JP7304320B2

JP7304320B2 - 抗Ｐｒｅ－Ｓ１ＨＢＶ抗体

Info

Publication number: JP7304320B2
Application number: JP2020116317A
Authority: JP
Inventors: 建華隋; 丹李; 文輝李
Original assignee: Huahui Health Ltd
Current assignee: Huahui Health Ltd
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2020-07-06
Publication date: 2023-07-06
Anticipated expiration: 2036-05-23
Also published as: JP2018519804A; CN107614525B; EP3298038A4; CN117247944A; US20200109186A1; KR20180009780A; MA42137A; US20180148496A1; HK1243429A1; CN113527470A; EP3298038B1; JP2020171311A; RU2739955C2; CN113527470B; CN107614525A; RU2017145085A; WO2016188386A1; US20180094047A1; EP3298038A1; US11485774B2

Description

導入
世界の３分の１を超える人口がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染しており、現在２億４０００万人が慢性的に感染している。ＨＢＶ感染および関連疾患により、毎年約１００万人が死亡する。

ＨＢＶの表面抗原は、大（Ｌ）、中（Ｍ）および小（Ｓ）タンパク質からなる。ＬおよびＭタンパク質は、Ｓドメインのみを有するＳタンパク質と比較して、それらのＮ末端にさらなるドメインを有する。ＬはＰｒｅ－Ｓ１、Ｐｒｅ－Ｓ２およびＳドメインを含み；ＭはＰｒｅ－Ｓ２およびＳドメインを含み；Ｓタンパク質はＳドメインのみを含む。Ｌタンパク質のｐｒｅ－Ｓ１ドメインは、ヒト肝細胞表面上に発現されるＨＢＶ受容体の標的分子であり、ＨＢＶのｐｒｅ－Ｓ１ドメインに対する抗体が報告されている。例えば、Ｗａｔａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１４年、１５巻、２８９２～２９０５頁、参考文献２２～２７。関連文献としては、ＷＯ２０１３１５９２４３Ａ１におけるＨＢＶ受容体、マウスハイブリドーマ由来のヒト化抗体、ＵＳ７１１５７２３におけるＫＲ１２７、およびＵＳ７８９２７５４におけるｐｒｅ－Ｓ１ペプチドの記載が挙げられる。

国際公開第２０１３／１５９２４３号米国特許第７１１５７２３号明細書米国特許第７８９２７５４号明細書

Ｗａｔａｓｈｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１４年、１５巻、２８９２～２９０５頁

本発明は、ＨＢＶおよび／またはＨＤＶを阻害することによる免疫活性化のための方法および組成物を提供する。１態様では、本発明は、ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ１に特異的に結合し、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を、以下の（ａ）～（ｒ）から選択される組合せで含む抗体抗原結合ドメインを提供する。ここで、抗体（Ａｂ）、重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）、およびＣＤＲの組合せが由来するＣＤＲ命名システム（Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴまたは複合体）が最初のカラムに示され、太字の残基はＫａｂａｔシステム、および下線で示した残基はＩＭＧＴシステムである。

実施形態では、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを含む重鎖可変領域（Ｖｈ）ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを含む軽鎖可変領域（Ｖｌ）を含む、または、ｍ３６、７１、７６、Ｔ４７、ｍ１Ｑ、２Ｈ５、ｍ１５０；および４、３１、３２、６９、Ａ１４、Ａ２１、Ｂ１０３、Ｂ１２９、Ｂ１３９、Ｂ１７２；および８、２０、２０－ｍ１、２０－ｍ２、２０－ｍ３から選択される、重鎖可変領域（Ｖｈ）および／もしくは軽鎖可変領域（Ｖｌ）を含む抗体抗原結合ドメインを提供する。
実施形態では、抗体抗原結合ドメインは、ｐｒｅ－Ｓ１のａａ１１～２８またはａａ１９～２５に特異的に結合する。

本発明はまた、対象の結合ドメインを含む抗体、特にモノクローナル抗体、およびＦ（ａｂ）またはＦ（ａｂ）２を提供する。

本発明はまた、対象の抗原結合ドメインをコードするｃＤＮＡおよび発現ベクターのような新規なポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含む細胞、ならびにそのような細胞を含む非ヒト動物を提供する。ポリヌクレオチドは、発現のために異種の転写調節配列に作動可能に連結されてもよく、そのようなベクター、細胞などに組み込まれてもよい。

本発明は、ＨＢＶもしくはＨＤＶ感染を治療するため、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発するために、対象のドメインを使用する方法であって、ＨＢＶもしくはＨＤＶ感染を有する、ＨＢＶもしくはＨＤＶに曝露された、ＨＢＶもしくはＨＤＶの曝露もしくは感染のリスクが高い、Ｐｒｅ－Ｓ１ドメインの拮抗作用が必要である、またはそうでなければそれを必要とすると判断された人にそのドメインを投与することを含む方法を提供する。本発明はさらに、任意選択でウイルス複製阻害剤と合わせた、ＨＢＶまたはＨＤＶ感染のための医薬の製造のための対象の組成物の使用を提供する。

本発明は、記載した特定の実施形態の全ての組合せを含む。本発明のさらなる実施形態および適用性の全ての範囲は、本明細書の以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、この詳細な説明から本発明の主旨および範囲内の様々な変更および改変が、当業者には明白であるから、説明の手段としてのみ与えられるものであることは理解されるべきである。本明細書に引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、それらの中の引用物を含み、全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＨＢＶＰｒｅ－Ｓ１に特異的に結合し、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を、以下の（ａ）～（ｒ）から選択される組合せで含む抗体抗原結合ドメインであって、抗体（Ａｂ）、重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）、および前記ＣＤＲの組合せが由来するＣＤＲ命名システム（Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴまたは複合体）が最初のカラムに示され、太字の残基はＫａｂａｔシステム、および下線で示した残基はＩＭＧＴシステムである、抗体抗原結合ドメイン。

