RU2814471C2 - Новые антитела против вируса гепатита b и их применение - Google Patents
Новые антитела против вируса гепатита b и их применение Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814471C2 RU2814471C2 RU2021138227A RU2021138227A RU2814471C2 RU 2814471 C2 RU2814471 C2 RU 2814471C2 RU 2021138227 A RU2021138227 A RU 2021138227A RU 2021138227 A RU2021138227 A RU 2021138227A RU 2814471 C2 RU2814471 C2 RU 2814471C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- antibody
- antigen
- binding fragment
- ser
- Prior art date
Links
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 title description 123
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 258
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 257
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 257
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 241
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 211
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 156
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 66
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 38
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 37
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 51
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 32
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 28
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 27
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 20
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 12
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 claims description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 12
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 claims description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 6
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 101000839686 Homo sapiens Immunoglobulin heavy variable 4-4 Proteins 0.000 claims description 4
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 4
- 102100028308 Immunoglobulin heavy variable 4-4 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 101001138089 Homo sapiens Immunoglobulin kappa variable 1-39 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100020910 Immunoglobulin kappa variable 1-39 Human genes 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 96
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 65
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 64
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 49
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 38
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 36
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 23
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 15
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 15
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 12
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 12
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 12
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 11
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N Thr-Val-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MNYNCKZAEIAONY-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 9
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 9
- TTXMOJWKNRJWQJ-FXQIFTODSA-N Ala-Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CCCN=C(N)N TTXMOJWKNRJWQJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 8
- PLNJUJGNLDSFOP-UWJYBYFXSA-N Asp-Tyr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PLNJUJGNLDSFOP-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DJPXNKUDJKGQEE-BZSNNMDCSA-N Phe-Asp-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DJPXNKUDJKGQEE-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 8
- KDGARKCAKHBEDB-NKWVEPMBSA-N Ser-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O KDGARKCAKHBEDB-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 8
- FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N Thr-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FQPDRTDDEZXCEC-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 8
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 8
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 8
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 7
- HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N Ser-Val-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 7
- SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- -1 substitution Chemical class 0.000 description 7
- ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ARHJJAAWNWOACN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- OHLLDUNVMPPUMD-DCAQKATOSA-N Cys-Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N OHLLDUNVMPPUMD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N Gln-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZFBBMCKQSNJZSN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 6
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 6
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 6
- ZTLGVASZOIKNIX-DCAQKATOSA-N Leu-Gln-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N ZTLGVASZOIKNIX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Cys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N)O LINKCQUOMUDLKN-KATARQTJSA-N 0.000 description 6
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 6
- YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YTJFXEDRUOQGSP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 6
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 6
- CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N Pro-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2 CGBYDGAJHSOGFQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 6
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 6
- 108010087846 prolyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 6
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- UOUHBHOBGDCQPQ-IHPCNDPISA-N Asn-Phe-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N UOUHBHOBGDCQPQ-IHPCNDPISA-N 0.000 description 5
- XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N Asp-Arg-Val Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O XYBJLTKSGFBLCS-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 5
- QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N Asp-Ile-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N QNFRBNZGVVKBNJ-PEFMBERDSA-N 0.000 description 5
- SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N Cys-Arg-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SZQCDCKIGWQAQN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- WLRYGVYQFXRJDA-DCAQKATOSA-N Gln-Pro-Pro Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 WLRYGVYQFXRJDA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 5
- PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N Glu-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 5
- CQIIXEHDSZUSAG-QWRGUYRKSA-N Gly-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 CQIIXEHDSZUSAG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 5
- PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N Gly-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NCC(O)=O PDUHNKAFQXQNLH-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 5
- KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N Gly-Tyr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 5
- LBHOVGUGOBINDL-KKUMJFAQSA-N His-Asp-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)O LBHOVGUGOBINDL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- USTCFDAQCLDPBD-XIRDDKMYSA-N Leu-Asn-Trp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N USTCFDAQCLDPBD-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 5
- CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N Leu-Gln-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)N1CCCC1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N Leu-Glu-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 FEHQLKKBVJHSEC-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 5
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N Lys-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N 0.000 description 5
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 5
- PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N Lys-Pro-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O PDIDTSZKKFEDMB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 5
- WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N Lys-Ser-Arg Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N WQDKIVRHTQYJSN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 5
- SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N Met-Thr-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O SPSSJSICDYYTQN-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 5
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 5
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VGQVAVQWKJLIRM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 5
- UKKROEYWYIHWBD-ZKWXMUAHSA-N Ser-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O UKKROEYWYIHWBD-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 5
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 5
- GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N Thr-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GXUWHVZYDAHFSV-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 5
- GQHAIUPYZPTADF-FDARSICLSA-N Trp-Ile-Arg Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)=CNC2=C1 GQHAIUPYZPTADF-FDARSICLSA-N 0.000 description 5
- QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N Tyr-Gln-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QUILOGWWLXMSAT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 5
- WUFHZIRMAZZWRS-OSUNSFLBSA-N Val-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N WUFHZIRMAZZWRS-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 5
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108010072986 threonyl-seryl-lysine Proteins 0.000 description 5
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- CREYEAPXISDKSB-FQPOAREZSA-N Ala-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O CREYEAPXISDKSB-FQPOAREZSA-N 0.000 description 4
- AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N Arg-Phe-Ser Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N AOHKLEBWKMKITA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 4
- QPTAGIPWARILES-AVGNSLFASA-N Asn-Gln-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O QPTAGIPWARILES-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- GMUOCGCDOYYWPD-FXQIFTODSA-N Asn-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GMUOCGCDOYYWPD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N Asp-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O MNQMTYSEKZHIDF-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 4
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 4
- CRRFJBGUGNNOCS-PEFMBERDSA-N Gln-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CRRFJBGUGNNOCS-PEFMBERDSA-N 0.000 description 4
- OSCLNNWLKKIQJM-WDSKDSINSA-N Gln-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O OSCLNNWLKKIQJM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gln-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O BYYNJRSNDARRBX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O IALQAMYQJBZNSK-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N Gly-Thr-Asp Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NVTPVQLIZCOJFK-FOHZUACHSA-N 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 4
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 4
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 4
- KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N Phe-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KLYYKKGCPOGDPE-OEAJRASXSA-N 0.000 description 4
- WDOCBGZHAQQIBL-IHPCNDPISA-N Phe-Trp-Ser Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 WDOCBGZHAQQIBL-IHPCNDPISA-N 0.000 description 4
- YDTUEBLEAVANFH-RCWTZXSCSA-N Pro-Val-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 YDTUEBLEAVANFH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N Ser-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GJFYFGOEWLDQGW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- DCLBXIWHLVEPMQ-JRQIVUDYSA-N Thr-Asp-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 DCLBXIWHLVEPMQ-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 4
- IQPWNQRRAJHOKV-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IQPWNQRRAJHOKV-KATARQTJSA-N 0.000 description 4
- LECUEEHKUFYOOV-ZJDVBMNYSA-N Thr-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LECUEEHKUFYOOV-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 4
- QOIKZODVIPOPDD-AVGNSLFASA-N Tyr-Cys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QOIKZODVIPOPDD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N Val-Tyr-Tyr Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O)N OWFGFHQMSBTKLX-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 4
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 4
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 4
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 108010070409 phenylalanyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 108010033670 threonyl-aspartyl-tyrosine Proteins 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 4
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 3
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 3
- MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N Ala-Leu-Thr Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MEFILNJXAVSUTO-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- OINVDEKBKBCPLX-JXUBOQSCSA-N Ala-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OINVDEKBKBCPLX-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 3
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 3
- ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N Arg-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 3
- MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N Asn-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MFFOYNGMOYFPBD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- SRUUBQBAVNQZGJ-LAEOZQHASA-N Asn-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N SRUUBQBAVNQZGJ-LAEOZQHASA-N 0.000 description 3
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N Asn-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 3
- QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N Asn-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- MJIJBEYEHBKTIM-BYULHYEWSA-N Asn-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MJIJBEYEHBKTIM-BYULHYEWSA-N 0.000 description 3
- CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CUQDCPXNZPDYFQ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 3
- JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 3
- YMBAVNPKBWHDAW-CIUDSAMLSA-N Cys-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N YMBAVNPKBWHDAW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N Cys-Pro-Pro Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N Cys-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N Gln-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LOJYQMFIIJVETK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- NVEASDQHBRZPSU-BQBZGAKWSA-N Gln-Gln-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O NVEASDQHBRZPSU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- ZEEPYMXTJWIMSN-GUBZILKMSA-N Gln-Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZEEPYMXTJWIMSN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- XUMFMAVDHQDATI-DCAQKATOSA-N Gln-Pro-Arg Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O XUMFMAVDHQDATI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- HMIXCETWRYDVMO-GUBZILKMSA-N Gln-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMIXCETWRYDVMO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- BJVBMSTUUWGZKX-JYJNAYRXSA-N Gln-Tyr-His Chemical compound N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O BJVBMSTUUWGZKX-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N Glu-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 3
- HUFCEIHAFNVSNR-IHRRRGAJSA-N Glu-Gln-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HUFCEIHAFNVSNR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- AAJHGGDRKHYSDH-GUBZILKMSA-N Glu-Pro-Gln Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O AAJHGGDRKHYSDH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N Glu-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 3
- ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 3
- BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N Gly-Gly-Pro zwitterion Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BUEFQXUHTUZXHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N Gly-Ser-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JSLVAHYTAJJEQH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 3
- CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 3
- SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N Gly-Val-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 3
- FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N Gly-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- FYVHHKMHFPMBBG-GUBZILKMSA-N His-Gln-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N FYVHHKMHFPMBBG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- TTYKEFZRLKQTHH-MELADBBJSA-N His-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O TTYKEFZRLKQTHH-MELADBBJSA-N 0.000 description 3
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 3
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 3
- MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 3
- DFJJAVZIHDFOGQ-MNXVOIDGSA-N Ile-Glu-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N DFJJAVZIHDFOGQ-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 3
- AMSYMDIIIRJRKZ-HJPIBITLSA-N Ile-His-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)N AMSYMDIIIRJRKZ-HJPIBITLSA-N 0.000 description 3
- UHNQRAFSEBGZFZ-YESZJQIVSA-N Leu-Phe-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N UHNQRAFSEBGZFZ-YESZJQIVSA-N 0.000 description 3
- KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N Leu-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KWLWZYMNUZJKMZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C XOWMDXHFSBCAKQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N Leu-Thr-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O DAYQSYGBCUKVKT-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 3
- WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O WSXTWLJHTLRFLW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- NTBFKPBULZGXQL-KKUMJFAQSA-N Lys-Asp-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 NTBFKPBULZGXQL-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 description 3
- OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N Lys-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OIQSIMFSVLLWBX-VOAKCMCISA-N 0.000 description 3
- LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N Lys-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- RKIIYGUHIQJCBW-SRVKXCTJSA-N Met-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RKIIYGUHIQJCBW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JOXIIFVCSATTDH-IHPCNDPISA-N Phe-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N JOXIIFVCSATTDH-IHPCNDPISA-N 0.000 description 3
- QARPMYDMYVLFMW-KKUMJFAQSA-N Phe-Pro-Glu Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 QARPMYDMYVLFMW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QEDMOZUJTGEIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 3
- HZWAHWQZPSXNCB-BPUTZDHNSA-N Ser-Arg-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O HZWAHWQZPSXNCB-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 3
- VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N Ser-Asn-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N Ser-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 3
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N Ser-Pro-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O RHAPJNVNWDBFQI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N Ser-Thr-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNXUIBACCONSOH-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- WLDUCKSCDRIVLJ-NUMRIWBASA-N Thr-Gln-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O WLDUCKSCDRIVLJ-NUMRIWBASA-N 0.000 description 3
- SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N Thr-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 3
- BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N Thr-Phe-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 BIBYEFRASCNLAA-CDMKHQONSA-N 0.000 description 3
- JMBRNXUOLJFURW-BEAPCOKYSA-N Thr-Phe-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N)O JMBRNXUOLJFURW-BEAPCOKYSA-N 0.000 description 3
- ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N Thr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N 0.000 description 3
- XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 3
- QYSBJAUCUKHSLU-JYJNAYRXSA-N Tyr-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QYSBJAUCUKHSLU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- JJNXZIPLIXIGBX-HJPIBITLSA-N Tyr-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N JJNXZIPLIXIGBX-HJPIBITLSA-N 0.000 description 3
- ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N Tyr-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N 0.000 description 3
- GZUIDWDVMWZSMI-KKUMJFAQSA-N Tyr-Lys-Cys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 GZUIDWDVMWZSMI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- MWUYSCVVPVITMW-IGNZVWTISA-N Tyr-Tyr-Ala Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 MWUYSCVVPVITMW-IGNZVWTISA-N 0.000 description 3
- SQUMHUZLJDUROQ-YDHLFZDLSA-N Tyr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SQUMHUZLJDUROQ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 3
- BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 3
- KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N Val-Phe-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 3
- KRAHMIJVUPUOTQ-DCAQKATOSA-N Val-Ser-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N KRAHMIJVUPUOTQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- SDHZOOIGIUEPDY-JYJNAYRXSA-N Val-Ser-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 SDHZOOIGIUEPDY-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 3
- BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N Val-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O BGTDGENDNWGMDQ-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 3
- ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 3
- JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N Val-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 3
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 3
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 3
- 229940036107 hepatitis b immunoglobulin Drugs 0.000 description 3
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 3
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 3
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 3
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 3
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 3
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 3
- 108010052774 valyl-lysyl-glycyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100450694 Arabidopsis thaliana HFR1 gene Proteins 0.000 description 2
- WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N Asp-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 208000031872 Body Remains Diseases 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101150097493 D gene Proteins 0.000 description 2
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 2
- 231100000491 EC50 Toxicity 0.000 description 2
- UESYBOXFJWJVSB-AVGNSLFASA-N Gln-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UESYBOXFJWJVSB-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- YNIMVVJTPWCUJH-KBPBESRZSA-N Gly-His-Tyr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O YNIMVVJTPWCUJH-KBPBESRZSA-N 0.000 description 2
- FOKISINOENBSDM-WLTAIBSBSA-N Gly-Thr-Tyr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O FOKISINOENBSDM-WLTAIBSBSA-N 0.000 description 2
- 101150055682 HK gene Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- ZUPVLBAXUUGKKN-VHSXEESVSA-N His-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O ZUPVLBAXUUGKKN-VHSXEESVSA-N 0.000 description 2
- QPSCMXDWVKWVOW-BZSNNMDCSA-N His-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O QPSCMXDWVKWVOW-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N Ile-His-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KEKTTYCXKGBAAL-VGDYDELISA-N 0.000 description 2
- GMUYXHHJAGQHGB-TUBUOCAGSA-N Ile-Thr-His Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N GMUYXHHJAGQHGB-TUBUOCAGSA-N 0.000 description 2
- WCNWGAUZWWSYDG-SVSWQMSJSA-N Ile-Thr-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N WCNWGAUZWWSYDG-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 2
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N Met-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCSC FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- OQPNSDWGAMFJNU-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Tyr Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 OQPNSDWGAMFJNU-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDBOEVPDIDDEPC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N Ser-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SIEBDTCABMZCLF-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 2
- VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N Thr-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VRUFCJZQDACGLH-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 2
- OSXNCKRGMSHWSQ-ACRUOGEOSA-N Tyr-His-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O OSXNCKRGMSHWSQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 2
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 2
- OACSGBOREVRSME-NHCYSSNCSA-N Val-His-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OACSGBOREVRSME-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N adamantane Chemical compound C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 108010078144 glutaminyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 2
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 2
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000003340 retarding agent Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- 229940058015 1,3-butylene glycol Drugs 0.000 description 1
- VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 1-oxidanylurea Chemical compound N[14C](=O)NO VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 235000006491 Acacia senegal Nutrition 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CXRCVCURMBFFOL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N Ala-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N)O BTYTYHBSJKQBQA-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- KUDREHRZRIVKHS-UWJYBYFXSA-N Ala-Asp-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KUDREHRZRIVKHS-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N Ala-Thr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O WNHNMKOFKCHKKD-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N Ala-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- ZEAYJGRKRUBDOB-GARJFASQSA-N Arg-Gln-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O ZEAYJGRKRUBDOB-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- GMFAGHNRXPSSJS-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O GMFAGHNRXPSSJS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XRNXPIGJPQHCPC-RCWTZXSCSA-N Arg-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)C(O)=O XRNXPIGJPQHCPC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- GXMSVVBIAMWMKO-BQBZGAKWSA-N Asn-Arg-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCN=C(N)N GXMSVVBIAMWMKO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- RTFXPCYMDYBZNQ-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RTFXPCYMDYBZNQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BLQBMRNMBAYREH-UWJYBYFXSA-N Asp-Ala-Tyr Chemical compound N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O BLQBMRNMBAYREH-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJLLRXWFPQQPHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229920000623 Cellulose acetate phthalate Polymers 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- VIRYODQIWJNWNU-NRPADANISA-N Cys-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VIRYODQIWJNWNU-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- IULKWYSYZSURJK-AVGNSLFASA-N Gln-Leu-Lys Chemical compound NC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O IULKWYSYZSURJK-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- GHAXJVNBAKGWEJ-AVGNSLFASA-N Gln-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O GHAXJVNBAKGWEJ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CLROYXHHUZELFX-FXQIFTODSA-N Glu-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O CLROYXHHUZELFX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N Gly-Leu-Glu Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ULZCYBYDTUMHNF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NNCSJUBVFBDDLC-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NNCSJUBVFBDDLC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N Gly-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN LCRDMSSAKLTKBU-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N Gly-Thr-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN XHVONGZZVUUORG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N Gly-Thr-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O TVTZEOHWHUVYCG-KYNKHSRBSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N His-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N Ile-Leu-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- QQFSKBMCAKWHLG-UHFFFAOYSA-N Ile-Phe-Pro-Pro Chemical compound C1CCC(C(=O)N2C(CCC2)C(O)=O)N1C(=O)C(NC(=O)C(N)C(C)CC)CC1=CC=CC=C1 QQFSKBMCAKWHLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLRJHVNFGAOYPS-HJPIBITLSA-N Ile-Ser-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N WLRJHVNFGAOYPS-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 description 1
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- DBVWMYGBVFCRBE-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DBVWMYGBVFCRBE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CQGSYZCULZMEDE-SRVKXCTJSA-N Leu-Gln-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O CQGSYZCULZMEDE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ser-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N AMSSKPUHBUQBOQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FGMHXLULNHTPID-KKUMJFAQSA-N Lys-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)CC1=CN=CN1 FGMHXLULNHTPID-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SQXZLVXQXWILKW-KKUMJFAQSA-N Lys-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQXZLVXQXWILKW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- MHQXIBRPDKXDGZ-ZFWWWQNUSA-N Met-Gly-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 MHQXIBRPDKXDGZ-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N Phe-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 NAXPHWZXEXNDIW-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N Phe-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O BPCLGWHVPVTTFM-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N Ser-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HRNQLKCLPVKZNE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N Ser-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HBOABDXGTMMDSE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N Ser-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FTVRVZNYIYWJGB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- INCNPLPRPOYTJI-JBDRJPRFSA-N Ser-Cys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CO)N INCNPLPRPOYTJI-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- ZOHGLPQGEHSLPD-FXQIFTODSA-N Ser-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZOHGLPQGEHSLPD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FMDHKPRACUXATF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N Ser-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO SFTZWNJFZYOLBD-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N Ser-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XXXAXOWMBOKTRN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Asp Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PPNPDKGQRFSCAC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XQJCEKXQUJQNNK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ZSDXEKUKQAKZFE-XAVMHZPKSA-N Ser-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O ZSDXEKUKQAKZFE-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 1
- ATEQEHCGZKBEMU-GQGQLFGLSA-N Ser-Trp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CO)N ATEQEHCGZKBEMU-GQGQLFGLSA-N 0.000 description 1
- VVKVHAOOUGNDPJ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VVKVHAOOUGNDPJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SSZBUIDZHHWXNJ-UHFFFAOYSA-N Stearinsaeure-hexadecylester Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCC SSZBUIDZHHWXNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N Thr-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O XSLXHSYIVPGEER-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- KRPKYGOFYUNIGM-XVSYOHENSA-N Thr-Asp-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N)O KRPKYGOFYUNIGM-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- CYVQBKQYQGEELV-NKIYYHGXSA-N Thr-His-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N)O CYVQBKQYQGEELV-NKIYYHGXSA-N 0.000 description 1
- CYCGARJWIQWPQM-YJRXYDGGSA-N Thr-Tyr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CYCGARJWIQWPQM-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N Thr-Tyr-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 YOPQYBJJNSIQGZ-JNPHEJMOSA-N 0.000 description 1
- SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N Trp-Gly-Gln Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 SVGAWGVHFIYAEE-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- KIMOCKLJBXHFIN-YLVFBTJISA-N Trp-Ile-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 KIMOCKLJBXHFIN-YLVFBTJISA-N 0.000 description 1
- VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N Tyr-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 VCXWRWYFJLXITF-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N Tyr-Cys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SMLCYZYQFRTLCO-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N Tyr-Gly Chemical compound [O-]C(=O)CNC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=C(O)C=C1 HPYDSVWYXXKHRD-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JHORGUYURUBVOM-KKUMJFAQSA-N Tyr-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JHORGUYURUBVOM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- QARCDOCCDOLJSF-HJPIBITLSA-N Tyr-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N QARCDOCCDOLJSF-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- AUZADXNWQMBZOO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Pro-Arg Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 AUZADXNWQMBZOO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N Tyr-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WQOHKVRQDLNDIL-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- QRCBQDPRKMYTMB-IHPCNDPISA-N Tyr-Trp-Ser Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N QRCBQDPRKMYTMB-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N Tyr-Tyr-Cys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N)O ANHVRCNNGJMJNG-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N Val-Ala-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SLLKXDSRVAOREO-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N Val-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- LHADRQBREKTRLR-DCAQKATOSA-N Val-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LHADRQBREKTRLR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OXVPMZVGCAPFIG-BQFCYCMXSA-N Val-Gln-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N OXVPMZVGCAPFIG-BQFCYCMXSA-N 0.000 description 1
- VCAWFLIWYNMHQP-UKJIMTQDSA-N Val-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VCAWFLIWYNMHQP-UKJIMTQDSA-N 0.000 description 1
- RHYOAUJXSRWVJT-GVXVVHGQSA-N Val-His-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N RHYOAUJXSRWVJT-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- HQYVQDRYODWONX-DCAQKATOSA-N Val-His-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N HQYVQDRYODWONX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- QPJSIBAOZBVELU-BPNCWPANSA-N Val-Tyr-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N QPJSIBAOZBVELU-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010009111 arginyl-glycyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 235000019437 butane-1,3-diol Nutrition 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical compound [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013539 calcium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008116 calcium stearate Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004203 carnauba wax Substances 0.000 description 1
- 235000013869 carnauba wax Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 229940081734 cellulose acetate phthalate Drugs 0.000 description 1
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 208000016350 chronic hepatitis B virus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N glycerine monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(CO)CO YQEMORVAKMFKLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N glycerol monostearate Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO SVUQHVRAGMNPLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical group 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000028802 immunoglobulin-mediated neutralization Effects 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010044374 isoleucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000000891 luminescent agent Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N olefin Natural products CCCCCCCC=C JRZJOMJEPLMPRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000008184 oral solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013326 plasmid cotransfection Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 1
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 108010069117 seryl-lysyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M sodium thioglycolate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CS GNBVPFITFYNRCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940046307 sodium thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- 239000007909 solid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 108010079202 tyrosyl-alanyl-cysteine Proteins 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010071635 tyrosyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000005570 vertical transmission Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способным специфически связываться с HBsAg, способу его получения, а также к фармацевтической композиции, его содержащей. Также раскрыты выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, а также вектор и клетка-хозяин, ее содержащие. Изобретение эффективно для лечения или профилактики HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией, у пациента. 11 н. и 25 з.п. ф-лы, 18 ил., 7 табл., 5 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области молекулярной вирусологии и иммунологии, а в частности к области лечения инфекции, вызываемой вирусом гепатита B (HBV). В частности, настоящее изобретение относится к антителу против поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg) и к нуклеиновой кислоте, кодирующей это антитело, и к их применению. Антитело против HBsAg согласно изобретению имеет более высокую аффинность связывания с HBsAg при нейтральном pH, чем при кислотном pH. Новое антитело может быть использовано для профилактики и/или лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (например, у человека) или для снижения уровня ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке индивидуума. Следовательно, настоящее изобретение также относится к применению антитела и его варианта в целях приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (например, у человека), для снижения уровня ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке у индивидуума или для активации гуморального иммунного ответа на HBV у индивидуума (например, у человека с хронической HBV-инфекцией или у пациента с хроническим гепатитом B).
