CN113480641B - 用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗乙肝表面抗原(HBsAg)的抗体(特别是人源化抗体)，编码它们的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物。此外，本发明还涉及所述抗体和药物组合物的用途。本发明的抗体和药物组合物可用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，或用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平。

Description

用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体
本申请是申请号为201810307136.5、申请日为2018年4月8日、发明名称为“用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体”的发明申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域，特别是治疗乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus,HBV)感染的领域。具体而言，本发明涉及抗乙肝表面抗原(HBsAg)的抗体，编码它们的核酸分子，制备它们的方法，以及包含它们的药物组合物。所述药物组合物可用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，或用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。因此，本发明进一步涉及，所述抗体(特别是人源化抗体)及其变体在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，或用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
背景技术
乙型肝炎病毒感染，尤其是慢性HBV感染是全球最为重要的公共卫生问题之一(Dienstag JL.Hepatitis B virus infection.N Engl J Med 2008Oct 2；359(14):1486-1500)。慢性HBV感染可导致慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化(Liver cirrhosis,LC)和原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)等一系列肝脏疾病(Liaw YF,Chu CM.Hepatitis B virus infection.Lancet 2009Feb 14；373(9663):582-592)。据报道，目前全球约有20亿人曾经感染过HBV，现约有3.5亿的慢性乙型肝炎病毒感染者，这些感染者最终死于HBV感染相关肝脏疾病的风险可达15％-25％，全球每年超过100万人死于此类疾病(Dienstag JL.，同上；和Liaw YF等，同上)。
当前针对慢性HBV感染的治疗药物主要可分为干扰素类(Interferon，IFNs)和核苷/核苷酸类似物(nucleoside or nucleotide,NAs)(Dienstag JL.，同上；Kwon H,LokAS.Hepatitis B therapy.Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011May；8(5):275-284；和Liaw YF等，同上)。前者包括普通干扰素(IFN)和聚乙二醇干扰素(Peg-interferon,Peg-IFN，又称为长效干扰素)，主要通过整体增强患者免疫能力来达到抑制HBV和治疗CHB的效果；后者主要包括拉米夫定(lamivudine，LMV)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)、恩替卡韦(Entecavir,ETV)、替比夫定(Telbivudine,LdT)、替诺福韦(Tenofovir)等5种，主要通过直接抑制HBV的聚合酶活性来抑制HBV复制。对于HBV感染者(例如CHB患者)来说，上述药物的单独或联合治疗，已能较为有效地抑制体内病毒复制，大幅降低HBV DNA水平；特别地，52周或延长的此类治疗后，患者体内HBV DNA水平低于检测下限(病毒学应答)的应答率可达40-80％(Kwon H等，同上)。然而，上述药物的单独或联合治疗均不能完全清除感染者体内的HBV病毒，其导致的HBsAg阴转或HBsAg血清学转换(感染者体内HBV病毒彻底清除的标志)的应答率通常小于5％(Kwon H等，同上)。因此，针对HBV感染者发展创新的、能更为有效地清除HBV病毒、尤其是清除HBsAg的治疗方法和药物是迫切而必要的。
基于免疫学手段发展新的治疗慢性HBV感染的药物是此领域的重要研究方向之一。慢性HBV感染的免疫治疗通常通过主动免疫治疗(其对应药物形式如疫苗等)和被动免疫治疗(其对应药物形式如抗体等)等两种方式来进行。主动免疫治疗则是指，通过施用治疗性疫苗(包括蛋白疫苗、多肽疫苗和核酸疫苗等)，刺激慢性HBV感染者机体主动产生针对HBV的细胞免疫应答(CTL效应等)或/和体液免疫应答(抗体等)，从而达到抑制或清除HBV的目的。目前尚无明确显著有效的、可用于治疗慢性HBV感染的主动免疫治疗药物/疫苗。被动免疫治疗(以抗体为例)是指，向HBV感染者被动施用具治疗特性的抗体，并利用抗体介导的病毒中和作用阻断HBV感染新生肝细胞，或利用抗体介导的免疫清除作用清除体内病毒和被感染的肝细胞，从而起到治疗的效果。目前，从预防性乙型肝炎疫苗免疫应答者或HBV感染恢复者血清/血浆中纯化获得的Anti-HBs多克隆抗体，即高效价的乙肝免疫球蛋白(HBIG)已广泛应用于阻断HBV的母婴垂直传播、预防慢性HBV感染者肝移植后的HBV再感染、以及预防意外暴露于HBV的人群的感染。然而，将HBIG直接用于HBV感染者(例如CHB患者)的治疗无明显疗效，且其存在例如高效价血浆来源较少、价格昂贵、性质不稳定、潜在的安全性问题等诸多局限性。
因此，针对HBV感染者发展创新的、能更为有效地治疗HBV感染的治疗方法和药物是迫切而必要的。
发明概述
在一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)选自下列的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)中的一个或多个(例如1个，2个或3个)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:18或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:19或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:20，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)选自下列的轻链可变区(VL)CDR中的一个或多个(例如1个，2个或3个):
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:15或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:16或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:17或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，所述VH包含：
(i)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，以及
(iii)VH CDR1，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VHCDR1的序列；
和/或
(b)轻链可变区(VL)，所述VL包含：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:9，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，以及
(vi)VL CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VH CDR1为人免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VH CDR1的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VH CDR1由下述序列组成：(a)SEQ ID NO:6，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；或，(b)人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的VH CDR1的序列。在某些示例性实施方案中，所述人重链胚系基因选自IGHV4-4*08和IGHV4-61*01。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:7所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；以及，具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138。
在某些优选的实施方案中，所述VL CDR2为人免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VL CDR2由下述序列组成：(a)SEQ ID NO:10，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；或，(b)人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的VL CDR2的序列。在某些示例性实施方案中，所述人轻链胚系基因选自IGKV1-39*01和IGKV1-5*03。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ IDNO:9所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3；以及，具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:7所示的VH CDR2，如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3，以及具有选自下列的氨基酸序列的VHCDR1：SEQ ID NO:6，137或138；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3，以及具有选自下列的氨基酸序列的VLCDR2：SEQ ID NO:10，139或140。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，所述VH包含：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，以及
(iii)VH CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VHCDR2的序列；
和/或
(b)轻链可变区(VL)，所述VL包含：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，以及
(vi)VL CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VH CDR2为人免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VH CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VH CDR2由下述序列组成：(a)SEQ ID NO:13，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；或，(b)人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的VH CDR2的序列。在某些示例性实施方案中，所述人重链胚系基因选自IGHV4-30-4*07和IGHV4-4*01。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：(a)如SEQID NO:12所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3；以及，具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142。
在某些优选的实施方案中，所述VL CDR2为人免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VL CDR2由下述序列组成：(a)SEQ ID NO:16，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；或，(b)人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的VL CDR2的序列。在某些示例性实施方案中，所述人轻链胚系基因选自IGKV2-28*01和IGKV3-15*01。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ IDNO:15所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3；以及，具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3，以及具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3，以及具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，所述VH包含：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:20，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)轻链可变区(VL)，所述VL包含：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:18所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:19所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:20所示的VHCDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1，如SEQ IDNO:16所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％或至少98％。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的非CDR区包含不超过19个，不超过15个，不超过14个，不超过13个，不超过12个，不超过11个，不超过10个，不超过9个，不超过8个，不超过7个，不超过6个，不超过5个，不超过4个或不超过3个的非人源(例如，食蟹猴源)氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含框架区(FR)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)选自下列的重链可变区(VH)构架区(FR)中的一个或多个(例如1个，2个，3个或4个)：
(i)VH FR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:37，SEQID NO:44，SEQ ID NO:50，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH FR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:51，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(iii)VH FR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:52，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；和
(iv)VH FR4，其由下述序列组成：SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:53，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)选自下列的轻链可变区(VL)构架区(FR)中的一个或多个(例如1个，2个，3个或4个)：
(v)VL FR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:47，SEQID NO:54，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(vi)VL FR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:55，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(vii)VL FR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:56，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；和
(viii)VL FR4，其由下述序列组成：SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:36，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VLFR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链框架区，其与选自下列的重链可变区中所包含的重链框架区相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NOs:1，3，5，57，59，157,158，163和164所示的重链可变区；
和/或
(b)轻链框架区，其与选自下列的轻链可变区中所包含的轻链框架区具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NOs:2，4，58，60，159,160,165和166任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)选自下列的重链可变区中含有的4个FR：
如SEQ ID NOs:1，3，5，57，59，157,158，163和164任一项所示的重链可变区；
和/或
(b)选自下列的轻链可变区中含有的4个FR：
如SEQ ID NOs:2，4，58，60，159,160,165和166任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(a)如SEQ ID NO:21所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:23所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:24所示的VH FR4；
(b)如SEQ ID NO:29所示的VH FR1、如SEQ ID NO:30所示的VH FR2、如SEQ ID NO:31所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；
(c)如SEQ ID NO:37所示的VH FR1、如SEQ ID NO:38所示的VH FR2、如SEQ ID NO:39所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；
(d)如SEQ ID NO:44所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:45所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:46所示的VH FR4；或
(e)如SEQ ID NO:50所示的VH FR1、如SEQ ID NO:51所示的VH FR2、如SEQ ID NO:52所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:53所示的VH FR4；
和/或，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：
(a)如SEQ ID NO:25所示的VL FR1、如SEQ ID NO:26所示的VL FR2、如SEQ ID NO:27所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VL FR4；
(b)如SEQ ID NO:33所示的VL FR1、如SEQ ID NO:34所示的VL FR2、如SEQ ID NO:35所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4；
(c)如SEQ ID NO:47所示的VL FR1、如SEQ ID NO:48所示的VL FR2、如SEQ ID NO:49所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VL FR4；或
(d)如SEQ ID NO:54所示的VL FR1、如SEQ ID NO:55所示的VL FR2、如SEQ ID NO:56所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含人免疫球蛋白的框架区(例如，人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区)，所述框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和/或人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：IGHV4-4*08所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和IGKV1-39*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：IGHV4-4*02所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和IGKV4-1*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如SEQ ID NO:21所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:23所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:24所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:25所示的VL FR1、如SEQ ID NO:26所示的VL FR2、如SEQ ID NO:27所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VL FR4；
(b)如SEQ ID NO:29所示的VH FR1、如SEQ ID NO:30所示的VH FR2、如SEQ ID NO:31所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:33所示的VL FR1、如SEQ ID NO:34所示的VL FR2、如SEQ ID NO:35所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4；
(c)如SEQ ID NO:37所示的VH FR1、如SEQ ID NO:38所示的VH FR2、如SEQ ID NO:39所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:33所示的VL FR1、如SEQ ID NO:34所示的VL FR2、如SEQ ID NO:35所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4；
(d)如SEQ ID NO:44所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:45所示的VH FR3、如SEQ ID NO:46所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:47所示的VL FR1、如SEQ ID NO:48所示的VL FR2、如SEQ ID NO:49所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VLFR4；或
(e)如SEQ ID NO:50所示的VH FR1、如SEQ ID NO:51所示的VH FR2、如SEQ ID NO:52所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:53所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:54所示的VL FR1、如SEQ ID NO:55所示的VL FR2、如SEQ ID NO:56所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与选自下列的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NOs:1，3，5，57，59，157,158，163和164所示的重链可变区。在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自如SEQ IDNOs:1，3，5，57，59，157,158，163和164任一项所示的重链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与选自下列的轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NOs:2，4，58，60，159,160,165和166任一项所示的轻链可变区。在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区选自如SEQ IDNOs:2，4，58，60，159,160,165和166任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的重链可变区和如上文所定义的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自如SEQ ID NOs:1,57,157和158任一项所示的重链可变区；并且，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区选自如SEQ ID NOs:2,58,159和160任一项所示的轻链可变区；或
本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自如SEQ ID NOs:3,59,163和164任一项所示的重链可变区；并且，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区选自如SEQID NOs:4,60,165和166任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
(1)如SEQ ID NO:1所示的VH和如SEQ ID NO:2所示的VL；
(2)如SEQ ID NO:3所示的VH和如SEQ ID NO:4所示的VL；
(3)如SEQ ID NO:5所示的VH和如SEQ ID NO:4所示的VL；
(4)如SEQ ID NO:57所示的VH和如SEQ ID NO:58所示的VL；
(5)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(6)如SEQ ID NO:157所示的VH和如SEQ ID NO:58所示的VL；
(7)如SEQ ID NO:158所示的VH和如SEQ ID NO:58所示的VL；
(8)如SEQ ID NO:57所示的VH和如SEQ ID NO:159所示的VL；
(9)如SEQ ID NO:57所示的VH和如SEQ ID NO:160所示的VL；
(10)如SEQ ID NO:163所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(11)如SEQ ID NO:164所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(12)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:165所示的VL；或
