNPSLEN(SEQ ID NO:154)；
YISYDGSVLYNPSLKS(SEQ ID NO:155)；
YISYDGSVLYNPSLKG(SEQ ID NO:156)；
YIAYDGVQSYNPSLKG(SEQ ID NO:157)；
YIGYDGAVQYNPSLKS(SEQ ID NO:158)；
YISYNGSVLYNPSLKS(SEQ ID NO:159)；
YISYDGSRLYNPSLKS(SEQ ID NO:160)；和
YISYDGSVLFNPSLKS(SEQ ID NO:285)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR2的序列选自如下：
YISYDGSDHYNPSLEN(SEQ ID NO:4)；
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)；
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)；
YISYDGSVLYNPSLEN(SEQ ID NO:149)；
YISYDGTNLYNPSLEN(SEQ ID NO:151)；和
YISYDGSILYNPSLEN(SEQ ID NO:144)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR2的序列选自如下：
YISYDGSDHYNPSLEN(SEQ ID NO:4)；
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)；
YISYDGSVLYNPSLEN(SEQ ID NO:149)；和
YISYDGTNLYNPSLEN(SEQ ID NO:151)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR3为SEQ IDNO:5，或者与SEQ ID NO:5的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个或2个置换)：
(20)位于H101的N；和
(21)位于H102的Y，R，S，T，A，L，或I；
其中(20)-(21)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR3为SEQ IDNO:5，或者与SEQ ID NO:5的差异在于，位于H102的Y或T(优选，Y)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH CDR3的序列选自如下：
GFDH(SEQ ID NO:5)；
GFDY(SEQ ID NO:181)；和
GFDT(SEQ ID NO:182)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR1为SEQ IDNO:6，或者与SEQ ID NO:6的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个或3个置换)：
(22)位于L24的H，L，W，S，T，或C；
(23)位于L25的L，V，P，或N；
(24)位于L26的G，E，V，Y，A，N，或D；
(25)位于L27的T，R，H，M，Y，V，或A；
(26)位于L27A的Q，或F；
(27)位于L27C的E，F，N，W，G，或L；
(28)位于L27D的L，V，G，W，Y，S，F，或N；
(29)位于L27E的P，R，V，T，或M；
(30)位于L28的F，W，G，D，A，E，R，L，S，V，或K；
(31)位于L29的F，I，Y，D，V，或L；
(32)位于L30的E，S，C，F，R，A，Q，L，P，N，M，或T；
(33)位于L31的I，V，Q，F，M，A，C，R，S，或L；
(34)位于L32的W，F，G，或L；
(35)位于L33的R，V，F，S，M，A，P，或Y；和
(36)位于L34的F，N，R，Q，或G；
其中(22)-(36)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR1为SEQ IDNO:6，或者与SEQ ID NO:6的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个或2个置换)：
(29)位于L27E的P，R，或T；和
(32)位于L30的S，R，A，P，N，或T；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR1的序列选自如下：
RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)；
RSNQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:232)；
RSSQSLVHPYGPTYLH(SEQ ID NO:234)；
RSSQSLVHTYGNTYLH(SEQ ID NO:235)；
RSSQSLVHPYGSTYLH(SEQ ID NO:236)；
RSSQSLVHRYGTTYLH(SEQ ID NO:237)；
RSSQSLVHPYGATYLH(SEQ ID NO:238)；
RSSQSLVHPYGRTYLH(SEQ ID NO:239)；
RSSQSLVHPFGPTYLH(SEQ ID NO:318)；
RSSQSLAHPYGSTYLH(SEQ ID NO:319)；和
RSSQSLVHPYGSTYFH(SEQ ID NO:320)
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR1的序列为SEQ ID NO:6。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR2为SEQ IDNO:7，或者与SEQ ID NO:7的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个或4个置换)：
(37)位于L50的N，R，F，S，T，或L；
(38)位于L51的C，A，N，D，S，或L；
(39)位于L52的L，V，M，W，A，或F；
(40)位于L53的C，H，K，R，P，Q，或S；
(41)位于L54的I，F，N，M，或L；
(42)位于L55的R，N，或C；和
(43)位于L56的L，F，W，T，K，R，或Q；
其中(37)-(43)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR2为SEQ IDNO:7，或者与SEQ ID NO:7的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个或4个置换)：
(37)位于L50的R；
(38)位于L51的A或S；
(40)位于L53的H，K，或Q；和
(42)位于L55的N；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR2的序列选自如下：
KVSNRFS(SEQ ID NO:7)；
KVSKRNS(SEQ ID NO:241)；
KASQRNS(SEQ ID NO:242)；和
RSSHRNS(SEQ ID NO:243)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR2的序列为SEQ ID NO:7。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR3为SEQ IDNO:8，或者与SEQ ID NO:8的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个或4个置换)：
(44)位于L89的L，G，N，T，或V；
(45)位于L90的H，或S；
(46)位于L92的A，S，或P；
(47)位于L93的A，S，K，R，L，T，Y，F，W，N，M，V，I，或E；
(48)位于L94的T，N，D，K，F，Y，P，H，L，R，S，A，或G；
(49)位于L95的A，I，S，C，或V；
(50)位于L96的N，A，V，R，T，或H；和
(51)位于L97的S；
其中(44)-(51)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR3为SEQ IDNO:8，或者与SEQ ID NO:8的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个或4个置换)：
(44)位于L89的G；
(46)位于L92的A，或S；
(47)位于L93的K，R，Y，M，或I；和
(48)位于L94的T，P，L，或A；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置；
优选地，所述VL CDR3为SEQ ID NO:8，或者与SEQ ID NO:8的差异在于位于L94的L。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR3的序列选自如下：
SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)；
SQNTHLPYT(SEQ ID NO:245)；
GQNAKTPYT(SEQ ID NO:246)；
GQNARVPYT(SEQ ID NO:247)；
SQNSYVPYT(SEQ ID NO:248)；
SQNTIPPYT(SEQ ID NO:249)；
GQNSMAPYT(SEQ ID NO:250)；和
GQNAHLPYT(SEQ ID NO:251)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL CDR3的序列选自如下：
SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)；和
SQNTHLPYT(SEQ ID NO:245)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含，选自下述(1)-(16)任一项的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的组合：
| VL-CDR1(SEQ ID NO:) | VL-CDR2(SEQ ID NO:) | VL-CDR3(SEQ ID NO:) | |
| (1) | 232 | 240 | 244 |
| (2) | 233 | 240 | 244 |
| (3) | 233 | 240 | 245 |
| (4) | 233 | 240 | 246 |
| (5) | 233 | 240 | 247 |
| (6) | 233 | 240 | 248 |
| (7) | 233 | 240 | 249 |
| (8) | 233 | 240 | 250 |
| (9) | 234 | 240 | 244 |
| (10) | 234 | 240 | 251 |
| (11) | 234 | 241 | 244 |
| (12) | 235 | 240 | 244 |
| (13) | 236 | 240 | 244 |
| (14) | 237 | 240 | 244 |
| (15) | 238 | 242 | 244 |
| (16) | 239 | 243 | 244 |
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含：
(a)如RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ ID NO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
(b)如RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ ID NO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHLPYT(SEQ ID NO:245)所示的VL CDR3；
(c)如RSNQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:232)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ IDNO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
(d)如RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ ID NO:7)所示的VL CDR2；以及，如GQNAKTPYT(SEQ ID NO:246)所示的VL CDR3；
(e)如RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ ID NO:7)所示的VL CDR2；以及，如GQNARVPYT(SEQ ID NO:247)所示的VL CDR3；
(f)如RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ ID NO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNSYVPYT(SEQ ID NO:248)所示的VL CDR3；
(g)如RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ ID NO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNTIPPYT(SEQ ID NO:249)所示的VL CDR3；
(h)如RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ ID NO:7)所示的VL CDR2；以及，如GQNSMAPYT(SEQ ID NO:250)所示的VL CDR3；
(i)如RSSQSLVHPYGPTYLH(SEQ ID NO:234)所示的VL CDR1；如KVSKRNS(SEQ IDNO:241)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
(j)如RSSQSLVHPYGPTYLH(SEQ ID NO:234)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ IDNO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
(k)如RSSQSLVHTYGNTYLH(SEQ ID NO:235)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ IDNO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
(l)如RSSQSLVHPYGSTYLH(SEQ ID NO:236)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ IDNO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
(m)如RSSQSLVHRYGTTYLH(SEQ ID NO:237)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ IDNO:7)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
(n)如RSSQSLVHPYGATYLH(SEQ ID NO:238)所示的VL CDR1；如KASQRNS(SEQ IDNO:242)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
(o)如RSSQSLVHPYGPTYLH(SEQ ID NO:234)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ IDNO:7)所示的VL CDR2；以及，如GQNAHLPYT(SEQ ID NO:251)所示的VL CDR3；或
(p)如RSSQSLVHPYGRTYLH(SEQ ID NO:239)所示的VL CDR1；如RSSHRNS(SEQ IDNO:243)所示的VL CDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含：如RSSQSLVHSYGDTYLH(SEQ ID NO:6)所示的VL CDR1；如KVSNRFS(SEQ ID NO:7)所示的VLCDR2；以及，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)或SQNTHLPYT(SEQ ID NO:245)所示的VL CDR3(优选，如SQNTHVPYT(SEQ ID NO:8)所示的VL CDR3)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含，选自下述(1)-(48)任一项的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的组合：
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(a)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGSDHYNPSLEN(SEQ ID NO:4)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(b)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGSVFYNPSLEN(SEQ ID NO:143)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(c)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYDGSILYNPSLEN(SEQ ID NO:144)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(d)如NGYHWN(SEQ ID NO:123)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(e)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGSILYNPSLEN(SEQ ID NO:144)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(f)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(g)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGSILYNPSLEN(SEQ ID NO:144)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(h)如RDYHWN(SEQ ID NO:125)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(i)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGNVLYNPSLEN(SEQ ID NO:147)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(j)如RWYHWN(SEQ ID NO:126)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(k)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(l)如RDYHWN(SEQ ID NO:125)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(m)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(n)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1；如
