KR20240049621A - 디스트로글리칸 및 라미닌-2에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 결합 분자 - Google Patents

디스트로글리칸 및 라미닌-2에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 결합 분자 Download PDF

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Abstract

디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 결합 분자가 본원에서 제공된다. 또한 그러한 결합 분자의 제조 방법 및 알파-디스트로글리칸병증의 치료 및/또는 예방을 위한 그러한 결합 분자의 용도가 본원에서 제공된다.

Description

디스트로글리칸 및 라미닌-2에 대한 특이성을 갖는 다중특이적 결합 분자{MULTISPECIFIC BINDING MOLECULES HAVING SPECIFICITY TO DYSTROGLYCAN AND LAMININ-2}
관련 출원에 관한 상호-참조
본 출원은 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가출원 일련번호 제62/460,663호, 및 2018년 2월 16일에 출원된 EP 출원 제EP18305168.9호의 우선권 이익을 주장하며, 그 각각은 전체내용이 참조로 본원에 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로의 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일로의 하기 제출의 내용은 그 전체내용이 참조로 본원에 포함된다: 컴퓨터 판독가능 형태(computer readable form; CRF)의 서열 목록(파일명: 183952028140SEQLIST.txt, 기록일: 2018년 2월 16일, 크기: 315 KB).
기술분야
본 발명은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적(예컨대, 다중특이적 및 3가, 또는 이중특이적 및 2가 또는 4가) 결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그러한 결합 분자의 제조 방법 및 알파-디스트로글리칸병증의 치료 및/또는 예방을 위한 그러한 결합 분자의 용도에 관한 것이다.
알파-디스트로글리칸병증은 알파-디스트로글리칸(알파-DG)에서 뮤신-유사 도메인 중 O-글리코실화의 감소 또는 부재를 특징으로 하는 선천성 근디스트로피(CMD)의 하위군이다(Muntoni, F. (2004) Acta. Myol. 23(2), 79-84; Toda, T. (2005) Rinsho Shinkeigaku 45(11), 932-934; Muntoni, F., et al. (2007) Acta. Myol. 26(3), 129-135; Hewitt, J. E. (2009). Biochim. Biophys. Acta. 1792(9), 853-861; Godfrey, C., et al. (2011) Curr. Opin. Genet. Dev. 21(3):278-285). 알파-디스트로글리칸에서 글리코실화의 부재 또는 저하는 골격근에서의 라미닌-2, 아그린 및 펠레칸, 뇌에서 뉴렉신, 및 눈에서 피카추린을 포함하는, 그 리간드의 결합 손실 또는 감소를 야기한다. 알파-디스트로글리칸은 모든 근육 및 심장에 공통적인 디스트로핀-당단백질 복합체(DGC)의 말초 막 성분이다(도 1a)(Matsumura, K., et al. (1993) Neuromuscul. Disord.: 3(5-6):533-535). 이들 조직에서, DGC 복합체는 디스트로핀을 통해 근섬유의 필라멘트성 액틴(F-액틴)-연합 세포골격을 라미닌-2를 통해 세포외 매트릭스(ECM, 기저층으로도 불림)로 연결하는 기능을 한다(도 1b).
알파-디스트로글리칸병증에서, 현재까지 확인된 적어도 18개의 유전자에서의 돌연변이가 알파-DG에 대한 O-글리코실화의 비정상적 가공 및 그 리간드에 대한 결합의 부재에 연관되어 질병을 야기한다. 예컨대, 문헌[Hara, Y., et al. (2011) N. Engl. J. Med. 364(10), 939-946; Kim, D. S., et al. (2004) Neurology 62(6), 1009-1011; van Reeuwijk, J., et al. (2005) J. Med. Genet. 42(12), 907-912; Murakami, T., et al. (2009) Brain Dev. 31(6), 465-468; Yanagisawa, A., et al. (2009) Eur. J. Med. Genet. 52(4), 201-206; Clement, E. M., et al. (2008) Arch. Neurol. 65(1), 137-141; Endo, T., et al. (2010) Methods Enzymol. 479, 343-352; Saredi, S., et al. (2012) J. Neurol. Sci. 318(1-2), 45-50; Longman, C., et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12(21), 2853-2861; Lefeber, D. J., et al. (2009) Am. J. Hum. Genet. 85(1), 76-86; Barone, R., et al. (2012) Ann. Neurol. 72(4), 550-558; Toda, T., et al. (2003) Congenit. Anom. (Kyoto) 43(2), 97-104; Toda, T. (2007). Rinsho Shinkeigaku 47(11), 743-748; Puckett, R. L., et al. (2009) Neuromuscul. Disord. 19(5), 352-356; Toda, T. (2009). Rinsho Shinkeigaku 49(11), 859-862; Yamamoto, T., et al. (2010) Cent. Nerv. Syst. Agents. Med. Chem. 10(2), 169-179; Kanagawa, M., et al. (2016) Cell. Rep. 14(9), 2209-2223; Yoshida-Moriguchi, T., et al. (2013) Science 341(6148), 896-899)]을 참고한다. 이들 유전자는, 예를 들어, 여러 글리코실트랜스퍼라제, 예컨대 자일로스-글루쿠론산 반복물을 글리칸에 부가하여 리간드 결합을 촉진하는 데 관여되는 자일로실- 및 글루쿠로닐- 이중 트랜스퍼라제를 인코딩하는 LARGE를 포함한다(Inamori, K., et al. (2012) Science 335(6064), 93-96; Longman, C., et al. (2003) Hum. Mol. Genet. 12(21), 2853-2861). 상기 경로에서 글리코실트랜스퍼라제(예컨대 LARGE)의 주된 생물학적 기능은 근육의 기저층에서 라미닌-2, 신경근 접합부에서 아그린 및 펠레칸, CNS에서 뉴렉신, 및 눈에서 피카추린에 대한 단단한 결합을 위해 필요한, 알파-DG에서의 뮤신-유사 도메인에서 O-글리코실화를 적절히 조립하는 것이다(Michele, D. E., et al. (2002) Nature 418(6896), 417-422; Muntoni, F., et al. (2002) Lancet 360(9343), 1419-1421). 임의의 상기 언급된 유전자의 결함으로 인한 적절한 O-글리코실화의 부재 시, 세포외 매트릭스(ECM)에서 알파-DG의 라미닌-2로의 결합이 손상되거나 소실되어(도 1c), 근육속막 온전성을 위해 필요한 기계적 연결의 파괴를 유도한다. 이는 근육이 수축-유도 부상을 입기 쉽게 만들어서, 근섬유의 근육속막에 대한 손상 및 결과적인 근디스트로피를 일으킨다(Barresi, R. and Campbell. K. P. (2006) J. Cell. Sci. 119, 199-207).
유전적 이종성으로 인해, 알파-디스트로글리칸병증은 중추 신경계(CNS) 및 눈 비정상성을 갖는 매우 중증의 근디스트로피에서부터 CNS 발현 또는 눈 문제를 갖지 않는 비교적 경증의 근디스트로피 표현형까지 다양하지만 중첩되는 임상적 발현을 나타내는 여러 서브타입의 질병을 포함한다. 알파-디스트로글리칸병증의 상이한 서브타입 간에 엄격한 유전적 및 표현형 상관관계는 존재하지 않는다. 하나의 유전자에서의 돌연변이는 중첩되는 임상적 발현을 갖는 상이한 서브타입의 질병을 유도할 수 있고, 상이한 유전자에서의 돌연변이는 동일하거나 유사한 질병을 야기할 수 있다(Godfrey, C., et al. (2007) Brain 130, 2725-2735). 상기 이종성으로 인해, 개별 유전자에서 돌연변이에 의해 유도되는 개별 알파-디스트로글리칸병증을 치료하기 위한 전략은 낮은 비용 효과로 인해 약물 개발을 위해 매력적이지 않았다.
알파-디스트로글리칸 및 베타-디스트로글리칸은 동일한 유전자 DAG1에 의해 인코딩되며 단일 mRNA로부터 온전한 유형-1 막통과 단백질, 디스트로글리칸으로 번역된다. 세포 표면으로 가는 도중에, 디스트로글리칸은 단백분해적으로 절단되어 막통과 박힌 베타-디스트로글리칸 및 비공유-연합된 알파-디스트로글리칸을 생성한다(Holt, K. H., et al. (2000) FEBS Lett. 468(1):79-83). 이론적으로, 적절한 O-글리코실화를 포함하는 재조합 알파-디스트로글리칸이 알파-디스트로글리칸병증에 대한 단백질 대체 치료법으로 제안되었다. 그러나, 재조합 알파-디스트로글리칸의 전신-전달은 상기 단백질이 근육속막 상으로 도입되기 위한 근육 간질 공간에 도달하지 못함을 시사하였다(Han, R., et al. (2009) PNAS 106(31), 12573-12579). 따라서 알파-디스트로글리칸병증에 대한 단백질 대체 치료법으로 재조합 알파-디스트로글리칸을 이용하는 것은 엄밀히 말해서 비실용적인 것으로 여겨진다.
따라서, 알파-디스트로글리칸병증 및 이의 연관된 병증을 예방하고/하거나 치료하기 위한 치료 분자에 대한 필요성이 존재한다.
특허 출원, 특허 공개, 및 UniProtKB/Swiss-Prot 접근 번호를 포함하는 본원에서 인용되는 모든 참고문헌은 각각의 개별 참고문헌이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 바와 같이 이의 전체내용이 참조로 본원에 포함된다.
상기 및 다른 필요성을 충족하기 위해, 특히, 라미닌-2 및 디스트로글리칸(들)에 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 및 이중특이적 결합 분자(예컨대, 이중특이적 항체) 및 이중작용 생물학적 제제가 본원에서 제공된다. 그러한 다중특이적/이중특이적 항체 또는 이중작용 생물학적 제제가 알파-디스트로글리칸병증을 갖는 환자에게 투여되는 경우, 기저층에서의 라미닌-2 및 근육속막 상의 디스트로글리칸(알파- 또는 베타-)에 대한 그 동시적 결합은 누락된 연결을 복구할 수 있다(도 1d 및 1e). 본 발명은 그러한 접근이 생체내 동물 모델 시스템에서 알파-디스트로글리칸병증의 특징적 증상을 완화할 수 있음을 실증한다. 특히, 항체는 항체 리사이클링을 매개하는, 신생 Fc 수용체에 대한 이의 결합으로 인해 생체내 연장된 순환 반감기(긴 약동학)를 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, 이러한 다중특이적/이중특이적 항체 전략(또는 대안적으로, 이중작용 생물학적 제제 전략)은 알파-디스트로글리칸병증을 치료하기 위한 신규한 치료 전략을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 제1 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 적어도 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 다중특이적 결합 단백질이다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 3개의 항원 결합 부위를 포함하는 다중특이적, 3가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하고:
[화학식 I]
VL2-L1-VL1-L2-CL
제2 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하고:
[화학식 II]
VH1-L3-VH2-L4-CH1-힌지-CH2-CH3
제3 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하고:
[화학식 III]
VH3-CH1-힌지-CH2-CH3
제4 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하고:
[화학식 IV]
VL3-CL
식 중,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드 및 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며; 총 3개의 항원 결합 부위에 있어서 VH1 및 VL1이 하나의 항원 결합 부위를 형성하며, VH2 및 VL2가 하나의 항원 결합 부위를 형성하며, VH3 및 VL3이 하나의 항원 결합 부위를 형성하고, 3개의 항원 결합 부위는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위 및 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 하나의 항원 결합 부위 및 라미닌-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위는 라미닌-2의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위는 라미닌-2의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 라미닌-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위를 형성하며, VH2 및 VL2는 라미닌-2에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 형성하며, VH3 및 VL3은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 2개의 항원 결합 부위 및 라미닌-2에 결합하는 하나의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 2개의 항원 결합 부위는 디스트로글리칸의 세포외 부분의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 2개의 항원 결합 부위는 디스트로글리칸의 세포외 부분의 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 항원 결합 부위를 형성하며, VH2 및 VL2는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 형성하며, VH3 및 VL3은 라미닌-2에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다중특이적 결합 단백질의 일부로서 검정되는 경우 약 1 μM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 인간 및 마우스 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 베타-디스트로글리칸에 결합한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 서열 SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD(SEQ ID NO: 290)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 서열 SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV(SEQ ID NO: 291)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 알파-디스트로글리칸에 결합한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 서열 SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV(SEQ ID NO: 291)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다중특이적 결합 단백질의 일부로서 검정되는 경우 약 1 μM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 마우스 및 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 4, 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5, 또는 둘 다를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 4 및 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 서열 VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 300)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 서열 Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 301)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 서열 ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 292)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 서열 ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 293)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 1~8로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 9~17로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 18~27로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) SEQ ID NO: 28~37로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38~42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 43~50으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 및 188로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며; 및 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 SEQ ID NO: 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 및 189로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 인간화된 VH 도메인 및 인간화된 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며; 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 SEQ ID NO: 346의 서열을 포함하며; 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 SEQ ID NO: 362의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 AS30SS_Hu6 또는 AS30SS_Hu9의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 AS30SS_Hu6 또는 AS30SS_Hu9의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 표 D2 또는 I4에 나타내는 AS30SS_Hu6 또는 AS30SS_Hu9 VH 도메인의 서열을 나타내며; 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 표 D2 또는 I4에 나타내는 AS30SS_Hu6 또는 AS30SS_Hu9 VL 도메인의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 51~55 및 81~95로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 56~60 및 96~110으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 61~65 및 111~125로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) SEQ ID NO: 66~70 및 126~140으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38, 71~75, 및 141~154로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 76~80 및 155~169로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 및 228로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하며; 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 및 229로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 인간화된 VH 도메인 및 인간화된 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며; 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 인간화된 VH 도메인 및 인간화된 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 SEQ ID NO: 410의 서열을 포함하며; 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 SEQ ID NO: 426의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 446의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 인간화된 VH 도메인 및 인간화된 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 SEQ ID NO: 442의 서열을 포함하며; 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 SEQ ID NO: 458의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 478의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 인간화된 VH 도메인 및 인간화된 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 SEQ ID NO: 474의 서열을 포함하며; 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 SEQ ID NO: 490의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위는 다음을 포함한다: (a) 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 C3_Hu10, C3_Hu11, C21_Hu11, 또는 C21_Hu21의 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 (b) 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 C3_Hu10, C3_Hu11, C21_Hu11, 또는 C21_Hu21의 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL). 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VH 도메인은 표 D2 또는 I4에 나타내는 C3_Hu10, C3_Hu11, C21_Hu11, 또는 C21_Hu21 VH 도메인의 서열을 포함하며; 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위의 VL 도메인은 표 D2 또는 I4에 나타내는 C3_Hu10, C3_Hu11, C21_Hu11, 또는 C21_Hu21 VL 도메인의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 446의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 442의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 458의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 478의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 410의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 426의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 474의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 490의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 446의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 442의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 458의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 410의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 426의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 478의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 474의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 490의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다.
임의의 상기 구현예의 일부 구현예에서, L1 및 L2는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 일부 구현예에서, L3 및 L4는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다.
상기 구현예의 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이고; 제3 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V이고; 제3 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 상기 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG4 CH3 도메인이며, 상기 CH3 도메인들 중 하나만이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 435 및 436에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 아미노산 치환은 H435R 및 Y436F이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 CH2 도메인은 EU 인덱스에 따른 넘버링으로, 위치 297에 아스파라긴 잔기, 위치 298에 아스파라긴 잔기, 위치 299에 알라닌 잔기, 및 위치 300에 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 인간 IgG1 또는 IgG4 CH2 도메인이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 CH2 도메인은 EU 인덱스에 따른 넘버링으로, 위치 252에 티로신 잔기, 위치 254에 트레오닌 잔기, 및 위치 256에 글루탐산 잔기를 포함하는 인간 IgG1 또는 IgG4 CH2 도메인이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 500의 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 498의 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 499의 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 501의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 504의 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 502의 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 503의 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 505의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 508의 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 506의 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 507의 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 509의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 512의 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 510의 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 511의 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 513의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 516의 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 514의 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 515의 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 SEQ ID NO: 517의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 I2 또는 I4에 나타낸 바와 같은 triAb 3407, 3423, 3429, 3437, 또는 3439의 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 폴리펩티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 (a) 제1 중쇄 가변(VH) 도메인 및 제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 항체 중쇄, 및 제1 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 제1 항체 경쇄(여기서, 제1 VH 및 VL 도메인은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 항원 결합 도메인을 형성함), 및 (b) 제2 중쇄 가변(VH) 도메인 및 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄, 및 제2 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 제2 항체 경쇄(여기서, 제2 VH 및 VL 도메인은 라미닌-2에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 형성함)를 포함하며; 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하고, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 간 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것이며, 상기 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산을 갖고, 상기 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405 및 407로 구성되는 군으로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고/갖거나 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 각각의 CH3 영역의 동종이량체 상호작용의 해리 상수가 0.01 내지 10 마이크로몰 농도이도록 하는 것이다. 일부 구현예에서, 제1 항체 중쇄는 SEQ ID NO: 518의 서열을 포함하며, 여기서 제2 항체 중쇄는 SEQ ID NO: 519의 서열을 포함하며, 제1 항체 경쇄는 SEQ ID NO: 520의 서열을 포함하며, 제2 항체 경쇄는 SEQ ID NO: 521의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 I3 또는 I4에 나타낸 바와 같은 AS30_Hu6 × C3_Hu10 듀오바디(Duobody), AS30_Hu6 × C21_Hu11 듀엣맵(Duetmab), AS30_Hu6 × C3_Hu10 TBTI, AS30_Hu6 × C21_Hu11 TBTI, AS30_Hu9 × C3_Hu11 CODV, 또는 AS30_Hu9 × C21_Hu21 CODV의 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 폴리펩티드를 포함한다.