(13)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:166所示的VL。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、双抗体(diabody)、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体或人源化抗体。在某些优选的实施方案中，所述抗体为嵌合抗体或人源化抗体。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段为IgG类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类别)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合HBsAg，中和HBV的毒力，和/或降低HBV DNA和/或HBsAg在受试者体内的血清水平。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段带有标记。在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段带有可检测的标记，例如放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质或酶(例如辣根过氧化物酶)。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含根据本发明的分离的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的载体。
在另一个方面，提供了制备根据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养根据本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在另一个方面，本发明提供了检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HBV的方法，其包括：使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测HBsAg蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HBV。
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，以及用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有根据本发明的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物还可包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的药物，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素。
在另一个方面，提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
在另一个方面，本发明提供了一种方法，其用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的药物组合物。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例2中测定3株食蟹猴-人嵌合单克隆抗体M1-23、M3-23、M3-13与抗原HBsAg的结合活性的ELISA检测结果，其中，横坐标表示抗体浓度(Log10 ng/ml)，纵坐标表示OD值。结果显示，3株食蟹猴-人嵌合单克隆抗体均具有良好的抗原结合活性。
图2显示了在实施例2中6D11鼠源抗体交叉阻断3株食蟹猴-人嵌合单克隆抗体M1-23、M3-23、M3-13与抗原HBsAg的结合的竞争ELISA法检测结果。结果显示，M1-23、M3-23、M3-13与抗原HBsAg的结合可以被6D11显著抑制。
图3A-3B显示了在实施例2中食蟹猴-人嵌合单克隆抗体M1-23、M3-23在HBV转基因小鼠体内疗效评估结果。图3A：小鼠血清中HBsAg水平的变化情况，其中，横坐标表示注射嵌合抗体后的天数，纵坐标表示小鼠血清中HBsAg的相对减少水平(Log10 IU/ml)；图3B：小鼠血清中HBV DNA水平的变化情况，其中，横坐标表示注射嵌合抗体后的天数，纵坐标表示小鼠血清中HBV DNA的相对减少水平(Log10 IU/ml)。结果显示，M1-23、M3-23均可明显清除动物体内HBsAg和HBV DNA。
图4显示了在实施例4中人源化抗体M1D、M3D与抗原HBsAg的结合活性的ELISA检测结果，其中，横坐标表示抗体浓度(Log10 ng/ml)，纵坐标表示OD值。结果显示，2株人源化抗体均具有良好的抗原结合活性，其对HBsAg的亲和力优于参比抗体162。
图5显示了在实施例4中6D11鼠源抗体交叉阻断人源化抗体M1D、M3D与抗原HBsAg的结合的竞争ELISA法检测结果。结果显示，人源化抗体M1D、M3D与抗原HBsAg的结合可以被6D11显著抑制。
图6A-6B显示了在实施例4中人源化抗体M1D对HBV病毒的中和活性的测定结果，其中，图6A为以HBIG为标准品做的标准曲线，图6B为样品的中和活性测定结果，纵坐标表示每mg的抗体具有多少mIU标准单位的HBIG的中和活性。结果显示，M1D对HBV的中和活性与参比抗体162相当。
图7显示了实施例5中人源化抗体M1D、M3D以及嵌合抗体M3-13在HBV转基因小鼠体内疗效评估结果。图7A：小鼠血清中HBsAg水平的变化情况，其中，横坐标表示注射人源化抗体后的天数，纵坐标表示小鼠血清中HBsAg的相对减少水平(Log10 IU/ml)；图7B：小鼠血清中HBV DNA水平的变化情况，其中，横坐标表示注射嵌合抗体后的天数，纵坐标表示小鼠血清中HBV DNA的相对减少水平(Log10 IU/ml)。结果显示，3株抗体均可明显清除动物体内HBsAg和HBV DNA，其效果优于参比抗体162。
图8A-8E显示了实施例6中人源化抗体M1D进行CDR区替换后的抗体与抗原HBsAg结合活性的ELISA检测结果，其中，横坐标表示抗体浓度(Log10 ng/ml)，纵坐标表示OD值。结果显示，对抗体M1D的HCDR1和LCDR2区替换后不影响与抗原HBsAg的结合活性，说明抗体M1D的HCDR1和LCDR2区不是与抗原HBsAg结合的关键CDR区。
图9A-9E显示了实施例6中人源化抗体M3D进行CDR区替换后的抗体与抗原HBsAg结合活性的ELISA检测结果，其中，横坐标表示抗体浓度(Log10 ng/ml)，纵坐标表示OD值。结果显示，重链CDR2(HCDR2)和轻链CDR2(LCDR2)替换后，不影响与抗原HBsAg的结合活性，说明抗体M3D的HCDR2和LCDR2区不是与抗原HBsAg结合的关键CDR区。
图10显示了实施例8中抗体M1D、M3D、162与多种单点突变的HBsAg aa113-135多肽片段结合情况的western blot检测结果。结果显示，抗体162与在aa120、aa122、aa123位点突变为丙氨酸后的HBsAg失去结合活性，其核心表位为CKTC(aa121-124)；M1D与在aa118-124位点突变为丙氨酸后的HBsAg失去结合活性，其结合的核心表位TGPCKTCT(aa118-124)，比参比抗体162更长，且位置比162靠前；M3D与在aa121-125位点突变为丙氨酸后的HBsAg失去结合活性结合，其核心表位为CKTCT(aa121-125)，核心表位位置比162靠后。
图11A-11B显示实施例9中了人源化抗体M1D、M3D与不同亚型对应的HBsAg-aa113-135的结合活性的ELISA检测结果，其中，横坐标表示抗体浓度(Log10 ng/ml)，纵坐标表示OD值。结果显示M1D、M3D均可以结合大部分HBV亚型。
图12A-12B显示了实施例11中单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M1D、M3D后，每一只食蟹猴血清(第1组)中人源化抗体M1D的血药浓度随时间变化的曲线图。其中，横坐标时间(h)，纵坐标表示血药浓度(ng/mL)。
图13A-13B显示了实施例12中人源化抗体M1D、M3D在三种不同缓冲液中的Tm值。横坐标表示温度(℃)，纵坐标表示CP(cal/℃)。结果显示，人源化抗体M1D的Tm onset为61.7℃以上，而M3D的Tm onset值均大于61.6℃，说明M1D和M3D具有很好的热稳定性。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure BDA0003149584870000201
Figure BDA0003149584870000211
发明详述
术语定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、生物化学、核酸化学、免疫学实验室等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。
如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基，其通常可包括，轻链可变区中的残基24-34{LCDR1}、50-56{LCDR2}、89-97{LCDR3}以及重链可变区中的残基31-35{HCDR1}、50-65{HCDR2}、95-102{HCDR3}(参见例如，Kabat等，Sequences of Proteins of lmmunological lnterest，第五版，PublicHealth Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991))，或者轻链可变区中的残基26-32{Ll}、50-52{L2}、91-96{L3}以及重链可变区中的残基26-32{H1}、53-55{H2}、96-101{H3}(参见，Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。
术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；术语“dAb片段”意指由VH结构域组成的抗体片段(Ward等人,Nature 341:544 546(1989))；术语“Fab片段”意指由VL、VH、CL和CH1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')2片段”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。
如本文中所使用的，术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段。Fv片段通常被认为是，能形成完整的抗原结合位点的最小抗体片段。一般认为，六个CDR赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即便是一个可变区(例如Fd片段，其仅仅含有三个对抗原特异的CDR)也能够识别并结合抗原，尽管其亲和力低于完整的结合位点。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如，scFv)，其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；和Pluckthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Roseburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994))。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)4的接头，但也可使用其变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31:94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
如本文中所使用的，术语“单链抗体-Fc”或“scFv-Fc”意指，将scFv连接至抗体的Fc片段而形成的工程抗体。如本文中所使用的，术语“Fc片段”意指，由抗体的第一重链的第二、第三恒定区与第二重链的第二、第三恒定区经二硫键结合而形成的抗体片段。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。
在一些情况下，抗体的抗原结合片段是双抗体，即，双价抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人,Structure 2:1121-1123(1994))。
可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体(例如本发明提供的单克隆抗体)获得抗体的抗原结合片段(例如，上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。
如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片段，也即，除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。
例如，可以如下来制备单克隆抗体。首先用免疫原(必要时候添加佐剂)免疫注射非人灵长类动物(例如，食蟹猴)或其它合适的宿主动物。免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。可将免疫原预先偶联到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆胰酶抑制剂上，以增强抗原在宿主内的免疫原性。佐剂可以是弗氏佐剂或MPL-TDM等。动物在接受免疫后，体内将产生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋巴细胞。另外，淋巴细胞也可以利用体外免疫获得。收集目的淋巴细胞，并用合适的融合剂，如PEG，使其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)。上述制备的杂交瘤细胞可以接种到合适的培养液中生长，培养液中优选含有一种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养液中添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)等物质将可以抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养液敏感等特征。生长杂交瘤细胞的培养液用于检测针对特异抗原的单抗的产生。测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性的方法包括例如，免疫沉淀或体外结合试验，如放射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。例如，可利用Munson等在Anal.Biochem.107:220(1980)描述的Scatchard分析法来测定单抗的亲和力。当确定了杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可以通过(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1996)所描述的标准的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，杂交瘤细胞还可以腹水瘤的形式在动物体内生长。利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等，可以将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出来。
还可以通过基因工程重组技术获得单克隆抗体。利用特异性结合单抗重链和轻链基因的核酸引物进行PCR扩增，可以从杂交瘤细胞中分离得到编码单抗重链和轻链基因的DNA分子。将所得的DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞(如E.coli细胞、COS细胞、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)，并在合适的条件下进行培养，可以获得重组表达的目标抗体。
如本文中所使用的，术语“抗原表位”和“表位”是指，抗原上被免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位。“表位”在本领域内也称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸，其可以是“线性的”或“构象的”。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用的点沿着蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中，相互作用的点跨越彼此分开的蛋白质氨基酸残基而存在。可使用本领域技术人员已知的常规技术，就与相同表位的结合竞争性筛选抗体。例如，可进行竞争和交叉竞争研究，以获得彼此竞争或交叉竞争与抗原结合的抗体。基于它们的交叉竞争来获得结合相同表位的抗体的高通量方法描述于国际专利申请WO 03/48731中。
如本文中所使用的，术语“胚系抗体基因(germline antibody gene)”或“胚系抗体基因片段(germline antibody gene segment)”是指，存在于生物体的基因组中的编码免疫球蛋白的序列，其没有经历过能够导致表达特异性免疫球蛋白的遗传学重排及突变的成熟过程。在本发明中，表述“重链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白重链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、D基因(diversity)、J基因(joining)和C基因(constant)；类似地，表述“轻链胚系基因”是指，编码免疫球蛋白轻链的胚系抗体基因或基因片段，其包括V基因(variable)、J基因(joining)和C基因(constant)。在本发明中，由所述胚系抗体基因或胚系抗体基因片段所编码的氨基酸序列也称为“胚系序列(germlinesequence)”。胚系抗体基因或胚系抗体基因片段及其相应的胚系序列是本领域技术人员熟知的，并且可从专业数据库(例如，IMGT、UNSWIg、NCBI或VBASE2)获得或查询。
如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(KD)结合该抗原。
如本文中所使用的，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体(例如，本发明的抗体)以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合抗原(例如，HBsAg)，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。
如本文中使用的，术语“免疫原性(immunogenicity)”是指，能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。其既指，抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答。当给受试者施用异源抗体时，异源抗体在受试者体内的免疫原性是不想要的，因为此类免疫原性将导致受试者的免疫系统/免疫细胞对异源抗体的排斥作用，从而导致异源抗体在受试者体内的功效下降或者在受试者体内引起不想要的副作用。因此，在施用给人受试者之前，通常需要对异源抗体(例如食蟹猴源抗体)进行改造，以尽可能减小其免疫原性。
如本文中所使用的，术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其轻链或/和重链的一部分源自一个抗体(其可以源自某一特定物种或属于某一特定抗体类或亚类)，且轻链或/和重链的另一部分源自另一个抗体(其可以源自相同或不同的物种或属于相同或不同的抗体类或亚类)，但无论如何，其仍保留对目标抗原的结合活性(U.S.P 4,816,567to Cabilly etal.；Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851 6855(1984))。例如，术语“嵌合抗体”可包括这样的抗体(例如人猴嵌合抗体)，其中抗体的重链和轻链可变区来自第一抗体(例如食蟹猴源抗体)，而抗体的重链和轻链可变区来自第二抗体(例如人抗体)。
如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性、中和病毒能力和/或清除病毒能力等。供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、中和病毒能力和/或清除病毒能力)的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物(例如，食蟹猴)抗体。
人源化抗体既能够保留非人源供体抗体(例如食蟹猴源抗体)的预期性质，又能够有效降低非人源供体抗体(例如食蟹猴源抗体)在人受试者中的免疫原性，因此，是特别有利的。然而，由于供体抗体的CDR与受体抗体的FR之间的匹配问题，人源化抗体的预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性、中和病毒能力和/或清除病毒能力)通常低于非人源供体抗体(例如食蟹猴源抗体)。
因此，尽管本领域的研究人员已对抗体的人源化展开了深入的研究，并取得了一些进展(参见例如，Jones et al.,Nature,321:522 525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332:323 329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593 596(1992)；andClark,Immunol.Today 21:397 402(2000))，但是，如何对某一供体抗体进行充分的人源化，以使得所产生的人源化抗体既具有尽可能高的人源化程度，又能够尽可能地保留供体抗体的预期性质，现有技术并没有提供详尽的指导。技术人员需要针对具体供体抗体进行摸索、探究和改造，付出大量的创造性劳动才有可能获得，既具有高人源化程度(例如至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的人源化程度)、又保留具体供体抗体的预期性质的人源化抗体。
在本发明中，为了使人源化抗体尽可能保留供体抗体的性质(包括例如，特异性、亲和性、反应性、中和病毒能力和/或清除病毒能力)，本发明的人源化抗体中构架区(FR)可以既包含人源受体抗体的氨基酸残基，也包含相应的非人源供体抗体的氨基酸残基。
此外，为了进一步提高人源化的程度，以尽可能地减少非人氨基酸残基引起的免疫原性，在本发明中，可以对人源化抗体中来源于供体抗体的CDR区的部分氨基酸残基进行替换，例如将其替换为相应的人源免疫球蛋白CDR区的氨基酸残基，或其他氨基酸残基。
此外，为了进一步完善或优化人源化抗体的性能，在本发明中还可以对人源化抗体的重链和轻链可变区中的部分氨基酸残基进行替换，例如将其替换为既非来源于受体抗体，也非来源于供体抗体的氨基酸残基。
具体而言，在本申请中，发明人首先开发了具有优良性质的3株食蟹猴-人嵌合单克隆抗体，分别命名为M1-23，M3-23，M3-13(其重链和轻链可变区分别如SEQ ID NO:1-5所示)：三株抗体不仅能够特异性识别/结合HBsAg，能够中和HBV的毒力，而且能够在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。因此，M1-23，M3-23及M3-13抗体具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
在此基础上，发明人又付出了大量的创造性劳动，对M1-23，M3-23这两株嵌合抗体进行了深入的研究和改造，从而开发了M1-23和M3-23嵌合抗体的人源化抗体：本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(人源化程度可高达98％)，而且具有与亲本抗体基本上相同的(或甚至更优良的)预期性质(包括但不限于，HBsAg结合活性，中和HBV的活性，清除体内的HBV DNA或HBsAg的活性，或清除体内的HBV和被HBV感染的细胞的活性等)。
因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)是极为有利的，其不仅保留了亲本抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力；而且具有极高的人源化程度(人源化程度可高达98％)，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。本发明的抗体(特别是人源化抗体)具有重大的临床价值。
在本申请中，本发明抗体的预期性质包括，特异性结合HBsAg的活性，中和HBV的活性，清除体内的HBV DNA或HBsAg的活性，和/或，清除体内的HBV和被HBV感染的细胞的活性。根据本发明的人源化抗体保留了亲本抗体(食蟹猴-人嵌合抗体)的上述预期性质中的一项或多项，优选保留了亲本抗体(食蟹猴-人嵌合抗体)的所有上述预期性质。
在本申请中，通过对本发明的亲本抗体(食蟹猴-人嵌合抗体)进行改造，例如对其FR中的部分氨基酸残基进行置换(例如保守置换)，以获得本发明的人源化抗体。此类置换例如可以(1)降低抗体对蛋白水解的敏感性；(2)降低抗体对氧化作用的易感性；(3)改变(例如增强)抗体对抗原的结合亲和力；(4)改变(例如增强)抗体中和HBV的活性；(5)改变(例如增强)抗体清除HBV的活性；(6)进一步提高抗体的人源化程度，降低抗体的免疫原性；或(7)改变抗体的其它生物化学特点或功能特性；而仍然保留抗体的预期性质。此类置换可以存在于CDR区和/或FR区中，并且可以是单个氨基酸置换或多个氨基酸置换。
如本文中所使用的，术语“人源化程度”是用于表示人源化抗体中非人源氨基酸残基的数量的指标。人源化抗体的人源化程度例如可通过下述来进行计算：人源化程度＝(FR区氨基酸个数-FR区保留的非人源氨基酸个数)/FR区氨基酸个数×100％。
如本文中所使用的，“中和抗体”是指，能够显著降低或完全抑制目标病毒的毒力(例如，感染细胞的能力)的抗体或其抗原结合片段。通常而言，中和抗体能够识别并结合目标病毒，并且阻止目标病毒进入/感染受试者的细胞。本发明的抗体即是中和抗体。
然而，应当理解的是，在本申请中，抗体的中和病毒的能力并不直接等同于抗体的清除病毒的能力。如本文中所使用的，“中和病毒”是指，通过抑制目标病毒进入/感染受试者的细胞的过程，从而中和目标病毒的毒力(即，显著降低或完全抑制目标病毒的毒力)。如本文中所使用的，“清除病毒”是指，机体内的目标病毒(无论其是否感染了细胞)被从机体中消除，从而机体朝向未被病毒感染之前的状态转变(例如，病毒的血清学检测结果转变为阴性)。因此，在一般情况下，中和抗体并不一定具备清除病毒的能力。然而，在本申请中，发明人出人意料地发现，本发明的抗体不仅具有中和HBV的能力，而且具有清除病毒的能力(即，能够清除体内的HBV DNA和/或HBsAg，清除体内的HBV和被HBV感染的细胞)，从而具有重大的临床价值。
如本文中所使用的，术语“分离的”是指，经人工手段从天然状态下获得。如果自然界中出现某一种“被分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变或从天然环境下离分出该物质，或二者情况均有发生。比如，对于某一活体动物体内天然存在的某种未被分离的多聚核苷酸或多肽而言，从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为“分离的”。术语“分离的”不排除人工或合成的物质的存在，也不排除不影响物质活性的其它不纯物质的存在。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”和“保守氨基酸置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。此外，如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。
如本文中所使用的，术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂，当其与抗原一起或预先递送入机体时，其可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂有很多种，包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)、弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂)、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物试验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂则在临床实验中使用较多。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，HBV感染或与HBV感染相关的疾病)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。在本申请中，本发明的抗体具有中和HBV的能力，从而可用于预防/阻止未患病受试者或其细胞感染HBV。此外，本发明的抗体具有清除HBV的能力(即，能够清除体内的HBV DNA和/或HBsAg，清除体内的HBV和被HBV感染的细胞)，从而可用于治疗患病受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病。
如本文中使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
本发明的抗体
在本申请中，发明人首先开发了具有优良性质的3株食蟹猴-人嵌合单克隆抗体，分别命名为M1-23，M3-23，M3-13(其重链和轻链可变区分别如SEQ ID NO:1-5所示)：三株抗体不仅能够特异性识别/结合HBsAg，能够中和HBV的毒力，而且能够在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。因此，M1-23，M3-23及M3-13抗体具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
在此基础上，发明人对M1-23，M3-23这两株抗体进行了深入的研究和改造，从而开发了M1-23和M3-23抗体的人源化抗体：本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(人源化程度可高达98％)，而且具有与亲本抗体基本上相同的(或甚至更优良的)预期性质(包括但不限于，HBsAg结合活性，中和HBV的活性，清除体内的HBV DNA或HBsAg的活性，或清除体内的HBV和被HBV感染的细胞的活性等)。
