KR100281163B1 - 비형 간염 표면 항원에 대해 활성적인 인체 단일클론 항체의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B형 간염 백신으로 면역화된 환자의 혈액 세포들과 SPAZ4로 명명되는 이종의 하이브리도마를 융합시키므로써 수득되는 세포주로 부터 제조되며, B형 간염의 진단 및 치료에 효과적인 단일클론 항체에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

비형 간염 표면 항원에 대해 활성적인 인체 단일클론 항체의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

본 발명은 비(B)형 간염 바이러스를 중화시키는 인체 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 이 세포주를 제조하는 방법, 이 세포주에 의해 생산된 항체, 및 이 항체의 사용방법, 특히, 치료적 사용방법에 관한 것이다.

단일 클론 항체를 제조하기 위한 목적으로 하이브리도마 세포주를 제조하는 방법은 현재 당업자에게 공지된 일반적인 것이다. 본 발명은 특히 B형 간염 표면 항원(HBsAg)에 대해 효과적인 인체 단일 클론 항체를 수득하는 방법에 관한 것이며, 이러한 항체는 문헌[Hybridoma 2(4):361(1983)] 및 1983년 8월 10일 공개된 영국 특허출원 2,113,715A호에서 본 출원인에 의해 기술된 일반적인 적용방법에 따라 제조된다. 보다 구체적으로는 인체 파트너 세포에 융합된 쥐의 골수종 세포(예, SP-2)와 같은 무한 증식성 설치류 모세포를 함유하는 하이브리도마 세포주가 무한 증식성의 이종 하이브리도마 세포를 산출한다는 것이 밝혀졌다. 이러한 이종 하이브리도마 세포는 항-HBsAg 인체 항체를 생산할 수 있는 세포에 융합되어 인체내에서 상기 항원에 대해 효과적인 인체 항체를 생성시킬 수 있는 신규한 트리오마(trioma) 세포주가 될 수 있다. 대안적으로, 보다 큰 안정성이 필요할때는, 바람직하게는 자신의 항체를 생성하는 능력을 더이상 갖지 않는 트리오마 세포주를 제조하고, 이 트리오마를 그 다음 상기 항원에 대해 유용한 항체를 생산할 수 있는 또 다른 세포와 융합시켜, 상기 항원에 대한 항체를 생산하는 더욱 안정한 하이브리도마(쿼드로마)를 수득한다.

본 출원인에 의한 이전의 공보들은 예컨대, NIGMS 인체 유전자 변이 세포 보관 번호 GM35669A(U.S. DHHS(1982)세포주 카타로그 참조)로부터 수득할 수 있는 약제 내성 세포주 SP-2로부터 제조된 SPAZ4로 명명되는 이종 하이브리도마의 제조방법을 기술하고 있다. 이 SPAZ4의 제법을 요약하면 다음과 같다. SP-2 세포주를 정상인의 말초 임파구와 통상적인 기법으로 융합시킨다. 다수의 하이브리드를 수득하고, 약 5주 후 빠르게 증식하고 항체 생산을 하지 않는 5개의 클론을 선별한다. 이 세포들을 8-아자구아닌에 대한 내성 실험으로 선별하고 이 세포주들 중 3개의 세포주를 가지고 8-아자구아닌 20㎍/㎖에 대해 내성인 변이주를 수득하는 것이 가능하다. 이 세포들은 동시에 히포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지에 민감한데, 이는 이들이 히포크산틴 포스포리보실 트란스퍼라제를 생산하는 능력을 상실했음을 나타낸다. 이 세포주들의 하나가 SPAZ 4이다.

세포주 SPAZ 4는 B형 간염 백신으로 면역화된 사람의 혈액으로부터 수득된 세포와 융합되어 하이브리도마 세포주를 산출할 수 있으며, 이는 표준 선별 과정이 바이러스 항원에 대한 항체의 결합성과 관련하여 사용될 때 양성 배양물을 제공한다. 이 양성 배양물은 여러 아형(subtype)의 바이러스가 항원 준비물로 사용되는 제2의 선별 과정을 통과하는 것이 바람직하다. 이것은 항체에 의해 인식되는 정확한 항원 결정인자를 정확하게 선발하는 기회를 제공한다.

따라서, 이종 하이브리도마와 인체 단일 클론 항체 생산 세포의 융합으로 수득되는 세포주(트리오마)는 간염을 유발하는 바이러스를 중화시키는데 효과적인 활성을 나타낼수 있는 단일 클론 항체를 제공하는데 유용하며, 이 항체는 예컨대, 수혈을 통한 간염의 확산을 예방할 수 있다. 이 항체는 또한 신생아 또는 백신이 효과를 나타낼 수 있는 것보다 이전에 노출된 개체에게 초기 예방을 제공하는데 사용될수 있다. 항-간염 항체는 조직이식 환자를 비롯하여 면역억제된 환자를 재발성 간염으로부터 보호하는데 사용될 수 있다. 이것은 B형 간염 양성인 간 피이식자인 경우에 매우 중요하다. 또한, 상기 항체는 진단 분석에 사용될 수 있다.

또한, Fab 단편과 같은 항체 단편이 B형 간염 바이러스 표면 항원에 결합할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 단편 또한 본 발명의 일부를 구성한다.

본 발명에 따라 제조된 특이적 항체로는 PE1-1, ZM1-1, ZM1-2, MD3-4 및 LO3-3을 포함하며, 이 항체들 각각은 IgGl류이다.

PE1-1을 생산하는 세포주는 1986년 10월 16일자로 미합중국 모식균 배양 수집소에 기탁번호 ATCC HB 9234호로 기탁되었고; ZM1-1을 생산하는 세포주는 1986년 9월 4일자로 ATCC HB 9191호로 기탁되었으며; ZM1-2를 생산하는 세포주는 ATCC HB 9192호로 기탁되었다. 미국 모식균 배양 수집소의 주소는 메릴랜드 20852, 록크빌, 파크론 드라이브 12301이다.

본 발명의 세포주는 모두 일반적인 (마우스 x 인체) x 인체 하이브리도마로서 작용하며 표준 현탁 배양에서 25mg/l 이하의 농도로 그들 각각의 항체를 생산한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 항체 PE1-1(단일선) 및 항체 ZM1-2(이중선)의 결합 속도론을 비교하는 직접 결합하는 효소 결합된 면역분석법의 결과를 나타낸 것이다.

제2도는 투여후 여러 시간에서 측정한 리서스 원숭이 혈청중의 항체 PE1-1의 혈청 농도를 나타낸다, 상세한 내용은 실시예 4C에 제시한다.

본 명세서 및 특허청구의 범위를 통해, 상기 세포주 및 이 세포주가 생산하는 항체를 동일하게 표기하여, 예컨대, 세포주 PE1-1은 단일 클론 항체 PE1-1을 생산하며 세포주 ZM1-1은 단일 클론 항체 ZM1-1을 생산한다. 당업자는 기술된 것이 세포주인지 항체인지를 알 수 있으리라 생각된다.

단일 클론 항체 및 세포주 PE1-1은 또한 본 발명자 및 본 발명자의 양수인에 의해 OST 577 및 64-577로서 명명되었었다. 이와 유사하게, 단일 클론 항체 및 세포주 ZM1-2는 또한 265-695로서 명명되었었고, 단일 클론 항체 및 세포주 LO3-3은 266-215로서 명명되었었다.

본 발명에 따라 수득된 항체 및 항체 단편은 시험관내 ELIBA 결합 분석법에서 B형 간염 표면 항원에 대해 우수한 특이성을 갖고 있다.