Предпосылки создания изобретения
Инфекция, вызываемая вирусом гепатита B, а в частности, хроническая HBV-инфекция, представляет одну из наиболее серьезных проблем здравоохранения в мире (Dienstag JL. Hepatitis Birus influenza. N. Engl. J. Med. 2008 Oct. 2; 359 (14):1486-1500). Хроническая HBV-инфекция может приводить к ряду заболеваний печени, таких как хронический гепатит B (CHB), цирроз печени (LC) и первичная гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) (Liaw YF, Chu CM. Hepatitis B virus infection. Lancet 2009 Feb 14; 373(9663): 582-592). По имеющимся данным, в настоящее время в мире насчитывается около 2 миллиардов человек, инфицированных HBV, причем, из них приблизительно 350 миллионов человек страдают хроническими инфекциями, вызываемыми вирусом гепатита B, и риск того, что смертность среди этих инфицированных пациентов от заболеваний печени, вызванных HBV-инфекцией, в конечном итоге может достичь от 15% до 25%, при этом, известно, что во всем мире от таких болезней ежегодно умирают более одного миллиона человек (Dienstag JL., ibid; and Liaw YF, et al., ibid).
Современные лекарственные средства для лечения хронической HBV-инфекции можно подразделить на интерфероны (IFN) и аналоги нуклеозидов или нуклеотидов (NA) (Dienstag JL., ibid.; Kwon H, Lok AS. Hepatitis B therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011 May; 8(5): 275-284; and Liaw YF et al., ibid.). Однако лечение вышеуказанными лекарственными средствами по отдельности или в комбинации не может полностью удалить вирус HBV у инфицированных пациентов, и уровень вызываемой при этом реакции отрицательной конверсии HBsAg или сероконверсии HBsAg (признак полного выведения вируса HBV у инфицированного человека) обычно составляет менее 5% (Kwon H et al., ibid.).
Разработка новых лекарственных средств для лечения хронической HBV-инфекции на основе иммунологических средств является одним из важных направлений исследований в этой области. Иммунотерапию хронической HBV-инфекции обычно проводят двумя способами, а именно, посредством активной иммунотерапии (соответствующими лекарственными формами, включая вакцины и т.п.) и пассивной иммунотерапии (соответствующими лекарственными формами, включая антитела, и т.п.). Активная иммунотерапия относится к введению терапевтической вакцины (включая белковую вакцину, пептидную вакцину, вакцину на основе нуклеиновой кислоты и т.п.) для стимуляции организма человека, имеющего хроническую HBV-инфекцию, на активное вырабатывание клеточного иммунного ответа (эффекта CTL и т.п.) и/или гуморального иммунного ответа против HBV (вырабатывание антител и т.п.) для ингибирования или удаления HBV. В настоящее время не существует какого-либо определенно значимого и эффективного активного иммунотерапевтического средства/вакцины, которые можно было бы использовать для лечения хронической HBV-инфекции. Пассивная иммунотерапия (на примере антител) относится к введению антитела с терапевтическими свойствами HBV-инфицированному пациенту, и терапевтический эффект может быть достигнут посредством нейтрализации вируса, опосредованной антителами, для блокирования заражения гепатоцитов новорожденных вирусом HBV, или посредством иммунного клиренса, опосредуемого антителом, для удаления вирусов и инфицированных клеток печени из организма. В настоящее время, поликлональное антитело против HBV, выделенное из сыворотки/плазмы пациентов, у которых наблюдался ответ на профилактическую вакцину против гепатита B, или которые выздоравливали от HBV-инфекции, а именно, высокоэффективный иммуноглобулин против гепатита B (HBIG), широко применяется для блокирования вертикальной передачи HBV от матери ребенку, для предотвращения повторного инфицирования HBV после трансплантации печени у пациентов с хронической HBV-инфекцией и профилактики инфицирования человека, случайно подвергшегося воздействию HBV. Однако прямое применение HBIG для лечения пациентов, инфицированных HBV (например, пациентов с хроническим гепатитом B), не дает очевидного эффекта и имеет множество ограничений, таких как снижение количества источников высокоактивной плазмы, высокая цена, нестабильная природа и потенциальные проблемы, связанные с безопасностью.
Поэтому крайне необходимо разработать инновационные способы лечения и лекарственные средства, которые могли бы более эффективно удалять вирус HBV, а в частности, HbsAg, у HBV-инфицированных пациентов.
Сущность изобретения
Авторами настоящего изобретения было ранее разработано гуманизованное антитело против HBsAg с превосходными свойствами, которое может нейтрализовать вирулентность HBV in vivo и снизить уровни ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке. На основе предыдущих исследований, авторы настоящего изобретения приложили много усилий для проведения тщательных исследований и разработки гуманизованного антитела, и тем самым разработки антител против HBsAg с pH-зависимой способностью связываться с антигеном. Антитело против HBsAg согласно изобретению имеет более высокую аффинность связывания с HBsAg при нейтральном pH, чем при кислотнм pH, а поэтому может быть осуществлено повторное применение антитела, значительно увеличено время полужизни антитела и повышена эффективность выведения HBV. Кроме того, авторами настоящего изобретения было получено акцепторное антитело и было увеличено время его полужизни путем введения мутации в Fc-область вышеупомянутого антитела для повышения его аффинности к hFcRn или к mFcγRII в нейтральных условиях.
Антитело согласно изобретению является чрезвычайно полезным, поскольку оно не только сохраняет активность в отношении снижения уровня ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке, но также имеет более длительное время подавления антигена, что позволяет значительно снизить дозу инъекции и частоту ее введения при лечении, а поэтому такое антитело имеет высокую клиническую ценность.
Антитело согласно изобретению
Следовательно, в одном своем аспекте, настоящее изобретение относится к антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту, способным специфически связываться с HBsAg, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с HBsAg с более высокой аффинностью при нейтральном pH, чем при кислотном pH.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, нейтральный pH составляет от pH 6,7 до pH 7,5, например, pH 7,4.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, кислотный pH составляет от pH 4,0 до pH 6,5, например, pH 6,0.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, отношение KD связывания с HBsAg при кислотном pH (например, pH 6,0) к KD связывания с HBsAg при нейтральном pH (например, pH 7,4) (то есть значение KD (при кислотном pH)/KD (при нейтральном pH)) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет более чем 1, например, не менее чем 1,5, не менее чем 2, не менее чем 3, не менее чем 4, не менее чем 5, не менее чем 6, не менее чем 7, не менее чем 8, не менее чем 9, не менее чем 10, не менее чем 15, не менее чем 20, не менее чем 30, не менее чем 40, не менее чем 50, не менее чем 60, не менее чем 70, не менее чем 80, не менее чем 90, не менее чем 100, не менее чем 300, не мене, чем 500, не менее чем 800, не менее чем 1000, не менее чем 2000, не менее чем 5000 или не менее чем 10000. В некоторых вариантах осуществления изобретения, значение KD (при кислотном pH)/KD (при нейтральном pH) составляет более чем 1, и не более чем 10000, например, не более чем 5000, не более чем 2000, не более чем 1000, не более чем 900, не более чем 800, не более чем 700, не более чем 600, не более чем 500, не более чем 400, не более чем 300, не более чем 200, не более чем 100, не более чем 90, не более чем 80, не более чем 70, не более чем 60, не более чем 50, не более чем 40, не более чем 30, не более чем 20 или не более чем 10. KD может быть измерена методом, известным специалистам, например, методом ППР (например, с помощью Biacore).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, отношение KD связывания с HBsAg при pH 6,0 к KD связывания с HBsAg при pH 7,4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет более чем 1, например, не менее чем 1,5, не менее чем 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, величина KD антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при нейтральном pH может составлять 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, 10-12 М или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения, величина KD антитела согласно изобретению при кислотном pH может составлять 10-9 M, 10-8 M, 10-7 M, 10-6 M или более.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, отношение EC50 связывания с HBsAg при кислотном pH (например, pH 6,0) к EC50 связывания с HBsAg при нейтральном pH (например, pH 7,4) (то есть значение EC50 (при кислотном pH)/EC50 (при нейтральном pH)) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет более чем 1, например, не менее чем 1,5, не менее чем 2, не менее чем 3, не менее чем 4, не менее чем 5, не менее чем 6, не менее чем 7, не менее чем 8, не менее чем 9, не менее чем 10, не менее чем 15, не менее чем 20, не менее чем 30, не менее чем 40, не менее чем 50, не менее чем 60, не менее чем 70, не менее чем 80, не менее чем 90, не менее чем 100, не менее чем 300, не менее чем 500, не менее чем 800, не менее чем 1000, не менее чем 2000, не менее чем 5000 или не менее чем 10000. В некоторых вариантах осуществления изобретения, значение EC50 (при кислотном pH)/EC50 (при нейтральном pH) составляет более чем 1, и не более чем 10000, например, не более чем 5000, не более чем 2000, не более чем 1000, не более чем 900, не более чем 800, не более чем 700, не более чем 600, не более чем 500, не более чем 400, не более чем 300, не более чем 200, не более чем 100, не более чем 90, не более чем 80, не более чем 70, не более чем 60, не более чем 50, не более чем 40, не более чем 30, не более чем 20 или не более чем 10. В некоторых вариантах осуществления изобретения, ЕС50 измеряют методом ELISA, например, с помощью регрессионного анализа кривой доза-ответ, построенной с применением метода ELISA.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, отношение EC50 связывания с HBsAg при pH 6,0 к EC50 связывания с HBsAg при pH 7,4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет более чем 1, например, не менее чем 1,5, или не менее чем 2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению получают из гуманизованного антитела M1D против HBV (которое подробно описано в заявке на патент Китая 201810307136.5).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению связывается с аминокислотами 118-124 HBsAg с более высокой аффинностью при нейтральном pH, чем при кислотном pH.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которые имеют одно или более из следующих свойств:
(i) HCDR1 имеет по меньшей мере одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 20;
(ii) HCDR2 имеет по меньшей мере одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 21; и/или,
(iii) HCDR3 имеет по меньшей мере одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 16.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи (VL), включающую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которые имеют одно или более из следующих свойств:
(i) LCDR1 имеет по меньшей мере одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 11;
(ii) LCDR2 имеет по меньшей мере одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12; и/или,
(iii) LCDR3 имеет по меньшей мере одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 46.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую следующие 3 CDR:
(i) HCDR1 с последовательностью GGSIX1X2NFW (SEQ ID NO: 50), где X1 выбран из T или H, а X2 выбран из S или H;
(ii) HCDR2 с последовательностью X3GX4X5X6X7T (SEQ ID NO: 51), где X3 выбран из S или H, X4 выбран из P, S или Y, X5 выбран из G или D, X6 выбран из T или H, а X7 выбран из Y или H; и
(iii) HCDR3 с последовательностью ARSHX8YGX9X10DYAFDF (SEQ ID NO: 52), где X8 выбран из D или H, X9 выбран из S или H, а X10 выбран из H или N;
и/или
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 CDR:
(iv) LCDR1 с последовательностью QDIX11X12S (SEQ ID NO: 53), где X11 выбран из S или H, а X12 выбран из S, Y или H;
(v) LCDR2 с последовательностью YAN (SEQ ID NO: 12); и
(vi) LCDR3 с последовательностью QQYHX13LPLT (SEQ ID NO: 54), где X13 выбран из S или Y.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 CDR:
(i) HCDR1, которая состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 8, 14, 17, 20;
(ii) HCDR2, которая состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 9, 15, 21, 18; и
(iii) HCDR3, которая состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 10, 16, 22;
и/или,
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 CDR:
(iv) LCDR1, которая состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 11, 19, 23;
(v) LCDR2, которая состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12; и
(vi) LCDR3, которая состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, X1 выбран из T или H, X2 выбран из S, X3 выбран из S, X4 выбран из P или S, X5 выбран из G, X6 выбран из T или H, X7 выбран из Y или H, X8 выбран из D или H, X9 выбран из S или H, X10 выбран из H или N, X11 выбран из S, X12 выбран из S или Y, а X13 выбран из Y.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 CDR:
(i) HCDR1, которая состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 8, 20;
(ii) HCDR2, которая состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 9, 21; и
(iii) HCDR3, которая состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 10, 22;
и/или,
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 CDR:
(iv) LCDR1, которая состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 11, 23;
(v) LCDR2, которая состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12; и
(vi) LCDR3, которая состоит из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(1) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 8, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 9, HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 10; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 11, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 12, LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 13;
(2) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 14, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 15, HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 16; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 11, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 12, LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 13;
(3) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 20, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 21, HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 22; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 23, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 12, LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 13; или,
(4) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, представленную в SEQ ID NO: 17, HCDR2, представленную в SEQ ID NO: 18, HCDR3, представленную в SEQ ID NO: 10; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, представленную в SEQ ID NO: 19, LCDR2, представленную в SEQ ID NO: 12, LCDR3, представленную в SEQ ID NO: 13.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит каркасную область человеческого иммуноглобулина (например, каркасную область, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном антитела человеческой зародышевой линии), и эта каркасная область необязательно содержит одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) обратных мутаций, а именно, замен человеческих остатков на мышиные остатки.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигнсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи человеческой зародышевой линии, и/или каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи человеческой зародышевой линии.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигнсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV4-4*08 (SEQ ID NO: 55), и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV1-39*01 (SEQ ID NO: 56), и указаная каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи необязательно содержат одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) обратных мутаций, а именно, замен человеческих остатков на мышиные остатки.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH FR1, представленную в SEQ ID NO: 24; VH FR2, представленную в SEQ ID NO: 25; VH FR3, представленную в SEQ ID NO: 26; и VH FR4, представленную в SEQ ID NO: 27.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL FR1, представленную в SEQ ID NO: 28; VL FR2, представленную в SEQ ID NO: 29; VL FR3, представленную в SEQ ID NO: 30; и VL FR4, представленную в SEQ ID NO: 31.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
(i) последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 4 и 6;
(ii) последовательности с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6; или
(iii) последовательности, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6; и
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
(iv) последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 2, 5 и 7;
(v) последовательности с заменой, делецией или добавлением одной или нескольких аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 2, 5, 7; или
(vi) последовательности, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 2, 5, 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, замена, описанная в (ii) или (v), представляет собой консервативную замену.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(1) VH с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, и VL с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2;
(2) VH с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, и VL с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2;
(3) VH с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 4, и VL с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 5; или
(4) VH с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 6, и VL с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит константную область, происходящую от человеческого иммуноглобулина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, тяжелая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит константную область тяжелой цепи, происходящую от человеческого иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), а легкая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит константную область легкой цепи, происходящую от человеческого иммуноглобулина (например, κ или λ).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(а) константную область тяжелой цепи (СН) человеческого иммуноглобулина или его варианта, где этот вариант имеет замену, делецию или добавление одной или более аминокислот или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление максимум 20, максимум 15, максимум 10 или максимум 5 аминокислот или любую их комбинацию, например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью дикого типа, от которой она происходит; и/или
(b) константную область легкой цепи (CL) человеческого иммуноглобулина или его варианта, где этот вариант имеет замену, делецию или добавление одной или более аминокислот или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление максимум 20, максимум 15, максимум 10 или максимум 5 аминокислот или любую их комбинацию, например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот или любую их комбинацию) по сравнению с последовательностью дикого типа, от которой она происходит.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН), представленную в SEQ ID NO: 57.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению содержит вариант константной области тяжелой цепи (СН) человеческого иммуноглобулина, где этот вариант обладает повышенной аффинностью к hFcRn или mFcγRII при нейтральном pH (например, pH 7,4) по сравнению с последовательностью дикого типа, от которой она происходит. В таких вариантах осуществления изобретения, указанный вариант обычно имеет замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с последовательностью дикого типа, от которой она происходит.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG1, где этот вариант имеет нижеследующие замены по сравнению с последовательностью дикого типа, от которой она происходит: (i) M252Y, N286E, N434Y; или (ii) K326D, L328Y; где вышеупомянутые положения аминокислот являются положениями согласно системе нумерации Кэбата. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН), представленную в SEQ ID NO: 47 или 48.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи κ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи (CL), представленную в SEQ ID NO: 58.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(1) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 1, и CH, представленную в SEQ ID NO: 57, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 2, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(2) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 1, и CH, представленную в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 2, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(3) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 1, и CH, представленную в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 2, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(4) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 3, и CH, представленную в SEQ ID NO: 57, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 2, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(5) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 3, и CH, представленную в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 2, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(6) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 3, и CH, представленную в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 2, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(7) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 4, и CH, представленную в SEQ ID NO: 57, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 5, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(8) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 4, и CH, представленную в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 5, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(9) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 4, и CH, представленную в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 5, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(10) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 6, и CH, представленную в SEQ ID NO: 57, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 7, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58;
(11) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 6, и CH, представленную в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 7, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58; или
(12) тяжелую цепь, содержащую VH, представленную в SEQ ID NO: 6, и CH, представленную в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, представленную в SEQ ID NO: 7, и CL, представленную в SEQ ID NO: 58.