因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)是极为有利的，其不仅保留了亲本抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力；而且具有极高的人源化程度(人源化程度可高达98％)，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。本发明的抗体(特别是人源化抗体)具有重大的临床价值。
因此，在一个方面，本发明提供了一种能够特异性结合HBsAg的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)选自下列的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)中的一个或多个(例如1个，2个或3个)：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:18或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:19或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:20，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)选自下列的轻链可变区(VL)CDR中的一个或多个(例如1个，2个或3个):
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:15或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:16或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:17或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，所述VH包含：
(i)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:7，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:8，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，以及
(iii)VH CDR1，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VHCDR1的序列；
和/或
(b)轻链可变区(VL)，所述VL包含：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:9，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:11，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，以及
(vi)VL CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VH CDR1为人免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VH CDR1的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VH CDR1由下述序列组成：(a)SEQ ID NO:6，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；或，(b)人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的VH CDR1的序列。在某些示例性实施方案中，所述人重链胚系基因选自IGHV4-4*08和IGHV4-61*01。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:7所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；以及，具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR1：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138。
在某些优选的实施方案中，所述VL CDR2为人免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VL CDR2由下述序列组成：(a)SEQ ID NO:10，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；或，(b)人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的VL CDR2的序列。在某些示例性实施方案中，所述人轻链胚系基因选自IGKV1-39*01和IGKV1-5*03。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ IDNO:9所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3；以及，具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:140。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:7所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；以及VH CDR1，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VH CDR1的序列(例如，SEQ ID NO:6，137或138)；
并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3，以及如SEQ ID NO:10所示的VL CDR2。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:7所示的VH CDR2；如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；以及如SEQ ID NO:6所示的VH CDR1；
并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3，以及VL CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列(例如，SEQ ID NO:10，139或140)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:7所示的VH CDR2，如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3，以及具有选自下列的氨基酸序列的VHCDR1：SEQ ID NO:6，137或138；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3，以及具有选自下列的氨基酸序列的VLCDR2：SEQ ID NO:10，139或140。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:10所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:137所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:10所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:138所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:10所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:139所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:6所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:7所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:8所示的VH CDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:9所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:140所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:11所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，所述VH包含：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:12，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(ii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:14，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，以及
(iii)VH CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VHCDR2的序列；
和/或
(b)轻链可变区(VL)，所述VL包含：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，以及
(vi)VL CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VH CDR2为人免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VH CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VH CDR2由下述序列组成：(a)SEQ ID NO:13，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；或，(b)人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的VH CDR2的序列。在某些示例性实施方案中，所述人重链胚系基因选自IGHV4-30-4*07和IGHV4-4*01。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：(a)如SEQID NO:12所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3；以及，具有选自下列的氨基酸序列的VH CDR2：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:142。
在某些优选的实施方案中，所述VL CDR2为人免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列。
在某些优选的实施方案中，所述VL CDR2由下述序列组成：(a)SEQ ID NO:16，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；或，(b)人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的VL CDR2的序列。在某些示例性实施方案中，所述人轻链胚系基因选自IGKV2-28*01和IGKV3-15*01。
在某些示例性实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ IDNO:15所示的VL CDR1；如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3；以及，具有选自下列的氨基酸序列的VL CDR2：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3，以及VH CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的重链可变区中所包含的VH CDR2的序列(例如，SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:141或SEQ ID NO:142)；
并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3，以及如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1；如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3；以及如SEQ ID NO:13所示的VHCDR2；
并且，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3，以及VL CDR2，其由下述序列组成：任意免疫球蛋白的轻链可变区(例如，κ轻链可变区)中所包含的VL CDR2的序列(例如，SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:143或SEQ ID NO:144)。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1,如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3,以及VH CDR2，所述VH CDR2具有选自下列的序列：SEQ ID NO:13，141或142；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQID NO:15所示的VL CDR1，如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3，以及VL CDR2，所述VL CDR2具有选自下列的序列：SEQ ID NO:16，143或144。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:13所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:141所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:14所示的VHCDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQ IDNO:16所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:142所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:14所示的VHCDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQ IDNO:16所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:13所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:143所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:13所示的VH CDR2、和如SEQ ID NO:14所示的VH CDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:144所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(VH)，所述VH包含：
(i)VH CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:18，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:19，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)VH CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:20，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)轻链可变区(VL)，所述VL包含：
(iv)VL CDR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:15，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，
(v)VL CDR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:16，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)VL CDR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:17，或者与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个或3个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ IDNO:18所示的VH CDR1，如SEQ ID NO:19所示的VH CDR2，以及如SEQ ID NO:20所示的VHCDR3；并且，该抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1，如SEQ IDNO:16所示的VL CDR2，以及如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段进一步包含框架区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)选自下列的重链可变区(VH)构架区(FR)中的一个或多个(例如1个，2个，3个或4个)：
(i)VH FR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:37，SEQID NO:44，SEQ ID NO:50，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(ii)VH FR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:51，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(iii)VH FR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:52，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；和
(iv)VH FR4，其由下述序列组成：SEQ ID NO:24，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:46，SEQ ID NO:53，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
和/或
(b)选自下列的轻链可变区(VL)构架区(FR)中的一个或多个(例如1个，2个，3个或4个)：
(v)VL FR1，其由下述序列组成：SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:47，SEQID NO:54，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(vi)VL FR2，其由下述序列组成：SEQ ID NO:26，SEQ ID NO:34，SEQ ID NO:48，SEQ ID NO:55，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；
(vii)VL FR3，其由下述序列组成：SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:49，SEQ ID NO:56，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列；和
(viii)VL FR4，其由下述序列组成：SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:36，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个或4个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH FR1、VH FR2、VH FR3和VH FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VL FR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含如上文所定义的VH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VLFR1、VL FR2、VL FR3和VL FR4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(a)如SEQ ID NO:21所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:23所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:24所示的VH FR4；
(b)如SEQ ID NO:29所示的VH FR1、如SEQ ID NO:30所示的VH FR2、如SEQ ID NO:31所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；或
(c)如SEQ ID NO:37所示的VH FR1、如SEQ ID NO:38所示的VH FR2、如SEQ ID NO:39所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：
(a)如SEQ ID NO:25所示的VL FR1、如SEQ ID NO:26所示的VL FR2、如SEQ ID NO:27所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VL FR4；或
(b)如SEQ ID NO:33所示的VL FR1、如SEQ ID NO:34所示的VL FR2、如SEQ ID NO:35所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如SEQ ID NO:21所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:23所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:24所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:25所示的VL FR1、如SEQ ID NO:26所示的VL FR2、如SEQ ID NO:27所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VL FR4；
(b)如SEQ ID NO:29所示的VH FR1、如SEQ ID NO:30所示的VH FR2、如SEQ ID NO:31所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:33所示的VL FR1、如SEQ ID NO:34所示的VL FR2、如SEQ ID NO:35所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4；或
(c)如SEQ ID NO:37所示的VH FR1、如SEQ ID NO:38所示的VH FR2、如SEQ ID NO:39所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:33所示的VL FR1、如SEQ ID NO:34所示的VL FR2、如SEQ ID NO:35所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是人源化的。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的人源化程度为至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，或100％。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的非CDR区包含不超过19个，不超过15个，不超过14个，不超过13个，不超过12个，不超过11个，不超过10个，不超过9个，不超过8个，不超过7个，不超过6个，不超过5个，不超过4个，不超过3个，不超过2个，或不超过1个的非人源(例如，食蟹猴源)氨基酸残基，或者其不包含非人源(例如，食蟹猴源)氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的FR区包含不超过19个，不超过15个，不超过14个，不超过13个，不超过12个，不超过11个，不超过10个，不超过9个，不超过8个，不超过7个，不超过6个，不超过5个，不超过4个，不超过3个，不超过2个，或不超过1个的非人源(例如，食蟹猴源)氨基酸残基，或者其不包含非人源(例如，食蟹猴源)氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：人免疫球蛋白的框架区，例如人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区。在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：人重链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和/或人轻链胚系基因所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。
在此类实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链框架区和/或轻链框架区可以包含一个或多个非人源(例如，食蟹猴源)氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，所述重链框架区和/或轻链框架区包含一或多个氨基酸残基，其被回复突变至相应的食蟹猴源残基或相应食蟹猴源残基的保守氨基酸置换(此类突变称为回复突变(backmutation))。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：人重链胚系基因IGHV4-4*08所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，所述重链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。在某些优选的实施方案中，所述IGHV4-4*08所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(i)VH FR1，其为SEQ ID NO:21，或者与SEQ ID NO:21的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个，2个或3个氨基酸置换)：
(01)位于H17的T；
(02)位于H20的L；和
(03)位于H23的T；
(ii)VH FR2，其为SEQ ID NO:22；
(iii)VH FR3，其为SEQ ID NO:23，或者与SEQ ID NO:23的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个，2个或3个氨基酸置换)：
(01)位于H64的K；
(02)位于H69的I；和
(03)位于H78的F；
(iv)VH FR4，其为SEQ ID NO:24，或者与SEQ ID NO:24的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个或2个氨基酸置换)：
(01)位于H107的T；和
(02)位于H108的T；
其中，上述提及的所有氨基酸位置均是根据Kabat编号系统的位置。
在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:44所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:45所示的VH FR3、和如SEQID NO:46所示的VH FR4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：人重链胚系基因IGHV4-4*02所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，所述重链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。在某些优选的实施方案中，所述IGHV4-4*02所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(i)VH FR1，其为SEQ ID NO:29，或者与SEQ ID NO:29的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个或2个)：
(01)位于H2的V；和
(02)位于H16的G；