（項目２）
ｍ３６、７１、７６、Ｔ４７、ｍ１Ｑ、２Ｈ５、ｍ１５０；および
４、３１、３２、６９、Ａ１４、Ａ２１、Ｂ１０３、Ｂ１２９、Ｂ１３９、Ｂ１７２；および
８、２０、２０－ｍ１、２０－ｍ２、２０－ｍ３
から選択される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを含む重鎖可変領域（Ｖｈ）ならびにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の組合せを含む軽鎖可変領域（Ｖｌ）を含む、項目１に記載の抗体抗原結合ドメイン。
（項目３）
ｍ３６、７１、７６、Ｔ４７、ｍ１Ｑ、２Ｈ５、ｍ１５０；および
４、３１、３２、６９、Ａ１４、Ａ２１、Ｂ１０３、Ｂ１２９、Ｂ１３９、Ｂ１７２；および
８、２０、２０－ｍ１、２０－ｍ２、２０－ｍ３
から選択される重鎖可変領域（Ｖｈ）または軽鎖可変領域（Ｖｌ）を含む、項目１に記載の抗体抗原結合ドメイン。
（項目４）
ｍ３６、７１、７６、Ｔ４７、ｍ１Ｑ、２Ｈ５、ｍ１５０；および
４、３１、３２、６９、Ａ１４、Ａ２１、Ｂ１０３、Ｂ１２９、Ｂ１３９、Ｂ１７２；および
８、２０、２０－ｍ１、２０－ｍ２、２０－ｍ３
から選択される重鎖可変領域（Ｖｈ）および軽鎖可変領域（Ｖｌ）を含む、項目１に記載の抗体抗原結合ドメイン。
（項目５）
ｐｒｅ－Ｓ１のａａ１１～２８またはａａ１９～２５に特異的に結合する、項目１から４のいずれかに記載の抗体抗原結合ドメイン。
（項目６）
項目１から５のいずれかに記載の抗体抗原結合ドメインを含むモノクローナルＩｇＧ抗体。
（項目７）
ＨＢＶもしくはＨＤＶ感染を処置するため、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発するために、項目１から５のいずれかに記載の抗体抗原結合ドメインを使用する方法であって、ＨＢＶもしくはＨＤＶ感染を有する、ＨＢＶもしくはＨＤＶに曝露された、ＨＢＶもしくはＨＤＶの曝露もしくは感染のリスクが高い、Ｐｒｅ－Ｓ１ドメインの拮抗作用が必要である、またはそうでなければそれを必要とすると判断された人に前記ドメインを投与するステップを含む方法。
（項目９）
項目１から５のいずれかに記載の抗体抗原結合ドメインをコードする発現ベクター。
（項目１０）
項目１から５のいずれかに記載の抗体抗原結合ドメインを発現する培養細胞。

２Ｈ５ＶＨ鎖シャッフルライブラリー選択由来の１０個の抗体によるＨＢＶ中和。

発明の特定の実施形態の説明
文脈で別に示した場合を除いて、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、ＨＢＶ／ＨＤＶＰｒｅ－Ｓ１を認識するか、そうでなければＨＢＶ／ＨＤＶを阻害する限り、抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）および抗体断片を特に包含する。抗体分子は通常、単一特異性であるが、独自特異性（ｉｄｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）、異種特異性、または多特異性として記載されることもあり得る。抗体分子は、抗原上の特定の抗原決定基またはエピトープに対する特異的結合部位によって結合する。「抗体断片」は、完全長抗体の一部分、一般的にその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。

天然のおよび操作された抗体構造は、当該技術分野において周知である。例えば、Strohlら、Therapeutic antibody engineering:Current and future advances driving the strongest growth area in the pharmaceutical industry、Woodhead Publishing Series in Biomedicine １１巻、２０１２年１０月；Holligerら、Nature Biotechnol ２３巻、１１２６～１１３６頁（２００５年）； Chamesら、Br J Pharmacol. ２００９年５月；１５７巻（２号）：２２０～２３３頁。

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、当業者に公知の方法によって得ることができる。例えば、Kohlerら（１９７５年）；ＵＳ４，３７６，１１０；Ausubelら（１９８７～１９９９年）；Harlowら（１９８８年）；およびColliganら（１９９３年）を参照されたい。本発明のｍＡｂは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびそれらの任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであってもよい。ｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで培養することができる。高い力価のｍＡｂは、個々のハイブリドーマからの細胞を、例えば初回刺激を受けた（ｐｒｉｓｔｉｎｅ－ｐｒｉｍｅｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスのような、マウスに腹腔内注射して、高濃度の所望のｍＡｂを含む腹水を生成することで、ｉｎｖｉｖｏ生成で得ることができる。アイソタイプＩｇＭまたはＩｇＧのｍＡｂは、そのような腹水または培養上清から、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使用して、精製することができる。

「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然に存在する状態においてそれに隣接する配列から分離されたポリヌクレオチドセグメントまたは断片、例えば、通常、断片に隣り合う配列、例えば、天然に存在するゲノム中の断片に隣り合う配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、あるいは、他の配列とは独立した別個の分子として（例えば、ｃＤＮＡ、またはＰＣＲもしくは制限酵素消化によって生成されたゲノム断片もしくはｃＤＮＡ断片として）存在する組換えＤＮＡを含む。それはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含む。

「構築物」は、１つまたは複数のポリヌクレオチド分子が機能的に作動可能な様式で（すなわち、作動可能に連結されている）ポリヌクレオチド分子を含む、プラスミド、コスミド、ウイルス、自律的に複製するポリヌクレオチド分子、ファージ、あるいは線状もしくは環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチド分子などの、任意の起源に由来し、ゲノムへの組み込みまたは自律的に複製することが可能な、任意の組換えポリヌクレオチド分子を意味する。組換え構築物は、典型的には、意図された宿主細胞中でのポリヌクレオチドの転写を指令する転写開始制御配列に作動可能に連結された本発明のポリヌクレオチドを含む。異種および非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を用いて、本発明の核酸の発現を指令することができる。

「ベクター」とは、形質転換、すなわち、宿主細胞への異種ＤＮＡの導入の目的のために使用することができる任意の組換えポリヌクレオチド構築物のことを指す。ベクターの１つのタイプとしては「プラスミド」があり、これは追加のＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状の二本鎖ＤＮＡループのことを指す。別のタイプのベクターとしては、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができるウイルスベクターがある。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へ導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指向させることができる。本明細書において、そのようなベクターを「発現ベクター」と呼ぶ。

本明細書で使用される「発現ベクター」とは、宿主細胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入された場合に、目的の遺伝子を複製および発現することができる核酸分子を指す。発現ベクターは、ベクターの維持を確実にするため、および、所望の場合には、宿主内で増幅を提供するために、１つまたは複数の表現型選択可能マーカーおよび複製起点を含む。発現ベクターは、細胞内のポリペプチドの発現を駆動するためのプロモーターをさらに含む。適切な発現ベクターは、例えば、商業的に利用可能なｐＢＲ３２２または様々なｐＵＣプラスミド由来のプラスミドであってもよい。他の発現ベクターは、バクテリオファージ、ファージミドまたはコスミド発現ベクターに由来していてもよい。