임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 본원에서 추가로 제공된다. 또한 표 G2 또는 I4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다. 또한 임의의 하나의 상기 구현예의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 또한 임의의 하나의 상기 구현예의 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 단리된 숙주 세포)가 제공된다. 임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자의 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템이 또한 제공된다. 임의의 하나의 상기 구현예의 벡터 시스템을 포함하는 숙주 세포(예컨대, 단리된 숙주 세포)가 또한 제공된다. 다중특이적 결합 분자의 제조 방법이 또한 제공되며, 이 방법은 숙주 세포가 다중특이적 결합 분자를 발현하도록 하는 조건 하에 임의의 하나의 상기 구현예의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 숙주 세포로부터 다중특이적 결합 분자를 단리하는 단계를 포함한다.
개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 추가로 제공되며, 이 방법은 임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 개체에서 라미닌-2 및 디스트로글리칸의 세포외 부분 간 결합을 제공하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 이 방법은 임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하기 위한 임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자의 용도가 또한 본원에서 제공된다. 개체에서 라미닌-2 및 디스트로글리칸의 세포외 부분 간 결합을 제공하기 위한 임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자의 용도가 또한 본원에서 제공된다. 개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의 임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자의 용도가 또한 본원에서 제공된다. 개체에서 라미닌-2 및 디스트로글리칸의 세포외 부분 간 결합을 제공하기 위한 약제의 제조에서의 임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자의 용도가 또한 본원에서 제공된다.
임의의 상기 구현예의 일부 구현예에서, 개체는 알파-디스트로글리칸의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체에서 발현되는 알파-디스트로글리칸은 손상되거나 비정상적인 O-글리코실화를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 디스트로글리칸(DAG1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-1(POMT1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-2(POMT2), 단백질 O-결합 만노스 베타1,2-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 1(POMGNT1), 단백질 O-결합 만노스 베타1,4-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 2(POMGNT2), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 1(LARGE1), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 2(LARGE2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 1(DPM1), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 2(DPM2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 3(DPM3), 푸쿠틴, 푸쿠틴 관련 단백질(FKRP), 이스프레노이드 합성효소 도메인 함유(ISPD), 단백질 O-만노스 키나제(POMK), 베타-1,3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 2(B3GALNT2), 베타-1,4-글루쿠로닐트랜스퍼라제 1(B4GAT1), 돌리콜 키나제(DOLK), 막통과 단백질 5(TMEM5), 및 GDP-만노스 피로포스포릴라제 B(GMPPB)로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 근육내, 복강내, 또는 피하 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 임의의 하나의 상기 구현예의 다중특이적 결합 분자 및 개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 지침을 포함하는 키트가 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 개체는 알파-디스트로글리칸의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체에서 발현되는 알파-디스트로글리칸은 손상되거나 비정상적인 O-글리코실화를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 디스트로글리칸(DAG1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-1(POMT1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-2(POMT2), 단백질 O-결합 만노스 베타1,2-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 1(POMGNT1), 단백질 O-결합 만노스 베타1,4-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 2(POMGNT2), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 1(LARGE1), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 2(LARGE2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 1(DPM1), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 2(DPM2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 3(DPM3), 푸쿠틴, 푸쿠틴 관련 단백질(FKRP), 이스프레노이드 합성효소 도메인 함유(ISPD), 단백질 O-만노스 키나제(POMK), 베타-1,3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 2(B3GALNT2), 베타-1,4-글루쿠로닐트랜스퍼라제 1(B4GAT1), 돌리콜 키나제(DOLK), 막통과 단백질 5(TMEM5), 및 GDP-만노스 피로포스포릴라제 B(GMPPB)로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 항체가 본원에서 추가로 제공되며, 여기서 항체는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 1~8로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 9~17로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 18~27로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄; 및 (b) SEQ ID NO: 28~37로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38~42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 43~50으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 및 188로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 SEQ ID NO: 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 및 189로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 결합 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열, 또는 표 D2 또는 I4에 나타내는 또는 표 G2에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다.
디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 항체가 본원에서 추가로 제공되며, 여기서 항체는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄; 및 (b) SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 314의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 330의 아미노산 서열을 포함하거나; VH 도메인은 SEQ ID NO: 346의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 362의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 결합 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열, 또는 표 D2 또는 I4에 나타내는 또는 표 G2에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다.
라미닌-2에 결합하는 항체가 본원에서 추가로 제공되며, 여기서 항체는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 51~55 및 81~95로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 56~60 및 96~110으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 61~65 및 111~125로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체 중쇄; 및 (b) SEQ ID NO: 66~70 및 126~140으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38, 71~75, 및 141~154로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 76~80 및 155~169로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 및 228로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 및 229로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 결합 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열, 또는 표 D2 또는 I4에 나타내는 또는 표 G2에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다.
라미닌-2에 결합하는 항체가 본원에서 추가로 제공되며, 여기서 항체는 다음을 포함한다: (a) SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄, 및 SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄; (b) SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄, 및 SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄; (c) SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 446의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄, 및 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄; 또는 (d) SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 478의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄, 및 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄. 일부 구현예에서, (a) VH 도메인은 SEQ ID NO: 378의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 394의 아미노산 서열을 포함하거나; (b) VH 도메인은 SEQ ID NO: 410의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 426의 아미노산 서열을 포함하거나; (c) VH 도메인은 SEQ ID NO: 442의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 458의 아미노산 서열을 포함하거나; (d) VH 도메인은 SEQ ID NO: 474의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 490의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 결합 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열, 또는 표 D2 또는 I4에 나타내는 또는 표 G2에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다.
임의의 하나의 상기 구현예의 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 본원에서 추가로 제공된다. 또한 임의의 하나의 상기 구현예의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 또한 임의의 하나의 상기 구현예의 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 단리된 숙주 세포)가 제공된다. 항체의 제조 방법이 또한 제공되며, 이 방법은 숙주 세포가 항체를 발현하도록 하는 조건 하에 임의의 하나의 상기 구현예의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 숙주 세포로부터 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이중특이적 결합 단백질이다.
일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 2개 또는 4개의 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적, 2가 또는 4가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 단백질은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인(여기서, 제1 결합 도메인은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH1) 및 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL1)을 포함함), 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인(여기서, 제2 결합 도메인은 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 표 A에 나타내는 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함하고/포함하거나 VL1 도메인은 표 A에 나타내는 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 표 B 또는 표 C에 나타내는 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함하고/포함하거나 VL2 도메인은 표 B 또는 표 C에 나타내는 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 여기서 2개의 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하며:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
2개의 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함한다:
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-힌지-CH2-CH3
식 중,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 링커이며; VH1 및 VL1 도메인은 VH1/VL1 결합 쌍을 형성하며, VH2 및 VL2 도메인은 VH2/VL2 결합 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, VH1 및 VL1 도메인은 교차하여 VH1/VL1 결합 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, VH2 및 VL2 도메인은 교차하여 VH2/VL2 결합 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 각각 0개 내지 50개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 각각 0개 내지 25개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 각각 0개 내지 14개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1은 5개의 아미노산 잔기 길이이며; L2는 5개의 아미노산 잔기 길이이며; L3은 5개의 아미노산 잔기 길이이며; L4는 5개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1은 14개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 2개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 14개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 2개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1 및 L3 각각은 서열 EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO: 296)를 포함하며, L2 및 L4 각각은 서열 GG를 포함한다. 일부 구현예에서, L1은 7개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 1개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 2개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GQPKAAP(SEQ ID NO: 297)를 포함하며; L2는 서열 TKGPS(SEQ ID NO: 298)를 포함하며; L3은 세린 잔기를 포함하며; L4는 서열 RT를 포함한다. 일부 구현예에서, L1은 10개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 10개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 0개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 0개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1 및 L2 각각은 서열 GGSGSSGSGG(SEQ ID NO: 299)를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 I 및/또는 화학식 II의 폴리펩티드의 가변 도메인의 하나 또는 둘 다는 인간, 인간화된, 또는 마우스 가변 도메인이다.
일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하는 2개의 경쇄:
[화학식 III]
VL1-L5-VL2-L6-CL
및 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다:
[화학식 IV]
VH1-L7-VH2-L8-CH1-힌지-CH2-CH3
식 중,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L5, L6, L7, 및 L8은 아미노산 링커이며; VH1 및 VL1 도메인은 VH1/VL1 결합 쌍을 형성하며, VH2 및 VL2 도메인은 VH2/VL2 결합 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, L5, L6, L7, 및 L8은 각각 0개 내지 50개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L5, L6, L7, 및 L8은 각각 0개 내지 25개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L5, L6, L7, 및 L8은 각각 0개 내지 14개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L5 및 L7 링커는 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 294)의 아미노산 서열을 포함하며, L6 및 L8 링커는 각각 0개 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 화학식 III 및/또는 화학식 IV의 폴리펩티드의 가변 도메인의 하나 또는 둘 다는 인간, 인간화된, 또는 마우스 가변 도메인이다.
임의의 상기 구현예의 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 인간 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 약 1 μM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 인간 및 마우스 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 베타-디스트로글리칸에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 서열 SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD(SEQ ID NO: 290)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 서열 SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV(SEQ ID NO: 291)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 알파-디스트로글리칸에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 약 1 μM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 마우스 및 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 4, 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5, 또는 둘 다를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 4 및 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 서열 VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 300)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 서열 Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 301)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 서열 ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 292)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 서열 ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 293)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구현예에서, VH1 도메인은 SEQ ID NO: 1~8로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 9~17로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 18~27로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL1 도메인은 SEQ ID NO: 28~37로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38~42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 43~50으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 및 188로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL1 도메인은 SEQ ID NO: 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 및 189로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 SEQ ID NO: 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 및 248로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL1 도메인은 SEQ ID NO: 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 및 249로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 51~55 및 81~95로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 56~60 및 96~110으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 61~65 및 111~125로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL2 도메인은 SEQ ID NO: 66~70 및 126~140으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38, 71~75, 및 141~154로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 76~80 및 155~169로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 및 228로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 및 229로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 및 288로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
임의의 상기 구현예의 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2에 결합하며, VH2/VL2 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 인간 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 약 1 μM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 인간 및 마우스 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 베타-디스트로글리칸에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 서열 SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD(SEQ ID NO: 290)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 서열 SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV(SEQ ID NO: 291)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 알파-디스트로글리칸에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 약 1 μM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 마우스 및 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 4, 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5, 또는 둘 다를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 4 및 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 서열 VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 300)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 서열 Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 301)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 서열 ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 292)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 서열 ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 293)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 1~8로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 9~17로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 18~27로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL2 도메인은 SEQ ID NO: 28~37로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38~42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 43~50으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 및 188로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 및 189로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 및 248로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 및 249로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 SEQ ID NO: 51~55 및 81~95로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 56~60 및 96~110으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 61~65 및 111~125로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL1 도메인은 SEQ ID NO: 66~70 및 126~140으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38, 71~75, 및 141~154로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 76~80 및 155~169로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 및 228로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 및 229로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 및 288로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
일 구현예에서, 본 발명은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자의 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 벡터 시스템을 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 이중특이적 결합 분자를 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) 숙주 세포가 이중특이적 결합 분자를 발현하도록 하는 조건 하에 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 b) 숙주 세포로부터 이중특이적 결합 분자를 단리하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 a) 숙주 세포가 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 단일특이적 결합 단백질의 일부로서 제1 폴리펩티드 사슬을 발현하도록 하는 조건 하에 제1 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계; b) 숙주 세포가 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 단일특이적 결합 단백질의 일부로서 제2 폴리펩티드 사슬을 발현하도록 하는 조건 하에 제2 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; c) 제1 숙주 세포로부터 제1 단일특이적 결합 단백질을 단리하는 단계; d) 제2 숙주 세포로부터 제2 단일특이적 결합 단백질을 단리하는 단계; e) 힌지 영역 내 시스테인이 디설피드 결합 이성화를 거치도록 하기 충분한 환원 조건 하에 단리된 제1 및 제2 단일특이적 결합 단백질을 인큐베이션하는 단계; 및 f) 이중특이적 결합 단백질을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 CH3 도메인은 상이하고 상기 제1 및 제2 CH3 도메인 간 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 도메인의 각각의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 개체에서 라미닌-2 및 디스트로글리칸의 세포외 부분 간 결합을 제공하는 방법을 제공하며, 이 방법은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 알파-디스트로글리칸의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체에서 발현되는 알파-디스트로글리칸은 손상되거나 비정상적인 O-글리코실화를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 디스트로글리칸(DAG1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-1(POMT1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-2(POMT2), 단백질 O-결합 만노스 베타1,2-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 1(POMGNT1), 단백질 O-결합 만노스 베타1,4-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 2(POMGNT2), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 1(LARGE1), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 2(LARGE2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 1(DPM1), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 2(DPM2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 3(DPM3), 푸쿠틴, 푸쿠틴 관련 단백질(FKRP), 이스프레노이드 합성효소 도메인 함유(ISPD), 단백질 O-만노스 키나제(POMK), 베타-1,3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 2(B3GALNT2), 베타-1,4-글루쿠로닐트랜스퍼라제 1(B4GAT1), 돌리콜 키나제(DOLK), 막통과 단백질 5(TMEM5), 및 GDP-만노스 피로포스포릴라제 B(GMPPB)로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 정맥내 주입을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 근육내, 복강내, 또는 피하 주사를 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일 구현예에서, 본 발명은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 임의의 하나의 상기 구현예에 따른 이중특이적 결합 분자 및 개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 개체는 알파-디스트로글리칸의 감소된 발현을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체에서 발현되는 알파-디스트로글리칸은 손상되거나 비정상적인 O-글리코실화를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 디스트로글리칸(DAG1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-1(POMT1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-2(POMT2), 단백질 O-결합 만노스 베타1,2-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 1(POMGNT1), 단백질 O-결합 만노스 베타1,4-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 2(POMGNT2), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 1(LARGE1), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 2(LARGE2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 1(DPM1), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 2(DPM2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 3(DPM3), 푸쿠틴, 푸쿠틴 관련 단백질(FKRP), 이스프레노이드 합성효소 도메인 함유(ISPD), 단백질 O-만노스 키나제(POMK), 베타-1,3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 2(B3GALNT2), 베타-1,4-글루쿠로닐트랜스퍼라제 1(B4GAT1), 돌리콜 키나제(DOLK), 막통과 단백질 5(TMEM5), 및 GDP-만노스 피로포스포릴라제 B(GMPPB)로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 돌연변이를 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
본 발명의 구체적 구현예는 소정 구현예의 하기의 더욱 상세한 설명 및 청구범위로부터 자명해질 것이다.
본원에 기재된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부, 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 구현예를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 이러한 양태 및 다른 양태는 당업자에게 명확해질 것이다.
도 1a 및 1b는 디스트로핀 연합 당단백질 복합체의 일반 단백질 상호작용 및 기능을 나타낸다. 알파-디스트로글리칸의 뮤신-유사 도메인에서의 O-결합 글리칸은 근육 내 라미닌-2를 포함하는 몇몇 리간드에 대한 수용체로서 작용한다. 도 1a는 디스트로글리칸이 보통 O-글리코실화되는, 디스트로핀 연합 당단백질 복합체를 나타낸다. 도 1b는 O-글리코실화 알파-디스트로글리칸과 상호작용하는 기저층 내 라미닌-2를 나타낸다. 베타-디스트로글리칸은 디스트로핀과 상호작용하며, 이는 다시 세포막 내부의 필라멘트성 액틴과 연합된다.
도 1c는 알파-디스트로글리칸병증의 병인을 나타낸다. 알파-디스트로글리칸 상 O-결합 글리코실화의 부재 시, 라미닌-2 및 알파-디스트로글리칸의 결합이 소실되어, 근육의 근육속막으로부터 기저층의 탈착을 일으키고 운동 중 막 손상 및 근디스트로피를 야기한다.
도 1d 및 1e는 알파-디스트로글리칸병증을 치료하기 위해 다중특이적 또는 이중특이적 항체를 이용하는 전략을 나타낸다. 이중특이적 및 다중특이적 항체는 하나 이상의 암(arm)으로 라미닌-2를 특이적으로 인식하고 이에 결합하며 하나 이상의 다른 암으로 알파-디스트로글리칸(도 1d) 또는 베타-디스트로글리칸(도 1e)을 특이적으로 인식하고 이에 결합하여, 알파-디스트로글리칸병증을 치료하기 위한 라미닌-2 및 디스트로글리칸 간 결합을 복구한다.
도 2a는 인간 및 마우스 라미닌 구형(LG)-4/5 도메인의 서열 정렬을 나타낸다. 인간 및 마우스 LG-5의 단백질 서열은 88% 동일성과 함께, 유의미한 상동성을 갖는다. 인간 및 쥣과 라미닌-2의 알파-2 서브유닛에서 박스표시한 서열을 단백질 발현 및 항체 생성을 위해 사용하였다. SEQ ID NO: 305(상부) 및 300(하부)을 나타낸다. 도 2b는 인간 및 마우스 베타-디스트로글리칸(DG) 세포외 도메인의 서열 정렬을 나타낸다. 인간 및 마우스 베타-DG 세포외 도메인의 단백질 서열은 88.4% 동일성과 함께 상동성을 갖는다. 인간 및 쥣과 베타-DG에서 박스표시한 서열을 단백질 발현 및 항체 생성을 위해 사용하였다. SEQ ID NO: 303(상부) 및 304(하부)를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 인간(도 3a) 및 마우스(도 3b) LG-4/5에 대한 하이브리도마 클론 C21 결합으로부터 유도되는 항-라미닌-2 항체의 표면 플라즈몬 공명(Biacore; GE Healthcare) 동력학 검정 데이터를 나타낸다.
도 3c는 HEK293 세포 상에서 발현되는 인간 및 마우스 LG-4/5에 대한 하이브리도마 클론 C21 결합으로부터 유도되는 항-라미닌-2 항체의 형광 활성화 세포 정렬(FACS) 분석을 나타낸다.
도 3d는 니트로셀룰로스 상에 도트화한 후 하이브리도마 클론 C21로부터 유도되는 항-라미닌-2 항체로 탐침분석된 다양한 양의 재조합 인간 라미닌-2, 쥣과 LG-5(mLG5), 인간 LG-5(hLG5), 및 인간 LG-4/5(hLG4/LG5)의 도트 블롯을 나타낸다. C2C12 세포 용해물에서 라미닌-2의 양은 검출 한계 미만이었다.