Получение антитела
Антитело согласно изобретению может быть получено различными способами, известными специалистам в данной области, например, с применением технологии рекомбинации методом генной инженерии. Так, например, молекулы ДНК, кодирующие гены тяжелой и легкой цепей антитела согласно изобретению, получают путем химического синтеза или ПЦР-амплификации. Полученную молекулу ДНК встраивают в экспрессионный вектор, а затем переносят в клетку-хозяина. Затем трансфицированную клетку-хозяина культивируют в определенных условиях, в результате чего экспрессируется антитело согласно изобретению.
Антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению может быть получен путем гидролиза полноразмерной молекулы антитела (см. Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992) и Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). Кроме того, эти антигенсвязывающие фрагменты также могут быть непосредственно продуцированы рекомбинантными клетками-хозяевами (см. обзор Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)). Так, например, фрагменты Fab' могут быть получены непосредственно из клеток-хозяев; Фрагменты Fab' могут быть химически связаны с образованием фрагментов F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Кроме того, фрагменты Fv, Fab или F(ab')2 могут быть также непосредственно выделены из среды для культивирования рекомбинантных клеток-хозяев. Специалистам в данной области хорошо известны и другие методы получения этих антигенсвязывающих фрагментов.
Следовательно, в другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащой нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению, или его вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению или его вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к вектору (например, к вектору для клонирования или к вектору для экспрессии), содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, вектор согласно изобретению представляет собой, например, плазмиду, космиду, бактериофаг и т.п.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению или вектор согласно изобретению. Такая клетка-хозяин включает, но не ограничивается ими, прокариотическую клетку, такую как клетка E. coli, и эукариотическую клетку, такую как дрожжевая клетка, клетка насекомого, клетка растения и клетка животного (например, клетка млекопитающего, такая как клетка мыши, клетка человека и т.п.). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, клетка-хозяин согласно изобретению представляет собой клетку млекопитающего, такую как CHO (например, CHO-K1, CHO-S, CHO DG44).
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению, где указанный способ включает культивирование клетки-хозяина согласно изобретению в условиях, позволяющих экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культивируемой культуры клеток-хозяев.
Производное антитела
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению могут быть дериватизированы, например, связаны с другой молекулой (например, с другим полипептидом или белком). Обычно, дериватизация (например, мечение) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента не будет негативно влиять на его связывание с HBsAg. Следовательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению также включает такие дериватизированные формы. Так, например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению могут быть функционально связаны (посредством химического связывания, сцепления генов, нековалентного связывания или другими способами) с одной или несколькими другими молекулярными группами, такими как другое антитело (например, для образования биспецифического антитела), реагент для детектирования, фармацевтический реагент и/или белок или полипептид, способные опосредовать связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с другой молекулой (например, с авидиновой или полигистидиновой меткой).
Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело согласно изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент являются меченными. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению имеют детектируемую метку, такую как фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество (например, хемилюминесцентное вещество) или биотин. Детектируемая метка согласно изобретению может представлять собой любое вещество, которое может быть детектировано с помощью флуоресцентных, спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунологических, электрических, оптических или химических средств. Такие метки хорошо известны специалистам в данной области, и примеры таких меток включают, но не ограничиваются ими, фермент (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, уреазу, глюкозооксидазу и т.п.), радиоактивный нуклид (например, 3H, 125I, 35S, 14C или 32P), флуоресцентный краситель (например, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), флуоресцеин, изотиоцианат тетраметилродамина (TRITC), фикоэритрин (PE), техасский красный, родамин, квантовые точки или производные цианинового красителя (например, Cy7, Alexa 750)), люминесцентное вещество (например, хемилюминесцентное вещество, такое как соединение сложного эфира акридина), магнитные шарики (например, Dynabeads®), калориметрический маркер, такой как коллоидное золото или цветное стекло или пластиковые (например, полистироловые, полипропиленовые, латексные и т.п.) шарики, и биотин, используемый для лигирования авидина (например, стрептавидина), модифицированного указанным выше маркером. В некоторых вариантах осуществления изобретения, такая метка может быть подходящей для иммунологического детектирования (например, с помощью иммуноферментного анализа, радиоиммуноанализа, флуоресцентного иммуноанализа, хемилюминесцентного иммуноанализа и т.п.). В некоторых вариантах осуществления изобретения, детектируемая метка, описанная выше, может быть лигирована с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом согласно изобретению посредством линкера различной длины для уменьшения потенциального стерического затруднения.
Фармацевтическая композиция и терапевтическое применение
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению могут быть использованы для профилактики или лечения HBV-инфекции у индивидуума (например, у человека) или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV in vitro или у индивидуума (например, у человека), для снижения уровня ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке индивидуума (например, человека) и для активации гуморального иммунного ответа на HBV у индивидуума (например, у пациента с хронической HBV-инфекцией или хроническим гепатитом В).
Следовательно, в другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может также включать дополнительный фармацевтически активный агент. В некоторых вариантах осуществления изобретения, дополнительный фармацевтически активный агент представляет собой лекарственное средство, используемое для профилактики или лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией (например, гепатита B), например, лекарственное средство на основе интерферона, такое как интерферон или ПЭГилированный интерферон.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению или фармацевтической композиции согласно изобретению в целях приготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения HBV-инфекции у индивидуума (например, у человека) или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV in vitro или у индивидуума (например, у человека), для снижения уровня ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке индивидуума (например, человека) и/или для активации гуморального иммунного ответа на HBV у индивидуума (например, у пациента с хронической HBV-инфекцией или хроническим гепатитом В).
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу профилактики и/или лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией (например, гепатита B) у индивидуума (например, человека), для нейтрализации вирулентности HBV in vitro или у индивидуума (например, человека), для снижения уровня ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке индивидуума (например, человека) и/или для активации гуморального иммунного ответа на HBV у индивидуума (например, у пациента с хронической HBV-инфекцией или хроническим гепатитом В), где указанный способ включает введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению или фармацевтической композиции согласно изобретению индивидууму, нуждающемуся в этом.
Лекарственные средства и фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть использованы по отдельности или в комбинации, а также они могут быть использованы в комбинации с другими фармацевтически активными агентами (например, другими противовирусными средствами, такими как препараты интерферона, такие как интерферон или ПЭГилированный интерферон).
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению или фармацевтическая композиция согласно изобретению могут быть введены традиционным способом, включая, но не ограничиваясь ими, пероральное, трансбуккальное, подъязычное, внутриглазное, местное, парентеральное, ректальное и интратекальное введение, введение в цитоплазматический ретикулум, введение в паховую область, интравезикулярное введение, местное введение (например, в виде порошка, мази или капель) или интраназальное введение. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению могут быть введены различными способами, известными специалистами в данной области. Однако, для многих терапевтических применений, предпочтительным путем/способом введения является парентеральное введение (например, внутривенная инъекция, подкожная инъекция, внутрибрюшинная инъекция, внутримышечная инъекция). Для квалифицированного специалиста очевидно, что путь и/или способ введения могут варьироваться в зависимости от предполагаемой цели. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению вводят путем внутривенной инфузии или инъекции.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению или фармацевтическая композиция согласно изобретению могут быть включены в состав различных лекарственных форм, таких как жидкие, полутвердые и твердые формы, например, раствор (например, раствор для инъекций), дисперсия или суспензия, таблетка, порошок, гранула, эмульсия, драже, сироп, порошок, липосома, капсула и суппозиторий. Предпочтительная лекарственная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.
Так, например, одной из предпочтительных лекарственных форм является инъекция. Такой инъекцией может быть стерильный раствор для инъекций. Так, например, стерильный раствор для инъекций может быть приготовлен следующим способом: необходимую дозу антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению вводят в подходящий растворитель и, необязательно, одновременно вводят и другие желаемые ингредиенты (включая, но не ограничиваясь ими, регулятор pH, поверхностно-активное вещество, адъювант, усилитель ионной силы, изотонический агент, консервант, разбавитель или любую их комбинацию), а затем проводят стерилизацию фильтрованием. Кроме того, стерильный раствор для инъекций может быть приготовлен в виде стерильного порошка (например, путем вакуумной сушки или сушки вымораживанием) для удобства хранения и использования. Такой стерильный порошок, перед его использованием, может быть диспергирован в подходящем носителе, таком как стерильная апирогенная вода.
Другой предпочтительной лекарственной формой является дисперсия. Дисперсия может быть приготовлена следующим способом: антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению вводят в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и, необязательно, другие желаемые ингредиенты (включая, но не ограничиваясь ими, регулятор pH, поверхностно-активное вещество, адъювант, усилитель ионной силы, изотонический агент, консервант, разбавитель или любую их комбинацию). Кроме того, в дисперсию также может быть включен агент, замедляющий всасывание, такой как моностеаратная соль и желатин, для достижения желаемых фармакокинетических свойств.
Другой предпочтительной лекарственной формой является пероральная твердая лекарственная форма, включая капсулу, таблетку, порошок, гранулы и т.п. Такая твердая лекарственная форма обычно включает по меньшей мере одно из таких веществ, как: (а) инертный лекарственный наполнитель (или носитель), такой как цитрат натрия и фосфат кальция; (b) наполнитель, такой как крахмал, лактоза, сахароза, манноза и кремниевая кислота; (c) связующее вещество, такое как карбоксиметилцеллюлоза, альгинат, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь; (d) смачивающий агент, такой как глицерин; (e) дезинтегрирующий агент, такой как агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки; (f) агент-замедлитель, такой как олефин; (g) усилитель всасывания, такой как соединение четвертичного аммония; (h) увлажнитель, такой как цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (i) адсорбент, такой как каолин и бентонит; (j) лубрикант, такой как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердый полиэтиленгликоль, додецилсульфат натрия или любая их комбинация. В случае лекарственных форм, используемых в виде таблеток и капсул, может быть также включен буфер.
Кроме того, модификатор скорости высвобождения (то есть, агент, способный изменять скорость высвобождения лекарственного средства) может быть также добавлен в твердую лекарственную форму для перорального введения для получения лекарственной формы с модифицированным высвобождением или импульсным высвобождением. Такой модификатор скорости высвобождения включает, но не ограничивается ими, карбоксипропилметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, натрий-содержащую карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, полиэтиленоксид, ксантановую камедь, изоакриловый аминосополимер, гидрогенизированное ароматизирующее масло, карнаубский воск, парафин, фталат ацетата целлюлозы, фталат карбоксипропилметилцеллюлозы, сополимер метакриловой кислоты или любую их комбинацию. Лекарственная форма с модифицированным высвобождением или импульсным высвобождением может содержать один или группу модификаторов скорости высвобождения.
Другой предпочтительной лекарственной формой является жидкая лекарственная форма для перорального введения, включая эмульсию, раствор, суспензию, сироп и т.п. Помимо активных ингредиентов, такая пероральная жидкая лекарственная форма может дополнительно содержать инертные растворители, обычно используемые специалистами в данной области, например, воду или другие растворители, такие как этиловый спирт, изопропанол, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масло (такое как масло семян хлопчатника, арахисовое масло, кукурузное масло, оливковое масло, ароматизирующее масло и кунжутное масло), глицерин, полиэтиленгликоль и сложный эфир жирной кислоты и сорбитана и любые их комбинации. Помимо этих инертных растворителей, такая жидкая лекарственная форма для перорального введения может дополнительно содержать увлажнитель, эмульгирующий агент, суспендирующий агент, подсластитель, ароматизатор, отдушку и т.п.
Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению могут присутствовать в унифицированной лекарственной форме в фармацевтической композиции для удобства введения. Фармацевтическая композиция согласно изобретению должна быть стерильной и стабильной в условиях ее приготовления и хранения.
Лекарственное средство и фармацевтическая композиция согласно изобретению могут быть использованы отдельно или в комбинации, либо они могут быть использованы в комбинации с дополнительным фармацевтически активным агентом (например, с другими противовирусными агентами, например, агентами типа интерферона, такими как интерферон или ПЭГилированный интерферон). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению используют в комбинации с другим(и) противовирусным(и) агентом(ами) для профилактики и/или лечения заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению и такой(ие) противовирусный(ие) агент(ы) могут быть введены одновременно, отдельно или последовательно. Такие противовирусные средства включают, но не ограничиваются ими, средства типа интерферона, рибавирин, адамантан, гидроксимочевину, IL-2, IL-12 и пентакарбоксицитозольную кислоту и т.п..
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может содержать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению. «Профилактически эффективное количество» означает количество, достаточное для предотвращения, подавления или задержки развития заболевания (такого как HBV-инфекция или заболевание, ассоциированное с HBV-инфекцией). «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое является достаточным для лечения или по меньшей мере частичного подавления заболевания и его осложнений у пациента с этим заболеванием. Терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению может варьироваться в зависимости от следующих факторов: тяжести заболевания, подлежащего лечению, общего состояния иммунной системы пациента, общих особенностей пациента, таких как возраст, масса и пол, и от способов введения лекарственных средств, дополнительных методов лечения, применяемых одновременно, и т.п.
Схема введения доз может быть скорректирована для обеспечения оптимального желаемого эффекта (например, терапевтического или профилактического эффекта). Так, например, может быть введена разовая доза, или могут быть введены дробные дозы в течение определенного периода времени, либо доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от остроты терапевтической ситуации.
Для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению, репрезентативный и неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества составляет от 0,025 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 50 мг/кг, более предпочтительно 0,1-25 мг/кг, 0,1-10 мг/кг. Следует отметить, что доза может варьироваться в зависимости от типа и тяжести заболевания, подлежащего лечению. Кроме того, специалисту в данной области известно, что для любого конкретного пациента, конкретная схема введения доз должна корректироваться с течением времени в зависимости от потребностей пациента и профессиональной оценки, сделанной врачом; причем, представленный здесь диапазон доз приводится лишь в целях иллюстрации, и не должен рассматриваться как ограничение применения или объема фармацевтической композиции согласно изобретению.
Набор и его использование для детектирования
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению могут специфически связываться с HBsAg, а поэтому они могут быть использованы для обнаружения присутствия или уровня HBsAg в образце.
Следовательно, в другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к набору, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению несет детектируемую метку. В других вариантах осуществления изобретения, набор дополнительно включает второе антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению. Предпочтительно, второе антитело дополнительно содержит детектируемую метку. Такие детектируемые метки хорошо известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются ими, радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, краситель и фермент (например, пероксидазу хрена) и т.п.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия или уровня белка HBsAg в образце, где указанный способ включает использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению дополнительно содержит детектируемую метку. В других вариантах осуществления изобретения, способ дополнительно включает использование второго антитела, несущего детектируемую метку, для детектирования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению. Этот способ может быть применен для диагностических целей или для не-диагностических целей (например, образцом является образец клеток, но не образец, взятый у пациента).
В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ включает: (1) контактирование образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом согласно изобретению; (2) детектирование образования комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и белком HBsAg или определение количества комплекса. Образование комплекса указывает на присутствие белка HBsAg и/или HBV.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к способу диагностики того, инфицирован ли индивидуум HBV, где указанный способ включает: использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению для обнаружения присутствия белка HBsAg в образце, взятом у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению дополнительно содержит детектируемую метку. В других вариантах осуществления изобретения, способ дополнительно включает использование второго антитела, несущего детектируемую метку, для обнаружения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению.
В другом своем аспекте, настоящее изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению в целях изготовления набора для обнаружения присутствия или уровня белка HBsAg в образце или для диагностики инфицирования индивидуума HBV-вирусом.
Определение терминов
В настоящем изобретении, если это не оговорено особо, используемые здесь научные и технические термины имеют общепринятые значения, хорошо известные специалистам в данной области. Кроме того, стадии культивирования клеток, биохимические анализы, определение химической структуры нуклеиновых кислот, лабораторные иммунологические анализы и другие рабочие стадии, описанные в настоящей заявке, являются рутинными стадиями, широко используемыми специалистами в соответствующих областях. В то же время, для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приводятся определения и объяснения соответствующих терминов.
Используемый здесь термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, обычно состоящей из двух пар полипептидных цепей, каждая из которых имеет легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (HC). Легкие цепи антитела можно подразделить на легкие цепи κ (каппа) и λ (лямбда). Тяжелые цепи можно классифицировать как μ, δ, γ, α или ε, а изотипы антител определены как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В легкой и тяжелой цепях, вариабельные и константные области соединены областью «J», состоящей приблизительно из 12 или более аминокислот, а тяжелая цепь также включает область «D», состоящую приблизительно из 3 или более аминокислот. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи состоит из 3 доменов (CH1, CH2 и CH3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область легкой цепи состоит из домена CL. Константный домен напрямую не участвует в связывании антитела и антигена, но обладает множеством эффекторных функций, таких как опосредование связывания иммуноглобулина с тканью или с фактором хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент классической системы комплемента (C1q). Области VH и VL также могут быть подразделены на гипервариабельные области (называемые областями, определяющими комплементарность (CDR)), чередующиеся с относительно консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 от амино-конца до карбокси-конца. Вариабельные области (VH и VL) каждой пары тяжелая цепь/легкая цепь образуют сайт связывания антигена, соответственно. Присвоение аминокислот в каждой области или домене может быть осуществлено в соответствии с определениями по Кэбату (Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)), или Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Биол. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883).
Используемый здесь термин «комплементарность-определяющая область» или «CDR» относится к аминокислотным остаткам в вариабельной области антитела, которые отвечают за связывание с антигеном. Каждая из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи содержит три CDR, названных CDR1, CDR2 и CDR3. Точные границы этих CDR могут быть определены в соответствии с различными системами нумерации, известными специалистам в данной области, например, в соответствии с системой нумерации по Кэбату (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), с системой нумерации по Чотия (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883) или с системой нумерации IMGT (Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003). Для данного антитела, специалисты в данной области могут легко идентифицировать CDR, определенные в соответствии с каждой системой нумерации. Кроме того, соответствие между различными системами нумерации хорошо известно специалистам в данной области (например, см. Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol. 27: 55-77, 2003).
В настоящем изобретении, CDR, содержащиеся в антителе или в его антигенсвязывающем фрагменте согласно изобретению, могут быть определены в соответствии с различными системами нумерации, известными специалистам. В некоторых вариантах осуществления изобретения, CDR, содержащиеся в антителе или в его антигенсвязывающем фрагменте согласно изобретению, предпочтительно определяют с помощью системы нумерации Кэбата, Чотия или IMGT. В некоторых вариантах осуществления изобретения, CDR, содержащиеся в антителе или в его антигенсвязывающем фрагменте согласно изобретению, предпочтительно определяют с помощью системы нумерации Кэбата.
Используемый здесь термин «остатки каркасной области» или «FR» относится к тем аминокислотным остаткам в вариабельной области антитела, которые не являются остатками CDR, как определено выше.
Термин «антитело» не ограничивается каким-либо конкретным способом получения антитела. Так, например, он включает рекомбинантное антитело, моноклональное антитело и поликлональное антитело. Антитело может представлять собой антитело другого изотипа, например, IgG (например, подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), антитело IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.
Используемый здесь термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела означает полипептид, содержащий фрагмент полноразмерного антитела, который сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или который конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном, и который также называют «антигенсвязывающей частью». В общих чертах, см. Руководство по фундаментальной иммунологии, гл. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, NY (1989), которое в полном объеме и во всех целях включено в настоящее описание посредством ссылки. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть получен с применением технологии рекомбинантных ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактного антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающего фрагмента включают Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, фрагменты комплементарность-определяющей области (CDR), scFv, диантитело, однодоменное антитело, химерное антитело, линейное антитело, наноантитело (полученное по технологии Domantis), проантитело и подобные полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть антитела, достаточную для сообщения полипептидам способности специфически связываться с антигеном. Сконструированные варианты антител рассматриваются в публикации Holliger et al. 2005; Nat Biotechnol, 23: 1126-1136.