(ii)VH FR2，其为SEQ ID NO:30，或者与SEQ ID NO:30的差异在于下列的氨基酸置换：位于H37的V；
(iii)VH FR3，其为SEQ ID NO:31，或者与SEQ ID NO:31的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个，2个，3个或4个氨基酸置换)：
(01)位于H65的S；
(02)位于H71的V；
(03)位于H73的K；和
(04)位于H81的K；
(iv)VH FR4，其为SEQ ID NO:32，或者与SEQ ID NO:32的差异在于下列的一个氨基酸置换：位于H107的T；
其中，上述中提及的所有氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VH包含：如SEQ ID NO:50所示的VH FR1、如SEQ ID NO:51所示的VH FR2、如SEQ ID NO:52所示的VH FR3、和如SEQID NO:53所示的VH FR4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：人轻链胚系基因IGKV1-39*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区，所述轻链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。在某些优选的实施方案中，所述IGKV1-39*01所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：
(i)VL FR1，其为SEQ ID NO:25，或者与SEQ ID NO:25的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个，或2个氨基酸置换)：
(01)位于L1的D；和
(02)位于L3的Q；
(ii)VL FR2，其为SEQ ID NO:26，或者与SEQ ID NO:26的差异在于下列的氨基酸置换：位于L45的K；
(iii)VL FR3，其为SEQ ID NO:27，或者与SEQ ID NO:27的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个，2个，3个或4个氨基酸置换)：
(01)位于L55的Q；
(02)位于L63的S；
(03)位于L70的D；和
(04)位于L84的A；
(iv)VL FR4，其为SEQ ID NO:28；
其中，上述提及的所有氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:47所示的VL FR1、如SEQ ID NO:48所示的VL FR2、如SEQ ID NO:49所示的VL FR3、和如SEQID NO:28所示的VL FR4。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：人轻链胚系基因IGKV4-1*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区，所述轻链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。在某些优选的实施方案中，所述IGKV4-1*01所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：
(i)VL FR1，其为SEQ ID NO:33，或者与SEQ ID NO:33的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个，2个或3个氨基酸置换)：
(01)位于L3的V；
(02)位于L5的T；和
(03)位于L19的A；
(ii)VL FR2，其为SEQ ID NO:34，或者与SEQ ID NO:34的差异在于下列的氨基酸置换：位于L43的V；
(iii)VL FR3，其为SEQ ID NO:35，或者与SEQ ID NO:35的差异在于选自下列的一个或几个氨基酸置换(例如，1个，2个或3个氨基酸置换)：
(01)位于L60的D；
(02)位于L76的S；和
(03)位于L77的S；
(iv)VL FR4，其为SEQ ID NO:36；
其中，上述提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
在某些示例性实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段的VL包含：如SEQ ID NO:54所示的VL FR1、如SEQ ID NO:55所示的VL FR2、如SEQ ID NO:56所示的VL FR3、和如SEQID NO:36所示的VL FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段包含：
(a)IGHV4-4*08所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，以及，IGKV1-39*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区；或
(b)IGHV4-4*02所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，以及，IGKV4-1*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区。
在某些优选的实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)如SEQ ID NO:44所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:45所示的VH FR3、如SEQ ID NO:46所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:47所示的VL FR1、如SEQ ID NO:48所示的VL FR2、如SEQ ID NO:49所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VLFR4；或
(b)如SEQ ID NO:50所示的VH FR1、如SEQ ID NO:51所示的VH FR2、如SEQ ID NO:52所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:53所示的VH FR4；以及，如SEQ ID NO:54所示的VL FR1、如SEQ ID NO:55所示的VL FR2、如SEQ ID NO:56所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4。
在某些优选的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VH包含：
(a)如SEQ ID NO:21所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:23所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:24所示的VH FR4；
(b)如SEQ ID NO:29所示的VH FR1、如SEQ ID NO:30所示的VH FR2、如SEQ ID NO:31所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；
(c)如SEQ ID NO:37所示的VH FR1、如SEQ ID NO:38所示的VH FR2、如SEQ ID NO:39所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:32所示的VH FR4；
(d)如SEQ ID NO:44所示的VH FR1、如SEQ ID NO:22所示的VH FR2、如SEQ ID NO:45所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:46所示的VH FR4；或者
(e)如SEQ ID NO:50所示的VH FR1、如SEQ ID NO:51所示的VH FR2、如SEQ ID NO:52所示的VH FR3、和如SEQ ID NO:53所示的VH FR4。
在某些优选的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段的VL包含：
(a)如SEQ ID NO:25所示的VLFR1、如SEQ ID NO:26所示的VL FR2、如SEQ ID NO:27所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VL FR4；
(b)如SEQ ID NO:33所示的VL FR1、如SEQ ID NO:34所示的VL FR2、如SEQ ID NO:35所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4；
(c)如SEQ ID NO:47所示的VL FR1、如SEQ ID NO:48所示的VL FR2、如SEQ ID NO:49所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:28所示的VL FR4；或者
(d)如SEQ ID NO:54所示的VL FR1、如SEQ ID NO:55所示的VL FR2、如SEQ ID NO:56所示的VL FR3、和如SEQ ID NO:36所示的VL FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如上文所定义的VH FR1、VH CDR1、VH FR2、VH CDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含如上文所定义的VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VL FR4。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含如上文所定义的VH FR1、VH CDR1、VH FR2、VHCDR2、VH FR3、VH CDR3和VH FR4；并且，轻链可变区包含如上文所定义的VL FR1、VL CDR1、VL FR2、VL CDR2、VL FR3、VL CDR3和VL FR4。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列与选自下列的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NOs:1，3，5，57，59，157,158，163和164任一项所示的重链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自如SEQ ID NOs:1，3，5，57，59，157,158，163和164任一项所示的重链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列与选自下列的轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性：如SEQ ID NOs:2，4，58，60，159,160,165和166任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区选自如SEQ ID NOs:2，4，58，60，159,160,165和166任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含如上文所定义的重链可变区和如上文所定义的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自如SEQ ID NOs:1,57,157和158任一项所示的重链可变区；并且，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区选自如SEQ ID NOs:2,58,159和160任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段的重链可变区选自如SEQ ID NOs:3,59,163和164任一项所示的重链可变区；并且，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区选自如SEQ ID NOs:4,60,165和166任一项所示的轻链可变区。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体包含：
(1)如SEQ ID NO:1所示的VH和如SEQ ID NO:2所示的VL；
(2)如SEQ ID NO:3所示的VH和如SEQ ID NO:4所示的VL；
(3)如SEQ ID NO:5所示的VH和如SEQ ID NO:4所示的VL；
(4)如SEQ ID NO:57所示的VH和如SEQ ID NO:58所示的VL；
(5)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(6)如SEQ ID NO:157所示的VH和如SEQ ID NO:58所示的VL；
(7)如SEQ ID NO:158所示的VH和如SEQ ID NO:58所示的VL；
(8)如SEQ ID NO:57所示的VH和如SEQ ID NO:159所示的VL；
(9)如SEQ ID NO:57所示的VH和如SEQ ID NO:160所示的VL；
(10)如SEQ ID NO:163所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(11)如SEQ ID NO:164所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(12)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:165所示的VL；或
(13)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:166所示的VL。
本发明的抗体可以通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明抗体的重链和轻链基因的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞，如E.coli细胞、猿猴COS、CHO细胞、或其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体。
本发明的抗体对HBsAg蛋白具有高特异性和高亲和力。例如，本发明的抗体结合HBsAg的KD值可小于1x10-5M；优选地，KD值小于1x10-6M；更优选地，KD值小于1x10-7M；最优选地，KD值小于1x10-8M。
本发明的抗体可以是包含两条重链和两条轻链的、具有传统的“Y”型结构的抗体。另外，本发明的抗体也可以是具有传统的“Y”型结构的抗体的Fab片段、Fab'、F(ab)2、Fv、或其它类型的片段，其保持了对HBsAg蛋白的亲和力，并且其结合HBsAg蛋白的亲和力可以高于或低于具有传统的“Y”型结构的抗体。
本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的抗体分子获得(参见Morimoto etal.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science 229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。比如，Fab'片段可以直接从E.coli细胞中获得；可以将Fab'片段化学藕联形成F(ab')2片段(Carter et al.,Bio/Technology,10:163-167(1992))。另外，Fv、Fab或F(ab')2片段也可以直接从重组宿主细胞培养液中直接分离得到。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。
因此，在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、双抗体(diabody)、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体或人源化抗体。特别优选地，本发明的抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体或人源化抗体。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合HBsAg，中和HBV的毒力，和/或降低HBV DNA和/或HBsAg在受试者体内的血清水平。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段是IgG类别。例如，本发明的抗体或其抗原结合片段可以为IgG1或IgG2或IgG3或IgG4类别。
融合抗体
在另一个方面，可制备融合抗体或免疫粘合素，例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接于另一个多肽。在某些优选的实施方案中，融合抗体包含抗本发明抗体的重链可变区和轻链可变区。在某些优选的实施方案中，融合抗体包含本发明抗体的VH结构域和VL结构域；其中，所述VH结构域连接于第一个多肽，而所述VL结构域连接于第二个多肽。
衍生的抗体
本发明的抗体或其抗原结合片段可进行衍生化，例如被连接至另一个分子(例如另一个多肽或蛋白)。通常，抗体或其抗原结合片段的衍生化(例如，标记)不会不利影响其对HBsAg的结合。因此，本发明的抗体或其抗原结合片段还意欲包括此类衍生化的形式。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段功能性连接(通过化学偶合、基因融合、非共价连接或其它方式)于一个或多个其它分子基团，例如另一个抗体(例如，形成双特异性抗体)，检测试剂，药用试剂，和/或能够介导抗体或抗原结合片段与另一个分子结合的蛋白或多肽(例如，抗生物素蛋白或多组氨酸标签)。
一种类型的衍生化抗体(例如,双特异性抗体)是通过交叉连接2个或多个抗体(属于同一类型或不同类型)而产生的。适当的交联剂包括例如异基双功能剂，其含有由适当的间隔区隔开的2个不同的反应基团(例如m-丁烯酰胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯)；以及，同基双功能剂(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)。此类交联剂可从Pierce Chemical Company,Rockford,II购买得到。
另一种类型的衍生化抗体是标记的抗体。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接至有用的检测试剂。此类检测试剂包括例如，荧光化合物，例如荧光素、异硫氯酸荧光素、罗丹明、5-二甲氨基-1-蔡磺酰氯、藻红蛋白、镧磷光剂等等。此外，抗体也可以用酶进行标记，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等等。当抗体用酶进行标记时，可通过加入能够被酶利用并产生可识别的信号或反应产物的试剂来检测标记的抗体。例如，当使用辣根过氧化物酶标记抗体时，可以加入过氧化氢和二氨基联苯，以产生可检测的有色反应产物，从而检测标记的抗体的存在或量。此外，抗体也可以用生物素进行标记。在这种情况下，可以通过间接测定抗生物素蛋白的结合来检测标记的抗体的存在或量。此外，抗体也可以用可被第二个报告分子识别的标签进行标记(例如亮氨酸拉链互补序列、金属结合结构域、附加表位等等)。在某些具体实施方式中，标签通过不同长度的间隔臂连接至抗体，以降低潜在的位阻。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
核酸分子、载体和宿主细胞
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含根据本发明的分离的核酸分子。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，提供了制备根据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养根据本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
诊断方法和试剂盒
本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合HBsAg，从而可用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，可用于诊断受试者是否感染了HBV。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。
可按照上文详细描述的方法来对本发明的抗体或其抗原结合片段或者第二抗体进行标记。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接至可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。此外，此类可检测的标记还包括例如，放射性同位素，例如125碘；荧光物质例如荧光素、异硫氯酸荧光素、罗丹明、5-二甲氨基-1-蔡磺酰氯、藻红蛋白、镧磷光剂等等；能够产生可识别的信号或反应产物的酶，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等等；能够被第二个报告分子识别的标签，例如生物素、抗生物素蛋白、亮氨酸拉链互补序列、金属结合结构域、附加表位等等。在某些具体实施方式中，可通过不同长度的接头将检测试剂(例如标签)连接至抗体，以降低潜在的位阻。
在另一个方面，本发明提供了检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HBV的方法，其包括：使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测HBsAg蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HBV。
治疗方法和药物组合物
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，以及用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有根据本发明的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物还可包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的药物，例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素。
在另一个方面，提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
在另一个方面，本发明提供了一种用于预防或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平的方法，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。
本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物的施用方式可以是传统的施用途径，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过本领域已知的多种方法给药。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段通过静脉输注或注射给予。
本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物可以配制成多种剂型，例如液体、半固体和固体剂型，例如溶液剂(例如注射剂)、分散剂或悬浮剂、片剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、丸剂、糖浆剂、粉剂、脂质体、胶囊剂和栓剂。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
例如，一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
另一种优选的剂型是分散剂。可通过下述方法来制备分散剂：将本发明的抗体或其抗原结合片段掺入无菌载体中，其含有一种基础分散介质以及任选的其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)。此外，还可以在分散剂中掺入可延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，以获得期望的药代动力学特征。
另一种优选的剂型是口服固相剂型，包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。此类固相剂型通常含有下述中的至少一种：(a)惰性药物赋形剂(或载体)，如柠檬酸钠、磷酸钙；(b)填充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(c)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(d)湿润剂，如甘油；(e)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(f)缓凝剂，如石蜡；(g)促吸收剂，如四氨基混合物；(h)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(i)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(j)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其任何组合。在片剂和胶囊剂型的情况下，还可以含有缓冲剂。
此外，还可以在口服固相剂型中添加释放速率改造剂(即，能改变药物释放速率的试剂)，以获得改良释放或脉冲释放剂型。此类释放速率改造剂包括但不限于，羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物，或其任何组合。改良释放和脉冲释放剂型可含有一种或一组释放速率改造剂。
另一种优选的剂型是口服的液体剂型，包括例如乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂等。除了活性成分之外，此类口服的液体剂型还可含有本领域常用的一些惰性溶液，例如水或其它溶剂，如乙烷基醇，异丙基醇，丙烯乙二醇，1,3-丁烯乙二醇，油(例如棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油)，甘油，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及其任何组合。除了这些惰性溶液之外，此类口服的液体剂型还可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。在某些优选的实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合片段与其它抗病毒试剂联合使用，以预防和或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病。本发明的抗体或其抗原结合片段可以和此类抗病毒试剂同时、分开或连续给药。此类抗病毒试剂包括但不限于，干扰素类药物、利巴韦林、金刚烷、羧基脲、IL-2、L-12和五羧链胞酸等。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明抗体或抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
本发明抗体或抗原结合片段的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.025到50mg/kg，更优选0.1到50mg/kg，更优选0.1-25mg/kg，O.1-10mg/kg。应注意的是，剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物的使用或范围。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的抗体不仅能够特异性识别/结合HBsAg，能够中和HBV的毒力，而且能够在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。因此，本发明的抗体具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
(2)本发明的抗体(特别是人源化抗体)不仅保留了亲本猴源抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力；而且具有极高的人源化程度(人源化程度可高达98％)，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)具有重大的临床价值。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：特异性结合HBsAg的人-食蟹猴嵌合单克隆抗体的制备
1.1食蟹猴免疫
使用实验室前期研发的重组HBV疫苗(该重组疫苗详细描述于中国专利申请201710085194.3)对大于6个月，体重为4±1kg的食蟹猴进行肌肉注射免疫，注射剂量为20μg/monkey/time。免疫时间点分别在第0、2、6、10、14、18、22、26周。在免疫第4针(10周)食蟹猴血清滴度达到平台期后，我们分别在第13、17、25、29周(即每次免疫后的第三周，产生大量记忆B细胞)，采集食蟹猴外周血10ml/monkey/time。
1.2食蟹猴外周血单核细胞分离
食蟹猴外周血单核细胞的分离参照SepMateTM使用说明书进行。SepMateTM试管用于通过密度梯度离心从人外周全血和脐带血样本中分离单个核细胞(MNCs)。分离前应确保样本、含2％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液(PBS+2％FBS)、密度梯度离心液以及离心机均处于室温(15-25℃)。