ヒトモノクローナル抗体はＢ型およびＤ型肝炎ウイルスのウイルス感染を遮断する
ここで、本発明者らは、ＨＤＶおよびＨＢＶウイルス感染を遮断することができるヒトモノクローナル抗体を開示する。これらの抗体は、９３人の健康なドナーからの末梢血単核細胞を使用して樹立された大きなファージディスプレイ抗体ライブラリーから同定された。ＨＢＶエンベロープタンパク質のｐｒｅ－Ｓ１ドメインを標的として使用した抗体ライブラリーの選択およびスクリーニングにより、ＨＢＶおよびＨＤＶ感染に対する中和活性を有するヒトモノクローナル抗体のパネルが同定された。それらのうち、２Ｈ５は、ＨＢＶおよびＨＤＶ感染に対して最も良い中和活性を示した。その標的（Ｐｒｅ－Ｓ１ドメインの８個のアミノ酸）と複合体化した２Ｈ５の共結晶構造が解明された。鎖シャッフリングアプローチにより２Ｈ５を最適化することにより、本発明者らはさらに強力な中和抗体を開発した。これらの抗体は２Ｈ５と同様のエピトープを認識し、エピトープはＨＢＶの異なる遺伝子型の間で高度に保存されている。例示的な抗体、Ａ１４を、ヒト化ＮＴＣＰを有するマウスにおいて試験したところ、ＨＤＶ感染からマウスは完全に防御され動物研究によりＨＢＶ感染に対する防御が確認された。

抗原標的：ｐｒｅ－Ｓ１ペプチド。選択のための抗原として、本発明者らはＨＢＶのｐｒｅ－Ｓ１ドメインに由来する２つのペプチドを使用した。それらはＳｃｉｌｉｇｈｔ－ペプチド（Ｓｃｉｌｉｇｈｔ－ｐｅｐｔｉｄｅ）（北京、中国）によって９５％を超える純度で合成された。ＮＣ３６ｂ：Ｃ末端にビオチン修飾を有するＨＢＶＬタンパク質のｐｒｅ－Ｓ１ドメインの残基４～３８を含むペプチド。ｍ４７ｂ：Ｃ末端におけるビオチン修飾およびＮ末端におけるミリストイル化修飾を有する、ｐｒｅ－Ｓ１ドメインのアミノ酸２～４８を含むミリストイル化リポペプチド。

ｐｒｅ－Ｓ１ペプチドに対するヒトモノクローナル抗体は、修飾を有するファージディスプレイ抗体技術に基づいて生成された［１、２］。

ファージディスプレイ抗体ライブラリー。９３人の健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からヒト非免疫ｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）抗体ライブラリーを構築した。ライブラリーのサイズは合計１．１×１０^１０メンバーである。

ファージ抗体ライブラリーの選択およびスクリーニング。表面にｓｃＦｖを発現するファージ粒子（ファージ－ｓｃＦｖ）をライブラリーから調製し、合成したＮＣ３６ｂおよびｍ４７ｂに対するｓｃＦｖの選択のために使用した。ペプチドをストレプトアビジンコンジュゲートマグネチックＭ－２８０ Dynabeads（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に捕捉し、その後、それぞれ、ライブラリーから調製した５×１０^１２個のファージ粒子と共にインキュベートした。各ペプチドについて、２ラウンドの選択を行った。各々の選択のラウンドについて、高親和性抗体を得るために、磁気ビーズ上に捕捉されたペプチドの量を最適化し、広範に及ぶ洗浄ステップを適用した。さらに、磁気ビーズから高親和性バインダーを回収し、回収されたファージ－ｓｃＦｖの多様性を増加させるために、ペプチド競合溶出および従来の塩基性トリエタノールアミン溶液を含む２つの溶出法を使用した。続いて、合計約２０００個の単一クローンを採取し、レスキューして細菌培養上清中にファージ－ｓｃＦｖを生成させ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によりｍ４７ｂおよび／またはＮＣ３６ｂへの特異的結合についてスクリーニングした。４５０ｎｍにおいて１．０超の光学密度の値でｍ４７ｂおよび／またはＮＣ３６ｂに結合したクローンを陽性としてスコアリングし、陰性クローンは０．１未満の値を与えた。ｍ４７ｂおよび／またはＮＣ３６ｂ特異的結合クローンについては、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の遺伝子を配列決定し、それらの対応するアミノ酸配列をアライメントして、反復クローンを排除し、さらなる特徴付けのために異なる配列を有する抗体を同定した。固有な配列を有する合計１０９個のクローンが同定された。

最良の抗体候補を同定するための固有な抗体配列を有する抗体のさらなる特徴付け。固有な配列を有する抗体クローンは、精製されたファージ－ｓｃＦｖ粒子として生成された、またはｓｃＦｖ－Ｆｃミニボディもしくは完全長ヒトＩｇＧ１に変換され、その後、ＥＬＩＳＡによりその結合活性について試験され、ならびに細胞培養液におけるＨＢＶおよびＨＤＶ中和活性について試験された。これらのアッセイによって、抗体は、それらの結合活性および中和活性に基づいてランク付けされた。最高の中和活性を有する上位の抗体を、さらなる開発のために選択した。

ＥＬＩＳＡまたは中和アッセイのための精製ファージ－ｓｃＦｖの調製。１０～３０ｍＬの細菌培養液の上清中のファージ－ｓｃＦｖをＰＥＧ／ＮａＣＬにより沈殿させ、その後、分光計により定量した。抗原結合またはウイルス感染を中和するための様々なファージ－ｓｃＦｖの活性を、同じ濃度に正規化された連続希釈ファージ－Ａｂの用量応答に基づいて評価した。

ｓｃＦｖ－Ｆｃミニボディの調製。ファージ－ｓｃＦｖ発現ベクターからのｓｃＦｖをコードする遺伝子を、ｓｃＦｖのＣ末端にヒトＩｇＧ１Ｆｃ断片を含有する発現ベクターにサブクローニングした。ｓｃＦｖ－Ｆｃを産生するために、２９３Ｆ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）にｓｃＦｖ－Ｆｃ発現プラスミドを一過的にトランスフェクトし、トランスフェクションから７２時間後に、細胞培養液上清を採取し、ｓｃＦｖ－ＦｃをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡセファロースＣＬ－４Ｂ、ＧＥヘルスケア）により精製した。

完全長ＩｇＧ１抗体の調製。ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬをコードする配列を、抗体重鎖（ＨＣ）発現ベクターおよび軽鎖（ＬＣ）発現ベクターに別々にサブクローニングした。ＩｇＧ１抗体を作製するために、２９３Ｆまたは２９３Ｔ細胞に、２つの発現プラスミド（ＨＣ＋ＬＣプラスミド）を、１：１の比で一過的に共トランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによりＩｇＧ１の精製のために細胞培養液上清を採取した。

