CN115236331A - 一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种检测SARS‑CoV‑2中和抗体的试剂盒及方法。本申请涉及生物医药领域，提供一种用于检测SARS‑CoV‑2中和抗体的检测试剂盒及方法，采用蛋白标签对RBD及ACE2修饰使其二者具有更好的稳定性和反应性，提高了检测灵敏度。

Description

一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒及方法
本申请是2020年11月11日提出的、名称为“一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒及方法”的发明专利申请No.2020112552126的分案申请。
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒及方法。
背景技术
SARS-CoV-2表面刺突蛋白(spike protein)是冠状病毒表面重要的受体结合位点，其可与细胞表面病毒特异性受体结合，介导病毒外膜与细胞融合、病毒吸附及穿膜；冠状病毒S蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)可与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme2，ACE2)结合，并使病毒进入宿主细胞。
当SARS-CoV-2侵入机体时，会刺激机体产生具有保护作用的中和抗体。中和抗体是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白，具有识别病毒表面蛋白、阻断其与人体细胞表面特异性受体结合的功能，从而发挥抗病毒作用。中和抗体的多少是疫苗免疫保护效果的一项重要指标，是疫苗评估和质控的重要依据。
现有的对SARS-CoV-2的检测方法主要有核酸检测和抗体检测，主要方法有荧光PCR法、酶联免疫吸附法、胶体金层析法、化学发光法，其中核酸检测灵敏度高，特异性强，准确度高，但是对操作要求相对较高，检测时间长。抗体检测灵敏度较高，特异性较强，但是需要在被感染7-14天后才能出现IgM/IgG抗体。而且目前这些方法只能检测是否处于感染期，并不能针对治愈后患者是否存在再感染风险，以及普通大众是否存在暴露及感染风险等进行确认。因此迫切需要新的检测SARS-CoV-2的方法。
发明内容
本申请提供了一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒及方法，其具有下列性质中的一种或多种：RBD、ACE2受体蛋白或其功能活性片段与Fc融合后，与天然结构的蛋白相比，1)具有更好的稳定性和反应性；2)提高了检测灵敏度；3)可以判断COVID-19疫苗的临床疗效，并评价个体自身免疫效果；4)可以判断是否存在SARS-CoV-2再次感染的风险；和5)参比抗体具有良好的中和效果，能很好地模拟人体内中和抗体的天然形式。
一方面，本申请提供了一种SARS-CoV-2中和抗体的检测试剂盒，其包含：
1)SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段；以及
2)竞争结合剂，所述竞争结合剂包含能够与所述SARS-CoV-2中和抗体竞争结合所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的物质。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含全长SARS-CoV-2刺突蛋白。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含三聚体全长SARS-COV-2刺突蛋白。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD，且所述RBD与Fc区直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述RBD与所述Fc在框内融合。
在某些实施方式中，所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:6-11中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml-4000ng/ml。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段固定在固体支持物上。
在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含人ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ECD。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与Fc区直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与所述Fc区在框内融合。
在某些实施方式中，所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含SEQ ID NO:1-5中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。
在某些实施方式中，所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
在某些实施方式中，所述竞争结合剂的浓度为100ng/ml-2000ng/ml。
在某些实施方式中，所述的试剂盒还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
在某些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
在某些实施方式中，所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：所述VH包含SEQ ID NO:30-32所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ IDNO:33-35所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述VH包含SEQ ID NO:36-38所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:39-41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或所述VH包含SEQ ID NO:42-44所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:45-47所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：所述VH包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述VH包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或所述VH包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述参比抗体包括抗体32-1,12-5和12-8。
在某些实施方式中，所述参比抗体的浓度为50ng/ml-1000ng/ml。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
在某些实施方式中，所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
另一方面，本申请提供了一种用于检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其包括：使用所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供了一种用于检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其包括：
1)包被SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段于固相支持物中；
2)将待测样品加入步骤1)中与所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段反应；
3)将竞争结合剂加入步骤2)中；
4)检测所述待测样品中SARS-CoV-2中和抗体；
其中，所述竞争结合剂包含能够与所述SARS-CoV-2中和抗体竞争结合所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的物质；所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD；所述竞争结合剂包含ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含全长SARS-CoV-2刺突蛋白。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含三聚体全长SARS-COV-2刺突蛋白。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD，且所述RBD与Fc区直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述RBD与所述Fc在框内融合。
在某些实施方式中，所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:6-11中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml-4000ng/ml。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段固定在固体支持物上。
在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含人ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ECD。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与Fc区直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与所述Fc区在框内融合。
在某些实施方式中，所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含SEQ ID NO:1-5中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述竞争结合剂包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。
在某些实施方式中，所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
在某些实施方式中，所述竞争结合剂的浓度为100ng/ml-2000ng/ml。
在某些实施方式中，所述的试剂盒还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
在某些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
在某些实施方式中，所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：所述VH包含SEQ ID NO:30-32所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ IDNO:33-35所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述VH包含SEQ ID NO:36-38所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:39-41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或所述VH包含SEQ ID NO:42-44所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:45-47所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：所述VH包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述VH包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或所述VH包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述参比抗体包括抗体32-1,12-5和12-8。
在某些实施方式中，所述参比抗体的浓度为50ng/ml-1000ng/ml。
在某些实施方式中，所述样品选自下组：尿液、唾液、血清、血浆、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。
在某些实施方式中，所述样品源自受试者。
在某些实施方式中，所述受试者为COVID-19康复患者、健康受试者和/或接受过COVID-19疫苗治疗的受试者。
另一方面，本申请一种用于检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其包括：
1)包被ACE2受体蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
2)将待测样品与SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段混合并孵育，得到孵育后产物；
3)将步骤2)所述孵育后产物加入步骤1)中；
4)检测所述待测样品中SARS-CoV-2中和抗体；
其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD，且所述RBD包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述RBD的存在和/或含量的信号。
在某些实施方式中，所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
在某些实施方式中，所述RBD与Fc区直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述RBD与所述Fc在框内融合。
在某些实施方式中，所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml-4000ng/ml。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与Fc区直接或间接连接。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与所述Fc区在框内融合。
在某些实施方式中，所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的浓度为100ng/ml-2000ng/ml。
在某些实施方式中，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的pH为6.0-9.6。
在某些实施方式中，所述检测是通过与校准品的比较获得，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段；所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中：所述VH包含SEQ ID NO:30-32所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:33-35所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；所述VH包含SEQ ID NO:36-38所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:39-41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或所述VH包含SEQ ID NO:42-44所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQID NO:45-47所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在某些实施方式中，所述检测是通过与校准品的比较获得，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段；所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：所述VH包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；所述VH包含SEQ IDNO:24所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或所述VH包含SEQID NO:27所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述参比抗体包括抗体32-1,12-5和12-8。
在某些实施方式中，所述参比抗体的浓度为50ng/ml-1000ng/ml。
在某些实施方式中，所述待测样品选自下组：尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。
在某些实施方式中，所述待测样品源自受试者。