具体步骤如下：
1)使用移液器将密度梯度离心液通过SepMateTM插件中央小孔小心加入SepMateTM试管中。密度梯度离心液上端应淹没过插件。注意：密度梯度离心液在使用移液器后可能会产生小气泡，这不会对使用效果产生影响。
2)使用等体积的PBS+2％FBS稀释样本。轻柔混匀。
3)保持SepMateTM试管垂直，用移液器沿试管壁加入稀释后的样本。样本将会在插件上面和密度梯度离心液混合。注意：样本可以沿管壁直接倒入。注意不要讲稀释的样本直接倒在中央小孔上。
4)在室温下1200×g离心10分钟，无需关闭离心机刹车。注意：对于存放超过24小时的样本，推荐离心时间为20分钟。
5)倒出上层液体至一个新的试管，该层含富集的MNCs。请勿将SepMateTM试管在倒置状态下超过2秒。注意：离心后可能会有部分红细胞(RBCs)出现在SepMateTM插件的表层，但不会对使用效果产生影响。
6)使用PBS+2％FBS清洗MNCs。重复清洗一次。注意：清洗细胞时建议在室温下1200×g离心8分钟，无需关闭离心机刹车。
1.3记忆B细胞分离
因市面上无专门的食蟹记忆B细胞分选试剂，我们采用EasySepTM HUMAN PAN-BCELL ENRICHMENT KIT进行。
1)按照上述1.2的方法分离出的PBMC细胞以300g，离心10分钟，然后用10mL无血清的1640培养基洗涤细胞一次。
2)用10mL过滤后的MACS buffer重复洗涤一次。
3)将细胞用1mL MACS buffer重悬，然后转移至5mL聚苯乙烯圆底试管中。
4)按50μL/mL细胞加入EasySepTM Human Pan-B Cell Enrichment Cocktail。
5)室温孵育10min，按75μL/mL细胞加入EasySepTM D Magnetic Particles。
6)补加MACS buffer至2.5mL，轻轻上下混匀。
7)将试管放入磁铁分离器上5分钟，之后将需要的阳性细胞转移至新的试管中，而不需要的阴性细胞保留在原始试管中。
1.4体外刺激培养
1.4.1HEK293-CD154辐照
辐照剂量为40Gy，具体操作步骤参见《RS 2000型生物学X-ray辐照仪使用说明书》。
1.4.2细胞铺板
RPMI 1640培养基重悬好的细胞按5个/孔与配制好的50ng/mL的IL21和辐射过后的HEK293-CD154按104个/孔混匀后，共同孵育铺入96孔板中，每孔250μL。静置放于37℃的CO2培养箱中，刺激培养14天。
1.4.3细胞培养阳性孔检测
取商业化的HBsAg板(购于北京万泰)，每孔加入100μL待测上清，并在37℃温育1h。随后，用PBST洗涤ELISA板5次，然后添加以1∶5000稀释的GAH-HRP 100μL，并在37℃温育30min。随后，用PBST洗涤ELISA板5次，并添加底物TMB溶液。显色15min后，用H2SO4终止显色反应，并于OD450/620测定读值。以RPMI 1640培养基为阴性对照。
1.5B细胞抗体可变区基因的钓取
1.5.1细胞处理
将含有阳性B细胞培养孔的培养板先在300×g条件下离心5min，将细胞上清吸出。加入150μL的Lysis Buffer(购自北京GenMagBio)裂解液，用枪头反复吹吸几次后移入无RNA酶的1.5mL Eppendorf管中，放置于-80℃冰箱中，可以保存一年。
1.5.2RNA提取
RNA提取方法参照病毒DNA/RNA共提取试剂盒说明书(GenMagBio)。
1)在1.5mL无核酸酶Eppendorf管中加入10μL Proteinase K、4μL AcrylCarrier、300μL Lysis Buffer、20μL磁珠(使用前颠倒或使用移液器吹吸混匀磁珠)，加入200μL样品，震荡混匀各离心管，室温上下颠倒混匀10min，使磁珠和核酸充分结合。
2)将离心管置于磁力架上1min，使管内磁珠被吸附，用移液器移走管内液体，取下离心管。
3)加入500μL的Wash BufferⅠ，使磁珠重新悬浮，利用磁力架吸附磁铁，1min后移走管内液体，取下离心管。
4)加入500μL的Wash BufferⅡ，使磁珠重新悬浮，利用磁力架吸附磁珠，1min后移走管内液体，同时保持离心管置于磁力架上，使磁珠继续被吸附。
5)加入550μL的Wash BufferⅢ，尽量不要冲起磁珠，1min后移走管内液体，取下离心管。
6)加入50μL的Elution Buffer，使磁珠重新悬浮，55℃水浴5min，期间轻轻晃动两次使核酸充分洗脱。
7)将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将液体转移至新的1.5mL无核酸酶的离心管中。
1.5.3B细胞抗体可变区RT-PCR
反转录使用的引物(参见Meng W,Li L,Xiong W,et al.Efficient generationof monoclonal antibodies from single rhesus macaque antibody secreting cells[C]//mAbs.Taylor&Francis,2015,7(4):707-718.)如表2所示。
表2:食蟹猴抗体可变区基因反转录引物
Figure BDA0003149584870000651
具体步骤如下：
(1)首先按下列配方配置Ⅰ液：
Buffers Volume
DEPC水 6.8μL
引物/条 0.6μL
RNAsin 0.1μL
Mrna 5μL
(2)75℃温浴5min。
(3)迅速放入冰浴中5min。
(4)之后按下列配方配置Ⅱ液：
Buffers Volume
5×AMV buffer 4μL
10mmol dNTP 1μL
AMV反转录酶 0.2μL
(5)混匀，加5.2μL到各管中。
(6)混匀，42℃水浴反转录40min。
(7)分装保存，短期内使用置于-20℃，短期内不使用置于-80℃。
1.5.4抗体可变区基因扩增
B细胞抗体H链、κ轻链及λ轻链可变区基因采用巢式PCR扩增，扩增引物参考(MengW,Li L,Xiong W,et al.Efficient generation of monoclonal antibodies fromsingle rhesus macaque antibody secreting cells[C]//mAbs.Taylor&Francis,2015,7(4):707-718).并将巢式第二轮引物上与载体的同源序列替换成本实验室已有的真核表达载体(参见实施例1.5.5.1)上的一段作为同源序列。按照表3配制PCR反应体系，每个体系为25μL。巢式第一轮反应以反转录的cDNA为模板，反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，60s；72℃，90s；72℃，7min；扩增循环数为35个；巢式第二轮反应以第一轮扩增产物为模板，反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；58℃，60s；72℃，90s；72℃，7min；扩增循环数为35个。随后通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并用DNA纯化回收试剂盒(TianGen，DP214-03)回收扩增产物。
表3:巢式PCR反应体系
Figure BDA0003149584870000661
1.5.5抗体基因的表达与纯化
1.5.5.1用于真核表达的重组载体的构建
本发明中，需要进行大量的抗体重组，因此需要构建一套可以高效重组抗体的轻重链载体。本发明对实验室现有的真核表达载体pTT5进行了特殊改造，构建一套供双质粒共转染用轻重链重组载体。轻重链信号肽采用MGWSCIILFLVATATGVHS。信号肽下游分别接入编码人抗体轻重链恒定区的序列，构建成一套方便抗体重组的pTT5-CH,pTT5-Cκ和pTT5-Cλ真核表达载体。利用实验室自制的Gibson装配液将上述构建好的真核表达载体与1.5.4中回收到的抗体可变区基因PCR产物连接(引物带有与载体同源序列),得到重组载体VH+pTT5-CH,VH+pTT5-Cκ和VH+pTT5-Cλ。将重组载体转化入到大肠杆菌DH5α菌株，涂布LB平板，并在37℃培养箱培养过夜。从平板上挑取单克隆菌落，并进行测序，测序结果使用IgBlast对序列进行比对，以确认其基因正确性，排除假基因。
1.5.5.2抗体基因的小量及大量表达
将构建好的重组载体VH+pTT5-CH和VH+pTT5-Cκ和VH+pTT5-Cλ共转染HEK293-细胞，小量表达双质粒共转染至每孔500μL的24孔板中，如小量表达的细胞上清具有抗原活性，将转染体系放大到100mL(根据抗体用量决定)的CHO-S悬浮细胞(细胞密度为约2×106cells/ml)。转染后的细胞在32℃，5％CO2培养箱摇瓶培养，表达7天后收上清。
1.5.5.3抗体纯化
收集细胞表达上清，根据制造商的说明书,用Protein A层析柱进行纯化。具体步骤如下：收获的细胞培养上清，8000rpm，离心10min，保留上清，利用干粉Na2HPO4调节其PH值为8.4，然后用0.22μm孔径滤膜过滤。取偶联上Protein A的Sepharose 4B介质10mL装柱，连接至AKTA Explorer100系统，将A泵接入0.2M磷酸氢二钠溶液，B泵接入0.2M柠檬酸溶液。选取检测波长UV 280nm，流速5mL/min，调节A/B泵进样比例，先取100％B(pH 2.3)冲洗柱子出去杂蛋白，取10％B(pH 8.0)平衡pH，待检测波长稳定后归零，上样，待穿透峰过后取10％B继续平衡至检测波长降至零点并稳定后，用70％B(pH 4.0)洗脱，收取洗脱峰。将洗脱峰样品透析至PBS缓冲液中，并测定浓度及SDS-PAGE分析，以确定IgG抗体的纯度。
实施例2：特异性结合HBsAg的食蟹猴-人嵌合单克隆抗体的性质分析
按照实施例1的方法，共制备获得了3株特异性结合HBsAg的食蟹猴-人嵌合单克隆抗体，分别命名为M1-23，M3-23，M3-13。三株抗体的VH和VL氨基酸序列如下表所示(SEQ IDNO：1-5)。另外，还利用IMGT确定了三株抗体的CDR序列,其重链可变区和轻链可变区的CDR的氨基酸序列如表5(SEQ ID NO:6-20)所示。
表4:M1-23/M3-23/M3-13轻重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003149584870000671
Figure BDA0003149584870000681
表5:M1-23/M3-23/M3-13轻重链CDR的序列
Figure BDA0003149584870000682
Figure BDA0003149584870000691
发明人对纯化后的3株单克隆抗体进行了一系列的性质分析。首先通过ELISA法分别检测了M1-23，M3-23及M3-13与HBsAg的结合能力，按首孔浓度为10μg/mL，进行3倍浓度梯度稀释，共稀释12个浓度梯度。随后，将稀释好的抗体加入商业化的HBsAg板中(购于北京万泰)，并在37℃孵育1h,用PBST洗板5次，甩干。随后，加入GAH-HRP酶标二抗，孵育30min，用PBST洗板5次，甩干。并添加底物TMB溶液。显色15min后，用H2SO4终止显色反应，并于OD450/630测定读值。结果如图1所示，M1-23，M3-23及M3-13均具有良好的抗原结合活性。
通过竞争ELISA法考察识别HBsAg SA类型表位(HBsAg aa113-135)的鼠源单抗6D11(详细描述于中国专利申请201610879693.5)阻断M1-23，M3-23及M3-13与HBsAg的结合的情况。竞争ELISA法的具体步骤参见实施例4.2。如图2所示，结果显示鼠源单抗6D11可显著阻断M1-23，M3-23，M3-13分别与HBsAg的结合，这表明M1-23，M3-23，M3-13与鼠源单抗6D11识别的均为相同HBsAg SA线性表位。
通过HBV转基因小鼠来评价食蟹猴-人嵌合抗体在动物体内的病毒清除能力。将食蟹猴-人嵌合抗体按10mg/kg的剂量单剂尾静脉注射的方式施用给HBV转基因小鼠，每组6只HBV转基因小鼠。随后，通过眼眶后静脉丛取血采集小鼠的血液，并检测小鼠血清中的HBsAg水平和HBV DNA水平的变化。小鼠血清中的HBsAg水平和HBV DNA水平的检测方法参见实施例5.1及5.2。结果表明，M1-23，M3-23及M3-13(M1-23、M3-23结果示于图3A-3B；M3-13对HBsAg的清除结果示于图7A-7B)具有用于治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
实施例3：抗体M1-23与M3-23的人源化
为了减少异源抗体施用给人受试者时引起的免疫原性，发明人对M1-23，M3-23这两株抗体进行了人源化。由于食蟹猴与人类的免疫球蛋白之间氨基酸序列具有高度一致性，因此对与M1-23，M3-23这两株抗体而言，为使其适用于人类治疗仅需额外地将可变区FR少数氨基酸替换为人可变区FR序列中相应位置的氨基酸。然而，虽然抗体主要通过CDR来接触和识别抗原，但是抗体FR区中的部分残基可能也参与抗原-抗体的相互作用，影响CDR的空间构型，例如在将鼠源抗体的FR区替换为人抗体的FR区后，鼠源抗体的CDR的空间构型往往发生改变，导致人源化抗体识别/结合抗原的亲和力显著下降，甚至导致人源化抗体丧失与抗原结合的能力(葛彦，人源化抗体研制策略分析及应用研究[J].国外医学，免疫学分册,2004,27(5):271)。因此，在对M1-23，M3-23进行人源化的过程中，可变区FR序列中点突变位置及替换后的氨基酸的选择是十分重要的。
通过使用IMGT信息系统(http://-www.imgt.org),并结合实验经验，在大量的分析和实验的基础上，发明人出人意料地发现，选择人胚系基因序列IGHV4-4*08(SEQ ID NO：40)与IGKV1-39*01(SEQ ID NO：41)作为M1-23人源化的模板，IGHV4-4*02(SEQ ID NO：42)与IGKV4-1*01(SEQ ID NO：43)作为M3-23人源化的模板是特别有利的，所涉及的胚系基因序列列于下表6。
表6:人胚系基因氨基酸序列
Figure BDA0003149584870000701
根据胚系基因序列，同时考虑到改变靠近CDR的FR区氨基酸可能会影响人源化抗体识别/结合抗原的亲和力，我们在保留CDR区附近的氨基酸基础上，设计了如下单点突变对两株抗体的FR区进行改造。分别将人源化后的M1-23、M3-23命名为M1D、M3D。
表7：抗体M1-23的FR区氨基酸残基的单点突变
Figure BDA0003149584870000711
※：上表中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
表8：抗体M3-23的FR区氨基酸残基的单点突变
Figure BDA0003149584870000712
※：其中上表中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
表9：M1-23，M3-23 FR区人源化改造引物
Figure BDA0003149584870000713
Figure BDA0003149584870000721
根据表7，表8中列出的单点突变，设计了相关引物(见表9)，并通过PCR的方法，分别以M1-23-H，M1-23-L,M3-23-H和M3-23-L为模板，将对应位置的原始氨基酸全部进行突变。以M1-23重链可变区(M1-23-H)的人源化为例，设计寡核苷酸引物PTT5-1-23H-F，1-23H-F1，1-23H-F2，1-23H-R1，1-23H-F3及PTT5-1-23H-R(其序列示于上表)。PCR的具体方案如下：以M1-23-H的编码基因为模板，分别用引物对1-23H-F1/1-23H-R1和1-23H-F3/PTT5-1-23H-R扩增出片段1和片段2；以片段1为模板，用引物对1-23H-F2/1-23H-R1扩增出片段3；以片段3为模板，用引物对PTT5-1-23H-F/1-23H-R1扩增出片段4；通过重叠延伸PCR将片段4和片段2连接到一起，再以PTT5-1-23H-F/PTT5-1-23H-R为上下游引物进行扩增，获得人源化后的基因片段M1D-H。
按照上述方法，获得M1-23-L的人源化基因片段M1D-L,M3-23-H的人源化基因片段M3D-H,M3-23-L的人源化基因片段M3D-L。
用实验室自制的Cibson装配液将获得的人源化基因片段M1D-H、M3D-H分别与真核表达载体pTT5-CH连接，M1D-L、M3D-L分别与真核表达载体pTT5-Cκ连接，得到重组载体。将重组载体转化入到大肠杆菌DH5α菌株，涂布LB平板，并在37℃培养箱培养过夜。从平板上挑取单克隆菌落，并进行测序，挑选测序正确的质粒，按照实施例1中方法，进行抗体的表达与纯化。
人源化抗体M1D、M3D氨基酸序列示于表11。另外，还通过下式计算了M1D、M3D的人源化程度。如下表10所示，这两株抗体经过上述人源化后，人源化程度由90％左右提高到了98％左右。
表10：人源化抗体的序列分析
Figure BDA0003149584870000731
人源化程度＝(FR区氨基酸个数-FR区保留的猴源氨基酸个数)/FR区氨基酸个数×100％
表11：抗体M1D,M3D轻重链可变区氨基酸序列
Figure BDA0003149584870000732
Figure BDA0003149584870000741
实施例4：人源化抗体M1D,M3D的体外结合活性评估
4.1抗体的抗原结合活性的测定
通过ELISA方法(酶联免疫吸附法)检测了人源化抗体M1D,M3D与抗原HBsAg的结合活性。按首孔浓度为10μg/mL，进行3倍浓度梯度稀释，共稀释12个浓度梯度，以人源化抗体162(其详细描述于中国专利申请CN201610879693.5中)作为参比抗体。随后，将稀释好的抗体加入商业化的HBsAg板中(购于北京万泰)，并在37℃孵育1h,用PBST洗板5次，甩干。随后，加入GAH-HRP酶标二抗，孵育30min，用PBST洗板5次，甩干。并添加底物TMB溶液。显色15min后，用H2SO4终止显色反应，并于OD450/630测定读值。结果如图4所示，人源化抗体M1D,M3D均具有很好的抗原结合活性，且其对抗原HBsAg的亲和力都优于参比抗体162。上述结果表明，经过人源化改造的这两株抗体不仅具有极高的人源化程度(97％以上)，而且基本上保留了亲本抗体的抗原结合活性，甚至表现出比亲本抗体更好的抗原结合活性。
4.2抗体的初步表位鉴定
发明人还对抗体的表位进行了初步鉴定，以判断所筛选得到的人猴嵌合抗体及人源化抗体是否识别HBsAg上的SA表位。使用识别SA类型表位的高浓度的6D11交叉阻断待测抗体与HBsAg的结合情况，若有明显阻断(竞争)效果，则说明待测抗体与6D11识别同一表位，具体步骤如下：
(1)测定抗体浓度，按照10μg/孔的用量加入商业化的HBsAg ELISA板中，然后用20％NBS补足体积至50μL,37℃孵育30min。
(2)6D11-HRP用ED-11以1:20000稀释后,按照50μL/孔加入ELISA板，37℃孵育30min。
(3)用PBST洗板5次，甩干。
(4)并添加底物TMB溶液，显色15min后，用H2SO4终止显色反应。
(5)于OD450/630测定读值。
结果如图5所示，其中162在本实验中作阳性对照。M1D,M3D与HBsAg的结合均可被鼠源抗体6D11竞争，且竞争效果跟阳性对照162以及亲本抗体M1-23，M3-23相当。上述结果说明人源化抗体M1D,M3D同样识别SA表位。
4.3抗体的中和活性的测定
发明人利用实验室自制的细胞模型HepaG2-NTCP，来评估抗体中和HBV感染(100MOI HBV感染滴度)的能力。将一定量的HBV与梯度稀释的抗体共孵育于HepaG2细胞中，HBV能够侵入分化后的HepaG2细胞并在细胞中进行复制，随着不同抗体的加入及加入抗体量的变化，HBV的侵入和复制将会被不同程度的减弱或抑制，从而细胞上清中将呈现不同水平的HBV抗原(HBeAg)。因此，通过测定HBV抗原(HBeAg)的水平，即可判断不同人源化抗体中和HBV的能力。
对人源化抗体进行两倍浓度梯度稀释，并以162抗体作为阳性对照，从10μg/mL开始，共稀释18个梯度。将病毒感染体系分别与抗体混合，预孵育1h。然后加入预先铺好HepaG2的细胞板中，37℃培养24h，每隔两天对细胞进行换液。感染后第7天，取细胞培养上清，检测其中的HBeAg水平。
检测方法如下：
(1)反应板的制备：将anti-HBeAg单克隆抗体用20mM PB缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，pH 7.4)稀释到2μg/mL。向96孔化学反光板中加入稀释的anti-HBeAg单克隆抗体(100μL/孔)，37℃孵育2h后4℃过夜。所使用的原料均购自北京万泰生物药业股份有限公司。用PBST洗涤96孔化学反光板一次，甩干。向96孔化学反光板中加入封闭液，每孔200μL，37℃封闭2h。随后，弃去封闭液，将平板放入干燥间干燥，于2-8℃保存备用。
(2)孵育：向上述制备好的反应板中加入100μL/孔的待检样品，并在37℃温育60min。
(3)洗涤：用PBST洗涤96孔化学反光板5次，甩干。
(4)孵育：加入辣根过氧化物酶标记的anti-HBeAg抗体(100μl/孔)，并在37℃温育30min。原料购自北京万泰生物药业股份有限公司。
(5)洗涤：用PBST洗涤96孔化学反光板5次，甩干。
(6)显色：加入鲁米诺化学发光试剂(100μl/孔)。
(7)读板：利用化学发光酶标仪读取数值。
实验结果如图6A-6B所示，M1D对HBV的中和活性与参比抗体162相当。
实施例5：人源化抗体M1D,M3D的动物治疗效果的测定
将上述5株抗体按10mg/kg的剂量单剂尾静脉注射的方式施用给HBV转基因小鼠，每组6只HBV转基因小鼠。随后，通过眼眶后静脉丛取血采集小鼠的血液，并检测小鼠血清中的HBsAg水平和HBV DNA水平的变化。
5.1HBsAg的定量检测
(1)反应板的制备：将小鼠单克隆抗体HBs-45E9用20mM PB缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，pH 7.4)稀释到2μg/mL，在化学发光板中每孔添加100μL的包被液，并在2-8℃下包被16-24h，随后再37℃包被2h，用PBST洗涤液洗涤平板一次，甩干。洗涤后，在各孔中加入200μL的封闭液，并在37℃封闭2h。随后，弃去封闭液，将平板放入干燥间干燥，于2-8℃保存备用。
(2)样品稀释：将采集的小鼠血清用含20％NBS(新生牛血清)的PBS溶液，稀释成1:30和1:150两个梯度，用于后续的定量检测。
(3)样品变性处理：取15μL经上述稀释的血清样品与7.5μL变性缓冲液(15％SDS，溶于20mM PB7.4)充分混匀，并在37℃反应1h。随后，加入90μL的中和缓冲液(4％CHAPS，溶于20mM PB7.4)，充分混匀。
(4)样品反应：在反应板中加入100μL经上述变性处理的血清样品，37℃反应1h。随后用PBST洗涤反应板5次，甩干。
(5)酶标记物反应：向化学发光板中按100μL/孔加入HBs-A6A7-HRP反应液,并在37℃反应1h。随后用PBST洗涤平板5次，甩干。
(6)发光反应和测量：向化学发光板中加入发光液(100μL/孔)，并进行光强检测。
(7)小鼠血清样品中的HBsAg浓度的计算：使用标准品进行平行实验，根据标准品的测定结果绘制标准曲线。然后，将小鼠血清样品的光强测量值代入标准曲线，计算出待检血清样品中的HBsAg浓度。
5.2HBV DNA的定量检测
HBV DNA的定量检测按照HBV DNA实时荧光定量检测试剂盒说明书进行(试剂盒购于上海科华生物工程股份有限公司)。
在本实施例中，测定了人源化抗体M1D、M3D、食蟹猴-人嵌合抗体M3-13以及参比抗体162在动物体内的病毒清除能力。实验结果如图7A-7B所示，结果显示人源化抗体M1D、M3D以及猴-人嵌合抗体M3-13均具有良好的病毒清除能力，其清除动物体内的HBsAg及HBV DNA的能力优于参比抗体162。
上述结果表明，本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(最高可达98％)，能够减少免疫排斥反应的可能性，而且展示出与猴-人嵌合抗体相当且优于参比抗体162的病毒清除能力。这样的技术效果是显著的和出人意料的。
实施例6：人源化抗体M1D,M3D的非关键CDR区确定
在抗体可变区结构域中，与抗原直接结合的部位主要是CDR区，但很多研究表明，在抗体的6个CDR中并不都是抗原-抗体结合的关键区域，非关键CDR区可以通过CDR替换的方法来确定。本发明依据最适匹配原则选择CDR替换序列，通过IMGT信息系统，将人源化抗体M1D，M3D的VH和VL氨基酸序列分别输入查找框中，然后将系统搜索出的胚系基因对应的抗体轻重链氨基酸序列，按照FR区同源性最高，CDR区序列差异性最大的原则选择人源化抗体CDR替换序列，除重链CDR3以外的每个CDR区最终选择两条相对应的替换序列。替换序列见下表：
表12：人源化抗体M1D,M3D CDR替换序列
Figure BDA0003149584870000781
根据上表所述CDR替换序列，设计相关引物，并通过PCR的方法，替换M1D，M3D抗体中相对应的CDR区，引物设计见下表。以M1D重链可变区CDR1(M1D-HCDR1)的第一种替换(M1D-H-CDR1-A)为例，设计寡核苷酸引物M1D-H-CDR1-A R及M1D-H-CDR1-A F(其序列示于下表),并将该替换CDR后的抗体命名为M1D HCDR1-1，其他替换后抗体的命名方式以此类推。PCR的具体方案如下：以M1D-H的编码基因为模板，用引物对pTT5-M1D-H-F/M1D-H-CDR1-A R和M1D-H-CDR1-A F/pTT5-M1D-H-R分别扩增出上、下游片段；通过重叠延伸PCR将片段连接到一起，再以pTT5-M1D-H-F/pTT5-M1D-H-R为上下游引物进行扩增，获得在M1D-HCDR1发生CDR替换的基因片段。
表13：CDR替换引物序列
Figure BDA0003149584870000782
Figure BDA0003149584870000791
Figure BDA0003149584870000801
按照上述方法，将获得的重链CDR替换的基因片段分别与真核表达载体pTT5-CH连接，并与相对应的没有进行CDR替换的轻链表达载体小量转染HEK293-细胞，并检测小量表达的细胞上清是否具有抗原活性；同样，将获得的轻链CDR替换的基因片段分别与真核表达载体pTT5-Cκ连接，并与相对应的没有进行CDR替换的重链表达载体进行小量转染并检测转染上清的抗原结合活性。
如果人源化抗体的某个CDR区被替换后，对应的细胞转染上清没有抗原结合活性或者结合活性显著下降，则说明被替换的CDR区是抗体抗原结合的关键CDR区。如果替换后，对应的细胞转染上清抗原结合活性基本不变，则说明被替换的CDR区不是抗体抗原结合的关键区域。
M1D替换结果如图8A-8E所示，M1D重链CDR1(M1D-H-CDR1)和轻链CDR2(M1D-L-CDR2)替换后，与HBsAg抗原结合活性基本没变；而重链CDR2和轻链CDR1替换后，抗原结合活性显著下降；而轻链CDR3替换后，完全失去抗原结合活性。上述结果表明，抗体M1D的HCDR1和LCDR2不是与抗原HBsAg结合的关键CDR区，对其替换并不会影响抗体与抗原的结合活性。
M3D替换结果如图9A-9E所示，M3D重链CDR2(HCDR2)和轻链CDR2(LCDR2)替换后，抗原结合活性基本没变；而轻链CDR1替换后，一种替换(M3D-LCDR1-1)抗原结合活性明显下降，另一种替换(M3D-LCDR1-2)，基本没有抗原结合活性；重链CDR1(HCDR1)和轻链CDR3(LCDR3)替换后，基本没有抗原结合活性。上述结果表明，抗体M3D的HCDR2和LCDR2不是与抗原结合的关键CDR区，对其替换并不会影响抗体与抗原的结合活性。
实施例7：人源化抗体M1D,M3D与抗原结合关键氨基酸确定
为了确定抗体抗原相互作用的关键氨基酸位点，我们对M1D的4个CDR区HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR3和M3D的4个CDR区HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR3进行丙氨酸扫描。关键氨基酸往往具有一定的保守性，比如维持抗体构象的氨基酸残基和被包埋的氨基酸残基，这些氨基酸突变成丙氨酸以后会导致抗体失去活性。突变后的抗体通过Elisa的方法检测同HBsAg的结合活性并计算突变后抗体的rEC50(WT/Mutation，原始抗体EC50相对值为1，完全失去结合活性的用0标示)，将突变后rEC50＜0.2即活性下降5倍的用蓝色标示出来，包括D、E、R、H、L、W、Y等氨基酸残基。结果如表14所示，其中，酸性氨基酸D、E，碱性氨基酸R、H在抗体抗原结合时可以形成盐桥，从而在抗体抗原的结合反应中起重要作用，把这些氨基酸突变成丙氨酸后会破坏离子键的形成从而使抗体结合活性大大降低；脂肪族氨基酸L，属于疏水性氨基酸；W、Y属于芳香族氨基酸，在维持抗体构象中起重要作用。其中，M1D的H56Y、H97D、H100cD、H100dL、94L、L96L突变成丙氨酸后活性显著下降，为不可变点；M3D的H33Y、H34D、H35W、H94R、H95D、H101E、L27dY、L32Y、L91H突变成丙氨酸后活性显著下降，为不可变点。
表14：M1D、M3D关键氨基酸位点确定
Figure BDA0003149584870000821
Figure BDA0003149584870000831
实施例8：M1D、M3D识别的核心表位鉴定
M1D、M3D识别SA线性表位，为了进一步确定两株抗体识别的核心表位，我们将HBsAg的aa113-135(SEQ ID NO:168)进行单点突变共合成下列表格中的14条多肽。多肽用CB稀释，100ng/mL包板，抗体用20％NBS溶液释到1000ng/mL，之后按照3倍稀释12个梯度，并用Elisa的方法检测抗体与不同单点突变多肽的结合活性，用PRISM软件绘制结合曲线。若突变后结合活性丧失，说明该突变位点为SA线性表位上的关键氨基酸。
表15：SEQ13-B点突变肽序列
Figure BDA0003149584870000832
Figure BDA0003149584870000841
M1D、M3D及参比抗体162与上述单点突变多肽结合的EC50值汇总到下列表16(完全失去结合活性的用>500表示)，由结果可知，162结合的核心表位为CKTC(aa121-124)，而M1D结合的核心表位TGPCKTCT(aa118-124)，比参比抗体162更长，且在aa113-135位置靠前；M3D结合的核心表位为CKTCT(aa121-125)，核心表位位置比162靠后。