Используемый здесь термин «полноразмерное антитело» означает антитело, состоящее из двух «полноразмерных тяжелых цепей» и двух «полноразмерных легких цепей». Термин «полноразмерная тяжелая цепь» означает полипептид, состоящий из вариабельной области тяжелой цепи (VH), домена CH1 константной области тяжелой цепи, шарнирной области (HR), домена CH2 константной области тяжелой цепи и домена CH3 константной области тяжелой цепи в направлении от N-конца до C-конца; и, если полноразмерное антитело относится к изотипу IgE, то оно также содержит, но необязательно, домен CH4 константной области тяжелой цепи. Предпочтительно, «полноразмерная тяжелая цепь» представляет собой полипептидную цепь, состоящую из VH, CH1, HR, CH2 и CH3 в направлении от N-конца до C-конца. «Полноразмерная легкая цепь» представляет собой полипептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL) в направлении от N-конца до C-конца. Две пары полноразмерных цепей антител связаны дисульфидной связью между CL и CH1 и дисульфидной связью между HR двух полноразмерных тяжелых цепей. Полноразмерное антитело согласно изобретению может происходить от одного вида, такого как человеческое антитело, и оно может также представлять собой химерное антитело или гуманизованное антитело. Полноразмерное антитело согласно изобретению содержит два антигенсвязывающих сайта, образованных парами VH и VL, соответственно, и эти два антигенсвязывающих сайта специфически распознают один и тот же антиген/связываются с ним.
Используемый здесь термин «Fd» относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VH и CH1; термин «фрагмент dAb» относится к фрагменту антитела, состоящему из домена VH (Ward et al., Nature 341: 544 546 (1989)); термин «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VL, VH, CL и CH1; термин «фрагмент F(ab')2» относится к фрагменту антитела, состоящему из двух фрагментов Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; термин «фрагмент Fab'» относится к фрагменту, полученному посредством восстановления дисульфидной связи, соединяющей два фрагмента тяжелой цепи во фрагменте F(ab')2, и состоит из интактной легкой цепи и фрагмента Fd (состоящего из доменов VH и CH1) тяжелой цепи.
Используемый здесь термин «Fv» относится к фрагменту антитела, состоящему из одноцепочесных доменов VL и VH антитела. Фрагмент Fv обычно считается наименьшим фрагментом антитела, который может образовывать полноразмерный антигенсвязывающий сайт. Обычно считается, что шесть CDR сообщают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако, даже одна вариабельная область (например, фрагмент Fd, который содержит только три антигенспецифических CDR) может распознавать антиген и связываться с ним, хотя его аффинность может быть ниже, чем аффинность полноразмерного сайта связывания.
Используемый здесь термин «Fc» относится к фрагменту антитела, который образуется посредством связывания второй и третьей константной области первой тяжелой цепи антитела и второй и третьей константной области второй тяжелой цепи посредством дисульфидной связи. Фрагмент Fc антитела выполняет множество различных функций, но не участвует в связывании с антигеном.
Используемый здесь термин «scFv» относится к одной полипептидной цепи, содержащей домены VL и VH, где VL и VH соединены линкером (см., например, Bird et al., Science 242: 423-426 (1988)); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); и Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Roseburg and Moore eds, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)). Такие молекулы scFv могут иметь общую структуру: NH2-VL-линкер-VH-COOH или NH2-VH-линкер-VL-COOH. Подходящие известные линкеры состоят из повторяющихся аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов. Так, например, может быть использован линкер, имеющий аминокислотную последовательность (GGGGS)4, но могут быть также использованы его варианты (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, описаны Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. В некоторых случаях, дисульфидные связи могут также присутствовать между VH и VL scFv.
Используемый здесь термин «диантитело» означает антитело, в котором его домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но в котором, используемый линкер является слишком коротким, что не позволяет двум доменам одной и той же цепи спариваться друг с другом, и приводит к тому, что один домен вынужден спариваться с комплементарным доменом другой цепи с образованием двух антигенсвязывающих сайтов (см., например, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), и Poljak RJ et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)).
Каждый из вышеупомянутых фрагментов антитела сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурировать с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном.
Стандартные методы, известные специалистам в данной области (например, технология рекомбинантных ДНК или ферментативная или химическая фрагментация), могут быть применены для получения антигенсвязывающих фрагментов антитела (например, вышеупомянутых фрагментов антител) из данного антитела (например, антитела согласно изобретению), и эти фрагменты могут быть скринированы на специфичность таким же образом, как и интактные антитела.
В данном случае, если это не оговорено особо, при употреблении термина «антитело», подразумевается, что он включает не только интактное антитело, но также и антигенсвязывающие фрагменты антитела.
Используемые здесь термины «моноклональное антитело», «McAb» и «mAb» имеют одинаковое значение и могут использоваться как синонимы. Эти термины относятся к антителу или фрагменту антитела из популяции высокогомологичных молекул антител, то есть, популяции полностью идентичных молекул антител, за исключением природной мутации, которая может возникать спонтанно. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью к одному эпитопу антигена. Поликлональное антитело, по сравнению с моноклональным антителом, обычно включает по меньшей мере два или более различных антител, которые обычно распознают различные эпитопы на антигене. Кроме того, термин «моноклональное» просто указывает на тип антитела, полученного из высокогомогенной популяции антител, и этот термин не следует истолковывать как антитело, которое должно быть получено каким-либо конкретным методом.
Используемый здесь термин «химерное антитело» относится к антителу, часть легкой цепи или/или тяжелой цепи которого происходит от одного антитела (которое может происходить от определенного вида антитела или принадлежать к определенному классу или подклассу антител), а другая часть его легкой цепи и/или тяжелой цепи происходит от другого антитела (которое может происходить от того же или разных видов или принадлежать к тому же или к другому классу или подклассу антител), но в любом случае, оно все еще сохраняет активность связывания с антигеном-мишенью (Патент США 4816567, Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 6855 (1984)). Так, например, термин «химерное антитело» может включать такое антитело (например, химерное антитело человек-мышь), в котором вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела происходят от первого антитела (например, мышиного антитела), тогда как константные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела происходят от второго антитела (например, человеческого антитела). Для получения химерного антитела, способы, известные специалистам в данной области, могут быть применены для связывания вариабельных областей иммуноглобулина иммунизованного животного с константными областями иммуноглобулина человека (см., например, патент США №4816567, Cabilly et al.). Так, например, ДНК, кодирующую VH, функционально связывают с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи, для получения полноразмерного гена тяжелой цепи. Последовательность гена константной области тяжелой цепи человека известна специалистам в данной области (см., например, Kabat, EA et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Публикацию NIH №91-3242), а фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены стандартными методами ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но обычно, она представляет собой предпочтительно константную область IgG1 или IgG4. Так, например, ДНК, кодирующую VL, функционально присоединяют к другой молекуле ДНК, кодирующей константную область легкой цепи CL, для получения полноразмерного гена легкой цепи (и гена легкой цепи Fab). Последовательность гена константной области легкой цепи человека известна специалистам в данной области (см., например, Kabat, EA et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, публикация NIH №91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены стандартными методами ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область κ или λ, но обычно, предпочтительно она представляет собой константную область κ.
Используемый здесь термин «гуманизованное антитело» относится к генетически сконструированному не-человеческому антителу, аминокислотная последовательность которого была модифицирована для повышения гомологии с последовательностью человеческого антитела. Вообще говоря, все области или часть областей CDR гуманизованного антитела происходят от не-человеческого антитела (донорного антитела), и все области или часть областей не-CDR (например, вариабельной области FR и/или константной области) происходят от человеческого иммуноглобулина (рецепторного антитела). В некоторых вариантах осуществления изобретения, области CDR гуманизованного антитела происходят от не-человеческого антитела (донорных антител), и все области или часть областей не-CDR (например, вариабельной области FR и/или константных областей) происходят от человеческого иммуноглобулина (рецепторного антитела). Гуманизированное антитело обычно сохраняет ожидаемые свойства донорного антитела, включая, но не ограничиваясь ими, специфичность к антигену, аффинность к антигену, способность реагировать с антигеном и т.п. Донорное антитело может представлять собой мышиное, крысиное или кроличье антитело или антитело примата, не являющегося человеком (например, собакоподобной обезьяны) с желаемыми свойствами (например, со специфичностью к антигену, аффинностью к антигену, способностью реагировать с антигеном и т.п.). Для получения гуманизованного антитела, методы, известные специалистам в данной области, могут быть применены для встраивания областей CDR иммунизованного животного в каркасные последовательности человеческого антитела (см. патент США №5225539, Winter; патент США №5530101, Queen et al.; 5585089; 5693762 и 6180370; и Lo, Benny, KC, editor, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004).
Используемый здесь термин «ген антитела зародышевой линии» или «сегмент гена антитела зародышевой линии» относится к последовательности, присутствующей в геноме организма, кодирующего иммуноглобулин, который не прошел процесса созревания, и который может приводить к генетическим реаранжировкам и мутациям при экспрессии конкретного иммуноглобулина. В настоящем изобретении, выражение «ген зародышевой линии тяжелой цепи» относится к гену антитела зародышевой линии или к фрагменту гена, кодирующему тяжелую цепь иммуноглобулина, где указанный ген включает ген V (вариабельный), ген D (дивергентный), ген J (сцепленный) и ген C (константный); аналогичным образом, выражение «ген зародышевой линии легкой цепи» относится к гену антитела зародышевой линии или к фрагменту гена, кодирующему легкую цепь иммуноглобулина, где указанный ген включает ген V (вариабельный), ген D (дивергентный), ген J (сцепленный) и ген C (константный). В настоящем изобретении, аминокислотная последовательность, кодируемая геном антитела зародышевой линии или фрагментом гена антитела зародышевой линии, также называется «последовательностью зародышевой линии». Ген антитела зародышевой линии или фрагмент гена антитела зародышевой линии и соответствующие им последовательности зародышевой линии хорошо известны специалистам в данной области и могут быть получены или взяты из профессиональных баз данных по запросу (например, IMGT, unswag, NCBI или VBASE2).
Используемый здесь термин «специфическое связывание» относится к реакции специфического связывания между двумя молекулами, такой как реакция между антителом и антигеном, на который оно направлено. Сила или аффинность специфического связывания может быть выражена константой равновесной диссоциации (KD) при взаимодействии. В настоящем изобретении, термин «KD» означает константу равновесной диссоциации при специфическом взаимодействии антитело-антиген, которая используется для описания аффинности связывания между антителом и антигеном. Чем меньше константа равновесной диссоциации, тем прочнее связывание антитела с антигеном и тем выше аффинность между антителом и антигеном. Свойства специфического связывания между двумя молекулами могут быть оценены с применением методов, известных специалистам в данной области, например, с применением поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIACORE.
Используемое здесь выражение «связывание при нейтральном pH с аффинностью выше, чем при кислотном pH» или эквивалентное выражение «pH-зависимое связывание» означает, что антитело согласно изобретению имеет значение KD или значение EC50 для связывания HBsAg при кислотном pH, которое выше, чем значение KD или значение EC50 для связывания с HBsAg при нейтральном pH. KD может быть определена известным методом, например, ППР-методом (например, на Biacore). В настоящем изобретении, термин «ЕС50» означает полумаксимальную эффективную концентрацию, необходимую для связывания антитела с антигеном, то есть, концентрацию антитела, необходимую для достижения 50% максимального эффекта связывания между специфическим антителом и антигеном, и этот термин используется для описания способности к связыванию между антителом и антигеном. Чем меньше ЕС50, тем выше связывающая способность между антителом и антигеном. Полумаксимальная эффективная концентрация, необходимая для связывания антитела с антигеном (ЕС50), может быть определена известными методами, например, с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), в котором антиген связывается с твердофазным носителем, а антитело специфически связывается с антигеном.
Используемый здесь термин «нейтрализующее антитело» относится к антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту, которое может значительно снижать или полностью ингибировать вирулентность (например, способность инфицировать клетки) вируса-мишени. Вообще говоря, нейтрализующие антитела могут распознавать и связывать вирус-мишень и предотвращать попадание вируса-мишени в клетки/инфицирование вирусом-мишенью клеток индивидуума. Антитело согласно изобретению представляет собой нейтрализующее антитело.
Однако, следует отметить, что в настоящей заявке, способность антитела к нейтрализации вирусов не эквивалентна способности антитела к удалению вирусов. Используемый здесь термин «нейтрализация вирус» означает, что вирулентность вируса-мишени нейтрализуется (то есть, вирулентность вируса-мишени значительно снижается или полностью ингибируется) путем ингибирования проникновения вируса-мишени в клетки/инфицирования вирусом-мишенью клеток индивидуума. Используемый здесь термин «удаление вируса» означает, что вирус-мишень (независимо от того, заражает ли он клетку или нет) удаляется из организма, а поэтому организм переходит в состояние до заражения вирусом (например, результат серологического теста на вирус становится отрицательным). Поэтому, обычно, нейтрализующие антитела не обязательно обладают способностью очищать организм от вирусов. Однако, автором настоящей заявки было неожиданно обнаружено, что антитела согласно изобретению могут не только нейтрализовать HBV, но также и удалять вирус (то есть, могут удалять ДНК HBV и/или HBsAg in vivo и удалять HBV и HBV-инфицированные клетки in vivo), а поэтому они имеют важное клиническое значение.
Используемый здесь термин «выделенный» относится к состоянию, искусственно полученному из природного состояния. Если определенное «выделенное» вещество или компонент присутствуют в природе, то оно может быть таким в результате изменения естественной среды, или это вещество было выделено из естественной среды, либо и то, и другое. Так, например, определенный невыделенный полинуклеотид или полипептид существует в природе в организме определенного животного, и такой же полинуклеотид или полипептид, выделенный из такого природного окружения с высокой чистотой, называется выделенным полинуклеотидом или полипептидом. Термин «выделенный» не исключает ни смешанное искусственное или синтезированное вещество, ни другие примесные вещества, которые не влияют на активность выделенного вещества.
Используемый здесь термин «вектор» относится к носителю нуклеиновой кислоты, в который может быть встроен полинуклеотид. Если вектор обеспечивает экспрессию белка, кодируемого встроенным полинуклеотидом, то этот вектор называется экспрессионным вектором. Вектор может быть введен в клетку-хозяина путем трансформации, трансдукции или трансфекции, так, чтобы элементы генетического материала, переносимые вектором, могли экспрессироваться в клетке-хозяине. Векторы хорошо известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются ими: плазмиды; фагмиды; космиды; искусственные хромосомы, такие как дрожжевые искусственные хромосомы (YAC), бактериальные искусственные хромосомы (BAC) или искусственные хромосомы на основе P1 (PAC); бактериофаги, такие как фаг λ или фаг M13, и вирусы животных. Вирусы животных, которые могут быть использованы в качестве векторов, включают, но не ограничиваются ими, ретровирусы (включая лентивирусы), аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса (например, вирус простого герпеса), поксвирусы, бакуловирусы, вирусы папилломы, паповавирусы (например, SV40). Вектор может содержать множество элементов, которые регулируют экспрессию, включая, но не ограничиваясь ими, последовательность промотора, последовательность инициации транскрипции, последовательность энхансера, элемент отбора и репортерный ген. Кроме того, вектор может содержать сайт инициации репликации.
Используемый здесь термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую может быть введен вектор, и которая включает, но не ограничивается ими, прокариотическую клетку, такую как Escherichia coli или Bacillus subtilis, клетку грибов, такую как дрожжевая клетка или Aspergillus, клетку насекомого, такую как клетка S2 Drosophila или Sf9, или клетку животного, такую как фибробласт, клетка CHO, клетка COS, клетка NSO, клетка HeLa, клетка BHK, клетка HEK 293 или клетка человека.
Используемый здесь термин «идентичность» относится к степени соответствия между двумя полипептидами или между двумя нуклеиновыми кислотами. Если две последовательности для сравнения содержат одну и ту же субъединицу мономера основания или аминокислоты в определенном сайте (например, каждая из двух молекул ДНК имеет аденин в определенном сайте или каждый из двух полипептидов имеет лизин в определенном сайте), то две молекулы являются идентичными в этом сайте. Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от количества идентичных сайтов, общих для двух последовательностей, по отношению к общему количеству сайтов для сравнения, умноженному на 100. Так, например, если совпадают 6 из 10 сайтов двух последовательностей, то эти две последовательности имеют идентичность 60%. Так, например, последовательности ДНК: CTGACT и CAGGTT идентичны на 50% (если совпадают 3 из 6 сайтов). Обычно сравнение двух последовательностей проводят таким образом, чтобы обеспечивалась максимальная идентичность. Такое выравнивание может быть проведено с использованием компьютерной программы, такой как программа Align (DNAstar, Inc.), которая основана на методе Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970). Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть также определен с помощью алгоритма E. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весовых остатков PAM120, штрафа за длину пробела 12, и штрафа за пробел 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями может быть определен с помощью алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol.48: 444-453 (1970)), который был включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступого на сайте http://www.gcg.com), с использованием матрицы Blossum 62 или матрицы PAM250, и веса пробела, равного 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и веса длины, равного 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Двадцать незаменимых аминокислот, используемых в настоящей заявке, экспрессируются обычным образом. См., например, публикацию Immunology-A Synthesis (2nd Edition, ES Golub и DR Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), которая включена в настоящее описание посредством ссылки. В настоящем изобретении, термины «полипептид» и «белок» имеют свое общепринятое значения и используются как синонимы. Кроме того, в настоящем изобретении, аминокислоты обычно представлены однобуквенными и трехбуквенными аббревиатурами, как известно специалистам в данной области. Так, например, аланин может быть обозначен буквой A или Ala. Кроме того, используемые здесь термины «моноклональное антитело» и «McAb» имеют одинаковое значение и могут использоваться как синонимы; термины «поликлональное антитело» и «PcAb» имеют одинаковое значение и могут использоваться как синонимы.
Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель» означает носитель и/или наполнитель, которые являются фармакологически и/или физиологически совместимыми с индивидуумом, и активный агент, хорошо известный специалистам в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), и включающий, но не ограничивающийся ими, регулятор pH, поверхностно-активное вещество, адъювант, усилитель ионной силы, разбавитель, агент, регулирующий осмотическое давление, агент, замедляющий всасывание, и консервант. Так, например, регулятор pH включает, но не ограничивается им, фосфатный буфер. Поверхностно-активное вещество включает, но не ограничивается ими, катионное, анионное или неионное поверхностно-активное вещество, например Твин-80. Усилитель ионной силы включает, но не ограничивается им, хлорид натрия. Консервант включает, но не ограничивается ими, различные антибактериальные и противогрибковые средства, такие как парабен, хлорбутанол, фенол и сорбиновая кислота. Агент, регулирующий осмотическое давление, включает, но не ограничивается ими, сахар, NaCl и его аналоги. Агент, замедляющий всасывание, включает, но не ограничивается ими, моностеарат и желатин.
Используемый здесь термин «профилактика/предотвращение» относится к способу, который применяется для подавления или отсрочки возникновения заболевания, расстройства или симптома (такого как HBV-инфекция или заболевание, ассоциированное с HBV-инфекцией) у индивидуума. Используемый здесь термин «лечение/терапия» относится к способу, который применяется для достижения благоприятного или желаемого клинического результата. В соответствии с настоящим изобретением, благоприятный или желаемый клинический результат включает, но не ограничивается ими, ослабление симптомов, снижение распространения заболевания, стабилизацию (то есть, отсутствие осложнений) заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания и ослабление симптомов (частично или полностью), независимо от того, поддаются ли они обнаружению или нет. Кроме того, термин «лечение» также относится к более продолжительному периоду выживания по сравнению с ожидаемым периодом выживания (если лечение не проводится). В настоящем изобретении, антитело согласно изобретению обладает способностью нейтрализовать HBV, а поэтому оно может быть использовано для предотвращения/защиты здорового индивидуума или его клеток от HBV-инфекции. Кроме того, антитело согласно изобретению обладает способностью удалять HBV (то есть, оно способно удалять ДНК HBV и/или HBsAg in vivo, удалять HBV и клетки, инфицированные HBV in vivo), а поэтому оно может быть использовано для лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией, у инфицированного индивидуума.
Используемый здесь термин «индивидуум» означает млекопитающее, такое как примат, например, человек.
Используемый здесь термин «эффективное количество» означает количество, которое является достаточным для достижения или по меньшей мере частичного достижения ожидаемого эффекта. Так, например, количество, эффективное для профилактики заболевания (такого как HBV-инфекция или заболевания, ассоциированные с HBV-инфекцией), относится к количеству, эффективному для профилактики, подавления или отсрочки возникновения заболевания (такого как HBV-инфекция или заболевания, ассоциированные с HBV-инфекцией). Эффективное количество для лечения заболевания означает количество, эффективное для лечения или по меньшей мере частичного блокирования заболевания и его осложнений у пациента, страдающего этим заболеванием. Определение такого эффективного количества находится в компетенции специалиста в данной области. Так, например, количество, эффективное для терапевтического применения, зависит от тяжести заболевания, подлежащего лечению, общего состояния иммунной системы пациента, общих особенностей пациента, таких как возраст, масса и пол, способов введения лекарственных средств, дополнительных методов лечения, применяемых одновременно, и т.п.