도 3e 및 3f는 인간(도 3f) 및 마우스(도 3g) LG-4/5에 대한 하이브리도마 클론 C3 결합으로부터 유도되는 항-라미닌-2 항체의 표면 플라즈몬 공명(Biacore; GE Healthcare) 동력학 검정 데이터를 나타낸다.
도 3g는 HEK293 세포 상에서 발현되는 인간 및 마우스 LG-4/5에 대한 하이브리도마 클론 C3 결합으로부터 유도되는 항-라미닌-2 항체의 형광 활성화 세포 정렬(FACS) 분석을 나타낸다.
도 3h는 니트로셀룰로스 상에 도트화한 후 하이브리도마 클론 C3으로부터 유도되는 항-라미닌-2 항체로 탐침분석된 다양한 양의 재조합 인간 라미닌-2(Hu 211), 쥣과 LG-5(mLG5), 인간 LG-5(hLG5), 및 인간 LG-4/5(hLG4/LG5)의 도트 블롯을 나타낸다. C2C12 세포 용해물에서 라미닌-2의 양은 검출 한계 미만이었다.
도 3i 및 3j는 인간(도 3i) 및 마우스(도 3j) 베타-DG에 대한 하이브리도마 클론 AS30 결합으로부터 유도되는 항-베타-DG 항체의 표면 플라즈몬 공명(Biacore; GE Healthcare) 동력학 검정 데이터를 나타낸다.
도 3k는 니트로셀룰로스 상에 도트화된 후 하이브리도마 클론 AS30으로부터 유도되는 항-베타-DG 항체로 탐침분석된 다양한 양의 재조합 쥣과 베타-DG ECD(m βDG), 인간 베타-DG ECD(Hu βDG), 또는 재조합 디스트로글리칸(rhDG)의 도트 블롯을 나타낸다. C2C12 세포 용해물 및 앞정강근 세포 용해물(TA 용해물) 중 βDG의 양은 검출 한계 미만이었다. 파브라자임(Fabrazyme, 아갈시다제(agalsidase) 베타, Genzyme)을 음성 대조군으로 사용하였다.
도 3l은 하이브리도마 클론 AS30으로부터 유도되는 항-베타-DG 항체를 사용하는 C2C12 세포 용해물로부터 베타-DG의 면역침전을 통해 생성된 샘플의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 첫 번째 레인은 양성 대조군을 나타내며, 두 번째 레인은 파지 디스플레이 클론 B06(βDG에 대해 낮은 친화도를 가지며, 이에 따라 βDG 및 알파-DG가 최소 풀다운됨)으로부터 유도된 항-베타-DG 항체로 탐침분석된 면역침전 샘플을 나타내고, 세 번째 레인은 하이브리도마 클론 AS30으로부터 유도된 고친화도 항-베타-DG 항체로 탐침분석된 면역침전 샘플(풍부한 βDG 및 알파-DG가 면역침전됨)을 나타낸다.
도 3m 및 3n은 인간(도 3m) 및 마우스(도 3n) 베타-DG에 대한 하이브리도마 클론 AS19 결합으로부터 유도되는 항-베타-DG 항체의 표면 플라즈몬 공명(Biacore; GE Healthcare) 동력학 검정 데이터를 나타낸다.
도 3o는 니트로셀룰로스 상에 도트화된 후 하이브리도마 클론 AS19로부터 유도되는 항-베타-DG 항체로 탐침분석된 다양한 양의 재조합 쥣과 베타-DG ECD, 인간 베타-DG ECD, 또는 재조합 디스트로글리칸의 도트 블롯을 나타낸다. C2C12 세포 용해물, 앞정강근 세포 용해물(TA 용해물). 파브라자임(Fabrazyme, 아갈시다제(agalsidase) 베타, Genzyme)을 음성 대조군으로 사용하였다.
도 3p는 하이브리도마 클론 AS19로부터 유도되는 항-베타-DG 항체를 사용하는 C2C12 세포 용해물로부터 베타-DG의 면역침전을 통해 생성된 샘플의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 첫 번째 레인은 양성 대조군을 나타내며, 두 번째 레인은 파지 디스플레이 클론 B06(βDG에 대해 낮은 친화도를 가지며, 이에 따라 βDG 및 알파-DG가 최소 풀다운됨)으로부터 유도된 항-베타-DG 항체로 탐침분석된 면역침전 샘플을 나타내고, 세 번째 레인은 하이브리도마 클론 AS19로부터 유도된 항-베타-DG 항체로 탐침분석된 면역침전 샘플을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 하이브리도마 클론 C21(도 4a) 및 C3(도 4b)으로부터 유도된 항-라미닌-2 항체로 염색된 후 형광 표지된 항-마우스 IgG 이차 항체로 검출된 미고정 냉동 인간 및 마우스 근육 조직 섹션을 나타낸다. 이차 항체 단독으로는 어떠한 염색도 드러내지 않았다(미도시).
도 4c 및 4d는 하이브리도마 클론 AS30(도 4c) 및 AS19(도 4d)로부터 유도된 항-베타-DG 항체로 염색된 후 형광 표지된 항-마우스 IgG 이차 항체로 검출된 미고정 냉동 인간 및 마우스 근육 조직 섹션을 나타낸다. 이차 항체 단독으로는 어떠한 염색도 드러내지 않았다(미도시).
도 5a는 일부 구현예에 따른, 베타-DG 및 라미닌-2에 특이적인 4가 이중특이적 일렬 IgG 형식 항체(TBTI 항체)의 도식적 설계를 나타낸다.
도 5b는 일부 구현예에 따른, 베타-DG 및 라미닌-2에 특이적인 교차 이중 가변 도메인 IgG 형식(CODV) 이중특이적 항체에 대한 도식적 설계를 나타낸다.
도 6a 및 6b는 인간 LG-4/5 및 인간 베타-DG(도 6a)에 대한 또는 쥣과 LG-4/5 및 쥣과 베타-DG(도 6b)에 대한 모체 모노클로날 항체(AS19, C3, 및 C21)에 대한 및 이중특이적 항체(T1T2, C5C6, 및 T5T6)에 대한 순차적 표면 플라즈몬 공명(Biacore; GE Healthcare) 결합 분석 데이터를 나타낸다.
도 7은 이중특이적 항체에 대한 LG-4/5 및 베타-DG의 동시적 결합에 대한 이중 덱 샌드위치 ELISA 결과를 나타낸다. 베타-DG가 첨가된 모체 모노클로날 항체(AS19, C3, 및 C21) 및 베타-DG가 첨가되거나 첨가되지 않은 이중특이적 항체(T1T2, C5C6, 또는 T5T6)가 결합에 대해 검정되었다. 이중특이적 항체 T1T2, T5T6, 및 C5C6만 LG-4/5 및 베타-DG에 대한 유의미한 결합을 동시에 나타내었다.
도 8a 및 8b는 모체 모노클로날 항체(AS19, C3, 및 C21) 또는 이중특이적 항체(T1T2, C5C6, 또는 T5T6)로 염색되고 형광 표지된 항-마우스 IgG 이차 항체로 검출된 야생형 쥣과 근육 조직(도 8a) 또는 LARGEmyd-3J/GrsrJ 쥣과 근육 조직(도 8b)의 미고정 냉동 섹션을 나타낸다.
도 8c는 운동-유도 근육 손상에 대한 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위한 이중특이적 근육내 주사 연구 계획을 개략한다. 이중특이적 항체를 실험 1일 및 4일차에 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스의 앞정강(TA) 근육 내로 근육내 주사하였다. 근섬유 손상을 추적하기 위해 5일차에 에반스 블루(Evans blue) 염료(EB)를 주사하였다. 마우스는 강제 트레드밀 운동을 시키고 6일차에 희생시켰다.
도 8d는 이중특이적 항체 T1T2 대 모체 모노클로날 항체 혼합물(AS19 및 C3)로의 처리에 대한 에반스 블루 양성(즉, 손상된) 근섬유의 평균 수를 나타낸다. 대조군 모체 항체 처리에 비해 이중특이적 항체 처리로 더 적은 손상이 나타났다.
도 8e는 이중특이적 항체 T1T2 또는 모체 모노클로날 항체 혼합물(AS19 및 C3)로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스의 염색된 근육 조직을 나타낸다. 에반스 블루 염료로의 염색(화살표)은 이중특이적 항체 T1T2로의 처리에 비해 모체 모노클로날 항체로 처리된 조직에서 훨씬 더 뚜렷하다. 형광 이차 항체를 사용한 이중특이적 항체 T1T2 또는 모체 모노클로날 항체 혼합물(AS19 및 C3)의 염색을 나타낸다.
도 8f는 전신 전달 후 이중특이적 항체 T1T2(꼬리 정맥 주사 또는 복강내로 투여됨) 및 하이브리도마 클론 AS19 또는 C3으로부터 유도된 모체 항체의 약동학 및 생체분포를 나타낸다. 이중특이적 항체는 투여한 지 4일 후 혈중에서 여전히 검출 가능하다.
도 9a 내지 9c는 야생형 마우스(아래를 향하는 삼각형), 대조군 모노클로날 모체 항체로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스(위를 향하는 삼각형), 및 이중특이적 항체-처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스(사각형)의 거동 평가를 나타낸다. 도 9a는 미처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 대비 이중특이적 항체-처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스가 그립 강도 평가에서 개선을 나타냈음을 보여준다. 도 9b는 미처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 대비 이중특이적 항체-처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스가 와이어 행 평가에서 개선을 나타냈음을 보여준다. 도 9c는 미처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 대비 이중특이적 항체-처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스가 구보 시간 평가에서 개선을 나타냈음을 보여준다.
도 9d는 미처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 대비 이중특이적 항체-처리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스가 감소된 크레아틴 키나제 수준을 가졌음을 나타내어, 더 적은 근육 손상을 제시한다.
도 10은 이중특이적 항체 T1T2(1군 T1T2) 대 모체 모노클로날 항체 AS19 및 C3의 혼합물(2군 대조군)로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스로부터의 조직에서 에반스 블루 양성(즉, 손상된) 근섬유의 평균 수를 나타낸다. 야생형 미처리 마우스(3군 WT)가 대조군으로 사용되었다. LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에서 대조군 모체 항체 처리에 비해 이중특이적 항체 T1T2 처리로 더 적은 손상이 나타났다.
도 11은 이중특이적 항체 T1T2, 모체 모노클로날 항체 AS19 또는 C3, 또는 음성 대조군으로의 PBS의 주사로부터 4일 후 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 조직의 면역형광 염색을 나타낸다. 슬라이드를 세척하고, DAPI(Vector Labs) 함유 Vectashield 실장 배지를 사용하여 실장하였다. IV: 정맥내 주사; IP: 복강내 주사.
도 12a는 항원 인간 베타-DG에 결합된 AS30 Fab의 전체 구조를 나타내며, 항원은 중쇄 및 경쇄 사이에 나타낸다. 도 12b는 AS30 Fab의 CDR 및 항원 베타-DG 간 상호작용의 클로즈업 도면을 나타낸다. 상호작용에 관여된 잔기를 막대로 나타낸다; CDR 내 화살표는 N-말단에서 C-말단으로의 배향을 나타낸다.
도 12c는 항원 인간 라미닌-2 LG-5 도메인에 결합된 C21 Fab의 전체 구조를 나타내며, 항원은 중쇄 및 경쇄 사이에 나타낸다. 도 12d는 C21 Fab의 CDR 및 항원 라미닌-2 LG-5 도메인 간 상호작용의 클로즈업 도면을 나타낸다. 상호작용에 관여된 잔기를 막대로 나타낸다; CDR 내 화살표는 N-말단에서 C-말단으로의 배향을 나타낸다.
도 13은 일부 구현예에 따른, 라미닌-2 또는 베타-DG에 결합하기 위한 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 3가 결합 단백질(triAb)의 모식도를 나타낸다.
도 14a 및 14b는 인간 LG4/5 또는 베타-DG에 대한 triAb 결합을 조사하는 이중 결합 샌드위치 ELISA 검정 결과를 나타낸다. 도 14a에서, 플레이트를 바이오틴화 N'Avi-HPC4-인간 LG4/5로 코팅하고, 인간 베타-DG에 대한 결합을 검출하였다. 도 14b에서, 플레이트를 인간-베타 DG-HPC4-Avi-C'으로 코팅하고, 인간 LG4/5에 대한 결합이 검출되었다.
도 14c는 triAb 3407, 3437, 또는 3439의 인간 LG4/5에 대한, 이어서 인간 베타-DG에 대한 순차 결합을 나타낸다. 대조적으로, 1가 항-LG4/5 항체 C3_Hu11, C21_Hu11, C21_Hu21, 및 C3_Hu10만 LG4/5에 결합한 반면, 1가 항-베타-DG 항체 AS30_Hu6만 베타-DG에 결합하였고, 음성 대조군 triAb는 결합을 나타내지 않았다.
도 15는 그립 강도 검정을 사용하여 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에서의 근육 기능에 대한 triAb 3407, 3437, 또는 3439로의 처리 효과를 나타낸다. 나타낸 triAb로의 투여를 식염수 또는 음성 대조군 triAb의 투여와 비교하였다. 검정에서 야생형 마우스의 수행을 또한 측정하였다.
도 16은 와이어 행 검정을 사용하여 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에서의 근육 기능에 대한 triAb 3407, 3437, 또는 3439로의 처리 효과를 나타낸다. 나타낸 triAb로의 투여를 식염수 또는 음성 대조군 triAb의 투여와 비교하였다. 검정에서 야생형 마우스의 수행을 또한 측정하였다.
도 17은 트레드밀 검정을 사용하여 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에서의 근육 기능에 대한 triAb 3407, 3437, 또는 3439로의 처리 효과를 나타낸다. 나타낸 triAb로의 투여를 식염수 또는 음성 대조군 triAb의 투여와 비교하였다. 검정에서 야생형 마우스의 수행을 또한 측정하였다.
본 발명은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 및 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 이중특이적이며 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 다중특이적이며 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인, 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인, 및 하나 이상의 추가 표적에 결합하는 하나 이상의 추가 결합 도메인을 포함한다. 본 발명은 디스트로글리칸 및 라미닌-2에 동시에 결합하고 생체내 모델 시스템에서 알파-디스트로글리칸병증의 증상을 완화할 수 있는 다중특이적/이중특이적 결합 분자의 여러 구성을 제공한다.
하기 설명은 예시적인 방법, 파라미터 등을 나타낸다. 그러나, 그러한 설명은 본 발명의 범주에 대한 제한으로서 의도되는 대신, 예시적인 구현예의 설명으로서 제공됨이 인지되어야 한다.
정의
본 발명에 따라 이용되는 바와 같이, 하기 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해된다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다.
본원에서 사용되는 "항원" 또는 "표적 항원" 또는 "항원 표적"이라는 용어는 결합 단백질이 결합할 수 있고, 추가로, 동물에서 사용되어 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 나타낸다. 표적 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 결합 단백질에 의해 인식되는 각각의 표적 항원과 관련하여, 결합 단백질은 표적 항원을 인식하는 온전한 항체와 경쟁할 수 있다. 본원에서 기재되는 예시적인 표적 항원은 디스트로글리칸(예컨대, 이의 세포외 부분) 및 라미닌-2를 포함한다.
"에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자, 예를 들어 폴리펩티드 결정인자를 포함한다. 소정 구현예에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기, 또는 설포닐기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그루핑을 포함하며, 소정 구현예에서, 특정 3-차원 구조 특징, 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 항체 또는 결합 단백질이 결합하는 항원의 영역이다. 소정 구현예에서, 결합 단백질은, 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 중 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 언급된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 평형 해리 상수가 ≤ 10-6 M일 때, 예를 들어 평형 해리 상수가 ≤ 10-9 M일 때, 그리고 예를 들어 해리 상수가 ≤ 10-10 M일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 언급된다.
결합 단백질의 해리 상수(KD)는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 표면 플라스몬 공명 분석에서는 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ)을 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 리간드(바이오센서 매트릭스 상의 표적 항원)와 피분석물(용액 중 결합 단백질) 사이의 실시간 결합 상호작용을 측정한다. 표면 플라스몬 분석은 또한 피분석물(바이오센서 매트릭스 상의 결합 단백질)의 고정 및 리간드(표적 항원)의 제시에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 "KD"라는 용어는 특정 결합 단백질과 표적 항원 사이의 상호작용의 해리 상수를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "특이적으로 결합하다"라는 용어는 적어도 약 1 × 10-6 M, 1 × 10-7 M, 1 × 10-8 M, 1 × 10-9 M, 1 × 10-10 M, 1 × 10-11 M, 1 × 10-12 M의 이상의 KD로 에피토프 함유 항원에 결합하고/하거나, 비특이적 항원에 대한 친화도보다 적어도 2배 더 큰 친화도로 에피토프에 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편의 능력을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "결합 단백질"이라는 용어는 적어도 하나의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 비-천연 발생(재조합 또는 조작) 분자를 나타낸다.
"단일특이적 결합 단백질"이라는 용어는 하나의 항원 표적에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 나타낸다.
"1가 결합 단백질"이라는 용어는 하나의 항원 결합 부위를 갖는 결합 단백질을 나타낸다.
"이중특이적 결합 단백질"이라는 용어는 2개의 상이한 항원 표적에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 나타낸다. 이중특이적 또는 이중작용 항체는 전형적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위 또는 에피토프를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 비제한적으로 하이브리도마의 융합 또는 F(ab') 단편의 연결을 포함하는 다양하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
"2가 결합 단백질"이라는 용어는 2개의 결합 부위 또는 도메인을 갖는 결합 단백질을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 중합체를 나타낸다. 소정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 그러한 변형은 염기 변형체, 예컨대 브로모우리딘, 리보스 변형체, 예컨대 아라비노시드 및 2',3'-디데옥시리보스, 및 뉴클레오티드간 결합 변형체, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다. "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 구체적으로 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.
"단리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부의 조합으로서, 이는 (1) 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드 전부와 또는 이의 일부분과 연합되지 않거나, (2) 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 (3) 자연에서는 더 큰 서열의 일부로서 존재하지 않는다.
