ES2896275T3 - Anticuerpos del VHB anti-Pre-S1 - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al dominio Pre-S1 del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (VHB), y comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; b) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; c) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 30 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; d) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; e) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; f) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; g) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 40 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; h) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 42 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; i) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 44 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; j) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 46 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; k) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24; l) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 50; m) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 52; n) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 54; o) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 56; o p) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la 0 SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 58.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos del VHB anti-Pre-SI

Introducción

Más de un tercio de la población mundial ha sido infectada por el virus de la hepatitis B (VHB) y actualmente 240 millones de personas están infectadas de forma crónica. La infección por el VHB y las enfermedades relacionadas provocan alrededor de un millón de muertes al año.

El antígeno de superficie del VHB se compone de proteínas grandes (L, del inglés Large), medianas (M) y pequeñas (S, del inglés Small). Las proteínas L y M tienen dominios adicionales en su N terminal en comparación con la proteína S que solo tiene el dominio S. L contiene los dominios Pre-S1, Pre-S2 y S; M contiene dominios Pre-S2 y S; la proteína S contiene solo el dominio S. El dominio pre-S1 en L es la molécula diana de receptor(es) del VHB expresados en la superficie de las células hepáticas humanas, y se han documentado anticuerpos contra el dominio pre-S1 del VHB, p. ej. Watashi et al, Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 2892-2905, ref. 22-27. La bibliografía relevante incluye descripciones del receptor del VHB en el documento WO2013159243A1, un anticuerpo humanizado de hibridoma de ratón, KR127 en el documento US 7115723 y péptidos pre-S1 en el documento US 7892754. Maeng C-Y. et al. (2000) Virology 270(1): 9-16 describe epítopos en pre-S1 del VHB que inducen anticuerpos que neutralizan el VHB.

Compendio de la invención

La invención se define según las reivindicaciones adjuntas. También se describen métodos y composiciones para la activación inmunitaria inhibiendo el VHB y/o el VHD. En un aspecto, la descripción proporciona un dominio de unión a antígeno de anticuerpo que se une específicamente a Pre-S1 del VHB y comprende la región determinante de complementariedad (CDR) 1, CDR2 y CDR3, en una combinación seleccionada de (a)-(r) como sigue, en donde el anticuerpo (Ab), la cadena pesada (HC) o la cadena ligera (LC) y el sistema de nomenclatura de CDR (Kabat, IMGT o compuesto) del que se obtienen las combinaciones de CDR se muestran en la primera columna, y los restos en negrita son el sistema Kabat y los restos subrayados son el sistema IMGT:

HCDR de anticuerpos específicos únicos de Pre-S1 del VHB

HCDR de anticuerpos que provienen de bibliotecas barajadas de cadenas VH de 2H5

HCDR de anticuerpos que provienen de bibliotecas barajadas de cadenas VL de A14

También se describe un dominio de unión a antígeno de anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende una combinación de CDR1, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende una combinación de CDR1, CDR2 y CDR3, o que comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y/o una región variable de cadena ligera (Vl), seleccionada de: m36, 71, 76, T47, m1Q, 2H5, m150; y 4, 31, 32, 69, A14, A21, B103, B129, B139, B172; y 8, 20, 20-m1,20-m2, 20-m3.

El dominio de unión al antígeno del anticuerpo se une específicamente a los aa11 -28 o aa19-25 de pre-S1.

También se describen anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, y F(ab) o F(ab)2 que comprenden un dominio de unión sujeto.

También se describen polinucleótidos novedosos como ADNc y vectores de expresión, que codifican un dominio de unión al antígeno sujeto, y células que comprenden tales polinucleótidos, y animales no humanos que comprenden tales células. Los polinucleótidos pueden unirse operativamente a una secuencia reguladora de la transcripción heteróloga para la expresión, y pueden incorporarse en dichos vectores, células, etc.

También se describen métodos para usar los dominios en cuestión para tratar la infección por VHB o VHD, o para inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), que comprende administrar el dominio a una persona que se determina que tiene una infección por VHB o VHD, haber estado expuesto al VHB o al VHD, tener un alto riesgo de exposición o infección a VHB o VHD, necesitar antagonismo del dominio Pre-S1, o necesitarlo de otro modo. También se describe el uso de las presentes composiciones para la fabricación de un medicamento para la infección por VHB o VHD, opcionalmente junto con un inhibidor de la replicación de virus.

Breve descripción del dibujo

Figura 1. Neutralización del VHB mediante 10 anticuerpos de selecciones de bibliotecas barajadas de cadenas VH de 2H5.

Descripción detallada

A menos que el contexto indique lo contrario, el término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa) y fragmentos de anticuerpos siempre que reconozcan Pre-S1 del VHB/VHD o inhiban de otro modo el VHB/VHD. Una molécula de anticuerpo suele ser monoespecífica, pero también puede describirse como idioespecífica, heteroespecífica o poliespecífica. Las moléculas de anticuerpos se unen por medio de sitios de unión específicos a los determinantes antigénicos específicos o epítopos en los antígenos. Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una parte de un anticuerpo de longitud completa, en general la región de unión a antígeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab').sub.2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Las estructuras de anticuerpos naturales y manipuladas son bien conocidas en la técnica, p. ej., Strohl et al., Therapeutic antibody engineering: Current and future advances driving the strongest growth area in the pharmaceutical industry, Woodhead Publishing Series en Biomedicine N.° 11, octubre de 2012; Holliger et al. Nature Biotechnol 23, 1126 - 1136 (2005); Chames et al. Br J Pharmacol. mayo de 2009; 157(2): 220-233.

Los anticuerpos monoclonales (MAb) pueden obtenerse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kohler et al (1975); US4.376.110; Ausubel et al (1987-1999); Harlow et al (1988); y Colligan et al (1993). Los mAb de la invención pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluida IgG, IgM, IgE, IgA y cualquier subclase de las mismas. Se puede cultivar un hibridoma que produzca un mAb in vitro o in vivo. Se pueden obtener altos títulos de mAb en producción in vivo en la que las células de los hibridomas individuales se inyectan por vía intraperitoneal en ratones, tales como ratones Balb/c con cebado prístino para producir líquido ascítico que contiene altas concentraciones de los mAb deseados. Los MAb de isotipo IgM o IgG pueden purificarse a partir de fluidos ascíticos o de sobrenadantes de cultivo, utilizando métodos de cromatografía en columna bien conocidos por los expertos en la técnica.

Un "polinucleótido aislado" se refiere a un segmento o fragmento polinucleotídico que se ha separado de las secuencias que lo flanquean en un estado natural, p. ej., un fragmento de ADN que se ha eliminado de las secuencias que normalmente son adyacentes al fragmento, p. ej., las secuencias adyacentes al fragmento en un genoma en el que se da en la naturaleza. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora a un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (p. ej., como un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por PCR o digestión con enzimas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante, que es parte de un gen híbrido que codifica una secuencia polipeptídica adicional.

Una "construcción" significa cualquier molécula de polinucleótido recombinante como un plásmido, cósmido, virus, molécula de polinucleótido de replicación autónoma, fago, o molécula de polinucleótido de ADN o ARN lineal o circular monocatenario o bicatenario, que proviene de cualquier fuente, capaz de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de polinucleótido en la que una o más moléculas de polinucleótido se han unido de una manera funcionalmente operativa, es decir, unido operativamente. Una construcción recombinante comprenderá típicamente los polinucleótidos de la invención unidos operativamente a secuencias reguladoras de iniciación de la transcripción que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula hospedadora deseada. Se pueden emplear promotores tanto heterólogos como no heterólogos (es decir, endógenos) para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos de la invención.