YISYDGSILYNPSLEN(SEQ ID NO:144)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(o)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYDGTSLYNPSLEN(SEQ ID NO:148)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(p)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(q)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(r)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGSILYNPSLEN(SEQ ID NO:144)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(s)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDT(SEQ ID NO:182)所示的VH CDR3；
(t)如NFYHWN(SEQ ID NO:127)所示的VH CDR1；如
YISYDGSVLYNPSLEN(SEQ ID NO:149)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(u)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(v)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(w)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(x)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(y)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(z)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1；如
YISYDGSVLYNPSLEN(SEQ ID NO:149)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(aa)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGNILYNPSLEN(SEQ ID NO:150)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(ab)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGTNLYNPSLEN(SEQ ID NO:151)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(ac)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYDGSNLYNPSLEN(SEQ ID NO:152)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(ad)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGTNLYNPSLEN(SEQ ID NO:151)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(ae)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYDGTILYNPSLEN(SEQ ID NO:145)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(af)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGSILYNPSLEN(SEQ ID NO:144)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(ag)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVHYNPSLEN(SEQ ID NO:153)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(ah)如NFYHWN(SEQ ID NO:127)所示的VH CDR1；如
YISYDGNVLYNPSLEN(SEQ ID NO:147)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(ai)如RYYHWN(SEQ ID NO:128)所示的VH CDR1；如
YISYDGTIRYNPSLEN(SEQ ID NO:154)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(aj)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVHYNPSLEN(SEQ ID NO:153)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(ak)如RDYHWN(SEQ ID NO:125)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(al)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1；如
YISYDGSVLYNPSLKS(SEQ ID NO:155)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(am)如RWYHWN(SEQ ID NO:126)所示的VH CDR1；如
YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ ID NO:146)所示的VH CDR2；以及，如GFDY(SEQ ID NO:181)所示的VH CDR3；
(an)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1；如
YISYDGSVLYNPSLKG(SEQ ID NO:156)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(ao)如NGYHWN(SEQ ID NO:123)所示的VH CDR1；如
YIAYDGVQSYNPSLKG(SEQ ID NO:157)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(ap)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGSVLYNPSLKS(SEQ ID NO:155)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(aq)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1；如
YISYDGSVLYNPSLKS(SEQ ID NO:155)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(ar)如NGYHWN(SEQ ID NO:123)所示的VH CDR1；如
YISYDGSVLYNPSLKS(SEQ ID NO:155)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(as)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YIGYDGAVQYNPSLKS(SEQ ID NO:158)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(at)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1；如
YISYNGSVLYNPSLKS(SEQ ID NO:159)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
(au)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1；如
YISYDGSRLYNPSLKS(SEQ ID NO:160)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；或
(av)如NGYHWN(SEQ ID NO:123)所示的VH CDR1；如
YISYNGSVLYNPSLKS(SEQ ID NO:159)所示的VH CDR2；以及，如GFDH(SEQ ID NO:5)所示的VH CDR3；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含如GFDH(SEQID NO:5)所示的VH CDR3，以及，选自下列的VH CDR1和VH CDR2：
(a)如SGYHWN(SEQ ID NO:3)所示的VH CDR1和如YISYDGSDHYNPSLEN(SEQ ID NO:4)所示的VH CDR2；
(d)如NGYHWN(SEQ ID NO:123)所示的VH CDR1和如YISYDGTILYNPSLEN(SEQ IDNO:145)所示的VH CDR2；
(e)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1和如YISYDGSILYNPSLEN(SEQ IDNO:144)所示的VH CDR2；
(j)如RWYHWN(SEQ ID NO:126)所示的VH CDR1和如YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ IDNO:146)所示的VH CDR2；
(k)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1和如YISYDGTVLYNPSLEN(SEQ IDNO:146)所示的VH CDR2；
(l)如RDYHWN(SEQ ID NO:125)所示的VH CDR1和如YISYDGTILYNPSLEN(SEQ IDNO:145)所示的VH CDR2；
(m)如HGYHWN(SEQ ID NO:122)所示的VH CDR1和如YISYDGTILYNPSLEN(SEQ IDNO:145)所示的VH CDR2；
(z)如YGYHWN(SEQ ID NO:124)所示的VH CDR1和如YISYDGSVLYNPSLEN(SEQ IDNO:149)所示的VH CDR2；或
(ad)如RGYHWN(SEQ ID NO:121)所示的VH CDR1和如YISYDGTNLYNPSLEN(SEQ IDNO:151)所示的VH CDR2。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的VH CDR1，VHCDR2和/或VH CDR3分别选自SEQ ID NOs:11-92和263-279任一项中所包含的VH CDR1，VHCDR2和VH CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段所包含的VLCDR1，VL CDR2和/或VL CDR3分别选自SEQ ID NOs:186-214和298-308任一项中所包含的VLCDR1，VL CDR2和VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，相对于VH为SEQ ID NO:1且VL为SEQ ID NO:2的抗体而言，本发明的抗体或其抗原结合片段在VH CDR1-3和VL CDR1-3中仅包含1、2、3、4、5或6个置换。在某些优选的实施方案中，相对于VH为SEQ ID NO:1且VL为SEQ ID NO:2的抗体而言，本发明的抗体或其抗原结合片段在VH CDR1-3和VLCDR1-3中仅包含1个置换。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含，选自下列的抗体的重链和轻链可变区中含有的6个CDR：
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含不超过20个，不超过15个，不超过14个，不超过13个，不超过12个，不超过11个，不超过10个，不超过9个，不超过8个，不超过7个，不超过6个，不超过5个，不超过4个，不超过3个，不超过2个，或不超过1个的鼠源氨基酸残基，或者其不包含鼠源氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的FR区包含不超过20个，不超过15个，不超过14个，不超过13个，不超过12个，不超过11个，不超过10个，不超过9个，不超过8个，不超过7个，不超过6个，不超过5个，不超过4个，不超过3个，不超过2个，或不超过1个的鼠源氨基酸残基，或者其不包含鼠源氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)选自下列的重链可变区(VH)构架区(FR)中的一个或多个(例如1个，2个，3个或4个)：
(i)VH FR1，其由下述序列组成：
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)，或与SEQ ID NO:93相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个或4个置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH FR2，其由下述序列组成：WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)，或与SEQ IDNO:129相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，或3个置换、缺失或添加)的序列；
(iii)VH FR3，其由下述序列组成：
RITITRDTSKNQFSLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:161)，或与SEQ ID NO:161相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个置换、缺失或添加)的序列；和
(iv)VH FR4，其由下述序列组成：WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)，或与SEQ ID NO:183相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个或2个置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)选自下列的轻链可变区(VL)构架区(FR)中的一个或多个(例如1个，2个，3个或4个)：
(v)VL FR1，其由下述序列组成：DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISC(SEQ ID NO:215)，或与SEQ ID NO:215相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，或3个置换、缺失或添加)的序列；
(vi)VL FR2，其由下述序列组成：WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)，或与SEQ IDNO:221相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个或2个置换、缺失或添加)的序列；
(vii)VL FR3，其由下述序列组成：
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC(SEQ ID NO:223)，或与SEQ ID NO:223相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个，2个，或3个置换、缺失或添加)的序列；和
(viii)VL FR4，其由下述序列组成：FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)，或与SEQ IDNO:230相比具有一个或几个置换、缺失或添加(例如1个或2个置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VLFR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR1为SEQ IDNO:93，或者与SEQ ID NO:93的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个或4个置换)：
(01)位于H1的Q，H，或D；
(02)位于H4的Q；
(03)位于H11的Q；
(04)位于H14的A；
(05)位于H23的T；
(06)位于H27的T，N，A，S，或G
(07)位于H28的P；和
(08)位于H30的T；
其中(01)-(08)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR1为SEQ IDNO:93，或者与SEQ ID NO:93的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个或4个置换)：
(01)位于H1的H或D；
(04)位于H14的A；
(05)位于H23的T；
(06)位于H27的T，N，A，或S；
(07)位于H28的P；和
(08)位于H30的T；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR1为SEQ IDNO:93，或者与SEQ ID NO:93的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个或4个置换)：
(01)位于H1的D；
(04)位于H14的A；
(05)位于H23的T；
(06)位于H27的N或S；
(07)位于H28的P；和
(08)位于H30的T；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR1的序列选自如下：
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT(SEQ ID NO:95)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:96)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT(SEQ ID NO:97)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:98)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIS(SEQ ID NO:99)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGGSIT(SEQ ID NO:100)；
EVQLQESGPGLVKASQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:101)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:102)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:103)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIS(SEQ ID NO:104)；
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:105)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT(SEQ ID NO:106)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:107)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:108)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT(SEQ ID NO:109)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:110)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:111)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:112)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT(SEQ ID NO:113)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:114)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:115)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:117)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYPIT(SEQ ID NO:116)；