본 발명의 항체는 인체에서 유래한 것이므로 인체 치료법에 유리하게 사용되며, 반복 치료시에도 쥐나 양의 항체의 경우에 발생하는 알레르기 유발성 반응을 일으키지 않는다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 하나 이상의 전출한 항체를 투여하여 B형 간염을 치료하는 방법이다. 약 10 내지 40mg의 항체를 반복 투여하면 순환성 HBsAg의 양이 현저히 감소된다는 것이 밝혀졌다. 또한, 추가 투여가 항원시험에서 검출할 수 있는 범위 이하의 수준으로 HBsAg의 양을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

본 발명의 또다른 목적은 2 이상의 단일 클론 항체의 혼합물이다. 이 혼합물은 제공된 하나의 단일 클론 항체에 잘 결합하지 않는 비야생형의 B형 간염 바이러스 균주를 보유하는 환자에게 투여하기에 특히 적합하다. 예를 들면, 간세포 종양과 만성 B형 간염을 겪는 특별한 치료가 필요한 한 환자에게 간 이식전에 항체 PE1-1을 투여하고, 그 후 반복 투여했다(상세한 것은 실시예 5에 제시됨). 약 4개월 반동안의 치료 후 PE1-1이 아닌 다클론 항체로 소량의 혈청 HBsAg가 검출되었다. 추정상의 단일 클론 항체 결합 도메인에 상응하는 HBsAg 유전자의 230 염기쌍 영역에 대한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) DNA 분석을 수행했다. PCR DNA를 M13 박테리오파지내로 클로닝하고 산출되는 DNA를 서열결정했다. 각 혈청 샘플로부터의 클론을 분석한 결과 본래의 간 및 항체 치료전의 PCR DNA와 비교했을 때 2개의 변이 서열이 나타났다. 이 변이 DNA는 HBsAg의 S 단백질중에서 2개의 다른 아미노산을 암호하며, 또한 바이러스 폴러머라제 유전자중의 종지 코돈(UAG)을 암호한다. 이 변이 유전자들은 보존 펩티드 도메인 내에서 글리신을 아르기닌으로 치환시키는 아미노산 변화를 가지고 있다.

단일 클론 항체 PE1-1, ZM1-2, ZM1-1, MD3-4 및 LO3-3은 여러 에피토프들에 결합하는 것으로 밝혀졌고, 하나 이상의 단일 클론 항체가 지금까지 시험된 모든 변이 바이러스에 임상적으로 충분히 유용한 정도로 결합하는 것으로 밝혀졌으므로, 본 발명의 또 다른 목적은 PE1-1, ZM1-2, ZM1-1, MD3-4 및 LO3-3으로 구성된 군중에서 선택된 2 이상의 단일 클론 항체의 혼합물이다. 특히 바람직한 것은 2개의 단일 클론 항체의 혼합물이며, 특히 PE1-1 및 ZM1-2의 혼합물, 및 PE1-1 및 LO3-3의 혼합물이다. 혼합물중에 존재하는 단일 클론 항체의 비율은 당업자에게 명백한 많은 요인들에 의해 변화할 수 있으며, 즉 환자의 혈청중에 존재하는 간염 바이러스(들)의 유전자형, 선택된 항체들의 상대적인 결합 강도, 선택된 항체가 결합하는 에피토프, 및 비용면을 포함한다. 일반적으로, 항체는 1:99의 비율 범위로, 보다 일반적으로는 25:75로 존재할 것이며, 바람직하게는 거의 동량으로 존재할 것이다.

PE1-1, ZM1-1, ZM1-2 및 MD3-4의 단편들을 표준 기법을 사용하여 서열결정했다. PE1-1의 V_H영역의 서열은 표 8-1에 제시했고, CDR1, CDR2,및 CDR3(D_H및 J_H4)에 상응하는 영역이 표시되어 있다. 이 CDR 영역은 항체의 결합 특성을 결정하는데 특히 중요한 영역이므로, 본 발명은 표 8-2에 기술한 바와 같이, PE1-1의 CDR1 영역과 거의 유사한 CDR1 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명은 또한 표 8-1에 기술한 바와 같이, PE1-1의 CDR2 영역과 거의 유사한 CDR2 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 또한, 본 발명은 표 8-1에 기술한 바와 같이, PE1-1의 CDR3 영역과 거의 유사한 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다.

이와 유사하게, ZM1-1의 V_H영역은 표 8-2에 제시된 바와 같이 서열 결정되었다. CDR1, CDR2, 및 CDR3(D_H및 J_H4)에 상응하는 영역이 또한 표시되어 있다. 본 발명은 표 8-2에 기술한 바와 같이, ZM1-1의 CDR1 영역과 거의 유사한 CDR1 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명은 또한 표 8-2에 기술한 바와 같이, ZM1-1의 CDR2 영역과 거의 유사한 CDR2 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함하며, 또한, 본 발명은 표 8-1에 기술한 바와 같이, ZM1-1의 CDR3 영역과 거의 유사한 CDR3 영역의 아미노산 서열을 갖는 항체를 포함한다.

ZM1-2 및 MD3-4의 영역을 암호하는 DNA 서열은 각각 표 8-3 및 8-4에 제시한다. 본 발명은 또한 표 8-3 및 표 8-4에 제시된 바와 같은 ZM1-2 및 MD3-4 영역의 서열과 거의 유사한 아미노산 서열을 갖는 임의의 항체를 포함한다.

PE1-1, ZM1-1, ZM1-2, 및 MD3-4의 V_H영역을 암호하는 DNA서열을 결정하여 각각 표V8-1 및 8-2, 8-3 및 8-4에 기재했다. 이 서열 또는 적절한 단편이 항체(또는 변형된 항체)를 클로닝하는데 또는 프로브로서 사용될 수 있다, 유전자공학 기법(하이브리도마로부터 수득하는 통상적인 기법이 아닌)을 사용하여 생산되는 항체는 당업계에 공지된 클로닝 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 공급원으로부터의 DNA는 거의 유사한 CDR1, CDR2, 및/또는 CDR3 영역을 가지므로써 PE1-1, ZM1-1, ZM1-2 및 MD3-4의 결합 특성을 갖는 합성 항체 분자를 생산하는데 사용될 수 있다. 이런 항체들이 본 발명의 영역내에 포함된다.

PE1-1, ZM1-1, ZM1-2 및 MD3-4의 V_L경쇄 가변부 영역을 암호하는 DNA 서열은 각각 표 9-1, 9-2, 9-3, 및 9-4에 제시한다. 본 발명은 또한 표 9-1, 9-2, 9-3, 및 9-4에 제시한 바와 같은 PE1-1, ZM1-1, ZM1-2 및 MD3-4 영역의 서열과 거의 유사한 아미노산 서열을 갖는 임의의 항체를 포함한다.

또한, PE1-1, ZM1-1, ZM1-2 및 MD3-4의 V_H영역, V_L영역, CDR1 영역, CDR2 영역, 및/또는 CDR3 영역을 암호하는 DNA 서열도 본 발명의 영역에 포함된다.

또한, 엄격한 하이브리드화 조건하에 임의의 전술한 서열에 하이브리드하는 DNA도 포함된다. 이 DNA에는 공급자인 표유류의 다른 DNA가 거의 없고 인트론을 함유할 수도 있고, 또는 cDNA일 수도 있다.

본 명세서 및 특허청구의 범위를 통해 사용된 바와 같이, 다음 정의들의 의미는 다음과 같다. 아미노산 서열은 또 다른 아미노산 서열과 아미노산 상동성이 80% 이상이라면 “거의 유사한” 것이다. DNA와 관련하여, “엄격한 한이브리드화 조건”은 하이브리드화를 2.5X 구연산 식염수 완충액(SSC)에서, 60℃에서 실시한 다음, 이루어진 하이브리드화에 영향을 미치지 않는 감소된 농도의 완충액으로 37℃에서 세정하는 것이다. “관련된 포유류 DNA”는 V_H항체 쇄의 공급원이지만 항체 또는 항체 단편을 암호하는데에는 관련되지 않은, 포유류에 존재하는 DNA를 의미한다.

본 발명은 다음의 비제한적 실시예에 보다 구체적으로 예시된다.