Un "vector" se refiere a cualquier construcción polinucleotídica recombinante que pueda usarse con el propósito de transformación, es decir, la introducción de ADN heterólogo en una célula hospedadora. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ADN de doble hebra en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (p. ej. vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del hospedador. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión".

Un "vector de expresión" como se emplea en esta memoria se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de replicarse y expresar un gen de interés cuando se transforma, se transfecta o se transduce en una célula hospedadora. Los vectores de expresión comprenden uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si se desea, proporcionar amplificación dentro del hospedador. El vector de expresión comprende además un promotor para promover la expresión del polipéptido dentro de las células. Los vectores de expresión adecuados pueden ser obtenidos de plásmidos, por ejemplo, de pBR322 o varios plásmidos pUC, que están disponibles comercialmente. Otros vectores de expresión pueden obtenerse de bacteriófagos, vectores de expresión de fagémidos o cósmidos.

Ejemplos

Los anticuerpos monoclonales humanos bloquean la infección vírica del virus de la hepatitis B y D

En el presente documento, los presentes inventores desvelan anticuerpos monoclonales humanos que pueden bloquear las infecciones víricas del VHD y el VHB. Estos anticuerpos se identificaron a partir de una gran biblioteca de anticuerpos de presentación en fagos, que se estableció utilizando células mononucleares de sangre periférica de 93 donantes sanos. Mediante la selección y cribado de la biblioteca de anticuerpos utilizando el dominio pre-S1 de la proteína de la envoltura del VHB como diana, se identificó un panel de anticuerpos monoclonales humanos con actividades neutralizantes frente a infecciones por VHB y VHD. Entre ellos, 2H5, mostró las mejores actividades neutralizantes contra las infecciones por VHB y VHD. Se resolvió la estructura cocristalina de 2H5 en complejo con su diana (8 aminoácidos del dominio Pre-S1). Al optimizar el 2H5 mediante el enfoque de mezcla de cadenas, los presentes inventores desarrollaron anticuerpos neutralizantes aún más potentes. Estos anticuerpos reconocen un epítopo similar al 2H5 y el epítopo está altamente conservado entre los diferentes genotipos del VHB. Un anticuerpo ilustrativo, A14 se probó en ratones que llevaban NTCP humanizado y proporcionó una protección completa de los ratones contra la infección por VHD, y los estudios en animales confirmaron la protección contra la infección por VHB.

Diana de antígeno: péptidos pre-S1. Como antígeno para la selección, los presentes inventores utilizaron dos péptidos que provienen del dominio pre-S1 del VHB. Fueron sintetizados por Scilight-peptide (Beijing, China) con una pureza superior al 95%. NC36b: un péptido que comprende los restos 4-38 del dominio pre-S1 de la proteína L del VHB con una modificación de biotina en su extremo C-terminal. m47b: un lipopéptido miristoilado que comprende los aminoácidos 2-48 del dominio pre-S1 con una modificación de biotina en el extremo C-terminal y una modificación de miristoilación en el extremo N-terminal.

Se generaron anticuerpos monoclonales humanos contra péptidos pre-S1 basados en tecnología de anticuerpos de presentación en fagos con modificaciones [1,2].

Biblioteca de anticuerpos de presentación en fagos. Se construyó una biblioteca de anticuerpos scFv (fragmento variable de cadena única) no inmunes humanos a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de 93 donantes sanos. La biblioteca tiene un tamaño total de 1,1x1010 miembros.

Selección y cribado de la biblioteca de anticuerpos en fagos. Las partículas de fago que expresan scFv en su superficie (fago-scFv) se prepararon a partir de la biblioteca y se usaron para la selección de scFv contra NC36b y m47b sintetizados. Los péptidos se capturaron en M-280 Dynabeads® magnéticos conjugados con estreptavidina (Life Technologies) y luego se incubaron con 5x1012 partículas de fago preparadas a partir de la biblioteca, respectivamente. Para cada péptido, se realizaron dos rondas de selección. Para cada ronda de selección, para obtener anticuerpos de alta afinidad, se optimizó la cantidad de péptidos capturados en las perlas magnéticas y se aplicaron extensas etapas de lavado. Además, para recuperar aglutinantes de alta afinidad de las perlas magnéticas y aumentar la diversidad de fagos-scFv recuperados, se utilizaron dos métodos de elución que incluían la elución por competición de péptidos y una solución de trietanolamina básica convencional. Posteriormente, se recogieron y rescataron un total de aproximadamente 2000 clones individuales para producir fagos-scFv en el sobrenadante del cultivo bacteriano, y se examinaron para determinar la unión específica a m47b y/o NC36b mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los clones que se unieron a m47b y/o NC36b con valores de densidad óptica a 450 nm >1,0 se puntuaron como positivos, mientras que los clones negativos dieron valores de <0,1. Para clones de unión específicos de m47b y/o NC36b, se secuenciaron los genes de las regiones variables de la cadena pesada (VH) y ligera (VL) y se alinearon sus correspondientes secuencias de aminoácidos para eliminar clones repetidos e identificar anticuerpos con secuencia diferente para su posterior caracterización. Se identificaron un total de 109 clones con secuencia única.

Caracterización adicional de los anticuerpos con secuencias de anticuerpos únicas para identificar el mejor candidato de anticuerpo. Los clones de anticuerpos con secuencia única se produjeron como partículas de fago-scFv purificadas 0 se convirtieron en minicuerpos scFv-Fc o IgG1 humanas de longitud completa, y luego se analizaron sus actividades de unión mediante ELISA y las actividades de neutralización de VHB y VHD en cultivos celulares. Mediante estos ensayos, los anticuerpos se clasificaron basándose en su actividad de unión y actividad de neutralización. Se eligió el anticuerpo superior con la actividad de neutralización más alta para un desarrollo posterior.

Preparación de fagos-scFv purificados para ELISA o ensayo de neutralización. Los fagos - scFv en el sobrenadante de 10-30 ml de cultivo bacteriano se precipitaron mediante PEG/NaCl y luego se cuantificaron mediante un espectrómetro. Se evaluaron las actividades de diferentes fagos-scFv para la unión de antígenos o neutralización de la infección vírica basándose en la respuesta a la dosis de fagos-Ab diluidos en serie que se normalizó a la misma concentración.

Preparación de minicuerpos scFv-Fc. El gen que codifica scFv del vector que expresa fago-scFv se subclonó en un vector de expresión que contenía el fragmento Fc de IgG1 humana en el extremo C-terminal del scFv. Para producir scFv-Fc, se transfectaron transitoriamente células 293F (Life Technologies) o 293T (ATCC) con el plásmido de expresión scFv-Fc, 72 horas después de la transfección, se recogió el sobrenadante del cultivo celular y se purificó scFv-Fc mediante cromatografía de afinidad de proteína A (proteína A Sepharose CL-4B, GE Healthcare).

Preparación de anticuerpo IgG1 de longitud completa. La secuencia codificante de VH y VL de un scFv se subclonó por separado en el vector de expresión de la cadena pesada (HC) del anticuerpo y el vector de expresión de la cadena ligera (LC). Para producir anticuerpos IgG1, las células 293F o 293T se cotransfectaron transitoriamente con los dos plásmidos de expresión (plásmidos HC+LC) en una proporción de 1:1. 72 horas después de la transfección, el sobrenadante del cultivo celular se recogió para la purificación de IgG1 mediante cromatografía de afinidad de proteína A.