"단리된 폴리펩티드"는 (1) 보통 함께 발견될 다른 폴리펩티드의 적어도 일부가 부재하는 것, (2) 동일한 공급원으로부터의, 예를 들어, 동일한 종으로부터의 다른 폴리펩티드가 본질적으로 부재하는 것, (3) 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되는 것, (4) 자연에서 함께 연합되는 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리된 것, (5) 자연에서는 "단리된 폴리펩티드"가 함께 연합되어 있는 폴리펩티드의 일부분과(공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 연합되어 있지 않은 것, (6) 자연에서는 연합되어 있지 않은 폴리펩티드와(공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동 가능하게 연합된 것, 또는 (7) 자연에서 존재하지 않는 것이다. 그러한 단리된 폴리펩티드는 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 기타 RNA(합성 기원의 것), 또는 이의 임의의 조합에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리펩티드에는 그 사용(치료적, 진단적, 예방적, 연구 또는 기타)을 방해할 그의 천연 환경에서 발견되는 폴리펩티드 또는 기타 오염물질이 실질적으로 부재한다.
천연 발생 항체는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 그러한 사량체는 전형적으로 동일한 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지며, 각 쌍은 하나의 전장 "경쇄"(전형적으로, 분자량이 약 25 kDa임)와 하나의 전장 "중쇄"(전형적으로, 분자량이 약 50 내지 70 kDa임)를 갖는다. 본원에서 사용되는 "중쇄" 및 "경쇄"라는 용어는 표적 항원에 대한 특이성을 부여하기에 충분한 가변 도메인 서열을 갖는 임의의 면역글로불린 폴리펩티드를 나타낸다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노 말단 부분은 전형적으로 항원 인식에 관여되는 전형적으로 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 도메인을 포함한다. 각 사슬의 카복시 말단 부분은 전형적으로 효과기 기능에 관여되는 불변 도메인을 정의한다. 따라서, 천연 발생 항체에서, 전장 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드는 하나의 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 포함하며, 여기서 VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고, CH3 도메인은 카복시 말단에 있으며, 전장 경쇄 면역글로불린 폴리펩티드는 하나의 가변 도메인(VL) 및 하나의 불변 도메인(CL)을 포함하고, 여기서 VL 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있으며, CL 도메인은 카복시 말단에 있다.
인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류되며, 인간 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. IgG는 비제한적으로 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하는 몇몇 하위클래스(subclass)를 갖는다. IgM은 비제한적으로 IgM1 및 IgM2를 포함하는 하위클래스를 갖는다. 이와 유사하게, IgA는 비제한적으로 IgA1 및 IgA2를 포함하는 하위클래스로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 도메인은 전형적으로 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 이때 중쇄는 또한 약 10개 초과의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들어, 그 전체내용이 모든 목적을 위하여 참조로 포함되는 문헌[Fundamental Immunology(Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989)]을 참고한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다. 전형적으로 천연 발생 항체의 가변 도메인은 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 칭해지는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 이는 특이적 에피토프에의 결합을 가능하게 할 수 있다. 아미노 말단으로부터 카복실 말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다.
"CDR 세트"라는 용어는 항원과 결합할 수 있는 단일 가변 영역에 존재하는 3개의 CDR의 군을 나타낸다. 이러한 CDR의 정확한 경계부는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. Kabat(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)])에 의해 기재된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용 가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계부도 제공한다. 이러한 CDR은 Kabat CDR로 칭해질 수 있다. Chothia 및 공동 연구자(문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83])는 Kabat CDR 내의 소정 하위부분이, 아미노산 서열 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고, 거의 동일한 펩티드 골격 입체형태를 채택함을 확인하였다. 이러한 하위부분은 L1, L2, 및 L3 또는 H1, H2, 및 H3으로 표기되었으며, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 영역 및 중쇄 영역을 표기한다. 이러한 영역은 Kabat CDR과 중첩되는 경계부를 갖는, Chothia CDR로 칭해질 수 있다. Kabat CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계부는 문헌[Padlan, 1995, FASEB J. 9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol. 262(5): 732-45; 및 Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77]에 기재되었다. 또 다른 CDR 경계부 정의는 본원의 시스템 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수도 있지만, 그럼에도 불구하고, 특정 잔기 또는 잔기 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의미하게 영향을 주지 않는다는 실험적인 발견 또는 예측을 고려하여 짧아지거나 길어질 수 있기는 해도 Kabat CDR과 중첩될 것이다. 본원에서 사용되는 방법에서는 이러한 시스템들 중 임의의 것에 따라 정의되는 CDR을 이용할 수 있지만, 소정 구현예에서 Kabat 또는 Chothia 정의된 CDR을 사용한다. 아미노산 서열을 사용한 예측 CDR의 확인은 당분야에서, 예컨대 문헌[Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains," In Antibody Engineering, Vol. 2. Kontermann R., S., eds. Springer-Verlag, Berlin, p. 33-51 (2010)]에 잘 알려져 있다. 또한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 다른 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열과의 비교에 의해 CDR의 서열을 확인하여 서열 초가변 영역을 결정하도록 점검될 수 있다. 넘버링된 서열들은 육안으로, 또는 정렬 프로그램, 예컨대 CLUSTAL 스위트(suite) 프로그램 중 하나의 이용에 의해 문헌[Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80]에 기재된 바와 같이 정렬될 수 있다. 통상적으로 분자 모델이 사용되어 프레임워크 및 CDR 영역을 정확하게 묘사하고 그에 따라 서열-기반 배치를 보정한다.
본원에서 사용되는 "Fc"라는 용어는 단량체 형태이든지 다량체 형태이든지 간에, 항체의 소화로부터 생성되거나 다른 수단에 의해 생성된 항원-비결합 단편의 서열을 포함하는 분자를 나타내며, 힌지 영역을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 천연 Fc의 본래의 면역글로불린 공급원은 인간 기원이며, 임의의 면역글로불린, 예를 들어 IgG1 및 IgG2일 수 있다. Fc 분자는 공유(즉, 디설피드 결합) 및 비-공유 연합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체 폴리펩티드로 이루어진다. 천연 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 디설피드 결합의 수는 클래스(예컨대, IgG, IgA, 및 IgE) 또는 하위클래스(예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, 및 IgGA2)에 따라 1개 내지 4개의 범위이다. Fc의 한 예로는 IgG의 파파인 소화로부터 생성되는 디설피드-결합된 이량체가 있다. 본원에서 사용되는 "Fc"라는 용어는 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 총칭이다.
F(ab) 단편은 전형적으로 하나의 경쇄와, 하나의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인을 포함하며, 여기서 F(ab) 단편의 VH-CH1 중쇄 부분은 또 다른 중쇄 폴리펩티드와 디설피드 결합을 형성할 수 없다. 본원에서 사용되는 F(ab) 단편은 또한 아미노산 링커에 의해 분리된 2개의 가변 도메인을 함유하는 하나의 경쇄와, 아미노산 링커에 의해 분리된 2개의 가변 도메인 및 CH1 도메인을 함유하는 하나의 중쇄를 포함할 수 있다.
F(ab') 단편은 전형적으로 하나의 경쇄와, (CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에) 더 많은 불변 영역을 함유하는 하나의 중쇄의 일부분을 포함하여, 사슬간 디설피드 결합이 2개의 중쇄 사이에서 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"재조합" 분자는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 것이다.
본 발명의 일 구현예는 1개 내지 3개의 표적 항원에 대한 생물학적 및 면역학적 특이성을 갖는 결합 단백질을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 그러한 결합 단백질을 형성하는 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 그러한 결합 단백질을 형성하는 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 그러한 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포(즉, 그러한 결합 단백질을 형성하는 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 분자 또는 벡터를 포함함)를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "스와프 능력(swapability)"이라는 용어는 결합 단백질 포맷 내에서의 가변 도메인들의 호환성(interchangeability)을 나타내며, 이때 폴딩 및 궁극적 결합 친화도는 유지된다. "전 스와프 능력(full swapability)"은 화학식 I의 폴리펩티드 사슬 또는 화학식 II의 폴리펩티드 사슬에서, 결합 친화도의 유지에 의해 입증되는 바와 같이 결합 단백질의 전체 기능성(full functionality)을 유지하면서, VH1 및 VH2 도메인 둘 다의 순서, 및 그에 따라 VL1 및 VL2 도메인의 순서를 스와프하는(즉, 상기 순서가 반대가 되도록) 능력을 나타낸다. 더욱이, VH 및 VL이라는 표기는 최종 포맷의 특정 단백질 사슬 상에서의 상기 도메인의 위치만을 나타낸다는 것이 주지되어야 한다. 예를 들어, VH1 및 VH2는 모 항체에서의 VL1 및 VL2 도메인으로부터 유래되고 결합 단백질에서의 VH1 및 VH2 위치에 배치될 수 있다. 이와 마찬가지로, VL1 및 VL2는 모 항체에서의 VH1 및 VH2 도메인으로부터 유래되고 결합 단백질에서의 VH1 및 VH2 위치에 배치될 수 있다. 따라서, VH 및 VL이라는 표기는 현재의 위치를 나타내며, 모 항체에서의 본래의 위치를 나타내는 것이 아니다. 따라서 VH 및 VL 도메인은 "스와프 가능하다".
"단리된" 결합 분자 또는 단백질은 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리된 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 결합 단백질의 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 분자 또는 단백질은 (1) 로우리법(Lowry method)에 의해 결정할 경우 95 중량% 초과의, 그리고 일부 구현예에서는 99 중량% 초과의 항체까지, (2) 회전 컵 서열 분석기의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue), 또는 은 염색제를 사용한 환원 또는 비환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의해 균질성까지 정제될 것이다. 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 결합 분자 또는 단백질은 재조합 세포 내에서의 원위치 분자/단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된"이라는 용어는 존재하는 주된 종인 종 또는 화합물을 나타낸다(즉, 몰 기준으로, 이것이 조성물 중의 임의의 다른 개별 종보다 풍부함). 일부 구현예에서, 실질적으로 정제된 분획은 그 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 기준으로)로 포함되는 조성물이다. 다른 구현예에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 거대몰(macromolar) 종의 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과를 포함할 것이다. 또 다른 구현예에서, 종은 본질적인 균질성까지 정제되며(오염 종이 통상적인 검출 방법에 의해 조성물에서 검출될 수 없음), 여기서 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 구성된다.
본원에서 사용되는 "벡터"라는 용어는 코딩 정보를 숙주 세포에게 전하는 데 사용되는 임의의 분자(예컨대, 핵산, 플라스미드, 또는 바이러스)를 나타낸다. "벡터"라는 용어는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 하나의 유형의 벡터로는 "플라스미드"가 있으며, 이는 추가의 DNA 분절이 삽입될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 분자를 나타낸다. 또 다른 유형의 벡터로는 바이러스 벡터가 있으며, 여기서 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 소정 벡터(예컨대, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다. 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 그에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 소정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. "플라스미드" 및 "벡터"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 그 이유는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 형태의 벡터이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터(예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 "재조합 숙주 세포"(또는 "숙주 세포")라는 어구는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 나타낸다. 재조합 숙주 세포 또는 숙주 세포는 특정한 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손도 나타내고자 한다. 소정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손이 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 그러한 세포는 여전히 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 박테리아, 효모, 바큘로바이러스 및 포유류 발현 시스템(이외에도, 파지 디스플레이 발현 시스템)을 포함하는 매우 다양한 숙주 세포 발현 시스템을 사용하여 결합 단백질을 발현시킬 수 있다. 적합한 박테리아 발현 벡터의 예로는 pUC19가 있다. 결합 단백질을 재조합적으로 발현시키기 위하여, 숙주 세포는 결합 단백질의 폴리펩티드 사슬이 숙주 세포 내에서 발현되고 숙주 세포가 배양되는 배지 내로 분비되도록, 상기 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질전환되거나 전달감염되며, 상기 배지로부터 결합 단백질이 회수될 수 있다.
본원에서 사용되는 "형질전환"이라는 용어는 세포의 유전적 특징의 변화를 나타내며, 세포는 새로운 DNA를 함유하도록 변형되었을 때 형질전환된 것이다. 예를 들어, 세포는 그의 천연 상태로부터 유전적으로 변형되었을 경우 형질전환된 것이다. 형질전환 후, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로의 물리적 통합에 의해 세포의 DNA와 재조합될 수 있거나, 복제되지 않고서 에피솜 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 또는 독립적으로 플라스미드로서 복제될 수 있다. 세포는 DNA가 세포 분열과 함께 복제될 때 안정하게 형질전환된 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 "전달감염"이라는 용어는 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 나타내며, 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입된 경우에 세포는 "전달감염"된 것이다. 다수의 전달감염 기술이 당분야에서 잘 알려져 있다. 그러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되고 대상에게 적용되는 "천연 발생"이라는 용어는 그 대상이 자연에서 발견될 수 있고 사람에 의해 조작되지 않았다는 사실을 나타낸다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 사람에 의해 의도적으로 변형된 것이 아닌 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 천연 발생한 것이다. 이와 유사하게, 본원에서 사용되는 "비-천연 발생"은 자연에서 발견되지 않거나 또는 사람에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 대상을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 20가지의 통상적인 아미노산 및 그의 약어는 통상적인 용법을 따른다. 20가지의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예컨대, D-아미노산); 비천연 아미노산 및 유사체, 예컨대 α-,α-2치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산이 또한 결합 단백질의 폴리펩티드 사슬에 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 다음을 포함한다: 4-히드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사 아미노산 및 이미노산(예컨대, 4-히드록시프롤린). 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표기법에서, 표준 용법 및 관례에 따르면 왼손 방향은 아미노 말단 방향이며, 오른손 방향은 카복실 말단 방향이다.
천연 발생 잔기는 통상적인 측쇄 특성에 따라 다음 클래스로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
(2) 극성 친수성: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;
(3) 지방족: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
(4) 지방족 소수성: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
(5) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(6) 산성: Asp, Glu;
(7) 염기성: His, Lys, Arg;
(8) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(9) 방향족: His, Trp, Tyr, Phe; 및
(10) 방향족 소수성: Phe, Trp, Tyr.
보존적 아미노산 치환에는 이들 클래스 중 하나의 구성원을 동일 클래스의 또 다른 구성원으로 대체하는 것이 관여될 수 있다. 비보존적 치환에는 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로부터의 구성원으로 대체하는 것이 관여될 수 있다.
당업자라면 잘 알려진 기술을 사용하여 결합 단백질의 폴리펩티드 사슬의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자라면 활성에 중요할 것으로는 생각되지 않는 영역의 표적화에 의해 활성을 파괴하지 않고서 변화될 수 있는 폴리펩티드 사슬의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 대안적으로, 당업자라면 유사 폴리펩티드들 사이에서 보존된 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 게다가, 심지어 생물학적 활성에 또는 구조에 중요할 수 있는 영역도 생물학적 활성을 파괴하지 않고서 또는 폴리펩티드 구조에 악영향을 주지 않고서 보존적 아미노산 치환을 거칠 수 있다.
본원에서 사용되는 "환자"("개체" 및 "대상체"라는 용어가 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있음)라는 용어는 인간 및 동물(예컨대, 비제한적으로 개, 고양이, 및 다른 가정 애완동물; 말, 소, 염소, 토끼, 물소, 및 다른 가축; 및 연구 동물, 예컨대 비-인간 영장류, 마우스 등을 포함하는 포유류) 대상체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하다"라는 용어는 치료적 처치, 예컨대, 하나 이상의 증상의 중증도 또는 존재의 감소 또는 경감을 나타낸다.
다른 구현예에서, 본원에서 사용되는 "예방하다"라는 용어는, 예를 들어, 본원에서 기재되는 병리적 질환의 발생 위험에 처한 개체에서, 하나 이상의 증상의 방지적 또는 예방적 조치, 예컨대 그 개시의 예방 또는 지연을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용되는 "약학 조성물" 또는 "치료 조성물"이라는 용어는 환자에게 적절하게 투여되는 경우, 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용 가능한 담체" 또는 "생리학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 결합 단백질의 전달을 성취하거나 향상시키기에 적합한 하나 이상의 제형화 물질을 나타낸다.
하나 이상의 결합 단백질을 포함하는 약학 조성물과 관련하여 사용될 때 "유효량" 및 "치료 유효량"이라는 용어는 원하는 치료 결과를 생성하기에 충분한 양 또는 투여량을 나타낸다. 더 구체적으로, 치료 유효량은 치료받는 질환과 연관된 임상적으로 정의된 병리적 과정 중 하나 이상을 일부 시기 동안 억제하기에 충분한 결합 단백질의 양이다. 유효량은 사용되고 있는 특정 결합 단백질에 따라 달라질 수 있으며, 또한 치료받는 환자와 관련된 다양한 요인 및 상태와 장애의 중증도에 달려 있다. 예를 들어, 결합 단백질을 생체 내에서 투여하려고 할 경우, 환자의 연령, 체중 및 건강과 같은 요인뿐만 아니라 전임상 동물 연구에서 얻어진 용량 반응 곡선 및 독성 데이터가 고려되는 요인에 속할 것이다. 주어진 약학 조성물의 유효량 또는 치료 유효량의 결정은 충분히 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명의 일 구현예는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 치료 유효량의 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
결합 분자
본 발명의 소정 양태는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 하나 이상의 결합 도메인(들) 및 라미닌-2에 결합하는 하나 이상의 결합 도메인(들)을 포함하는 다중특이적 결합 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 다중특이적 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 2개 또는 4개의 항원 결합 부위를 포함하는 2가 또는 4가 이중특이적 결합 분자이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 분자는 3개의 항원 결합 부위를 포함하는 3가 다중특이적 결합 분자이다. "결합 도메인" 및 "결합 부위"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
다중특이적 결합 단백질을 위한 다양한 포맷 및 구성이 당분야에 알려져 있고 본원에서 기재된 바와 같은 용도에 적합하다. 예시적이고 비제한적인 포맷의 설명이 아래에서 제공된다. 국제 공개 번호 WO2017/180913에 기재된 임의의 포맷 및 이의 선택적인 특징이 본원에서 기재되는 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)에서 사용될 수 있다.