[실시예]

[항체 세포주의 제조]

B형 간염 백신으로 지원한 사람들을 면역화한다. MD3-4, ZM1-2, ZM1-1, 및 PE1-1 하이브리도마 세포주는 헵타박스(Merck ＆ Co.)로 면역화된 개체의 임파구로부터 유래된다. 세포주 LO3-3은 헵타박스를 여러 차례 주사하고 융합 직전에 리콤비박스(Merck ＆ Co.)를 주사한 개체의 세포로부터 형성된다. 말초 혈액 임파구는 밀도가 1.085g/㎖인 퍼콜(Pharmacia Inc.)의 쿠숀상에서 밀도 구배 원심분리로 정제한다. 분리된 임파구를 항크스액(Hank′s Balanced salt solution) 중에서 3회 세정하고 동일한 수의 (마우스×인체)세포주 SPAZ-4로부터의 세포와 혼합한다. 세포 혼합물을 실온에서 400×g로 5분 동안 펠릿화한다. 배지를 제거한 후, 세포 펠릿을 둘베코 최소 필수 배지(MEM)중의 PEG-1000 50% 용액으로 37℃에서 1분 동안 처리한 다음, 이 배지를 둘베코 MEM으로 서서히 희석한다. 이 세포를 원심분리로 수거하고 20% 태내 송아지 혈청을 함유하는 둘베코 MEM에 재현탁시킨다. 이 세포를 1㎖당 약 2×10⁶세포의 농도로 마이크로웰 평판에 접종한다. 다음날, HAT배지(히포크산틴 아미노프테린 티미딘)의 성분을 함유하는 새 배지를 첨가하여 융합되지 않은 SPAZ-4 세포에 대하여 선별한다. 융합후 4일째 HAT-선별에 민감한 모든 세포가 그 시기에 사멸되었으므로 배지를 단지 HT만을 함유하는 새로운 배지로 대체한다.

3 내지 4주 후, 하이브리도마 유사 세포의 증식이 현미경으로 관찰될 수 있을때, 상청액을 항-B형 간염 표면 항원 항체의 존재에 대해 시험한다. 고체상 위에 1/100 희석율의 헵타박스를 사용하는 ELISA 분석법을 사용한다. 상청액과 항온 배양한 후 평판을 비오틴화된 염소 항-인체 면역글로불린 및 아비딘-결합된 양고추냉이 퍼옥시다제(Vectastain, Vector Laboratories Inc.)의 킷트로 발색시킨다. 상기 효소는 페닐렌디아민과의 정색 반응으로 검출된다. 양성 배양물을 새 웰로 옮겨놓고 일부 세포를 1㎖당 20% 태내 송아지 혈청과 10⁷마우스 흉선세포를 함유하는 둘베코 MEM으로 한계 희석하여 클로닝한다. 클로닝 평판을 전술한 것과 동일한 ELISA법으로 시험하고 양성 배양물을 확대 배양하여 동결시킨다.

모든 세포주는 일반적인 (마우스 × 인체) × 인체 하이브리도마로서 작용하며 표준 현탁 배양시에 25mg/1 이하의 농도범위로 각각의 항체를 생산한다.

[실시예 2]

[면역화학적 특성]

A. 항체 군/아군

항체 PE1-1, ZM1-1, ZM1-2, MD3-4 및 LO3-3의 면역글로불린 군을 ELISA 방법을 사용하여 결정한다. 각 항체를 항원 도포된 평판상에 결합시킨 뒤, 아군 특이적인 퍼옥시다제-결합된 항-인체 Ig(Tago)로 각 분석을 진행한다. 항체 각각은 명백히 IgG₁이다.

B . 경쇄형

상기 A에서 기술한 것과 유사한 ELISA 방법을 사용하여, 각 항체를 항-κ 또는 항-λ 경쇄 시약(Tago)으로 시험한다. 다음의 결과가 수득된다.

PE 1-1 람다

ZM1-1 카파

ZM1-2 카파

LO3-3 람다

MD3-4 람다

C. 등전촛점법(IEF)

항체 LO3-3 또는 PE1-1의 샘플을 겔에 적용한다. 그 각각이 염기성 단백질로서 작용하는 것으로 밝혀졌다.

D . 특이성

아형 adw 및 ayr의 정제된 HBsAg를 Scripts Laboratories(캘리포니아, 산디에고 소재)에서 구입했다. HBsAg 아형 ayw는 Connaught Laboratories(온타리오, 월로우달 소재)에서 구입했다. ELISA 분석은 문헌[Ostberg, et at.(1983) Hybridoma 2:361-367]에 기술된 바와 같이 실시된다.

PE1-1은 ayr 및 adw와 반응하나, adw 아형과 좀 더 잘 반응한다. LO3-3은 ayr 및 adw와 거의 동일하게 잘 반응한다. ZM1-1은 adw와 보다 높은 반응성을 나타내나 ZM1-2는 ayr에 약간 보다 잘 결합한다. 고체상 흡착된 ayr 또는 adw 항원으로 고체상 RIA에서 스캐챠드 분석함으로써 PE1-1 및 LO3-3에 대해 이 결과들을 확인한다. 따라서, 이 단일클론 항체들이 아형 결정인자에 명백하게 결합하지는 않을지라도, HBsAg 와 상기 항체들의 반응은 아형에 의해 크게 영향받을 수 있다.

G. 이인자형 결정

이인자형은 네덜란드 적십자 수혈부 중앙 실험실에서 공급된 시약을 사용하여 결정한다. 저해 ELISA 또는 직접 결합 ELISA가 사용된다. 결과를 하기 표 1에 제시한다. 하기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 경쇄 또는 이인자형과 관련하여 고친화성 항-HBsAg 항체에 대한 어떤 뚜렷한 제한은 없다.

[표 1]

G. 친화도

본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌[Wands, et al. (1981) Gastroenterology 80 : 225-232]에 기술된 바와 같이 방사능 표지된 항체를 사용하여 각 항체에 대해 고체 흡착된 HBsAg 의 친화도를 측정한다. 항체를¹²⁵I를 지닌 요오도겐(Pierce)으로 표지한다. LO3-3을 제외한 각 단일클론 항체에 대해 고체상 흡착된 HBsAg 는 ayw이다. LO3-3은 거의 동일한 결과를 나타내는 ayr 및 adw로 분석한다. 항체-항원 항온 배양을 실온에서 실시한다.

상대적 친화도는 또한 저해 ELISA를 사용하므로써 측정되며, 이때 다양한 농도의 가용성 HBsAg (ayw 아형)를 단일클론 항체와 예비 항온 배양하고, 그다음 이 혼합물을 HBsAg가 도포되어 있는 미량역가 웰중에서, 37℃에서 항온 배양한다. 결과를 하기 표 2에 기재한다.

[표 2]

상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, PE1-1 및 ZM1-2에 대한 ELISA 결과는 RIA 결과보다 약 2배 더 낮으며, 이는 실험적 오차의 범위이내이다. ZM 1-1에 대해 수행된 RIA 결과의 스캐챠드 플롯은 저 친화도 결합 부위가 있을 수 있음을 나타낸다. 따라서, ELISA 결과가 RIA보다 약 50배 더 낮으므로 ELISA는 상기 저 친화도 결합 부위를 측정하고 있다고 할 수도 있다. 또한 스캐챠드 플롯은 ZM1-2 또는 PE1-1 고친화도 부위보다 상당히 적은 고친화도 ZM1-1 부위가 있다는 것을 나타낸다. 이론적으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, ZM1-1이 비교된 4개의 항체들중 HBsAg에 대해 가장 높은 친화도를 가질 수 있으나, 단지 어떤 공간적 배열 상태에 있는 HBsAg에 대해서만 가능하다. 이 배열은 소량의 HBsAg 분자내에서만 단지 명백히 나타난다. 또한, 이것은 저 친화도 부위가 1가인 반면 HBsAg에 대한 ZM1-1의 이가 결합에 기인하는 것일 수도 있다.

[실시예 3]

[PE1-1의 역가]

항체 PE1-1을 가지고 AUSAB 방사능면역분석법(Abbott)으로 역가에 대해 시험한다. 시험은 생물학적 제제부의 참조 물질인 B형 간염 면역글로빈(the Bureau of Biologics Reference Hepatitis B immune globin), 및 시판용의 여러 B형 간염 면역 글로불린 제제(H-Big 면역글로빈, HeP B Gammagee 면역글로빈, 및 Hyper Hep 면역글로빈, 모두 의약 공급처에서 구입함)에 대해 수행한다. 면역글로불린 제조물이 다클론성이고 PE 1-1이 단일클론성이라는 사실에도 불구하고, 결합 데이타는 면역글로불린 제조물을 비교하기 위한 생물학적 제제부의 기준 범위에 속하는 것이며, 즉 작도선들이 0.01 이하의 확률 수준에서 평행했다.