ＥＬＩＳＡアッセイ。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５μｇ／ｍＬストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）を、１ウェル当たり１００μＬ、４℃で一晩または３７℃で１時間、Ｕ底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標））中にコーティングした。その後、２μｇ／ｍＬ（３７０ｎＭ）のｍ４７ｂまたはＮＣ３６ｂペプチドを１ウェルあたり１００μＬで、３０℃で０．５～１時間のインキュベーションによってプレート上に捕捉した。ファージ－ｓｃＦｖに基づいたＥＬＩＳＡについては、２％無脂肪ミルクを含有するＰＢＳ中に連続希釈したファージ－ｓｃＦｖを、各々のウェルに１ウェルあたり１００μＬで加えた。ＨＲＰコンジュゲートマウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加して、３０℃で３０分間インキュベートすることによって、特異的結合ファージ－ｓｃＦｖを検出した。各々のインキュベーションステップの間に、ＰＢＳＴ溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）を１ウェルあたり２００μＬで用いて、ＥＬＩＳＡプレートを６回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート抗体インキュベーションに続いて、３０℃で５～１０分間ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートすることにより、ＥＬＩＳＡシグナルを発色させ、次に２ＭＨ_２ＳＯ_４を１ウェルあたり２５μＬで用いて反応を停止させる。４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で読み取った。ｓｃＦｖ－ＦｃまたはＩｇＧ１に基づくＥＬＩＳＡについては、結合した抗体がＨＲＰコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）によって検出された以外は、ファージ－ｓｃＦｖについて上記の方法と基本的に同じであった。

ＨＢＶおよびＨＤＶウイルスの調製。ＨＢＶおよびＨＤＶは、以前、記載されたようにして生成された［３］。ＨＤＶ。簡潔に述べると、ＣＭＶプロモーターのコントロール下にある遺伝子型Ｉウイルス（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号：ＡＦ４２５６４４．１）の１．０×ＨＤＶｃＤＮＡのヘッドトゥーテール三量体（ｈｅａｄｔｏｔａｉｌｔｒｉｍｅｒ）を含有するプラスミドを、ＨＤＶＲＮＰの生成のための新規合成ＨＤＶｃＤＮＡを用いて構築した。内因性ＨＢＶプロモーターのコントロール下でＨＢＶエンベロープタンパク質を発現させるために、ＨＢＶのヌクレオチド２４３１～１９９０（遺伝子型Ｄ、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号：Ｕ９５５５１．１）を含有するｐＵＣ１８プラスミドを使用した。以前にＳｕｒｅａｕら［４］によって記載されたように、Ｈｕｈ－７におけるプラスミドのトランスフェクションによって、ＨＤＶビリオンを生成した。トランスフェクトした細胞培養液上清を採取し、ＨＤＶ中和アッセイのために直接使用した。ＨＢＶ。ＣＭＶプロモーターの制御下の１．０５コピーのＨＢＶゲノムを含有するプラスミドをＨｕｈ－７細胞にトランスフェクションすることによって、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤウイルスを生成した。遺伝子型ＢまたはＣのＨＢＶウイルスもまた、ＨＢＶ患者の血漿由来であった。

ＨＢＶおよびＨＤＶ中和アッセイ。中和アッセイは、若干の改変を施すと共に以前に記載される［３、５］ように行った。ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞（ＨＢＶおよびＨＤＶ受容体ｈＮＴＣＰ（ｈｕｍａｎｓｏｄｉｕｍｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ；ヒトタウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド）を安定に発現するＨｅｐＧ２細胞株）をこれらのアッセイに使用した。ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞をウイルス感染前に４８ウェルプレート中で１２～２４時間、ＰＭＭ培地［３］中で培養した。様々な型の抗体：ファージ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＦｃまたはＩｇＧ１と混合した約５００多重度のゲノム相当（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓｏｆｇｅｎｏｍｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ；ｍｇｅ）のＨＤＶまたは２００ｍｇｅのＨＢＶを、５％ＰＥＧ８０００の存在下でＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞に接種し、１６時間インキュベートした。その後、細胞を培地で３回洗浄し、ＰＭＭで維持した。細胞培養培地は、新鮮なＰＭＭ培地で２～３日ごとに変えた。ＨＤＶ感染については、感染の７日後（ｄａｙｓｐｏｓｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；ｄｐｉ）に、１００％メタノールを用い、ＨＤＶ感染細胞を室温で１０分間固定し、細胞内デルタ抗原を５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲート４Ｇ５（マウス抗ＨＤＶデルタ抗原モノクローナル抗体）で染色し、核をＤＡＰＩで染色した。蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）により画像を収集した。ＨＤＶに対する中和活性は、染色されたデルタ抗原の量および強度に基づいて決定された。ＨＢＶ感染については、ｄｐｉ３、５および７において、培養上清を収集し、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｗａｎｔａｉ、北京、中国）を用い、ＨＢＶ分泌ウイルス抗原ＨＢｓＡｇおよび／またはＨＢｅＡｇについて試験した。ＨＢｅＡｇおよび／またはＨＢｓＡｇのレベルを使用して、抗体のＨＢＶ中和活性を評価した。

上に記載のＥＬＩＳＡおよびＨＢＶ中和アッセイを介して、本発明者らは、ＮＣ３６ｂならびにｍ４７ｂおよび４７ｂ（ｍ４７ｂと同様であるが、ミリストイル化を伴わないペプチド）との特異的結合を示し、ＨＢＶにおいて中和活性を示したいくつかの上位の抗体を同定した。

これらの上位の抗体の中で、ｍ３６、２Ｈ５およびｍ１Ｑは、最良のＨＢＶ（遺伝子型Ｄ）中和活性を示す上位３種の抗体であった。ｍ３６は、完全長ＩｇＧ１に変換したときに発現の減少を示したため、さらなる試験から除外した。２Ｈ５およびｍ１ＱをＨＤＶ中和活性についてさらに比較したところ、２Ｈ５は中和ＨＤＶ感染においてより良好な活性を示した。ペプチドとの高い結合活性およびＨＢＶおよびＨＤＶに対する強力な中和活性に基づいて、２Ｈ５をさらなる開発のために選択した。さらに、２Ｈ５は、以前に刊行されたｐｒｅ－Ｓ１ペプチド抗体ＫＲ１２７［６～８］よりもより大きなＨＢＶおよびＨＤＶ中和活性を示した。ＨＢＶ感染アッセイにおいて、ＩＣ_５０（ＨＢＶ感染の５０％阻害をもたらす抗体濃度）によって示されるように、２Ｈ５－ＩｇＧ１は、ＫＲ１２７よりも１１倍強力である；２Ｈ５もまた、ＨＤＶ感染アッセイにおいて、より大きな阻害効果を示した。