Ensayo ELISA. Se recubrieron 5 Mg/ml de estreptavidina (Sigma) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una placa de 96 pocillos con fondo en U (Nunc, MaxiSorp™), 100mI por pocillo, a 4 °C durante la noche o 37 °C durante 1 hora. A continuación, se capturaron 2 Mg/ml (370 nM) de péptidos m47b o NC36b a 100 |jl por pocillo en las placas mediante incubación a 30 °C durante 0,5-1 hora. Para ELISA basado en fagos-scFv, se añadieron fagos-scFv diluidos en serie en PBS que contenía leche desnatada al 2% a cada pocillo a 100 j l por pocillo. Se detectaron scFv de fagos de unión específica mediante la adición de anticuerpo anti-M13 de ratón conjugado con HRP (GE Healthcare) y se incubaron durante 30 minutos a 30 °C. Entre cada etapa de incubación, la placa de ELISA se lavó 6 veces con solución de PBST (0,05% de Tween20 que contenía PBS) a 200 j l por pocillo. Tras la incubación de anticuerpos conjugados con HRP, se desarrolló la señal de ELISA incubando con sustrato TMB (Sigma) durante 5-10 minutos a 30 °C y luego se detuvo la reacción con H2SO4 2 M a 25 j l por pocillo. La absorbancia a 450 nm se leyó mediante un lector de microplacas (Bio-Rad). Para ELISA basado en scFv-Fc o IgG1, el método fue básicamente el mismo que el descrito anteriormente para fagos-scFv excepto que los anticuerpos unidos fueron detectados por anticuerpo anti-IgG Fc humano de ratón conjugado con HRP (Sigma).

Preparación de virus VHB y VHD. El VHB y el VHD se produjeron como se describió anteriormente [3]. VHD. En resumen, un plásmido que contiene un trímero de cabeza a cola de 1,0 x ADNc de VHD de un virus de genotipo I (número de registro de Genebank: AF425644.1) bajo el control de un promotor de CMV se construyó con ADNc de nueva aparición del VHD sintetizado para la producción de RNP de VHD. Un plásmido pUC18 que contiene el nucleótido 2431-1990 del VHB (genotipo D, número de registro de Genebank: U95551.1), se utilizó para expresar proteínas de la envoltura del VHB bajo el control del promotor del VHB endógeno. Los viriones del VHD se produjeron por transfección de los plásmidos en Huh-7 como describió anteriormente Sureau. et al [4]. El sobrenadante del cultivo de células transfectadas se recogió y se usó directamente para el ensayo de neutralización del VHD. VHB. Los virus de los genotipos B, C y D del VHB se produjeron por transfección de células Huh-7 con un plásmido que contenía 1,05 copias del genoma del VHB bajo el control de un promotor de CMV. Los virus del VHB de genotipo B o C también procedían del plasma de pacientes con VHB.

Ensayos de neutralización de VHB y VHD. Los ensayos de neutralización se realizaron como se describió anteriormente [3, 5] con modificaciones menores. En estos ensayos se usaron células HepG2-hNTCP (una línea celular HepG2 que expresa de manera estable el receptor hNTCP de VHB y VHD (polipéptido cotransportador de taurocolato de sodio humano)). Se cultivaron células HepG2-hNTCP en medio PMM [3] durante 12-24 horas en una placa de 48 pocillos antes de la infección vírica. Aproximadamente 500 multiplicidades de equivalentes de genoma (mge) de VHD o 200 mge de VHB mezclados con diferentes formas de anticuerpos: fago-scFv, scFv-Fc o IgG1 se inocularon con células HepG2-hNTCP en presencia de PEG8000 al 5% y se incubaron durante 16 horas. Después, las células se lavaron con medio tres veces y se mantuvieron en PMM. El medio de cultivo celular se cambió por medio PMM reciente cada 2-3 días. Para la infección por VHD, a los 7 días después de la infección (dpi), las células infectadas con VHD se fijaron con metanol al 100% a temperatura ambiente durante 10 min, el antígeno delta intracelular se tiñó con 5 Mg/ml de 4G5 conjugado con FITC (un anticuerpo monoclonal antígeno delta anti-VHD de ratón) y los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes se recogieron mediante un microscopio de fluorescencia (Nikon). La actividad de neutralización contra el VHD se determinó basándose en la cantidad y fuerza del antígeno Delta teñido. Para la infección por VHB, a los 3, 5 y 7 dpi, el sobrenadante del cultivo se recogió y se analizó para detectar el antígeno vírico HBsAg y/o HBeAg secretado por el VHB con kits de ELISA comerciales (Wantai, Beijing, China). Los niveles de HBeAg y/o HBsAg se utilizaron para evaluar la actividad de neutralización del VHB de los anticuerpos.

A través de los ensayos de neutralización del VHB y ELISA descritos anteriormente, los presentes inventores identificaron algunos de los principales anticuerpos, que mostraron unión específica con NC36b así como con m47b y 47b (un péptido similar a m47b pero sin miristoilación y mostró actividades de neutralización en el VHB.

Entre estos principales anticuerpos, m36, 2H5 y m1Q fueron los tres primeros anticuerpos que mostraron la mejor actividad de neutralización del VHB (genotipo D), m36 se excluyó de las pruebas adicionales ya que mostró una expresión reducida cuando se convirtió en IgG1 de longitud completa. 2H5 y m1Q se compararon adicionalmente para la actividad de neutralización del VHD, 2H5 mostró una mejor actividad para neutralizar la infección por VHD. Basado en la alta actividad de unión con el péptido y la potente actividad neutralizante contra el VHB y el VHD, se eligió 2H5 para un mayor desarrollo. Además, 2H5 mostró una mayor actividad de neutralización de VHB y VHD que un anticuerpo KR127 del péptido pre-S1 publicado previamente [6-8]. En el ensayo de infección por VHB, 2H5-IgG1 es 11 veces más potente que KR127 como lo indica la CI50 (la concentración de anticuerpo que da como resultado una inhibición del 50% de la infección por VHB); el 2H5 también mostró un mayor efecto inhibidor sobre el ensayo de infección por VHD.

Mapeo del epítopo de unión del anticuerpo 2H5. Para mapear el epítopo de 2H5 en la región pre-S1, los presentes inventores sintetizaron péptidos cortos que cubren diferentes regiones del dominio pre-S1 y probaron su capacidad para competir por la unión de 2H5 a m47b mediante un ensayo ELISA de competición. El péptido más corto que puede competir por la unión es el péptido LN16 (correspondiente al aminoácido NT (aa) 11-28 del dominio pre-S1 de la proteína L del VHB (genotipo D), lo que indica que el epítopo de unión de 2H5 se encuentra dentro de esta región. Los péptidos LD15 y LA15 también mostraron cierto grado de actividad competitiva pero a un nivel más bajo que LN16. Los aminoácidos comunes compartidos por los tres péptidos, LN16, LD15 y LA15, son los aa19-25 de pre-S1. Por lo tanto, los presentes inventores probaron péptidos LN16, cada uno con una sola mutación de alanina en las posiciones 19, 20, 22 y 23, LN16-L19A, -D20A, -P21a , - F23A, por su actividad competitiva, el resultado mostró que todos ellos tenían actividad competitiva reducida (LN16-L19A) o perdieron completamente esta actividad (LN16-D20A, -P21A, -F23A), lo que indica que estos aminoácidos son de importancia crítica para la unión de pre-S1 a 2H5.

