CN116253795A - 一种识别EB病毒gL蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗体技术领域，公开了一种识别EB病毒gL蛋白的单克隆抗体及其应用。该单克隆抗体或其抗原结合片段与gL蛋白和/或gHgL蛋白具有良好的结合活性，对gL蛋白和/或gHgL蛋白有较高的亲和力，能特异识别表达在细胞表面的天然gL蛋白和/或gHgL蛋白，可以显著抑制EBV对于B细胞和上皮细胞的感染，有效抑制细胞膜融合，可用于检测gL蛋白和/或gHgL蛋白在样品中的存在或水平、检测EB病毒、诊断EB病毒感染所引起的疾病、预防EB病毒感染和/或治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。

Description

一种识别EB病毒gL蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种识别EB病毒gL蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)最早于1964年由Epstein和Barr从Burkitt淋巴瘤细胞中成功培养并建株。EBV属于γ亚型疱疹病毒，是首个被发现的人类致癌病毒。EBV在人群中的感染非常普遍，据报道全球约有95％以上的成年人携带有EBV。在儿童和青少年中，EBV感染多造成传染性单核细胞增多症。EBV的潜伏感染与人类多种淋巴肿瘤和上皮肿瘤发生有关，如霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及NK/T细胞淋巴瘤等，上皮肿瘤包括鼻咽癌和大约10％的胃癌等。而对于器官移植病人以及艾滋病患者等免疫抑制病人来说，罹患EBV相关肿瘤的概率大大增加。据统计，全球每年新增约200000例EBV相关的肿瘤病例，美国国立卫生研究院NIH已于2016年正式将EBV列入第14版致癌物名录。
目前针对EB病毒尚无有效的疫苗，由EBV感染引起的疾病也缺乏特异的治疗手段。传染性单核细胞增多症的治疗大多应用抗病毒药物如阿昔洛韦等，虽然可一定程度上缓解症状，但并不能消除B淋巴细胞内及咽喉部上皮的EB病毒。EBV相关肿瘤的治疗主要为化疗和放疗，但对于复发或转移的患者来说，疗效较差。
单克隆抗体可大量生产，其与抗原结合的高亲和性和高特异性，大大减少了临床应用时的不良反应。同时可以对抗体分子进行改造以增加其抗病毒效力。抗体以其特异性和使用的灵活性成为感染性疾病治疗中非常有前景的手段。而至今仍未有针对EBV囊膜糖蛋白的单克隆抗体上市。因此开发抗EBV的单克隆抗体，将为EBV感染相关疾病提供更有效的预防和治疗手段。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段。
本发明第二方面的目的，在于提供一种重组蛋白。
本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段或第二方面的重组蛋白相关的生物材料。
本发明第四方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的偶联物。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二方面的重组蛋白、第三方面的生物材料、和/或第四方面的偶联物在制备产品中的应用。
本发明第六方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第六方面的偶联物的试剂盒。
本发明第七方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和/或本发明第六方面的偶联物的药物。
本发明第八方面的目的，在于提供本发明第一方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的制备方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；
所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列为：
a1)GFSLSTYW(SEQ ID NO.2)；或
a2)将SEQ ID NO.2经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.2具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列为：
a1)IGGSGST(SEQ ID NO.3)；或
a2)将SEQ ID NO.3经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.3所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.3具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.3所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列为：
a1)ARDSGAGVRFRF(SEQ ID NO.4)；或
a2)将SEQ ID NO.4经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.4具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；
所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为：
a1)ENIGSR(SEQ ID NO.5)；或
a2)将SEQ ID NO.5经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.5具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为：
a1)RAS；或
a2)将RAS经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列为RAS的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与RAS具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与序列为RAS的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为：
a1)QCTYGVSITINYGND(SEQ ID NO.7)；或
a2)将SEQ ID NO.7经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.7所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.7具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.7所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包含：
a1)QQVKESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEYIGVIGGSGSTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSGAGVRFRFWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.8)；或
a2)将SEQ ID NO.8经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.8所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.8具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.8所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列包含：
a1)DLVMTQTPASVEAGVGGTVTINCQASENIGSRLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLESGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTYGVSITINYGNDFGGGTEVVVK(SEQ ID NO.9)；或