역가는 다음과 같이 측정한다. 제조물을 중량을 기준으로 하여 비교한다(208nm에서의 흡광도가 1.4인 것을 1mg/㎖에 해당하는 것으로 간주함). 그 다음 5℃에서 보관된 PE1-1의 제조물을 또한 5℃에서 보관된 상기 다클론 제조물과 비교한다. 제조물 중의 면역글로불린 농도 ㎍/㎖로 1000을 나눈 값의 로그값(즉, 희석율의 log와 유사한, 면역글로불린의 농도에 역비례하는 수의 log)을 1분당 로그 계수값(세개의 평균값)에 대하여 플롯팅한다. 작도된 선들이 평행하다는 가정을 분산을 분석하므로써 시험한다. 그 선들이 0.01 이하의 확률수준에서 평행한 것으로 밝혀졌다. 모든 제조물들의 선들이 평행하며 공통의 기울기가 측정된다. 이 공통 기울기로부터 X-절편을 계산하고 절편들의 차이를 사용하여 역가의 차이를 측정했다. 이 절차에 따르면, 단일클론 항체 PE1-1이 생물학적 제제부의 참조물질인 B형 간염 면역 글로빈보다 약 435배 더 강력했다. 시판용 B형 간염 면역글로불린 제제가 생물학적 제제부의 참조용 제제보다 2배(또는 그 이하) 더 강력한 것으로 밝혀졌으므로, PE1-1은 중량을 기준으로 할때 시판용 B형 간염 면역 글로불린 제제보다 200배 이상 더 강력하다.

[실시예 4]

A. 결합 속도론

항체 PE1-1 및 ZM1-2의 HBsAg에 대한 결합 속도론을 비교하기 위해 직접 결합 효소 결합된 면역 분석법을 사용한다. ELISA 미량역가 평판을 1㎍/㎖로 헵타박스로 피복시킨다. 그 다음 웰을 인산염 완충 식염수중의 2% 태내송아지 혈청과 37℃에서 항온배양한다. 2% 태내 송아지 혈청중의 0.5㎍/㎖의 단일클론 항체 PE1-1 또는 ZM1-2를 다양한 시간 동안 웰 중에서 항온 배양한다. 각각의 지정된 시간에 항체 용액을 제거하고 웰을 새로운 2% 태내 송아지 혈청으로 3회 세정한다. 그 다음 웰을 2% 태내 송아지 혈청과 항온배양하여 90분의 시간 동안 웰이 2% 태내 송아지 혈청을 함유하도록 한다. 이어서, 용액을 퍼옥시다제 결합된 염소 항-람다쇄(PE1-1 웰) 또는 염소 항-카파쇄(ZM1-2웰)로 대체한다. 0-페닐렌디아민 및 H₂O₂를 첨가하여 플라스틱에 결합된 퍼옥시다제 결합물을 정량한다. 그 결과를 제1도에 도시하였고, 단일선은 PE1-1 이고 이중선은 ZM1-2 이다.

제1도에 도시한 바와 같이, PE1-1이 5분내에 거의 완전하게 반응하는 농도일때 고체상 흡착된 HBsAg와 ZM1-2의 반응은 30분내에 완료되지 않고 90분이상 동안 반응을 지속할 수도 있다. 따라서, PE1-1은 이 분석법에서 항원에 훨씬 신속하게 결합한다. 이것이 또한 생체내에서 일어난다고 가정하면, PE1-1은 바이러스 입자들이 간을 감염시킬 수 있기 전에 바이러스 입자를 중화시키는데 더욱 효과적 일 것이다.

B. 에피토프들의 상대적 위치

항체 PE1-1, LO3-3 및 ZM 1-2에 존재하는 에피토프들의 상대적인 위치를 측정한다. 고체상 흡착된 단일클론 항체와의 동시적인 샌드위치 면역분석법을 사용한다. 동일한 항체를 방사능 표지시키고 미량역가 웰중에서 B항 간염 양성 환자로부터의 혈청 및 저해제와 항온 배양한다. 방사능 표지된 LO3-3은 본래 IgG인반면 방사능 표지된 PE1-1 Fab 단편을 사용한다. 결과를 하기 표 3에 제시한다.

[표 3]

단일클론 항체 ZM1-2는 HBsAg에 대한¹²⁵I-PE1-1의 결합을 저해하는데 있어서 비표지된 PE1-1 보다 약 9배 정도 효과가 떨어지는 반면, LO3-3은 수천배 정도 효과가 떨어진다. 따라서, ZM1-2 및 PE1-1의 에피토프들은 아마도 HBsAg 분자상에서 서로 인접해 있는 반면, LO3-3 에피토프는 아마도 HBsAg 분자의 다른 부분에 존재하는 것으로 보인다. 방사능 표지된 LO3-3의 PE1-1 저해를 실험한 역비례 실험은 PE1-1 및 LO3-3이 중복되지 않는 에피토프들에 결합한다는 추가 증거를 제공한다.

PE1-1 및 ZM1-2 에퍼토프들의 유사성 및 LO3-3과의 차이는 환원되고 알킬화된 HBsAg와의 면역분석법에 의해 확인된다. LO3-3은 변성된 항원에 결합할 수 있는 반면 ZM1-2 및 PE1-1은 둘다 변성된 항원에 결합할 수 없다. PE1-1 및 ZM1-2가 여러 아형들과 다양한 반응을 하므로 구별되는 에퍼토프들을 가짐을 주목해야 한다.

C. 리서스 원숭이에서의 PE1-1의 약력학

두마리의 리서스 원숭이에서 PE1-1의 약력학을 연구한다. 각 동물에게 단일클론 항체 PE1-1의 일회 정맥내 환괴 주사액(0.5mg/kg)을 주입한다. PE1-1에 대한 래빗 항-유전인자형 항체 및 ELISA 평판상에 도포된 헵타박스와의 ELISA를 기초로 한 샌드위치 면역분석법을 사용하여 투여후 여러 시간에서 PE1-1의 혈청농도를 측정한다. 그 결과를 제2도에 나타낸다.

두 마리의 리서스 원숭이 중에 존재하는 PE1-1의 혈청농도는 아마도 단일클론 항체의 분배 단계와 관련있는 보다 짧은 반감기를 지닌 2단계 감소(t 1/α=1일 및 1.4일 ; t 1/β=11일 및 16일) 를 특징적으로 나타낸다. 정지 상태에서의 분배 부피(Vdss)는 혈장 부피의 114-144% 인 것으로 계산되며, 이는 항원이 없는 원숭이 중의 조직 구획에 대한 PE1-1의 분포가 거의 이루어지지 않았음을 암시한다.

[실시예 5]

[임상 시험]

A. 간 이식을 받은 적이 있고 만성 활성 B형 간염 및 간세포 종양에 따른 말기 간 질환을 겪고 있는 2명의 환자에 대한 PE1-1의 특별 사용

간 이식을 받은 적이 있고 말기 간 질환을 겪고 있는 2명의 환자에게 특별한 필요에 따라 PE1-1을 제공했다. 환자 #1은 20년 병력의 만성 활성 간염과 간세포 종양의 진단을 받은 56세의 남성이었다. 두번째 환자는 출생시에 B형 간염에 감염된 것으로 추정되는 10세의 남성이었다. 환자 #2 는 초기에 우측 간엽에서 커다란 덩어리가 진단되었고, 생검한 결과 간세포 종양이었다.

이 환자들에게 PE1-1의 수술전 투여량을 투여하여, 이식수술전 순환성 HBsAg 양을 현저히 감소시켰다. 각 환자에게 또한 이식중에 PE1-1 20mg 의 투여량을 2회 투여했다. 그 다음 수술후 이틀째에 수술후 투여를 시작했다.