在某些实施方式中，所述受试者为COVID-19康复患者、健康受试者和/或接受过COVID-19疫苗治疗的受试者。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述校准品模拟出的中和抗体在人体内含量变化的趋势；
图2显示的是本申请所述Cutoff值的ROC曲线。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“样品”通常是指含有或假定含有抗体，尤其是包含SARS-CoV-2中和抗体的任何物质。“样品”可以是天然或合成来源的，并且可以通过本领域技术人员已知的任何方式获得。“样品”可以是从受试者分离的组织或液体样品，包括但不限于尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。样品可以是研究样品和临床样品。样品也可以是用于输血或治疗的血液样品。样品也可以是合成的并且包括但不限于体外细胞培养成分，包括但不限于条件培养基、重组细胞和细胞组分。在本申请中，术语“样品”和“样本”可以互换使用。
在本申请中，术语“检测”通常是指发现某物的存在或出现。
在本申请中，术语“抗原”通常是指促使抗体产生并且可以引起免疫反应的物质。它们还可以用于诊断或患者选择或表征目的。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体(全人源抗体)、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本文所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体中发挥特异性结合抗原功能的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可通过抗体的全长片段来实现。抗体的抗原结合功能也可通过以下片段来实现：包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的重链，或者，包括Fv、ScFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2的片段的轻链。(1)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH结构域组成的一价片段；(2)F(ab’)2片段，包含通过铰链区处的二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(3)由VH和CH结构域组成的Fd片段；(4)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(5)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；(6)分离的互补决定区(CDR)和(7)可任选的通过接头连接的两个或以上分离的CDR的组合。此外，还可包括由VL和VH配对形成的一价单链分子Fv(scFv)(参见Bird等(1988)Science 242：423-426；以及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。所述“抗原结合部分”还可包括免疫球蛋白融合蛋白，所述融合蛋白包含选自以下的结合结构域：(1)与免疫球蛋白铰链区多肽融合的结合结构域多肽；(2)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区；和(3)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。
在本申请中，术语“受试者”通常是指任何生物，包括但不限于哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔和灵长类动物。在本申请中，受试者可以是人类、宠物或家畜。在本申请中，受试者可以是COVID-19康复患者、健康受试者和/或接受过COVID-19疫苗治疗的受试者。
在本申请中，术语“RBD”是指SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域。在本申请中，所述RBD可为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的突变体或截短体。在本申请中，所述截短体通常是指少于整体的任何事物。例如，截短体少于参比序列至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在本申请中，“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。在本申请中，截短体或突变体可以天然存在或非天然存在。可以用本领域已知的技术来生成非天然存在的截短体或突变体。
在本申请中，术语“SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段”通常是指冠状病毒的衣壳表面糖蛋白。SARS-COV-2通过SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2受体结合并侵入细胞。SARS-CoV-2刺突蛋白含有一个跨膜区，包含来自冠状病毒的衣壳表面糖蛋白从N端起或从第14位氨基酸起至少到1213氨基酸片段，或者来自其它SAS病毒的相应区域。在本申请中，SARS-CoV-2刺突蛋白可以是三聚体全长SARS-CoV-2刺突蛋白。在本申请中，SARS-CoV-2刺突蛋白可以是全长SARS-CoV-2刺突蛋白。
在本申请中，术语“ACE2受体蛋白或其功能活性片段”通常是指冠状病毒刺突蛋白的功能受体。在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白可以是人ACE2受体蛋白。例如，ACE2受体蛋白序列可以在Uniprot登录号Q9BYF1中找到。
在本申请中，术语“功能活性片段”通常是指保留与其更大对应物相同活性或能力的较大多肽或多核苷酸的片段。功能活性片段的活性水平可以与所述更大对应物的活性相同，或比它更小或更大。例如，SARS-CoV-2刺突蛋白的功能活性片段可以是这样的多肽，其由比全长SARS-CoV-2刺突蛋白更少的氨基酸组成，但是仍然可以保留全长SARS-CoV-2刺突蛋白的活性。又例如，人ACE2受体蛋白的功能活性片段可以是这样的多肽，其由比全长人ACE2受体蛋白更少的氨基酸组成，但是仍可以保留全长人ACE2受体蛋白的活性。
在本申请中，术语“Fc区”或“Fc”通常是指免疫球蛋白重链的C末端区，其含有恒定区的至少一部分。Fc区包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一些实施方式中，所述Fc区可以与SARS-CoV-2刺突蛋白直接或间接连接。在一些实施方式中，所述Fc区可以与SARS-CoV-2刺突蛋白在框内融合。在一些实施方式中，所述Fc区可与ACE2受体蛋白直接或间接连接。在一些实施方式中，所述Fc区可与ACE2受体蛋白在框内融合。在本申请中，Fc区包括人或非人(例如大鼠、小鼠、兔)的Fc区。例如，Fc区可以包括兔Fc区(rFc)。例如，Fc区可包括小鼠的Fc区(mFc)。例如，Fc区可包括人Fc区(hFc)。
在本申请中，“框内融合(in-frame fusion)”通常是指以维持原始ORF正确阅读框的方式，将两个或多个开放阅读框(ORF)连接起来以形成连续的较长ORF。因此，所得的“融合多肽”是包含两个或更多个片段的单一蛋白质，所述两个或更多个片段对应于原始ORF编码的多肽(该片段通常在自然界中不是这样连接的)。“融合位点”是指两个或更多个片段连接在一起的序列。在某些情况下，融合位点可以是与两个或更多个要连接的片段中的序列相同的序列。在一些情况下，融合位点可以进一步包含与被连接的两个或更多个片段的序列中的任一个都不相同的空位片段。
发明详述
检测试剂盒
一方面，本申请提供一种SARS-CoV-2中和抗体的检测试剂盒，其可包含：
1)SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段；以及
2)竞争结合剂，所述竞争结合剂包含能够与所述SARS-CoV-2中和抗体竞争结合所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的物质。
在本申请中，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含受体结合区RBD。
在本申请中，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含全长SARS-CoV-2刺突蛋白。
在本申请中，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含三聚体全长SARS-CoV-2刺突蛋白。
例如，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。例如，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含受体结合区RBD，且所述RBD可与Fc区直接或间接连接。
在本申请中，所述RBD可与所述Fc在框内融合。在本申请中，所述Fc可选自下组：rFc、mFc和hFc。
在本申请中，所述RBD可与Fc区直接或间接连接。在本申请中，所述Fc可为rFc。
在本申请中，所述RBD可与Fc区直接或间接连接。在本申请中，所述Fc可为mFc。
在本申请中，所述RBD可与Fc区直接或间接连接。在本申请中，所述Fc可为hFc。
例如，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。例如，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。例如，所述的SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可以包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可为50ng/ml-4000ng/ml。例如，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可以为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml、2500ng/ml、3000ng/ml、3500ng/ml或4000ng/ml。
在本申请中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可固定在固体支持物上。
在本申请中，所述固体支持物可以是反应板或酶标板(适应于ELISA测定的反应板或酶标板)。
在本申请中，所述竞争结合剂可包含ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述竞争结合剂可包含已知的RBD中和抗体。
在本申请中，所述ACE2受体蛋白可包含人ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在本申请中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含胞外域ECD。
在本申请中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可与Fc区直接或间接连接。
在本申请中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可与所述Fc区在框内融合。
在本申请中，所述Fc区可选自下组：rFc、mFc和hFc。
在本申请中，所述Fc区可以为rFc。在本申请中，所述Fc区可以为mFc。在本申请中，所述Fc区可以为hFc。
在本申请中，所述竞争结合剂可包含SEQ ID NO:1-5中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述的竞争结合剂以包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。例如，所述的竞争结合剂可以包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。例如，所述的竞争结合剂可以包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述竞争结合剂可包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。例如，所述标记物可包含辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。例如，所述标记物可以是辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、葡萄糖氧化酶或β半乳糖苷酶β-Galactosidase。在一些实施方案中，所述标记物可以是辣根过氧化物酶(HRP)。
在本申请中，所述竞争结合剂可包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶以及选自下组的一种或多种标记物：AVI标签、生物素，荧光素和链霉亲和素。
例如，所述竞争结合剂可包含HRP、AVI标签、链霉亲和素。
在本申请中，所述竞争结合剂的浓度可为100ng/ml-2000ng/ml。例如，所述竞争结合剂的浓度可为100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、1800ng/ml、1900ng/ml或2000ng/ml。
在本申请中，所述试剂盒可包括样本稀释液，所述样本稀释液的pH可为6.0-9.6。例如，所述样本稀释液的pH可为6.0、6.1、6.2、6.3、6.5、7.0、7.5、7.8、8.0、8.5、9.0、9.5或9.6。
例如，所述样本稀释液的pH可为6.0。
在本申请中，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品可包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
在本申请中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
在本申请中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
另一方面，本申请提供一种SARS-CoV-2中和抗体的检测试剂盒，其与前述试剂盒的区别在于所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含一种或多种标记物，所述标记物可以直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。例如，所述竞争结合剂可以不含标记物。
参比抗体
在本申请中，所述参比抗体可包括抗体32-1、12-5和12-8。
例如，本申请所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。其中，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列或其变体；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列或其变体；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR1可包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列或其变体。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体32-1或与其具有相同的HCDR1-3及LCDR1-3的抗体。在本申请中，所述VH可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列或其变体；且所述VL可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列或其变体。在本申请中，所述编码VH的核酸序列可包含SEQ ID NO:12所示的序列；且所述编码VL的核酸序列可包含SEQ ID NO:13所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体32-1或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，本申请所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链恒定区CH和轻链恒定区CL。在本申请中，所述CH可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其变体；且所述CL可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其变体。在本申请中，所述编码CH的核酸序列可包含SEQ ID NO:20所示的序列；且所述编码CL的核酸序列可包含SEQ ID NO:14所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体32-1或与其具有相同的重链恒定区及轻链恒定区的抗体。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体可以为32-1。抗体32-1的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别包含SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列；VH可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别包含SEQ ID NO:33、SEQID NO:34和SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；VL可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。