a2)将SEQ ID NO.9经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.9具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体中的至少一种。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区。
优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列包含：
a1)GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO.10)；或
a2)将SEQ ID NO.10经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.10所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.10具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.10所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列包含：
a1)GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO.11)；或
a2)将SEQ ID NO.11经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.11所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.11具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.11所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段为识别和/或靶向gL蛋白和/或gHgL蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段。
优选地，所述gHgL蛋白包含gH蛋白和gL蛋白。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段为识别和/或靶向EB病毒的gL蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段识别gL蛋白的第104～123aa。
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段识别gL蛋白的关键位点为gL蛋白的第106、108、109、110、112、114、116、119位氨基酸。
本发明的第二个方面，提供一种重组蛋白，包含：本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
优选地，所述的标签序列选自下组中的至少一种：6×His标签、GGGS序列、FLAG标签。
本发明的第三个方面，提供与本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段或本发明第二个方面的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b8)中至少一种：
b1)编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段或第二个方面的重组蛋白的核酸分子；
b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
b4)包含b2)所述表达盒的载体；
b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。
优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
优选地，所述编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子包含编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子和编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子；
所述编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a1)SEQ ID NO.16；或
a2)将SEQ ID NO.16经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.16所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.16具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.16所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
所述编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a1)SEQ ID NO.17；或
a2)将SEQ ID NO.17经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.17所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.17具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.17所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
优选地，所述编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的核酸分子还包含编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的核酸分子和编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的核酸分子；
所述编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a1)SEQ ID NO.18；或
a2)将SEQ ID NO.18经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.18所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.18具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.18所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；
所述编码本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的核酸分子的核苷酸序列包含：
a1)SEQ ID NO.19；或
a2)将SEQ ID NO.19经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.19所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.19具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ ID NO.19所示的核酸分子具有相同功能的核苷酸序列。
本发明的第四个方面，提供一种偶联物，包含：本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段和本发明第二个方面的重组蛋白中的至少一种；
以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶中的至少一种。
优选地，所述可检测标记物选自放射性同位素，荧光物质，化学发光物质，有色物质，或其任意组合。