El epítopo 2H5 está altamente conservado entre la mayoría de los genotipos del VHB. El alineamiento de secuencia de péptidos pre-S1 de ocho genotipos de VHB mostró que el epítopo está altamente conservado entre ellos. El aminoácido variable principal está en la posición 24: glicina en el genotipo A y C, una lisina o arginina en el genotipo D y otros genotipos. Para probar si este cambio de aminoácido afectará a la unión de 2H5 al péptido pre-S1, se sintetizó el péptido NC36b que contenía una arginina en la posición 24 y se ensayó la unión con 2H5 mediante ELISA. El resultado mostró que este cambio de aminoácido tenía solo un efecto mínimo sobre la unión. Esto es consistente con el resultado de la neutralización vírica del VHB y el VHD que 2H5 neutralizó el VHB del genotipo D y el VHB que portaban envolturas del genotipo D del VHB.

Caracterización estructural del complejo peptídico 2H5 scFv y pre-S1. También determinamos la estructura cristalina de 2H5 (como el fragmento scFv fusionado con el marcador His6 en su N-terminal) en complejo con un péptido pre-S1, 59C. La secuencia de aminoácidos de 59C corresponde a aa-10~48 de pre-S1 del genotipo C:

GGWSSKPRQGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPNKDHWPEANQV (SEQ ID NO: 147). Se coexpresaron 2H5-scFv y 59C en E. coli. El complejo se purificó como un complejo mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) usando perlas de agarosa Ni-NTA (QIAGEN) seguido de cromatografía de exclusión por tamaño-HPLC (SEC-HPLC) con una columna Superdex S200 10/300 (GE Healthcare). El complejo purificado 2H5-scFv/59C luego se concentró y cristalizó a 20 °C usando el método de difusión de vapor de gota colgante mezclando 1 gl de proteína (29 mg/ml en Tris-HCl 10 mM a pH 8,0 y NaCl 100 mM) y 1 gl de solución de depósito que contiene acetato de sodio 2,8 M, a pH 7,0. Los cristales en forma de aguja aparecieron después de 10 días. Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en la línea de luz BL17U de la instalación de radiación sincrotrón de Shanghai y se procesaron con el HKL2000 [9]. La estructura se determinó a una resolución de 2,7 A ° mediante sustitución molecular en Phaser [10, 11] utilizando VH y VL derivados de la estructura del complejo Herceptina-Fab (PDB 3H0T) [12] como modelo de partida. El modelo inicial de reemplazo molecular se refinó aún más en Phenix [13] y se reconstruyó manualmente con Coot [14]. El modelo final incluye 220 restos de 2H5 scFv, restos 20-27 del péptido 59C. El análisis RAMPAGE muestra que el 96,71% de los restos están en la región favorecida y el 3,29% de los restos están en la región permitida [15]. La estructura reveló que tanto VH como VL de 2H5 scFv participan en la interacción con el péptido. Los ocho aminoácidos del péptido incluidos en la estructura son D20P21A22F23G24N25A26S27. Entre ellos, D²⁰, P21, A²², F²³, A²⁶ y S27 interactúan con 2H5. T res aminoácidos, D20, P21 y F23 hacen interacciones críticas para la unión de 2H5.

Mejora de la actividad de neutralización y afinidad de 2H5 mediante la mezcla de cadenas VH.

Identificación de los cuatro anticuerpos superiores de la biblioteca barajada de cadenas VH de 2H5. A continuación, los presentes inventores usaron la mezcla de cadenas para mejorar la afinidad de unión y la actividad de neutralización de 2H5, en donde una de las dos cadenas (VH y VL) se fija y se combina con un repertorio de la otra cadena para producir una biblioteca secundaria que puede seleccionarse para una actividad superior. En primer lugar, los presentes inventores hicieron barajar la cadena VH, en el que VL de 2H5 se fijó y emparejó con una biblioteca de cadenas VH.

Se construyeron dos bibliotecas de presentación de fagos VH-Lib/2H5VL. Un tamaño de biblioteca es ~2x108, el otro es de aproximadamente 9x108. Mediante el uso de péptidos capturados en M-280 Dynabeads® magnéticos conjugados con estreptavidina (Fife Technologies) como diana, las dos bibliotecas VH-Lib/2H5VL se seleccionaron por separado para una ronda cada una. Al final de una ronda de selección de ambas bibliotecas, un total de 576 clones individuales se seleccionaron aleatoriamente y se cribaron para determinar la unión con m47b mediante ELISA. Se seleccionaron y secuenciaron los clones positivos en EFISA. Se identificaron 10 clones con secuencias VH únicas (T abla 1) y mostraron una actividad de unión igual o más fuerte a m47b en forma de anticuerpo de fago que 2H5. Estos 10 clones luego se convirtieron en IgG1 humana de longitud completa y se validaron para unirse a m47b por EFISA, ensayos de neutralizar el VHB (genotipo D) (Figura 1) y el VHD por ensayos de neutralización in vitro. Cuatro anticuerpos superiores, N.° 31, N.° 32, A14 y A21 se seleccionaron en función de sus actividades generales de unión a m47b, neutralizando el VHB y el VHD.

Tabla 1. Alineación de la secuencia VH de 10 anticuerpos de selecciones de bibliotecas barajadas de cadenas VH de 2H5.

La Figura 1 muestra la neutralización del VHB mediante 10 anticuerpos de selecciones de bibliotecas barajadas de cadenas VH de 2H5. Las células HepG2-hNTCP se infectaron mediante incubación con VHB (genotipo D) en presencia de anticuerpos a diferentes concentraciones durante 16 horas. Posteriormente, se lavaron los anticuerpos y los virus y se siguieron cultivando durante 7 días, el medio de cultivo celular se cambió cada 2 días. E1HBeAg secretado se detectó mediante ELISA 7 días después de la infección. Basado en la reducción del nivel de HBeAg, la actividad de neutralización del VHB se calculó y expresó como los cambios porcentuales para las células infectadas en presencia de anticuerpos con respecto al control (células infectadas en presencia de un anticuerpo de control).

Mapeo de epítopos de los cuatro anticuerpos superiores de bibliotecas barajadas de cadenas VH de 2H5. Tal como se ha descrito anteriormente, los presentes inventores utilizaron el método ELISA de competición de péptidos para mapear el epítopo de unión de los cuatro anticuerpos principales identificados a partir de bibliotecas barajadas de cadenas VH de 2H5. El péptido LN16 (correspondiente al aminoácido NT (aa) 11 -28 del dominio pre-S1) y los mutantes del péptido LN16, LN16-L19A, -D20A, -P21A, -F23A se utilizaron para competir por la unión de estos anticuerpos al péptido m47b. Los datos de los presentes inventores revelaron que todos tenían un patrón de competencia de péptidos similar al 2H5, los aminoácidos, L19, D20, P21 y F23 son importantes para la unión de estos anticuerpos. El D20 y F23 son los más importantes para todos los anticuerpos, mientras que L19 y P21 jugaron un papel ligeramente variable para diferentes anticuerpos.