其中，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列或其变体；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列或其变体；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR1可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列或其变体。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包含抗体12-5或与其具有相同的HCDR1-3及LCDR1-3的抗体。在本申请中，所述VH可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列或其变体；且所述VL可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列或其变体。在本申请中，所述编码VH的核酸序列可包含SEQ ID NO:15所示的序列；且所述编码VL的核酸序列可包含SEQ ID NO:16所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体12-5或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，本申请所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链恒定区CH和轻链恒定区CL。在本申请中，所述CH可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其变体；且所述CL可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列或其变体。在本申请中，所述编码CH的核酸序列可包含SEQ ID NO:20所示的序列；且所述编码CL的核酸序列可包含SEQ ID NO:17所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体12-5或与其具有相同的重链恒定区及轻链恒定区的抗体。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体可以为12-5。抗体12-5的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别包含SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；VH可包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别包含SEQ ID NO:39、SEQID NO:40和SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；VL可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
例如，本申请所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区VH和轻链可变区VL，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。其中，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列或其变体；所述HCDR2可包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其变体；所述HCDR3可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR1可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR2可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列或其变体；所述LCDR3可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列或其变体。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包含抗体12-8或与其具有相同的HCDR1-3及LCDR1-3的抗体。在本申请中，所述VH可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列或其变体；且所述VL可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列或其变体。在本申请中，所述编码VH的核酸序列可包含SEQ ID NO:18所示的序列；且所述编码VL的核酸序列可包含SEQ ID NO:19所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体12-8或与其具有相同的轻链可变区及重链可变区的抗体。例如，本申请所述的参比抗体或其抗原结合片段可包含重链恒定区CH和轻链恒定区CL。在本申请中，所述CH可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列或其变体；且所述CL可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列或其变体。在本申请中，所述编码CH的核酸序列可包含SEQ ID NO:20所示的序列；且所述编码CL的核酸序列可包含SEQ ID NO:14所示的序列。例如，该参比抗体或其抗原结合片段可包括抗体12-8或与其具有相同的重链恒定区及轻链恒定区的抗体。
在一些实施方式中，本申请所述的抗体可以为12-8。抗体12-8的HCDR1、HCDR2和HCDR3可分别包含SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；VH可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列；LCDR1、LCDR2和LCDR3可分别包含SEQ ID NO:45、SEQID NO:46和SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；VL可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述参比抗体的浓度可以为50ng/ml-1000ng/ml。例如，所述参比抗体的浓度可以为50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml和1000ng/ml。
检测方法
另一方面，本申请提供了一种用于检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其可包括：
使用所述的试剂盒。
另一方面，本申请提供了一种检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其可包括：
1)包被SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
2)将待测样品加入步骤1)中与所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段反应；
3)将竞争结合剂加入步骤2)中；
4)检测所述待测样品中SARS-CoV-2中和抗体；
其中，所述竞争结合剂可包含能够与所述SARS-CoV-2中和抗体竞争结合所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的物质；所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含受体结合区RBD；所述竞争结合剂可包含ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含全长SARS-CoV-2刺突蛋白。在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含三聚体全长SARS-COV-2刺突蛋白。
在一些实施方式中，所述RBD可与Fc区直接或间接连接。在一些实施方式中，所述RBD可与所述Fc在框内融合。
在一些实施方式中，所述Fc区可选自下组：rFc、mFc和hFc。例如，所述Fc区可以是rFc。例如，所述Fc区可以是mFc。例如，所述Fc区可以是hFc。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可为50ng/ml-4000ng/ml。例如可以是50ng/ml-3500ng/ml、50ng/ml-3000ng/ml、50ng/ml-2000ng/ml、50ng/ml-1500ng/ml、50ng/ml-1000ng/ml、50ng/ml-900ng/ml或50ng/ml-800ng/ml。例如，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可以为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、2000ng/ml、2500ng/ml、3000ng/ml、3500ng/ml或4000ng/ml。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含人ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含胞外域ECD。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可与Fc区直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可与所述Fc区在框内融合。
在一些实施方式中，所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。例如，是rFc。例如，是mFc。例如，是hFc。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
在一些实施方式中，所述标记物可包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的反应浓度可以为100ng/ml-2000ng/ml。例如可以是100ng/ml-1500ng/ml、100ng/ml-1000ng/ml、100ng/ml-800ng/ml、500ng/ml-2000ng/ml、500ng/ml-1500ng/ml、500ng/ml-1000ng/ml或500ng/ml-800ng/ml。例如可以是200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml或2000ng/ml。
在一些实施方式中，所述RBD的包被浓度可以为50ng/ml-4000ng/ml。例如可以是50ng/ml-3500ng/ml、50ng/ml-3000ng/ml、50ng/ml-2000ng/ml、50ng/ml-1500ng/ml、50ng/ml-1000ng/ml、50ng/ml-900ng/ml或50ng/ml-800ng/ml。例如可以是50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml、800ng/ml、900ng/ml或1000ng/ml。
在一些实施方式中，当所述RBD的包被浓度可以为50ng/ml-4000ng/ml时，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的反应浓度可以为500ng/ml-1500ng/ml。
在一些实施方式中，其可包括样本稀释液，所述样本稀释液的pH可为6.0-9.6。
在一些实施方式中，其还可以包括校准品，所述校准品可包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
在一些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
在一些实施方式中，所述参比抗体可以包括抗体32-1,12-5和12-8。
在一些实施方式中，所述参比抗体的浓度可为50ng/ml-1000ng/ml。
在另一方面，本申请提供了一种用于检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其可包括：
1)包被ACE2受体蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
2)将待测样品与SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段混合并孵育，得到孵育后产物；
3)将步骤2)所述孵育后产物加入步骤1)中；
4)检测所述待测样品中SARS-CoV-2中和抗体；
其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含受体结合区RBD，且所述RBD可包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述RBD的存在和/或含量的信号。
在一些实施方式中，所述标记物可包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
在一些实施方式中，所述RBD可与Fc区直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述RBD可与所述Fc在框内融合。
在一些实施方式中，所述Fc区可选自下组：rFc、mFc和hFc。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段可包含SEQ IDNO:11所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度可以为50ng/ml-4000ng/ml。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可与Fc区直接或间接连接。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可与所述Fc区在框内融合。
在一些实施方式中，所述Fc区可选自下组：rFc、mFc和hFc。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的包被浓度可以为1μg/ml-20μg/ml。例如可以是1μg/ml-15μg/ml、1μg/ml-10μg/ml、1μg/ml-8μg/ml、1μg/ml-7μg/ml、1μg/ml-6μg/ml或1μg/ml-5μg/ml。例如可以是2μg/ml-10μg/ml、2μg/ml-8μg/ml、2μg/ml-6μg/ml、3μg/ml-10μg/ml、3μg/ml-8μg/ml或3μg/ml-6μg/ml。例如可以是1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml、15μg/ml或20μg/ml。
在一些实施方式中，所述RBD的反应浓度可以为10ng/ml-200ng/ml。例如可以是10ng/ml-150ng/ml、10ng/ml-100ng/ml、10ng/ml-80ng/ml、10ng/ml-50ng/ml、10ng/ml-40ng/ml、10ng/ml-30ng/ml或10ng/ml-20ng/ml。例如可以是20ng/ml-150ng/ml、20ng/ml-100ng/ml、20ng/ml-80ng/ml、20ng/ml-50ng/ml、20ng/ml-40ng/ml或20ng/ml-30ng/ml。例如可以是10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、400ng/ml、90ng/ml或100ng/ml。
在一些实施方式中，当所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的包被浓度可以为1μg/ml-10μg/ml时，所述RBD的反应浓度可为20ng/ml-150ng/ml。
在一些实施方式中，当所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的包被浓度可以为3μg/ml-6μg/ml时，所述RBD的反应浓度可以为20ng/ml-40ng/ml。
在一些实施方式中，其可包括样本稀释液，所述样本稀释液的pH可为6.0-9.6。
在一些实施方式中，其还可以包括校准品，所述校准品可包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
在一些实施方式中，所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段可特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
在一些实施方式中，所述参比抗体可包括抗体32-1,12-5和12-8。
在一些实施方式中，所述参比抗体的浓度可以为50ng/ml-1000ng/ml。
在本申请中，所述样品可以是天然或合成来源的，并且可以通过本领域技术人员已知的任何方式获得。例如，所述样品可以是从受试者分离的组织或液体样品，包括但不限于尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。例如，所述样品可以是研究样品和临床样品。例如，所述样品也可以是用于输血或治疗的血液样品。例如，所述样品也可以是合成的并且包括但不限于体外细胞培养成分，包括但不限于条件培养基、重组细胞和细胞组分。在本申请中，术语“样品”和“样本”可以互换使用。