２Ｈ５抗体の結合エピトープのマッピング。ｐｒｅ－Ｓ１領域上の２Ｈ５のエピトープをマッピングするために、本発明者らは、ｐｒｅ－Ｓ１ドメインの様々な領域をカバーする短いペプチドを合成し、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより、ｍ４７ｂへの２Ｈ５の結合について競合するそれらの能力を試験した。結合を競合することができる最も短いペプチドは、ＬＮ１６ペプチド（ＨＢＶＬタンパク質（遺伝子型Ｄ）のｐｒｅ－Ｓ１ドメインのＮＴアミノ酸（ａａ）１１～２８に対応する）であり、２Ｈ５の結合エピトープがこの領域内に位置することを示している。ＬＤ１５およびＬＡ１５ペプチドもまた、ある程度の競合活性を示したが、ＬＮ１６よりも低いレベルであった。３つのペプチドＬＮ１６、ＬＤ１５およびＬＡ１５によって共有される共通アミノ酸は、ｐｒｅ－Ｓ１のａａ１９～２５である。したがって、本発明者らは、１９、２０、２２および２３位にそれぞれ単一のアラニン変異を持つＬＮ１６ペプチド、ＬＮ１６－Ｌ１９Ａ、－Ｄ２０Ａ、－Ｐ２１Ａ、－Ｆ２３Ａをそれらの競合活性について試験し、その結果は、それら全ての競合活性が低減した（ＬＮ１６－Ｌ１９Ａ）、またはこの活性を完全に失った（ＬＮ１６－Ｄ２０Ａ、－Ｐ２１Ａ、－Ｆ２３Ａ）ことを示したが、このことは、これらのアミノ酸が、２Ｈ５へのｐｒｅ－Ｓ１結合について非常に重要であることを示している。

２Ｈ５エピトープは、大部分のＨＢＶ遺伝子型の間で高度に保存されている。８つのＨＢＶ遺伝子型のｐｒｅ－Ｓ１ペプチドの配列アライメントにより、それらの間でそのエピトープが、高度に保存されていることが示された。主要な可変アミノ酸は、２４位：遺伝子型ＡおよびＣにおけるグリシン、遺伝子型Ｄおよび他の遺伝子型におけるリジンまたはアルギニンである。ｐｒｅ－Ｓ１ペプチドへの２Ｈ５結合にこのアミノ酸変化が影響を及ぼすかどうかを試験するために、２４位にアルギニンを含有するＮＣ３６ｂペプチドを合成し、ＥＬＩＳＡにより２Ｈ５との結合を試験する。その結果は、このアミノ酸変化が結合に対して最小限の影響しか有さないことを示した。これは、２Ｈ５が、遺伝子型ＤのＨＢＶおよびＨＢＶ遺伝子型Ｄエンベロープを持つＨＤＶを中和したＨＢＶおよびＨＤＶウイルス中和結果と一致する。

２Ｈ５ｓｃＦｖおよびｐｒｅ－Ｓ１ペプチド複合体の構造的特徴付け。本発明者らはまた、ｐｒｅ－Ｓ１ペプチド、５９Ｃと複合体化した２Ｈ５の結晶構造（そのＮ末端にＨｉｓ_６タグを融合させたｓｃＦｖ断片として）を決定した。５９Ｃのアミノ酸配列は、遺伝子型Ｃのｐｒｅ－Ｓ１のａａ－１０～４８に対応する：

２Ｈ５－ｓｃＦｖおよび５９ＣをＥ．ｃｏｌｉで共発現させた。この複合体を、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、続いてＳｕｐｅｒｄｅｘＳ２００１０／３００カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー－ＨＰＬＣ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって複合体として精製した。その後、精製した２Ｈ５－ｓｃＦｖ／５９Ｃ複合体を濃縮し、１μＬのタンパク質（１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ８．０および１００ｍＭＮａＣｌ中に２９ｍｇ／ｍＬ）および１μＬの２．８Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含有するリザーバー溶液を混合することによるハンギングドロップ蒸気拡散法を使用して、２０℃で結晶化させた。針状の結晶が１０日後に現れた。Ｘ線回折データを、上海シンクロトロン放射施設のビームラインＢＬ１７Ｕで収集し、ＨＫＬ２０００により処理した［９］。構造は、ハーセプチン－Ｆａｂ複合体（ＰＤＢ３Ｈ０Ｔ）［１２］の構造に由来するＶＨおよびＶＬをスターティング・モデルとして使用して、Ｐｈａｓｅｒ［１０、１１］での分子置換によって２．７Åの分解能で決定した。分子置換から得られた初期モデルは、Ｐｈｅｎｉｘ［１３］においてさらに精密化され、Ｃｏｏｔ［１４］において手動で再構築された。最終的なモデルは、２Ｈ５ｓｃＦｖの２２０残基、５９Ｃペプチドの残基２０～２７を含む。ＲＡＭＰＡＧＥ分析は、９６．７１％の残基が好ましい領域にあり、３．２９％の残基が許容領域にあることを示している［１５］。２Ｈ５ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬの両方がペプチドとの相互作用に関与していることが、構造により明らかになった。この構造に含まれるペプチドの８個のアミノ酸はＤ_２０Ｐ_２１Ａ_２２Ｆ_２３Ｇ_２４Ｎ_２５Ａ_２６Ｓ_２７である。そのうち、Ｄ_２０、Ｐ_２１、Ａ_２２、Ｆ_２３、Ａ_２６およびＳ_２７は２Ｈ５と相互作用する。３つのアミノ酸、Ｄ_２０、Ｐ_２１およびＦ_２３は、２Ｈ５結合にとって重要な相互作用をする。