优选地，所述偶联物选自：荧光物质、化学发光标记物、有色物质、放射性同位素、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第五个方面，提供发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段、第二个方面的重组蛋白、第三个方面的生物材料、和/或第四个方面的偶联物在制备产品中的应用；
所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒中的至少一种。
优选地，所述药物具有c1)～c2)中至少一种功能：
c1)预防EB病毒感染；
c2)治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述试剂、检测板或试剂盒具有d1)～d3)中至少一种功能：
d1)检测gL蛋白和/或gHgL蛋白在样品中的存在或水平；
d2)检测EB病毒；
d3)诊断EB病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。
优选地，所述gHgL蛋白包含gH蛋白和gL蛋白。
本发明的第六个方面，提供一种产品，所述产品包含e1)～e3)中至少一种：
e1)本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；
e2)本发明第二个方面的重组蛋白；
e3)本发明第四个方面的偶联物；
所述产品包含试剂、检测板、试剂盒中的至少一种。
优选地，所述产品具有d1)～d3)中至少一种功能：
d1)检测gL蛋白和/或gHgL蛋白在样品中的存在或水平；
d2)检测EB病毒；
d3)诊断EB病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。
优选地，所述gHgL蛋白包含gH蛋白和gL蛋白。
本发明的第七个方面，提供一种药物，所述药物包含f1)～f4)中至少一种：
f1)本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段；
f2)本发明第二个方面的重组蛋白；
f3)苯发明第三个方面的生物材料；
f4)本发明第四个方面的偶联物。
优选地，所述药物还包含药学上可接受的载体。
优选地，所述药物具有c1)～c2)中至少一种功能：
c1)预防EB病毒感染；
c2)治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。
优选地，所述疾病包括：鼻咽癌、胃癌、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、淋巴组织增生性疾病、传染性单核细胞增多症中的至少一种。
本发明第八个方面，在于提供本发明第一个方面的单克隆抗体或其抗原结合片段或第二方面的重组蛋白的制备方法，通过培养本发明第三个方面中的转基因细胞系得到。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，该单克隆抗体或其抗原结合片段与gL蛋白和/或g HgL蛋白具有良好的结合活性，对gL蛋白和/或gHgL蛋白有较高的亲和力，能特异识别表达在细胞表面的天然gL蛋白和/或gHgL蛋白，可以显著抑制EBV对于B细胞和上皮细胞的感染，有效抑制细胞膜融合，可用于检测gL蛋白和/或gHgL蛋白在样品中的存在或水平、检测EB病毒、诊断EB病毒感染所引起的疾病、预防EB病毒感染和/或治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病。
附图说明
图1是实施例2中单克隆抗体10E4与gHgL蛋白的结合活性ELISA测定结果图。
图2是实施例2中单克隆抗体10E采用Western Blot检测gHgL的结果图。
图3是实施例3中单克隆抗体10E4与gHgL蛋白的亲和力常数检测结果图。
图4是实施例4中单克隆抗体10E4检测细胞中过表达的EB病毒gHgL蛋白或gL蛋白的流式图：其中，A是单克隆抗体10E4检测细胞中过表达的EB病毒gHgL蛋白的流式图；B是单克隆抗体10E4检测细胞中过表达的EB病毒gL蛋白的流式图。
图5是实施例5中单克隆抗体10E4检测EBV阳性细胞系gHgL蛋白表达的结果图。
图6是实施例6中单克隆抗体10E4阻断EBV感染B细胞或上皮细胞的结果图：其中，A是单克隆抗体10E4阻断EBV感染B细胞的结果图；B是单克隆抗体10E4阻断EBV上皮细胞的结果图。
图7是实施例7中单克隆抗体10E4在细胞融合模型的阻断结果图。
图8是实施例8中基于与生物素标记多肽反应的单克隆抗体10E4表位鉴定结果图：其中，A是与生物素标记的多肽的氨基酸序列图；B是单克隆抗体10E4和与生物素标记的多肽的反应结果图。
图9是实施例9中单克隆抗体10E4与丙氨酸点突变的gHgL蛋白Western Blot反应结果图。
图10是实施例9中单克隆抗体10E4与丙氨酸点突变的gHgL蛋白ELISA反应结果图。
图11是实施例9中单克隆抗体10E4识别表位在gL蛋白3D结构中的位置图。
图12是实施例9中单克隆抗体10E4识别表位在gHgL/gp42/E1D1复合物3D结构中的位置图。
图13是实施例9中单克隆抗体10E4识别表位在gHgL/EphA2 LBD复合物3D结构中的位置图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1抗EB病毒gHgL蛋白兔源单克隆抗体(单抗)的制备
使用弗式佐剂混合抗原对兔子进行皮下免疫，每14天为一个免疫周期，加强免疫前进行兔血采集，分离血清做后续滴度检测；采集兔全血，使用Ficoll(葡聚糖)密度梯度离心分离得到PBMC；使用非B细胞Marker染料对PBMC进行染色，使用B细胞IgG Marker荧光抗体、荧光标记抗原对PBMC进行标记；使用流式分选技术负选非B细胞marker阳性细胞群，正选IgG阳性和抗原荧光阳性细胞群，分离到96孔板中，提取阳性孔中兔B细胞RNA并进行反转录得到cDNA，通过特异性引物钓取兔单抗轻重链可变区基因；将兔单抗基因分别构建到轻重链表达质粒载体，共同转染293细胞系进行初步转染表达鉴定，挑选有抗原特异结合的阳性孔做进一步大量表达及功能评价，制备较为完整的gHgL特异性抗体库。
1.1蛋白抗原的制备：参考EB病毒M81毒株全基因序列(KF373730.1)将gL蛋白膜外区序列(对应病毒BKRF2基因所编码蛋白aa 24～137)C端通过柔性氨基酸序列连接gH蛋白膜外区序列(对应病毒BXLF2基因所编码蛋白aa 19～678)，gL蛋白的N端连接上信号肽编码序列，gH蛋白的C端连接上便于亲和层析纯化的多聚组氨酸多肽(6×His)，将以上序列构建到合适的真核表达载体，把构建成功的重组质粒转染至293F细胞表达并进行纯化，最终获得gHgL胞外域全长蛋白(gHgL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，SEQ ID NO.12依次包括：信号肽序列(MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLG，SEQ ID NO.6)、gL蛋白(SEQ ID NO.1(MRAVGVFLATCLVTIFVLPTWGNWAYPCCHVTQLRAQHLLALENISDIYLVSNQTCDGFSLASLNSPKNGSNQLVISRCANGLNVVSFFISILKRSSSALTSHLRELLTTLETLYGSFSVEDLFGANLNRYAWHRGG)所示的氨基酸序列的第24～137位)、连接(linker)序列(GGGGSGGGGSGGGGS，SEQ ID NO.14)、gH蛋白(SEQ IDNO.13(MQLLCVFCLVLLWEVGAASLSEVKLHLDIEGHASHYTIPWTELMAKVPGLSPEALWREANVTEDLASMLNRYKLIYKTSGTLGIALAEPVDIPAVSEGSMQVDASKVHPGVISGLNSPACMLSAPLEKQLFYYIGTMLPNTRPHSYVFYQLRCHLSYVALSINGDKFQYTGAMTSKFLMGTYKRVTEKGDEHVLSLIFGKTKDLPDLRGPFSYPSLTSAQSGDYSLVIVTTFVHYANFHNYFVPNLKDMFSRAVTMTAASYARYVLQKLVLLEMKGGCREPELDTETLTTMFEVSVAFFKVGHAVGETGNGCVDLRWLAKSFFELTVLKDIIGICYGATVKGMQSYGLERLAAMLMATVKMEELGHLTTEKQEYALRLATVGYPKAGVYSGLIGGATSVLLSAYNRHPLFQPLHTVMRETLFIGSHVVLRELRLNVTTQGPNLALYQLLSTALCSALEIGEVLRGLALGTESGLFSPCYLSLRFDLTRDKLLSMAPQEAMLDQAAVSNAVDGFLGRLSLEREDRDAWHLPAYKCVDRLDKVLMIIPLINVTFIISSDREVRGSALYEASTTYLSSSLFLSPVIMNKCSQGAVAGEPRQIPKIQNFTRTQKSCIFCGFALLSYDEKEGLETTTYITSQEVQNSILSSNYFDFDNLHVHYLLLTTNGTVMEIAGLYEERAHVVLAIILYFIAFALGIFLVHKIVMFFL)所示的氨基酸序列的第19～678位)、标签蛋白(HHHHHH，SEQ ID NO.15)。