在本申请中，所述样品源自受试者。在本申请中，所述受试者通常是指任何生物，包括但不限于哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗、豚鼠、雪貂、兔和灵长类动物。在本申请中，受试者可以是人类、宠物或家畜。在本申请中，所述受试者可以为COVID-19康复患者、健康受试者和/或接受过COVID-19疫苗治疗的受试者。
在一些实施方式中，所述的方法可包括以下步骤：
步骤一，包被抗原：用包被液稀释SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段，将SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段稀释液加入到反应板酶标孔中。
步骤二，加待测样品，孵育30-60分钟(例如，孵育30分钟、孵育35分钟、孵育40分钟、孵育45分钟、孵育50分钟、孵育55分钟或孵育60分钟)。
步骤三，加竞争结合剂，孵育30-60分钟(例如孵育30分钟、孵育35分钟、孵育40分钟、孵育45分钟、孵育50分钟、孵育55分钟或孵育60分钟)。
步骤四，显色，终止读数。
在一些实施方式中，待测样品可在35℃-40℃环境中孵育(例如，孵育温度可为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃、37.5℃、37.6℃、37.7℃、37.8℃、37.9℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃)。
在一些实施方式中，竞争结合剂可在35℃-40℃环境中孵育(例如，孵育温度可为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃、37.5℃、37.6℃、37.7℃、37.8℃、37.9℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃)。
在一些实施方式中，显色过程可在35℃-40℃环境中进行(例如，可为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、37℃、37.1℃、37.2℃、37.3℃、37.4℃、37.5℃、37.6℃、37.7℃、37.8℃、37.9℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃)。
本发明的一些实施方案：
1.一种SARS-CoV-2中和抗体的检测试剂盒，其包含：
1)SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段；以及
2)竞争结合剂，所述竞争结合剂包含能够与所述SARS-CoV-2中和抗体竞争结合所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的物质。
2.根据实施方案1所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD。
3.根据实施方案1-2中任一项所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含全长SARS-CoV-2刺突蛋白。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含三聚体全长SARS-COV-2刺突蛋白。
5.根据实施方案2-4中任一项所述的试剂盒，其中所述RBD与Fc直接或间接连接。
6.根据实施方案5所述的试剂盒，其中所述RBD与所述Fc在框内融合。
7.根据实施方案5-6中任一项所述的试剂盒，其中所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
8.根据实施方案7所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
9.根据实施方案7所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
10.根据实施方案7所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
11.根据实施方案3所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
12.根据实施方案4所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
13.根据实施方案1-12中任一项所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
14.根据实施方案13所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含人ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
15.根据实施方案13-14中任一项所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ECD。
16.根据实施方案13-15中任一项所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与Fc区直接或间接连接。
17.根据实施方案16所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与所述Fc区在框内融合。
18.根据实施方案16-17中任一项所述的试剂盒，其中所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
19.根据实施方案18所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案18所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
21.根据实施方案18所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
22.根据实施方案13所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。
23.根据实施方案22所述的试剂盒，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
24.根据实施方案1-23中任一项所述的试剂盒，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的pH为6.0-9.6。
25.根据实施方案1-24中任一项所述的试剂盒，其还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
26.根据实施方案25所述的试剂盒，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
27.根据实施方案25所述的试剂盒，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
28.根据实施方案25-27中任一项所述的试剂盒，所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：
所述VH包含SEQ ID NO:30-32所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:33-35所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
所述VH包含SEQ ID NO:36-38所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:39-41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO:42-44所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:45-47所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
29.根据实施方案25-28中任一项所述的试剂盒，其中所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：
所述VH包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
所述VH包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或
所述VH包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
30.根据实施方案25-29中任一项所述的试剂盒，其中所述参比抗体包括抗体32-1,12-5和12-8。
31.根据实施方案25-30中任一项所述的试剂盒，其中所述参比抗体的浓度为50ng/ml-1000ng/ml。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
33.根据实施方案32所述的试剂盒，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
34.一种用于检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其包括：
使用实施方案1或13所述的试剂盒。
35.一种用于检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其包括：
1)包被SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
2)将待测样品加入步骤1)中与所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段反应；
3)将竞争结合剂加入步骤2)中；
4)检测所述待测样品中SARS-CoV-2中和抗体；
其中，所述竞争结合剂包含能够与所述SARS-CoV-2中和抗体竞争结合所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的物质；
所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD；所述竞争结合剂包含ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
36.根据实施方案35所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含全长SARS-CoV-2刺突蛋白。
37.根据实施方案35-36中任一项所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含三聚体全长SARS-COV-2刺突蛋白。
38.根据实施方案35-37中任一项所述的方法，其中所述RBD与Fc区直接或间接连接。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述RBD与所述Fc在框内融合。
40.根据实施方案38-39中任一项所述的方法，其中所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
41.根据实施方案40所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
42.根据实施方案40所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
43.根据实施方案40所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
44.根据实施方案36所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
45.根据实施方案37所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
46.根据实施方案35-45中任一项所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml-4000ng/ml。
47.根据实施方案35-46任一项所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含人ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
48.根据实施方案47所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ECD。
49.根据实施方案47-48中任一项所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与Fc区直接或间接连接。
50.根据实施方案49所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与所述Fc区在框内融合。
51.根据实施方案49-50中任一项所述的方法，其中所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
52.根据实施方案51所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
53.根据实施方案51所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
54.根据实施方案51所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
55.根据实施方案35-54中任一项所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
56.根据实施方案55所述的方法，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
57.根据实施方案35-56中任一项所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的浓度为100ng/ml-2000ng/ml。
58.根据实施方案35-57中任一项所述的方法，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的pH为6.0-9.6。
59.根据实施方案35-58中任一项所述的方法，其还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
61.根据实施方案59所述的方法，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
62.根据实施方案59-61中任一项所述的方法，所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：
所述VH包含SEQ ID NO:30-32所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:33-35所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
所述VH包含SEQ ID NO:36-38所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:39-41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO:42-44所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:45-47所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
63.根据实施方案59-62任一项所述的方法，其中所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：
所述VH包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
所述VH包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或
所述VH包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
64.根据实施方案59-63中任一项所述的方法，其中所述参比抗体包括抗体32-1,12-5和12-8。
65.根据实施方案59-64中任一项所述的方法，其中所述参比抗体的浓度为50ng/ml-1000ng/ml。
66.根据实施方案35所述的方法，其中所述样品选自下组：尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述样品源自受试者。
68.根据实施方案67所述的方法，其中所述受试者为COVID-19康复患者、健康受试者和/或接受过COVID-19疫苗治疗的受试者。
69.一种用于检测样品中SARS-CoV-2中和抗体的方法，其包括：
1)包被ACE2受体蛋白或其功能活性片段于固体支持物中；
2)将待测样品与SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段混合并孵育，得到孵育后产物；
3)将步骤2)所述孵育后产物加入步骤1)中；
4)检测所述待测样品中SARS-CoV-2中和抗体；
其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD，且所述RBD包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述RBD的存在和/或含量的信号。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
71.根据实施方案69-70中任一项所述的方法，其中所述RBD与Fc区直接或间接连接。
72.根据实施方案71所述的方法，其中所述RBD与所述Fc在框内融合。