表16：M1D、M3D与HBsAg(aa113-135)单点突变多肽结合的EC50值
Figure BDA0003149584870000842
为了进一步验证抗体在抗原上结合的关键位置，我们将上述实验在HBsAg抗原蛋白进行验证。设计相关引物(表17)，并通过PCR的方法扩增14条带点突变HBsAg基因片段，扩增出的片段分别用Gibson连接入经过EcoRI和BamHI双酶切的PTT5空载中，测序正确即载体构建完成。将构建好的质粒小量转染HEK293T细胞，转染两天后，收集细胞，做western blot进行验证，具体步骤如下：
(1)收集细胞，用5mL PBS洗涤细胞两次，细胞计数后1000rpm离心5分钟；
(2)按照每1×10^6个细胞加入30μL DDM裂解细胞(也可用BCA法定量细胞蛋白量)，4℃裂解2h，期间用振荡器振荡几次；
(3)13300rpm离心10分钟，吸取上清制样，并取30μL进行还原SDS-PAGE凝胶电泳；
(4)用电转仪转膜300mA恒流电转90min，商业化封闭液37℃封闭1h；
(5)1mg/mL抗体M1D、M3D和162分别用ED-11稀释1000倍并在37℃条件下孵育1h；
(6)PBST每间隔5分钟洗涤1次，共3次；
(7)加入酶标二抗GAH-HRP(1:5000)，37℃孵育30min；
(8)PBST每间隔5分钟洗涤1次，共3次；
(9)显色拍照；(10)以β-actin作内参，将步骤(4)中PVDF膜β-actin对应位置裁下，直接37℃孵育HRP偶联的mouse anti-β-actin抗体(1:5000)30min，其他步骤同上。结果如图10所示，可以看出，在HBsAg抗原蛋白验证的三个抗体的核心表位与在线性多肽上完全一致。
表17：C-HBsAg单点突变引物
Figure BDA0003149584870000851
Figure BDA0003149584870000861
实施例9：M1D、M3D广谱活性鉴定
为了进一步确认M1D、M3D的广谱活性，我们将不同亚型A-G(其中F型包括F1、F2)对应的HBsAg片段(aa113-135)包板(序列见表18)，多肽用CB稀释，100ng/mL包板，抗体用20％NBS溶液释到1000ng/mL，之后按照3倍稀释12个梯度，并用Elisa的方法检测M1D、M3D与不同亚型的HBsAg(aa113-135)的结合活性，用PRISM软件绘制结合曲线。结果如图11A-11B所示，M1D、M3D均可以与大部分HBV亚型结合。
表18：不同亚型的HBsAg-aa113-135氨基酸序列
Figure BDA0003149584870000862
Figure BDA0003149584870000871
实施例10：M1D、M3D的亲和力测定
以5μg/mL的HBsAg溶解于醋酸钠(pH 4.5)在Biacore 3000设备上运行包被芯片程序，将HBsAg包被至CM5芯片上，HBsAg的包被量为2400RU。将分析物从100nM，2倍梯度稀释，制备7个浓度的样品。在Biacore 3000设备上运行亲和力测定程序，设置流速为50μl/min，结合时间为90s，解离时间为600s，样品室的温度设置为10℃，再生液为50mM NaOH，再生流速为50μL/min，再生时间为60s。表19展示了M1D分子和M3D分子与抗原HBsAg的亲和力，分别为1.06nM和1.12nM。
表19：M1D、M3D与抗原的亲和力
Figure BDA0003149584870000872
实施例11：给食蟹猴单次静脉注射抗体M1D、M3D后的药代动力学及初步毒性的评估
将6只未曾经历过大分子实验(>2000Dalton)的雄性食蟹猴分成2组，3只/组。其中，通过静脉推注给第1组和第2组的食蟹猴施用剂量为20mg/kg的抗体M1D和M3D溶液。评估给食蟹猴单次静脉注射抗体M1D和M3D后的药代动力学特征及初步毒性反应。具体的实验设计如表20。
表20：评估M1D、M3D分子药代动力学特征及初步毒性反应的实验设计
Figure BDA0003149584870000873
在给药前(0小时)，每天两次(上午9:30和下午4:00)笼边观察实验动物的健康及外观的状态。在实验开展前对实验动物进行体检，以确认动物的健康状态。在给药当天，在每个采血点前后分别观察实验动物的状态，包括实验动物的一般状态、行为、活动量、排泄、呼吸及其它异常症状。结果显示，所有动物在给药期间及给药后均未表现出任何异常反应。此外，还在给药后，跟踪实验动物的体重和体温。结果示于表21-24中。
表21：M1D给药后的实验动物的体重
Figure BDA0003149584870000881
表22：M1D给药后的实验动物的体温
Figure BDA0003149584870000882
表23：M3D给药后的实验动物的体重
Figure BDA0003149584870000883
表24：M3D给药后的实验动物的体温
Figure BDA0003149584870000891
上述实验结果表明，抗体M1D和M3D在施用给实验动物后，不会引起实验动物的不良副作用，从而初步证实了两株抗体良好的安全性。
此外，还分别于给药前(0小时)，给药后0.25h(15分钟)、0.5h(30分钟)、1h、2h、4h、10h、24h(Day 1)、48h(Day 2)、72h(Day 3)、96h(Day 4)、144h(Day 6)、192h(Day 8)、240h(Day 10)、336h(Day 14)、408h(Day 17)、504h(Day 21)及672h(Day 28)，从实验动物的头静脉采集约1.0mL全血。对收集的血清和全血进行下述分析。
采用化学发光免疫分析法(CLIA)，检测食蟹猴血清中抗体M1D和M3D的浓度。血清中人源化抗体M1D和M3D的定量下限(LLOQ)为0.063ng/mL，定量上限(ULOQ)为4.0ng/mL。检测结果示于图12A-12B中。
图12A显示了单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M1D后，每一只食蟹猴血清(第1组)中人源化抗体M1D的血药浓度随时间变化的曲线图。
图12B显示了单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M3D后，每一只食蟹猴血清(第2组)中人源化抗体M3D的血药浓度随时间变化的曲线图。
使用药动学软件WinNonlinTM Version 6.2.1(Pharsight，Mountain View，CA)，以静脉注射非房室模型(IV bolus input)对人源化抗体M1D、M3D的实验数据进行处理。
使用对数线性梯形法计算下列参数：起始血清药物浓度(C0)、最后一个可检测点的时间(Tlast)，消除半衰期(T1/2)，表观分布容积(Vdss)，总体清除率(CL)，从零时间点到最后一个可检测到浓度的时间点的平均滞留时间(MRT0-last)，从零时间点到无穷大的平均滞留时间(MRT0-inf)，从零时间点到最后一个可检测到浓度的时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUC0-last)，及从零时间点到无穷大的血清浓度-时间曲线下面积(AUC0-inf)。
结果显示：单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M1D后，雄性食蟹猴对人源化抗体M1D的CL为0.00962±0.00335mL/min/kg。人源化抗体M1D的平均消除半衰期(t1/2)为81.3±78.7小时。食蟹猴血清中人源化抗体M1D的Vdss和AUC0-inf值分别为0.05±0.0209L/kg和38053±14915μg.h/mL。
单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M3D后，雄性食蟹猴对人源化抗体M3D的CL为0.0049±0.0025mL/min/kg。人源化抗体M3D的平均消除半衰期(t1/2)为134±94.6小时。食蟹猴血清中人源化抗体M3D的Vdss和AUC0-inf值分别为0.0497±0.0143L/kg和79419±33500μg.h/mL。
上述实验结果还概述于表25和表26中。
表25：第1组雄性食蟹猴的血清中人源化抗体M1D的主要药动学参数
Figure BDA0003149584870000901
表26：第2组雄性食蟹猴的血清中人源化抗体M3D的主要药动学参数
Figure BDA0003149584870000902
Figure BDA0003149584870000911
另外，还对食蟹猴的血清进行血常规化学分析。食蟹猴血清中的各项指标(包括胆红素，丙氨酸转氨酶，天冬氨酸转氨酶，总蛋白，白蛋白，碱性磷酸酶，γ-谷氨酰转移酶，葡萄糖，尿素，肌酸酐，钙离子，磷，总胆固醇，甘油三酯，钠离子，钾离子，氯离子和球蛋白等的水平)均未见明显异常。这些实验结果表明，在指定的剂量条件下人源化抗体M1D或M3D的单次静脉注射是安全的。因此，本发明的人源化抗体M1D或M3D可施用给受试者(例如人)，以预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
实施例12：M1D及M3D的成药性评估
1.人源化抗体M1D及M3D的等电点测定
利用毛细管等电聚焦电泳法(cIEF)对人源化抗体M1D和M3D的等电点进行测定。实验结果如表27所示。结果显示，人源化抗体M1D的pI值为8.8，M3D的pI为9.0。
表27：M1D、M3D的等电点
Figure BDA0003149584870000912
2.人源化抗体M1D、M3D的稳定性测定
通常使用Tm值来描述抗体分子的稳定性。Tm值越高，抗体分子的热稳定性越好。将人源化抗体M1D和M3D分别溶解于三种缓冲液中，并稀释至1mg/ml，并通过差式扫描量热法(DSC)进行测试。开始扫描温度设置为10℃，结束扫描温度设置为110℃，扫描速度为200℃/hr，冷却速度设置为Exp，最终仪器保持温度设置为25℃，数据采集频率设置为10sec，进样前毛细管温度设置为30℃。实验结果示于图13A-13B、表28-29中。结果显示，人源化抗体M1D的Tm onset为61.7℃以上，而M3D的Tmonset值均大于61.6℃，说明M1D和M3D具有很好的热稳定性。
表28：M1D的Tm值
Buffer Tm onset(℃) Tm1(℃) Tm2(℃)
Acetate pH5.0 61.7 68.9 95.6
Histidine pH6.0 63.8 71.0 96.1
PBS 7.2 65.6 72.9 92.4
表29：M3D的Tm值
Buffer TM onset(℃) TM1(℃) TM2(℃)
Acetate 5.0 61.6 68.8 82.2
Histidine 6.0 62.8 71.1 82.3
PBS7.2 65.7 78.5 /
此外，将人源化抗体M1D和M3D，以60mg/ml的浓度溶解于pH6.0的组氨酸缓冲液，以2mg/ml的浓度溶解于pH7.2的磷酸缓冲液，然后分别储存于40℃的条件下。分别于第0周(T0)、第1周(T1W)和第2周(T2W)，对样品的理化性质(包括外观、pH值、蛋白浓度等)进行监测。结果描述于表30和表31中。
表30：M1D稳定性测试
Figure BDA0003149584870000921
Figure BDA0003149584870000931
表31：M3D稳定性测试
Figure BDA0003149584870000932
外观的监测
将样品瓶擦拭干净，并使用澄明度检测仪(黑背景和白背景)来观察样品的颜色和澄清度。上述表30-31的结果显示，两种缓冲液及40℃储存条件下的人源化抗体M1D和M3D样品均未出现明显变化。
pH值和蛋白浓度的监测
检测样品在A280处的吸光值，利用比尔-朗伯定律(Beer–Lambert law)，计算样品中的蛋白浓度。另外，使用pH计测定样品的pH值，重复测定2次，取平均值为最终结果。实验结果示于上述表30-31中。结果显示，人源化抗体M1D和M3D在不同缓冲液，40℃下储存2周后，pH值和蛋白浓度未发生显著改变。
SEC-HPLC检测
采用Agilent 1260infinity，TSK G3000SWXL凝胶柱(5μm,7.8mm×300mm)，通过SEC-HPLC对经历不同储存条件的人源化抗体M1D和M3D样品进行分析，其中，流动相组成为50mM PB+300mM NaCl，pH7.0±0.2；流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；样品浓度为10mg/mL，进样量为10μL。实验结果示于上述表30-31中。结果显示，在不同储存条件(不同缓冲液，不同储存时间)下，含有人源化抗体M1D和M3D的样品的主峰均大于95％。这说明，人源化抗体M1D和M3D是稳定的。
cIEF检测
利用毛细管电泳对样品进行测试分析，结果显示M1D分子在组氨酸缓冲液中40℃储存2周后cIEF主峰下降6.0％，而在PBS缓冲液中储存2周后，主峰下降24.9％。对于M3D而言，在组氨酸缓冲液中40℃储存2周后cIEF主峰下降13.7％，而在PBS缓冲液中储存2周后，主峰下降30.6％。
3.人源化抗体M1D及M3D变体的可溶性分析
将人源化抗体M1D和M3D分别以60mg/mL的浓度溶解在含有5％蔗糖和0.02％PS80的25mM组氨酸溶液(pH 6.0)中，并进行离心超滤浓缩(离心温度为5℃，转速为4850rpm)，直至样品溶液的液面随着离心时间的增加而不再有明显下降。用移液器小心回收样品，观察此时样品的性状。结果显示，溶液样品呈黄色。
然后，移取1000μL的溶液样品至1.5mL EP管中，以10000rpm离心20分钟。离心结果显示，样品无分层，液体澄清，且无沉淀出现。用移液器分别小心吸取离心后样品的上层和下层，并通过UV280测定蛋白浓度。结果显示，M1D的溶解度为171mg/ml；M3D的溶解度170mg/ml。进一步，对溶解在含有5％蔗糖和0.02％PS80的25mM组氨酸溶液(pH 6.0)中的人源化抗体M1D和M3D变体的粘度进行测定。在该缓冲体系中，人源化抗体M1D在171mg/mL浓度下的粘度为13.2cp(1cP＝1mPa.s)，而M3D在170mg/mL浓度下的粘度为19.8cp，在100mg/ml下粘度为11.5cp。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 厦门大学
养生堂有限公司
<120> 用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体
<130> IDC210074
<150> CN 201710223992.8
<151> 2017-04-07
<160> 220
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 重链可变区
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
            20                  25                  30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Arg Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Leu Arg Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 轻链可变区
<400> 2
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 重链可变区
<400> 3
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
            20                  25                  30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Arg Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Ile Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 轻链可变区
<400> 4
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Arg Gly Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 重链可变区
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Pro Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Asn Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Gly Asn Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Thr Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Val Tyr Thr Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Val Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HCDR1
<400> 6
Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn Phe
1               5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HCDR2
<400> 7
Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr
1               5
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HCDR3
<400> 8
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe
1               5                   10                  15
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LCDR1
<400> 9
Gln Asp Ile Ser Ser Ser
1               5
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LCDR2
<400> 10
Tyr Ala Asn
1
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LCDR3
<400> 11
Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu Thr
1               5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HCDR1
<400> 12
Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro Tyr Asp Trp
1               5                   10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HCDR2
<400> 13
Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr
1               5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HCDR3
<400> 14
Val Arg Asp Glu Thr
1               5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 LCDR1
<400> 15
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1               5                   10
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 LCDR2
<400> 16
Trp Ala Ser
1
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 LCDR3
<400> 17
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1               5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HCDR1
<400> 18
Gly Ala Ser Asn Ser Ser Asn Tyr
1               5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HCDR2
<400> 19
Ile Tyr Gly Asn Ser Gly Ser Thr
1               5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HCDR3
<400> 20
Ala Arg Gly Ser Val Tyr Thr Tyr Ser
1               5
<210> 21
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HFR1
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser
            20                  25
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23/M1D HFR2
<400> 22
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10                  15
Tyr
<210> 23
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HFR3
<400> 23
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HFR4
<400> 24
Trp Gly Gln Gly Leu Arg Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 25
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LFR1
<400> 25
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr
            20                  25
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LFR2
<400> 26
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
1               5                   10                  15
Tyr
<210> 27
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LFR3
<400> 27
Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Thr
            20                  25                  30
Thr Tyr Tyr Cys
        35
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23/M1D LFR4
<400> 28
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HFR1
<400> 29
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser
            20                  25
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HFR2
<400> 30
Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg
1               5                   10                  15
<210> 31
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HFR3
<400> 31
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Ile Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 HFR4
<400> 32
Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 33
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 LFR1
<400> 33
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
            20                  25
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 LFR2
<400> 34
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Tyr
<210> 35
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 LFR3
<400> 35
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
            20                  25                  30
Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3D LFR4
<400> 36
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HFR1
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Pro Leu Thr Cys Ala Val Ser
            20                  25
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HFR2
<400> 38
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10                  15
Arg
<210> 39
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HFR3
<400> 39
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Thr Asp Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
        35
<210> 40
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGHV4-4*08
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
    50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg
<210> 41
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGKV1-39*01
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
                85                  90                  95
<210> 42
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGHV4-4*02
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210> 43
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGKV4-1*01
<400> 43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro
            100
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D HFR1
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
            20                  25
<210> 45
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D HFR3
<400> 45
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D HFR4
<400> 46
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 47
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D LFR1