QVQQQESGPGQVKPSQTLSLTCAVSGYPIS(SEQ ID NO:118)；和
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:119)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR1的序列选自如下：
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:96)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:98)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:102)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:117)；
EVQLQESGPGLVKASQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:101)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIS(SEQ ID NO:104)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:103)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT(SEQ ID NO:106)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:107)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:108)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:110)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:111)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:115)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYPIT(SEQ ID NO:116)；和
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT(SEQ ID NO:109)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR1的序列选自如下：
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:96)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:98)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:117)；
EVQLQESGPGLVKASQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:101)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIS(SEQ ID NO:104)；和
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYPIT(SEQ ID NO:116)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR2为SEQ IDNO:129，或者与SEQ ID NO:129的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个或3个置换)：
(09)位于H37的V；
(10)位于H38的Q；
(11)位于H40的L；
(12)位于H43的K；
(13)位于H44的R，S，E，或G；
(14)位于H46的V；和
(15)位于H48的M；
其中(09)-(15)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR2为SEQ IDNO:129，或者与SEQ ID NO:129的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个或3个置换)：
(11)位于H40的L；
(12)位于H43的K；
(13)位于H44的R或E；
(14)位于H46的V；和
(15)位于H48的M；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR2的序列选自如下：
WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)；
WVRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:130)；
WIQQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:131)；
WIRQLPGNKLEWIG(SEQ ID NO:132)；
WIRQFPGKKLEWIG(SEQ ID NO:133)；
WIRQFPGKGLEWIG(SEQ ID NO:134)；
WIRQFPGNKLVWMG(SEQ ID NO:135)；
WIRQFPGKSLEWIG(SEQ ID NO:136)；
WIRQFPGKRLEWMG(SEQ ID NO:137)；
WIRQFPGNELEWIG(SEQ ID NO:138)；
WIRQFPGNRLEWIG(SEQ ID NO:139)；
WIRQFPGNRLEWMG(SEQ ID NO:140)；和
WIRQFPGNKLEWMG(SEQ ID NO:141)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR3为SEQ IDNO:161，或者与SEQ ID NO:161的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，或10个置换)：
(16)位于H67的V；
(17)位于H68的S；
(18)位于H70的S；
(19)位于H71的V；
(20)位于H73的I；
(21)位于H79的F；
(22)位于H81的K；
(23)位于H82A的S；
(24)位于H84的T；
(25)位于H85的A；
(26)位于H89的V或K；和
(27)位于H91的F；
其中(16)-(27)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR3的序列选自如下：
RITITRDTSKNQFSLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:161)；
RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)；
RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTARYYCAS(SEQ ID NO:163)；
RITISRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:164)；
RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:165)；
RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:166)；
RVSITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:167)；
RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS(SEQ ID NO:168)；
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:169)；
RVSISRDISKNQFFLKLSSVTAADTAVYFCAS(SEQ ID NO:170)；
RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:171)；
RVSITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS(SEQ ID NO:172)；
RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:173)；
RVTITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:174)；
RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:175)；
RISITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:176)；
RITITRDTSKNQFSLKLRSVTAEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:177)；
RITITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:178)；和
RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTTEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:179)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR4为SEQ IDNO:183，或者与SEQ ID NO:183的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个或2个置换)：
(28)位于H108的L或M；和
(29)位于H109的V；
其中(28)-(29)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR4为SEQ IDNO:183，或者与SEQ ID NO:183的差异在于，位于H108的M。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR4的序列选自如下：
WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)；
WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:184)；和
WGQGTMLTVSS(SEQ ID NO:185)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH FR4的序列选自WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)；和WGQGTMLTVSS(SEQ ID NO:185)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR1为SEQ IDNO:215，或者与SEQ ID NO:215的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，或3个置换)：
(30)位于L2的I；
(31)位于L7的T；
(32)位于L14的N；
(33)位于L15的P；和
(34)位于L18的Q；
其中(30)-(34)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR1为SEQ IDNO:215，或者与SEQ ID NO:215的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，或2个置换)：
(30)位于L2的I；
(31)位于L7的T；和
(32)位于L14的N；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR1为SEQ IDNO:215，或者与SEQ ID NO:215的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，或2个置换)：
(30)位于L2的I；和
(34)位于L18的Q；
其中，上述中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR1的序列选自如下：
DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISC(SEQ ID NO:215)；
DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISC(SEQ ID NO:216)；
DVVMTQTPLSLPVNLGEPASISC(SEQ ID NO:217)；
DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISC(SEQ ID NO:218)；
DVVMTQSPLSLPVTLGEQASISC(SEQ ID NO:219)；和
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC(SEQ ID NO:220)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR2为SEQ IDNO:221，或者与SEQ ID NO:221的差异在于下述置换：(35)位于L45的Q，
其中(35)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR2的序列选自如下：
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)；和
WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR3为SEQ IDNO:223，或者与SEQ ID NO:223的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，或3个置换)：
(36)位于L79的D；
(37)位于L80的A；
(38)位于L83的L；和
(39)位于L87的F；
其中(36)-(39)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR3为SEQ IDNO:223，或者与SEQ ID NO:223的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个，2个，或3个置换)：
(37)位于L80的A；
(38)位于L83的L；和
(39)位于L87的F；
其中(37)-(39)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR3为SEQ IDNO:223，或者与SEQ ID NO:223的差异在于选自下列的一个或多个置换(例如，1个或2个置换)：
(38)位于L83的L；和
(39)位于L87的F；
其中(38)-(39)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR3的序列选自如下：
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC(SEQ ID NO:223)；
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)；
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:225)；
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:226)；
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC(SEQ ID NO:227)；
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVDTEDLGVYFC(SEQ ID NO:228)；和
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYFC(SEQ ID NO:229)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR3的序列选自如下：
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC(SEQ ID NO:223)；
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)；
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC(SEQ ID NO:227)；和
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:226)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR3的序列选自如下：
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC(SEQ ID NO:223)；
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)；和
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC(SEQ ID NO:227)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR4为SEQ IDNO:230，或者与SEQ ID NO:230的差异在于下述置换：(40)位于L100的Q，
其中(40)中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR4的序列选自如下：
FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)；和
FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:231)；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL FR4的序列为FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含，选自下述(1)-(14)任一项的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4的组合：
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含：
(a)如DVVMTQSPLSLPVTLGEPAS ISC(SEQ ID NO:215)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC(SEQ ID NO:223)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(b)如DVVMTQSPLSLPVTLGEPAS ISC(SEQ ID NO:215)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(c)如DIVMTQSPLSLPVTLGEPAS ISC(SEQ ID NO:216)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC(SEQ ID NO:223)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(d)如DVVMTQSPLSLPVTLGEPAS ISC(SEQ ID NO:215)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(e)如DVVMTQSPLSLPVTLGEPAS ISC(SEQ ID NO:215)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:225)所示的VL FR3；以及，如FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:231)所示的VL FR4；