ＶＨ鎖シャッフリングによる２Ｈ５親和性および中和活性の改善。

２Ｈ５のＶＨ鎖シャッフルライブラリーからの４つの上位抗体の同定。次に、本発明者らは、２Ｈ５の結合親和性および中和活性を改善するために、鎖シャッフリングを使用した。この鎖シャッフリングでは、優れた活性について選択できる二次ライブラリーを生じさせるために、２つの鎖（ＶＨおよびＶＬ）のうち１つは固定され、他の鎖のレパートリーと組み合わせた。まず、２Ｈ５のＶＬを固定し、ＶＨ鎖のライブラリーと対にしたＶＨ鎖シャッフリングを行った。２つのＶＨ－Ｌｉｂ／２Ｈ５ＶＬファージディスプレイライブラリーを構築した。１つのライブラリーサイズは約２×１０^８で、もう１つは約９×１０^８である。ストレプトアビジンコンジュゲートマグネチックＭ－２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に捕捉されたペプチドを標的として使用することにより、２つのＶＨ－Ｌｉｂ／２Ｈ５ＶＬライブラリーを各々１ラウンドずつ別々に選択した。両方のライブラリーからの選択の１ラウンドの終わりに、合計５７６個の個々のクローンを無作為に採取し、ＥＬＩＳＡによってｍ４７ｂとの結合についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡにおける陽性クローンを選択し、配列決定した。ファージ抗体型において、２Ｈ５に比べて同等またはより強力なｍ４７_ｂに対する結合活性を示した、固有のＶＨ配列（表１）を有する１０個のクローンを同定した。その後、これらの１０個のクローンを完全長ヒトＩｇＧ１に変換し、ＥＬＩＳＡによるｍ４７ｂへの結合と、ｉｎｖｉｔｒｏ中和アッセイによるＨＢＶ（遺伝子型Ｄ）（図１）およびＨＤＶの中和について、確証した。ｍ４７ｂへの結合、ＨＢＶおよびＨＤＶの中和におけるそれらの全体的な活性に基づいて、４つの上位抗体、＃３１、＃３２、Ａ１４およびＡ２１を選択した。

図１は、２Ｈ５ＶＨ鎖シャッフルライブラリー選択からの１０個の抗体によるＨＢＶ中和を示す。抗体の存在下、様々な濃度で１６時間、ＨＢＶ（遺伝子型Ｄ）とインキュベーションすることにより、ＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞を感染させた。その後、抗体およびウイルスを洗い流し、７日間培養し続け、細胞培養用培地を２日ごとに交換した。感染の７日後にＥＬＩＳＡによって、分泌されたＨＢｅＡｇを検出した。ＨＢｅＡｇレベルの低減に基づいて、ＨＢＶ中和活性を計算し、抗体の存在下での感染細胞の、対照（対照抗体の存在下で感染させた細胞）と比較した変化パーセンテージとして表した。

２Ｈ５ＶＨ鎖シャッフルライブラリーからの４つの上位抗体のエピトープマッピング。上に記載のように、本発明者らは、２Ｈ５ＶＨ鎖シャッフルライブラリーから同定された４つの上位抗体の結合エピトープをマッピングするために、ペプチド競合ＥＬＩＳＡ法を使用した。ＬＮ１６ペプチド（ｐｒｅ－Ｓ１ドメインのＮＴアミノ酸（ａａ）１１～２８に対応する）、およびＬＮ１６ペプチド変異体、ＬＮ１６－Ｌ１９Ａ、－Ｄ２０Ａ、－Ｐ２１Ａ、－Ｆ２３Ａを使用して、これら抗体のｍ４７ｂペプチドへの結合について競合させた。それらの全てが２Ｈ５と同様のペプチド競合パターンを有し、アミノ酸、Ｌ１９、Ｄ２０、Ｐ２１およびＦ２３がこれらの抗体の結合に重要であることが、本発明者らのデータにより明らかになった。Ｄ２０およびＦ２３は全ての抗体にとって最も重要である一方で、Ｌ１９およびＰ２１は様々な抗体に対してわずかに変わりやすい役割を果たす。

２Ｈ５ＶＨ鎖シャッフルライブラリーからの４つの上位抗体のさらなる特徴付け。これらの抗体は、親の２Ｈ５抗体と比較して、ＨＢＶ（遺伝子型Ｄ）中和活性が１５～２０倍を超えて改善されている。これらの抗体のＩＣ５０は約１０～４０ｐＭ前後である。これらの４つの抗体のうちの代表的な抗体、Ａ１４を、ＨＢＶ（遺伝子型Ｄ）感染の中和において、Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＩｍｍｕｎｅＧｌｏｂｕｌｉｎ）とさらに比較した。ＨＢＩＧは、Ｂ型肝炎表面抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ；ＨＢｓＡｇ）の高い抗体レベルを有するドナーの血漿から調製され、臨床でＢ型肝炎を発症する危険性のある人々のための曝露後予防法として使用される。Ａ１４は、ＨＢＩＧよりも１０００倍を超える中和活性を示した。さらに、Ａ１４は、他の２つのＨＢＶ遺伝子型、ＢおよびＣに対して、広く中和活性を示した。遺伝子型Ｂ、ＣおよびＤのＩＣ５０は、それぞれ８０ｐＭ、３０ｐＭおよび１０ｐＭである。Ａ１４はまた、ＨＢＶ感染患者の血漿からの６つのＨＢＶ遺伝子型Ｃウイルスの中和について試験された。やはり、Ａ１４は、これらのウイルスの中和において、ＨＢＩＧよりも少なくとも数百倍から１０００倍強力であった。

Ａ１４は、その可変ドメインの最も高い熱安定性を反映して、８０．２℃の最も高いＦａｂ融解温度（Ｔｍ）を有するものである。Ａ１４は、起源の２Ｈ５と比較しておよそ２℃、安定化されている一方で、他の３つのｎＡｂは全て、わずかに熱安定性が低減する。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、熱安定性を測定した。

初代ヒト肝細胞（ｐｒｉｍａｒｙｈｕｍａｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ；ＰＨＨ）を使用して、本発明者らはまた、ＨＢＶ患者の血漿サンプルからの２つのＨＢＶ臨床株に対するＡ１４の強力な中和活性を実証した。１つのウイルスは遺伝子型Ｂであり；他のウイルスは遺伝子型Ｃウイルスである。細胞培養液上清に分泌されたＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇを、市販のキット（ＡｕｔｏｂｉｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏ．，Ｌｔｄ．）を使用して、感染過程の全体にわたって２日ごとに検査した。

Ａ１４は、細胞上に発現したＮＴＣＰへの結合について、ｐｒｅ－Ｓ１と競合した。Ａ１４は、用量依存的にＨｅｐＧ２細胞上に発現したＮＴＣＰへの結合に関してｐｒｅ－Ｓ１（ＦＩＴＣ標識ｐｒｅ－Ｓ１ペプチド：ｍ５９）と効果的に競合した。