73.根据实施方案71-72中任一项所述的方法，其中所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
74.根据实施方案73所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
75.根据实施方案73所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
76.根据实施方案73所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
77.根据实施方案69所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
78.根据实施方案69所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
79.根据实施方案69-78中任一项所述的方法，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml-4000ng/ml。
80.根据实施方案69-79所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与Fc区直接或间接连接。
81.根据实施方案80所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与所述Fc区在框内融合。
82.根据实施方案80-81中任一项所述的方法，其中所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
83.根据实施方案82所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
84.根据实施方案82所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
85.根据实施方案82所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
86.根据实施方案69-85中任一项所述的方法，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段的浓度为100ng/ml-2000ng/ml。
87.根据实施方案69-86中任一项所述的方法，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的pH为6.0-9.6。
88.根据实施方案69-87中任一项所述的方法，所述检测是通过与校准品的比较获得，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段；所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL，其中：
所述VH包含SEQ ID NO:30-32所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:33-35所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
所述VH包含SEQ ID NO:36-38所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:39-41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO:42-44所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:45-47所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
89.根据实施方案88所述的方法，所述检测是通过与校准品的比较获得，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段；所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：
所述VH包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
所述VH包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或
所述VH包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
90.根据实施方案88-89中任一项所述的方法，其中所述参比抗体包括抗体32-1,12-5和12-8。
91.根据实施方案88-90中任一项所述的方法，其中所述参比抗体的浓度为50ng/ml-1000ng/ml。
92.根据实施方案69所述的方法，其中所述待测样品选自下组：尿液、唾液、血清、血浆、全血、鼻咽吸出物和支气管灌洗液。
93.根据实施方案92所述的方法，其中所述待测样品源自受试者。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述受试者为COVID-19康复患者、健康受试者和/或接受过COVID-19疫苗治疗的受试者。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1SARS-CoV-2中和抗体的ELISA测试方法
1.1辣根过氧化物酶(HRP)的活化：将辣根过氧化物酶(HRP)粉末溶解于ddH2O中配制成10mg/ml辣根过氧化物酶(HRP)溶液，高碘酸钠粉末溶解于ddH2O中配制成0.1M高碘酸钠溶液，将辣根过氧化物酶(HRP)溶液与高碘酸钠溶液按体积比1：0.51混匀，2-8℃避光1小时；加入0.26倍辣根过氧化物酶(HRP)溶液体积的乙二醇，2-8℃避光20分钟；50mL超滤管6000-7500rpm离心10-20分钟；1mM醋酸缓冲液，离心3-5次；-80℃保存。
1.2辣根过氧化物酶(HRP)标记人ACE2受体蛋白：按质量比1：4加入人ACE2受体蛋白和活化好的辣根过氧化物酶(HRP)，加入人ACE2受体蛋白与辣根过氧化物酶(HRP)体积总量1/5的碳酸钠缓冲液(pH9.6)，室温避光放置1小时；加入1/10辣根过氧化物酶(HRP)体积的还原剂，室温避光放置1小时；加入1/10辣根过氧化物酶(HRP)体积的终止剂，室温避光放置30分钟，即可使用或4℃保存。
1.3包被抗原：使用1x包被液(10x包被液为15.9g/LNa2CO3+29.3g/LNaHCO3，用ddH2O稀释至1x使用)将RBD抗原稀释至0.3μg/mL并充分混匀，将RBD抗原稀释液加到反应板酶标孔中，每孔100μL，将反应板加盖放于4℃过夜包被，上层为液体，包被后的RBD抗原吸附在反应板上。
1.4封闭：用1x洗涤液(20x洗涤液为2.4g/L KH2PO4+29g/L NaHPO4·12H2O+160g/LNaCl+4g/L KCl+10mL/L Tween-20+2.24g/LP300，用ddH2O稀释至1x使用)每孔350μL冲洗反应板一次以洗去包被液，在吸水纸上将反应板中洗涤液拍干，每孔迅速加入100～200μL封闭液(104.5g/L 10x PBS+10g/L Casein+50g/L蔗糖+2.24g/L P300)，置于37℃培养箱，孵育2h；倒去封闭液，甩板机甩干或在吸水纸上拍干封闭液，即可使用反应板，如不立即使用，反应板应放于密封袋中并加入干燥包置于2～8℃保存，干燥包需位于反应板板底，不能接触反应板孔。
1.5加待测样品：将所有组分包括待测血清提前拿出平衡至室温，反应板平衡至室温后从密封袋中拿出，每孔加入80μL样本稀释液(0.02M PBS+0.9％NaCl+0.5％BSA+0.1％Tween-20+0.2％P300，pH7.4)，然后加入20μL校准品(校准品为不同浓度的抗体，浓度分别为1000ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL和50ng/mL，详见实施例6)、20μL待测血清至相应已加入样本稀释液的孔中，贴好板贴，在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀，置于37℃培养箱，孵育0.5小时。
1.6加酶标结合物：使用样本稀释液按1：3000稀释ACE2-HRP(初始浓度为5mg/mL)，小心揭下板贴，每孔加入100μL稀释好的ACE2-HRP，更换板贴并贴好，在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀，置于37℃培养箱，孵育0.5小时。
1.7洗板：小心揭下板贴，用1x洗涤液冲洗反应板六次(推荐使用洗板机，每孔加液量350μL)，最后在吸水纸上拍干或甩板机甩干。
1.8显色：将显色A液(2.1g/L一水合柠檬酸+8.448g/L醋酸钠+0.5g/L过氧化脲+0.08g/L EDTA+2mL/L P300)和B液(10mL/L 100x基础buffer(105.6g/L一水合柠檬酸+10.3g/L醋酸钠+2mL/L P300)+100mL/L甘油+0.5g/L TMB盐酸盐+1.67mL/LNa2S2O3(20mg/mL)+2mL/L P300)按体积比1:1混匀成显色工作液，每孔加入显色工作液100μL，更换板贴并贴好，置于37℃避光反应10分钟。
1.9读数：
小心揭下板贴，每孔加入终止液(252.5g/L一水合柠檬酸+26.6mL/L浓硫酸)50μL终止反应，用酶标仪450nm单波长检测，测定各孔的吸光值。
1.10临界值确定：利用上述方法检测待测血清，当样品抑制率>15％时判定样品为阳性，当样品抑制率<15％时判定样品为阴性，抑制率＝(1-待测样品吸光值/阴性对照吸光值)x100％，抑制率反映了待测血清中抗体的中和效率。
实施例2SARS-CoV-2中和抗体的ELISA测试方法
本实施例中未特别说明的步骤及其对应试剂，与实施例1相同。
1.1辣根过氧化物酶(HRP)的活化：将辣根过氧化物酶(HRP)粉末溶解于ddH2O中配制成10mg/ml辣根过氧化物酶(HRP)溶液，高碘酸钠粉末溶解于ddH2O中配制成0.1M高碘酸钠溶液，将辣根过氧化物酶(HRP)溶液与高碘酸钠溶液按体积比1：0.51混匀，2-8度避光1小时；加入0.26倍辣根过氧化物酶(HRP)溶液体积的乙二醇，2-8℃避光20分钟；50ml超滤管6000-7500rpm离心10-20分钟；1mM醋酸缓冲液，离心3-5次；-80℃保存。
1.2辣根过氧化物酶(HRP)标记RBD蛋白：按质量比1：4加入RBD蛋白和活化好的辣根过氧化物酶(HRP)，加入RBD蛋白与辣根过氧化物酶(HRP)体积总量1/5的碳酸钠缓冲液(pH9.6)，室温避光放置1小时；加入1/10辣根过氧化物酶(HRP)体积的还原剂，室温避光放置1小时；加入1/10辣根过氧化物酶(HRP)体积的终止剂，室温避光放置30分钟，即可使用或4℃保存。
1.3包被蛋白：使用1x包被液将ACE2蛋白稀释至0.3μg/mL并充分混匀，将ACE2蛋白稀释液加到反应板酶标孔中，每孔100μL，将反应板加盖放于4℃过夜包被，上层为液体，包被后的ACE2蛋白吸附在反应板上。
1.4封闭：用1x洗涤液每孔350μL冲洗反应板一次以洗去包被液，在吸水纸上将反应板中洗涤液拍干，每孔迅速加入100～200μL封闭液，置于37℃培养箱，孵育2h；倒去封闭液，甩板机甩干或在吸水纸上拍干封闭液，即可使用反应板，如不立即使用，反应板应放于密封袋中并加入干燥包置于2～8℃保存，干燥包需位于反应板板底，不能接触反应板孔。
1.5加待测样品：将所有组分包括样品提前拿出平衡至室温，反应板平衡至室温后从密封袋中拿出，样品用样本稀释液两倍梯度稀释后，每孔分别加入10μL阳性对照、阴性对照以及一系列不同稀释倍数的样品，并加入90μL样本稀释液。
1.6加酶标结合物：使用样本稀释液将RBD-HRP稀释至所需浓度(初始浓度为5mg/mL)，每孔加入100μL稀释好的RBD-HRP，贴好板贴，在微型振荡器上振荡60秒使孔内液体混合均匀，置于37℃培养箱，孵育0.5h。
1.7转移：小心揭开板贴，将100μL样本/对照反应液由96孔PCR板中转移至反应板对应的孔中，贴好板贴，置于37℃培养箱，孵育0.5h。
1.8洗板：小心揭下板贴，用1x洗涤液冲洗反应板六次(推荐使用洗板机，每孔加液量350μL)，最后在吸水纸上拍干或甩板机甩干。
1.9显色：将显色A液和B液按体积比1:1混匀成显色工作液，每孔加入显色工作液100μL，更换板贴并贴好，置于37℃避光反应10分钟。
1.10读数：小心揭下板贴，每孔加入终止液50μL终止反应，用酶标仪450nm单波长检测，测定各孔的吸光值。
1.11滴度值确定：利用上述方法检测样品，当在某稀释倍数下此样品的抑制率>15％，在该稀释倍数的下一稀释梯度下该样品抑制率<15％时，则该稀释度为此样品的滴度。滴度为仍能产生阳性结果的最大稀释度，反映了抗体的效价。
实施例3不同pH样本稀释液对检测结果的影响
通过改变样本稀释液的pH减少血清样本的非特异性结合。如表1所示，分别使用pH6.0、pH7.8、pH9.6样本稀释液，按照实施例1的检测步骤，使用RBD-mFc包被板和辣根过氧化物酶(HRP)标记ACE2-mFc，检测非SARS-CoV-2感染人血清样本即阴性血清，比较不同pH的样品稀释液稀释的阳性血清的抑制率以及阴性血清的抑制率。结果表明，pH6.0的通用样本稀释液既可以降低阴性血清中非特异性结合对反应的影响，又不会影响阳性样本的检出。
表1不同pH样本稀释液对检测结果的影响
Figure BDA0003715068590000301
实施例4RBD和ACE2不同分子形式对检测结果的影响
按照建立好的ELISA检测方法(操作步骤同实施例1或实施例2)，在ACE2-mFc包板上加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的RBD-His和RBD-mFc，在RBD-His包板上加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的ACE2-His、ACE2-hFc、ACE2-mFc和ACE2-rFc。每个样品两个重复，分别检测0μg/mLRBD中和抗体和1μg/mL RBD中和抗体。结果如表2所示，选用带有Fc标签的RBD和ACE2，信噪比、稳定性相较于His标签的RBD和ACE2都有显著提高。
表2带不同标签的RBD和ACE2对检测结果的影响
Figure BDA0003715068590000311
实施例5RBD和ACE2用量对检测结果的影响
5.1使用五种不同RBD-mFc浓度的反应板，采用1：2000和1：4000两种稀释比例稀释ACE2-mFc-HRP，按照实施例1的操作步骤，检测25例COVID-19疫苗血清即阳性血清和25例阴性血清，比较不同RBD-mFc包被浓度和ACE2-mFc-HRP稀释比例下的灵敏度、特异性以及线性范围。
5.2使用五种不同全长S蛋白浓度的反应板，操作步骤同5.1，比较不同全长S蛋白包被浓度和ACE2-mFc-HRP稀释比例下的灵敏度、特异性以及线性范围。
5.3使用五种不同三聚体S蛋白浓度的反应板，操作步骤同5.1，比较不同三聚体S蛋白包被浓度和ACE2-mFc-HRP稀释比例下的灵敏度、特异性以及线性范围。
结果表明，通过优化RBD-mFc或者全长S蛋白或者三聚体S蛋白的包板浓度，能够显著提高检测灵敏度，如表3-5所示。
表3RBD-mFc和ACE2-mFc-HRP用量优化结果
Figure BDA0003715068590000321
表4全长S蛋白和ACE2-mFc-HRP用量优化结果
Figure BDA0003715068590000322
表5三聚体S蛋白和ACE2-mFc-HRP用量优化结果
Figure BDA0003715068590000323
ACE2-mFc包被量及RBD-mFc-HRP用量优化
使用三种不同ACE2-mFc浓度的反应板，采用500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml和30ng/ml五种稀释比例稀释RBD-mFc-HRP，按照实施例2的操作步骤，检测梯度稀释浓度抗体，比较不同ACE2-mFc包被浓度和RBD-mFc-HRP稀释比例下的检测线差异。
结果表明，通过优化ACE2-mFc的包板浓度及RBD-mFc-HRP使用浓度，能够显著提高检测灵敏度，结果如表6所示。
表6ACE2-mFc包被量及RBD-HRP用量优化
Figure BDA0003715068590000331
实施例6校准品的选择
通过单B细胞筛选出多株天然人源中和抗体，通过真病毒验证具有良好的中和效果，能很好地模拟人体内中和抗体的天然形式。从中筛选出3株不同表位的抗体进行混合制备标准品，配制六种抗体浓度的校准品，C.1～C.6抗体浓度分别为1000ng/mL、800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL、100ng/mL和50ng/mL。按照实施例1的操作步骤，检测这六种抗体浓度的标准品在450nm处的吸光值。使用Graphpad 6.02版本软件，依据校准品的抗体浓度和吸光值作图。根据结果推测其反应性(反应斜率)更接近真实样本，更能真实的模拟出中和抗体在人体内的含量变化趋势，如图1所示。
实施例7Cutoff值的确定
Cut-off值是被检样本的量值，用于确定结果高于还是低于临床或分析决断点。cut-off值的设定给出了简要的敏感性和特异性组合。Cutoff值的确定是根据27例康复患者血清、1452例非新冠感染人血清样本、72例疫苗血清(三分之一安慰剂)的评测结果，用SPSS软件分析得出，基于这个Cutoff值，按照实施例1的操作步骤，本申请的试剂盒灵敏度>90％、特异性>99％。疫苗效果评价跟真病毒实验结果一致性95％。敏感度：即灵敏度，表示阳性样本的检出率。如0.977表示99.7％的阳性样本可以正确判断为阳性结果。特异性：表示阴性样本的检出率。如0.991表示99.1％阴性样本可以正确判断为阴性结果，检测变量结果如表7所示，接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve，或者叫ROC曲线)如图2所示，曲线坐标和检测结果如表8所示。
表7检测变量结果
Figure BDA0003715068590000341