다중특이적, 3가 결합 단백질
일부 구현예에서, 결합 단백질은 다중특이적 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 다중특이적 결합 단백질은 3개의 항원 결합 부위를 포함하며 종합적으로 2개 이상의 표적 항원을 표적화하는 3가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하며:
[화학식 I]
VL2-L1-VL1-L2-CL
제2 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하며:
[화학식 II]
VH1-L3-VH2-L4-CH1-힌지-CH2-CH3
제3 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하며:
[화학식 III]
VH3-CH1-힌지-CH2-CH3
제4 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함한다:
[화학식 IV]
VL3-CL
식 중,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이다.
일부 구현예에서, 화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, 총 3개의 항원 결합 부위에 있어서 VH1 및 VL1은 하나의 항원 결합 부위를 형성하며, VH2 및 VL2는 하나의 항원 결합 부위를 형성하며, VH3 및 VL3은 하나의 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 3개의 항원 결합 부위는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위 및 라미닌-2에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위(예컨대, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 하나의 항원 결합 부위 및 라미닌-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위, 또는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 2개의 항원 결합 부위 및 라미닌-2에 결합하는 하나의 항원 결합 부위)를 포함한다.
일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위는 라미닌-2의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 2개의 항원 결합 부위는 라미닌-2의 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 라미닌-2에 결합하는 제1 항원 결합 부위를 형성하며, VH2 및 VL2는 라미닌-2에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 형성하며, VH3 및 VL3은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 2개의 항원 결합 부위는 디스트로글리칸의 세포외 부분의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 2개의 항원 결합 부위는 디스트로글리칸의 세포외 부분의 동일한 또는 중첩되는 에피토프에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 항원 결합 부위를 형성하며, VH2 및 VL2는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 형성하며, VH3 및 VL3은 라미닌-2에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 형성한다.
본원에서 기재되는 임의의 항원 결합 부위는, 예컨대, 비제한적으로 상술된 화학식 I, II, III, 및/또는 IV에 따른 폴리펩티드(들)를 포함하는 결합 단백질을 포함하는 본원에서 기재되는 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)에서의 용도를 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 GFTFTDSV(SEQ ID NO: 316)의 서열을 포함하는 CDR-H1, IYPGSGNF(SEQ ID NO: 318)의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 AMRRSS(SEQ ID NO: 320)의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 QTIVHSNSKTY(SEQ ID NO: 332)의 서열을 포함하는 CDR-L1, KVS(SEQ ID NO: 334)의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 FQGSHVPLT(SEQ ID NO: 336)의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 및 VL 도메인은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 항원 결합 부위(예컨대, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 또는 VH3 및 VL3)를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 A2에 나타낸 바와 같은 항체 AS30SS_Hu6 또는 AS30SS_Hu9의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인은 인간화된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 314의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 330의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 346의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 362의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 D2에 나타낸 바와 같은 항체 AS30SS_Hu6 또는 AS30SS_Hu9의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 306의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 322의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 338의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 354의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 GFTFSSYT(SEQ ID NO: 380)의 서열을 포함하는 CDR-H1, ISSSGSNT(SEQ ID NO: 382)의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 ARFDYGSSLDS(SEQ ID NO: 384)의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 QSISNN(SEQ ID NO: 396)의 서열을 포함하는 CDR-L1, YAS(SEQ ID NO: 398)의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 QQSKSWPRT(SEQ ID NO: 400)의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 및 VL 도메인은 라미닌-2에 결합하는 항원 결합 부위(예컨대, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 또는 VH3 및 VL3)를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 A2에 나타낸 바와 같은 항체 C3_Hu10의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인은 인간화된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 378의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 394의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 D2에 나타낸 바와 같은 항체 C3_Hu10의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 370의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 386의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 GFTFSSYT(SEQ ID NO: 380)의 서열을 포함하는 CDR-H1, ISSSGSNT(SEQ ID NO: 382)의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 ARFDYGSSLDS(SEQ ID NO: 384)의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 QSIGNN(SEQ ID NO: 428)의 서열을 포함하는 CDR-L1, YAS(SEQ ID NO: 398)의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 QQSKSWPRT(SEQ ID NO: 400)의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 및 VL 도메인은 라미닌-2에 결합하는 항원 결합 부위(예컨대, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 또는 VH3 및 VL3)를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 A2에 나타낸 바와 같은 항체 C3_Hu11의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인은 인간화된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 410의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 426의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 D2에 나타낸 바와 같은 항체 C3_Hu11의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 402의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 418의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 GFTFSSYT(SEQ ID NO: 444)의 서열을 포함하는 CDR-H1, ISSSGSNT(SEQ ID NO: 446)의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 ARFDYGSSLDS(SEQ ID NO: 448)의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 QSISNY(SEQ ID NO: 460)의 서열을 포함하는 CDR-L1, YAS(SEQ ID NO: 462)의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 QQSKSWPRT(SEQ ID NO: 464)의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 및 VL 도메인은 라미닌-2에 결합하는 항원 결합 부위(예컨대, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 또는 VH3 및 VL3)를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 A2에 나타낸 바와 같은 항체 C21_Hu11의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인은 인간화된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 442의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 458의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 D2에 나타낸 바와 같은 항체 C21_Hu11의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 434의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 450의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 GFTFSSYT(SEQ ID NO: 444)의 서열을 포함하는 CDR-H1, ISSSGDNT(SEQ ID NO: 478)의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 ARFDYGSSLDS(SEQ ID NO: 448)의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 QSISNY(SEQ ID NO: 460)의 서열을 포함하는 CDR-L1, YAS(SEQ ID NO: 462)의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 QQSKSWPRT(SEQ ID NO: 464)의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 및 VL 도메인은 라미닌-2에 결합하는 항원 결합 부위(예컨대, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 또는 VH3 및 VL3)를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 A2에 나타낸 바와 같은 항체 C21_Hu21의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 및/또는 VL 도메인은 인간화된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 474의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 490의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 D2에 나타낸 바와 같은 항체 C21_Hu21의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 466의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 및/또는 SEQ ID NO: 482의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 500의 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 498의 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 499의 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬, 및 SEQ ID NO: 501의 서열을 포함하는 제4 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은, 예컨대 표 I2 또는 I4에 나타낸 바와 같은 triAb 3407의 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 446의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 442의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 458의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 504의 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 502의 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 503의 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬, 및 SEQ ID NO: 505의 서열을 포함하는 제4 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은, 예컨대 표 I2 또는 I4에 나타낸 바와 같은 triAb 3423의 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 478의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 410의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 426의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 474의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 490의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 508의 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 506의 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 507의 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬, 및 SEQ ID NO: 509의 서열을 포함하는 제4 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은, 예컨대 표 I2 또는 I4에 나타낸 바와 같은 triAb 3429의 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 446의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 442의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 458의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 410의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 426의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 512의 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 510의 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 511의 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬, 및 SEQ ID NO: 513의 서열을 포함하는 제4 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은, 예컨대 표 I2 또는 I4에 나타낸 바와 같은 triAb 3437의 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 478의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 396의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1은 SEQ ID NO: 474의 서열을 포함하며, VL1은 SEQ ID NO: 490의 서열을 포함하며; VH2는 SEQ ID NO: 378의 서열을 포함하며, VL2는 SEQ ID NO: 394의 서열을 포함하며; VH3은 SEQ ID NO: 314의 서열을 포함하며, VL3은 SEQ ID NO: 330의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 SEQ ID NO: 516의 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 514의 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬, SEQ ID NO: 515의 서열을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬, 및 SEQ ID NO: 517의 서열을 포함하는 제4 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은, 예컨대 표 I2 또는 I4에 나타낸 바와 같은 triAb 3439의 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
이중특이적 결합 단백질
일부 구현예에서, 결합 단백질은 이중특이적 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 단백질은 2개의 항원 결합 부위를 포함하며 종합적으로 2개 이상의 표적 항원을 표적화하는 2가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 단백질은 4개의 항원 결합 부위를 포함하며 종합적으로 2개 이상의 표적 항원을 표적화하는 4가 결합 단백질이다.
일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인(여기서, 제1 결합 도메인은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH1) 및 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL1)을 포함함), 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인(여기서, 제2 결합 도메인은 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH2) 및 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(VL2)을 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 이중특이적 결합 단백질, 예컨대 이중특이적 항체이다.
일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 여기서 2개의 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하며:
[화학식 I]
VL1-L1-VL2-L2-CL
2개의 폴리펩티드 사슬은 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함한다:
[화학식 II]
VH2-L3-VH1-L4-CH1-힌지-CH2-CH3
식 중,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
VH1 및 VL1 도메인은 VH1/VL1 결합 쌍을 형성하며, VH2 및 VL2 도메인은 VH2/VL2 결합 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, 화학식 I 및 II는 N-말단에서 C-말단으로의 순서로 각각의 폴리펩티드 사슬 내 도메인의 배열을 설명한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 사슬의 하나 이상은, 예컨대, N-말단 또는 C-말단 끝에 추가 서열(들)을 포함할 수 있다.
상기 포맷의 예시적인 설명을 위해, 예컨대 국제 공개 제WO2012/135345호, US 특허 제9,221,917호, 및 EP 특허 제EP2691416B1호를 참고한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 SEQ ID NO: 530의 서열을 포함하는 화학식 II에 따른 2개의 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO: 531의 서열을 포함하는 화학식 I에 따른 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 SEQ ID NO: 532의 서열을 포함하는 화학식 II에 따른 2개의 폴리펩티드 사슬 및 SEQ ID NO: 533의 서열을 포함하는 화학식 I에 따른 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 I3 또는 I4에서 AS30_Hu9xC3_Hu11 CODV 또는 AS30_Hu9xC21_Hu21 CODV에 대해 나타내는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 A2에 나타내는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 D2, I3, 또는 I4에 나타내는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다. 다른 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다.
상술된 임의의 다중특이적 및/또는 이중특이적 결합 분자의 일부 구현예에서, 화학식 I의 폴리펩티드 및 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1 도메인은 교차하여 VH1/VL1 결합 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, VH2 및 VL2 도메인은 교차하여 VH2/VL2 결합 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, 상기 포맷에 대해 본원에서 사용되는 "링커"라는 용어는 경쇄 및 중쇄의 도메인에 교차 이중 가변 영역 면역글로불린으로 폴딩되기에 충분한 이동성을 제공하도록 면역글로불린 도메인 사이에 삽입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 나타낸다. 링커는 서열 수준에서 각각 가변 도메인 사이 또는 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 전환부(transition)에 삽입된다. 면역글로불린 도메인의 근사치 크기가 잘 이해되어 있기 때문에, 도메인 사이의 전환부가 확인될 수 있다. 도메인 전환부의 정확한 위치는, 실험 데이터에 의해 실증되는 바와 같이 또는 2차 구조 예측 또는 모델링 기술에 의해 추정될 수 있는 바와 같이, 베타-시트(sheet) 또는 알파-나선과 같은 2차 구조의 요소를 형성하지 않는 펩티드 스트레치(stretch)의 배치에 의해 결정될 수 있다. 링커 L1, L2, L3, 및 L4는 독립적이지만, 일부 경우에서, 그들은 동일한 서열 및/또는 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 일부 구현예에서, L1 및 L2는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 일부 구현예에서, L3 및 L4는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 국제 공개 제WO2017/180913호에 기재된 임의의 링커 및 링커 조합이 본원에서 기재되는 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 각각 0개 내지 50개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 40개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 30개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 25개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 20개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 18개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 16개의 아미노산 잔기 길이, 또는 0개 내지 14개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 없음(길이=0)으로부터 약 100개의 아미노산의 길이까지, 또는 100개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 15개 미만의 아미노산 또는 이보다 더 적은 아미노산까지의 범위이다. 링커는 또한 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산의 길이일 수 있다. 하나의 결합 단백질에서의 L1, L2, L3, 및 L4는 전부 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있거나 또는 전부 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
소정 구현예에서, L1은 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 5개의 아미노산 잔기 길이이다. 소정 구현예에서, L1은 14개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 2개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 14개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 2개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1 및 L3 각각은 서열 EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO: 296)를 포함하며, 및/또는 L2 및 L4 각각은 서열 GG를 포함한다. 소정 구현예에서, L1은 7개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 1개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 2개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GQPKAAP(SEQ ID NO: 297)를 포함하며, L2는 서열 TKGPS(SEQ ID NO: 298)를 포함하며, L3은 세린 잔기(예컨대, 서열 S)를 포함하며, L4는 서열 RT를 포함한다. 소정 구현예에서, L1은 10개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 10개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 0개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 0개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1 및 L2 각각은 서열 GGSGSSGSGG(SEQ ID NO: 299)를 포함한다.
일부 구현예에서, 화학식 I 및/또는 화학식 II의 폴리펩티드의 가변 도메인의 하나 또는 둘 다는 인간, 인간화된, 또는 마우스 가변 도메인이다.
일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하는 2개의 경쇄:
[화학식 III]
VL1-L5-VL2-L6-CL
및 다음 화학식으로 나타내는 구조를 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다:
[화학식 IV]
VH1-L7-VH2-L8-CH1-힌지-CH2-CH3
식 중,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L5, L6, L7 및 L8은 아미노산 링커이며;
VH1 및 VL1 도메인은 VH1/VL1 결합 쌍을 형성하며, VH2 및 VL2 도메인은 VH2/VL2 결합 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, 화학식 III 및 IV는 N-말단에서 C-말단으로의 순서로 각각의 폴리펩티드 사슬 내 도메인의 배열을 설명한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 사슬의 하나 이상은, 예컨대, N-말단 또는 C-말단 끝에 추가 서열(들)을 포함할 수 있다.
상기 포맷의 예시적인 설명에 대해서는, 예컨대, US PG 공개 제US20130209469호를 참고한다.
일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 SEQ ID NO: 522의 서열을 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 523의 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 결합 분자는 SEQ ID NO: 528의 서열을 포함하는 2개의 중쇄 및 SEQ ID NO: 529의 서열을 포함하는 2개의 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 I3 또는 I4에서 AS30_Hu6xC3_Hu10 또는 AS30_Hu6xC21_Hu11에 대해 나타내는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 A2에 나타내는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함하는 가변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 D2, I3, 또는 I4에 나타내는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1/VL1 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다. 다른 구현예에서, VH2/VL2 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다.
일부 구현예에서, 화학식 III 및/또는 화학식 IV의 폴리펩티드의 가변 도메인의 하나 또는 둘 다는 인간, 인간화된, 또는 마우스 가변 도메인이다.
링커
일부 구현예에서, L5, L6, L7, 및 L8은 각각 0개 내지 50개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 40개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 30개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 25개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 20개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 18개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 16개의 아미노산 잔기 길이, 또는 0개 내지 14개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 L5, L6, L7, 및 L8은 아미노산 없음(길이=0)으로부터 약 100개의 아미노산의 길이까지, 또는 100개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 15개 미만의 아미노산 또는 이보다 더 적은 아미노산까지의 범위이다. 링커는 또한 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산의 길이일 수 있다. 하나의 결합 단백질에서의 L5, L6, L7, 및 L8은 전부 동일 아미노산 서열을 가질 수 있거나 또는 전부 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 링커는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 일부 구현예에서, L1 및 L2는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 일부 구현예에서, L3 및 L4는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 서열 DKTHT(SEQ ID NO: 534)를 포함한다. 국제 공개 제WO2017/180913호에 기재된 임의의 링커 및 링커 조합이 본원에서 기재되는 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, L1, L2, L3, 및 L4는 각각 0개 내지 50개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 40개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 30개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 25개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 20개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 18개의 아미노산 잔기 길이, 0개 내지 16개의 아미노산 잔기 길이, 또는 0개 내지 14개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, 링커 L1, L2, L3, 및 L4는 아미노산 없음(길이=0)으로부터 약 100개의 아미노산의 길이까지, 또는 100개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 15개 미만의 아미노산 또는 이보다 더 적은 아미노산까지의 범위이다. 링커는 또한 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산의 길이일 수 있다. 하나의 결합 단백질에서의 L1, L2, L3, 및 L4는 전부 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있거나 또는 전부 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
소정 구현예에서, L1은 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 5개의 아미노산 잔기 길이이다. 소정 구현예에서, L1은 14개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 2개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 14개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 2개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1 및 L3 각각은 서열 EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO: 296)를 포함하며, 및/또는 L2 및 L4 각각은 서열 GG를 포함한다. 소정 구현예에서, L1은 7개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 5개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 1개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 2개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GQPKAAP(SEQ ID NO: 297)를 포함하며, L2는 서열 TKGPS(SEQ ID NO: 298)를 포함하며, L3은 세린 잔기(예컨대, 서열 S)를 포함하며, L4는 서열 RT를 포함한다. 소정 구현예에서, L1은 10개의 아미노산 잔기 길이이며, L2는 10개의 아미노산 잔기 길이이며, L3은 0개의 아미노산 잔기 길이이며, L4는 0개의 아미노산 잔기 길이이다. 일부 구현예에서, L1 및 L2 각각은 서열 GGSGSSGSGG(SEQ ID NO: 299)를 포함한다.
소정 구현예에서, L5 및 L7 링커는 GGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 294)의 아미노산 서열을 포함하며, 및/또는 L6 및 L8 링커는 각각 0개의 아미노산 잔기 길이이다.
상기 열거된 예(예컨대, L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, 또는 L8에 대한)는 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하려는 것이 아니며, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴, 글루타민, 글리신 및 프롤린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 무작위로 선택된 아미노산을 포함하는 링커가 결합 단백질에서 적합하다.
링커에서의 아미노산 잔기의 아이덴티티(identity) 및 서열은 링커에서 달성할 필요가 있는 이차 구조 요소의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 글리신, 세린, 및 알라닌은 가요성 링커를 위해 사용된다. 글리신, 프롤린, 트레오닌 및 세린의 일부 조합은, 더욱 경성(rigid)이고 연장된 링커가 필요한 경우에 유용하다. 원하는 특성에 따라 필요할 경우 더 큰 펩티드 링커가 구축되도록 임의의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기와 조합되어 링커로 간주될 수 있다.