Благоприятные эффекты настоящего изобретения
Антитело согласно изобретению не только может специфически распознавать/связывать HBsAg, нейтрализовать вирулентность HBV, снижать уровень ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке у индивидуума и эффективно удалять HBV и HBV-инфицированные клетки из организма, но также дает значительно улучшенный эффект выведения антигена и снижает время подавления антигена. Особенно удивительно то, что, как известно специалистам в данной области, у пациентов с хроническим гепатитом B наблюдается тенденция к истощению иммунитета (толерантности) к HBV из-за высоких уровней HBsAg в организме, что тем самым продлевает присутствие инфекции, но антитело согласно изобретению может активировать организм индивидуума (например, у пациентов с хронической HBV-инфекцией или у пациентов с хроническим гепатитом B) на восстановление гуморального иммунного ответа против HBV, ускоряя тем самым процесс излечения. Следовательно, антитело согласно изобретению является особенно подходящим для профилактики и лечения HBV-инфекции и заболеваний, ассоциированных с HBV-инфекцией (например, гепатита B). Кроме того, антитело согласно изобретению обладает pH-зависимыми антигенсвязывающими свойствами, и одна молекула антитела может связываться с множеством молекул антигенов, что также позволяет снижать частоту и дозу введения, а поэтому имеет высокую клиническую ценность.
Варианты осуществления настоящего изобретения будут подробно описаны ниже вместе с прилагаемыми чертежами и примерами. Однако, специалистам в данной области очевидно, что нижеследующие чертежи и примеры используются только для иллюстрации настоящего изобретения, но не для ограничения объема настоящего изобретения. Согласно прилагаемым чертежам и нижеследующему подробному описанию предпочтительных вариантов осуществления изобретения, различные цели и преимущественные аспекты настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена схематическая диаграмма принципа действия антитела с pH-зависимой антигенсвязывающей активностью. Плазма человека является нейтральной при pH приблизительно 7,4, в то время как внутриклеточная среда является кислотной и имеет pH приблизительно 6,0. Антитело с pH-зависимой антигенсвязывающей активностью может связываться с антигеном в плазме, после чего комплекс антиген-антитело интернализуется в клетку. рH-зависимое антитело будет диссоциироваться из антигена в кислотной среде эндосомы. Антитело, диссоциированное из антигена, захватывается FcRn и распространяется за пределы клетки. Во внеклеточной нейтральной среде, FcRn высвобождает антитело, и антитело, возвращенное в плазму, может снова связываться с другим антигеном, что позволяет реализовать цикл использования антитела.
На фиг. 2 показано моделирование трехмерной структуры вариабельной области M1D. Палочкообразная структура представляет собой область CDR, синим цветом показана CDR VK, зеленым цветом показана CDR VH, а красным цветом показаны поверхностные аминокислоты. В области CDR присутствует всего 25 поверхностных аминокислот.
На фиг. 3 представлена схематическая диаграмма рекомбинантного вектора (pCGMT-scFv), кодирующего антитело scFv, где антитело scFv имеет структуру NH2-VH-линкер-VL-COOH.
На фиг. 4A-4C показаны результаты ELISA-анализа фаговой библиотеки, представляющей pH-зависимое антитело scFv, происходящее от M1D, и антиген HBsAg. На Фиг. 4A показаны результаты обнаружения связывания с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 для фаговой библиотеки pH-зависимого scFv-антитела, полученного из M1D, после третьего раунда скрининга, где на оси абсцисс представлены номер фагового антитела или коэффициент разведения, а на оси ординат представлено значение OD. Эти результаты показали, что все эти отдельные клоны обладают сильной антигенсвязывающей активностью и значительно снижают связывающую активность при pH 6,0. На Фиг. 4B показаны результаты детектирования рН-зависимого связывания с HBsAg для 6 отдельных клонов с высокой величиной OD(450/630) при рН 7,4 в третьем раунде и показано большое различие величин OD(450/630) при рН 7,4 и pH 6,0, с 8 градиентами и 3-кратным разведением, где на оси абсцисс представлен коэффициент разведения, а на оси ординат представлено значение OD. Результаты показали, что pH-зависимый эффект связывания антигена лучше проявляется после градиентного разведения, среди которых A31-73 показывает лучший эффект. На Фиг. 4C показаны предварительные результаты pH-зависимого детектирования связывания фага scFv-антитела с HBsAg для 24 превосходных кандидатов фага-scFv после четвертого раунда скрининга с 4 градиентами и 5-кратным разведением, где на оси абсцисс показан коэффициент разведения, а на оси ординат показано значение OD. Результаты показали, что A41-8, A42-12 и A42-23 лучше, чем A31-73, а A44-1 и A44-20 эквивалентны A31-73.
На фиг. 5 представлены систематизированные сайты мутаций A31-73, A42-13, A42-23 и A41-8.
На фиг. 6 представлены результаты ВЭЖХ-анализа для A31-73, A42-12, A42-23 и A41-8 в Примере 2, где M1D-C/S представляет собой позитивный контроль, относящийся к различным партиям антител M1D, и как можно видеть по результатам, четыре антитела являются однокомпонентными.
На фиг. 7 показаны результаты обнаружения связывания с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 для A31-73, A42-12, A42-23 и A41-8 в Примере 3, где на оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log10 нг/мл), а на оси ординат представлено значение OD. Результаты показали, что все четыре антитела могут поддерживать эквивалентную антигенсвязывающую активность при нейтральном pH исходного антитела, и все они показывают значительное снижение антигенсвязывающей активности в условиях pH 6,0, при которых A31-73 лучше, чем A42-12, A42-23 и A41-8.
На фиг. 8A-8B показаны результаты терапевтического действия A31-71, A41-8, A42-12 и родительского M1D на трансгенных HBV-самках мышей в Примере 3. На Фиг. 8A показан эффект клиренса HBsAg в сыворотке мыши, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлен уровень HBsAg в сыворотке мыши после клиренса (log10 МЕ/мл). На Фиг. 8B показано изменение концентрации антитела в сыворотке мыши, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлена концентрация антитела (Log10 нг/мл). Результаты показали, что уровень HBsAg в случае M1D возвращается к исходному уровню приблизительно через 10 дней, в то время как в случае модифицированных антител согласно изобретению, этот уровень возвращаются к исходному уровню приблизительно через 15 дней; при этом, что касается концентрации антител в сыворотке, то M1D имеет самую низкую концентрацию антител на 10 день, в то время как три модифицированных антитела все еще могут быть обнаружены на 15-й день, что указывает на то, что pH-зависимые модифицированные антитела демонстрируют способность удалять HBsAg, сравнимую с такой способностью родительского антитела, и у них, время ингибирования антигена больше, чем у родительского антитела, то есть, их эффект выведения может проявляться в течение более длительного периода времени.
На фиг. 9 показан принцип действия акцепторного антитела. pH-зависимая антигенсвязывающая активность играет определенную роль в клетках. Таким образом, если этот первый ограничивающий фактор проникновения в клетку не нарушен, то pH-зависимые антигенсвязывающие свойства не будут применяться впоследствии, и польза от модификации будет значительно снижена. Акцепторное антитело, полученное путем последующей мутации аминокислот в области Fc, может повышать уровень связывания с рецептором hFcRn при нейтральном pH или повышать уровень связывания с рецептором FcγR. Как показано на фиг. 9, акцепторное антитело находится вне клетки и действует как «транспортное средство» для реципрокного транспорта антигенов в клетку, а поэтому, время полужизни антитела может быть значительно увеличено, и это антитело может снова связываться с антигеном, что будет повышать эффективность проникновения антигена в клетку и тем самым значительно повышать эффективность клиренса.
На фиг. 10 показаны результаты ВЭЖХ-анализа для двух молекул A31-73 и A41-8 в Примере 4, где красным и зеленым цветом показаны нерелевантный позитивный контроль. Эти результаты показали, что все антитела являются однокомпонентными.
На фиг. 11 показаны результаты определения связывания с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 для A31-73 V4 и A41-8 V4 в Примере 4, где на оси абсцисс представлена концентрация антитела (log10 нг/мл), а на оси ординат представлено значение OD. Результаты показали, что обе молекулы могут поддерживать антигенсвязывающую активность и pH-зависимую антигенсвязывающую активность родительского антитела при нейтральном pH, а pH-зависимая антигенсвязывающая активность немного увеличивается.
На фиг. 12A-12B показаны результаты иммунофлуоресцентного анализа на клетках MDCK с использованием A31-73 V4 и A31-73 (фиг. 12A) и A41-8 V4 и A41-8 (фиг. 12B) в Примере 4. Флуоресцентное излучение в зеленом диапазоне спектра соответствует hFcRn, флуоресцентное излучение в синем диапазоне спектра соответствует ядру, а флуоресцентное излучение в красном диапазоне спектра соответствует HBsAg. Результаты показали, что интенсивности флуоресценции антигена в клетках, обработанных вариантами A31-73 V4 и A41-8 V4, значительно выше, чем в клетках, обработанных A31-73 и A41-8, что указывает на то, что акцепторное антитело с модификацией V4 может эффективно транспортировать большее число антигенов в клетки. Было подтверждено, что мутация V4 в акцепторном антителе может повышать уровень связывания антитела с hFcRn в нейтральных условиях. После проникновения комплекса антиген-антитело в клетку, этот комплекс антиген-антитело диссоциируется при внутриклеточном pH только приблизительно 6,0, и антитело возвращается на поверхность клетки, для того, чтобы снова выполнять антигенсвязывающую функцию. Повышение способности акцепторного антитела связываться с hFcRn в нейтральных условиях может улучшать последующие pH-зависимые антигенсвязывающие свойства.
На фиг. 13A-13C показаны терапевтические эффекты двух акцепторных антител A31-73 V4 и A41-8 V4, M1D и негативного контроля 16G12 после однократной инъекции через хвостовую вену в дозе 20 мг/кг трансгенным мышам hFcRn со стабильным титром вируса HBV в Примере 4. На Фиг. 13A показан эффект клиренса HBsAg в сыворотке мышей, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлен уровень клиренса HBsAg в сыворотке мышей (log10 МЕ/мл). На Фиг. 13B показан эффект клиренса ДНК HBV в сыворотке мыши, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлен уровень клиренса ДНК HBV в сыворотке мыши (log10 МЕ/мл). На Фиг. 13C: показано изменение концентрации антитела в сыворотке мыши, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлена концентрация антитела (Log10 нг/мл). Результаты показали, что акцепторные антитела обладают способностью к клиренсу антигена, сравнимой с активностью M1D, но имеют более длительное время ингибирования. После достижения максимального клиренса антигена посредством M1D, уровень антигена быстро начинает восстанавливаться, и M1D уже является неэффективным на 14 день, а HBsAg в сыворотке возвращается к исходному уровню (как было определено исходя из негативного контроля 16G12). Однако, после того, как два акцепторных антитела будут давать максимальный эффект клиренса, они все еще могут поддерживать низкий уровень антигена в течение длительного периода времени, а затем этот уровень будет медленно восстанавливаться. В группе обработки A41-8 V4, HBsAg возвращается к исходному уровню приблизительно через 30 дней. A31-73 V4 показал лучшую эффективность, и после ожидаемого окончания эксперимента, HBsAg все еще не возвращался к исходному уровню, что соответствует результатам определения времени полужизни антитела в сыворотке.
На фиг. 14 показаны результаты в белковом геле для A31-73 DY в Примере 4, где M1D представляет собой позитивный контроль. Из этих результатов видно, что все антитела являются однокомпонентными.
На Фиг. 15 показаны результаты обнаружения связывания A31-73 DY с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 в Примере 4, где на оси абсцисс представлена концентрация антитела (log10 нг/мл), а на оси ординат представлено значение OD. Результаты показали, что A31-73 DY может поддерживать антигенсвязывающую активность и pH-зависимую антигенсвязывающую активность родительского антитела при нейтральном pH, а pH-зависимая антигенсвязывающая активность немного увеличивается.
На фиг. 16 показаны результаты эксперимента по оценке иммунофлуоресценции для A31-73 DY и A31-73 на мышиных первичных макрофагах в Примере 4, где флуоресцентное излучение в зеленом диапазоне спектра соответствует hFcRn, флуоресцентное излучение в синем диапазоне спектра соответствует ядру, а флуоресцентное излучение в красном диапазоне спектра соответствует HBsAg. Результаты показали, что модификация DY усиливает фагоцитоз комплексов антиген-антитело мышиными макрофагами.
На фиг. 17A-17C показаны терапевтические эффекты акцепторного антитела DY A31-73 и M1D в примере 4 после однократной инъекции в хвостовую вену в дозе 5 мг/кг HBV-трансгенным мышам. Фиг. 17A: эффект клиренса HBsAg в сыворотке мышей, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлен уровень клиренса HBsAg в сыворотке мышей (log10 МЕ/мл). На Фиг. 17B показан эффект клиренса ДНК HBV в сыворотке мыши, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлен уровень клиренса ДНК HBV в сыворотке мыши (log10 МЕ/мл). На Фиг. 17C показано изменение концентрации антитела в сыворотке мыши, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлена концентрация антитела (нг/мл). Результаты показали, что акцепторное антитело A31-73 DY с модификацией DY более чем на порядок превышает клиренс антигена посредством M1D. A31-73 DY может не только быстро удалять HBsAg у HBV-трансгенных мышей, но также эффективно снижать титр ДНК HBV у мышей, что соответствует результатам определения времени полужизни антител в сыворотке. Сравнение результатов оценки концентрации антител в сыворотке показало, что время полужизни A31-73 DY превышает время полужизни M1D почти на 8 дней, что указывает на то, что акцепторное антитело A31-73 DY выполняет функцию реципрокного связывания с антигеном, что тем самым увеличивает время клиренса антигена.
На фиг. 18A-18C показан терапевтический эффект акцепторного антитела A31-73 DY и негативного контроля 16G12 в Примере 4 после 5-кратной инъекции акцепторного антитела в дозе 5 мг/кг мышам с моделью HBV, полученной путем трансфекции аденоссоциированного вируса. На Фиг. 18A представлена схематическая диаграмма этого эксперимента на животных, где число означает количество дней, красная стрелка указывает на момент времени забора крови, а белая стрелка указывает на время введения. На Фиг. 18B показан эффект клиренса HBsAg в сыворотке мышей, где на оси абсцисс представлено количество дней после инъекции антитела (d), а на оси ординат представлен уровень клиренса HBsAg в сыворотке мышей (log10 МЕ/мл). На Фиг. 18C показаны относительные титры анти-HB антител в сыворотке мыши, где на оси абсцисс представлено название антитела, а на оси ординат представлен относительный титр анти-HB антител (log10 OD450/OD630). Результаты показали, что акцепторное антитело A31-73 DY преодолевает ограничения традиционных антител и обеспечивает лечение в низких дозах и с низкой частотой введения, где титр HBsAg у мышей ингибируется в течение длительного периода времени на уровне ниже 100 МЕ/мл, и гуморальный иммунный ответ быстро активируется после лечения, что позволяет получить анти-HB антитела.
Информация о последовательностях
Информация о неполных последовательностях, используемых в настоящем изобретении, представлена ниже в Таблице 1.
Таблица 1: Описание последовательностей
SEQ ID NO | Описание | Информация о последовательности |
1 | A31-73 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIHSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGPGHHTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGHHDYAFDFWGQGTTVTVSS |
2 | A31-73 A42-12 VK | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVP.SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHYLPLTFGGGTKVEIK |
3 | A42-12 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIHHNFWSWIRQPPGKGLEWIGYIHGPGHYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS |
4 | A42-23 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITHNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGYDTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGHHDYAFDFWGQGTTVTVSS |
5 | A42-23 VK | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDIHHSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVP.SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHYLPLTFGGGTKVEIK |
6 | A41-8 VH | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHHYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS |
7 | A41-8 VK | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISYSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVP.SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHYLPLTFGGGTKVEIK |
8 | A31-73 HCDR1 |
GGSIHSNFW |
9 | A31-73 HCDR2 |
SGPGHHT |
10 | A31-73 A42-23 HCDR3 | ARSHDYGHHDYAFDF |
11 | M1D A31-73 A42-12 LCDR1 |
QDISSS |
12 | M1D A31-73 A42-12 A42-23 A41-8 LCDR2 |
YAN |
13 | A31-73 A42-12 A42-23 A41-8 LCDR3 | QQYHYLPLT |
14 | A42-12 HCDR1 |
GGSIHHNFW |
15 | A42-12 HCDR2 |
HGPGHYT |
16 | M1D A42-12 HCDR3 |
ARSHDYGSNDYAFDF |
17 | A42-23 HCDR1 |
GGSITHNFW |
18 | A42-23 HCDR2 |
SGYDTYT |
19 | A42-23 LCDR1 |
QDIHHS |
20 | M1D A41-8 HCDR1 |
GGSITSNFW |
21 | M1D A41-8 HCDR2 |
SGSGTYT |
22 | A41-8 HCDR3 |
ARSHHYGSNDYAFDF |
23 | A41-8 LCDR1 |
QDISYS |
24 | M1D HFR1 |
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS |
25 | M1D HFR2 |
SWIRQPPGKGLEWIGYI |
26 | M1D HFR3 |
DYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC |
27 | M1D HFR4 |
WGQGTTVTVSS |
28 | M1D LFR1 |
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAT |
29 | M1D LFR2 |
LNWYQQKPGKAPKLLIY |
30 | M1D LFR3 |
RLQSGVP.SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC |
31 | M1D LFR4 |
FGGGTKVEIK |
32 | Праймер | 5'>GTTATTACTCGTGGCCCAGCCGGCCATGGCACAGGTGCAGCTGCAGGAG<3' |
33 | Праймер | 5'>CACTCCAGACCCTTCCCTGGGGGCTGGCGGATCCAGCTCCAGAAGTTGYKGKKGATGYKGYSGYSAGAGAC <3' |
34 | Праймер | 5'>CCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGATTGGGTATATCYMTGGTYMTSRTMMTYATMMCGACTACAACCCCTC <3' |
35 | Праймер | 5'>CCCTTGGCCCCAGAAATCAAAAGCGTRGTSGTKGYKGYSGTRGTSGTGCGATCTCGCACAGTAATAC <3' |
36 | Праймер | 5'>CCTCCACTCCCGCCTCCACCTGAAGAGACGGTGACGGTGGTCCCTTGGCCCCAGAAAT<3' |
37 | Праймер | 5'>TGGAGGCGGGAGTGGAGGTGGCGGATCTGGAGGGGGTGGTAGCGACATACAGATGACGCAG<3' |
38 | Праймер | 5'>TGCTGATACCAATTTAAAGAACTGCTAATGTCSTGAGTTGCCCGGCAAGTG <3' |
39 | Праймер | 5'>TCTTTAAATTGGTATCAGCAAAAACCGGGGAAAGCCCC<3' |
40 | Праймер | 5'>CACCTTGGTCCCTCCGCCGAAAGTGAGGKGTAAACTATGGTRCTGTTGACAGTAATAAGT <3' |
41 | Праймер | 5'>TAGTCGACCAGGCCCCCGAGGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTCCGCC<3' |
42 | Праймер | 5'- AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC |
43 | Праймер | 5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACGGTGG |
44 | Праймер | 5'-AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTCTC |
45 | Праймер | 5'-ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC |
46 | M1D LCDR3 | QQYHSLPLT |
47 | Константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 с мутацией V4 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHEAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK |
48 | Константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 с мутацией DY | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNDAYPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
49 | Сигнальный пептид | MGWSCIILFLVATATGVHS |
50 | Общая формула HCDR1 | GGSIX1X2NFW |
51 | Общая формула HCDR2 | X3GX4X5X6X7T |
52 | Общая формула HCDR3 | ARSHX8YGX9X10DYAFDF |
53 | Общая формула LCDR1 | QDIX11X12S |
54 | Общая формула LCDR3 | QQYHX13LPLT |
55 | IGHV4-4*08 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR |
56 | IGKV1-39*01 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP |
57 | Константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
58 | Константная область человеческой легкой цепи каппа | RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDSALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
Примеры
Настоящее изобретение будет описано со ссылкой на нижеследующие примеры, которые приводятся лишь для иллюстрации настоящего изобретения, и не должны рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения.