1.2实验兔的免疫：
10周龄雌性新西兰兔采购自上海市松江区松联实验动物场，使用标准的体内免疫方式，详细方法参见Ed Harlow et al.,“Antibodies A Laboratory Manual”,ColdSpring Harbor Laboratory 1988.简要过程如下：
使用上述步骤1.1中纯化后的EBV gHgL蛋白500μg与弗氏完全佐剂(CFA)(购于SIGMA-ALDRICH，货号：F5881)等体积混合乳化成2mL，经颈部及背部多点注射实验兔。首次免疫后第14天和28天，使用上述步骤1.1中纯化后的EBV gHgL蛋白500μg与弗式非完全佐剂(IFA)(购于SIGMA-ALDRICH，货号：F5506)等体积混合乳化成2mL，经颈部及背部多点注射实验兔。在首次免疫后第42天通过兔耳中央动脉采集全血，分离血清，进行针对gHgL蛋白的抗体滴度测定。
1.3兔外周血单核细胞(PBMC)的制备
使用无血清RPMI1640培养基按1:1比例稀释兔全血，使用Ficoll试剂进行密度梯度离心分离外周血单核细胞，具体如下：加入兔全血1.5倍体积的Ficoll溶液于离心管底层，再缓慢加入兔全血稀释液，800×g，30min，4℃，进行缓慢升降速离心，离心完成后收集Ficoll与RPMI1640培养基交界处的悬浮细胞即为PBMC，再第二次离心收集PBMC细胞，1500rpm，5min，4℃离心。
1.4抗EBV gHgL的特异性B细胞筛选
用100μL无菌PBS溶液重悬分离获得的兔PBMC，按照3ml兔全血PBMC加入1μg生物素标记的gHgL蛋白的标准添加相应量的蛋白，轻柔吹吸混匀，4℃孵育30min。1500rpm 3min 4℃离心，弃去上清保留细胞，使用PBS重悬细胞洗涤2～3次，每管加入100μL如下所示的染色体系：live/dead aqua1μL，CD4-FITC 5μL，CD8-FITC 5μL，T Lymphocytes-FITC 5μL，IgM-RPE 5μL，IgG-BV421 1μL，链霉素偶联APC 1μL，PBS 100μL。置于4℃避光孵育30min。筛选得到B细胞。
使用SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)试剂盒并按照说明书配制单个B细胞裂解液，并加入96孔U底板中，将gHgL特异结合的B细胞按照1cell/well标准分选到相应的U底板中。
通过巢式PCR方法获得重链和轻链配对的PCR产物，使用核酸回收试剂盒回收，送测序。将测序结果在IMGT数据库(http://www.imgt.org/)进行比对，判断得到的基因是否为抗体基因、基因是否完整、是否能够成功编码抗体，确定抗体基因(V区和J区)所属家族。
对克隆载体进行酶切，重链表达质粒载体酶切位点为EcoR I/BamH I，轻链表达质粒载体酶切位点为Nhe I/Sal I。采用Gibson装配方法将轻重链可变区基因构建到相应真核表达载体pRVRCH、pRVRCL，分别得到IgK质粒和IgH质粒；其中，pRVRCH包含编码兔单克隆抗体重链恒定区的核酸序列，pRVRCL包含编码兔单克隆抗体轻链恒定区的核酸序列；重链可变区的核酸序列为：CAGCAGGTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATTGGAGTCATTGGTGGTAGTGGTAGCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAGATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGACAGTGGTGCTGGTGTAAGATTTAGATTCTGGGGCCCTGGCACCCTGGTCACCGTCTCTTCA(SEQ ID NO.16)；轻链可变区的核酸序列为：GACCTCGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGGTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGTAGATTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGCTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTTATGGTGTTAGTATTACTATTAATTATGGTAATGATTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTCGTCAAA(SEQ ID NO.17)；重链恒定区的核酸序列为：GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA(SEQ ID NO.18)；轻链恒定区的核酸序列为：GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACGTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAG(SEQ ID NO.19)。
表达载体构建完成后，脂质体法瞬时转染HEK293T细胞，进行抗EBV-gHgL蛋白的兔源单克隆抗体的表达。转染前12小时，对细胞进行传代，将细胞接种到48孔细胞培养板中，待细胞汇合度达到60％～80％时开始转染；A管：10μL Opti-MEM中加入0.2μg IgH质粒和0.2μg IgK质粒；B管：10μL Opti-MEM中加入0.4μL诺唯赞公司
Figure BDA0003779532290000091
TransfectionReagent；将A、B管分别轻柔混匀，室温静置5min，再将稀释好的质粒滴加至稀释的转染试剂中，轻柔混匀，室温孵育10min；将质粒-转染试剂复合物滴加至细胞中，置于细胞培养箱中培养；48h后，收集细胞上清，并离心，3000rpm 5min 4℃，取上清，弃去细胞碎片沉淀，纯化，得到与gHgL蛋白的反应活性好的单克隆抗体10E4，其重链可变区为：QQVKESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEYIGVIGGSGSTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSGAGVRFRFWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.8)，轻链可变区为：DLVMTQTPASVEAGVGGTVTINCQASENIGSRLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLESGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTYGVSITINYGNDFGGGTEVVVK(SEQ ID NO.9)，重链恒定区为：GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK(SEQ ID NO.10)，轻链恒定区为：GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC(SEQ ID NO.11)；并经过IMGT数据库(http://www.imgt.org/)分析其CDR区序列，其中，重链可变区的CDR1为：GFSLSTYW(SEQ ID NO.2)，CDR2为：IGGSGST(SEQ ID NO.3)，CDR3为：ARDSGAGVRFRF(SEQ ID NO.4)；轻链可变区的CDR1为：ENIGSR(SEQ ID NO.5)，CDR2为RAS，CDR3为：QCTYGVSITINYGND(SEQ ID NO.7)。
1.5抗EBV gHgL蛋白的兔源单克隆抗体的制备