불변/Fc 영역
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 제2 폴리펩티드 사슬 상의 "놉(knob)" 돌연변이 및 제3 폴리펩티드 사슬 상의 "홀(hole)" 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 제3 폴리펩티드 사슬 상의 "놉" 돌연변이 및 제2 폴리펩티드 사슬 상의 "홀" 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, "놉" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및/또는 366에 상응하는 위치에서의 치환(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S354C, T366W, T366Y, S354C 및 T366W, 또는 S354C 및 T366Y이다. 일부 구현예에서, "놉" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이다. 일부 구현예에서, "홀" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 407, 및 선택적으로, 349, 366, 및/또는 368에 상응하는 위치에서의 치환(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 Y407V 또는 Y407T 및 선택적으로 Y349C, T366S, 및/또는 L368A이다. 일부 구현예에서, "홀" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에서의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(예컨대, S354C 및 T366W)을 포함하며; 제3 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(예컨대, Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V)을 포함하며; 제3 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(예컨대, S354C 및 T366W)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은, 예컨대, 정제 시약에 대한 친화도를 조정함으로써 정제를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이종이량체형 결합 단백질은 상기 이종이량체 형태가 동종이량체 형태보다 단백질 A-기반 정제에 대하여 중간 친화도를 가질 것이고, 예를 들어 상이한 pH의 사용에 의해 단백질 A로부터 선택적으로 용출될 수 있기 때문에, 이종이량체 형태의 2개의 Fc 영역 중 하나가 단백질 A에의 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이(들)를 함유할 경우 이의 동종이량체 형태로부터 선택적으로 정제될 수 있음이 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep. 5:17943] 참고). 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 435 및 436에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하며, 여기서 아미노산 치환은 H435R 및 Y436F이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인은 인간 IgG1 또는 IgG4 CH3 도메인이며, CH3 도메인 중 하나만이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 435 및 436에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(예컨대, H435R 및 Y436F)을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 놉 및 홀 돌연변이 및 정제를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 반감기, 예컨대 생체내 반감기를 증가시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 U.S. 특허 제7,083,784호에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 CH2 도메인은 EU 인덱스에 따른 넘버링으로, 위치 252에 티로신 잔기, 위치 254에 트레오닌 잔기, 및 위치 256에 글루탐산 잔기를 포함하는 인간 IgG1 또는 IgG4 CH2 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 글리코실화가 변경되고/되거나 효과기 기능이 감소된 Fc 영역을 생성하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 U.S. 특허 제9,790,268호에 기재된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 CH2 도메인은 EU 인덱스에 따른 넘버링으로, 위치 297에 아스파라긴 잔기, 위치 298에 아스파라긴 잔기, 위치 299에 알라닌 잔기, 및 위치 300에 세린 또는 트레오닌 잔기를 포함하는 인간 IgG1 또는 IgG4 CH2 도메인이다.
본원에서 사용을 위해 고려되는 또 다른 이중특이적 결합 단백질 플랫폼은 US PG 공개 제US2013/0039913호 및 문헌[Labrijn, A.F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. 110:5145-5150]에 기재되어 있다. 상기 접근에서, 각각의 결합 도메인은 동종이량체 형태로 제조된 후, 시험관내 조립되어 이종이량체 이중특이적 결합 단백질을 형성한다. 상기 접근은 Fab-암 교환을 촉진하기 위해 특정 돌연변이를(예컨대, 항체 CH3 도메인에) 채택하여, 어느 한 동종이량체 형태에 비해 더 안정한 이종이량체 결합 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, 이들 돌연변이는 문헌[Kabat et al.]에 기재된 바와 같은 EU-인덱스에 따라, 예컨대, 위치 366, 368, 370, 399, 405, 407 및/또는 409에서 일어난다. 특정 돌연변이는 US PG 공개 제US2013/0039913호 및 문헌[Labrijn, A.F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. 110:5145-5150]에 더 상세히 기재되어 있다.
본원에서의 사용을 위해 고려되는 추가 이중특이적 결합 단백질 플랫폼이 아래에 간략히 기재된다. Fc의 CH3 도메인에서 한 세트의 "홀-내-놉(knob-into-hole)" 돌연변이를 사용하여 Fc 이종이량체를 제조하기 위한 하나의 전략이 문헌[Carter et al. Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7): 617-21; Carter, 2011, J. Immunol. Methods 248(1-2): 7-15]에서 제안되었다. 이들 돌연변이는 이종이량체의 형성이 동종이량체에 비해 선호되도록 하는 구조적으로 보존된 소수성 코어 내의 CH3 도메인 인터페이스 간 상보성을 충전하는 잔기의 변경을 일으키며, 이는 포유류 세포 배양으로부터 우수한 이종이량체 발현을 일으킨다. 이 전략은 더 높은 이종이량체 수율을 야기하였으나, 동종이량체가 완전히 억제되지는 않았다(Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81).
결합 단백질의 수율을 개선시키기 위하여, 일부 구현예에서, CH3 도메인은, 예를 들어 국제 공개 제96/027011호, 문헌[Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; 및 Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 677-81]에서 몇몇 예와 함께 상세히 기재된 "홀-내-놉" 기술에 의해 변경될 수 있다. 구체적으로, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이러한 2개의 CH3 도메인을 함유하는 중쇄 둘 다의 이종이량체화를 증가시키도록 변경된다. (2개의 중쇄의) 2개의 CH3 도메인 각각은 "놉"일 수 있는 반면, 다른 것은 "홀"이다. 디설피드 가교의 도입은 이종이량체를 추가로 안정화시키며(Merchant et al., 1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35) 수율을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 놉은 하나의 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인 상에 있다. 다른 구현예에서, 놉은 교차 배향을 갖는 제1 폴리펩티드 쌍 상에 있다. 또 다른 구현예에서, CH3 도메인은 홀 내 놉을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 하나의 폴리펩티드 사슬 상의 "놉" 돌연변이 및 다른 폴리펩티드 사슬 상의 "홀" 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, "놉" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이다. 일부 구현예에서, "홀" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에서의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 혈청 반감기를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(예를 들어, 문헌[Hinton, P.R. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56] 참고). 일부 구현예에서, 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 428 및 434에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 M428L 및 N434S이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 놉 및 홀 돌연변이 및 혈청 반감기를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
본원에서 사용을 위해 고려되는 또 다른 이중특이적 결합 단백질 플랫폼은 WO2011131746에 기재된 이종이량체, 2가 항체 Fc-함유 포맷이다. 본원에서 기재되는 임의의 항원 결합 부위는 상기 이종이량체, 이중특이적 포맷으로 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 결합 단백질은 제1 중쇄 가변(VH) 도메인 및 제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제1 Fc 영역을 포함하는 제1 항체 중쇄, 및 제1 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 제1 항체 경쇄(여기서 제1 VH 및 VL 도메인은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 항원 결합 도메인을 형성함), 및 제2 중쇄 가변(VH) 도메인 및 제2 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린의 제2 Fc 영역을 포함하는 제2 항체 중쇄, 및 제2 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는 제2 항체 경쇄(여기서, 제2 VH 및 VL 도메인은 라미닌-2에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 형성함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 상이하며, 상기 제1 및 제2 CH3 영역 간 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 각각의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것이다. 일부 구현예에서, 제1 동종이량체 단백질은 위치 409에 Lys, Leu 또는 Met 이외의 아미노산을 가지며 제2 동종이량체 단백질은 366, 368, 370, 399, 405 및 407로부터 선택되는 위치에 아미노산 치환을 갖고/갖거나 상기 제1 및 제2 CH3 영역의 서열은 각각의 CH3 영역의 동종이량체 상호작용의 해리 상수가 0.01 내지 10 마이크로몰 농도이도록 하는 것이다. 일부 구현예에서, 제1 항체 중쇄는 SEQ ID NO: 518의 서열을 포함하며, 제2 항체 중쇄는 SEQ ID NO: 519의 서열을 포함하며, 제1 항체 경쇄는 SEQ ID NO: 520의 서열을 포함하며, 제2 항체 경쇄는 SEQ ID NO: 521의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 I3에서 AS30_Hu6xC3_Hu10 듀오바디에 대해 나타내는 2개의 항체 경쇄 및 2개의 항체 중쇄를 포함한다.
본원에서의 사용을 위해 고려되는 또 다른 이중특이적 결합 단백질 플랫폼은 "듀앳맵" 설계이다(Mazor, Y. et al. (2015) MAbs 7:377-389). 간략하게, 상술된 "홀-내-놉" 접근은 인지체 중쇄 및 경쇄 쌍 형성의 효율을 증가시키기 위해 CH1-CL 인터페이스 중 하나에서 천연 디설피드 결합을 조작된 디설피드 결합으로 대체하여 조합된다. 일부 구현예에서, 하나의 결합 도메인의 중쇄는 F126C 돌연변이를 보유하고, 그 결합 도메인에 대한 인지체 경쇄는 Kabat에 따른 넘버링으로, S121C 돌연변이를 보유한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 결합 단백질은 SEQ ID NO: 524의 서열을 포함하는 제1 항체 중쇄, SEQ ID NO: 525의 서열을 포함하는 제2 항체 중쇄, SEQ ID NO: 526의 서열을 포함하는 제1 항체 경쇄, 및 SEQ ID NO: 527의 서열을 포함하는 제2 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 I3에서 AS30_Hu6xC21_Hu11 듀앳맵에 대해 나타내는 2개의 항체 경쇄 및 2개의 항체 중쇄를 포함한다.
Gunasekaran 등은 CH3 도메인 인터페이스에서 전하 상보성을 변화시킴으로써 Fc 이종이량체의 형성을 유도하면서 소수성 코어의 온전성을 유지하는 타당성을 탐색하였다(Gunasekaran et al., 2010, J. Biol. Chem. 285(25): 19637-46). 정전기적 스티어링 메커니즘의 장점을 취하여, 이들 작제물은 말초 배치된 하전 잔기의 2쌍의 돌연변이를 통해 최소 오염량의 동종이량체를 포함하며 Fc 이종이량체 형성의 효율적 촉진을 나타내었다. 홀-내-놉 설계와 대조적으로, 동종이량체는 정전기적 반발 메커니즘의 성질에 의해 균일하게 억제되지만, 완전히 회피되지는 않았다.
Davis 등은 추가적인 사슬내 디설피드 결합의 도입 없이, 인간 IgG 및 IgA CH3 도메인의 β-가닥 분절을 맞물림으로써 Fc 동종이량체를 이종이량체로 전환시키는 항체 조작 접근을 기재한다(Davis et al., 2010, Protein Eng. Des. Sel. 23(4): 195-202). 포유류 세포에 의한 씨드바디(SEEDbody (Sb)) 융합 단백질의 발현은 소량의 부산물을 제거하기 위해 쉽게 정제되는 고수율로 Sb 이종이량체를 산출한다.
U.S. 특허 출원 공개 제US 2010/331527호 A1은 하나의 중쇄에서 CH3 도메인 내에 돌연변이 H95R 및 Y96F를 도입하는 CH3 도메인의 이종이량체화에 기반한 이중특이적 항체를 기재한다. 이들 아미노산 치환은 IgG3 서브타입의 CH3 도메인으로부터 유래되며 IgG1 골격과 이종이량체화할 것이다. 모든 중쇄와 쌍을 형성하기 쉬운 공통 경쇄가 CH3 도메인을 통한 이종이량체화에 기반하는 모든 포맷에 대한 필요 조건이다. 따라서 총 3개 유형의 항체가 제조된다: 순수한 IgG1 골격을 갖는 50%, 순수한 H95R 및 Y96F 돌연변이 골격을 갖는 1/3, 및 2개의 상이한 중쇄를 갖는 1/3(이중특이적). 원하는 이종이량체는 단백질 A에 대한 그 결합 특성이 모체 항체에 대한 것과 상이하므로, 상기 혼합물로부터 정제될 수 있다: IgG3-유래 CH3 도메인은 단백질 A에 결합하지 않는 반면, IgG1은 결합한다. 결과적으로, 이종이량체는 단백질 A에 결합하지만, 순수한 IgG1 동종이량체보다 높은 pH에서 용출되며, 이는 이중특이적 이종이량체의 선택적 정제를 가능하게 만든다.
U.S. 특허 제7,612,181호는 U.S. 특허 제5,989,830호에 기재된 이중-Fv 포맷에 기반하는 이중-가변-도메인 IgG(DVD-IgG) 이중특이적 항체를 기재한다. 유사한 이중특이적 포맷이 또한 U.S. 특허 출원 공개 제US 2010/0226923호 A1에 기재되었다. 이중-Fv의 각각의 사슬로의 불변 도메인의 첨가(중쇄로 CH1-Fc 및 경쇄로 카파 또는 람다 불변 도메인의 첨가)는 어떠한 추가 변형(즉, 안정성을 향상시키기 위한 불변 도메인의 명백한 첨가)이 필요 없이 기능적 이특이적 항체를 생성하였다. DVD-Ig/TBTI 포맷으로 발현되는 일부 항체는 제2(또는 최내부) 항원 결합 위치(Fv2) 상에서 위치 효과를 나타낸다. Fv2 위치에 의해 인식되는 항원의 성질 및 서열에 따라, 상기 항체 도메인은 그 항원에 대해 감소된 친화도(즉, 모체 항체와 대조적인 온-율(on-rate) 손실)를 나타낸다. 상기 관찰에 대해 가능한 하나의 설명은 VL1 및 VL2 간 링커가 Fv2의 CDR 영역 내로 돌출되어, Fv2를 더 큰 항원이 다소 접근 불가능하게 만든다는 것이다.
U.S. 특허 제5,989,830호에 기재된 이중특이적 항체 단편의 제2 구성은 2개의 사슬 상에서 발현되는 하기 배향의 가변 도메인: 경쇄에 있어서 VL1-링커-VL2, 및 중쇄에 있어서 VH2-링커-VH1을 갖는 교차 이중 헤드(CODH)이다.
CDR, VH, 및 VL 도메인 서열
임의의 수, 조합, 또는 구성인 본 발명의 임의의 다중특이적 또는 이중특이적 결합 단백질에서 사용될 수 있는 예시적인 CDR, VH 도메인, 및 VL 도메인 서열이 후술된다.
본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, 본 발명의 VH1/VL1 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, 본 발명의 VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다.
일부 구현예에서, VH1 도메인은 SEQ ID NO: 1~8로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 9~17로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 18~27로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL1 도메인은 SEQ ID NO: 28~37로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38~42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 43~50으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, VH1 도메인은 SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 및 188로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL1 도메인은 SEQ ID NO: 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 및 189로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 SEQ ID NO: 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 및 248로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL1 도메인은 SEQ ID NO: 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 및 249로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, 본 발명의 VH1/VL1 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, 본 발명의 VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2(예컨대, 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5, 또는 LG-5)에 결합한다. 본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 51~55로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 56~60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 61~65로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL2 도메인은 SEQ ID NO: 66~70으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 71~75로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 76~80으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 및 198로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 및 199로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 250, 252, 254, 256, 및 258로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 251, 253, 255, 257, 및 259로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, 본 발명의 VH1/VL1 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, 본 발명의 VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2(예컨대, 라미닌 G-유사(LG) 4 및/또는 5 도메인, 또는 LG-4/5)에 결합한다. 본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 81~95로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 96~110으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 111~125로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL2 도메인은 SEQ ID NO: 126~140으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38 및 141~154로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 155~169로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 및 228로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 및 229로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 및 288로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, 본 발명의 VH2/VL2 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, 본 발명의 VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다. 본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 1~8로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 9~17으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 18~27로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL2 도메인은 SEQ ID NO: 28~37로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38~42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 43~50으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 및 188로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 및 189로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 및 248로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 및 249로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, 본 발명의 VH2/VL2 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, 본 발명의 VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2(예컨대, 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5, 또는 LG-5)에 결합한다. 본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 51~55로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 56~60으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 61~65로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL2 도메인은 SEQ ID NO: 66~70으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 71~75로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 76~80으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 및 198로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 및 199로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 250, 252, 254, 256, 및 258로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 251, 253, 255, 257, 및 259로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, 본 발명의 VH2/VL2 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, 본 발명의 VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2(예컨대, 라미닌 G-유사(LG) 4 및/또는 5 도메인, 또는 LG-4/5)에 결합한다. 본원에서 기재된 임의의 포맷의 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 81~95로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 96~110으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 111~125로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하며; 및/또는 VL2 도메인은 SEQ ID NO: 126~140으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38 및 141~154로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 155~169로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 및 228로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 및 229로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 SEQ ID NO: 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 및 288로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서, VL2 도메인은 SEQ ID NO: 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 및 289로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 인코딩된다.