환자 #1은 순환성 HBsAg양이 치료전 양보다 크게 감소했음에도 불구하고 결코 HBsAg 음성이 되지는 않았다. 환자 #2는 HBsAg 음성이 되었고, 이는 이식후 9일째 처음으로 나타났다. 환자 #1에게 2 내지 20일 간격으로 5-40mg 범위의 PE1-1의 추가 투여량을 투여했다. 환자 #2에게는 평균 21일 내지 28일마다 5mg 또는 10mg 투여량을 투여했다.

PE1-1을 투여한 기간 동안 상기 환자들에게서 어떤 부작용도 보고되지 않았다. 그러나, 환자 #1은 병원에서 퇴원한지 약 4주 후 전이성 종양을 가진 것으로 진단되었다. 그리고 이식후 139일째 사망했다. 그러나, 환자 #1은 이식후 경과동안 검출가능한 정도의 순환성 HBsAg의 존재에도 불구하고 재발성 간염의 어떤 증거도 나타내지 않았다. B형 간염 바이러스 DNA 분석이 수술전 음성이었지만, 이식후 60일째에 하나의 양성값이 검출되었다.

이식후 143일째, 환자 #2는 처음에는 HBsAg에 대해 양성인 것으로 나타났다. HBsAg양은 짧은 기간동안 변동된 후 치료전의 HBsAg양보다 훨씬 적은 양으로 안정화되었다. PE1-1으로 치료하기 전과 후에 수득된 상기 환자의 B형 간염 바이러스의 분리물을 PE1-1에 대한 결합 능력에 대해 분석했다. PE1-1은 변이 바이러스에 결합할 수 있는 것으로 발견되었으나, 야생형 바이러스에는 결합하지 않았다.

2가지 바이러스 분리물의 유전자 분석은 주요 바이러스 표면 단백질의 고도로 보존된 영역내에서 하나의 뉴클레오티드 차이들을 나타냈다. 처리전 바이러스와 비교해 볼때, 이러한 차이들은 B형 간염 바이러스 결합 입자에 대한 PE1-1의 결합 능력을 감소시키는 단일 아미노산 차이를 암호할 수 있는 유력한 것이다.

B. 간이식을 받은 만성 활성 B형 간염이 있는 환자(간세포 종양의 합병증은 갖지 않음)에 대한 PE1-1의 사용

본 연구에는 HBsAg 양성(간세포 종양은 갖지 않음)이고 간 이식을 받은 5명의 환자가 관련된다. 각 환자에게 PE1-1의 수술전 투여량을 1일 3회씩(각각, 10, 20 및 40mg) 3일에 걸쳐 투여했다. 수술전 투여량의 시험 약물을 투여한 후 최소 2일에서 최고 32일까지에 걸쳐 간 이식을 수행했다. 수술동안 추가로 40mg의 PE1-1을 투여했다. 5회의 모든 이식이 성공적으로 완료되었다.

환자의 HBsAg 역가, 간 효소 및 기타 임상 매개 변수를 환자들이 병원에 입원해 있는 동안 면밀하게 검사했다. 그 후, 각 환자들의 개인 의사들에 의해 PE1-1을 계속 규칙적으로(대략 1 내지 3주마다) 투여하고 진단했다. 투여량 및 기타 매개 변수는 환자마다 달랐다.

2명의 환자(#5 및 #6)는 음성의 HBsAg 검색 결과의 기간후 변이 바이러스가 나타났다는 점에서 상기 환자 #2와 유사한 결과를 나타냈다. 이 환자들의 혈청은 PE1-1에 대채 활성 상태로 유지되었다. 서열 분석 결과 상기 환자들의 혈청내의 변이주들과 야생형 바이러스 간에 하나의 뉴클레오티드 차이가 존재함을 나타냈다. 각 환자내에서 2가지 변이주가 검출되었다. 이를 면역 분석 및 서열 분석한 결과, 각 환자내에서의 변이주들이 상이하며, 또한 환자 #2의 변이주와는 다른 것으로 나타났다.

환자 #3은 39세의 백인 남성으로 16년의 만성 B 형 간염의 병력에 따른 말기 간질환을 갖고 있다. 환자 #3에게 투여한 3회의 PE1-1 수술전 투여는 이 환자의 HBsAg 역가를 현저히 감소시켰다. 이식 후, 2일 및 3일째에 PE1-1 20mg을 투여했고, 이식 후 2일째에 HBsAg 음성인 것으로 나타났다. 그후, 2개월 동안 환자 #3에게 평균 1 내지 7일 마다 10mg의 PE1-1을 투여했다. 그 후, 14일 내지 43일 마다 7.5mg 또는 10mg의 PE1-1를 투여했다. 1989년 2월에 수행한 간 생검의 조직 병리학적 평가 결과는 HBsAg 및 HBcAg 둘다에 대해 음성이었다. 환자 #3은 이식 후 582일째에도 HBsAg 음성을 유지했다. 또한, PE1-1의 투여 이외에도 1989년 7월, 8월 및 9월에 리콤비박스를 연속 3회 매월 주사했다.

환자 #4는 40세의 아라비아 여성으로 10년 병력의 만성 활성 B형 간염에 따른 말기 간질환을 갖고 있었다. 환자 #4에게 투여한 PE1-1의 3회의 수술전 투여는 이 환자의 HBsAg 양을 크게 감소시켰다. 이식수술 후 1일 및 2일째에 환자 #4에게 PE1-1 20mg을 투여했고 수술후 6일째에 HBsAg 음성인 것으로 밝혀졌다. 그 후, 2개월 동안 평균 3 내지 8일 마다 10mg의 PE1-1을 투여했다. 그 후 5 내지 26일 마다 10mg의 PE1-1을 투여했다. 이식한지 약 1년후, 상기 환자에게서 간 동맥 혈전증이 나타났으나, HBsAg 음성을 유지했고 재이식 수술을 받았다. 3일 후, 허혈로 인해 3차 이식을 실시했다. 20일 후 감염으로 인해 4차 이식을 실시했다. 환자는 4차 이식후 18일째(초기 이식후 404일)에 간 손상 및 세균패혈증으로 인해 사망했다. 1차 이식된 간으로부터의 간 생검의 조직 병리학적 평가 결과 HBsAg 음성인 것으로 나타났다.

환자 #5는 38세의 백인 남성으로 만성 활성 B형 간염에 따른 말기 간질환을 갖고 있었다. 이 환자에게 PE1-1을 수술전에 투여한 결과 환자의 순환성 HBsAg 양이 현저하게 감소되었다. 이식 후 2일 및 3일째에 20mg의 PE1-1을 환자 #5에게 투여했고 이식후 3일째에 HBsAg 음성인 것으로 밝혀졌다. 이식 후 처음 2개월 동안은 평균 3 내지 7일 마다 10mg의 PE1-1을 투여했다. 그후, 9 내지 26일마다 10mg의 PE1-1을 투여했다. 이 환자의 항원 양이 이식전의 항원 양에 비해 현저하게 감소되었음에도 불구하고, 이식 후 252일째에 HBsAg 양성인 것으로 나타났다. 1990년 1월에 실시한 간 생검의 조직 병리학적 평가는 HBsAg 및 HBcAg에 대해 양성이었다.

환자 #6은 28세의 백인 남성으로 만성 활성 B형 간염 및 알콜 남용에 따른 말기 간 질환을 갖고 있었다. 이 환자는 수혈을 통해 처음 감염되었다. 이식 전, 상기 환자는 HBsAg 및 HBeAg 둘다에 대해 양성이었다. PE1-1를 수술 전 투여한 결과 환자의 HBsAg 역가의 정도가 감소되었다. 환자 #6에게 이식 후 1일 및 2일째에 PE1-1 20mg을 투여했고, 이식 후 1일째에 HBsAg 음성인 것으로 나타났다. 그후 2개월 동안 환자 #6에게 평균 3 내지 14일 마다 10mg의 PE1-1을 투여했다. 이어서 외래 환자 기준으로 7 내지 63일 마다 10mg의 PE1-1을 투여했다. HBsAg 양성 반응은 이식 후 251일째에 처음 나타났고, PE1-1의 투여와 투여 사이의 기간중 가장 오랜 기간(63일) 후에 나타났다. 현재 환자 #6은 HBsAg에 대해 양성을 나타내지만, 그 역가는 이식전 양에 비해 훨씬 낮게 유지되고 있다.