进行10E4单克隆抗体的大量表达，准备处于对数生长期的悬浮细胞293F，置于100rpm 37℃5％CO2细胞摇床进行培养至密度为1.5×106/mL，细胞活率>95％，取400mL细胞置于新的细胞培养瓶中为一个转染体系。A管：20mL悬浮细胞培养基中分别加入600μg表达10E4轻重链的质粒(IgH质粒和IgK质粒)，振荡混匀；B管：20mL悬浮细胞培养基中加入1.2mgPEI转染试剂，振荡混匀。将B管溶液加入A管中，振荡混匀并室温孵育15min，再将混合液体加入400mL的细胞培养体系中，置于100rpm 37℃5％CO2细胞摇床进行抗体表达6天。培养完成后，收集细胞上清，4℃4000rpm 10min。
用0.22μm滤器过滤上述细胞上清。打开AKTA仪器，先分别用A液(200mM十二水合磷酸氢二钠)和B液(100mM一水柠檬酸)冲洗A管道和B管道，装上protein A柱子。用A液以8mL/min的流速平衡protein A柱子15min以上，待仪器检测的UV值、pH值和电导率稳定后进行上样。以6～10mL/min流速上样，随后UV值会上升，该峰为穿透峰，并继续用A液洗柱，同时收集穿透峰样品待检测。待pH值不再变化后用B液以6～10mL/min流速进液，随后pH值下降，UV值上升，该峰为洗脱峰，抗体主要存在于洗脱峰中，并收取洗脱峰样品待检测。用A液平衡柱子，再用20％乙醇充满管道和protein A柱子，取下柱子，4℃保存。对收集的穿透峰和洗脱峰样品进行SDS-PAGE鉴定。纯化的单克隆抗体10E4用20mM PBS缓冲液透析过夜，并采用紫外分光或者BCA测取浓度分装至1.5mL管中，存放于-20℃备用。
实施例2单克隆抗体10E4与gHgL蛋白的结合活性ELISA测定
2.1反应板的制备
将gHgL胞外域全长蛋白用50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，制备为gHgL蛋白终浓度为2μg/mL的包被液。在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，37℃包被2h；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清、1％酪蛋白的pH值为7.4的20mMNa2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2h。弃去封闭液，干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
2.2单克隆抗体10E4与gHgL蛋白反应活性的ELISA检测
取实施例1中获得的单克隆抗体10E4(以9E1为对照抗体，该抗体已在文献：RabbitMonoclonal Antibody Specifically Recognizing a Linear Epitope in the RBD ofSARS-CoV-2Spike Protein中公开)以20mM PBS缓冲液从1μg/mL为起始浓度开始2倍梯度稀释，共稀释20个梯度。取上述步骤2.1中已包被gHgL蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应30min。将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG反应液(购于Abcam，货号：ab6721)，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mMPB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。
结果如图1所示，兔源单克隆抗体10E4与gHgL蛋白的EC50数值为33.49ng/mL，结果表明单抗10E4对纯化后的gHgL蛋白具有良好的结合活性。
2.3 gHgL蛋白兔源单克隆抗体10E4的Western Blot检测
取gHgL蛋白样品加入还原性buffer，100℃加热10min制备样品，再进行SDS-PAGE蛋白电泳。
转膜：利用转膜仪将蛋白胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜。
封闭：将膜用超纯水漂洗一遍，加入商品化封闭液-1(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，室温孵育2h。
一抗孵育：弃去封闭液，用商品化酶稀液ED-13(购自北京万泰生物药业股份有限公司)稀释单克隆抗体10E4至1μg/mL，加入膜中，在室温中于摇床上轻摇孵育1h。
二抗孵育：用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗去膜上未结合的一抗，洗膜3次，每次5min，加入稀释后的HRP标记的羊抗兔IgG反应液(购于Abcam，货号：ab6721)，于摇床上室温轻摇孵育1h。
用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤3次，每次5min。加入适量的化学发光底物混合液，覆盖到硝酸纤维素膜表面，在化学发光成像仪上进行成像与拍照，结果如图2所示。
从图2的结果可知，兔源单克隆抗体10E4可以用于gHgL蛋白的Western blot检测。
实施例3单克隆抗体10E4与gHgL蛋白的亲和力常数检测
使用Biacore 8K系统(Cytiva)对单克隆抗体10E4和抗原gHgL进行结合的动力学分析。所有步骤都在PBS缓冲液下进行，采用该公司配套的Protein A芯片捕获稀释为1μg/mL的单克隆抗体，使用EBV-gHgL蛋白作为检测抗原，检测时抗原分别稀释为200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM七个梯度。检测按照下述程序进行：捕获60s，分析120s，解离240s，再生60s。采用仪器配套数据采集和分析软件进行抗体平衡解离常数的计算。
结果如图3所示，10E4对EBV-gHgL蛋白的平衡解离常数(KD)为3.53nM，表明兔源单克隆抗体10E4与gHgL蛋白有高亲和结合能力。
实施例4单克隆抗体10E4检测细胞中过表达的EB病毒gHgL蛋白(流式细胞仪)
(1)将293T接种到10cm细胞培养板中，待细胞汇合率达到60～80％时进行转染；
(2)A管：2mL Opti-MEM中加入30μg含EBV gL、gH蛋白全长基因或gL全长基因的真核表达质粒(pCAGGS-gH(gH的登录号：BAU51590.1；载体：pCAGGS)、pCAGGS-gL(gL的登录号：BAU51568.1，载体：pCAGGS))；
(3)B管：2mL Opti-MEM中加入60μL诺唯赞公司
Figure BDA0003779532290000111
TransfectionReagent；
(4)将A、B管分别轻柔混匀，室温静置5min，再将稀释好的质粒滴加至稀释的转染试剂中，轻柔混匀，室温孵育10min；
(5)将质粒-转染试剂复合物滴加至细胞中，置于细胞培养箱中培养；
(6)转染48h后，用胰酶消化细胞，取5×105的细胞于Ep管中，450×g离心5min，加入1mL PBS洗涤一次，450×g离心5min，将10E4(以9E1为对照抗体，该抗体已在文献：RabbitMonoclonal Antibody Specifically Recognizing a Linear Epitope in the RBD ofSARS-CoV-2Spike Protein中公开)用PBS稀释至10μg/mL，每管加入50μL，4℃孵育30min，每管加入1mL PBS洗涤三次；
(7)BV421标记的羊抗兔IgG二抗使用PBS配制的2％BSA以1:500稀释，每管加入50μL，4℃孵育30min，4℃孵育30min，每管加入1mL PBS洗涤三次；
(8)用1mL PBS重悬细胞，使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20检测BV421阳性细胞比例。
结果如图4所示，单克隆抗体10E4对转染了gHgL蛋白或gL蛋白全长基因质粒的293T细胞有明显反应，而对照抗体没有反应，说明单克隆抗体10E4能特异识别表达在细胞表面的天然gHgL蛋白或gL蛋白。
实施例5单克隆抗体10E4检测EBV阳性细胞系gHgL蛋白表达