表8曲线坐标和检验变量结果表
Figure BDA0003715068590000342
序列表
<110> 南京诺唯赞生物科技股份有限公司
<120> 一种检测SARS-CoV-2中和抗体的试剂盒及方法
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 723
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
130 135 140
Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
145 150 155 160
Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
290 295 300
Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
305 310 315 320
Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
325 330 335
Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp Phe
340 345 350
Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala Tyr
355 360 365
Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe His
370 375 380
Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys His
385 390 395 400
Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn Glu
405 410 415
Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly Thr
420 425 430
Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe Lys
435 440 445
Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys
450 455 460
Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr
465 470 475 480
Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
485 490 495
Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu
500 505 510
Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser
515 520 525
Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly
530 535 540
Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys
545 550 555 560
Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
565 570 575
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp
580 585 590
Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys
595 600 605
Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
610 615 620
Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys
625 630 635 640
Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala
645 650 655
Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys
660 665 670
Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg
675 680 685
Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser
690 695 700
Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro
705 710 715 720
Pro Val Ser
<210> 2
<211> 954
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe Asn
1 5 10 15
His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp Asn
20 25 30
Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn Ala
35 40 45
Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln Leu
65 70 75 80
Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
85 90 95
Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser Thr
100 105 110
Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu Glu
115 120 125
Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Arg
130 135 140
Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu Arg
145 150 155 160
Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
195 200 205
Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His
210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
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Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly
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740 745 750
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770 775 780
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His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
820 825 830
Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
835 840 845
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
850 855 860
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
865 870 875 880
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
885 890 895
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
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Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
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20 25 30
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Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala Gln
50 55 60
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Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys Ser
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130 135 140
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Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
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225 230 235 240
Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
245 250 255
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260 265 270
Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
275 280 285
Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu Pro
290 295 300
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305 310 315 320
Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
325 330 335
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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945 950 955
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<211> 740
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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275 280 285
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340 345 350
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Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile
485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys
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675 680 685
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<210> 6
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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1 5 10 15
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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245 250 255
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455
<210> 8
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile
275 280 285
Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln
290 295 300
Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln
305 310 315 320
Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala
325 330 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro
340 345 350
Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser
355 360 365
Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser
370 375 380
Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr
385 390 395 400
Lys Thr Thr Pro Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr
405 410 415
Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe
420 425 430
Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435 440 445
Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 9
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
225 230 235 240
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
275 280 285
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
290 295 300
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
325 330 335
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
340 345 350
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
355 360 365
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
370 375 380
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
385 390 395 400
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
405 410 415
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
420 425 430
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
435 440 445
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 10
<211> 1195
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr
1 5 10 15
Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser
20 25 30
Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn
35 40 45
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys
50 55 60
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr
85 90 95
Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn
100 105 110
Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu
115 120 125
Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe
130 135 140
Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln
145 150 155 160
Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu
165 170 175
Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser
180 185 190
Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser
195 200 205
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210 215 220
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp
225 230 235 240
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys
275 280 285
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
420 425 430
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
435 440 445
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
450 455 460
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
485 490 495
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
500 505 510
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
515 520 525
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys
530 535 540
Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr
545 550 555 560
Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
565 570 575
Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
580 585 590
Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro
595 600 605
Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser
610 615 620
Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala
625 630 635 640
Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly
645 650 655
Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
660 665 670
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
725 730 735
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
740 745 750
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
755 760 765
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
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Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
835 840 845
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
850 855 860
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
865 870 875 880
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
885 890 895
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
900 905 910
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
915 920 925
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
930 935 940
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
945 950 955 960
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
965 970 975
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
980 985 990
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
995 1000 1005
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
1010 1015 1020
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1025 1030 1035 1040
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
1045 1050 1055
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
1060 1065 1070
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
1075 1080 1085
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
1090 1095 1100
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
1105 1110 1115 1120
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
1125 1130 1135
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
1140 1145 1150
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
1155 1160 1165
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
1170 1175 1180
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln
1185 1190 1195
<210> 11
<211> 1224
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr
1 5 10 15
Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser
20 25 30
Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn
35 40 45
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys
50 55 60
Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala
65 70 75 80
Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr
85 90 95
Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn
100 105 110
Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu
115 120 125
Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe
130 135 140
Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln
145 150 155 160
Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu
165 170 175
Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser
180 185 190
Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser
195 200 205
Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg
210 215 220
Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp
225 230 235 240
Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr
245 250 255
Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile
260 265 270
Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys
275 280 285
Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn
290 295 300
Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr
305 310 315 320
Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser
325 330 335
Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr
340 345 350
Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly
355 360 365
Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala
370 375 380
Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
385 390 395 400
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe
405 410 415
Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val
420 425 430
Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu
435 440 445
Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser
450 455 460
Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln
465 470 475 480
Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg
485 490 495
Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys
500 505 510
Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
515 520 525
Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys
530 535 540
Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr
545 550 555 560
Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro
565 570 575
Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser
580 585 590
Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro
595 600 605
Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser
610 615 620
Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala
625 630 635 640
Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly
645 650 655
Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg
660 665 670
Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala
675 680 685
Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn
690 695 700
Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys
705 710 715 720
Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys
725 730 735
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg
740 745 750
Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val
755 760 765
Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe
770 775 780
Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser
785 790 795 800
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala
805 810 815
Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
820 825 830
Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu
835 840 845
Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu
850 855 860
Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala
865 870 875 880
Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile
885 890 895
Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
900 905 910
Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr
915 920 925
Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln
930 935 940
Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile
945 950 955 960
Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala
965 970 975
Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
980 985 990
Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser
995 1000 1005
Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser
1010 1015 1020
Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1025 1030 1035 1040
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro
1045 1050 1055
Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
1060 1065 1070
Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His
1075 1080 1085
Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr
1090 1095 1100
Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val
1105 1110 1115 1120
Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys
1125 1130 1135
Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
1140 1145 1150
Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys
1155 1160 1165
Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu
1170 1175 1180
Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ile
1185 1190 1195 1200
Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu
1205 1210 1215
Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu
1220
<210> 12
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtacag cctctgaaat caacgtcagt agcaactaca tgaactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtt ctttatgccg gtggtaccac atactacgca 180
gactccgtga aggacaggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctt 240
caaatgaaca acctgagagc cgaggacacg gctttctatt actgtgcgag agaggcctat 300
gcttttgata tctggggcca agggacaatg gtcaccgtct cttca 345
<210> 13
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gggcattagc agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaactg cttaatagtt accctccgag caccttcggc 300
caagggacac gactggagat taaa 324
<210> 14
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 15
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaggtgcaac tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttggt gattatgcca tgagctgggt ccgccaagct 120
ccagagaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag gacaggttat 180
gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt attactgtgc gagatatctt 300
cagcactcat attttgactt gttattacct aatgatgctt ttgatatctg gggccaaggg 360
acaatggtca ccgtctcttc a 381
<210> 16
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaattgtgg tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccggggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaactact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag aagactggag 240
gccgaagatt ttgcagtgta ttactgtcaa cagtatggga gctcaccgct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 17
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaac tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 18
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120
ccggggaggg gactggagtg gattgggtat atccattaca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca ggagtcgact caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ccgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt attgtgcgag agatcagggg 300
tatagcagtg gctggcctga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccatc 360
tcttca 366
<210> 19
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactga catcccagcc 180
aggttcagtg acagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcaccag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctgggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 20
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Ile Asn Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Leu Tyr Ala Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Ala Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Leu Asn Ser Tyr Pro Pro
85 90 95
Ser Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 24
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Leu Gln His Ser Tyr Phe Asp Leu Leu Leu Pro Asn Asp
100 105 110
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 25
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Glu Ile Val Val Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Arg Leu Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 27
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gln Gly Tyr Ser Ser Gly Trp Pro Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Asp
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Gly
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Glu Ile Asn Val Ser Ser Asn Tyr
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Leu Tyr Ala Gly Gly Thr Thr
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Ala Arg Glu Ala Tyr Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 34
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Ala Ala Ser
1
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gln Leu Leu Asn Ser Tyr Pro Pro Ser Thr
1 5 10
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr Ala
1 5
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Ile Asn Trp Asn Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 38
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Ala Arg Tyr Leu Gln His Ser Tyr Phe Asp Leu Leu Leu Pro Asn Asp
1 5 10 15
Ala Phe Asp Ile
20
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gln Ser Val Ser Ser Asn Tyr
1 5
<210> 40
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Gly Ala Ser
1
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 44
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Ala Ala Ala Gly Gly Thr Ser Ser Gly Thr Pro Ala Ala Pro Ala Ile
1 5 10 15
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
1 5
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Asp Ala Ser
1
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Gly Thr
1 5

Claims (25)

1.一种SARS-CoV-2中和抗体的检测试剂盒，其包含：
1)SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段；以及
2)竞争结合剂，所述竞争结合剂包含能够与所述SARS-CoV-2中和抗体竞争结合所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的物质；
其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含受体结合区RBD，
其中所述RBD与Fc区直接或间接连接。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述RBD与所述Fc在框内融合。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述ARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的浓度为50ng/ml-2000ng/ml。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含SEQ ID NO:6-11中任一项所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-5之一所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能片段的浓度为1μg/ml-20μg/ml。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含人ACE2受体蛋白或其功能活性片段。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段包含胞外域ECD。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与Fc区直接或间接连接。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述ACE2受体蛋白或其功能活性片段与所述Fc区在框内融合。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述Fc区选自下组：rFc、mFc和hFc。
13.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含SEQ ID NO:1-5中任一项所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述竞争结合剂包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述竞争结合剂的存在和/或含量的信号。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
16.根据权利要求1所述的试剂盒，其包括样本稀释液，所述样本稀释液的pH为6.0-9.6。
17.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包括校准品，所述校准品包含特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少2个不同的表位。
19.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述一种或多种参比抗体分子或其抗原结合片段特异性识别所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段上的至少3个不同的表位。
20.根据权利要求17所述的试剂盒，所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：
所述VH包含SEQ ID NO:30-32所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:33-35所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
所述VH包含SEQ ID NO:36-38所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:39-41所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
所述VH包含SEQ ID NO:42-44所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述VL包含SEQ ID NO:45-47所示的氨基酸序列的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
21.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述参比抗体包含重链可变区VH和轻链可变区VL；其中：
所述VH包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列；
所述VH包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列；或
所述VH包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，所述VL包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述参比抗体包括抗体32-1,12-5和12-8。
23.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述参比抗体的浓度为50ng/ml-1000ng/ml。
24.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段包含一种或多种标记物，所述标记物能够直接或间接产生显示所述SARS-CoV-2刺突蛋白或其功能活性片段的存在和/或含量的信号。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中所述标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)或HRP类似的酶。
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