본 발명의 결합 단백질에서 사용하기 적합한 예시적인 CDR 서열이 아래에서 표 A~C에 제공된다. 본 발명의 결합 단백질에서 사용하기 적합한 예시적인 VH 및 VL 서열(폴리펩티드 및 핵산)이 아래에서 표 D~I에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 결합 도메인은 아래에서 표 A에 나타내는 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 아래에서 표 A에 나타내는 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 라미닌-2에 결합하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 결합 도메인은 아래에서 표 B 또는 표 C에 나타내는 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 아래에서 표 B 또는 표 C에 나타내는 항체의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개의 CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 결합 도메인은 아래에서 표 D에 나타내는 VH 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 아래에서 표 D에 나타내는 VL 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 라미닌-2에 결합하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 결합 도메인은 아래에서 표 E 또는 표 F에 나타내는 VH 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 아래에서 표 E 또는 표 F에 나타내는 VL 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 결합 도메인은 아래에서 표 G에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 아래에서 표 G에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 라미닌-2에 결합하는 결합 도메인을 포함하며, 여기서 결합 도메인은 아래에서 표 H 또는 표 I에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VH 도메인 및/또는 아래에서 표 H 또는 표 I에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 28의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 170의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 171의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 230의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 231의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 172의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 173의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 232의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 233의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 174의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 175의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 234의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 235의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 176의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 177의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 236의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 237의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 178의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 179의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 238의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 239의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 180의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 181의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 240의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 241의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 24의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 182의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 183의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 242의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 243의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 25의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 184의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 185의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 244의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 245의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 26의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 186의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 187의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 246의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 247의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 27의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 188의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 189의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 248의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 249의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 76의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 190의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 191의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 250의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 251의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 57의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 192의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 193의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 252의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 253의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 78의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 194의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 195의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 254의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 255의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 69의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 74의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 79의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 196의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 197의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 256의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 257의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 70의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 80의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 198의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 199의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 258의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 259의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 96의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 111의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 126의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 141의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 155의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 200의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 201의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 260의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 261의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 97의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 112의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 127의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 142의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 156의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 202의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 203의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 262의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 263의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 98의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 113의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 128의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 143의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 157의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 204의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 205의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 264의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 265의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 99의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 114의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 129의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 144의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 158의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 206의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 207의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 266의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 267의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 100의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 115의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 130의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 145의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 159의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 208의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 209의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 268의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 269의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 101의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 116의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 131의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 146의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 160의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 210의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 211의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 270의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 271의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 102의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 117의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 132의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 161의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 212의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 213의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 272의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 273의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 88의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 118의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 133의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 148의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 162의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 214의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 215의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 274의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 275의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 104의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 119의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 134의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 149의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 163의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 216의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 217의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 276의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 277의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 135의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 150의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 164의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 218의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 219의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 278의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 279의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 136의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 151의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 165의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 220의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 221의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 280의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 281의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 137의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 152의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 166의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 222의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 223의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 282의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 283의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 108의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 138의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 153의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 167의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 224의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 225의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 284의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 285의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 124의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 139의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 168의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 226의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 227의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 286의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 287의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 (a) (i) SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) SEQ ID NO: 110의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 (iii) SEQ ID NO: 125의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 VH 도메인; 및/또는 (b) (i) SEQ ID NO: 140의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) SEQ ID NO: 154의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 (iii) SEQ ID NO: 169의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 228의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 229의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 단백질은 SEQ ID NO: 288의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VH 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 서열 및/또는 SEQ ID NO: 289의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 VL 도메인 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인 서열을 포함한다.
당업자에게는 본원에서 기재된 임의의 항-디스트로글리칸 항체의 CDR 및/또는 VH/VL 도메인이 임의의 조합 또는 구성으로(예컨대, 디스트로글리칸의 세포외 도메인에 특이적인 VH1/VL1 결합 쌍 및 라미닌-2에 특이적인 VH2/VL2 결합 쌍을 갖거나 디스트로글리칸의 세포외 도메인에 특이적인 VH2/VL2 결합 쌍 및 라미닌-2에 대해 특이적인 VH1/VL1 결합 쌍을 가짐) 본원에서 기재되는 임의의 항-라미닌-2 항체(예컨대, 라미닌-2의 LG-4/5 및/또는 LG-5 도메인에 결합하는 항체)의 CDR 및/또는 VH/VL 도메인과 함께 이중특이적 결합 단백질에서 조합될 수 있음을 이해할 것이다.
당업자에게는 본원에서 기재된 임의의 항-디스트로글리칸 항체의 CDR 및/또는 VH/VL 도메인이 임의의 조합 또는 구성으로 본원에서 기재되는 임의의 항-라미닌-2 항체(예컨대, 라미닌-2의 LG-4/5 및/또는 LG-5 도메인에 결합하는 항체)의 CDR 및/또는 VH/VL 도메인과 함께 다중특이적 결합 단백질에서 조합될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 A2에 나타내는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 CDR 또는 표 D2, I2, I3, 또는 I4에 나타내는 가변 도메인 또는 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 D2, I2, I3, 또는 I4에 나타내는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 가변 도메인 서열, 또는 표 G2에 나타내는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 가변 도메인 서열을 포함한다(예컨대, 각각 VH 및 VL 도메인을 포함하는, 1개, 2개, 또는 3개의 VH/VL 결합 쌍). 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예컨대, 다중특이적 결합 단백질)은 표 I4에 나타내는 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 가변 도메인 프레임워크를 포함한다.
[표 A]
[표 A2]
[표 B]
[표 C]
[표 D]
[표 D2]
[표 E]
[표 F]
[표 G]
[표 G2]
[표 H]
[표 I]
[표 I2]
[표 I3]
[표 I4]
표적 단백질
디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자(예컨대, 결합 단백질)가 본원에서 제공된다. "결합한다" 및 "특이적으로 결합한다"라는 용어는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 항원(예컨대, 라미닌-2 또는 디스트로글리칸의 세포외 부분)에 "결합하는" 결합 도메인은 약 1 × 10-6 M 이하의 KD로 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원(예컨대, 항원 에피토프)에 대한 항원 결합 도메인의 결합 친화도(예컨대, KD)는 1가 항체 또는 이의 항원-결합 단편에서의 항원 결합 도메인을 사용하여 검정된다. 일부 구현예에서, 항원(예컨대, 항원 에피토프)에 대한 항원 결합 도메인의 결합 친화도(예컨대, KD)는 본 발명의 다중특이적 포맷에서의 항원 결합 도메인을 사용하여 검정된다.
본원에서 사용되는 디스트로글리칸(DG)은 세포외 매트릭스(ECM, 기저층으로도 알려짐)를 근섬유의 F-액틴-연합 세포골격에 연결하는 디스트로핀 복합체의 성분으로 작용하는 디스트로핀-연합 단백질이다. 디스트로글리칸은 번역 후 절단되며 서로 비-공유 연합되는 2개의 서브유닛, 알파 디스트로글리칸 및 베타 디스트로글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸은 인간 디스트로글리칸(예컨대, NCBI Ref. Seq. Gene ID No. 1605에 나타낸 인간 DAG1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, 또는 UniProt Entry Q14118에 상응하는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸은 마우스 디스트로글리칸(예컨대, NCBI Ref. Seq. Gene ID No. 13138에 나타낸 마우스 Dag1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, 또는 UniProt Entry Q62165에 상응하는 단백질)이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 알파-디스트로글리칸에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 베타-디스트로글리칸에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD(SEQ ID NO: 290)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD(SEQ ID NO: 290) 내 에피토프 또는 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV(SEQ ID NO: 291)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV(SEQ ID NO: 291) 내 에피토프 또는 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 인간 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 마우스 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 인간 및 마우스 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 400 nM 미만, 약 300 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인 및 인간 디스트로글리칸의 세포외 부분 간 결합의 친화도는 결합 도메인이 단일특이적 결합 도메인(예컨대 단일특이적 항체)으로서가 아닌 이중특이적 포맷인 경우에 측정된다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 본 발명의 항원 결합 부위는 다중특이적 결합 단백질의 일부로서 검정되는 경우 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 400 nM 미만, 약 300 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다.
본원에서 사용되는 라미닌-2(메로신으로도 알려짐)는 디스트로글리칸에 결합하는 세포외 기저막 단백질을 나타낸다. 라미닌-2는 3개의 서브유닛: 알파, 베타, 및 감마로 이루어진다. 일부 구현예에서, 라미닌-2는 인간 라미닌 서브유닛 알파 2(예컨대, NCBI Ref. Seq. Gene ID No. 3908에 나타낸 인간 LAMA2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, 또는 UniProt Entry P24043에 상응하는 단백질)이다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸은 마우스 라미닌 서브유닛 알파 2(예컨대, NCBI Ref. Seq. Gene ID No. 16773에 나타낸 마우스 Lama2 유전자에 의해 인코딩되는 단백질, 또는 UniProt Entry Q60675에 상응하는 단백질)이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 4, 라미닌-2의 라미닌 G-유사(LG) 도메인 5, 또는 둘 다를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 300)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 VQPQPV PTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFY MARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPK KADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 300) 내 에피토프 또는 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 292)를 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT(SEQ ID NO: 292) 내 에피토프 또는 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 301)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 Q PEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESG LLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRT ISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 301) 내 에피토프 또는 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 293)을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 서열 ANAQR GTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTA VYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTT SIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN(SEQ ID NO: 293) 내 에피토프 또는 영역에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 마우스 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 인간 및 마우스 라미닌-2에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인은 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 400 nM 미만, 약 300 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 도메인 및 인간 라미닌-2 간 결합의 친화도는 결합 도메인이 단일특이적 결합 도메인(예커내 단일특이적 항체)으로서가 아닌 이중특이적 포맷인 경우에 측정된다. 일부 구현예에서, 라미닌-2에 결합하는 본 발명의 항원 결합 부위는 다중특이적 결합 단백질의 일부로서 검정되는 경우 약 1 μM 미만, 약 500 nM 미만, 약 400 nM 미만, 약 300 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 10 nM 미만, 또는 약 1 nM 미만의 평형 해리 상수(KD)로 인간 라미닌-2에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 VH1/VL1 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, 본 발명의 VH2/VL2 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 VH2/VL2 결합 쌍은 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하며, 본 발명의 VH1/VL1 결합 쌍은 라미닌-2에 결합한다.
항체
본 발명은 또한 표 A2, D2, 또는 I4에 나타내는 결합 도메인의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 CDR 서열, 또는 표 D2 또는 I4에 나타내는 또는 표 G2에 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 결합 도메인의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 포함하는 항체(예컨대, 1가 및/또는 모노클로날 항체)를 제공한다. 일부 구현예에서, 항체는 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 라미닌-2에 결합한다. 일부 구현예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO: 1~8로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 9~17로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 18~27로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄; 및 (b) SEQ ID NO: 28~37로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38~42로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 43~50으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 및 188로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 SEQ ID NO: 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 및 189로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO: 316의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 318의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 320의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄; 및 (b) SEQ ID NO: 332의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 334의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 336의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 314의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 330의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 346의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 362의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 (a) SEQ ID NO: 51~55 및 81~95로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 56~60 및 96~110으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 61~65 및 111~125로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 항체 중쇄; 및 (b) SEQ ID NO: 66~70 및 126~140으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 38, 71~75, 및 141~154로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 76~80 및 155~169로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 및 228로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 SEQ ID NO: 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 및 229로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄; 및 SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 380의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 382의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 384의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄; 및 SEQ ID NO: 428의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 398의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 400의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 446의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄; 및 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 444의 서열을 포함하는 CDR-H1, SEQ ID NO: 478의 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 SEQ ID NO: 448의 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는 항체 중쇄; 및 SEQ ID NO: 460의 서열을 포함하는 CDR-L1, SEQ ID NO: 462의 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 SEQ ID NO: 464의 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 378의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 394의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 410의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 426의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 442의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 458의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 SEQ ID NO: 474의 아미노산 서열을 포함하며, VL 도메인은 SEQ ID NO: 490의 아미노산 서열을 포함한다.
핵산
본 발명의 임의의 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 결합 분자(예컨대, 이중특이적 결합 단백질)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 본원에서 제공된다.
표준 재조합 DNA 방법은 결합 단백질을 형성하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 이러한 폴리뉴클레오티드를 재조합 발현 벡터 내에 포함시키고, 그러한 벡터를 숙주 세포 내에 도입하는 데 사용된다. 예컨대, 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.)]을 참고한다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조업자의 사양에 따라 수행될 수 있으며, 이는 당분야에서 일반적으로 성취되는 바와 같거나 본원에서 기재된 바와 같다. 특정한 정의가 제공되지 않으면, 본원에서 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학과 관련하여 이용되는 명명법 및 이들의 실험실 절차 및 기술은 당분야에서 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 것들이다. 이와 유사하게, 통상적인 기술이 화학 합성, 화학 분석, 약학 제조, 제형화, 전달, 및 환자의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본원에서 기재된 임의의 결합 단백질 또는 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산은 결합 단백질-코딩 핵산 서열의 전사를 지시하기 위해 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열을 나타낼 수 있다. 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적으로 관련되어 배치될 때 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터가 결합 단백질의 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 줄 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 프로모터의 예에는 비제한적으로 바이러스(예컨대 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 계두 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스(adenovirus)(예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포 바이러스(cytomegalovirus), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 시미안 바이러스(Simian Virus) 40(SV40) 등)의 게놈으로부터, 이종성 진핵 프로모터(예컨대 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 열-충격(heat-shock) 프로모터 등), CAG-프로모터(문헌[Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991]), 포스포글리세레이트 키나아제(PGK)-프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터(문헌[Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005]), lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, 3-포스포글리세레이트 키나아제에 대한 프로모터, 효모 산 포스파타아제의 프로모터, 및 효모 알파-교배 인자의 프로모터로부터 수득되는 프로모터를 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구성적(constitutive) 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 적합한 프로모터 또는 당업자에 의해 쉽게 인식될 다른 적합한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산은 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터는 발현될 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있다. "조절 서열"이라는 용어는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 적합한 인핸서의 예는 비제한적으로 포유류 유전자(예컨대 글로빈, 엘라스타아제, 알부민, α-태아단백질, 인슐린 등)로부터의 인핸서 서열, 및 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서 서열(예컨대 복제 기원의 후기 쪽의 SV40 인핸서(bp 100~270), 거대세포 바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 후기 쪽의 폴리오마(polyoma) 인핸서, 아데노바이러스 인핸서 등)을 포함할 수 있다. 적합한 벡터의 예는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 트랜스포존, 및 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 홍역 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스 벡터 등)를 포함할 수 있다. 발현 벡터는, 예를 들어 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포와 같은 숙주 세포를 전달감염시키는 데 사용될 수 있다. 숙주에서의 발현 및 복제가 가능한 생물학적 기능성 바이러스 및 플라스미드 DNA 벡터가 당분야에 알려져 있으며, 임의의 관심 세포를 전달감염시키는 데 사용될 수 있다.
다중 벡터를 포함하는 벡터 시스템이 본원에서 추가로 제공되며, 여기서 다중 벡터는 종합적으로 본 발명의 이중특이적 결합 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 본 발명의 이중특이적 결합 분자의 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
숙주 세포 및 결합 단백질의 제조 방법
본 발명의 다른 양태는 본원에서 기재되는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및/또는 벡터 시스템을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 단리된 숙주 세포)에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 단리된 숙주 세포는 시험관 내에서 배양된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균(E. coli) 세포)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 효모 세포(예를 들어, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 세포)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 곤충 숙주 세포의 예는, 예를 들어 드로소필라(Drosophila) 세포(예를 들어, S2 세포), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포(예를 들어, High Five™ 세포), 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포(예를 들어, Sf21 또는 Sf9 세포)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 포유류 숙주 세포의 예는, 예를 들어 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 현탁 배양에서의 성장용으로 서브클로닝된 293 또는 293 세포), Expi293™ 세포, CHO 세포, 베이비 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney cell)(예를 들어, BHK, ATCC CCL 10), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들어, TM4 세포), 원숭이 신장 세포(예를 들어, CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 사바나 원숭이(African green monkey) 신장 세포(예를 들어, VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 자궁경부 암종 세포(예를 들어, HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포(예를 들어, MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포(예를 들어, BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포(예를 들어, W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포(예를 들어, Hep G2, HB 8065), 마우스 유선 종양 세포(예를 들어, MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포, 인간 간암 세포주(예를 들어, Hep G2), 및 골수종 세포(예를 들어, NS0 및 Sp2/0 세포)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본원에서 기재된 임의의 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 a) 숙주 세포가 결합 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 단리된 핵산, 벡터, 및/또는 벡터 시스템(예를 들어, 본원에서 기재된 임의의 단리된 핵산, 벡터, 및/또는 벡터 시스템)을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 본원에서 기재된 임의의 숙주 세포)를 배양하는 단계; 및 b) 결합 단백질을 숙주 세포로부터 단리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 다중 숙주 세포는 이중특이적 결합 분자(예컨대, 단백질)의 성분을 제조하기 위해 사용될 수 있으며, 이후 이중특이적 결합 분자로 조립된다. 일부 구현예에서, 디스트로글리칸의 세포외 부분에 결합하는 제1 결합 도메인 및 라미닌-2에 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 단백질을 제조하는 방법이 본원에서 제공되며, 이 방법은 a) 숙주 세포가 제1 CH3 도메인을 포함하는 제1 단일특이적 결합 단백질의 일부로서 제1 폴리펩티드 사슬을 발현하도록 하는 조건 하에 제1 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제1 숙주 세포를 배양하는 단계; b) 숙주 세포가 제2 CH3 도메인을 포함하는 제2 단일특이적 결합 단백질의 일부로서 제2 폴리펩티드 사슬을 발현하는 조건 하에 제2 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제2 숙주 세포를 배양하는 단계; c) 제1 숙주 세포로부터 제1 단일특이적 결합 단백질을 단리하는 단계; d) 제2 숙주 세포로부터 제2 단일특이적 결합 단백질을 단리하는 단계; e) 힌지 영역 내 시스테인이 디설피드 결합 이성화를 거치도록 하기 충분한 환원 조건 하에 단리된 제1 및 제2 단일특이적 결합 단백질을 인큐베이션하는 단계; 및 f) 이중특이적 결합 단백질을 수득하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 및 제2 CH3 도메인은 상이하고 상기 제1 및 제2 CH3 도메인 간 이종이량체 상호작용이 상기 제1 및 제2 CH3 도메인의 각각의 동종이량체 상호작용보다 강하도록 하는 것이다. 추가 설명에 대해서는, 예컨대 US PG 공개 제US2013/0039913호 및 문헌[Labrijn, A.F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. 110:5145-5150]을 참고한다.
단백질을 발현하는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 친화도 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 친화도 크로마토그래피, 이어서 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 2 단계 친화도 크로마토그래피)를 포함하는, 단백질을 배양된 숙주 세포로부터 단리하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
결합 단백질의 용도
개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 추가로 제공되며, 이 방법은 본 발명의 이중특이적 결합 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 개체에서 라미닌-2 및 디스트로글리칸의 세포외 부분 간 결합을 제공하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 이 방법은 본 발명의 이중특이적 결합 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이중특이적 결합 분자 및 개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 지침을 포함하는 키트가 본원에서 추가로 제공된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하는 방법이 본원에서 추가로 제공되며, 이 방법은 본 발명의 다중특이적 결합 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 개체에서 라미닌-2 및 디스트로글리칸의 세포외 부분 간 결합을 제공하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 이 방법은 본 발명의 다중특이적 결합 분자를 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다중특이적 결합 분자 및 개체에서 알파-디스트로글리칸병증을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 지침을 포함하는 키트가 본원에서 추가로 제공된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
일부 구현예에서, 개체는 알파-디스트로글리칸의 감소된 발현을 갖는다(예컨대, 대조군 개체, 또는 본원에서 기재되는 유전적 돌연변이가 없는 개체에서의 발현에 비해). 일부 구현예에서, 발현은 하나 이상의 조직, 예컨대, 근육 조직에서의 발현을 나타낸다.