Akata-EBV-GFP细胞(该细胞已在文献：An Antibody Targeting the FusionMachinery Neutralizes Dual-Tropic Infection and Defines a Site ofVulnerability on Epstein-Barr Virus中公开)使用1mL PBS洗涤一次，用anti-humanFcR block(BioLegend)在4℃孵育30min封闭，在用Fixation Buffer/Permeabili zationWash Buffer处理细胞，将10E4(以9E1为对照抗体，该抗体已在文献：Rabbit MonoclonalAntib ody Specifically Recognizing a Linear Epitope in the RBD of SARS-CoV-2Spike Protein中公开)用PBS稀释至10μg/mL，每管加入50μL，4℃孵育30min，每管加入1mLPBS洗涤三次。BV421标记的羊抗兔IgG二抗使用PBS配制的2％BSA以1:500稀释，每管加入50μL，4℃孵育30min，4℃孵育30min，每管加入1mL PBS洗涤三次。用500μL PBS重悬细胞沉淀，使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20检测BV421阳性细胞比例。
结果如图5所示，10E4可以与EBV阳性细胞系中的gHgL蛋白结合。以上结果表明10E4可以识别EBV阳性细胞系中的天然gHgL蛋白。
实施例6单克隆抗体10E4在病毒感染模型的中和能力分析
EBV的B细胞中和模型：
取单克隆抗体10E4、无关抗体VRC01，以RPMI1640无血清培养基稀释，从100μg/mL为起始浓度开始3倍梯度稀释，稀释8个梯度。取20μL稀释后的抗体于96孔细胞板中，加入20μL CNE2细胞生产的携带GFP绿色荧光蛋白基因的病毒稀释液(病毒稀释液已在AnAntibody Targeting the Fusion Mach inery Neutralizes Dual-Tropic Infectionand Defines a Site of Vulnerability on Epstein-Barr Virus中公开)，混合均匀，放置在37℃培养箱中孵育2h。用16mL 10％FBS RPMI1640培养基重悬1×106个Akata细胞，在上述病毒与抗体混合液中加入160μL的细胞悬液，放置在37℃培养箱中孵育48h，使用BD公司的流式细胞仪LSRFortessaX-20检测Akata细胞的病毒感染率，计算出与感染对照组(加入等体积RPMI1640无血清培养基)相比，抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少比例(％)，计算抗体在B细胞感染模型的抑制率(中和效率，％)。
EBV的上皮细胞中和模型：
提前使用10％FBS DMEM培养基将HNE1细胞按照160μL体积，5000cell/well标准铺板到96孔板中，置于37℃培养箱培养24小时。待细胞贴壁后，以DMEM无血清培养基稀释单克隆抗体10E4、无关抗体VRC01，从100μg/mL为起始浓度开始2倍梯度稀释，稀释12个梯度。吸取20μL不同浓度的稀释抗体与20μL Akata细胞生产的EBV病毒悬液(病毒稀释液已在文献：An Antibody Targeting the Fusion Machinery Neutralizes Dual-Tropic Infectionand Defines a Site of Vulnerability on Epstein-Barr Virus中公开)充分混合，37℃孵育3小时，将抗体与病毒的混合液加入铺有HNE1细胞的96孔板中，置于37℃培养箱中培养。48小时后，消化96孔板中的HNE1细胞，使用BD公司的流式细胞仪LSRFortess aX-20检测表达GFP绿色荧光蛋白的HNE1细胞比例，计算出与感染对照组(加入等体积RPMI1640无血清培养基)相比，抗体处理组的GFP阳性细胞数量减少比例(％)，计算抗体在上皮细胞感染模型的抑制率(中和效率，％)。
结果如图6所示，单克隆抗体10E4在B细胞和上皮细胞感染模型的IC50分别为15.15μg/mL和0.73μg/mL。表明单克隆抗体10E4在B细胞感染模型和上皮细胞感染模型中都能够中和病毒感染。
实施例7单克隆抗体10E4在细胞融合模型的阻断能力分析
将293T接种到10cm细胞培养板中，待细胞汇合率达到60～80％时进行转染。设置A板：使用PEI为转染试剂，分别准备2.5μg的携带编码全长gB、gH、gL的基因的真核表达质粒(分别为pCAGGS-gB(gB的登录号：BAU51603.1；载体：pCAGGS)、pCAGGS-gH(gH的登录号：BAU51590.1；载体：pCAGGS)、pCAGGS-gL(gL的登录号：BAU51568.1，载体：pCAGGS)、pCAGSS-T7(T7的登录号：CP053597.1，载体：pCAGGS)，具体构建方法参考文献：Fusion ofepithelial cells by Epstein–Barr virus proteins is triggered by binding ofviral glycoproteins gHgL to integrinsαvβ6orαvβ8)并进行转染；B板：使用PEI为转染试剂，在293T细胞中转染10μg含T7启动子控制的Luciferase基因的真核表达质粒(pT7EMCLuc(Luciferase的登录号：M15077.1，载体：pCAG)，具体构建方法参考文献：Fusionof epithelial cells by Epstein–Barr virus proteins is triggered by binding ofviral glycoproteins gHgL to integrinsαvβ6orαvβ8)。
转染24h后，消化A板的293T细胞，并按照每组2×105个细胞的比例分装到96孔板中，分别加入200μL不同浓度的抗体(10E4、1已报道的单克隆抗体AMMO1(Immunity,2018,48:799-811.e9)、对照单克隆抗体VRC01、No Ab组加入等量溶剂)，置于37℃培养箱孵育30min后转移到24孔板中。将B板细胞提前消化，在上述24孔板每孔中加入2×105个细胞，37℃培养24h。
取Promega公司的Dual-Glo Luciferase Assay System试剂盒中的萤火虫荧光素酶底物100μL加入24孔板中，4℃裂解20min，每孔取80μL的细胞裂解上清进行荧光定量检测。计算与未处理的对照孔(No Ab组)相比，抗体处理组的荧光读值减少的比例，计算抗体在细胞融合模型的阻断效率(％)。
结果如图7所示，结果显示单克隆抗体10E4对于细胞融合模型的阻断具有浓度依赖性，说明对细胞膜融合具有特异性阻断效果，且同等浓度条件下，10E4的膜融合抑制效果与AMMO1相当。
实施例8单克隆抗体10E4的表位鉴定结果
将gL蛋白的aa 24-137区域的序列合成为每条肽链长度为20aa，相邻多肽包含10aa的序列重叠，共获得11条多肽链(如图8中A所示)，在多肽链N端标记生物素，多肽合成及生物素标记工作由金斯瑞公司完成。
将多肽链用50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，制备为终浓度为2μg/mL的包被液。在96孔链霉素预包被的酶标板中每孔加入100μL的包被液，37℃包被2h；用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次；然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清、1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2h。弃去封闭液，干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
取实施例1中获得的单克隆抗体10E4以20mM PBS缓冲液稀释为1μg/mL的抗体稀释液。取上述中已包被gL多肽的酶标板及gHgL蛋白酶标板，每孔加入100μL稀释后的抗体，置于37℃温箱反应30min。将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG反应液(购于Abcam，货号：ab6721)，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mMNaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。