Caracterización adicional de los cuatro anticuerpos superiores de las bibliotecas barajadas de cadenas VH de 2H5. Estos anticuerpos tienen una actividad de neutralización del VHB (genotipo D) mejorada más de 15-20 veces en comparación con el anticuerpo 2H5 original. La CI50 para estos anticuerpos está alrededor de ~ 10-40 pM. Un anticuerpo representativo de estos 4 anticuerpos, A14, se comparó además con la inmunoglobulina contra la hepatitis B para neutralizar la infección por VHB (genotipo D). La IGHB se prepara a partir del plasma de donantes que tienen altos niveles de anticuerpos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) y se usa como profilaxis posterior a la exposición para personas con riesgo de desarrollar hepatitis B en la clínica. A14 mostró una actividad de neutralización más de 1000 veces mayor que la IGHB. Asimismo, A14 mostró una amplia actividad de neutralización contra otros dos genotipos del VHB, B y C. La CI50 para el genotipo B, C y D son 80 pM, 30 pM y 10 pM, respectivamente. También se examinó A14 para neutralizar seis virus del genotipo C del VHB del plasma de pacientes infectados por el VHB. De nuevo, A14 fue al menos varios cientos a 1000 veces más potente que IGHB en la neutralización de estos virus.

A14 es el que tiene las temperaturas de fusión (Tm) de Fab más altas de 80,2 °C, que refleja la mejor termoestabilidad de sus dominios variables. A14 se estabiliza en aproximadamente 2 °C en comparación con el 2H5 original, mientras que otros tres nAb tienen todos una termoestabilidad ligeramente reducida. La termoestabilidad se midió mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Utilizando hepatocitos humanos primarios (PHH), los presentes inventores también demostraron la potente actividad neutralizante de A14 contra dos cepas clínicas del VHB de muestras de plasma de pacientes con VHB. Un virus es el genotipo B; el otro virus es un virus de genotipo C. El HBsAg o HBeAg secretado a los sobrenadantes del cultivo celular se examinó cada dos días durante todo el curso de la infección utilizando kits comerciales (Autobio Diagnostics Co., Ltd.).

A14 compitió con pre-S1 por la unión a NTCP expresada en células. A14 compitió eficazmente con pre-S1 (péptido pre-S1 marcado por FITC: m59) para unirse a NTCP expresado en células HepG2 de una manera dependiente de la dosis.

A14 no tiene reactividad cruzada con 12 líneas celulares diferentes que representan 6 tejidos diferentes. Esto se analizó mediante ensayos de inmunotinción y transferencia de Western.

A14 tiene actividad de citotoxicidad mediada por anticuerpos (ADCC) contra células que llevan su epítopo en la superficie celular y células productoras de VHB, así como células infectadas. En el ensayo de ADCC, el epítopo de A14 se expresa de manera estable en la superficie de las células CHO, se usaron células DE19 productoras de VHB y células HepG2-hNTCP infectadas como células diana. Como células efectoras se utilizó una línea de linfocitos citolíticos humanos (NK92-MI que expresa CD16 (alelo V158) y cadena FcRgamma. Las células efectoras y las células diana (E/T) se cultivaron conjuntamente en una proporción de 6:1 durante 6 horas en presencia de A14 o su mutante Fc. La muerte celular se determinó usando un kit de ensayo de liberación de LDH de Promega. El ensayo ADCC mostró que A14 presentó una fuerte destrucción específica de las células CHO que expresan el epítopo, células productoras de VHB y células HepG2-hNTCP infectadas por VHB, pero no las células de control que carecen de la expresión del epítopo, células no productoras de VHB y células no infectadas por VHB. Al mismo tiempo, el mutante Fc de A14 (D265A/N297A) que carece de actividad ADCC pero conserva la misma actividad de unión no tenía actividad ADCC.

La actividad de ADCC es común a los anticuerpos que tienen el mismo o similar epítopo que A14, incluyendo 2H5, y sus cadenas VH barajadas derivadas: 4, 31, 32, 69, A14, A21, B103, B129, B139, b 172, y la cadena Vl barajó los clones N.° 8, 20, 20-m1, 20-m2, 20-m3 y anticuerpos que tienen distintos epítopos, como m36, 71, 76, T47, m150, m1Q también puede presentar actividad ADCC; por ejemplo, m1Q, también mostró actividad ADCC, su epítopo es aproximado al C-terminal del epítopo de A14 en preS1.

A14 protegió a los ratones de la infección por VHD. Anteriormente, los presentes inventores revelaron que el determinante molecular que restringe el ratón NTCP (mNTCP) para apoyar la entrada vírica de VHB y v Hd se encuentra dentro de los restos 84-87 de mNTCP. Cuando los restos 84-87 fueron reemplazados por sus homólogos humanos NTCP, puede apoyar eficazmente las infecciones víricas en cultivos celulares [16]. Basándose en esto, los presentes inventores han establecido un modelo de ratón (fondo de la cepa FVB) que puede soportar la infección por VHD reemplazando los restos de mNTCP en 84-87 con los restos correspondientes de hNTCP usando un método de edición del genoma, TALEN [17, 18]. Usando este modelo de ratón, los presentes inventores probaron si A14 puede proteger a los ratones de la infección por VHD. A los ratones FVB (edad de 9 días después del nacimiento) con aa84-87 de homocigotos modificados con mNTCP se les administró el mAb A14 a 10 mg/kg de peso corporal. 1 hora después de la administración del mAb, los ratones se expusieron al virus VHD. El día 6 después de la prueba de VHD, los ratones se sacrificaron y los tejidos del hígado se recolectaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la recolección. A continuación, las muestras de hígado de ratón se homogeneizaron y lisaron con el reactivo Trizol® para extraer el ARN total. Las muestras de ARN se transcribieron de forma inversa en ADNc con el kit Prime Script RT-PCR (Takara). Para cuantificar el ARN total de VHD (genoma equivalente) y las copias de ARN NTCP editadas, el ADNc obtenido a partir de 20 ng de ARN se utilizó como molde para el ensayo de PCR en tiempo real. La PCR en tiempo real se realizó en un instrumento de sistema en tiempo real ABI Fast 7500 (Applied Biosystems, EE. UU.). Se calcularon las copias de NTCP y VHD equivalentes del genoma vírico editado con una curva estándar y se utilizó el GAPDHRNA celular como control interno. El mAb A14 bloqueó completamente la infección por VHD, mientras que la infección por VHD alcanzó 1 -10x106 copias/20 ng de ARN de hígado en el grupo de control. Los ratones de ambos grupos tenían copias de ARNm de NTCP comparables en el tejido hepático.

A14 protegió a los ratones de la infección por VHB en un modelo de ratón de profilaxis e inhibió la infección por VHB en un modelo de ratón de tratamiento. Se ha establecido un modelo de infección por VHB en ratón utilizando ratones con triple inactivación génica FRG (Fah-/-Rag2-/-/IL2rg-/-) trasplantados con hepatocitos humanos [19, 20]. Los ratones FRG permiten que los hepatocitos humanos trasplantados se repliquen en el hígado del ratón para formar un hígado quimérico con hasta un 98% de hepatocitos humanos, como tales, los ratones FRG humanizados de hígado (FRGC) son muy susceptibles a la infección por VHB. Para probar el efecto profiláctico de A14, se dividieron 10 ratones FRGC en dos grupos, de cinco ratones cada uno. A los ratones del grupo de profilaxis A14 se les inyectó A14 a una dosis de 15 mg/kg mediante una única administración IP un día antes de la exposición al virus del VHB, mientras que a los ratones del grupo de control se les inyectó el mismo volumen de PBS. El día 0, se inyectaron ratones ah con 10e9 GE (genoma equivalente) VHB cada uno a través de la vena de la cola. Para probar el efecto terapéutico de A14, los ratones FRGC fueron expuestos con 10e9 GE/ratones de VHB a través de la vena de la cola el día 0, el día 5 después de la infección, los ratones se trataron con entecavir (ETV) control o A14 o IGHB. La ETV se administró por vía oral a 0,1 mg/kg al día; se administraron A14 o IGHB cada tres días mediante inyección IP a 20 mg/kg y 72 mg/kg (40 UI/kg), respectivamente. Tanto para el modelo de profilaxis como para el de tratamiento, se recolectaron muestras de sangre cada 3 días de ratones ah para medir el título de ADN de HBsAg y VHB en suero. Los ratones fueron sacrificados al final del experimento, el día 35 dpi y los tejidos del hígado se conservaron para la tinción inmunohistoquímica (IHC) de FIBsAg y HBcAg. A14 mostró una protección del 100% de los ratones FRGC de la infección por FIBV en el modelo de profilaxis; también mostró una inhibición significativa de la infección por VHB en el modelo de tratamiento.