환자 #7은 38세의 백인 여성으로 IV 약물 남용의 병력을 갖고 있다. 이 환자는 만성 활성 B형 간염에 따른 말기 간 질환을 갖고 있었다. 이식하기 전에 상기 환자는 HBsAg 및 HBeAg에 대해 양성이었다. PE1-1의 각각의 수술전 투여는 환자의 HBsAg 역가를 감소시켰다. 이식 후 처음 1개월간 환자 #7에게 평균 1 내지 7일 마다 10 내지 40mg의 PE1-1을 투여했고 이식 후 16일째에 HBsAg 음성인 것으로 나타났다. 이어서, 환자에게 15 내지 29일 마다 10mg의 PE1-1을 투여했다. 1989년 7월에 실시한 간 생검의 조직 병리학적 평가는 HBsAg 및 HBcAg에 대해 음성이었다. 환자 #7은 이식 후 464일째 HBsAg 음성을 유지했다.

[실시예 6]

[변이 바이러스와의 반응성]

실시예 5에 기술한 환자로부터 분리된 B형 간염 바이러스 변이주에 대한 단일클론 항체 PE1-1, ZM1-2 및 LO3-3의 반응성을 연구했다. 고체상에 흡착된 항체에 결합된 방사능 활성을 측정하므로써 방사능 면역 분석법을 수행했다. 0.02% NaN₃을 함유하는 인산염 완충 식염수중의 20 ㎍/㎖ 농도의 단일클론 항체용액을 U자형 바닥의 웰(팔콘 마이크로테스트 III 가요성 분석 평판)에서 18시간 이상 항온 배양했다. 웰에서 용액을 제거한 다음, 증류수로 웰을 3회 세정한다. 인산염 완충 식염수중의 2% 농도의 태내 송아지 혈청을 첨가하고 혈청 HBsAg 또는 대조군 및¹²⁵I-방사능 표지된 항체(1% 태내 송아지 혈청중의 약 4000cpm) 용액과 실온에서 하룻밤 항온 배양했다. 그 다음 웰을 증류수로 3회 세정했다. 각 웰을 여기시켜 계수했다. 그 결과를 하기 표 4에 제시한다.

[표 4]

* 간 이식 및 항-HBsAg 치료용 판일클론 항체 PE1-1로의 치료후 환자에서 얻은 대표적인 HBsAg-양성 혈청 샘플, 괄호안의 숫자는 이식 후의 경과 일수를 나타냄.

** LO3-3:LO3-3은 고체상 흡착된 인체 단일클론 항체 LO3-3와 방사능 표지된 인체 단일클론 항체 LO3-3 둘다로 구성된 방사능 면역 분석법을 나타냄.

PE1-1:ZM1-2는 고체상 흡착된 인체 단일클론 항체 PE1-1 및 방사능 표지된 인체 단일클론 항체 ZM1-2로 구성된 방사능 면역 분석법을 나타냄.

ZM1-2:ZM1-2는 고체상 흡착된 인체 단일클론 항체 ZM-2와 방사능 표지된 인체 단일클론 항체 ZM1-2 둘다로 구성된 방사능 면역 분석법을 나타냄.

대조군 HBsAg-양성 혈청은 항체 LO3-3, PE1-1 및 ZM1-2와 잘 반응했음.

[실시예 7]

[항체의 대량 생산]

세포를 가지고 항체 생산을 개시하기 위해, 하나 이상의 동결 세포 앰플을 액체 질소에서 꺼냈다. 대부분의 얼음이 용해될때까지 37℃의 수조에서 빠르게 가열 처리한 후, 수직형의 라미나 플로우 후드내에서 앰플을 개봉했다 앰플의 내용물을 철(III)염이 Fe⁺⁺⁺의 최종농도가 50μM이 되도록 첨가되어- 있는 둘베코 MEM/함(Ham) Fl2(1:1) (DMEM/F12) 1ml 부피와 혼합한다. 혼합후, 튜브를 동일배지로 약 1㎖까지 채우고, 원심분리하여 세포를 수거한다. 세포 펠릿을 20% 태내 송아지 혈청을 지닌 상술한 배지 5㎖ 내에 재현탁시킨 후, 6웰의 조직 배양 평판의 하나의 월내에 접종한다. 세포를 5% CO₂대기중의 37℃ 항온 배양기내에서 항온배양했다. 세포가 배양물에서 복원되어 증식하기 시작해서 약 10⁶/㎖의 세포농도가 되었을때, 세포와 배지를 80cm²의 표면적을 지닌 조직 배양 플라스크내로 옮기고 DMEM/F12 (혈청제외)을 사용하여 40㎖로 희석시킨다. 세포가 다시 10⁶/㎖의 농도에 도달하면 세포와 배지를 175cm²의 표면적을 지닌 조직 배양 플라스크내로 옮기고, 다시 DMEM/F12를 사용하여 100㎖의 용량으로 희석시킨다. 세포가 다시 적절한 농도에 도달했을 때, 세포와 배지를 850cm²표면적의 회전병으로 옮기고, 최종 부피가 500㎖이 되도록 희석시킨다. 이 회전 병이 최적의 세포 농도에 도달했을때 전술한 것과 동일한 배지를 사용하여 새 회전 병내로 1/3씩 분할한다. 이 회전 병들의 분할 과정은 베락스 시스템 (Verax System) 200 반응기에 접종하는데 필요한 수의 세포를 제공하기에 충분한 수의 병이 수득될때 까지 계속한다.

[베락스 시스템 200]

베락스 시스템 200 반응기는 교차-정렬된 타입 I 소 콜라겐으로 구성된 스테인레스 강철 중량의 미소구 (밀도 1.6g/㎖)에서 세포를 배양하는 밀폐된 세포 해양 시스템이다. 이 미소구들을 수직형의 투명한 유리관내에 장입하고, 이 관을 통해 배양 배지 (전술한 바와 같음)를 바닥부로 펌프 주입시킨다. 관으로의 유입구는 배지가 적절한 속도로 펌프 주입될 때 미소구가 유동화 베드 배열을 구성할 수 있도록 형성되어 있다. 작동중에, 새 배지는 일정 속도로 첨가되고 조정 배지는 글루코스 소비로 검사되는 바와 같이 세포성장에 의해 측정되는 속도로 제거된다. 온도는 37℃로 유지되고 , pH 는 7.1 로 유지되며 산소/질소비도 또한 조절된다.

1% 태내 송아지 혈청을 함유하는 배지중에 미소구를 장입한 후, 반응기를 세포 첨가없이 적어도 3일 동안 작동시켜 미소구 장입이 시스템을 오염시키지 않았음을 확인한다. 이 시기동안 반응기에 단백질이 없는 배지를 유입시켜 태내 송아지 혈청의 초기 투여량을 감소시킨다. 모든 시스템이 만족할만하게 작동한다면, 회전병으로부터의 세포를 반응기내에 접종한다.

[베락스 시스템 2000]

이 장치는 상기 시스템 200과 동일한 형태의 미소구를 사용하며 그 조절 및 조작도 상기 시스템 200과 거의 동일하다. 시스템 2000은 시스템 200과 비교해볼 때 약 15 배의 용량 증가를 나타낸다.

[총규모의 배양물로부터의 항체 수율의 검사]

조정 배지를, 수거 탱크가 빌때마다, ELISA-형의 분석법을 사용하여 상청액중의 인체 면역 글로불린 얀에 대해 검사한다. 그 결과를 단백질 A HPLC 법을 사용하여 확인한다.

[세포 배양 배지의 수거 및 수거 푸울의 생산]

조정 배지를 베락스 장치로부터 냉장된 수거 탱크내로 지속적으로 옮긴다. 이 배지는 후에 추가 처리를 위해 이동성 스테인레스 강 탱크내로 옮겨진다(베락스 시스템내의 질소압력을 사용).