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr
            20                  25
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D LFR2
<400> 48
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1               5                   10                  15
Tyr
<210> 49
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D LFR3
<400> 49
Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
            20                  25                  30
Thr Tyr Tyr Cys
        35
<210> 50
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D HFR1
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser
            20                  25
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D HFR2
<400> 51
Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg
1               5                   10                  15
<210> 52
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D HFR3
<400> 52
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D HFR4
<400> 53
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 54
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D LFR1
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
            20                  25
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D LFR2
<400> 55
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Tyr
<210> 56
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D LFR3
<400> 56
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
            20                  25                  30
Val Tyr Tyr Cys
        35
<210> 57
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D 重链可变区
<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
            20                  25                  30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D 轻链可变区
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 59
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D 重链可变区
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
            20                  25                  30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Arg Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210> 60
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D 轻链可变区
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
ggacagcckg gaaggtgtgc 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
gaggcagttc cagatttcaa 20
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
ccgcgtactt gttgttgctc tgt 23
<210> 64
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcag gcccag 56
<210> 65
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
caggagtcag gcccaggact ggtgaagcct tcggagaccc tgtccctcac ctgcac 56
<210> 66
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
aagccttcgg agaccctgtc cctcacctgc actgtctctg gtggctccat c 51
<210> 67
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
gttcttggac gtgtctacgg atatggtgac tcgactcttg agggaggggt tgtagt 56
<210> 68
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
tccgtagaca cgtccaagaa ccagttctcc ctgaaactga gctc 44
<210> 69
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gatgggccct tggtcgacgc tgaagagacg gtgacggtgg tcccttggcc ccagaaatc 59
<210> 70
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catacagatg acgcagtctc catcc 55
<210> 71
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
cagcaaaaac cggggaaagc ccctaagctc ctgatctatt atgc 44
<210> 72
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
gaaccttgat gggaccccac tttgcaaacg atttgcataa tagatcagga gc 52
<210> 73
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
ctgtcccaga tccactgcca ctgaaccttg atgggacccc 40
<210> 74
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaacct gagg 54
<210> 75
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
gcagcctgca acctgaggat tttgcaactt attactgtca ac 42
<210> 76
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
gaccaaggtg gaaatcaaac gtacggtggc tgcaccat 38
<210> 77
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcgg gcccaggact 60
ggtgaagcc 69
<210> 78
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
attcccgggt agatgcccag taaaagagca gcttaggagg ctgtcctggt ttctgctg 58
<210> 79
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
ggtgtctcca tcagcagtcc ttatgactgg acctgggtcc gccagccccc agggaag 57
<210> 80
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
aactggttct tggacttgtc tactgaaatg gtgactcgac tcttgaggga ggggttg 57
<210> 81
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
agacaagtcc aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct gtgaccgccg c 51
<210> 82
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
gaaacctggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatc 59
<210> 83
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catcgtgatg acccagtctc cagactcc 58
<210> 84
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
cccagtctcc agactccctg gctgtgtctc tgggagagag ggccaccatc aactgcaagt 60
ccag 64
<210> 85
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcttttact gggcatctac ccgggaat 58
<210> 86
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
gtgaaatctg tcccagatcc actgccactg aatcggtcag ggaccccgga ttcccgggta 60
gatgcc 66
<210> 87
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gcctgcaggc tgaagatg 58
<210> 88
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtcc 39
<210> 89
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 89
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcag gc 52
<210> 90
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
gatgggccct tggtcgacgc tgaagagacg gtgac 35
<210> 91
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catacagatg acgcagtc 48
<210> 92
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 92
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtccc 40
<210> 93
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 93
gtagtaacta ctgatggagc caccagagac agtgcaggtg ag 42
<210> 94
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 94
ggtggctcca tcagtagtta ctactggagc tggatccgcc ag 42
<210> 95
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 95
atagtaacta ccactgctga cggagccacc agagacagtg caggtgag 48
<210> 96
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 96
ggtggctccg tcagcagtgg tagttactat tggagctgga tccgccag 48
<210> 97
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 97
ggtgctccca ctggtataga tatacccaat ccactccag 39
<210> 98
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 98
atctatacca gtgggagcac cgactacaac ccctccctc 39
<210> 99
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 99
tgtgtaacta ctactactac taatataccc aatccactcc ag 42
<210> 100
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 100
attagtagta gtagtagtta cacagactac aacccctccc tc 42
<210> 101
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 101
gtagctgctg ctaacactct gagttgcccg gcaagtgatg g 41
<210> 102
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 102
cagagtgtta gcagcagcta cttaaattgg tatcagc 37
<210> 103
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 103
agtattactt ccgatgttgg agctagttgc ccggcaagtg atgg 44
<210> 104
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 104
agctccaaca tcggaagtaa tactttaaat tggtatcagc 40
<210> 105
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 105
gaccccactt tgcaaacggg atgcagcata gatcaggagc ttagg 45
<210> 106
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 106
cctaagctcc tgatctatgc tgcatcccgt ttgcaaagtg gggtc 45
<210> 107
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 107
gaccccactt tgcaaacgag acgccttata gatcaggagc ttagg 45
<210> 108
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 108
cctaagctcc tgatctataa ggcgtctcgt ttgcaaagtg gggtc 45
<210> 109
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 109
agtgagaggg taattgtaat cttgtagaca gtaataagtt gcaaaatc 48
<210> 110
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 110
ctacaagatt acaattaccc tctcactttc ggcggaggga ccaag 45
<210> 111
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 111
agtgagaggt aaactactac tctgatgaca gtaataagtt gcaaaatc 48
<210> 112
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 112
catcagagta gtagtttacc tctcactttc ggcggaggga ccaag 45
<210> 113
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 113
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcg 49
<210> 114
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 114
gatgggccct tggtcgacgc tgaggagacg gtgaccag 38
<210> 115
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 115
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catcgtgatg acccagtctc 50
<210> 116
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 116
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtc 38
<210> 117
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 117
ggagtaacca ccactgctga tggagccacc agagacagcg caggtgaggg acag 54
<210> 118
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 118
ggtggctcca tcagcagtgg tggttactcc acctgggtcc gccagccc 48
<210> 119
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 119
ccagttacta ctgctgatgg agccaccaga gacagcgcag gtgagggaca g 51
<210> 120
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 120
ggtggctcca tcagcagtag taactggacc tgggtccgcc agccc 45
<210> 121
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 121
ggtgctccca ctatgataga ttcgtccaat ccactccag 39
<210> 122
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 122
atctatcata gtgggagcac cagctacaac ccctccctca ag 42
<210> 123
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 123
tgtgctacca ccactaccac taattcgtcc aatccactcc ag 42
<210> 124
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 124
attagtggta gtggtggtag cacaagctac aacccctccc tcaag 45
<210> 125
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 125
ataggtcttt ccatcactat gcaggaggct ctggctggac ttgcagttga tggtggc 57
<210> 126
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 126
cagagcctcc tgcatagtga tggaaagacc tatttagcct ggtaccagca gaaac 55
<210> 127
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 127
gtagctgctg ctaacactct ggctggactt gcagttgatg gtggc 45
<210> 128
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 128
cagagtgtta gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aac 43
<210> 129
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 129
gggaccccgg attcccgggt agaacccaag taaaagagca gcttaggagg 50
<210> 130
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 130
cctcctaagc tgctctttta cttgggttct acccgggaat ccggggtccc 50
<210> 131
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 131
gggaccccgg attcccgggt ggatgcaccg taaaagagca gcttaggagg 50
<210> 132
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 132
cctcctaagc tgctctttta cggtgcatcc acccgggaat ccggggtccc 50
<210> 133
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 133
cgtccaagga gtactataat attgctgaca gtaatacact gccacatc 48
<210> 134
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 134
cagcaatatt atagtactcc ttggacgttc ggccaaggga ccaag 45
<210> 135
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 135
cgtccaagga gtttgtagag cttgcataca gtaatacact gccacatc 48
<210> 136
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 136
atgcaagctc tacaaactcc ttggacgttc ggccaaggga ccaag 45
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGHV4-4*08) for M1D HCDR-1
<400> 137
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGHV4-61*01) for M1D HCDR-1
<400> 138
Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr
1               5                   10
<210> 139
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV1-39*01) for M1D LCDR-2
<400> 139
Ala Ala Ser
1
<210> 140
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGKV1-5*03) for M1D LCDR-2
<400> 140
Lys Ala Ser
1
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGHV4-4*02) for M3D HCDR-2
<400> 141
Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr
1               5
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGHV3-23*02) for M3D HCDR-2
<400> 142
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1               5
<210> 143
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV2-28*01) for M3D LCDR-2
<400> 143
Leu Gly Ser
1
<210> 144
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGKV3-15*01) for M3D LCDR-2
<400> 144
Gly Ala Ser
1
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGHV4-4*08) for M1D HCDR-2
<400> 145
Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr
1               5
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGHV3-11*03) for M1D HCDR-2
<400> 146
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr
1               5
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV3D-7*01) for M1D LCDR-1
<400> 147
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGLV1-44*01) for M1D LCDR-1
<400> 148
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr
1               5
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV1-6*01) for M1D LCDR-3
<400> 149
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV6-21*02) for M1D LCDR-3
<400> 150
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr
1               5
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGHV4-30-4*07) for M3D HCDR-1
<400> 151
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Ser
1               5                   10
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGHV4-4*01) for M3D HCDR-1
<400> 152
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp
1               5
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV2-29*02) for M3D LCDR-1
<400> 153
Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1               5                   10