(f)如DVVMTQTPLSLPVNLGEPAS ISC(SEQ ID NO:217)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:226)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(g)如DVVMTQSPLSLPVTLGEPAS ISC(SEQ ID NO:215)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:225)所示的VL FR3；以及，如FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO:231)所示的VL FR4；
(h)如DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISC(SEQ ID NO:216)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC(SEQ ID NO:227)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(i)如DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISC(SEQ ID NO:218)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC(SEQ ID NO:227)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(j)如DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISC(SEQ ID NO:218)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC(SEQ ID NO:227)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(k)如DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISC(SEQ ID NO:218)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVDTEDLGVYFC(SEQ ID NO:228)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(l)如DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISC(SEQ ID NO:218)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
(m)如DVVMTQSPLSLPVTLGEQASISC(SEQ ID NO:219)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；或者
(n)如DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC(SEQ ID NO:220)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYFC(SEQ ID NO:229)所示的VL FR3；以及，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含，如FGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:230)所示的VL FR4；以及，选自下列的VL FR1、VL FR2和VL FR3：
(b)如DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISC(SEQ ID NO:215)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)所示的VL FR3；
(c)如DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISC(SEQ ID NO:216)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDVGVYYC(SEQ ID NO:223)所示的VL FR3；
(d)如DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISC(SEQ ID NO:215)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC(SEQ ID NO:224)所示的VL FR3；
(f)如DVVMTQTPLSLPVNLGEPASISC(SEQ ID NO:217)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:221)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:226)所示的VL FR3；
(h)如DIVMTQSPLSLPVTLGEPASISC(SEQ ID NO:216)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC(SEQ ID NO:227)所示的VL FR3；和
(i)如DIVMTQSPLSLPVTLGEQASISC(SEQ ID NO:218)所示的VL FR1；如WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:222)所示的VL FR2；如GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFC(SEQ ID NO:227)所示的VL FR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含，选自下述(1)-(41)任一项的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4的组合：
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(a)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RITITRDTSKNQFSLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:161)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(b)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(c)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTARYYCAS(SEQ ID NO:163)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(d)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)所示的VH FR1；如WVRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:130)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(e)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)所示的VH FR1；如WIRQFPGNRLEWIG(SEQ ID NO:139)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:174)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(f)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(g)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:167)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(h)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGKRLEWMG(SEQ ID NO:137)所示的VH FR2；如RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:171)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(i)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGNELEWIG(SEQ ID NO:138)所示的VH FR2；如RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:173)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(j)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:167)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(k)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT(SEQ ID NO:95)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(l)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:96)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(m)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT(SEQ ID NO:97)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(n)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT(SEQ ID NO:97)所示的VH FR1；如WIQQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:131)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(o)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:98)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(p)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIS(SEQ ID NO:99)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(q)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGGSIT(SEQ ID NO:100)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(r)如EVQLQESGPGLVKASQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:101)所示的VH FR1；如WIRQLPGNKLEWIG(SEQ ID NO:132)所示的VH FR2；如RITISRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:164)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(s)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIS(SEQ ID NO:104)所示的VH FR1；如WIRQFPGKKLEWIG(SEQ ID NO:133)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS(SEQ ID NO:168)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(t)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:117)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS(SEQ ID NO:172)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(u)如HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT(SEQ ID NO:106)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:166)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(v)如HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:108)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:166)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(w)如HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT(SEQ ID NO:109)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:166)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(x)如HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:103)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:166)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(y)如HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:107)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:166)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(z)如HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:110)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:166)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(aa)如QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:105)所示的VH FR1；如WIRQFPGKGLEWIG(SEQ ID NO:134)所示的VH FR2；如RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:169)所示的VH FR3；以及，如WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:184)所示的VH FR4；
(ab)如QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:105)所示的VH FR1；如WIRQFPGKSLEWIG(SEQ ID NO:136)所示的VH FR2；如RVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:169)所示的VH FR3；以及，如WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:184)所示的VH FR4；
(ac)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:111)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:165)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(ad)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYPIT(SEQ ID NO:116)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLVWMG(SEQ ID NO:135)所示的VH FR2；如RVSISRDISKNQFFLKLSSVTAADTAVYFCAS(SEQ ID NO:170)所示的VH FR3；以及，如WGQGTMLTVSS(SEQ ID NO:185)所示的VH FR4；
(ae)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:102)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:165)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(af)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:112)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:165)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(ag)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT(SEQ ID NO:113)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:165)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；
(ah)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:114)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:165)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4；或
(ai)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:115)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2；如RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:165)所示的VH FR3；以及，如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(1)如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2，如WGQGTTLTVSS(SEQ IDNO:183)所示的VH FR4，以及，