[세포 배양 배지]

통상적으로 사용된 배지는 둘베코 MEM H2l 및 Ham′s Fl2(Mediatech) 1:1혼합물이다. 이 배지를 50리터의 최종 배지에 충분한 분말로서 구입한다. 2개의 용기에 함유된 각 배지 분말을 약 190 리터의 물을 함유하는 스테인레스 강 탱크에 첨가한다. 분말을 임펠러로 현탁시켜 모두 용해시킨다. 이탄산 나트륨을 제조자의 추천에 따라 첨가하고 배지의 pH를 7.4로 고정시킨다. 아셀렌산 나트륨을 17,3㎍/l의 최종 농도로 첨가하고 용량을 물로 200ℓ까지 채운다. 또한, Fe⁺⁺⁺의 최종 농도가 50μM이 되도록 질산 철(III)/구연산 나트륨의 형태로 철(III) 이온을 배지에 보충한다. 이 배지를 장착된 멸균 필터를 통해 베락스 시스템 S200의 배지 탱크에 즉시 첨가한다. 이 배지에는 단백질을 전혀 첨가하지 않는다. 또한, 어떤 종류의 항생제도 사용하지 않는다.

[단일클론 항체의 정제]

[최종 생성물의 수거 및 정제 방법의 설명]

혈청의 부재하에 하이브리도마 세포주의 세포 배양물에서 단일클론 항체가 생산된다. 이것은 최종 생성물로부터 세포 물질로부터의 성분들만을 제거할 필요가 있다는 것을 의미한다. 인체 단일클론 항체 그 자체가 면역원성인 것으로 생각되지 않으므로, 모든 강력한 면역원성 성분을 제거하는 것이 매우 중요해진다.

정제 과정의 목표는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 순도가 99.9% 이상인 최종 생성물을 수득하는 것이다. 이것은 친화성 크로마토그래피의 생물학적 폭이성에 따라 크게 좌우된다. 정제 과정의 각 단계(표 5 에 요약됨)는 보다 상세하게 기술되어 있다(상기 참조).

[표 5]

[세포 수거 및 조정 베지로부터 미립자 물질의 제거]

세포 대부분이 미소구에 보유될지라도 상당 수의 세포가 수거된 상청액중에도 존재한다. 세포 성분에 의한 배지의 심한 오염을 피하기 위해 상청액을 베락스 수거 탱크에서 분리해낸 후 즉시 이플루오르화 폴리비닐리덴 0.65μm 프로스탁필터(Millipore)를 통해 여과한다. 이런 종류의 필터 유닛은 여과기가 막힘이 없이 다량의 미립자 물질을 여과시키는 정접 유동 방식으로 작용한다. 여과된 배지를 냉장된 스테인레스 강 탱크에 수거한다.

[조정 배지의 농축]

조정 배지를 밀리포어사 제품인 공칭 37,000 달톤의 폴리설폰이 나선형으로 감겨진 막을 사용하여 농축시킨다. 농축 후, pH는 1M의 아세트산을 사용하여 7.0으로 조정한다. 이 물질을 사르토브란-pH 0.8/0.2μm (Saartorius) 필터 (0.8μm 성분은 폴리에스테르이고, 0.2μm 성분은 셀룰로스 아세테이트임)를 통해 멸균 여과한 뒤 4℃에서 보관한다. 이 물질을 미세여과(0.22μM 밀리포어)하고 폴리프로필렌 용기에 넣어둔다.

[단백질 A 크로마토그래피]

가장 강력한 정제 단계는 스타필로코커스 아우레우스 단백질 A에 대한 고친화성의 인체 IgGl 항체를 이용한다.

단백질 A는 아미드 결합에 의해 아가로스에 이미 공유 결합된 것을 구입한다. 이 겔을 컬럼에 충전시킨 후, 부착된 관과 내용물을 지닌 컬럼을 물중의 70% 에탄올로 24시간 동안 처리하므로써 멸균처리 한다. 그 다음 컬럼을 PBS(pH7.0)로 평형화시킨다.

단백질 A 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피 분리를 수행하는 것은 다음의 순차적인 단계를 포함한다:

A) 장입

농축 조정 배지를 펌프를 사용하여 컬럼상에 장입한다, 컬럼으로부터의 유출액을 수거하고 인체 면역글로불린 ELISA에 의해 항체의 존재를 검사한다. 컬럼은 측정 가능한 양의 항체-함유 유체가 컬럼을 통해 흐르는 정도로 장입되어 있다.

과잉 장입된 분획은 별도로 회수하여, 20mg/㎖ 이상의 항체를 함유하고 있다면 재순환시킨다.

B) 세정

결합되지 않은 물질을 제거하기 위해, 컬럼을 염화 나트륨이 0.5M의 최종 농도로 첨가된 인산염 완충화된 식염수(pH7)로 충분히 세정한다. 이 세정 단계 다음, 0.5M 염화 나트륨을 함유하는 0.02M 구연산 나트륨(pH5.6) 완충액을 사용하여 2차 세정 단계를 실시한다. 이 세정으로 소량의 인체 항체가 방출된다.

C) 용출

결합된 단일클론 항체는 0.5M 염화 나트륨을 함유하는 0.02M 구연산 나트륨(pH3.0)으로 구성된 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 용출된 물질은 일정부피의 1M Tris-HCl(pH8.0)로 지속적으로 희석하여 중성 부근의 조건으로 빠르게 복귀시킨다.

단백질 A 정제는 워터스 650 단백질 정제 시스템을 사용하여 폐쇄계중에서 수행한다.

[단백질 A 컬럼 용출물의 농축]

다음의 정제 단계를 더욱 효과적이고 편리하게 하기 위해 단백질 A 컬럼으로부터의 용출물을 적어도 5mg/㎖ 항체로 농축시킨다. 이 농축물을 0.2μm 필터를 통해 멸균 여과하고 멸균 농축물을 4℃에 보관하여 충분한 물질을 다음 정제 단계를 위해 모아둔다.

[높은 분리력의 세파크릴 S-300상에서의 겔 크로마토그래피에 의한 크기 분리]

약 10 리터의 베드 용량으로 파마시아 BP113/120 컬럼내에 충전된 세파크릴 S300 고해상도(파마시아)겔 상에서 항체 제조물을 전개시킨다. 이 컬럼은 젖산화된 링거 관개 USP(Travenol Laboratories)에서 충전된다. 워터스 650 단백질 정제 시스템에 의해 컬럼의 용출을 검사한다.

이 단계의 목적은 주로 추가 정제가 아닌 완충액의 교환이다. 단백질 A 컬럼의 용출 후, 항체는 구연산 나트륨, 염화나트륨 및 Tris-HCl로 구성된 복합 고장성 완충액내에 존재한다. 이 완충액 혼합물은 정맥내 주사용의 부형제로서 직접 사용될 수 없다. 이 단계후의 완충액이 정맥내 주사 및 장 기간의 냉장 보관에 적합하다.

[이온 교환 컬럼 통과에 의한 숙주 세포 DNA의 분리]

농축된 상청액 중에 존재하는 다량의 DNA를 제거하는 단백질 A 크로마토그래피, 및 단일클론 항체 생성물보다 상당히 크거나, 또는 상당히 적은 DNA 분자를 제거하는 세파크릴 5-300HR 후에도, 항체 제조물중에는 적지만 검출 가능한 DNA가 존재한다. 본 발명자들은 이 오염물을 제거하기 위해 강력한 음이온 교환기인 Q 세파로스(Pharmacia Inc.) 상에서의 이온 교환 단계를 선택했다. 젖산염화된 링거 용액의 pH에서, 항체 단백질은 양성 전하를 가지며, 음이온 교환기에 의해 반발된다. 그러나, 상기 pH에서 음전하를 띠는 핵산은 상기 컬럼에 결합할 것이다.