结果如图8所示，结果显示单克隆抗体10E4与P9肽及阳性对照gHgL蛋白有反应，即单克隆抗体10E4识别104～123aa。
实施例9单克隆抗体10E4识别表位关键位点鉴定
9.1gHgL胞外域点突变蛋白的构建
为了鉴定gHgL蛋白兔源中和抗体识别的关键位点，开展gHgL蛋白胞外域点突变克隆、表达和评价工作。
根据Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2(购自诺唯赞公司)试剂盒说明进行引物设计，并开展点突变克隆，将gHgL蛋白胞外结构域对应位点的氨基酸突变成丙氨酸(gHgL-L104A表示gHgL蛋白(序列如SEQ ID NO.12所示)中的第104位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-R105A表示gHgL蛋白中的第105位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-E106A表示gHgL蛋白中的第106位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-L107A表示gHgL蛋白中的第107位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-L108A表示gHgL蛋白中的第108位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-T109A表示gHgL蛋白中的第109位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-T110A表示gHgL蛋白中的第110位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-L111A表示gHgL蛋白中的第111位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-E112A表示gHgL蛋白中的第112位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-T113A表示gHgL蛋白中的第113位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-L114A表示gHgL蛋白中的第114位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-Y115A表示gHgL蛋白中的第115位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-G116A表示gHgL蛋白中的第116位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-S117A表示gHgL蛋白中的第117位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-F118A表示gHgL蛋白中的第118位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-S119A表示gHgL蛋白中的第119位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-V120A表示gHgL蛋白中的第120位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-E121A表示gHgL蛋白中的第121位氨基酸突变为丙氨酸的gHgL蛋白；gHgL-WT的序列如SEQ ID NO.12所示)，通过测序验证点突变克隆是否构建正确。将正确点突变克隆瞬转293F细胞进行真核表达，通过镍柱纯化获得点突变蛋白。
9.2Western Blot方法鉴定抗体识别关键位点
取上述步骤9.1中获得的野生型(WT)或各点突变gHgL蛋白样品加入还原性buffer，100℃加热10min制备样品，再进行SDS-PAGE蛋白电泳。
转膜：利用转膜仪将蛋白胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜。
封闭：将膜用超纯水漂洗一遍，加入商品化封闭液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)，室温孵育2h。
一抗孵育：弃去封闭液，用商品化酶稀液ED-13(购自北京万泰生物药业股份有限公司)稀释单克隆抗体10E4至1μg/mL，加入膜中，在室温中于摇床上轻摇孵育1h。
加二抗：用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗去膜上未结合的一抗，洗膜3次，每次5min，加入稀释后的HRP标记的羊抗兔IgG反应液(购于Abcam，货号：ab6721)，在室温中于摇床上轻摇孵育1h。
用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗去膜上未结合的二抗，每次5min。加入适量的化学发光底物混合液，覆盖到硝酸纤维素膜表面，在化学发光成像仪上进行成像与拍照，记录结果。
Western blot结果如图9所示，结果显示部分位点突变之后影响了抗体与蛋白的结合能力。第106、108、109、110、112、114、116位七个氨基酸位点为10E4抗体的关键位点，该位点的任意一个氨基酸的突变都能导致单抗10E4对蛋白不反应或反应变弱。
9.3ELISA方法鉴定gHgL单克隆抗体与点突变蛋白反应性
将上述步骤9.1中获得的野生型(WT)或各点突变gHgL蛋白样品用pH9.6的50mM CB缓冲液(NaHCO3/Na2CO3缓冲液，终浓度为50mM，pH值为9.6)稀释，得到终浓度为2μg/mL的包被液。在96孔酶标板每孔中加入100μL的包被液，37℃包被2h。用PBST洗涤液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤1次。然后每孔加入200μL的封闭液(含有20％小牛血清及1％酪蛋白的pH值为7.4的20mM Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液溶液)，放入37℃封闭2h。弃去封闭液。干燥后装入铝箔袋2-8℃保存备用。
取实施例1中获得的单克隆抗体10E4，以20mM PBS缓冲液从10μg/mL为起始浓度开始2倍梯度稀释，共稀释10个梯度。取已包被gHgL蛋白的酶标板，每孔加入100μL已稀释的样品，置于37℃温箱反应30min。将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入100μL HRP标记的羊抗兔IgG反应液，置于37℃温箱反应30min。完成酶标记物反应步骤后，将酶标板用PBST洗液(20mM PB7.4，150mM NaCl，0.1％Tween20)洗涤5遍，每孔加入TMB显色剂(购自北京万泰生物药业股份有限公司)各50μL，置于37℃温箱反应15min。完成显色反应步骤后，在反应完的酶标板中每孔加入终止液(购自北京万泰生物药业股份有限公司)50μL，并于酶标仪上检测各孔的OD450/630值。
ELISA OD450检测结果如图10所示，第106、108、109、110、112、114、116、119位八个氨基酸位点为10E4抗体的关键位点，该位点的任意一个氨基酸的突变都能导致单抗10E4对蛋白不反应或反应变弱。10E4单抗识别表位在蛋白3D结构中的位置如图11(使用pymol软件作图，EBV gHgL的PDB ID：3PHF)所示。10E4单抗识别表位与E1D1识别表位的比较如图12(使用pymol软件作图，EBV gHgL/gp42/E1D1的PDB ID：5T1D)所示，10E4识别表位与E1D1不同。10E4单抗识别表位与EphA2 LBD结合表位的比较如图13(使用pymol软件作图，EBV gHgL/EphA2 LBD的PDB ID：7CZE)所示，10E4识别表位与EphA2 LBD结合表位不同。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；
所述重链可变区的CDR1的氨基酸序列为：
a1)GFSLSTYW(SEQ ID NO.2)；或