Если это не оговорено особо, то экспериментальные методы молекулярной биологии и методы иммуноанализа, применяемые в настоящем изобретении, в основном описаны в руководстве J. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и FM Ausubel et al., Compiled Molecular Biology Experiment Guide, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995; а рестриктирующие ферменты были использованы в соответствии с условиями, рекомендованными производителем продукта. Специалистам в данной области известно, что примеры представлены лишь для описания настоящего изобретения и не рассматриваются как ограничение объема защиты, заявленной в настоящем изобретении.
Пример 1: Фаговый скрининг pH-зависимого антитела против HBsAg
1.1 Определение сайта мутации для pH-зависимой модификации антитела
Гуманизированное анти-HBV антитело M1D (подробно описанное в заявке на патент Китая 201810307136.5), ранее разработанное в лаборатории, было использовано в качестве родительского антитела, а его вариабельные области были модифицированы для pH-зависимого связывания антигена. Как показано на фиг. 1, модифицированное M1D может поддерживать антигенсвязывающую активность в нейтральных условиях, но обнаруживает значительное снижение антигенсвязывающей активности в кислотых условиях; при этом, диссоциированное модифицированное M1D может связываться с внутриклеточным FcRn так, чтобы это антитело могло возвращаться в плазму и снова связываться с антигеном, в результате чего одна молекула M1D после pH-зависимой модификации для связывания с антигеном может повторно связываться с множеством молекул антигенов и нейтрализовать эти молекулы. Гистидин может быть протонирован в кислотых условиях и является ключевой аминокислотой, обеспечивающей pH-зависимые антигенсвязывающие свойства. Была смоделирована трехмерная структура вариабельных областей M1D (трехмерная структура вариабельных областей была смоделирована в соответствии с аминокислотными последовательностями вариабельных областей) и показана на фиг. 2. Структура в форме палочек представляет область CDR, синим цветом показана CDR VK, зеленым цветом показана CDR VH, а красным цветом показаны поверхностные аминокислоты. Всего в областях CDR было обнаружено 25 поверхностных аминокислот, и в соответствии с информацией, полученной для аминокислот и описанной в литературе, было определено, что существует 24 сайта неспецифической замены на гистидин.
1.2 Конструирование фаговой библиотеки pH-зависимых антител scFv, происходящих от M1D
С использованием вариабельных областей легкой и тяжелой цепей антитела M1D в качестве матрицы, 24 сайта, определенные в CDR вариабельной области антитела, были заменены гистидинами, а целевые фрагменты были амплифицированы в соответствии с праймерами, представленными в Таблице 2 с получением генных фрагментов, кодирующих pH-зависимые антитела scFv, происходящие от M1D. ПЦР проводили в следующих условиях: 95°C, 5 мин.; 95°C, 30 сек.; 57°C, 30 сек.; 72°C, 30 сек.; 72°C, 10 мин.; для 25 циклов амплификации; а реакцию SOE-ПЦР проводили в следующих условиях: 95°C, 5 мин.; 95°C, 30 сек.; 57°C, 30 сек.; 72°C, 30 сек.; 72°C, 10 мин. для 5 циклов амплификации. Амплифицированные продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, и продукты амплификации выделяли/очищали с использованием набора для очистки и выделения ДНК (TianGen, DP214-03), в результате чего получали генные фрагменты HK, кодирующие pH-зависимые scFv-антитела, происходящие от M1D. scFv-антитела имели следующую структуру: NH2-VH-линкер-VL-COOH, а линкерная последовательность может представлять собой (G4S)3. Каждый из фрагментов гена HK расщепляли SfiI, а затем лигировали с вектором pCGMT (от Scripps, «Химическая структура была сделана селективной путем связывания для сообщения инфекционности») в молярном отношении 10:1 (фрагмент гена : вектор). Продукты лигирования переносили в компетентную Escherichia coli ER2738 с помощью электропорации (условия электропорации: 25 мкФ, 2,5 кВ, 200 Ом). Трансформированную Escherichia coli выделяли в среде SOC в течение 45 минут, а затем 200 мкл бактериального раствора высевали на планшеты LB (содержащие 100 г/л ампициллина+тетрациклин+2 г/мл глюкозы) и инкубировали путем выдерживания при 37°C в течение ночи. Все колонии на планшетах представляли собой библиотеки, в которых сайты мутаций, определенные в вариабельных областях, были неспецифически мутированы, то есть, заменены на гистидин, для их использования в последующем скрининге. Моноклональные колонии отбирали из планшетов и секвенировали для гарантии правильности последовательностей рекомбинантных векторов, кодирующих антитела scFv. Схематическая диаграмма рекомбинантного вектора (pCGMT-scFv), кодирующего антитело scFv, показана на фиг. 3.
Таблица 2: Мутантные праймеры для pH-зависимых антител scFv, происходящих от M1D
Название праймера | Последовательность |
VH-F | SEQ ID NO: 32 |
HCDR1-R | SEQ ID NO: 33 |
HCDR2-F | SEQ ID NO: 34 |
HCDR3-R | SEQ ID NO: 35 |
VH-R | SEQ ID NO: 36 |
VK-F | SEQ ID NO: 37 |
KCDR1-R | SEQ ID NO: 38 |
KCDR2-F | SEQ ID NO: 39 |
KCDR3-R | SEQ ID NO: 40 |
VK-R | SEQ ID NO: 41 |
1.3 Скрининг pH-зависимых антител scFv
Библиотеку, полученную в предыдущей стадии, подвергали скринингу в течение нескольких раундов, и позитивные моноклональные колонии, полученные в результате скрининга, культивировали в среде 2×YT, содержащей ампициллин (100 г/л) и глюкозу (2 г/мл), для достижения значения OD 0,6, после чего добавляли M13KO7 для вспомогательного суперинфицирования. Через 2 часа добавляли 100 г/л канамицина и проводили суперинфициование при 37°C. Через 2 часа, культуру центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут, супернатант отбрасывали и собирали клеточный осадок. Клеточный осадок ресуспендировали в среде, содержащей ампициллин и канамицин (100 г/л), и культивировали при встряхивании при 30°C в течение ночи. Затем культуру центрифугировали при 12000 об/мин. в течение 10 мин, клетки и супернатант собирали и хранили при 4°C для тестирования.
Затем брали планшет для ELISA, покрытый антигеном HBsAg (200 нг/мл), и в каждую лунку добавляли 100 мкл тестируемого супернатанта, после чего проводили инкубирование при 37°C в течение 1 часа (две лунки для каждого супернатанта). Затем планшет для ELISA один раз промывали PBST, после чего 120 мкл PBS при pH 7,4 и PBS при pH 6,0 добавляли в две лунки с каждым супернатантом, соответственно, и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Промывку проводили 5 раз PBST при соответствующем pH, добавляли 100 мкл ПХ-конъюгированного анти-M13 антитела, разведенного 1:5000, и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Затем планшет для ELISA промывали 5 раз PBST и добавляли раствор субстрата TMB. Через 15 минут после появления окраски, цветную реакцию прекращали путем добавления H2SO4, и результаты оценивали при OD450/620. Результаты третьего раунда ELISA-тестирования показаны на фиг. 4А-4С. Результаты, представленные на фиг. 4A-4C, показали, что все фаги, демонстрирующие эти scFv-антитела, обладают реактивностью при ELISA-детектировании и могут слабо связываться с антигеном при pH 6,0. Первоначально было получено 4 штамма pH-зависимых фаговых антител с хорошими эффектами, и эти штаммы были названы A31-73, A42-13, A42-23 и A41-8.
Пример 2: Получение pH-зависимого антитела против HBsAg.
2.1 Создание рекомбинантного вектора для эукариотической экспрессии
В настоящем изобретении было необходимо провести рекомбинацию большого числа антител, а поэтому было необходимо сконструировать набор векторов легкой и тяжелой цепей, которые могут эффективно осуществлять рекомбинацию антител. В настоящем изобретении, имеющийся в лаборатории эукариотический экспрессионный вектор pTT5 был специально модифицирован для создания набора рекомбинантных векторов легкой и тяжелой цепей для котрансфекции двойной плазмиды. MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 49) использовали в качестве сигнального пептида для легкой и тяжелой цепей. Последовательности, кодирующие константные области легкой и тяжелой цепей человеческого антитела, по отдельности лигировали с расположенным ниже сигнальным пептидом для конструирования набора эукариотических экспрессионных векторов pTT5-CH, pTT5-Cκ и pTT5-Cλ, которые облегчают рекомбинацию антител.
Четыре антитела scFv, полученные как описано в п. 1.3, использовали для амплификации фрагментов вариабельной области легкой и тяжелой цепей с помощью праймеров, представленных в Таблице 3. Реакцию амплификации проводили в следующими конкретных условиях: 95°C, 5 мин.; 95°C, 30 сек.; 57°C, 30 сек.; 72°C, 30 сек.; 72°C, 10 мин.; на 25 циклов амплификации. Эти продукты амплификации были выделены из геля.
Полученный в лаборатории раствор, созданный путем сборки Гибсона, использовали для лигирования сконструированного вышеописанного эукариотического экспрессионного вектора с выделенным ПЦР-продуктом гена вариабельной области антитела (праймер имел последовательность, гомологичную вектору) с получением рекомбинантного вектора VH+pTT5-CH (содержащего константную область тяжелой цепи, представленную в SEQ ID NO: 57), и VH+pTT5-Cκ (включающего константную область легкой цепи, представленную в SEQ ID NO: 58). Рекомбинантный вектор переносили в штамм E. coli DH5α, высевали на планшете LB и культивировали в течение ночи в инкубаторе при 37°C. Моноклональные колонии отбирали из планшета и секвенировали, а результаты секвенирования подвергали сравнению последовательностей с использованием MEGA для подтверждения правильности генов и исключения генов с ошибочной информацией.
Таблица 3: Праймеры для конструирования эукариотических экспрессионных векторов
Праймер | Последовательность праймера |
VH-F | SEQ ID NO: 42 |
VH-R | SEQ ID NO: 43 |
VK-F | SEQ ID NO: 44 |
VK-R | SEQ ID NO: 45 |
2.2 Лабораторная и крупномасштабная экспрессия генов антител
Сконструированные рекомбинантные векторы VH+pTT5-CH и VH+pTT5-Cκ котрансфицировали в клетки HEK293, и двойные плазмиды для лабораторной экспрессии котрансфицировали в 24-луночный планшет в количестве 500 мкл на лунку; если клеточный супернатант лабораторной экспрессии обладал антигенной активностью, то систему трансфекции увеличивали до 100 мл (как было определено по количеству используемого антитела) суспензионных клеток FreeStyle TM 293F (плотность клеток составляла приблизительно 2×106 клеток/мл). Трансфецированные клетки культивировали в шейкерной колбе в инкубаторе с 5% CO2 при 32°C и супернатант собирали через 7 дней после экспрессии.
2.3. Очистка антител
Супернатант клеточной экспрессии собирали и очищали на колонке с белком А в соответствии с инструкциями производителя. Были проведены следующие конкретные стадии: супернатант собранной клеточной культуры центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 минут, супернатант сохраняли, значение pH доводили до 8,4 с помощью сухого порошка Na2HPO4, а затем фильтровали через мембрану фильтра с диаметром пор 0,22 мкм. В колонку загружали 10 мл среды сефарозы 4B, связанной с белком A, а затем эту колонку подсоединяли к системе AKTA Explorer100, насос A был подключен к 0,2 M раствору дигидрофосфата натрия, а насос B был подключен к 0,2 M раствору лимонной кислоты. Длина волны УФ-детектирования составляла 280 нм, скорость потока составляла 5 мл/мин, и отношение ввода пробы в насосы A/B было отрегулировано. Колонку сначала промывали 100% B (pH 2,3) для удаления примесей белка, pH уравновешивали 10% B (pH 8,0), и сигнал на длине волны детектирования возвращался к нулю после того, как он становился стабильным, а затем загружали образец. После прохождения пика потока, 10% B использовали для уравновешивания до тех пор, пока сигнал на длине волны детектирования не уменьшился до нуля и не был стабильным, после чего проводили элюирование с использованием 70% B (pH 4,0), и пик элюирования собирали. Образец с пиком элюирования подвергали диализу в буфере PBS, оценивали концентрацию и проводили анализ с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и ВЭЖХ для определения чистоты антитела IgG. Результаты ВЭЖХ-анализа A31-73, A42-12, A42-23 и A41-8 показаны на фиг. 6, при этом, четыре антитела были однокомпонентными.
Пример 3: Анализ свойств и функциональная оценка pH-зависимых антител против HBsAg
4 штамма фаговых антител со свойством pH-зависимого связывания с HBsAg, которые были получены посредством предварительного скрининга способом, описанным в Примере 1, были обозначены A31-73, A42-13, A42-23 и A41-8, соответственно. Кроме того, четыре штамма фаговых антител подвергали эукариотической экспрессии и очистке методом, описанным в Примере 2. Аминокислотные последовательности VH и VL четырех антител показаны ниже в Таблице. Кроме того, были определены последовательности CDR четырех антител, и аминокислотные последовательности CDR вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи представлены в Таблице 5. Сайты мутаций, сообщающих A31-73, A42-13, A42-23 и A41-8 способность к pH-зависимому связыванию с антигеном HbsAg, систематизированы в Таблице 5.
Таблица 4: Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепи A31-73/A42-12/A42-23/A41-8
Название последовательности | SEQ ID NO | Аминокислотная последовательность |
A31-71 VH | 1 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIHSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGPGHHTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGHHDYAFDFWGQGTTVTVSS |
A31-73 VK | 2 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVP.SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHYLPLTFGGGTKVEIK |
A42-12 VH | 3 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIHHNFWSWIRQPPGKGLEWIGYIHGPGHYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS |
A42-12 VK | 2 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVP.SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHYLPLTFGGGTKVEIK |
A42-23 VH | 4 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITHNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGYDTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGHHDYAFDFWGQGTTVTVSS |
A42-23 VK | 5 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDIHHSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVP.SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHYLPLTFGGGTKVEIK |
A41-8 VH | 6 | QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHHYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS |
A41-8 VK | 7 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISYSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVP.SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHYLPLTFGGGTKVEIK |
Таблица 5: Последовательность CDR легкой и тяжелой цепи A31-73/A42-12/A42-23/A41-8
A31-73 | ||
VH CDR1 | GGSIHSNFW | SEQ ID NO: 8 |
VH CDR2 | SGPGHHT | SEQ ID NO: 9 |
VH CDR3 | ARSHDYGHHDYAFDF | SEQ ID NO: 10 |
VL CDR1 | QDISSS | SEQ ID NO: 11 |
VL CDR2 | YAN | SEQ ID NO: 12 |
VL CDR3 | QQYHYLPLT | SEQ ID NO: 13 |
A42-12 | ||
VH CDR1 | GGSIHHNFW | SEQ ID NO: 14 |
VH CDR2 | HGPGHYT | SEQ ID NO: 15 |
VH CDR3 | ARSHDYGSNDYAFDF | SEQ ID NO: 16 |
VL CDR1 | QDISSS | SEQ ID NO: 11 |
VL CDR2 | YAN | SEQ ID NO: 12 |
VL CDR3 | QQYHYLPLT | SEQ ID NO: 13 |
A42-23 | ||
VH CDR1 | GGSITHNFW | SEQ ID NO: 17 |
VH CDR2 | SGYDTYT | SEQ ID NO: 18 |
VH CDR3 | ARSHDYGHHDYAFDF | SEQ ID NO: 10 |
VL CDR1 | QDIHHS | SEQ ID NO: 19 |
VL CDR2 | YAN | SEQ ID NO: 12 |
VL CDR3 | QQYHYLPLT | SEQ ID NO: 13 |
A41-8 | ||
VH CDR1 | GGSITSNFW | SEQ ID NO: 20 |
VH CDR2 | SGSGTYT | SEQ ID NO: 21 |
VH CDR3 | ARSHHYGSNDYAFDF | SEQ ID NO: 22 |
VL CDR1 | QDISYS | SEQ ID NO: 23 |
VL CDR2 | YAN | SEQ ID NO: 12 |
VL CDR3 | QQYHYLPLT | SEQ ID NO: 13 |
3.1 Определение антигенсвязывающей активности pH-зависимых анти-HBsAg антител при различных pH
Авторами настоящего изобретения была протестирована способность pH-зависимого связывания антител A31-73, A42-12, A42-23 и A41-8 с антигеном HBsAg, соответственно, с применением метода ELISA. Сначала, для определения концентрации очищенного антитела использовали набор для количественного определения белка BCA, и концентрации антител были унифицированы до 1111,11 нг/мл путем разведения. Затем использовали 20% NBS для градиентного разведения концентрации антитела путем 3-кратного градиентного разведения, и всего было получено 8 концентраций путем градиентного разведения. Затем разведенное антитело добавляли в коммерчески доступный планшет с HBsAg (приобретенный у Beijing Wantai) и инкубировали при 37°C в течение 1 часа (две лунки на супернатант). Затем планшет для ELISA один раз промывали PBST и сушили центрифугированием. После этого, 120 мкл PBS с pH 7,4 и pH 6,0 добавляли в две лунки с каждым супернатантом и инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Планшет промывали 5 раз PBST с соответствующим pH и сушили центрифугированием. Затем добавляли «второе» антитело, конъюгированное с ПХ и меченное GAH, и инкубировали в течение 30 минут, после чего планшет промывали 5 раз PBST и сушили центрифугированием. Затем добавляли раствор субстрата ТМВ. Через 15 минут после появления окраски, цветную реакцию прекращали добавлением H2SO4, и результаты оценивали на OD450/630.
Результаты представлены на фиг. 7. При pH 7,4, все A31-73, A42-12, A42-23 и A41-8 обладали антигенсвязывающей активностью, сравнимой с активностью M1D, но при pH 6,0, их антигенсвязывающая активность была значительно снижена. Результаты EC50 систематизированы в Таблице 6.
Таблица 6: EC50 для pH-зависимого определения активности A31-73, A42-12, A42-23 и A41-8
Антитело | EC50 при pH 6,0 (нг/мл) | EC50 при pH 7,4 (нг/мл) | EC50 (pH 6,0)/EC50 (pH 7,4) |
A31-73 | 14046,00 | 17,32 | 810,97 |
A42-12 | 4604,00 | 15,13 | 304,30 |
A42-23 | 345,00 | 12,68 | 27,21 |
A41-8 | 31,13 | 15,78 | 1,97 |
3.2 Определение терапевтического эффекта pH-зависимых анти-HBsAg антител у животного-модели
HBV-трансгенных мышей HBV использовали для оценки способности вышеупомянутых pH-зависимых анти-HBsAg антител элиминировать вирус HBV у животных. рH-зависимые анти-HbsAg антитела и исходное антитело M1D вводили HBV-трансгенным мышам (предоставленным профессором Chen Peizhe, Национальный Университет Тайваня) в дозе 10 мг/кг посредством инъекции в хвостовую вену 4-5 HBV-трансгенным мышам на группу. Затем, у мышей были взяты пробы крови через ретроорбитальное венозное сплетение, и были обнаружены изменения уровней HBsAg и антител в сыворотке мышей.
3.2.1 Количественное определение HBsAg
(1) Приготовление реакционного планшета: мышиное моноклональное антитело HB-45E9 разводили 20 мМ буфера PB (буфера Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7,4) до 2 мкг/мл, а затем в каждую лунку хемилюминесцентного планшета добавляли 100 мкл раствора для нанесения покрытия при 2-8°C в течение 16-24 часов, после чего планшет оставляли еще на 2 часа при 37°C, а затем планшет один раз промывали промывочным раствором PBST и сушили центрифугированием. После промывки, в каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора для блокирования при 37°C в течение 2 часов. Впоследствии, блокирующий раствор удаляли, планшет сушили в сушильном шкафу и хранили при 2-8°C для дальнейшего использования.
(2) Разведение пробы: собранную мышиную сыворотку разводили раствором PBS, содержащим 20% NBS (сыворотку новорожденного бычка), с образованием двух градиентов 1:30 и 1:150 для последующего количественного определения.
(3) Обработка для денатурации пробы: 15 мкл пробы сыворотки, разведенной как описано выше, полностью смешивали с 7,5 мкл денатурирующего буфера (15% ДСН, растворенного в 20 мМ PB7.4) и проводили реакцию при 37°C в течение 1 часа. Затем добавляли 90 мкл буфера для прекращения реакции (4% CHAPS, растворенного в 20 мМ PB7.4) и тщательно перемешивали.
(4) Реакция пробы: 100 мкл вышеупомянутой денатурированной пробы сыворотки добавляли в реакционный планшет и проводили реакцию при 37°C в течение 1 часа. Затем реакционный планшет промывали 5 раз PBST и сушили центрифугированием.