En conjunto, los resultados demostraron claramente que el mAb A14 es un potente inhibidor de la entrada de VHD y VHB en modelos animales. El mAb A14 se puede utilizar para reemplazar IGHB para la prevención de la infección por VHD y VHB. Por otro lado, el tratamiento con A14 de una infección por VHB establecida en ratones inhibió significativamente la infección por VHB, además, A14 mostró actividad ADCC específica contra las células infectadas por VHB pero no contra las células no infectadas por VHB. Estos resultados indican que el mAb A14 puede combinarse con ETV para tratar a pacientes con infección crónica por VHB. Como A14 bloquea la entrada de nuevos virus en las células hospedadoras y tiene actividad ADCC contra las células infectadas, mientras que ETV inhibe la replicación vírica, la combinación de A14 con un inhibidor de la replicación vírica como ETV, lamivudina, adefovir, tenofovir, telbivudina u otros nucleósidos y análogos de nucleótidos (NUC) proporcionan nuevas opciones terapéuticas y profilácticas para los pacientes y pueden lograr un mejor control de la viremia y reducción de FIBsAg.

Mejora de la actividad de neutralización y afinidad de A14 mediante la mezcla de cadenas VL. Para mejorar aún más la actividad de A14, los presentes inventores hicieron una biblioteca de presentación en fagos mezclados en cadena A14-VL, en el que VH de A14 se fijó y emparejó con una biblioteca de cadenas VL. La biblioteca final (A14VH/VLlib) construida tenía un tamaño de ~3x108. Al usar el péptido m47b capturado en M-280 Dynabeads® magnético conjugado con estreptavidina (Life Technologies) como diana, se seleccionó la biblioteca A14VH/VLIib para dos rondas. Se cribaron 196 clones para determinar su unión con m47b mediante ELISA. Todos los clones fueron positivos, pero se seleccionaron para secuenciación 24 clones con la lectura de DO450 más alta. Se identificaron dos clones, N.° 8 y N.° 20, con secuencias de cadena de VL diferentes a las de VL de A14. Estos dos anticuerpos se convirtieron en IgG1 humana de longitud completa y se analizaron para determinar su unión a m47b mediante ELISA. Ambos mostraron una actividad de unión más fuerte a m47b que a A14. En el ensayo de neutralización del VHB (genotipo D), el N.° 8 mostró una mejora de 5 veces en la neutralización de la infección por VHB, mientras que el N.° 20 mostró una actividad similar a la del A14. Más mutagénesis del VL de N.° 20 (N.° 20-m1, -m2, -m3) mejoró su actividad de neutralización en ~3-5 veces que A14, alcanzó el nivel similar al N.° 8. Se demostraron las actividades de neutralización de VHD elevadas de estos mutantes N.° 20 en comparación con A14. Por lo tanto, estos anticuerpos derivados de A14 con actividades mejoradas adicionales se pueden usar de manera similar a A14 como se describió anteriormente, ya sea solo o en combinación con un inhibidor de la replicación vírica.

Referencias

1. Harrison, J.L., et al., Screening of phage antibody librarles. Methods Enzymol, 1996. 267: pág. 83-109.

2. McCafferty, J., et al., Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature, 1990.

348(6301): p. 552-4.

3. Yan, H., et al., Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is afunctional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife, 2012. 1: pág. e00049.

4.Sureau, C., et al., Production of infectious hepatitis delta virus in vitro and neutralization with antibodies directed against hepatitis B virus pre-S antigens. J Virol, 1992. 66(2): pág. 1241-5.

5. Yan, H., et al., Viral entry of hepatitis B and D viruses and bile salts transportation share common molecular determinants on sodium taurocholate cotransporting polypeptide. J Virol, 2014. 88(6): pág. 3273-84.

6. Hong, H.J., et al., In vivo neutralization of hepatitis B virus infection by an anti-preS1 humanized antibody in chimpanzees. Virology, 2004. 318(1): pág. 134-41.

7. Ryu, C.J., et al., Mouse monoclonal antibodies to hepatitis B virus preS1 produced after immunization with recombinantpreS1 peptide. Hybridoma, 2000. 19(2): pág. 185-9.

8. Chi, S.W., et al., Broadly neutralizing anti-hepatitis B virus antibody reveals a complementarity determining region H3 lid-opening mechanism. Proc Natl Acad Sci USA, 2007. 104(22): pág. 9230-5.

9. Otwinowski, Z. and W. Minor, Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol, 1997. 276: pág. 307-326.

10. McCoy, A.J., et al., Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr, 2007. 40(Pt 4): pág. 658-674.

11. McCoy, A.J., Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2007. 63(Pt 1): pág. 32-41.

12. Jordan, J.B., et al., Hepcidin revisited, disulfide connectivity, dynamics, and structure. J Biol Chem, 2009. 284(36): pág. 24155-67.

13. Adams, P.D., et al., PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2010. 66(Pt 2): pág. 213-21.

14. Emsley, P. y K. Cowtan, Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 2004. 60(Pt 12 Pt 1): pág. 2126-32.

15. Lovell, S.C., et al., Structure validation by Calpha geometry: phi,psi and Cbeta deviation. Proteins, 2003. 50(3): pág. 437-50.

16. Yan, H., et al., Molecular determinants of hepatitis B and D virus entry restriction in mouse sodium taurocholate cotransporting polypeptide. J Virol, 2013. 87(14): p. 7977-91.

17. Moscou, M.J. y A.J. Bogdanove, A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science, 2009.

326(5959): pág. 1501.

18. Boch, J., et al., Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science, 2009. 326(5959): pág. 1509-12.

19.Strom, S.C., J. Davila y M. Grompe, Chimeric mice with humanized liver: tools for the study of drug metabolism, excretion, and toxicity. Methods Mol Biol, 2010. 640: pág. 491-509.

20.Bissig, K.D., et al., Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest, 2010. 120(3): pág. 924-30.