(1a)如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3，和选自下列的VH FR1：
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:98)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)；和
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:96)；或
(1b)如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:166)所示的VH FR3，和选自下列的VH FR1：
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:103)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGTSIT(SEQ ID NO:106)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:107)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:108)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:110)；
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:103)；和
HVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGASIT(SEQ ID NO:109)；或
(1c)如RVSITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:165)所示的VH FR3，和选自下列的VH FR1：
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:111)；
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:115)；和
DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:102)；或
(1d)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)所示的VH FR1，和如RITITRDTSKNQFSLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:161)所示的VH FR3；或
(1e)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1，和如RVSITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:167)所示的VH FR3；或
(1f)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:117)所示的VH FR1，和如RVSITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS(SEQ ID NO:172)所示的VH FR3；或者
(2)如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4，以及选自下列的VH FR1、VHFR2和VH FR3：
(2a)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGKRLEWMG(SEQ ID NO:137)所示的VH FR2；和如RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:171)所示的VH FR3；
(2b)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGNELEWIG(SEQ ID NO:138)所示的VH FR2；和如RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:173)所示的VH FR3；
(2c)如EVQLQESGPGLVKASQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:101)所示的VH FR1；如WIRQLPGNKLEWIG(SEQ ID NO:132)所示的VH FR2；和如RITISRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:164)所示的VH FR3；
(2d)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIS(SEQ ID NO:104)所示的VH FR1；如WIRQFPGKKLEWIG(SEQ ID NO:133)所示的VH FR2；和如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS(SEQ ID NO:168)所示的VH FR3；或者
(3)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYPIT(SEQ ID NO:116)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLVWMG(SEQ ID NO:135)所示的VH FR2；如RVSISRDISKNQFFLKLSSVTAADTAVYFCAS(SEQ ID NO:170)所示的VH FR3；以及，如WGQGTMLTVSS(SEQ ID NO:185)所示的VH FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(1)如WIRQFPGNKLEWIG(SEQ ID NO:129)所示的VH FR2，如WGQGTTLTVSS(SEQ IDNO:183)所示的VH FR4，以及，
(1a)如RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:162)所示的VH FR3，和选自下列的VH FR1：
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT(SEQ ID NO:98)；
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)；和
EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGNSIS(SEQ ID NO:96)；或
(1b)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)所示的VH FR1，和如RITITRDTSKNQFSLILRSVTAEDTAIYYCAS(SEQ ID NO:161)所示的VH FR3；或
(1c)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1，和如RVSITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:167)所示的VH FR3；或
(1d)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIT(SEQ ID NO:117)所示的VH FR1，和如RVSITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS(SEQ ID NO:172)所示的VH FR3；或者
(2)如WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:183)所示的VH FR4，以及选自下列的VH FR1、VHFR2和VH FR3：
(2a)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGKRLEWMG(SEQ ID NO:137)所示的VH FR2；和如RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAVYYCAS(SEQ ID NO:171)所示的VH FR3；
(2b)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIT(SEQ ID NO:94)所示的VH FR1；如WIRQFPGNELEWIG(SEQ ID NO:138)所示的VH FR2；和如RITITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:173)所示的VH FR3；
(2c)如EVQLQESGPGLVKASQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:101)所示的VH FR1；如WIRQLPGNKLEWIG(SEQ ID NO:132)所示的VH FR2；和如RITISRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAKYFCAS(SEQ ID NO:164)所示的VH FR3；
(2d)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYPIS(SEQ ID NO:104)所示的VH FR1；如WIRQFPGKKLEWIG(SEQ ID NO:133)所示的VH FR2；和如RVTITRDTSKNQFFLKLRSVTAEDTAIYFCAS(SEQ ID NO:168)所示的VH FR3；
(2e)如EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSIS(SEQ ID NO:93)所示的VH FR1；如WIRQFPGNRLEWIG(SEQ ID NO:139)所示的VH FR2；和如RVTITRDTSKNQFFLILRSVTAEDTAKYYCAS(SEQ ID NO:174)所示的VH FR3；或者
(3)如DVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGYPIT(SEQ ID NO:116)所示的VH FR1；如WIRQFPGNKLVWMG(SEQ ID NO:135)所示的VH FR2；如RVSISRDISKNQFFLKLSSVTAADTAVYFCAS(SEQ ID NO:170)所示的VH FR3；以及，如WGQGTMLTVSS(SEQ ID NO:185)所示的VH FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VLFR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体的重链可变区构架区(FR1-4)与包含于SEQ ID NOs:11-92和263-279任一项(例如SEQ ID NO:11)中的重链可变区构架区(FR1-4)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体的轻链可变区构架区(FR1-4)与包含于SEQ ID NOs:186-214和298-308任一项(例如SEQ ID NO:186)中的轻链可变区构架区(FR1-4)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含，与包含于SEQ ID NOs:11-92和263-279任一项(例如SEQ ID NO:11)中的重链可变区构架区(FR1-4)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的重链可变区构架区(FR1-4)，以及与包含于SEQ ID NOs:186-214和298-308任一项(例如SEQ ID NO:186)中的轻链可变区构架区(FR1-4)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)序列同一性的轻链可变区构架区(FR1-4)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含，选自下列的抗体的重链和轻链可变区中含有的8个FR：
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如上文所定义的VH FR1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如上文所定义的VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VL FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如上文所定义的VH FR1、VH CDR1、VH FR2、VHCDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4；并且，轻链可变区包含如上文所定义的VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VL FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与选自下列的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：
如SEQ ID NOs:11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，263，264，265，266，267，268，269，270，271，272，273，274，275，276，277，278和279所示的重链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自如SEQ ID NOs:11-92和263-279任一项所示的重链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与选自下列的轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：
如SEQ ID NOs:186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，298，299，300，301，302，303，304，305，306，307和308所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区选自如SEQ ID NOs:186-214和298-308任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体所包含的重链可变区与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体所包含的轻链可变区与SEQ ID NO:186具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且，轻链可变区与SEQ ID NO:186具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含如上文所定义的重链可变区和如上文所定义的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含选自下列的抗体的重链和轻链可变区：
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含：
(1)如SEQ ID NO:11所示的VH和如SEQ ID NO:186所示的VL；
(2)如SEQ ID NO:16所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(3)如SEQ ID NO:14所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(4)如SEQ ID NO:72所示的VH和如SEQ ID NO:201所示的VL；
(5)如SEQ ID NO:71所示的VH和如SEQ ID NO:199所示的VL；
(6)如SEQ ID NO:17所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(7)如SEQ ID NO:31所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(8)如SEQ ID NO:69所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；
(9)如SEQ ID NO:44所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(10)如SEQ ID NO:73所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；
(11)如SEQ ID NO:32所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(12)如SEQ ID NO:77所示的VH和如SEQ ID NO:206所示的VL；
(13)如SEQ ID NO:45所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
(14)如SEQ ID NO:74所示的VH和如SEQ ID NO:209所示的VL；
(15)如SEQ ID NO:47所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；
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(133)如SEQ ID NO:277所示的VH和如SEQ ID NO:307所示的VL；
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或者
(135)如SEQ ID NO:279所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL。
本发明的抗体可以通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，如E.coli细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
本发明的抗体对HBsAg蛋白具有高特异性和高亲和力。例如，本发明的抗体结合HBsAg的KD值可小于1x10-5M；优选地，KD值小于1x10-6M；更优选地，KD值小于1x10-7M；最优选地，KD值小于1x10-8M。
本发明的抗体可以是包含两条重链和两条轻链的、具有传统的“Y”型结构的抗体。另外，本发明的抗体也可以是具有传统的“Y”型结构的抗体的Fab片段、Fab'、F(ab)2、Fv、或其它类型的片段，其保持了对HBsAg蛋白的亲和力，并且其结合HBsAg蛋白的亲和力可以高于或低于具有传统的“Y”型结构的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab'片段可以直接从E.coli细胞中获得；可以将Fab'片段化学藕联形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab')2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、双抗体(diabody)、双特异性抗体、多特异性抗体。特别优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段为scFv抗体。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合HBsAg，中和HBV的毒力，和/或降低HBV DNA和/或HBsAg在受试者体内的血清水平。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是IgG类别的。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可以为IgG1或IgG2或IgG4类别的。
融合抗体