(5) Реакция ферментативной метки: Реакционный раствор HB-A6A7-ПХ добавляли в хемилюминесцентный планшет в количестве 100 мкл/лунку, и проводили реакцию при 37°C в течение 1 часа. Затем планшет 5 раз промывали PBST и сушили центрифугированием.
(6) Реакция люминесценции и оценка: в хемилюминесцентный планшет добавляли люминесцентный раствор (100 мкл/лунку) и определяли интенсивность излучения.
(7) Вычисление концентрации HBsAg в пробе мышиной сыворотки: были проведены параллельные эксперименты с использованием стандартных продуктов, и была построена стандартная кривая на основе результатов оценки стандартных продуктов. Затем значение интенсивности излучения для пробы мышиной сыворотки подставляли в стандартную кривую и вычисляли концентрацию HBsAg в пробе сыворотки, которая должна быть протестирована.
3.2.2 Количественное определение антитела в сыворотке
(1) Разведение пробы: пробы сыворотки разводили 20% NBS с 3 градиентами: 1000 раз, 10000 раз, 100000 раз; соответствующее контрольное антитело разводили 20% NBS до 20 нг/мл в первой лунке, а затем 3 раза разводили с 6 градиентами.
(3) Добавление пробы: 100 мкл/лунку пробы, разведенной в предыдущей стадии, и соответствующий разбавитель антител добавляли в коммерчески доступный планшет с HBsAb (приобретенный у Beijing Wantai) и инкубировали при 37°C в течение 1 часа.
(4) Промывка: планшет промывали 5 раз 300 мкл/лунку PBST на устройстве для промывки планшетов и сушили центрифугированием;
(5) Добавление меченного ферментом второго антитела: добавляли 100 мкл/лунку разбавителя второго ПХ-конъюгированого антитела, меченного GAH, и инкубировали при 37°C в течение 30 минут;
(6) Промывка: планшет промывали 5 раз 300 мкл/лунку PBST на устройстве для промывки планшетов и сушили центрифугированием;
(7) Проявление окраски: 100 мкл/лунку раствора для проявления окарски, 37°C, 10-15 минут;
(8) Прекращение реакции и считывание: добавляли 50 мкл/лунку раствора для прекращения реакции, и величину считывания определяли при OD450/630 в течение 10 минут на микропланшет-ридере.
(9) Вычисление концентрации антител в пробе мышиной сыворотки: стандартная кривая была построена исходя из результатов оценки соответствующих стандартных антител. Затем величину интенсивности излучения для пробы мышиной сыворотки подставляли в стандартную кривую и вычисляли концентрацию антитела в пробе сыворотки, которая должна быть протестирована.
Результаты определения уровней HBsAg и антител в мышиной сыворотке после обработки антителами представлены на фиг. 8А-8В. Результаты показали, что уровень родительского антитела M1D против HBsAg возвращался к исходному уровню приблизительно через 10 дней, в то время как уровень pH-зависимых антител против HBsAg снова возвращался к исходному уровню приблизительно через 15 дней; и при сравнении концентраций антител в сыворотке, M1D показало самую низкую концентрацию антитела на 10-й день, в то время как три pH-зависимых антитела все еще можно было обнаружить на 15-й день, что указывает на то, что pH-зависимые антитела имели более длительное время ингибирования антигена, чем родительское антитело при сохранении способности элиминировать HBsAg, которая была эквивалентна способности родительского антитела, то есть, эффект клиренса pH-зависимых антител может проявляться в течение более длительного периода времени. Результаты клиренса HBsAg с помощью A31-73, A42-12 и A41-8 показаны на фиг. 8A, а результаты оценки концентраций A31-73, A42-12 и A41-8 в сыворотке показаны на фиг. 8B. Результаты лечения животных показали, что A31-73, A42-12 и A41-8 могут быть использованы для лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией (например, гепатита B).
Пример 4: Конструирование и функциональная оценка акцепторого антитела
Для проявления своей pH-зависимой антигенсвязывающей активности, рH-зависимому антителу необходимо проникнуть в клетку. Следовательно, если этот первый ограничивающий фактор проникновения в клетку не нарушен, то pH-зависимые антигенсвязывающие свойства не будут играть какой-либо «роли». Следовательно, в этом примере, акцепторное антитело, полученное путем последующей мутации аминокислот в области Fc, может повышать уровень связывания с рецептором hFcRn при нейтральном pH или повышать уровень связывания с рецептором FcγR. Как показано на фиг. 9, акцепторное антитело находится вне клетки и действует как «транспортное средство» для реципрокного транспорта антигенов в клетку, а поэтому, время полужизни антитела может быть значительно увеличено, и это антитело может снова связываться с антигеном, что будет повышать эффективность проникновения антигена в клетку и тем самым значительно повышать эффективность клиренса.
4.1 Акцепторное антитело, способное связываться с hFcRn
4.1.1 Конструирование, экспрессия и очистка акцепторноого антитела, способного связываться с hFcRn
A31-73 и A41-8 с лучшими параметрами у HBV-трансгенных мышей в Примере 3 были подвергнуты мутации V4 (M252Y, N286E, N434Y) в области Fc (эта работа была заказана фирме General Biology, номер заказа: G120460) для повышения аффинности к hFcRn в нейтральных условиях. Были получены два акцепторных антитела A31-73 V4 и A41-8 V4, и константная область тяжелой цепи после мутации была показана в SEQ ID NO: 47. Вышеупомянутые два антитела были подвергнуты крупномасштабной эукариотической экспрессии и очистке, и конкретные стадии этой процедуры представлены в Примерах 2.2 и 2.3. Результаты ВЭЖХ-анализа A31-73 V4 и A41-8 V4 представлены на фиг. 10, и эти результаты показали, что антитела являются однокомпонентными.
4.1.2 Определение активности
in vitro
акцепторного антитела, способного связываться с hFcRn
4.1.2.1 Определение антигенсвязывающей активности акцепторного антитела, способного связываться с hFcRn при различных pH
Были определены антигенсвязывающие активности A31-73 V4 и A41-8 V4 при pH 7,4 и pH 6,0, соответственно, и конкретные стадии этой процедуры представлены в Примере 3.1. Результаты представлены на фиг. 11. Результаты показали, что как A31-73 V4, так и A41-8 V4 могут поддерживать антигенсвязывающую активность, эквивалентную активности родительского антитела при нейтральном pH, а антигенсвязывающая активность при кислотном pH еще больше ослабляется, что указывает на то, что pH-зависимые антигенсвязывающие активности A31-73 V4 и A41-8 V4 были увеличены до определенной степени.
4.1.2.2 Проверка функции акцепторного антитела, способного связываться с hFcRn, на клеточном уровне
4.1.2.2.1 Мечение HBsAg флуоресцентным веществом 488
В качестве примера было проведено мечение 1 мг HBsAg, и вся эта процедура была проведена в защищенном от света помещении.
(1) 1 мл 1 мг/мл HBsAg диализовали боратным буфером (pH 8,5, 500 мл) при 4°C в течение 4 часов;
(2) Молярное отношение HBsAg к метке 488 составляло 1:5, и после вычисления требовалось добавление 0,1988 мг флуоресцентного вещества 488;
(3) 10 мг/мл флуоресцентного раствора 488 приготавливали вместе с ДМФ и тщательно перемешивали;
(4) 19,88 мкл флуоресцентного раствора 488 добавляли к 1 мл диализованного HBsAg, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа;
(5) Смесь для инкубирования диализовали PBS при 4°C в течение ночи.
4.1.2.2.2 Эксперимент по оценке иммунофлуоресценции на клетках MDCK
(все стадии, в которых использовали флуоресцентно меченный образец, проводили в темноте)
(1) Посев клеток: клетки при плотности 2×105 клеток/мл культивировали в 24-луночном культуральном планшете со стеклянным дном для визуализации клеток в течение ночи при 250 мкл/лунку;
(2) антитело и антиген, меченные соответствующим флуоресцентным раствором, разводили в бессывороточной среде: 800 нг/мл для антигена и 2 мкг/мл для антитела;
(3) 125 мкл каждого из антигена и антитела равномерно перемешивали, а затем оставляли на 1 час в инкубаторе с CO2 при 37°C;
(4) супернатант клеток в визуализирующем планшете для культивирования удаляли, добавляли комплекс антиген-антитело, равномерно встряхивали и оставляли в инкубаторе с CO2 при 37°C на 2 часа;
(5) супернатант отбрасывали, 1 мл стерильного PBS, заранее инкубированного при 37°C, использовали для «промывки» поверхности клеток 3-5 раз и удаляли пипеткой;
(6) добавляли 1 мл 10% параформальдегида и оставляли на 0,5 часа в инкубаторе с CO2 при 37°C, защищенном от света;
(7) параформальдегид удаляли, 1 мл стерильного PBS, заранее инкубированного при 37°C, использовали для «промывки» поверхности клеток 3-5 раз и удаляли пипеткой;
(8) добавляли 0,5 мл DAPI (разведенного в соотношении 1:1000 стерильным PBS) и оставляли на 15 минут в инкубаторе с CO2 при 37°C, защищенном от света;
(9) разбавитель DAPI удаляли, 1 мл стерильного PBS, заранее инкубированного при 37°C, использовали для «промывки» поверхности клеток 3-5 раз и удаляли пипеткой, после чего добавляли 0,5 мл PBS и помещали в высокоуровневый формирователь изображения для визуализации.
Результаты экспериментов представлены на фиг. 12А-12В. Результаты показали, что интенсивность флуоресценции антигена в клетках, обработанных A31-73 V4 и A41-8 V4, была значительно выше, чем у клеток, обработанных A31-73 и A41-8, что указывает на то, что вышеописанные акцепторные антитела могут эффективно транспортировать большее число антигенов в клетки. Этот результат подтвердил, что мутация V4 в акцепторном антителе может повышать уровень связывания антитела с hFcRn в нейтральных условиях. После проникновения комплекса антиген-антитело в клетки, внутриклеточный pH составлял только приблизительно 6,0, антитело диссоциировалось из комплекса антиген-антитело и возвращалось на поверхность клетки, и снова выполняло свою антигенсвязывающую функцию. Повышение способности связываться с hFcRn в нейтральных условиях для акцепторных антител может открыть «удобную дверь» для последующих pH-зависимых свойств связывания антигена.
4.1.3 Определение терапевтического эффекта акцепторных антител, способных связываться с hFcRn, у животных-моделей
Модификация V4 была нацелена на рецептор hFcRn. Рецептором трансгенных мышей HBV был mFcRn, который нельзя было использовать для оценки эффекта модификации. Поэтому была создана модель hFcRn-трансгенных мышей, инфицированных rAAV-HBV adr. hFcRn-трансгенным мышам в возрасте от 6 до 8 недель (приобретенным у Biosaitu) вводили одну инъекцию соответствующей дозы rAAV-HBV adr (приобретенной у Beijing Wujiahe Molecular Medicine Institute Co., Ltd.) через хвостовую вену. Титр вируса HBV у мышей контролировали в течение четырех недель подряд. После того, как титр вируса был стабильным, hFcRn-трансгенным мышам со стабильным титром вируса HBV (по 4 в каждой группе) вводили через хвостовую вену два акцепторных антитела, M1D и негативный контроль 16G12, соответственно, при однократной дозе 20 мг/кг, и дополнительно вводили внутрибрюшинную инъекцию антитела против CD4 для подавления гуморального иммунного ответа. Затем определяли концентрацию HBsAg, антитела и ДНК HBV в сыворотке для оценки скорости клиренса антигена in vivo и времени полужизни акцепторных антител.
4.1.3.1 Количественное определение HBsAg
Конкретные стадии описаны в примере 3.2.1, а результаты обнаружения A31-73 V4 и A41-8 V4 показаны на фиг. 13А.
4.1.3.2 Количественное определение антител в сыворотке
Конкретные стадии описаны в примере 3.2.2, а результаты обнаружения A31-73 V4 и A41-8 V4 показаны на фиг. 13B.
4.1.3.3 Количественное определение ДНК HBV
Количественное определение ДНК HBV проводили в соответствии с инструкциями, приложенными к набору для количественного определения флуоресценции ДНК HBV в реальном времени (набор был приобретен у Beijing Jinmaige Biotechnology Co., Ltd.).
В этом примере определяли способность A31-73 V4, A41-8 V4 и эталонного антитела M1D к удалению вируса у животных. Результаты экспериментов показаны на фиг. 13C.
Результаты, представленные на фиг. 13A-13C, показали, что акцепторные антитела A31-73 V4 и A41-8 V4 обладают способностью удалять антиген, сравнимую с такой способностью для M1D, но имеют более длительное время ингибирования. После того, как M1D проявило максимальный эффект клиренса антигена, уровень антигена начал быстро возвращаться, и M1D уже не функционировало на 14-й день, и HBsAg в сыворотке возвращался к исходному уровню (как было определено исходя из негативного контроля 16G12). Однако, 2 акцепторных антитела все еще могли поддерживать более низкий уровень антигена в течение длительного времени после проявления максимального эффекта клиренса и медленно восстанавливаться. В группе обработки антителом A41-8 V4, HBsAg возвращался на исходный уровень приблизительно через 30 дней. В группе обработки антителом A31-73 V4, HBsAg не возвращался на исходный уровень после ожидаемого окончания эксперимента. Это соответствовало результатам определения времени полужизни антител в сыворотке. Такие технические эффекты оказались замечательными и неожиданными.
4.2. Акцепторное антитело, способное связываться с mFcγRII
4.2.1. Конструирование, экспрессия и очистка акцепторного антитела, способного связываться с mFcγRII
A31-73 и A41-8 с лучшими параметрами у HBV-трансгенных мышей в Примере 3 были подвергнуты мутации DY (K326D, L328Y) в области Fc (эта работа была заказана фирме General Biology, номер заказа: G120460) для получения A31-73 DY и A41-8 DY соответственно, и константная область тяжелой цепи после мутации представлена в SEQ ID NO: 48. Антитела были подвергнуты крупномасштабной эукариотической экспрессии и очистке, и конкретные стадии этой процедуры представлены в Примерах 2.2 и 2.3. Результаты для A31-73 DY, полученные на белковом геле, представлены на фиг. 14. Результаты показали, что антитела являются однокомпонентными.
4.2.2 Определение активности in vitro акцепторных антител, способных связываться с mFcγRII
4.2.2.1 Определение антигенсвязывающей активности акцепторных антител, способных связываться с mFcγRII при различных значениях pH
Были определены антигенсвязывающие активности A31-73 DY при pH 7,4 и pH 6,0, соответственно, и конкретные стадии этой процедуры описаны в Примере 3.1. Результаты представлены на фиг. 15. A31-73 DY могло поддерживать антигенсвязывающую активность и pH-зависимую антигенсвязывающую активность, эквивалентную активности родительского антитела при нейтральном pH, а антигенсвязывающая активность при кислотном pH еще больше ослаблялась, что указывает на то, что pH-зависимая антигенсвязывающая активность A31-73 DY была повышена до определенной степени.
4.2.2.2 Проверка функции акцепторных антител, способных связываться с mFcγRII, на клеточном уровне
4.2.2.2.1 Мечение HBsAg флуоресцентным веществом 488
Конкретные стадии представлены в 4.1.2.2.1.
4.2.2.2.2. Эксперимент по оценке иммунофлуоресценции на первичных мышиных макрофагах
(1) за 4 дня до эксперимента, 1,5 мл 3% раствора тиогликолята натрия вводили в брюшную полость каждой мыши, но не вводили в кишечник;
(2) двух мышей умерщвляли и помещали в 75% спирт на 3 минуты;
(3) мышь была горизонтально закреплена на пенопласте так, чтобы была обнажена брюшина; кожу брюшной полости разрезали ножницами для разрезания ткани, после чего, брюшину дезинфицировали и рассекали для обнажения брюшной полости, а затем кожу разреза брюшной полости натягивали двумя зубчатыми щипцами левой рукой и фиксировали, после чего культуральную среду 1640 перенесили с помощью пастеровской пипетки правой рукой для перитонеального лаважа 4 мл за один раз, всего два раза. С помощью пипетки аккуратно и полностью перемешивали брюшную полость так, чтобы промывание было более полным и тщательным. После полного перемешивания в течение приблизительно 2 минут и выдерживания в течение приблизительно 5 минут для полного выделения макрофагов, раствор для лаважа пипетировали и переносили в центрифужную пробирку;
(4) 4°C, 1100×g, 5 минут;
(5) супернатант осторожно сливали, клетки дважды промывали средой 1640, центрифугировали при 4°C, 1100×g в течение 5 минут, супернатант удаляли и клетки ресуспендировали в RPM1640;
(6) после подсчета клеток, клетки доводили до плотности 106 клеток/мл, культивировали на 24-луночном планшете со стеклянным дном для визуализации клеток, 250 мкл/лунку, после чего среду заменяли через 2 часа, осуществляли промывку один раз с помощью RPM1640, и неприлипшие клетки отбрасывали, а затем проводили инкубирование в течение ночи в инкубаторе с CO2 при 37°C;
(7) антитело и антиген, меченные соответствующим флуоресцентным веществом, разводили в бессывороточной среде до 800 нг/мл для антигена и 20 мкг/мл для антитела;
(8) 125 мкл каждого из антигена и антитела равномерно смешивали, а затем оставляли на 1 час в инкубаторе с CO2 при 37°C;
(9) супернатант клеток в визуализирующем планшете для культивирования удаляли, добавляли комплекс антиген-антитело, равномерно встряхивали и оставляли в инкубаторе с CO2 при 37°C на 2 часа;
(10) супернатант отбрасывали, и 1 мл стерильного PBS, заранее инкубированного при 37°C, использовали для «промывки» поверхности клеток 3-5 раз и удаляли пипеткой;
(11) Dio разводили до 1:2000, добавляли в количестве, достаточном для погружения клеток и оставляли на 20 минут при комнатной температуре;
(12) супернатант отбрасывали, и 1 мл стерильного PBS, заранее инкубированного при 37°C, использовали для «промывки» поверхности клеток 3-5 раз и удаляли пипеткой;
(13) добавляли краситель для окрашивания ядра живых клеток (2 капли добавляли к объему 1 мл), затем оставляли на 20 минут при комнатной температуре и помещали в высокоуровневый формирователь изображения для визуализации.
Результаты эксперимента показаны на фиг. 16. Из этих результатов видно, что модификация DY усиливает фагоцитоз комплекса антиген-антитело мышиными макрофагами, что приводит к еще большему разложению антигена.
4.2.3 Определение терапевтического эффекта акцепторного антитела, способного связываться с mFcγRII, у животного-модели
4.2.3.1 Оценка терапевтического эффекта акцепторного антитела у трансгенных мышей
Были отобраны 6-8 недельные HBV-трансгенные мыши, которым инъецировали акцепторное антитело A31-73 DY и M1D в хвостовую вену в разовой дозе 5 мг/кг (4 мыши на группу). После определения концентраций HBsAg, антител и ДНК HBV в сыворотке определяли скорость клиренса антигена in vivo и время полужизни акцепторного антитела.
4.2.3.1.1 Количественное определение HBsAg
Конкретные стадии описаны в примере 3.2.1, а результаты обнаружения A31-73DY показаны на фиг. 17А.
4.2.3.1.2 Количественное определение ДНК HBV
Количественное определение ДНК HBV проводили в соответствии с инструкциями, приложенными к набору для количественного определения флуоресценции ДНК HBV в реальном времени (набор был приобретен у Beijing Jinmaige Biotechnology Co., Ltd.).
В этом примере определяли способность A31-73 DY и эталонного антитела M1D к удалению вируса у животных. Результаты экспериментов показаны на фиг. 17B.
4.2.3.1.3 Количественное определение антитела в сыворотке
Конкретные стадии описаны в примере 3.2.2, а результаты обнаружения A31-73 DY показаны на фиг. 17С.
Результаты, представленные на фиг. 17A-17C, показали, что акцепторное антитело A31-73 DY с модификацией DY более чем на порядок превышает клиренс антигена, чем M1D. A31-73 DY может не только быстро удалять HBsAg у HBV-трансгенных мышей (фиг. 17A), но также эффективно снижать титр ДНК HBV у мышей (фиг. 17В), что соответствует результатам определения времени полужизни антител в сыворотке (фиг. 17С). Сравнение результатов оценки концентрации антител в сыворотке показало, что время полужизни A31-73 DY превышает время полужизни M1D почти на 12 дней, что указывает на то, что акцепторное антитело A31-73 DY выполняет функцию реципрокного связывания с антигеном, что тем самым увеличивает время клиренса антигена.