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGKV3D-7*01) for M3D LCDR-1
<400> 154
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV4-1*01) for M3D LCDR-3
<400> 155
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGKV2-28*01) for M3D LCDR-3
<400> 156
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr
1               5
<210> 157
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (HCDR1-A) 重链可变区
<400> 157
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 158
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (HCDR1-B) 重链可变区
<400> 158
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro
    50                  55                  60
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp
            100                 105                 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 159
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (LCDR2-A) 轻链可变区
<400> 159
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 160
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (LCDR2-B) 轻链可变区
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 161
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (HCDR2-B) 重链可变区
<400> 161
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
            20                  25                  30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 162
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (LCDR1-B) 轻链可变区
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser
            20                  25                  30
Asn Thr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 163
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (HCDR2-A) 重链可变区
<400> 163
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
            20                  25                  30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210> 164
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (HCDR2-B) 重链可变区
<400> 164
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
            20                  25                  30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
        35                  40                  45
Ile Gly Arg Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            100                 105                 110
Ser
<210> 165
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (LCDR2-A) 轻链可变区
<400> 165
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210> 166
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (LCDR2-B) 轻链可变区
<400> 166
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                 105                 110
Lys
<210> 167
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (LCDR1-A) 轻链可变区
<400> 167
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His
                85                  90                  95
Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 168
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBsAg-aa113-135 (SEQ13-B)
<400> 168
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 169
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-S117A
<400> 169
Ser Ser Thr Thr Ala Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 170
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T118A
<400> 170
Ser Ser Thr Thr Ser Ala Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 171
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-G119A
<400> 171
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Ala Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 172
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-P120A
<400> 172
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Ala Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 173
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-C121S
<400> 173
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Ser Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 174
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-K122A
<400> 174
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Ala Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 175
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T123A
<400> 175
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 176
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-C124S
<400> 176
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Ser Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 177
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T125A
<400> 177
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Ala Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 178
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T126A
<400> 178
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ala Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 179
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-P127A
<400> 179
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Ala Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 180
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-Q129A
<400> 180
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 181
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T131A
<400> 181
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Ala Ser Met Phe Pro
            20
<210> 182
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-S132A
<400> 182
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ala Met Phe Pro
            20
<210> 183
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 183
atcaactacc gccacgggac catgcaagac ctgcac 36
<210> 184
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 184
ggtcccgtgg cggtagttga tgttcctgga agtaga 36
<210> 185
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 185
aactaccagc gcgggaccat gcaagacctg cacgat 36
<210> 186
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 186
catggtcccg cgctggtagt tgatgttcct ggaagt 36
<210> 187
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 187
accagcacgg caccatgcaa gacctgcacg attcct 36
<210> 188
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 188
cttgcatggt gccgtgctgg tagttgatgt tcctgg 36
<210> 189
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 189
cagcacggga gcatgcaaga cctgcacgat tcctgc 36
<210> 190
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 190
gtcttgcatg ctcccgtgct ggtagttgat gttcct 36
<210> 191
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 191
acgggaccat ccaagacctg cacgattcct gctcaa 36
<210> 192
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 192
gcaggtcttg gatggtcccg tgctggtagt tgatgt 36
<210> 193
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 193
gggaccatgc cggacctgca cgattcctgc tcaagg 36
<210> 194
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 194
gtgcaggtcc ggcatggtcc cgtgctggta gttgat 36
<210> 195
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 195
gggaccatgc gcgacctgca cgattcctgc tcaagg 36
<210> 196
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 196
gtgcaggtcg cgcatggtcc cgtgctggta gttgat 36
<210> 197
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 197
accatgcaag gcctgcacga ttcctgctca aggaac 36
<210> 198
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 198
atcgtgcagg ccttgcatgg tcccgtgctg gtagtt 36
<210> 199
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 199
tgcaagacct ccacgattcc tgctcaagga acctct 36
<210> 200
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 200
aggaatcgtg gaggtcttgc atggtcccgt gctggt 36
<210> 201
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 201
caagacctgc gcgattcctg ctcaaggaac ctctat 36
<210> 202
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 202
gcaggaatcg cgcaggtctt gcatggtccc gtgctg 36
<210> 203
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 203
gacctgcacg gctcctgctc aaggaacctc tatgtt 36
<210> 204
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 204
tgagcaggag ccgtgcaggt cttgcatggt cccgtg 36
<210> 205
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 205
ctgcacgatt gctgctcaag gaacctctat gtttcc 36
<210> 206
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 206
ccttgagcag caatcgtgca ggtcttgcat ggtccc 36
<210> 207
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 207
gattcctgct gcaggaacct ctatgtttcc ctcttg 36
<210> 208
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 208
gaggttcctg cagcaggaat cgtgcaggtc ttgcat 36
<210> 209
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 209
tgctcaagga gcctctatgt ttccctcttg ttgctg 36
<210> 210
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 210
aacatagagg ctccttgagc aggaatcgtg caggtc 36
<210> 211
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 211
tcaaggaacc gctatgtttc cctcttgttg ctgtac 36
<210> 212
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 212
ggaaacatag cggttccttg agcaggaatc gtgcag 36
<210> 213
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-A
<400> 213
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro
            20
<210> 214
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-C
<400> 214
Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 215
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-D
<400> 215
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro
            20
<210> 216
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-E
<400> 216
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 217
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-F/H
<400> 217
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 218
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13F1
<400> 218
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
            20
<210> 219
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13F2
<400> 219
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Leu Pro
            20
<210> 220
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-G
<400> 220
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Asn Ser Met Tyr Pro
            20

Claims (25)

1.能够特异性结合HBsAg的抗体，所述抗体包含：
(1)包含如SEQ ID NO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:13所示的VH CDR2、和如SEQ IDNO:14所示的VH CDR3的重链可变区(VH)；以及，包含如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQID NO:16所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3的轻链可变区(VL)；
(2)包含如SEQ ID NO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:141所示的VH CDR2、和如SEQID NO:14所示的VH CDR3的重链可变区(VH)；以及，包含如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3的轻链可变区(VL)；
(3)包含如SEQ ID NO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:142所示的VH CDR2、和如SEQID NO:14所示的VH CDR3的重链可变区(VH)；以及，包含如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQ ID NO:16所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3的轻链可变区(VL)；
(4)包含如SEQ ID NO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:13所示的VH CDR2、和如SEQ IDNO:14所示的VH CDR3的重链可变区(VH)；以及，包含如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQID NO:143所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3的轻链可变区(VL)；或
(5)包含如SEQ ID NO:12所示的VH CDR1、如SEQ ID NO:13所示的VH CDR2、和如SEQ IDNO:14所示的VH CDR3的重链可变区(VH)；以及，包含如SEQ ID NO:15所示的VL CDR1、如SEQID NO:144所示的VL CDR2、和如SEQ ID NO:17所示的VL CDR3的轻链可变区(VL)。
2.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体是人源化的。
3.权利要求2所述的抗体，其中，所述抗体的人源化程度为至少89％。
4.权利要求2所述的抗体，其中，所述抗体的非CDR区包含不超过19个的非人源氨基酸残基。
5.权利要求2所述的抗体，其中，所述抗体进一步包含人免疫球蛋白的框架区，所述框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。
6.权利要求5所述的抗体，其中，所述人免疫球蛋白的框架区是人胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的框架区。
7.权利要求5所述的抗体，其中，所述抗体包含：IGHV4-4*02所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区，和IGKV4-1*01所编码的氨基酸序列中所包含的轻链框架区，所述重链框架区和/或轻链框架区任选地包含一个或多个从人源残基至食蟹猴源残基的回复突变。
8.权利要求1所述的抗体，其中：
所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与选自下列的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性：如SEQ ID NOs:3，59，163和164所示的重链可变区。
9.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体的重链可变区选自如SEQ ID NOs:3，59，163和164任一项所示的重链可变区。
10.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与选自下列的轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性：如SEQ ID NOs:4，60，165和166任一项所示的轻链可变区。
11.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体的轻链可变区选自如SEQ ID NOs:4，60，165和166任一项所示的轻链可变区。
12.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体包含：
(1)如SEQ ID NO:3所示的VH和如SEQ ID NO:4所示的VL；
(2)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(3)如SEQ ID NO:163所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(4)如SEQ ID NO:164所示的VH和如SEQ ID NO:60所示的VL；
(5)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:165所示的VL；或
(6)如SEQ ID NO:59所示的VH和如SEQ ID NO:166所示的VL。
13.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体选自scFv、Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv片段、双抗体(diabody)、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
14.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体为IgG类别。
15.权利要求14所述的抗体，其中，所述抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4类别。
16.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体带有可检测的标记。
17.权利要求16所述的抗体，其中，所述可检测的标记选自放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质或酶。
18.权利要求16所述的抗体，其中，所述可检测的标记为辣根过氧化物酶。
19.分离的核酸分子，其编码权利要求1-18任一项所述的抗体，或其重链可变区和轻链可变区。
20.载体，其包含权利要求19所述的核酸分子。
21.宿主细胞，其包含权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的载体。
22.制备权利要求1-18任一项所述的抗体的方法，其包括，在允许所述抗体表达的条件下，培养权利要求21所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体。
23.药物组合物，其含有权利要求1-18任一项所述的抗体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
24.权利要求1-18任一项所述的抗体或权利要求23所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗受试者的HBV感染或乙肝，用于体外或在受试者体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
25.权利要求24所述的用途，其中，所述受试者是人。
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