在另一个方面，可制备融合抗体或免疫粘合素，例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接于另一个多肽。在某些优选的实施方案中，融合抗体包含抗本发明抗体的重链可变区和轻链可变区。在某些优选的实施方案中，融合抗体包含本发明抗体的VH结构域和VL结构域；其中，所述VH结构域连接于第一个多肽，而所述VL结构域连接于第二个多肽。
衍生的抗体
本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对HBsAg的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。
一种类型的衍生化抗体(例如,双特异性抗体)是通过交叉连接2个或多个抗体(属于同一类型或不同类型)而产生的。适当的交联剂包括例如异基双功能剂，其含有由适当的间隔区隔开的2个不同的反应基团(例如m-丁烯酰胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)；以及，同基双功能剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)。此类交联剂可从Pierce Chemical Company,Rockford,II购买得到。
另一种类型的衍生化抗体是标记的抗体。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接至有用的检测试剂。此类检测试剂包括例如，荧光化合物，例如荧光素、异硫氯酸荧光素、罗丹明、5-二甲氨基-1-蔡磺酰氯、藻红蛋白、镧磷光剂等等。此外，抗体也可以用酶进行标记，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等等。当抗体用酶进行标记时，可通过加入能够被酶利用并产生可识别的信号或反应产物的试剂来检测标记的抗体。例如，当使用辣根过氧化物酶标记抗体时，可以加入过氧化氢和二氨基联苯，以产生可检测的有色反应产物，从而检测标记的抗体的存在或量。此外，抗体也可以用生物素进行标记。在这种情况下，可以通过间接测定抗生物素蛋白的结合来检测标记的抗体的存在或量。此外，抗体也可以用可被第二个报告分子识别的标签进行标记(例如亮氨酸拉链互补序列、金属结合结构域、附加表位等等)。在某些具体实施方式中，标签通过不同长度的间隔臂连接至抗体，以降低潜在的位阻。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
核酸分子、载体和宿主细胞
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含根据本发明的分离的核酸分子。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，提供了制备根据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养根据本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
诊断方法和试剂盒
本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合HBsAg，从而可用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，可用于诊断受试者是否感染了HBV。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。
可按照上文详细描述的方法来对本发明的抗体或其抗原结合片段或者第二抗体进行标记。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接至可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。此外，此类可检测的标记还包括例如，放射性同位素，例如125碘；荧光物质例如荧光素、异硫氯酸荧光素、罗丹明、5-二甲氨基-1-蔡磺酰氯、藻红蛋白、镧磷光剂等等；能够产生可识别的信号或反应产物的酶，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等等；能够被第二个报告分子识别的标签，例如生物素、抗生物素蛋白、亮氨酸拉链互补序列、金属结合结构域、附加表位等等。在某些具体实施方式中，可通过不同长度的接头将检测试剂(例如标签)连接至抗体，以降低潜在的位阻。
在另一个方面，本发明提供了检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HBV的方法，其包括：使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测HBsAg蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HBV。
治疗方法和药物组合物
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，以及用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有根据本发明的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物还可包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的药物，例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素。
在另一个方面，提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
在另一个方面，本发明提供了一种用于预防或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平的方法，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。
本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物的施用方式可以是传统的施用途径，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过本领域已知的多种方法给药。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段通过静脉输注或注射给予。
本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物可以配制成多种剂型，例如液体、半固体和固体剂型，例如溶液剂(例如注射剂)、分散剂或悬浮剂、片剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、丸剂、糖浆剂、粉剂、脂质体、胶囊剂和栓剂。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
例如，一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
另一种优选的剂型是分散剂。可通过下述方法来制备分散剂：将本发明的抗体或其抗原结合片段掺入无菌载体中，其含有一种基础分散介质以及任选的其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)。此外，还可以在分散剂中掺入可延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，以获得期望的药代动力学特征。
另一种优选的剂型是口服固相剂型，包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。此类固相剂型通常含有下述中的至少一种：(a)惰性药物赋形剂(或载体)，如柠檬酸钠、磷酸钙；(b)填充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(c)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(d)湿润剂，如甘油；(e)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(f)缓凝剂，如石蜡；(g)促吸收剂，如四氨基混合物；(h)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(i)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(j)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其任何组合。在片剂和胶囊剂型的情况下，还可以含有缓冲剂。
此外，还可以在口服固相剂型中添加释放速率改造剂(即，能改变药物释放速率的试剂)，以获得改良释放或脉冲释放剂型。此类释放速率改造剂包括但不限于，羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物，或其任何组合。改良释放和脉冲释放剂型可含有一种或一组释放速率改造剂。
另一种优选的剂型是口服的液体剂型，包括例如乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂等。除了活性成分之外，此类口服的液体剂型还可含有本领域常用的一些惰性溶液，例如水或其它溶剂，如乙烷基醇，异丙基醇，丙烯乙二醇，1,3-丁烯乙二醇，油(例如棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油)，甘油，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及其任何组合。除了这些惰性溶液之外，此类口服的液体剂型还可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。在某些优选的实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合片段与其它抗病毒试剂联合使用，以预防和或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病。本发明的抗体或其抗原结合片段可以和此类抗病毒试剂同时、分开或连续给药。此类抗病毒试剂包括但不限于，干扰素类药物、利巴韦林、金刚烷、羧基脲、IL-2、L-12和五羧链胞酸等。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明抗体或抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
本发明抗体或抗原结合片段的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.025到50mg/kg，更优选0.1到50mg/kg，更优选0.1-25mg/kg，O.1-10mg/kg。应注意的是，剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物的使用或范围。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的抗体不仅能够特异性识别/结合HBsAg，能够中和HBV的毒力，而且能够在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。因此，本发明的抗体具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
(2)本发明的抗体(特别是人源化抗体)不仅保留了亲本鼠源抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力；而且具有极高的人源化程度(人源化程度可高达97％)，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)具有重大的临床价值。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wi ley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：特异性结合HBsAg的小鼠单克隆抗体6D11及其人源化
1.1：小鼠单克隆抗体6D11的表征
已按照常规的免疫学方法，制备获得了特异性结合HBsAg的小鼠单克隆抗体6D11(下文中也简称为6D11-mAb或mAb)。小鼠单克隆抗体6D11的重链可变区氨基酸序列如SEQID NO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：1
DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGYPITSGYHWNWIRQFPGNKLVWMGYISYDGSDHYNPSLENRISITRDISKNQFFLILRSVTTEDTGKYFCASGFDHWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO：2
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYFCSQNTHVPYTFGGGTKLEIKR
进一步，还使用Kabat等人描述的方法(Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第五版，Public Health Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了小鼠单克隆抗体6D11的CDR序列。小鼠单克隆抗体6D11的重链可变区和轻链可变区的CDR的氨基酸序列如表3(SEQ ID NO:3-8)所示。
表3：抗体6D11的重链和轻链可变区的CDR的氨基酸序列
| VH CDR1 | SGYHWN | SEQ ID NO:3 |
| VH CDR2 | YISYDGSDHYNPSLEN | SEQ ID NO:4 |
| VH CDR3 | GFDH | SEQ ID NO:5 |
| VL CDR1 | RSSQSLVHSYGDTYLH | SEQ ID NO:6 |
| VL CDR2 | KVSNRFS | SEQ ID NO:7 |
| VL CDR3 | SQNTHVPYT | SEQ ID NO:8 |
另外，还将编码小鼠单克隆抗体6D11的重链和轻链可变区的基因序列分别与编码人抗体的重链和轻链恒定区的基因序列相连接，并在CHO细胞中进行重组表达，从而获得嵌合抗体6D11-cAb(下文中也简称为cAb)。
已出人意料地发现，小鼠单克隆抗体6D11-mAb以及嵌合抗体6D11-cAb不仅能够特异性识别/结合HBsAg，而且能够在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞(关于6D11-mAb和6D11-cAb的实验数据，参见图7-9)。因此，小鼠单克隆抗体6D11-mAb以及嵌合抗体6D11-cAb具有用于治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
1.2：用于抗体6D11-mAb人源化的人抗体模板的选择和优化
为了减少异源抗体施用给人受试者时引起的免疫原性，需要通过CDR移植的方法对小鼠单克隆抗体6D11-mAb进行人源化。虽然抗体主要通过CDR来接触和识别抗原，但是抗体FR区中的部分残基可能也参与抗原-抗体的相互作用，影响CDR的空间构型。因此，在将鼠源抗体的FR区替换为人抗体的FR区后，鼠源抗体的CDR的空间构型往往发生改变，导致人源化抗体识别/结合抗原的亲和力显著下降，甚至导致人源化抗体丧失与抗原结合的能力(葛彦，人源化抗体研制策略分析及应用研究[J].国外医学，免疫学分册,2004,27(5):271)。因此，在鼠源抗体的人源化过程中，选择能够与鼠源抗体CDR匹配的人抗体模板是十分重要的。
在大量的分析和实验的基础上，发明人出人意料地发现，将人胚系基因序列4-28-02(SEQ ID NO：9)及2D-28-01(SEQ ID NO：10)作为接受6D11-mAb的CDR的人抗体模板是特别有利的。特别地，人胚系基因序列4-28-02(SEQ ID NO：9)及2D-28-01(SEQ ID NO：10)能够与6D11-mAb的重链和轻链CDR良好地匹配，能够最大程度地保留6D11-mAb结合抗原的亲和力。人胚系基因序列4-28-02(SEQ ID NO：9)及2D-28-01(SEQ ID NO：10)的具体序列还可见于NCBI，Kabat和GenBank等公共数据库。
将小鼠单克隆抗体6D11-mAb的重链和轻链CDR区分别移植到人源化模板(即，人胚系基因序列4-28-02(SEQ ID NO：9)及2D-28-01(SEQ ID NO：10))的FR框架上。进一步，还结合对序列的分析及以往的人源化经验，对上述人源化模板的FR区氨基酸残基进行了一系列的回复突变，以使人源化抗体尽可能保留鼠源抗体的抗原结合能力。一共获得了20株人源化抗体。这20株人源化抗体的名称以及VH和VL的序列信息示于图1A-1B中，其中，图1A显示了人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列；图1B显示了人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列；“.”表示该位置的氨基酸残基与抗体B-S3-45的相应位置的氨基酸残基相同。此外，这20株人源化抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和轻链的FR区(FR1-FR4)和CDR区(CDR1-CDR3)的氨基酸序列编号还概述于表1和表2中。
1.3：衍生自6D11-mAb的人源化scFv抗体的构建
以上述20个人源化抗体的编码基因为模板，采用重叠延伸PCR(splicingoverlapping extension-PCR,SOE-PCR)方法，获得编码衍生自6D11-mAb的人源化scFv抗体的基因片段(20个)。scFv抗体的结构为：NH2-VH-linker-VL-COOH，其中linker的序列可以为(G4S)3。PCR条件为：95℃预变性5min；8个循环的(95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s)；72℃反应10min。通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并用DNA纯化回收试剂盒(TianGen，DP214-03)回收/纯化扩增产物，从而获得编码衍生自6D11-mAb的人源化scFv抗体的基因片段H-K(20个)。将各个基因片段H－K用SfiⅠ酶切，然后按照10∶1(基因片段：载体)的摩尔比分别与载体pCGMT(来自Scripps，Making chemistry selectable by linkingit to infectivity)进行连接。通过电穿孔法(电转条件：25μF、2.5KV、200Ω)，将连接产物转化入感受态大肠杆菌ER2738。经转化的大肠杆菌在SOC培养基中恢复45min，然后取出200μL菌液用于涂布LB平板(含100g/L的氨苄青霉素+四环素+2g/mL葡萄糖)，并在37℃静置培养过夜。从平板上挑取单克隆菌落，并进行测序，以确保编码scFv抗体的重组载体的序列正确性。编码scFv抗体的重组载体(pCGMT-scFv)的示意图如图2所示。
1.4：人源化的scFv抗体的检测
将前一步骤获得的阳性单克隆菌落用含氨苄青霉素(100g/L)和葡萄糖(2g/mL)的2×YT培养基培养至OD＝0.6，然后添加M13KO7进行辅助超感染。2h后，添加100g/L的卡那霉素，并在37℃进行超感染。2h后，以4000rpm离心培养物10min，弃去上清，并收集细胞沉淀。将细胞沉淀用含氨苄青霉素和卡那霉素(100g/L)的双抗性培养基重悬，并在30℃振荡培养过夜。随后，以12000rpm离心培养物10min，收集菌体和上清，4℃保存用于检测。
取包被有HBsAg(3μg/mL)抗原的ELISA板，每孔加入100μL待测上清，并在37℃温育1h。随后，用PBST洗涤ELISA板5次，然后添加以1∶5000稀释的anti M13－HRP 100μL，并在37℃温育30min。随后，用PBST洗涤ELISA板5次，并添加底物TMB溶液。显色15min后，用H2SO4终止显色反应，并于OD450/620测定读值。以M13KO7为阴性对照。ELISA检测结果如图3所示。图3的结果显示，展示这些scFv抗体的噬菌体均具有ELISA检测反应活性；所构建的20个人源化scFv抗体均能够与抗原HBsAg结合。
另外，还通过下式计算这20个人源化抗体的人源化程度：
人源化程度＝(FR区氨基酸个数-FR区保留的鼠源氨基酸个数)/FR区氨基酸个数×100％