a2)将SEQ ID NO.2经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.2具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述重链可变区的CDR2的氨基酸序列为：
a1)IGGSGST(SEQ ID NO.3)；或
a2)将SEQ ID NO.3经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.3所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.3具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.3所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述重链可变区的CDR3的氨基酸序列为：
a1)ARDSGAGVRFRF(SEQ ID NO.4)；或
a2)将SEQ ID NO.4经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.4具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.4所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区包含CDR1、CDR2、CDR3；
所述轻链可变区的CDR1的氨基酸序列为：
a1)ENIGSR(SEQ ID NO.5)；或
a2)将SEQ ID NO.5经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.5具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的CDR2的氨基酸序列为：
a1)RAS；或
a2)将RAS经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列为RAS的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与RAS具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与序列为RAS的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的CDR3的氨基酸序列为：
a1)QCTYGVSITINYGND(SEQ ID NO.7)；或
a2)将SEQ ID NO.7经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.7所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.7具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.7所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述重链可变区的氨基酸序列包含：
a1)QQVKESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEYIGVIGGSGSTYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARDSGAGVRFRFWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.8)；或
a2)将SEQ ID NO.8经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.8所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.8具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.8所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列包含：
a1)DLVMTQTPASVEAGVGGTVTINCQASENIGSRLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLESGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTYGVSITINYGNDFGGGTEVVVK(SEQ ID NO.9)；或
a2)将SEQ ID NO.9经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ IDNO.9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a3)与SEQ ID NO.9具有99％、98％、97％、96％、95％、94％或93％的同源性且与SEQ IDNO.9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于：
所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双特异性抗体、多特异性抗体中的至少一种；
优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和轻链恒定区。
4.一种重组蛋白，包含：权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
5.与权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b8)中至少一种：
b1)编码权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段相关或权利要求4所述的重组蛋白的核酸分子；
b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；
b3)包含b1)所述核酸分子的载体；
b4)包含b2)所述表达盒的载体；
b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；
b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；
b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；
b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系。
6.一种偶联物，包含：权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段和权利要求4所述的重组蛋白中的至少一种；
以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶中的至少一种。
7.(1)～(4)中至少一种在制备产品中的应用；
(1)权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
(2)权利要求4所述的重组蛋白；
(3)权利要求5所述的生物材料；
(4)权利要求6所述的偶联物；
所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：
所述药物具有c1)～c2)中至少一种功能：
c1)预防EB病毒感染；
c2)治疗和/或预防EB病毒感染所引起的疾病；
优选地，所述试剂、检测板或试剂盒具有d1)～d3)中至少一种功能：
d1)检测gL蛋白和/或gHgL蛋白在样品中的存在或水平；
d2)检测EB病毒；
d3)诊断EB病毒感染所引起的疾病。
9.一种产品，所述产品包含e1)～e3)中至少一种：
e1)权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
e2)权利要求4所述的重组蛋白；
e3)权利要求6所述的偶联物；
所述产品包含试剂、检测板、试剂盒中的至少一种。
10.一种药物，所述药物包含(1)～(4)中至少一种：
(1)权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；
(2)权利要求4所述的重组蛋白；
(3)权利要求5所述的生物材料；
(4)权利要求6所述的偶联物。
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