컬럼을 제조자의 제안에 따라 충전시켰다. 겔이 함유되어 있는 20% 에탄올 용액을 버린 후, 100㎖의 겔을 200㎖의 젖산염화된 링거용액에 현탁시킨다. 이 슬러리를 파마시아 K50/30 컬럼에 쏟아붓고, 겔이 일정 부피로 충전되었을때, 1 컬럼 부피의 0.5N 수산화 나트륨으로 세정한 다음, 3 컬럼 부피의 둘베코 PBS, 그 다음 5 컬럼 부피의 젖산염화된 링거 용액으로 세정한다. 이 컬럼을 사용하기 바로 전에 추가로 5 컬럼 부피의 젖산염화된 링거 용액으로 세정한다. 그 다음 샘플을 상기 컬럼을 통해 통과시키고 유출액을 멸균 용기내에 수집한다.

[실시예 8]

[PE-1, ZM1-1, ZM1-2 및 MD3-4의 분자적 분석]

항체 PE1-1, ZM1-1, ZM1-2 및 MD3-4의 중쇄 가변부(V_H)를 분리하여 서열 결정한다. 총 RNA를 본원에 참고문헌으로 포함되는 문헌[Sanz, et at. 1989 J. Immunol. 142 : 883]에 기술된 과정을 사용하여 각 세포주의 10⁷하이브리도마 세포로부터 추출했다. 효소로서 AMV-역전사효소 및 프라이머로서 올리고-dT를 사용하여 단일 가닥의 DNA 를 합성한다.³²P-dCTP의 병입량을 측정하여 합성된 ss-cDNA의 양을 평가한다.

폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 제조자(Pertain Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut)의 추천에 따라 수행한다. DNA 1㎍을 각각의 프라이머 100pmo1과 Taq DNA 폴리머라제 5 유니트를 함유한 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각의 200μm 용액에 첨가한다. PCR 순환은 다음과 같다 : 98℃에서 3분 동안 변성시키고, 55℃에서 2분 동안 어닐링시킨 후, 72℃에서 3분 동안 신장시키며, DNA 열 순환기(Perkin Elmer Cetus)로 조절된다.

증폭된 DNA 를 1.0% 저융점 아가로스 겔 상에서 크기 선별하고, 블루스크립트 파지미드 벡터의 EcoRV 부위에 결찰시킨 뒤, CaC1₂감응 BSJ72 세균내로 형질전환시킨다. 문헌 [Sanz, et al., (상기문헌참조)]에 기술된 바와 같이 M13K07로 초과 감염시킨 후 각각의 양성 클론으로부터 서열결정용의 단일가닥 DNA 를 분리했다. 서열 결정은 변형된 T7 DNA 폴리머라제(Seguenase)가 문헌[Tabor, et al. 1987 PNAS (USA) 84 : 4767]에 기술된 바와 같이 사용된 것을 제외하고는 문헌[Sanger, et al. 1980 J. Mol. Biol. 143 : 161]에 기술된 바와 같이 디데옥시 사슬 종지 방법을 통해 수행한다. 그 결과를 표 8-1, 8-2, 8-3 및 8-4 에 제시한다.

[표 8-1]

PE1-1의 V_H영역의 DNA 서열을 하기 제시한다.

리더, V_HIII, D, 및 J_H4 영역을 점선으로 나타낸다; 상보성-결정 영역 CDR1 및 CDR2는 별표로 나타낸다. 아미노산은 DNA 밑에 단일 문자의 약어로 나타낸다.

[표 8-2]

ZM1-1의 V_H영역의 DNA 서열을 하기 제시한다.

리더, V_HIII, D 및 J_H4 영역들은 점선으로 나타내고; 상보성-결정 영역 CDR1 및 CDR2는 별표로 나타낸다. 아미노산은 DNA 밑에 단일문자의 약어로서 나타낸다.

[표 8-3]

ZM1-2의 V_H영역의 DNA 서열을 하기 제시한다.

리더, V_HIV, D 및 J_H4 영역들은 점선으로 나타내고; 상보성-결정 영역 CDR1 및 CDR2는 별표로 나타낸다. 아미노산은 DNA 밑에 단일문자의 약어로서 나타낸다.

[표 8-4]

MD3-4의 V_H영역의 DNA 서열을 하기 제시한다.

리더, V_HV, D 및 J_H3 영역들은 점선으로 나타내고; 상보성-결정 영역 CDR1 및 CDR2는 별표로 나타낸다. 아미노산은 DNA 밑에 단일문자의 약어로서 나타낸다.

[실시예 9]

실시예 8의 절차에 따라, 항체 PE1-1, ZM1-1, ZM1-2, 및 MD3-4의 경쇄 가변부(V_L)를 분리하여 서열결정 한다. 그 결과를 표 9-1, 9-2, 9-3 및 9-4에 제시한다.

[표 9-1]

PE1-1의 V_L영역의 DNA 서열을 하기 제시한다.

VV 및 J3 영역들은 점선으로 나타내고; 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3는 별표로 나타낸다. 아미노산은 DNA 밑에 단일문자의 약어로서 나타낸다.

[표 9-2]

ZM1-1의 V_L영역의 DNA 서열을 하기 제시한다.

리더, VII 및 J5 영역들은 점선으로 나타내고; 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 별표로 나타낸다 아미노산은 DNA 밑에 단일문자의 약어로서 나타낸다.

[표 9-3]

ZM1-2의 V_L영역의 DNA 서열을 하기 제시한다.

리더, VI 및 J 영역들은 점선으로 나타내고; 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 별표로 나타낸다. 아미노산은 DNA 밑에 단일문자의 약어로서 나타낸다.

[표 9-4]

MD3-4의 V_L영역의 DNA 서열을 하기 제시한다.

VIII 및 J3 영역들은 점선으로 나타내고; 상보성-결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3은 별표로 나타낸다. 아미노산은 DNA 밑에 단일문자의 약어로서 나타낸다.

Claims (15)

1. 비(B)형 간염 바이러스를 중화시키며, 표 8-1에 기재된 아미노산 서열의 성숙 영역과 동일한 아미노산 서열을 갖는 V_H영역을 가지며 표 9-1에 기재된 아미노산 서열의 성숙 영역과 동일한 아미노산 서열을 갖는 V_L영역을 갖는 단일클론 항체 또는 그 Fab 단편.
2. 제1항에 있어서, IgG₁이며 람다(λ) 경쇄를 포함하는 항체.
3. B형 간염 바이러스를 중화시키며, 표 8-1에 기재된 아미노산 서열의 성숙 영역과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 V_H영역을 가지며 표 9-1에 기재된 아미노산 서열의 성숙 영역과 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 V_L영역을 가지며, B형 간염 표면 항원에 제1항의 항체가 결합하는 것을 억제하는 단일클론 항체.
4. 제3항에 있어서, Fab 단편인 항체.
5. 제3항의 항체 또는 그 Fab 단편을 생산하는 인체 세포에 융합된 이종의 무한증식성 세포를 포함하는 하이브리도마 세포주.
6. 제5항에 있어서, 이종의 무한증식성 세포가 무한 증식성 모세포와 인체 파트너 세포가 융합된 하이드리도마를 포함하는 세포주.
7. 제6항에 있어서, 상기 무한증식성 모세포가 쥐의 골수종 세포 또는 하이브리도마인 세포주.
8. 약제 내성인 이종의 무한증식성 세포주를 제조하고, 그 결과 얻어진 약제 내성의 무한증식성 세포를 인체 항체-생산 세포에 융합시킨 다음, 목적하는 하이브리드를 선별하는 것을 포함하는 제12항의 하이브리도마 세포주를 제조하는 방법.
9. 제5항의 세포주에 의해 생산된 항체.
10. 제6항의 세포주에 의해 생산된 항체.
11. 제7항의 세포주에 의해 생산된 항체.
12. 제5항에 있어서, 제1항의 항체를 생산하는 세포주.
13. a) 표 8-1의 가닥 및 b) 표 9-1의 가닥으로부터 선택된 DNA 가닥에 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA 서열을, 선택적으로 벡터의 성분으로서, 함유하는 분리된 DNA.
14. 제13항의 DNA를 포함하는 DNA 를 지닌 세포주.
15. 제3항의 항체 또는 그 Fab 단편을 포함하는 진단 분석용 조성물.