结果显示，这20个人源化抗体的人源化程度在91.12％到88.17％之间，其FR区保留的鼠源氨基酸的个数以及人源化程度示于表4中。
表4：人源化抗体的序列分析
实施例2：人源化抗体B-S3-45的CDR区氨基酸的单点置换
用天然存在的20种氨基酸分别对人源化抗体B-S3-45的6个CDR区的每个位点的氨基酸进行单点置换。采用实施例1.3和1.4的克隆方法获得表达噬菌体抗体的重组载体，其中所述噬菌体抗体与B-S3-45相比，在CDR区具有单点突变。使用简并引物来引入突变位点的氨基酸置换。
以重链可变区CDR3(HCDR3)的第一位氨基酸为例，设计寡核苷酸引物H3R1及B45-H3F(其序列示于表5)，引物在人源化抗体B-S3-45的编码基因上的退火位置见图4。PCR的具体方案如下：以B-S3-45的编码基因为模板，用引物对B45-VhF/H3R1和B45-H3F/B45-VkR分别扩增出上、下游片段；通过重叠延伸PCR将片段连接到一起，再以B45-VhF/B45-VkR为上下游引物进行扩增，获得在HCDR3第一位氨基酸上发生了单点突变的完整scFv基因片段。
表5：引物序列
将获得的scFv基因片段H-K用SfiⅠ酶切，然后按照10∶1(基因片段：载体)的摩尔比与载体pCGMT进行连接。将含有单点突变的重组质粒电转入ER2738细胞。然后，用经转化的大肠杆菌涂布LB平板(含100g/L的氨苄青霉素+四环素+2g/mL葡萄糖)，并在37℃静置培养过夜。从平板上挑取单克隆菌落，并进行测序，以确保编码含有单点突变的scFv抗体的重组载体的序列正确性。然后，按照实施例1的方法，检测含有单点突变的scFv抗体与抗原HBsAg的反应性，以展示抗体B-S3-45的噬菌体为阳性对照。
ELISA的检测结果如图5A-5I所示，其中，横坐标表示scFv抗体中的单点突变的位置和类型(例如，“H31-R”表示，根据Kabat编号系统的位置H31上的氨基酸残基被突变为R)，纵坐标表示展示含有单点突变的scFv抗体的噬菌体与抗原HBsAg的反应性。图5A-5I的实验结果显示，可以对抗体B-S3-45的CDR区的氨基酸残基进行单点突变，而不破坏抗体对抗原HBsAg的结合亲和力。
另外，还将图5A-5I中涉及的所有单点突变概述于表6中，以确定抗体B-S3-45中能够耐受突变的CDR区氨基酸位置，以及在该位置上可以使用的氨基酸残基的类型。
表6：抗体B-S3-45的CDR区氨基酸残基的单点突变
※：所提及的氨基酸残基位置均根据Kabat编号系统；“X”代表天然存在的20种氨基酸中的任意氨基酸。
实施例3：人源化抗体B-S3-45的优化和改造
由于人源化抗体的FR区中还含有10％左右的鼠源氨基酸残基(参见表4)，再考虑到CDR区中的氨基酸残基基本上都是鼠源的，因此，人源化抗体在施用给人受试者时，在一定程度上都会引起免疫排斥反应。为了尽可能减少此类免疫排斥反应，并使得人源化抗体尽可能保留亲本鼠源抗体的功能和性质(即，抗原结合活性，病毒中和活性，以及清除HBV的DNA和HBsAg的能力)，对人源化抗体B-S3-45进行进一步的优化和改造。
简言之，基于人源化抗体B-S3-45的氨基酸序列，实施例2确定的可进行置换的CDR区氨基酸残基的位置和可用于置换的氨基酸残基的类型，以及来自NCBI BLAST的比对结果，发明人在人源化抗体B-S3-45的FR和CDR区引入了不同的氨基酸突变的组合，设计了115株新的人源化抗体。这115株人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列示于图6A-6J中，其中，图6A-6E展示了人源化抗体的重链可变区的氨基酸序列；图6F-6J展示了人源化抗体的轻链可变区的氨基酸序列；“.”表示该位置的氨基酸残基与抗体B-S3-45的相应位置的氨基酸残基相同。此外，这115株人源化抗体的重链可变区、轻链可变区、重链和轻链的FR区(FR1-FR4)和CDR区(CDR1-CDR3)的氨基酸序列编号还概述于表1和表2中。
在这115株人源化抗体中，抗体162B、B3-S4-N-130、B3-S4-N-65、B4-T13-11、B3-S4-N-68、P-44、P-50、B3-S4-N-50、112、110、84、116、153、187、127、62、23、123、83、138、192的人源化程度均达到97％，其FR区只保留了4个鼠源氨基酸残基。
就真核表达能力和抗原结合活性，对这115株人源化抗体以及从实施例1的20株人源化抗体中随机选择的10株抗体进行测定。
3.1：用于真核表达的重组载体的构建
表达重链的重组载体的构建：利用EcoRI酶切位点(GAATTC)和HindIII酶切位点(AAGCTT)，将编码重链可变区的基因序列插入到之前构建好的重链表达载体pTT5-CH(其包含编码人抗体重链恒定区的序列)上。简言之，采用重叠延伸PCR(splicing overlappingextension-PCR,SOE-PCR)方法获得125株人源化抗体的重链可变区基因片段。PCR扩增产物通过凝胶电泳来进行回收和纯化。随后，以回收的PCR扩增产物(第一轮PCR产物)为模板，用引物PTT5-VHF2/6D11-PTT5-VHR(其序列示于表5中)进行第二轮PCR，得到第二轮PCR的扩增产物(其包含完整的VH基因和编码信号肽的序列)。用DNA回收试剂盒(TIANGEN)回收第二轮PCR的扩增产物。用EcoRI和HindIII两种限制性内切酶对第二轮PCR的扩增产物和载体PTT5-CH进行双酶切。使用T4连接酶(NEB)，将二者的酶切产物连接在一起，从而获得表达重链的重组载体VH+CH+pTT5。连接反应的条件为，在16℃下连接4h。将重组载体VH+CH+pTT5转化入到大肠杆菌5α菌株中。然后，用经转化的大肠杆菌涂布LB平板，并在37℃静置培养过夜。从平板上挑取单克隆菌落，并进行测序，以确保重组载体VH+CH+pTT5的序列正确性。
表达轻链的重组载体的构建：利用EcoRI酶切位点(GAATTC)和XbaI酶切位点(TCTAGA)，将编码轻链可变区和轻链恒定区的基因序列插入到轻链表达载体pTT5上。简言之，采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法获得125株人源化抗体的轻链可变区基因片段。PCR扩增产物通过凝胶电泳来进行回收和纯化。随后，以回收的PCR扩增产物(第一轮PCR产物)为模板，用引物PTT5-VKF2/6D11-PTT5-VKR(其序列示于表5中)进行第二轮PCR，得到第二轮PCR的扩增产物(其包含完整的VK基因和编码信号肽的序列)。用DNA回收试剂盒(TIANGEN)回收第二轮PCR的扩增产物。以含有轻链恒定区基因的载体为模板，用引物PTT5-CK-F/PTT5-CK-R(其序列示于表5，其中引物PTT5-CK-R含有XbaI的酶切位点)进行PCR扩增，以获得轻链恒定区基因CK。通过凝胶电泳来回收和纯化轻链恒定区基因CK。随后，用重叠延伸PCR法，将第二轮PCR的扩增产物和轻链恒定区基因CK连接到一起，形成完整的轻链基因VK+CK。用引物PTT5-VKF2和PTT5-CK-R扩增基因VK+CK。用EcoRI和XbaI两种限制性内切酶对基因VK+CK和载体pTT5进行双酶切。基因VK+CK的酶切产物用DNA回收试剂盒(TIANGEN)进行回收，载体pTT5的酶切产物通过凝胶电泳进行回收。使用T4连接酶(NEB)，将基因VK+CK和载体pTT5的酶切产物连接在一起，从而获得表达轻链的重组载体VK+CK+pTT5。连接反应的条件为，在16℃下连接4h。将重组载体VK+CK+pTT5转化入到大肠杆菌5α菌株中。然后，用经转化的大肠杆菌涂布LB平板，并在37℃静置培养过夜。从平板上挑取单克隆菌落，并进行测序，以确保重组载体VK+CK+pTT5的序列正确性。
3.2：人源化抗体的真核表达
用重组载体VH+CH+pTT5和VK+CK+pTT5共转染CHO-S悬浮细胞(细胞密度为约2×106cells/ml)。转染后的细胞在32℃，CO2细胞培养箱中培养7天，随后收集细胞上清，用于纯化抗体。根据制造商的说明书，使用protein A柱纯化上清中的IgG抗体。对纯化后的IgG抗体进行SDS-PAGE分析，以确定IgG抗体的纯度。
3.3：人源化抗体的抗原结合活性的测定
通过化学发光方法检测人源化抗体与HBsAg的结合活性。简言之，首先，用BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后的抗体的浓度，并将抗体的浓度统一稀释到200μg/mL。随后，用20％NBS进行抗体浓度梯度稀释：从20μg/mL开始，3倍浓度梯度稀释，共稀释12个浓度梯度。随后，将稀释好的抗体加入包被有2μg/mL HBsAg的化学发光板中，并在37℃孵育1h。随后，加入MAH-HRP酶标二抗，并孵育30min。孵育后，洗涤平板，加入发光液，并检测光强。用GraphPad Prism分析数据，并将结果示于图7A-7W中。图7A-7W的结果显示，测试的所有人源化抗体均具有良好的抗原结合活性，其对抗原HBsAg的亲和力优于6D11-mAb和6D11-cAb，或至少与6D11-mAb和6D11-cAb相当。这些结果表明，本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(最高可达97％)，能够减少免疫排斥反应的可能性，而且基本上保留了亲本鼠源抗体的抗原结合活性，甚至展示出比亲本鼠源抗体更高的抗原结合活性。这样的技术效果是显著的和出人意料的。
还分析了具有良好HBsAg结合活性的人源化抗体的重链和轻链CDR的序列。分析结果概述于表7A-7B中。
表7A：具有良好HBsAg结合活性的人源化抗体的重链CDR的序列
表7B：具有良好HBsAg结合活性的人源化抗体的轻链CDR的序列
| SEQ ID NO: | VK-CDR1 | SEQ ID NO: | VK-CDR2 | SEQ ID NO: | VK-CDR3 |
| 232 | RSNQSLVHSYGDTYLH | 240 | KVSNRFS | 244 | SQNTHVPYT |
| 233 | RSSQSLVHSYGDTYLH | 241 | KVSKRNS | 245 | SQNTHLPYT |
| 234 | RSSQSLVHPYGPTYLH | 242 | KASQRNS | 246 | GQNAKTPYT |
| 235 | RSSQSLVHTYGNTYLH | 243 | RSSHRNS | 247 | GQNARVPYT |
| 236 | RSSQSLVHPYGSTYLH | 248 | SQNSYVPYT | ||
| 237 | RSSQSLVHRYGTTYLH | 249 | SQNTIPPYT | ||
| 238 | RSSQSLVHPYGATYLH | 250 | GQNSMAPYT | ||
| 239 | RSSQSLVHPYGRTYLH | 251 | GQNAHLPYT | ||
| 318 | RSSQSLVHPFGPTYLH | ||||
| 319 | RSSQSLAHPYGSTYLH | ||||
| 320 | RSSQSLVHPYGSTYFH |
实施例4：人源化抗体的中和活性的测定
小鼠单克隆抗体6D11-mAb能够特异性结合HBV病毒颗粒，阻止HBV对诱导分化后的HepaRG细胞的吸附，抑制HBV侵入细胞，使HBV失去感染能力。在中和抗体不存在的情况下，HBV侵入分化后的HepaRG细胞，在细胞内进行复制，从而样品将呈现高水平的HBV抗原(HBeAg)。相反地，在中和抗体存在的情况下，HBV的侵入和复制将会被减弱或被完全抑制，从而样品将呈现低水平的HBV抗原(HBeAg)。因此，通过测定HBV抗原(HBeAg)的水平，即可确定不同人源化抗体的中和HBV的能力。
HepaAD38细胞是本实验室制备的、能够可控表达HBV的细胞。当需要扩增HepaAD38细胞，而不表达HBV时，可在培养基中加入四环素，以抑制HBV的转录复制。当需要表达HBV时，可使用不含四环素的培养基进行培养，以启动HBV的转录复制。将源于HepaAD38细胞的培养上清与分化的HepaRG细胞接触。结果显示，该培养上清含有HBV病毒，能够有效感染分化的HepaRG细胞。
利用上述HepaRG/HBV感染模型，评估人源化抗体中和/阻断HBV感染(100MOI HBV感染滴度)的能力。对人源化抗体进行两倍浓度梯度稀释，从10μg/mL开始，共稀释10个梯度。在用于感染细胞的病毒溶液中预先加入指定浓度的人源化抗体，然后将该病毒溶液用于感染HepaRG细胞。感染后第7天，取细胞培养上清，测定其中的HBeAg水平(HBV感染成功的重要指标)。检测方法如下：
(1)包被：将anti-HBeAg单克隆抗体稀释于20mM PB7.4中，终浓度为2μg/mL。向96孔微孔板中加入稀释的anti-HBeAg单克隆抗体(100μl/孔)，并于4℃孵育过夜。所使用的原料均购自北京万泰生物药业股份有限公司。
(2)洗涤：用PBST洗涤96孔微孔板一次，甩干。
(3)封闭：向96孔微孔板中加入封闭液，每孔200μL。封闭液购自北京万泰生物药业股份有限公司。
(4)孵育：加入100μL/孔的待检样品，并在37℃温育60min。
(5)洗涤：用PBST洗涤96孔微孔板5次。
(6)孵育：加入辣根过氧化物酶标记的anti-HBeAg抗体(100μl/孔)，并在37℃温育30min。原料购自北京万泰生物药业股份有限公司。
(7)洗涤：用PBST洗涤96孔微孔板5次。
(8)显色：加入鲁米诺化学发光试剂(100μl/孔)。
(9)读板：利用化学发光酶标仪读取数值。
在本实施例中，对下述人源化抗体的中和活性进行了检测：24-40、6-16、162、7-34-239、H11/K1、H17/K1、H40/K1、H42/K1、H162/K1、D11/K1、D162/K1、D239/K1、11-3、D11/41K、162/41k、D239/41K、84、110、116、162ccp-S5-N-56、162ccp-S6-N-149、162ccp-S5-P-64、162ccp-S5-N-32、162ccp-S4-N-81、162ccp-S5-P-27、162ccp-S5-P-77、162ccp-S5-N-41、162ccp-S5-N-69、162ccp-S5-N-70、162ccp-S6-N-101、162ccp-S6-N-111、162ccp-S6-N-137、162ccp-S6-N-146、162ccp-S6-N-160、162ccp-S6-N-66和162ccp-S6-N-45。
实验结果示于图8A-8G中。图8A-8G的结果显示，人源化抗体24-40、6-16、162、7-34-239、H11/K1、H17/K1、H40/K1、H42/K1、H162/K1、D11/K1、D162/K1、D239/K1、11-3、D11/41K、162/41k、D239/41K、84、110、116、162ccp-S5-N-56、162ccp-S6-N-149、162ccp-S5-P-64、162ccp-S5-N-32、162ccp-S4-N-81、162ccp-S5-P-27、162ccp-S5-P-77、162ccp-S5-N-41、162ccp-S5-N-69、162ccp-S5-N-70、162ccp-S6-N-101、162ccp-S6-N-111、162ccp-S6-N-137、162ccp-S6-N-146、162ccp-S6-N-160、162ccp-S6-N-66和62ccp-S6-N-45均具有良好的病毒中和活性，其对HBV的中和活性均优于嵌合抗体6D11-cAb，且部分中和抗体甚至具有与6D11-mAb相当的中和活性。这些结果表明，本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(最高可达97％)，能够减少免疫排斥反应的可能性，而且展示出比嵌合抗体6D11-cAb更高的病毒中和活性。这样的技术效果是显著的和出人意料的。
还分析了具有良好病毒中和活性的人源化抗体的重链和轻链CDR的序列。分析结果概述于表8A-8B中。
表8A：具有良好病毒中和活性的人源化抗体的重链CDR的序列
| SEQ ID NO: | VH-CDR1 | SEQ ID NO: | VH-CDR2 | SEQ ID NO: | VH-CDR3 |
| 126 | RWYHWN | 146 | YISYDGTVLYNPSLEN | 180 | GFDH |
| 122 | HGYHWN | 145 | YISYDGTILYNPSLEN | ||
| 124 | YGYHWN | 149 | YISYDGSVLYNPSLEN | ||
| 121 | RGYHWN | 151 | YISYDGTNLYNPSLEN | ||
| 123 | NGYHWN | 144 | YISYDGSILYNPSLEN | ||
| 120 | SGYHWN | 142 | YISYDGSDHYNPSLEN | ||
| 155 | YISYDGSVLYNPSLKS | ||||
| 156 | YISYDGSVLYNPSLKG | ||||
| 285 | YISYDGSVLFNPSLKS |
表8B：具有良好病毒中和活性的人源化抗体的轻链CDR的序列
实施例5：人源化抗体的动物治疗效果的测定
通过HBV转基因小鼠来评价人源化抗体在动物体内的病毒清除能力。该病毒清除能力直接反应了不同抗体作为治疗药物的潜力。将纯化后的、具有确定浓度的人源化抗体用0.22μm的滤器过滤，以确保无菌的状态。以10mg/kg的剂量，以尾静脉注射的方式将人源化抗体单次施用给HBV转基因小鼠。随后，在指定的时间，通过眼眶后静脉丛取血，采集小鼠的血液样品。定量检测小鼠血清中的HBsAg水平。
5.1：HBsAg的定量检测
(1)反应板的制备：将抗HBsAg的小鼠单抗HBs-45E9用1×PB缓冲液稀释到2μg/mL，然后添加至ELISA平板，并在2-8℃下包被16-24h，随后在37℃下包被2h。随后，用PBST洗涤平板一次。洗涤后，在各孔中加入200μL的封闭液，并在37℃封闭2h。随后，弃去封闭液，将平板干燥，装入真空铝箔袋，于2-8℃保存备用。
(2)样品稀释：用含20％新生牛血清的PBS溶液，将采集的小鼠血清稀释成1:30和1:150两个梯度，用于进行定量检测。
(3)样品变性处理：将15μL经稀释的血清样品与7.5μL变性缓冲液(15％SDS，溶于20mM PB7.4)充分混合，并在37℃温育1h。随后，加入90μL中和缓冲液(4％CHAPS，溶于20mMPB7.4)，充分混合。
(4)样品反应：将100μL经变性处理的血清样品加入反应板的孔中，并在37℃温育1h。随后用PBST洗涤平板5次。
(5)酶标记物反应：向反应板的孔中加入HBs-A6A7-HRP反应液(100μL/孔),并在37℃温育1h。随后用PBST洗涤平板5次。
(6)发光反应和测量：向反应板的孔中加入发光液(100μL/孔)，并进行光强检测。
(7)待测血清样品中的HBsAg浓度的确定：使用HBsAg浓度已知的标准品进行平行实验。基于标准品的测定结果绘制标准曲线(即，对标准品的光强测定值与HBsAg的浓度值进行线性回归)。然后，利用标准曲线，计算出待测血清样品中的HBsAg浓度。
在本实施例中，测定了下述人源化抗体在动物体内的病毒清除能力：24-40、7-34-239、162、11-3、162/41K、116、110和138。实验结果示于图9A-9B中。
图9A-9B的结果显示，人源化抗体24-40、7-34-239、162、11-3、162/41K、116、110和138均具有良好的病毒清除能力，其清除动物体内的HBsAg的能力优于嵌合抗体6D11-cAb。这些结果表明，本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(最高可达97％)，能够减少免疫排斥反应的可能性，而且展示出比嵌合抗体6D11-cAb更高的病毒清除能力。这样的技术效果是显著的和出人意料的。
还分析了具有良好病毒清除能力的人源化抗体的重链和轻链CDR的序列。分析结果概述于表9A-9B中。
表9A：在小鼠体内具有良好HBsAg清除活性的人源化抗体的重链CDR的序列
| SEQ ID NO: | VH-CDR1 | SEQ ID NO: | VH-CDR2 | SEQ ID NO: | VH-CDR3 |
| 126 | RWYHWN | 146 | YISYDGTVLYNPSLEN | 180 | GFDH |
| 121 | RGYHWN | 151 | YISYDGTNLYNPSLEN | ||
| 124 | YGYHWN | 149 | YISYDGSVLYNPSLEN | ||
| 120 | SGYHWN | 142 | YISYDGSDHYNPSLEN | ||
| 155 | YISYDGSVLYNPSLKS |
表9B：在小鼠体内具有良好HBsAg清除活性的人源化抗体的轻链CDR的序列
| SEQ ID NO: | VK-CDR1 | SEQ ID NO: | VK-CDR2 | SEQ ID NO: | VK-CDR3 |
| 233 | RSSQSLVHSYGDTYLH | 240 | KVSNRFS | 244 | SQNTHVPYT |
| 235 | RSSQSLVHTYGNTYLH | ||||