Ａ１４は、６つの異なる組織を代表する１２の異なる細胞株との交差反応性が無い。このことは、ウエスタンブロッティングおよび免疫染色アッセイによって分析された。

Ａ１４は、感染細胞と同様に細胞表面上にそのエピトープを持つ細胞およびＨＢＶ産生細胞に対する抗体媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙｍｅｄｉａｔｅｄｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）活性を有する。ＡＤＣＣアッセイにおいて、Ａ１４のエピトープはＣＨＯ細胞表面上に安定して発現され、ＨＢＶを産生するＤＥ１９細胞、感染したＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞は、標的細胞として使用された。ヒトＮＫ細胞株（ＣＤ１６（Ｖ１５８対立遺伝子）およびＦｃＲｇａｍｍａ鎖を発現するＮＫ９２－ＭＩ）をエフェクター細胞として使用した。エフェクター細胞および標的細胞（Ｅ／Ｔ）を、Ａ１４またはそのＦｃ変異体の存在下、６：１の比で６時間、共培養した。プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのＬＤＨ放出アッセイキットを使用して、細胞殺滅を測定した。Ａ１４は、エピトープを発現するＣＨＯ細胞、ＨＢＶ産生細胞、およびＨＢＶに感染したＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞の強い特異的殺滅を示すものの、エピトープ発現を欠く対照細胞、非ＨＢＶ産生細胞、非ＨＢＶ感染細胞の強い特異的殺滅は示さないことが、ＡＤＣＣアッセイにより示された。一方で、ＡＤＣＣ活性を欠くが、同じ結合活性を保持するＡ１４のＦｃ変異体（Ｄ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａ）は、ＡＤＣＣ活性を有していなかった。

ＡＤＣＣ活性は、Ａ１４と同じまたは類似のエピトープを有する抗体であって、２Ｈ５およびそのＶＨ鎖シャッフル由来のもの：４、３１、３２、６９、Ａ１４、Ａ２１、Ｂ１０３、Ｂ１２９、Ｂ１３９、Ｂ１７２、およびそのＶＬ鎖シャッフルしたクローン＃８、２０、２０－ｍ１、２０－ｍ２、２０－ｍ３を含む抗体に共通しており、ならびにｍ３６、７１、７６、Ｔ４７、ｍ１５０、ｍ１Ｑのような異なるエピトープを有する抗体もまたＡＤＣＣ活性を示すことができる；例えばｍ１ＱもまたＡＤＣＣ活性を示し、そのエピトープはｐｒｅＳ１上のＡ１４のエピトープのＣ末端に接近している。

Ａ１４はマウスをＨＤＶ感染から保護した。本発明者らは以前に、ＨＢＶおよびＨＤＶのウイルス侵入を支援するようにマウスＮＴＣＰ（ｍｏｕｓｅＮＴＣＰ；ｍＮＴＣＰ）を限定する分子決定基が、ｍＮＴＣＰの残基８４～８７内に位置することを明らかにした。残基８４～８７がヒトＮＴＣＰの対応部分で置き換えられた場合、これは細胞培養においてウイルス感染を効果的に支援することができる［１６］。このことに基づき、本発明者らは、ゲノム編集法、ＴＡＬＥＮ［１７、１８］を使用して、ｍＮＴＣＰの８４～８７における残基をｈＮＴＣＰの対応する残基に置き換えることにより、ＨＤＶ感染を支援することのできるマウスモデル（ＦＶＢ株のバックグラウンド）を樹立した。このマウスモデルを使用して、本発明者らは、Ａ１４がＨＤＶ感染からマウスを保護できるかどうかを試験した。ｍＮＴＣＰ修飾ホモ接合体のａａ８４～８７を有するＦＶＢマウス（生後９日齢）に、１０ｍｇ／ｋｇ体重でＡ１４ｍＡｂを投与した。ｍＡｂ投与の１時間後、ＨＤＶウイルスでマウスをチャレンジした。ＨＤＶチャレンジ後６日目に、マウスを屠殺し、収集直後に肝臓組織を液体窒素中で採取した。その後、マウス肝臓サンプルをホモジナイズし、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬で溶解して全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡサンプルを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ－ＰＣＲキット（Ｔａｋａｒａ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ＨＤＶ全ＲＮＡ（ゲノム等価物）および編集されたＮＴＣＰＲＮＡコピーを定量するために、２０ｎｇのＲＮＡから得られたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲアッセイのための鋳型として使用した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩＦａｓｔ７５００リアルタイムシステム機器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）で行った。編集されたＮＴＣＰおよびＨＤＶウイルスゲノム等価コピーを、標準曲線を用いて計算し、細胞内ＧＡＰＤＨＲＮＡを内部対照として使用した。Ａ１４ｍＡｂはＨＤＶ感染を完全に遮断した一方で、対照群においては、ＨＤＶ感染は１～１０×１０^６コピー／２０ｎｇ肝臓ＲＮＡに達した。両方の群のマウスは、肝臓組織において、同等のＮＴＣＰｍＲＮＡコピーを有していた。

Ａ１４は、予防マウスモデルにおいてＨＢＶ感染からマウスを保護し、処置マウスモデルにおいてＨＢＶ感染を阻害した。ヒト肝細胞を移植したＦＲＧ（Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－／ＩＬ２ｒｇ－／－）三重ノックアウトマウスを使用してマウスＨＢＶ感染モデルを樹立した［１９、２０］。ＦＲＧマウスは、移植されたヒト肝細胞をマウス肝臓において複製させ、９８％までヒト肝細胞を有するキメラ肝臓を形成することを可能となるが、このような肝臓ヒト化ＦＲＧマウス（ＦＲＧＣ）はＨＢＶ感染に対して非常に感受性が高い。Ａ１４の予防効果を試験するために、１０匹のＦＲＧＣマウスを各々５匹ずつの２つのグループに分けた。Ａ１４予防群のマウスには、ＨＢＶウイルスチャレンジの１日前に、１回のＩＰ投与によってＡ１４を１５ｍｇ／ｋｇの用量で注射した一方で、対照群のマウスには、同量のＰＢＳを注射した。０日目に、全てのマウスに１０ｅ９ＧＥ（ｇｅｎｏｍｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ；ゲノム等価量）ＨＢＶを各々、尾の静脈経由で注射した。Ａ１４の治療効果を試験するために、０日目に、尾の静脈経由で１０ｅ９ＧＥ／マウスのＨＢＶによりＦＲＧＣマウスをチャレンジし、感染後５日目に、マウスをエンテカビル（ＥＴＶ）対照またはＡ１４またはＨＢＩＧで処置した。ＥＴＶは毎日０．１ｍｇ／ｋｇで経口的に与えられ；Ａ１４またはＨＢＩＧは、３日ごとにＩ．Ｐ．注射により、それぞれ２０ｍｇ／ｋｇおよび７２ｍｇ／ｋｇ（４０ＩＵ／ｋｇ）で投与された。予防および処置モデルの両方において、血清中のＨＢｓＡｇおよびＨＢＶＤＮＡ力価を測定するために、全てのマウスから３日ごとに血液サンプルを採取した。マウスを実験の最後に屠殺し、ｄｐｉ３５および肝臓組織をＨＢｓＡｇおよびＨＢｃＡｇの免疫組織化学染色（ＩＨＣ）のために保存した。Ａ１４は、予防モデルにおいて、ＨＢＶ感染からのＦＲＧＣマウスの１００％保護を示した；それはまた、処置モデルにおいてもＨＢＶ感染の有意な阻害を示した。