4.2.3.2. Оценка терапевтического эффекта акцепторного антитела у мышей с моделью HBV, трансфицированных аденоассоциированным вирусом
Как показано на фиг. 18A, мышам C57 в возрасте 4-6 недель инъецировали 1×1011 rAAV8-1.3HBV adr для создания мышей с моделью HBV, полученной путем трансфекции аденоассоциированным вирусом (день -28), и титр вируса мыши непрерывно контролировали. После того, как титр вируса становился стабильным, у мышей определяли исходный уровень HbsAg, и этих мышей подразделяли на группы (День -1). Акцепторное антитело A31-73 DY (сокращенно 73 DY) и негативный контроль 16G12 вводили в дозе 5 мг/кг 5 раз; затем всех мышей умерщвляли через 2 недели после 5-й обработки, сыворотку мышей собирали и анализировали сывороточные уровни HBsAg и антител против HB.
4.2.3.2.1 Количественное определение HBsAg
Конкретные стадии описаны в примере 3.2.1, а результаты обнаружения A31-73DY представлены на фиг. 18B.
4.2.3.2.2 Качественное обнаружение антител против HB
(1) Разведение пробы: пробу сыворотки разводили 20% NBS с 5 градиентами: 100 раз, 500 раз, 2500 раз, 12500 раз и 62500 раз;
(3) Добавление пробы: 100 мкл/лунку пробы, разведенной в предыдущей стадии, и соответствующий разбавитель антител добавляли в коммерчески доступный планшет с HBsAb (приобретенный у Beijing Wantai) и инкубировали при 37°C в течение 1 часа.
(4) Промывка: планшет промывали 5 раз 300 мкл/лунку PBST на устройстве для промывки планшетов и сушили центрифугированием;
(5) Добавление меченного ферментом второго антитела: добавляли 100 мкл/лунку разбавителя второго ПХ-конъюгированого антитела, меченного GAМ, и инкубировали при 37°C в течение 30 минут;
(6) Промывка: планшет промывали 5 раз 300 мкл/лунку PBST на устройстве для промывки планшетов и сушили центрифугированием;
(7) Проявление окраски: для проявления использовали 100 мкл/лунку раствора для проявления окраски, 37°C, 10~15 минут;
(8) Прекращение реакции и считывание: добавляли 50 мкл/лунку раствора для прекращения реакции, и величину считывания определяли при OD450/630 в течение 10 минут на микропланшет-ридере;
(9) Вычисление концентрации антител против НВ в пробе мышиной сыворотки: величину считывания от 0,1 до 1 умножали на коэффициент разведения и брали его логарифм (log10).
Результаты определения уровня антител против HB в сыворотке мышей после обработки антителами показаны на фиг. 18С.
Результаты на фиг. 18B показали, что акцепторное антитело A31-73 DY может регулировать уровень HBsAg у мышей с моделью HBV, полученной с использованием аденоассоциированного вируса, до значения ниже 100 МЕ/мл в течение длительного времени с дозой 5 мг/кг и частотой введения доз 15 дней/инъекцию. Результаты на фиг. 18C показали уровни антител против HB у мышей на дни 0, 7, 37, 52, 67 и 82, и можно было видеть, что мыши, обработанные антителом A31-73 DY, имели более высокие уровни антител против HB, то есть, у 3 из 4 мышей продуцировались заметные уровни антител против HB (подсчитывали только мышей, которых непрерывно обрабатывали до окончания эксперимента), что указывает на то, что продуцирование антител против HB может быть связано с непрерывным ингибированием HBsAg. Это указывает на то, что акцепторное антитело A31-73 DY позволяет преодолеть ограничения для традиционных антител и обеспечить обработку низкими дозами и с низкой частотой введения; и, что более важно, после длительной обработки, у мышей активировался гуморальный иммунный ответ, что приводило к продуцированию антител против HB.
Пример 5: Определение аффинности M1D, A31-73 и A41-8
HBsAg растворяли в ацетате натрия (pH 4,5) при 5 мкг/мл, и программу нанесения покрытия на чип запускали на устройстве Biacore 3000 для нанесения HBsAg на чип CM5. Объем покрытия HBsAg составлял 2400RU. Аналит 2-кратно разводили, начиная со 100 нМ, и приготавливали образцы с 7 концентрациями. Программа определения аффинности была запущена на устройстве Biacore 3000, скорость потока была установлена на 50 мкл/мин, время связывания было установлено на 90 сек., время диссоциации было установлено на 600 сек., температура камеры для образцов была установлена на 10°С, регенерирующий раствор представлял собой 50 мМ NaOH, скорость регенерационного потока была установлена на 50 мкл/мин, а время регенерации было установлено на 60 сек. Результаты систематизированы в Таблице 7.
Таблица 7: Определение аффинности M1D, A31-73 и A41-8
Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были подробно описаны, однако, специалистам в данной области очевидно, что в соответствии со всеми опубликованными здесь вариантами, в настоящее изобретение могут быть внесены различные модификации и изменения, и эти изменения входят в объем защиты настоящего изобретения. Настоящее изобретение представлено прилагаемой формулой изобретения и в любых ее эквивалентах.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> СЯМЭНЬ ЮНИВЕРСИТИ
ЯН ШЭН ТАН КОМПАНИ, ЛТД.
<120> НОВОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА B И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130> IEC190069PCT
<150> CN 201910432602.7
<151> 2019-05-23
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A31-73 VH
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile His Ser Asn
20 25 30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Gly Pro Gly His His Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly His His Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A31-73/A42-12 VK
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Tyr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 122
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A42-12 VH
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile His His Asn
20 25 30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile His Gly Pro Gly His Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 122
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A42-23 VH
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr His Asn
20 25 30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Asp Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly His His Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A42-23 VK
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile His His Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Tyr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 122
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A41-8 VH
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
20 25 30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His His Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A41-8 VK
<400> 7
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Tyr Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Tyr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A31-73 HCDR1
<400> 8
Gly Gly Ser Ile His Ser Asn Phe Trp
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A31-73 HCDR2
<400> 9
Ser Gly Pro Gly His His Thr
1 5
<210> 10
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A31-73/A42-23 HCDR3
<400> 10
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly His His Asp Tyr Ala Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 11
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D/A31-73/A42-12 LCDR1
<400> 11
Gln Asp Ile Ser Ser Ser
1 5
<210> 12
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D/A31-73/A42-12/A42-23/A41-8 LCDR2
<400> 12
Tyr Ala Asn
1
<210> 13
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A31-73/A42-12/A42-23/A41-8 LCDR3
<400> 13
Gln Gln Tyr His Tyr Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A42-12 HCDR1
<400> 14
Gly Gly Ser Ile His His Asn Phe Trp
1 5
<210> 15
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A42-12 HCDR2
<400> 15
His Gly Pro Gly His Tyr Thr
1 5
<210> 16
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D/A42-12 HCDR3
<400> 16
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 17
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A42-23 HCDR1
<400> 17
Gly Gly Ser Ile Thr His Asn Phe Trp
1 5
<210> 18
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A42-23 HCDR2
<400> 18
Ser Gly Tyr Asp Thr Tyr Thr
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A42-23 LCDR1
<400> 19
Gln Asp Ile His His Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D/A41-8 HCDR1
<400> 20
Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn Phe Trp
1 5
<210> 21
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D/A41-8 HCDR2
<400> 21
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr
1 5
<210> 22
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A41-8 HCDR3
<400> 22
Ala Arg Ser His His Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 23
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> A41-8 LCDR1
<400> 23
Gln Asp Ile Ser Tyr Ser
1 5
<210> 24
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D HFR1
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 25
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D HFR2
<400> 25
Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr
1 5 10 15
Ile
<210> 26
<211> 38
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D HFR3
<400> 26
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 27
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D HFR4
<400> 27
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D LFR1
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr
20 25
<210> 29
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D LFR2
<400> 29
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 30
<211> 36
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D LFR3
<400> 30
Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 31
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D LFR4
<400> 31
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 32
<211> 49
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 32
gttattactc gtggcccagc cggccatggc acaggtgcag ctgcaggag 49
<210> 33
<211> 71
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 33
cactccagac ccttccctgg gggctggcgg atccagctcc agaagttgyk gkkgatgykg 60
ysgysagaga c 71
<210> 34
<211> 68
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 34
ccagggaagg gtctggagtg gattgggtat atcymtggty mtsrtmmtya tmmcgactac 60
aacccctc 68
<210> 35
<211> 67
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 35
cccttggccc cagaaatcaa aagcgtrgts gtkgykgysg trgtsgtgcg atctcgcaca 60
gtaatac 67
<210> 36
<211> 58
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 36
cctccactcc cgcctccacc tgaagagacg gtgacggtgg tcccttggcc ccagaaat 58
<210> 37
<211> 61
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 37
tggaggcggg agtggaggtg gcggatctgg agggggtggt agcgacatac agatgacgca 60
g 61
<210> 38
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 38
tgctgatacc aatttaaaga actgctaatg tcstgagttg cccggcaagt g 51
<210> 39
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 39
tctttaaatt ggtatcagca aaaaccgggg aaagcccc 38
<210> 40
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 40
caccttggtc cctccgccga aagtgaggkg taaactatgg trctgttgac agtaataagt 60
<210> 41
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 41
tagtcgacca ggcccccgag gcctttgatt tccaccttgg tccctccgcc 50
<210> 42
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 42
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtc 48
<210> 43
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 43
gatgggccct tggtcgacgc tgaagagacg gtgacggtgg 40
<210> 44
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 44
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catacagatg acgcagtctc 50
<210> 45
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 45
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtcc 39
<210> 46
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> M1D LCDR3
<400> 46
Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 47
<211> 330
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 с мутацией V4
<400> 47
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Glu Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Tyr His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 48
<211> 330
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи человеческого IgG1 с мутацией DY
<400> 48
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Asp Ala Tyr Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 49
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальный пептид
<400> 49
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 50
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Общая формула HCDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = T или H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X = S или H
<400> 50
Gly Gly Ser Ile Xaa Xaa Asn Phe Trp
1 5
<210> 51
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Общая формула HCDR2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X = S или H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X = P, S или Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X = G или D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = T или H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X = Y или H
<400> 51
Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Thr
1 5
<210> 52
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Общая формула HCDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = D или H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X = S или H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X = H или N
<400> 52
Ala Arg Ser His Xaa Tyr Gly Xaa Xaa Asp Tyr Ala Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 53
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Общая формула LCDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> X = S или H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = S, Y или H
<400> 53
Gln Asp Ile Xaa Xaa Ser
1 5
<210> 54
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Общая формула LCDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> X = S или Y
<400> 54
Gln Gln Tyr His Xaa Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 55
<211> 97
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IGHV4-4*08
<400> 55
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 56
<211> 95
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> IGKV1-39*01
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 57
<211> 330
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область тяжелой цепи человеческого IgG1
<400> 57
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 58
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Константная область легкой цепи каппа человека
<400> 58
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Ser Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<---
Claims (82)
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способные специфически связываться с HBsAg,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с HBsAg с более высокой аффинностью при нейтральном pH, чем при кислотном pH, и
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(1) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1 c SEQ ID NO:8, HCDR2 c SEQ ID NO:9, HCDR3 c SEQ ID NO:10; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1 c SEQ ID NO:11, LCDR2 c SEQ ID NO:12, LCDR3 c SEQ ID NO:13;
(2) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1 c SEQ ID NO:14, HCDR2 c SEQ ID NO:15, HCDR3 c SEQ ID NO:16; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1 c SEQ ID NO:11, LCDR2 c SEQ ID NO:12, LCDR3 c SEQ ID NO:13;
(3) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1 c SEQ ID NO:20, HCDR2 c SEQ ID NO:21, HCDR3 c SEQ ID NO:22; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1 c SEQ ID NO:23, LCDR2 c SEQ ID NO:12, LCDR3 c SEQ ID NO:13; или,
(4) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1 c SEQ ID NO:17, HCDR2 c SEQ ID NO:18, HCDR3 c SEQ ID NO:10; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1 c SEQ ID NO:19, LCDR2 c SEQ ID NO:12, LCDR3 c SEQ ID NO:13.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит каркасную область иммуноглобулина человека, и каркасная область необязательно содержит одну или более обратных мутаций, а именно замен человеческих остатков на мышиные остатки.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV4-4*08, и
каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV1-39*01, и
каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи необязательно содержат одну или более обратных мутаций, а именно замен человеческих остатков на мышиные остатки.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где
VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента включает: VH FR1 c SEQ ID NO:24; VH FR2 c SEQ ID NO:25; VH FR3 c SEQ ID NO:26; и VH FR4 c SEQ ID NO:27; и
VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL FR1 c SEQ ID NO:28; VL FR2 c SEQ ID NO:29; VL FR3 c SEQ ID NO:30; и VL FR4 c SEQ ID NO:31.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
(i) последовательности с любой из SEQ ID NO:1, 3, 4 и 6; или
(ii) последовательности, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности с любой из SEQ ID NO:1, 3, 4 и 6; и
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из:
(iii) последовательности с любой из SEQ ID NO:2, 5 и 7; или
(iv) последовательности, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентична последовательности с любой из SEQ ID NO:2, 5 и 7.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(1) VH с последовательностью с SEQ ID NO:1, и VL с последовательностью с SEQ ID NO:2;
(2) VH с последовательностью с SEQ ID NO:3, и VL с последовательностью с SEQ ID NO:2;
(3) VH с последовательностью с SEQ ID NO:4, и VL с последовательностью с SEQ ID NO:5; или
(4) VH с последовательностью с SEQ ID NO:6, и VL с последовательностью с SEQ ID NO:7.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область, происходящую от человеческого иммуноглобулина.
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где
тяжелая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента включает константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, и
легкая цепь антитела или антигенсвязывающего фрагмента включает константную область легкой цепи κ или λ человека.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи (CL) c SEQ ID NO:58.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG1,
где указанный вариант имеет следующие замены по сравнению с последовательностью дикого типа, от которой она происходит: (i) M252Y, N286E, N434Y; или (ii) K326D, L328Y;
где вышеупомянутые положения аминокислот являются положениями согласно системе нумерации по Кэбату.
11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН) c SEQ ID NO:47 или 48.
12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН) c SEQ ID NO:57.
13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1,
где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(1) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:1, и CH c SEQ ID NO:57, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:2, и CL c SEQ ID NO:58;
(2) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:1, и CH c SEQ ID NO:47, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:2, и CL c SEQ ID NO:58;
(3) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:1, и CH c SEQ ID NO:48, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:2, и CL c SEQ ID NO:58;
(4) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:3, и CH c SEQ ID NO:57, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:2, и CL c SEQ ID NO:58;
(5) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:3, и CH c SEQ ID NO:47, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:2, и CL c SEQ ID NO:58;
(6) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:3, и CH c SEQ ID NO:48, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:2, и CL c SEQ ID NO:58;
(7) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:4, и CH c SEQ ID NO:57, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:5, и CL c SEQ ID NO:58;
(8) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:4, и CH c SEQ ID NO:47, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:5, и CL c SEQ ID NO:58;
(9) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:4, и CH c SEQ ID NO:48, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:5, и CL c SEQ ID NO:58;
(10) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:6, и CH c SEQ ID NO:57, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:7, и CL c SEQ ID NO:58;
(11) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:6, и CH c SEQ ID NO:47, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:7, и CL c SEQ ID NO:58; или
(12) тяжелую цепь, содержащую VH c SEQ ID NO:6, и CH c SEQ ID NO:48, и легкую цепь, содержащую VL c SEQ ID NO:7, и CL c SEQ ID NO:58.
14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-13, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из фрагмента scFv, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, или антитело представляет собой химерное антитело или гуманизованное антитело.
15. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14.
16. Вектор экспрессии, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.15.
17. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-14, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.15 или вектор по п.16.
18. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-14, где указанный способ включает культивирование клетки-хозяина по п.17 в условиях, которые обеспечивают экспрессию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культивируемой культуры клеток-хозяев.
19. Фармацевтическая композиция для лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией, у пациента, которая содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
20. Фармацевтическая композиция для профилактики HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией, у пациента, которая содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
21. Фармацевтическая композиция по п.19 или 20, где уровень ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке индивидуума снижается.
22. Фармацевтическая композиция по п.19 или 20, где у индивидуума активируется гуморальный иммунный ответа против HBV.
23. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-14 или фармацевтической композиции по п.19 для получения лекарственного средства для лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией у индивидуума.
24. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-14 или фармацевтической композиции по п.19 для получения лекарственного средства для профилактики HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией у индивидуума.
25. Применение по п.23 или 24, где уровень ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке индивидуума снижается.
26. Применение по п.23 или 24, где у индивидуума активируется гуморальный иммунный ответа против HBV.
27. Применение по п.23 или 24, где индивидуумом является человек.
28. Применение по п.23 или 24, где индивидуумом является больной хроническим HBV или больной с хроническим гепатитом В.
29. Применение по п.23 или 24, где заболеванием, ассоциированным с HBV-инфекцией, является гепатит В.
30. Способ, который используют для лечения HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией у индивидуума,
где способ включает введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-14 или фармацевтической композиции по п.19 больному.
31. Способ, который используют для профилактики HBV-инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV-инфекцией у индивидуума,
где способ включает введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-14 или фармацевтической композиции по п.19 больному.
32. Способ по п.30 или 31, где уровень ДНК HBV и/или HBsAg в сыворотке индивидуума снижается.
33. Способ по п.30 или 31, где у индивидуума активируется гуморальный иммунный ответа против HBV.
34. Способ по п.30 или 31, где индивидуумом является человек.
35. Способ по п.30 или 31, где индивидуумом является больной хроническим HBV или больной с хроническим гепатитом В.
36. Способ по п.30 или 31, где заболеванием, ассоциированным с HBV-инфекцией, является гепатит В.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910432602.7 | 2019-05-23 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021138227A RU2021138227A (ru) | 2023-06-23 |
RU2814471C2 true RU2814471C2 (ru) | 2024-02-29 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102906111A (zh) * | 2009-12-24 | 2013-01-30 | 株式会社绿十字 | 特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原的人抗体 |
RU2616236C1 (ru) * | 2016-05-05 | 2017-04-13 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Способ оценки уровня антител, специфичных к различным вариантам HBsAg вируса гепатита В |
WO2018184593A1 (zh) * | 2017-04-07 | 2018-10-11 | 厦门大学 | 用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体 |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102906111A (zh) * | 2009-12-24 | 2013-01-30 | 株式会社绿十字 | 特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原的人抗体 |
RU2616236C1 (ru) * | 2016-05-05 | 2017-04-13 | Закрытое акционерное общество научно-производственная компания "Комбиотех" | Способ оценки уровня антител, специфичных к различным вариантам HBsAg вируса гепатита В |
WO2018184593A1 (zh) * | 2017-04-07 | 2018-10-11 | 厦门大学 | 用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PAULINE BONVIN et al., De novo isolation of antibodies with pH-dependent binding properties, mAbs, 2015, 7:2, pp.294-302. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111201246B (zh) | 结合补体成分c5或血清白蛋白的多肽及其融合蛋白 | |
CN113480641B (zh) | 用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体 | |
JP2021063092A (ja) | B型肝炎表面抗原に対する抗体及びその使用 | |
CN115043938A (zh) | SARS-CoV-2及其突变株的抗体及应用 | |
JP2024506315A (ja) | コロナウイルスのスパイクタンパク質を標的とする抗体 | |
JP2014526886A (ja) | マクロファージ遊走阻止因子(mif)とd−ドーパクロームトートメラーゼ(d−dt)に交差反応性がある抗体 | |
RU2814471C2 (ru) | Новые антитела против вируса гепатита b и их применение | |
CN106749645B (zh) | 一种全人源抗丙型肝炎病毒的中和抗体 | |
US20220235117A1 (en) | Novel anti-hepatitis b virus antibody and uses thereof | |
RU2803082C2 (ru) | Антитела против вируса гепатита в и их применение | |
JP2024505674A (ja) | 抗il1rap抗体 | |
KR20200092539A (ko) | B형 간염 치료 및 예방용 항체 | |
CN113549146B (zh) | 针对柯萨奇病毒b1型的单克隆抗体及其用途 | |
CN115073593B (zh) | 新型冠状病毒抗体及其用途 | |
CN116496389A (zh) | 用于治疗hbv感染及相关疾病的表位肽及抗体 | |
CN114751986A (zh) | 中和新冠病毒的多特异性抗体 | |
CN114751988A (zh) | 中和冠状病毒的多特异性抗体 | |
CN114751987A (zh) | 一种中和冠状病毒的多特异性抗体 | |
CN117843784A (zh) | 抗人cd73抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
AU2012213962A1 (en) | Ultra high affinity neutralizing antibodies |