| 236 | RSSQSLVHPYGSTYLH |
实施例6：人源化抗体162、116、110、153和138的成药性的评估
1.人源化抗体162、116、110、153、138系列抗体的等电点测定
利用毛细管等电聚焦电泳法(cIEF)对人源化抗体162的等电点进行测定。实验结果如图10所示。结果显示，人源化抗体162的pI值为7.78(范围：7.03-7.87)，碱性峰的含量为0.99％，主峰的含量为55.87％，酸性峰的含量为43.14％。
162、116、110、153和138的等电点测定，结果如图11所示，等电点为7.83-8.6之间。表10对162、116、110、153和138的等电点进行统计。
表10：人源化抗体的等电点
2.人源化抗体的稳定性测定
通常使用Tm值来描述抗体分子的稳定性。Tm值越高，抗体分子的热稳定性越好。将人源化抗体162、116、110、153和138稀释至1mg/ml，并通过差式扫描量热法(DSC)进行测试。开始扫描温度设置为10℃，结束扫描温度设置为110℃，扫描速度为200℃/hr，冷却速度设置为Exp，最终仪器保持温度设置为25℃，数据采集频率设置为10sec，进样前毛细管温度设置为30℃。实验结果示于图12、图13、和表11、表12中。结果显示，人源化抗体162的Tm onset为61.81℃，Tm 1为71.21℃，Tm 2为84.48℃；而116、110、153和138的Tm值均大于80℃，说明162、116、110、153和138具有很好的热稳定性。
表11：人源化抗体162的DSC测试结果
| 样品名 | Tm onset | Tm 1 | Tm 2 |
| 162 | 61.81℃ | 71.21℃ | 84.48℃ |
表12：人源化抗体116、110、153和138的DSC测试结果
此外，将人源化抗体162以60mg/ml的浓度溶解于含有5％蔗糖和0.02％PS80的三种缓冲液中(即：缓冲液1为pH 5.0的25mM柠檬酸盐溶液；缓冲液2为pH 6.0的25mM组氨酸溶液；缓冲液3为pH 7.0的25mM磷酸盐溶液)，然后分别储存于5℃、25℃和40℃的条件下。分别于第0周(T0)、第1周(T1W)、第2周(T2W)和第4周(T4W)，对样品的理化性质(包括外观、pH值、蛋白浓度、粒径等)进行监测。
外观的监测
将样品瓶擦拭干净，并使用澄明度检测仪(黑背景和白背景)来观察样品的颜色和澄清度。结果示于表13中。表13展示了人源化抗体162在不同储存条件(不同缓冲液，不同温度，不同储存时间)下的外观变化。结果显示，溶解在缓冲液1中的人源化抗体162在40℃条件下储存4周后出现了浑浊外，其他储存条件下的样品均未出现明显变化。
表13：人源化抗体162在不同储存条件下的外观变化。
SS＝slightly yellow,slightly opalescent(微黄，微浊)；
SO＝slightly yellow,opalescent(微黄，浑浊)。
pH值和蛋白浓度的监测
检测样品在A280处的吸光值，利用比尔-朗伯定律(Beer–Lambert law)，计算样品中的蛋白浓度。另外，使用pH计测定样品的pH值，重复测定2次，取平均值为最终结果。实验结果示于图14A-14F中。图14显示了人源化抗体162在不同储存条件下的pH值(图14A-14C)和蛋白浓度(图14D-14F)的变化情况。结果显示，人源化抗体162在不同缓冲液，不同温度下储存4周后，pH值(图14A-14C)和蛋白浓度(图14D-14F)未发生显著改变。
SDS-PAGE分析抗体的稳定性
将37℃和40℃储存的不同时间点162、116、110、153和138分子，分别进行非还原型和还原型SDS-PAGE分析，非还原型SDS-PAGE胶的聚丙烯酰胺浓度为10％，还原型SDS-PAGE胶的聚丙烯酰胺浓度为12％。实验结果示于图15，从胶图可见，样品储存两周之内，条带表现基本稳定，无显著的降解和聚集。
粒径分析和SEC-HPLC检测
通过DLS对经历不同储存条件的人源化抗体162样品中的分子聚合物的粒径进行分析。简言之，在生物安全柜中，用移液器吸取40μl样品加入Nano ZS粒度仪的样品池中，然后启动Nano ZS粒度仪进行测试。实验数据用Zetasizer Nano软件进行分析处理。实验结果示于图14G-14I中。结果显示，在不同储存温度(5℃、25℃和40℃)下，溶解于缓冲液2(pH6.0)的人源化抗体162均具有最小的流体动力学直径；并且，在5℃条件下，溶解于不同缓冲液的人源化抗体162的流体动力学直径未发生显著变化，但是在25℃和40℃条件下，人源化抗体162的流体动力学直径将时间而增大。此外，在40℃条件下，在第4周，溶解于缓冲液2(pH 6.0)的人源化抗体162的粒径基本达到饱和，大约为16nM。这些结果说明，溶解于不同缓冲液的人源化抗体162在5℃条件下是稳定的；并且，与缓冲液1和3相比，溶解于缓冲液2(pH 6.0)的人源化抗体162更稳定。
采用Agilent 1260 infinity，TSK G3000SWXL凝胶柱(5μm,7.8mm×300mm)，通过SEC-HPLC对经历不同储存条件的人源化抗体162样品进行分析，其中，流动相组成为50mMPB+300mM NaCl，pH7.0±0.2；流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；样品浓度为10mg/ml，进样量为10μl。实验结果示于图14J-14L中。结果显示，在不同储存条件(不同缓冲液，不同温度，不同储存时间)下，含有人源化抗体162的样品的主峰均大于85％。这说明，人源化抗体162是稳定的。
3.人源化抗体162、116、110、153和138的可溶性分析
将人源化抗体162以60mg/ml的浓度溶解在含有5％蔗糖和0.02％PS80的25mM组氨酸溶液(pH 6.0，缓冲液2)中，并进行离心超滤浓缩(离心温度为5℃，转速为4850rpm)，直至样品溶液的液面随着离心时间的增加而不再有明显下降。用移液器小心回收样品，观察此时样品的性状。结果显示，溶液样品呈黄色。
然后，移取1000μL的溶液样品至1.5mlEP管中，以10000rpm离心20分钟。离心结果显示，样品无分层，液体澄清，且无沉淀出现。用移液器分别小心吸取离心后样品的上层和下层，并通过UV280测定蛋白浓度。结果显示，162上层溶液的蛋白浓度为171.81mg/ml，下层溶液的蛋白浓度为188.61mg/ml。以上层溶液的蛋白浓度作为人源化抗体162在该缓冲体系中的溶解度(即，溶解度为171.81mg/ml)。116的溶解度为185.99mg/ml；110的溶解度144.27mg/ml；153的溶解度为159.87mg/ml。
进一步，对溶解在含有5％蔗糖和0.02％PS80的25mM组氨酸溶液(pH 6.0，缓冲液2)中的人源化抗体的粘度进行测定。测定结果示于图16和图17中。结果显示，在该缓冲体系中，人源化抗体162在150mg/ml浓度下的粘度为9.66cp(1cP＝1mPa.s)，在160mg/ml浓度下的粘度为11.73cp。116在最高溶解度时的12.37cp；110在最高溶解度时的6.6cp；153在最高溶解度时的8.54cp。
实施例7：给食蟹猴单次静脉注射CHO-HBsAg和人源化抗体162、116、110和153后的药代动力学及初步毒性的评估
将9只未曾经历过大分子实验(>2000Dalton)的雄性食蟹猴分成3组，3只/组。其中，通过静脉推注给第1组的食蟹猴施用剂量为3mg/kg的由CHO细胞表达的HBsAg溶液(CHO-HBsAg)；通过静脉推注给第2组的食蟹猴施用剂量为20mg/kg的人源化抗体162溶液；通过静脉推注给第3组的食蟹猴施用剂量为3mg/kg的CHO-HBsAg溶液，10分钟后再给予20mg/kg的人源化抗体162溶液。评估给食蟹猴单次静脉注射CHO-HBsAg和人源化抗体162后的药代动力学特征及初步毒性反应。具体的实验设计如下(表14)：
表14：评估162分子药代动力学特征及初步毒性反应的实验设计
将27只未曾经历过大分子实验(>2000Dalton)的雄性食蟹猴分成9组，3只/组。其中，通过静脉推注给第9组的食蟹猴施用剂量为3mg/kg的由CHO细胞表达的HBsAg溶液(CHO-HBsAg)；通过静脉推注给第1、3、5和第7组的食蟹猴分别施用剂量为20mg/kg的人源化抗体116、110、153和138溶液；通过静脉推注给第2、4、6和第8组的食蟹猴施用剂量为3mg/kg的CHO-HBsAg溶液，10分钟后再给予20mg/kg的人源化抗体116、110和153溶液。评估给食蟹猴单次静脉注射CHO-HBsAg和人源化抗体后的药代动力学特征及初步毒性反应。具体的实验设计如下(表15)：
表15：评估人源化抗体分子药代动力学特征及初步毒性反应的实验设计
在给药前(0小时)，每天两次(上午9∶30和下午4∶00)笼边观察实验动物的健康及外观的状态。在实验开展前对实验动物进行体检，以确认动物的健康状态。在给药当天，在每个采血点前后分别观察实验动物的状态，包括实验动物的一般状态、行为、活动量、排泄、呼吸及其它异常症状。结果显示，所有动物在给药期间及给药后均未表现出任何异常反应(注：第1组的实验动物P1001由于较快的给药速率(注射时间为约1分钟)和较低的药物溶液温度(未加热至37℃)，而在给药后出现短暂的不适症状。其他实验动物均接受约3分钟的注射，且药物溶液在注射前被加温至37℃，未表现出任何异常反应)。
此外，还在给药后，跟踪实验动物的体重和体温。结果示于表16-18中。
表16：162给药后的实验动物的体重
表17:116、110、153和138给药后的实验动物的体重
表18：162给药后的实验动物的体温
上述实验结果表明，人源化抗体162、116、110、153和138在施用给实验动物后，不会引起实验动物的不良副作用，从而初步证实了人源化抗体162、116、110、153和138的良好的安全性。
此外，还分别于给药前(0小时)，给药后0.25h(15分钟)、0.5h(30分钟)、1h、2h、4h、10h、24h(Day 1)、48h(Day 2)、72h(Day 3)、96h(Day 4)、144h(Day 6)、192h(Day 8)、240h(Day 10)、336h(Day 14，针对除P1001之外的实验动物)、360h(Day 15，针对实验动物P1001)、408h(Day 17)、504h(Day 21)及672h(Day 28)，从实验动物的头静脉采集约1.0mL全血。对收集的血清和全血进行下述分析。
采用化学发光免疫分析法(CLIA)，检测食蟹猴血清中CHO-HBsAg和人源化抗体162的浓度。血清中CHO-HBsAg的定量下限(LLOQ)为0.037ng/mL，定量上限(ULOQ)为20ng/mL。血清中人源化抗体162的定量下限(LLOQ)为0.063ng/mL，定量上限(ULOQ)为4.0ng/mL。检测结果示于图18-22中。
图18显示了单次静脉注射CHO-HBsAg和/或人源化抗体162后，各组的雄性食蟹猴血清中CHO-HBsAg和人源化抗体162的平均血药浓度随时间变化的曲线图。
图19显示了单次静脉注射3mg/kg的CHO-HBsAg后每一只食蟹猴血清(第1组)中CHO-HBsAg的血药浓度随时间变化的曲线图。
图20显示了单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体162后，每一只食蟹猴血清(第2组)中人源化抗体162的血药浓度随时间变化的曲线图。
图21显示了接受3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体162后，每一只食蟹猴血清(第3组)中CHO-HBsAg的血药浓度随时间变化的曲线图。
图22显示了接受3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体162后，每一只食蟹猴血清(第3组)中人源化抗体162的血药浓度随时间变化的曲线图。
使用药动学软件WinNonlinTM Version 6.2.1(Pharsight，Mountain View，CA)，以静脉注射非房室模型(IV bolus input)对CHO-HBsAg及人源化抗体162的实验数据进行处理。
图23显示了接受3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体116、110和153后，每组食蟹猴血清(第3组)中CHO-HBsAg的血药浓度平均值随时间变化的曲线图。
图24显示了接受20mg/kg的人源化抗体116、110和153后，每组食蟹猴血清中人源化抗体116、110和153变体的血药浓度随时间变化的曲线图。
图25显示了接受3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体116、110和153后，每组食蟹猴血清中人源化抗体的血药浓度随时间变化的曲线图。
使用对数线性梯形法计算下列参数：起始血清药物浓度(C0)、最后一个可检测点的时间(Tlast)，消除半衰期(T1/2)，表观分布容积(Vdss)，总体清除率(CL)，从零时间点到最后一个可检测到浓度的时间点的平均滞留时间(MRT0-last)，从零时间点到无穷大的平均滞留时间(MRT0-inf)，从零时间点到最后一个可检测到浓度的时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUC0-last)，及从零时间点到无穷大的血清浓度-时间曲线下面积(AUC0-inf)。
结果显示：单次静脉注射3mg/kg的CHO-HBsAg后，雄性食蟹猴(第1组)对CHO-HBsAg的CL为0.535±0.0188mL/min/kg(约占肝血流量的1.23％)。食蟹猴对CHO-HBsAg的平均消除半衰期(t1/2)为21.6±0.723h。食蟹猴血清中CHO-HBsAg的Vdss和AUC0-inf分别为0.430±0.0344L/kg和93533±3235ng.h/mL。
相比之下，联合给予3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体162后，雄性食蟹猴(第3组)对CHO-HBsAg的总清除率升至2.09±0.603mL/min/kg(约占肝血流量的4.79％)，平均消除半衰期(t1/2)为24.7±1.04小时，表观分布容积为0.357±0.0778L/kg，AUC0-inf为25567±8741ng.h/mL。因此，第3组雄性食蟹猴中CHO-HBsAg的C0、AUC0-inf及CL值分别为第1组的1.09、0.273及3.91倍。
结果还显示：单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体162后，雄性食蟹猴对人源化抗体162的CL为6.30±1.50mL/min/kg(约占肝血流量的14.4％)。人源化抗体162的平均消除半衰期(t1/2)为158±52.7小时。食蟹猴血清中人源化抗体162的Vdss和AUC0-inf值分别为80.4±12.6L/kg和54967±13077μg.h/mL。
相比之下，联合给予3mg/kg的CHO-HBsAg和20mg/kg的人源化抗体162后，雄性食蟹猴(第3组)对人源化抗体162的总清除率升至11.1±1.09mL/min/kg(约占肝血流量的25.5％)，平均消除半衰期(t1/2)为87.6±102h，表观分布容积为109±60.4L/kg，AUC0-inf为30200±3100μg.h/mL。因此，第3组雄性食蟹猴中人源化抗体162的C0、AUC0-inf及CL值分别为第2组的0.867，0.549及1.76倍。
上述实验结果还概述于表19、表20和表21中。
表19：第1-3组雄性食蟹猴的血清中CHO-HBsAg和人源化抗体162的主要药动学参数
表20.食蟹猴的血清中CHO-HBsAg的半衰期(h)
| CHO-HBsAg | CHO-HbsAg+162C | |
| CHO-HbsAg | 20.42 | |
| CHO-HbsAg+116 | 1.4 | |
| CHO-HbsAg+110 | 1.29 | |
| CHO-HbsAg+153 | 1.54 |
表21.食蟹猴的血清中116、110和153抗体的半衰期
| Ab | CHO-HBsAg+Ab | |
| 116 | 125.87 | 151.51 |
| 110 | 154.33 | 128.35 |
| 153 | 233.23 | 184.12 |
另外，还对食蟹猴的血清进行血常规化学分析。食蟹猴血清中的各项指标(包括胆红素，丙氨酸转氨酶，天冬氨酸转氨酶，总蛋白，白蛋白，碱性磷酸酶，γ-谷氨酰转移酶，葡萄糖，尿素，肌酸酐，钙离子，磷，总胆固醇，甘油三酯，钠离子，钾离子，氯离子和球蛋白等的水平)均未见明显异常。这些实验结果表明，在指定的剂量条件下CHO-HBsAg和人源化抗体162、116、110和153的单次静脉注射是安全的。因此，本发明的人源化抗体162、116、110和153可施用给受试者(例如人)，以预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (16)
1.能够特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(1)如SEQ ID NO:72所示的VH和如SEQ ID NO:201所示的VL；或
(2)如SEQ ID NO:69所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；或
(3)如SEQ ID NO:73所示的VH和如SEQ ID NO:202所示的VL；或
(4)如SEQ ID NO:91所示的VH和如SEQ ID NO:205所示的VL；或
(5)如SEQ ID NO:36所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；或
(6)如SEQ ID NO:36所示的VH和如SEQ ID NO:189所示的VL；或
(7)如SEQ ID NO:20所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL；或
(8)如SEQ ID NO:41所示的VH和如SEQ ID NO:187所示的VL。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体能够特异性结合HBsAg，中和HBV的毒力，和/或降低HBV DNA和/或HBsAg在受试者体内的血清水平。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，其选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、双抗体(diabody)、双特异性抗体、多特异性抗体。
4.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中，其是IgG类别的抗体或其抗原结合片段。
5.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其是IgG1或IgG2或IgG4类别的抗体或其抗原结合片段。
6.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其连接至可检测的标记。
7.权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述可检测的标记选自放射性同位素，发光物质，有色物质和酶。
8.权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述可检测的标记是荧光物质。
9.分离的核酸分子，其编码权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和轻链可变区。
10.载体，其包含权利要求9所述的核酸分子。
11.宿主细胞，其包含权利要求9所述的核酸分子或权利要求10所述的载体。
12.制备权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求11的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
13.一种药物组合物，它含有权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
14.权利要求1-5任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求13的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病，用于体外或在受试者体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
15.权利要求14所述的用途，其中，所述受试者是人。
16.权利要求14所述的用途，其中，所述与HBV感染相关的疾病是乙肝。
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