Secuencias de anticuerpos de 7 anticuerpos que provienen de una biblioteca sin tratamiento previo

m36

ADN de VH de m36:

CAAGTTCCTTTATGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAGAATTCGCCACCATGAAACATCTGTGGT TCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGG GGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTT GATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTA TTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAG AGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTG TATTACTGTGCAAAAACGTCCTACGGGGGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCA CCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:01)

ADN de VL de m36:

CAGCCTGTGCTGACTCAATCGCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT GTTCTGGAAACACTTCCAACATCGGAAGTTATTATGCATACTGGTATCAGCAACTCCCAGGAAC GGCCCCCAAACTCCTCATCTATGATAATAATCAGCGGCCCTCGGGGATCCCTGCCCGATTCTCT GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCAG ATTATTACTGTGCAACATGGGATGACAGCCTGAATGGTCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGT CACCGTCCTA(SEQ ID NO:02)

Aminoácidos de VH de m36:

QMQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSV KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKTSYGGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:03)

Aminoácidos de VL de m36:

QPVLTQSPSASGTPGQRVTISCSGNTSNIGSYYAYWYQQLPGTAPKLLIYDNNQRPSGIPARFS GSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSLNGPVFGGGTKVTVL( SEQ ID N O :04)

71:

71 ADN de VH:

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCT GCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATACATTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACA AGGGCTTGAGTGGATGGGACGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTT CAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGGACGGCCTACATGGAACTGAGTACAC TGACATCTGACGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAGAAGGAAGGGGCGGCATGGACGTCTG GGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:05)

71 ADN de VL:

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCT CCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCA GAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGCTCCTGATCTATTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCGGGGTCCCT GACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTG AGGATGTTGGGATTTATTACTGCATGCAAGGTCTACAACCTCCCATCACCTTCGGCCAGGGGAC ACGACTGGAGATTAAA(SEQ ID NO:06)

71 Aminoácidos de VH:

QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYY1HWVRQAPGQGLEWMGRINPNSGGTNYAQKF QGRVTMTRDTSIRTAYMELSTLTSDDTAVYYCAREGRGGMDVWGQGTTVTVSS{SEQ ID

NO:0 7)

71 Aminoácidos de VL:

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQGLQPPITFGQGTRLEIK(SEQ ID NO:08)

76:

76 ADN de VH:

GAGGTGCAGCTGTTGGAGACCGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAA GGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTG AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGG GACAATGGTCACCGTCTCTTCA(SEQ ID NO:09)

76 ADN de VL:

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCT CCTGCAGGTCTAGTCACAGCCTCGTATACAGTGATGGAAACACCTACTTGAGTTGGTTTCACCA GAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAATCGGGACTTTGGGGTCCCA GACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGGCACTGACTTCACACTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCTG AGGATGTTGGAGTTTATTACTGCATGCAAGGTACACACTGGCCTGGGACGTTCGGCCAGGGGAC CAAACTGGATATCAAA (SEQ ID NO:10)

76 Aminoácidos de VH:

EVQLLETGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:11)

76 Aminoácidos de VL:

DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSHSLVYSDGNTYLSWFHQRPGQSPRRLIYKVSNRDFGVP DRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPGTFGQGTKLDIK (SEQ ID NO:12)

T47:

ADN de VH de T47:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCTCCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCCAGCAACAGTGTTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCA GTCTCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGC TGAGCTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTATATTACTGTGCAAGAGCCGATGGTTCGCGAGG GGGAGGGTATGACCAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA (SEQ ID NO:13)

ADN de VL de T47:

GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCA AATGCAAGTCCAGTCAGTCTATTTTATACAGGTCCAACAATAAGAACTACTTAGCTTGGTACCA ACACAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTCCTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTC CCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAACAGCCTGCAGG CTGAAGATGTGGCGGTTTATTACTGTCAGCAATATTATACTACTCCTCAGACTTTTGGCCAGGG GACCAAGGTGGAGATCAAA (SEQ ID NO:14)

Aminoácidos de VH de T47:

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLSCAISGDSVSSNSVAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYA VSVKSRITINPDTSKNQFSLQLSSVTPEDTAVYYCARADGSRGGGYDQWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:15)

Aminoácidos de VL de T47:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATIKCKSSQSILYRSNNKNYLAWYQHKPGQPPKLLISWASTRESGV PDRFSGSGSGTDFTLTINSLQAEDVAVYYCQQYYTTPQTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:16)

m1Q

ADN de VH de m1Q

CAGGTCCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAA GGGGCTGGAGCAGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTACGTAGACTCCGTG AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATCTACATACGGTATGGACGTCTGGGG CCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:17)

ADN de m1Q-VL

GATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGTCGGCCTCCATCT CCTGCAGGTCTAGTCAAAGCCTCGTACACAGTGATGGAAACACCTACTTGAATTGGTTTCAGCA GAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAATCGGGACTCCGGGGTCCCA GACAGATTCAGCGGCAGTGGGTCAGACACTGATTTCACACTGGAAATCAGCAGGGTGGAGGCCG AGGATGTTGGGATTTATTACTGCATGCAAGGTACACACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAA GCTGGATATCAAA (SEQ ID NO:18)

Aminoácidos de VH de m1 Q:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEQVAVISYDGSNKYYVDSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSTYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:19)

Aminoácidos de Vk de m1Q:

DVVMTQSPLSLPVTLGQSASISCRSSQSLVHSDGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVP DRFSGSGSDTDFTLEISRVEAEDVGIYYCMQGTHWWTFGQGTKLDIK (SEQ ID NO:20)

2H5:

ADN de VH de 2H5:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGGCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAAGAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCC TTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGCATAATGATTATGCA GTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTTTCCCTGCAGC TGAACTCTGTGACCCCCGAAGACACGGCTGTGTATTATTGTGCGCGCGGCCAGATGGGAGCTTT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:21)

ADN de VL de 2H5:

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT GTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTTATTATGTATACTGGTACCAGCAATTCCCAGGAAC GGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCT GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTG ATTATTACTGTCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGTGTGATATTCGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGTCCTA (SEQ ID NO:22)

Aminoácidos de VH de 2H5:

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCGISGDSVSSKSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWHNDYA VSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGQMGALDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:23)

Aminoácidos de VL de 2H5:

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSYYVYWYQQFPGTAPKLLIYGNNQRPSGVPDRFS GSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGVIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:24)

m150

ADN de VH de m150:

GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAA GGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTG AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGTTGGTGGCTGGTCGAAGTGCTTTTGA TATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:25)

ADN de VK de m150:

GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCT CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGC TCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTT ATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGCCTCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGAT TAAA (SEQ ID NO:26)

Aminoácidos de VH de m150: EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVAGRSAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID

NO:2 7)

Aminoácidos de VK de m150: EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSG SGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO:28)

Secuencias de anticuerpos de 10 anticuerpos que provienen de la selección de bibliotecas barajadas de cadenas VH de 2H5. Téngase en cuenta, estos anticuerpos tienen la misma secuencia de VL que 2H5, por lo tanto, solo se enumeran a continuación las secuencias de VH de estos anticuerpos.

N.° 4

N.° 4 ADN de VH:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGGCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAAGAGTGTTACTTGGAACTGGATCAGGGAGTCTCC AACGGGAGGCCTTGAGTGGCTGGGCAGGACATACTATAGGTCCAAGTGGTTTAATGATTATGCA GTATCTGTGAAAAGTCGAATAACTGTCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTTTCCCTGCAGC TAAACTCTGTGACTCCCGAGGACAGGGGTGTCTATTACTGCGCACGCGCCAAGATGGGAGGTAT GGACGTCTGGGGCCAGGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCA (SEQ ID NO:29)

N.° 4 Aminoácidos de VH: QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCGISGDSVSSKSVTWNWIRESPTGGLEWLGRTYYRSKWFNDYA VSVKSRITVNPDTSKNQFSLQLNSVTPEDRGVYYCARAKMGGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID

NO:3 0)

N.° 31 ADN de VH:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCA GTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGC TGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTACAAGACAGAGTTGGCACGGTAT GGAAGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:31)

N.° 31 Aminoácidos de VH:

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYA VSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCTRQSWHGMEVWGQGTTVTVSS (SEQ ID

NO:3 2)

N.° 32 ADN de VH:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCA GTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACTCAGACACATCGAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGC TGAAGTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGGAGTATAGCAACAGGTAC TGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:33)