まとめると、結果は、Ａ１４ｍＡｂが動物モデルにおける強力なＨＤＶおよびＨＢＶ侵入阻害剤であることを明白に実証した。ＨＤＶおよびＨＢＶ感染の防止のために、ＨＢＩＧに置き換えて、Ａ１４ｍＡｂを使用することができる。一方、マウスにおいて樹立されたＨＢＶ感染のＡ１４処置により、ＨＢＶ感染が有意に阻害され、さらに、Ａ１４は、ＨＢＶ感染細胞に対して特異的ＡＤＣＣ活性を示したが、非ＨＢＶ感染細胞に対しては示さなかった。これらの結果は、ＨＢＶに慢性的に感染した患者を処置する目的で、Ａ１４ｍＡｂをＥＴＶと組み合わせられ得ることを示している。Ａ１４は宿主細胞への新たなウイルス侵入を遮断し、感染細胞に対するＡＤＣＣ活性を有する一方で、ＥＴＶはウイルス複製を阻害するので、Ａ１４とＥＴＶ、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、アデフォビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）、テノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）、テルビブジン（ｔｅｌｂｉｖｕｄｉｎｅ）または他のヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログ（ＮＵＣ）などのウイルス複製阻害剤との組合せは、患者に新しい治療的および予防的選択肢を提供すると共に、より良好なウイルス血症制御およびＨＢｓＡｇ減少を達成することができる。

ＶＬ鎖シャッフリングによるＡ１４親和性および中和活性の改善。Ａ１４活性をさらに改善するために、本発明者らは、Ａ１４のＶＨを固定し、ＶＬ鎖のライブラリーと対にした、Ａ１４－ＶＬ鎖シャッフルファージディスプレイライブラリーを作製した。構築した最終ライブラリー（Ａ１４ＶＨ／ＶＬｌｉｂ）は、約３×１０^８のサイズであった。ストレプトアビジンコンジュゲートマグネチックＭ－２８０Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に捕捉されたｍ４７ｂペプチドを標的として使用して、Ａ１４ＶＨ／ＶＬｌｉｂライブラリーを２ラウンド選択した。ｍ４７ｂとの結合についてＥＬＩＳＡにより、１９６個のクローンがスクリーニングされた。全てのクローンは陽性であったが、最も高いＯＤ４５０読み取り値を有する２４個のクローンを配列決定のために採取した。Ａ１４のＶＬとは異なるＶＬ鎖配列を有する２個のクローン、＃８および＃２０が同定された。これら２つの抗体を完全長ヒトＩｇＧ１に変換し、ＥＬＩＳＡにより、ｍ４７ｂへの結合について試験した。それらは両方とも、Ａ１４よりも強いｍ４７ｂへの結合活性を示した。ＨＢＶ（遺伝子型Ｄ）のＨＢＶ中和アッセイにおいて、＃８は、ＨＢＶ感染の中和について５倍の改善を示したが、＃２０は、Ａ１４と同様の活性を示した。＃２０（＃２０－ｍ１、－ｍ２、－ｍ３）のＶＬのさらなる変異生成により、その中和活性がＡ１４よりも約３～５倍改善し、＃８と同様のレベルにまで達した。これらの＃２０変異体のＨＤＶ中和活性が、Ａ１４と比較して上昇したことが実証された。したがって、さらに改善された活性を有するこれらのＡ１４由来抗体は、上に記載のＡ１４と同様に、単独またはウイルス複製阻害剤と組み合わせて使用することができる。

参考文献

Claims

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面抗原のＰｒｅ－Ｓ１ドメインにＨＢＶを特異的に結合させる抗体またはその抗原結合断片であって、
ａ）Ｋａｂａｔシステムを利用した、配列番号５９の残基６～１０に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６０に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号６１の残基３～１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号６２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６３に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号６４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｂ）Ｋａｂａｔシステムを利用した、配列番号６５の残基５～９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号６７の残基３～１０に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号６８の残基１～１２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号６９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号７０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｃ）Ｋａｂａｔシステムを利用した、配列番号７１の残基６～１０に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号７３の残基３～７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号７４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号７６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）Ｋａｂａｔシステムを利用した、配列番号７７の残基６～１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号７８に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号７９の残基３～１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号８０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号８２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｅ）Ｋａｂａｔシステムを利用した、配列番号８３の残基６～１０に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８４に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号８５の残基３～９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号８６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号８７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号８８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｆ）Ｋａｂａｔシステムを利用した、配列番号９５の残基６～１０に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９６に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号９７の残基３～１２に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号９８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号９９に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および配列番号１００に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含み、
前記抗体またはその抗原結合断片は、
ｇ）配列番号３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号４に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｈ）配列番号７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｉ）配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｊ）配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１６に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｋ）配列番号１９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２０に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｌ）配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号２８に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む、ことを特徴とする抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｃドメインをさらに含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体またはその抗原結合断片は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイにおいてＡＤＣＣ活性を示す、請求項１または請求項２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１４６に示すアミノ酸配列を含むＰｒｅ－Ｓ１のエピトープに結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
前記抗体は、ヒトモノクローナル抗体である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする遺伝子。
請求項７に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を発現する培養細胞。
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片を対象に投与することを含む、対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）またはＤ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）感染を処置または予防する方法において使用される組成物であって、前記対象は、ＨＢＶもしくはＨＤＶを有する、ＨＢＶもしくはＨＤＶに曝露された、ＨＢＶもしくはＨＤＶの曝露もしくは感染のリスクが高い、Ｐｒｅ－Ｓ１ドメインの拮抗作用が必要である、またはそうでなければそれを必要とする、と判断されている、組成物。
前記抗体またはその抗原結合断片は、注射によって投与されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。