N.° 32 Aminoácidos de VH: QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYA VSVKSRITINSDTSKNQFSLQLKSVTPEDTAVYYCARSIATGTDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID

NO:3 4)

N.° 69 ADN de VH:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGATGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGTAGCCGTGCTACTTGGAACTGGATCAGGGAGTCTCC AACGGGAGGCCTTGAGTGGCTGGGCAGGACATACTATAGGTCCAAGTGGTTTAATGATTATGCA GTATCTGTGAAAAGTCGAATAACTGTCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTTTCCCTGCAGC TAAACTCTGTGACTCCCGAGGACAGGGGTGTCTATTACTGCGCACGCGCCAAGATGGGAGGTAT GGACGTCTGGGGCCAGGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:35)

N.° 69 Aminoácidos de VH:

QVQLQQSGPGLMKPSQTLSLTCAISGDSVSSSRATWNWIRESPTGGLEWLGRTYYRSKWFNDYA VSVKSRITVNPDTSKNQFSLQLNSVTPEDRGVYYCARAKMGGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:3 5)

ADN de VH de A14:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCA GTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGC TGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGAACACGTTGGGGTAT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO:37)

Aminoácidos de VH de A14:

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYA VSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGTRWGMDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3 8)

ADN de VH de A21:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCA GTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGC TGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGCGAAAGTGTACGGTGT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:39)

Aminoácidos de VH de A21:

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYA VSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARAKVYGVDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:4 0)

ADN de VH de B103:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGGCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAAGAGTGCCACTTGGAACTGGGTCAGGCAGTCCGC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAGGTGGTTTAATGATTATGCA GTGTCTGTGAAAAGTCGAATAACCGTCAAGCCAGACACATCCAAGAACCAGTTTTCCCTGCAAT TAAATTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTATCTATTACTGTGCACGCGGCAACATGGGAGCTAT GGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCTTCA (SEQ ID NO:41)

Aminoácidos de VH de B103:

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCGISGDSVSSKSATWNWVRQSASRGLEWLGRTYYRSRWFNDYA VSVKSRITVKPDTSKNQFSLQLNSVSPEDTAIYYCARGNMGAMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:42)

ADN de VH de B129:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGCTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGGGTCTCTAGCAATAGAGCTGCTTGGAACTGGGTCAGGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCCAGTGGTATAATGATTATGCA GTCTCTGTAAAAAGTCGAGTGACCATCAGCCCAGACGCATCCAAGAACCAAGTCTCCCTGCAGC TGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGTACAGCTATGGGTGA CGCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCA (SEQ ID NO:43) Aminoácidos de VH de B129:

QVQLQQSGPGLLKPSQTLSLTCAISGDRVSSNRAAWNWVRQSPSRGLEWLGRTYYRSQWYNDYA VSVKSRVTISPDASKNQVSLQLNSVTPEDTAVYYCARGTAMGDAWGQGTLVTVSS (SEQ ID

NO:4 4)

ADN de VH de B139:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCACACTCACCT GTGTCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCA GTTTCTCTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGC TGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGACAAGCCTCCAACGGTTT TGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA (SEQ ID NO:45)

Aminoácidos de VH de B139:

QVQLQQSGPGLVKPSQTLTLTCVISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYA VSLKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQASNGFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID

NO:4 6)

ADN de VH de B172:

CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCT GTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCC ATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAAGTGGTATAATGATTATGCA GTATCTGTGAAAAGTCGAATAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGC TGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGACAGGGGACGACAGGCTT TGACTACTGGGGCCAGGGAACCACGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:47)

Aminoácidos de VH de B172:

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYA VSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARQGTTGFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID

NO:48)

Secuencias de anticuerpos de dos anticuerpos que provienen de la selección de bibliotecas barajadas de cadenas VL de A14. Téngase en cuenta, estos anticuerpos tienen la misma secuencia de VH que A14, por lo tanto, solo se enumeran a continuación las secuencias VL de estos dos anticuerpos.

N.° 8 ADN de VL:

CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCT GCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATTATTATGTGTCCTGGTACCAGCACCTCCCAGGAAC AGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATGCTAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCT GGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACTGGGCTCCGGGCTGAGGATGAGGCTG ATTATTACTGCCAGTCCTATGACAATAGCCTTAGTGGTTTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGTCCTA (SEQ ID NO:49)

N.° 8 Aminoácidos de VL:

QSWTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNYYVSWYQHLPGTAPKLLIYDNAKRPSGIPDRFS GSKSGTSATLGITGLRAEDEADYYCQSYDNSLSGLVFGGGTKLTVL (SEQ ID N O :50 )

N.° 20 ADN de VL:

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT GTTCTGGAACCAGCTCCAACATCGGAAGTAAGTATGTATACTGGTACCAGCGGCTCCCAGGAAC GGCCCCCAAACTCCTCATCTATACTAATGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGCCCGATTCTCT GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTG ATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGCGTGCTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGTCCTA (SEQ ID NO:51)

N.° 20 Aminoácidos de VL:

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGTSSNIGSKYVYWYQRLPGTAPKLLIYTNDQRPSGVPARFS GSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLRAWFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 52 )

N.° 20-m1 ADN de VL:

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT GTTCTGGAACCAGCTCCAACATCGGAAGTTTCTATGTATACTGGTACCAGCGGCTCCCAGGAAC GGCCCCCAAACTCCTCATCTATACTAATGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGCCCGATTCTCT GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTG ATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGCGTGCTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGTCCTA (SEQ ID NO:53)

N.° 20-m1 Aminoácidos de VL:

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGTSSNIGSFYVYWYQRLPGTAPKLLIYTNDQRPSGVPARFS GSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLRAWFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 54)

N.° 20-m2 ADN de VL:

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT GTTCTGGAACCAGCTCCAACATCGGAAGTTTCTATGTATACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAAC GGCCCCCAAACTCCTCATCTATACTAATGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGCCCGATTCTCT GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTG ATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGCGTGCTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGTCCTA (SEQ ID NO:55)

N.° 20-m2 Aminoácidos de VL:

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGTSSNIGSFYVYWYQQLPGTAPKLLIYTNDQRPSGVPARFS GSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLRAWFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 56)

N.° 20-m3 ADN de VL:

CAGTCTGTGTTGACGCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTT GTTCTGGAACCAGCTCCAACATCGGAAGTTACTATGTATACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAAC GGCCCCCAAACTCCTCATCTATACTAATGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGCCCGATTCTCT GGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTG ATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGCGTGCTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGTCCTA (SEQ ID NO:57)

N.° 20-m3 Aminoácidos de VL:

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGTSSNIGSYYVYWYQQLPGTAPKLLIYTNDQRPSGVPARFS GSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLRAWFGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 58)

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al dominio Pre-S1 del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (VHB), y comprende:

a) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

b) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 23 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

c) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 30 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

d) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 32 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

e) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

f) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 36 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

g) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 40 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

h) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 42 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

i) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 44 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

j) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 46 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

k) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 48 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 24;

l) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 50;

m) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 52;

n) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 54;

o) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 56; o

p) una región variable de cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 38 y una región variable de cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 58.

2. Una secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación ¹.

3. Un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 2.

4. Una célula cultivada que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 2 o el vector de expresión de la reivindicación 3.

5. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento de una infección por VHB o VHD que comprende administrar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a una persona que se determina que tiene infección por VHB o VHD, que ha estado expuesta a VHB o VHD o que tiene un alto riesgo de exposición o infección a VHB o VHD.