일부 구현예에서, 개체에서 발현되는 알파-디스트로글리칸은 손상되거나 비정상적인 O-글리코실화를 갖는다(예컨대, 대조군 개체, 또는 본원에서 기재되는 유전적 돌연변이가 없는 개체에서의 발현에 비해).
일부 구현예에서, 개체는 알파-디스트로글리칸병증을 갖거나, 이로 진단받았거나, 그 발생 성향을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체는 디스트로글리칸(DAG1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-1(POMT1), 단백질 O-만노실트랜스퍼라제-2(POMT2), 단백질 O-결합 만노스 베타1,2-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 1(POMGNT1), 단백질 O-결합 만노스 베타1,4-N-아세틸글루코실아미닐트랜스퍼라제 서브유닛 2(POMGNT2), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 1(LARGE1), 자일로실- 및 글루쿠로닐-트랜스퍼라제 2(LARGE2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 1(DPM1), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 2(DPM2), 돌리칠-포스페이트 만노실트랜스퍼라제 서브유닛 3(DPM3), 푸쿠틴, 푸쿠틴 관련 단백질(FKRP), 이스프레노이드 합성효소 도메인 함유(ISPD), 단백질 O-만노스 키나제(POMK), 베타-1,3-N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 2(B3GALNT2), 베타-1,4-글루쿠로닐트랜스퍼라제 1(B4GAT1), 돌리콜 키나제(DOLK), 막통과 단백질 5(TMEM5), 및 GDP-만노스 피로포스포릴라제 B(GMPPB)로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 돌연변이를 갖는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 정맥내 주입, 근육내 주사, 복강내 주사, 또는 피하 주사에 의해 투여된다.
결합 단백질은 하나 이상의 표적 항원의 검출 및 정량화를 위한 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 경쟁적 결합 검정, 직접적 및 간접적 샌드위치 검정, 및 면역침전 검정에서 이용될 수 있다. 결합 단백질은 이용되는 검정 방법에 적절한 친화도로 하나 이상의 표적 항원에 결합할 것이다.
본 발명의 이중특이적 결합 분자 및 선택적인 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에서 제공된다.
본 발명의 다중특이적 결합 분자 및 선택적인 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 또한 본원에서 제공된다.
약학 조성물은, 예를 들어 조성물의 pH, 오스몰 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 살균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착성, 또는 투과성을 변형하거나, 유지하거나, 보존하기 위한 제형화 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제형화 물질은 비제한적으로 아미노산(예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 라이신), 항미생물제, 산화방지제(예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨, 또는 황산수소나트륨), 완충제(예컨대 보례이트, 바이카보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트, 또는 다른 유기 산), 벌킹제(bulking agent)(예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이팅제(예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 복합체 형성제(complexing agent)(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충전제, 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린), 단백질(예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린), 착색제, 착향제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염-형성 짝이온(예컨대 나트륨), 보존제(예컨대 벤잘코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소), 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알코올(예컨대 만니톨 또는 소르비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉(pluronic); PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤(triton); 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 향상제(예컨대 수크로스 또는 소르비톨), 장성 향상제(예컨대 알칼리 금속 할로겐화물 - 예를 들어, 염화나트륨 또는 염화칼륨 - 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학 보조제(adjuvant)(예를 들어, 임의의 목적을 위하여 본원에 참고로 포함되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)], 및 이의 후속판 참고)를 포함한다. 허용 가능한 제형화 물질은 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.
최적 약학 조성물은, 예를 들어 의도된 투여 경로, 전달 포맷, 및 원하는 투여량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 그러한 조성물은 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 생체 내 제거 속도에 영향을 줄 수 있다.
약학 조성물 중 일차 비히클 또는 담체는 성질 상 수성 또는 비-수성 중 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 주사에 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에서 일반적인 다른 물질이 보충된, 물, 생리 식염수 용액, 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 추가적인 예시적 비히클이다. 다른 예시적인 약학 조성물은 약 pH 7.0 내지 8.5의 트리스 완충제, 또는 약 pH 4.0 내지 5.5의 아세테이트 완충제를 포함하며, 소르비톨 또는 적합한 대체재를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 결합 단백질 조성물은 보관을 위해 원하는 정도의 순도를 갖는 선택된 조성물을 선택적 제형화제와 혼합함으로써, 동결건조 케이크 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 결합 단백질은 적절한 부형제, 예컨대 수크로스를 사용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
제형화 성분은 투여 부위에 허용 가능한 농도로 존재한다. 예를 들어, 완충제는 조성물을 생리학적 pH에서 또는 약간 더 낮은 pH에서, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 유지하는 데 사용된다.
비경구 투여가 고려될 때, 사용하기 위한 치료 조성물은 약학적으로 허용 가능한 비히클 중 원하는 결합 단백질을 포함하는 무발열원성의 비경구용으로 허용 가능한 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은 적절하게 보존 처리된, 결합 단백질이 살균, 등장 용액으로서 제형화되는 살균 증류수이다. 또 다른 제법에는 이후 데포(depot) 주사를 통하여 전달될 수 있는 생성물의 제어 방출 또는 지속 방출을 제공하는, 주사 가능 미소구체, 생분해성(bio-erodible) 입자, 중합체성 화합물(예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드, 또는 리포좀과 같은 제제를 이용한 원하는 분자의 제형화가 관여될 수 있다. 히알루론산이 또한 사용될 수 있으며, 이것은 순환의 지속 기간을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 원하는 분자의 도입에 적합한 다른 수단에는 이식 가능한 약물 전달 장치를 포함한다.
소정 제형은 경구 투여될 수 있음이 또한 고려된다. 본 발명의 일 구현예에서, 이러한 방식으로 투여되는 결합 단백질은 고체 투여량 형태, 예컨대 정제 및 캡슐의 배합에서 관례적으로 사용되는 담체를 이용하여 또는 이를 이용하지 않고서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체이용률이 최대화되고 전신-전 분해가 최소화되는 위장관에서의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 추가 제제가 결합 단백질의 흡수를 촉진하기 위해 포함될 수 있다. 희석제, 착향제, 저융점 왁스, 식물유, 활택제, 현탁제, 정제 붕해제, 및 결합제가 또한 이용될 수 있다.
또 다른 약학 조성물에는 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물 형태의 유효한 양의 결합 단백질이 관여될 수 있다. 정제를 살균수, 또는 또 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써, 용액이 단위 용량 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 비제한적으로 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스, 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴, 또는 아카시아; 또는 활택제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 또는 활석을 포함한다.
지속-전달 또는 제어-전달 제형 형태의 결합 단백질이 관여되는 제형을 비롯한 본 발명의 추가의 약학 조성물은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 다른 지속 전달 또는 제어 전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생분해성 미세입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사제의 제형화 기술이 또한 당업자에게 알려져 있다. 지속 방출형 제조물의 추가 예는 성형 물품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예를 들어 필름, 또는 미세캡슐을 포함한다. 지속 방출형 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드, L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산을 포함할 수 있다. 지속 방출형 조성물은 또한 리포좀을 포함할 수 있으며, 이는 당분야에 알려진 임의의 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있다.
생체 내 투여에 사용될 약학 조성물은 전형적으로 살균성이어야 한다. 이는 살균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 이러한 방법을 사용한 살균은 동결건조 및 재구성 전에, 또는 후에 수행될 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조 형태로 또는 용액으로 보관될 수 있다. 게다가, 일반적으로 비경구 조성물은 살균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 배치된다.
일단 약학 조성물이 제형화되었으면, 그것은 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 살균 바이알에 보관될 수 있다. 그러한 제형은 즉시 사용 가능한 형태 또는 투여 전에 재구성을 필요로 하는 형태(예를 들어, 동결건조됨)로 보관될 수 있다.
본 발명은 또한 단회 용량 투여 단위를 제조하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 각각 건조 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형물을 갖는 제2 용기를 둘 다 함유할 수 있다. 또한, 단일 및 다중-챔버형 사전-충전 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 동결주사기(lyosyringe))를 함유하는 키트가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
치료적으로 이용될 결합 단백질 약학 조성물의 유효량은, 예를 들어 치료 맥락 및 목적에 따라 달라질 것이다. 따라서 당업자라면 치료에 적절한 투여량 수준이 부분적으로는 전달되는 분자, 결합 단백질이 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 체격(체중, 체표면적, 또는 기관 크기) 및 상태(연령 및 종합 건강)에 따라 달라짐을 인식할 것이다. 따라서, 임상의는 투여량을 적정하고 투여 경로를 변형하여 최적의 치료 효과를 얻을 수 있다.
투여 빈도는 사용되는 제형 중 결합 단백질의 약동학 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 투여량에 도달될 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서 조성물은 단회 용량으로서, 시간이 지남에 따른 2회 이상의 용량(이는 동일한 양의 원하는 분자를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있음)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입물로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가 개량은 당업자에 의해 일상적으로 이루어지며, 당업자에 의해 일상적으로 수행되는 과제의 영역 내에 있다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통하여 확인될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에서 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시 목적을 위한 것이고, 이에 대한 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이며, 본 출원의 사상 및 범주 그리고 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다.
실시예 1: 항-베타-DG ECD, 항-LG-5, 및 항-LG-4/5 항체의 확인.
방법
단백질 발현
쥣과 베타-DG 세포외 도메인(m베타-DG ECD)을 발현시키기 위해, pET22b를 모체 벡터 골격으로 하는, N-말단 말토스 결합 단백질, TEV 절단 부위, m베타-DG(UniProt Q62165, 아미노산 652~746), 및 C-말단 HPC4 태그를 인코딩하는 대장균(E. coli) 코돈-최적화 카세트를 함유하는 작제물을 생성하였다. 작제물을 화학적으로 적격인 Origami B(DE3) pLysS 세포(Novagen) 내로 형질전환하였다. OD = 0.6에서 IPTC로 유도하며, 발현을 37℃에서 수행하였다. 세포를 펠렛화하고 EDTA-비함유 프로테아제 억제제(Roche) 함유 용해 완충액 중에 재현탁하고, 초음파분쇄에 의해 용해시켰다. 세포 용해물을 아밀로스 수지 컬럼(New England Biolabs)에 걸쳐 가공하고, 말토스 결합 단백질을 Turbo TEV 프로테아제(Eton Biosciences)로 절단 제거하고, 소화물을 아밀로스 수지 및 His-Trap FastFlow 컬럼(GE Healthcare)을 통해 가공하여 미소화 융합 단백질 및 절단 말토스 결합 단백질을 제거하고, 마우스 항-HPC4 항체와 커플링된 NHS-활성화 세파로스 4 FastFlow 수지(GE Healthcare)를 통해 플로우를 가공함으로써, m베타-DG-HPC4를 청정화된 세포 용해물로부터 정제하였다. Superdex 75 크기 배제 컬럼(GE Healthcare) 상에서 추가 정제를 수행하고, 고도 정제된 m베타-DG-HPC4(SDS-PAGE 겔 상에 분획 샘플을 걸고 쿠마시 염색하여 결정됨)를 함유하는 용출액 분획을 수집하고 풀링하였다.
쥣과 또는 라미닌 G-유사 5 도메인(mLG-5 또는 hLG-5)을 발현시키기 위해, N-말단 Avi 및 HPC4 태그, 및 mLG-5(UniProt Q60675, 아미노산 2932~3118; SEQ ID NO: 292 참고) 또는 hLG-5(UniProt P24043, 아미노산 2936~3122; SEQ ID NO: 293)를 인코딩하는 포유류 코돈-최적화 카세트를 함유하는 작제물을 생성하였다. 작제물을 엑스피펙타민(Expifectamine) 시약(Thermo Fisher)을 사용해서 Expi293F 세포를 전달감염시키는데 사용하였다. 7일 발현 후, 가용성 바이오틴화 단백질을 마우스 항-HPC4 항체와 커플링된 NHS-활성화 세파로스 4 FastFlow 수지(GE Healthcare)로 상청액으로부터 정제하였다.
쥣과 또는 인간 라미닌 G-유사 4 및 5 도메인(mLG-4/5 또는 hLG-4/5)을 발현시키기 위해, N-말단 mIgG2a 융합 파트너, TEV 절단 부위, Avi 태그, HPC4 태그, 및 mLG-4/5(UniProt Q60675, 아미노산 2725~3118; SEQ ID NO: 292) 또는 hLG-4/5(UniProt P24043, 아미노산 2729~3122; SEQ ID NO: 293)를 인코딩하는 포유류 코돈-최적화 카세트를 함유하는 작제물을 생성하였다. 작제물을 엑스피펙타민 시약(Thermo Fisher)을 사용해서 Expi293F 세포를 전달감염시키는 데 사용하였다. 7일 발현 후, 가용성 단백질을 HiTrap MabSelect SuRe 컬럼(GE Healthcare)으로 상청액으로부터 정제하였다. Turbo TEV 프로테아제(Nacalai USA)를 사용하여 mIgG2a를 mLG-4/5 단백질에서 절단해내고, 소화물을 MabSelect SuRe 수지(GE Healthcare) 및 Ni-NTA 수지(Qiagen) 상에서 가공하여 mIgG2a 및 TEV 프로테아제를 정제 mLG-4/5로부터 제거하였다.
파지 디스플레이
정제 m베타-DG, mLG-5, 또는 mLG-4/5 및 hLG-4/5(예컨대, 마우스 및 인간 펩티드를 사용하는 것이 교대됨)를 자성 토실-활성화 비드(Invitrogen)와 커플링하고 m베타-DG, mLG-5, 또는 mLG-4/5 결합제에 대해 파지 디스플레이 라이브러리를 농축하는 데 사용하였다. 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 m베타-DG 선택에서 사용하였고, Dyax FAB 310 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 hLG-4/5 및 mLG-4/5 선택을 위해 사용하였다. 먼저 미코팅 비드 및 HPC4-6xHis-Avi 태그화된 미관련 단백질을 사용하여 라이브러리에서 비특이적 결합제를 고갈시켰다. 이후 고갈된 라이브러리 상에서 각 회 감소하는 농도의 항원을 사용하여(1회차에 500 nM 항원부터 3회차에 1 nM 항원으로) 3회 선택을 수행하였다. 농축된 라이브러리를 플레이트접종하고, 개별 라이브러리 클론을 픽킹하고, 96-웰 포맷으로 배양하고, 파지 ELISA 결합 검정을 위해 각각의 클론에 대해 파지 모노클로날 항체를 제조하였다.
파지 ELISA 결합 검정
정제 항원(m베타-DG, mLG-5, hLG-5, mLG-4/5, 또는 hLG-4/5)을 1 ㎍/㎖으로 Nunc MaxiSorp 96-웰 ELISA 플레이트(Thermo Scientific) 상에 코팅하였다. 선택된 라이브러리 클론으로부터의 파지 모노클로날 항체를 각 웰에 첨가하고, 양성 또는 음성 결합을 항-M13 유로퓸 표지 이차 항체(GE Healthcare, Perkin Elmer에서 사제 표지된 항체)를 사용하여 검출하였다.
가변 영역 서열분석
양성 결합 클론의 박테리아 스톡을 PCR 증폭하고, 서열분석하고, 고유한 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 서열을 확인하였다.
결과
베타-DG, LG-5, 및 LG-4/5에 대한 특이적 친화도를 갖는 몇몇 파지 라이브러리 클론이 확인되었다: 10개 클론이 베타-DG에 특이적으로 결합하였고, 15개 클론이 LG-4/5에 특이적으로 결합하였다. 이들 클론의 서열분석은 각 클론의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역이 상기 표 D 내지 I에 나타내는 바와 같이 구별됨을 드러내었다(예컨대, 클론 B04, B06, CL-40968, CL-40992, CL-41136, CL-41400, 및 CL-41500 참고). 이들 클론의 상보성-결정 영역(CDR)이 상기 표 A 내지 C에서 확인된다.
실시예 2: 베타-DG, LG-5, 및 LG-4/5에 대해 표적화된 하이브리도마, 모노클로날 항체, 및 키메라 항체의 생성.
방법
세포주 제조
N-말단 myc 태그 및 베타-DG의 세포외 및 내인성 막통과 도메인(마우스 UniProt Q62165, 아미노산 652~893; 인간 UniProt Q14118, 아미노산 654~895)을 함유하는 작제물의 코돈 최적화에 의해 인간 또는 쥣과 베타-DG 표면 발현을 갖는 안정한 세포주를 생성하였다. 부착성 인간 배아 신장 세포(HEK) 및 부착성 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1)를 리포펙타민(Thermo Fisher)을 사용해서 전달감염시키고 세포를 제네티신(Geneticin(Gibco))으로 선택하였다. 생존 세포를 단세포 클론화를 위해 연속 희석하고 베타-DG의 표면 발현을 항-myc 유세포 측정에 의해 확인하였다.
N-말단 myc 태그, Gly/Ser 링커, LG-5(마우스 UniProt Q60675, 아미노산 2932~3118; 인간 UniProt P24043, 아미노산 2936~3122), 및 포유류 발현을 위한 Tfr1 막통과 도메인을 함유하는 작제물의 코돈 최적화에 의해 인간 또는 쥣과 LG-5 표면 발현을 갖는 안정한 세포주를 생성하였다. 부착성 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO-K1)를 리포펙타민(Thermo Fisher)을 사용해서 전달감염시키고 세포를 제네티신(Gibco)으로 선택하였다. 생존 세포를 단세포 클론화를 위해 연속 희석하고 베타-DG의 표면 발현을 항-myc 유세포 측정에 의해 확인하였다.
N-말단 myc 태그, Gly/Ser 링커, LG-4/5(마우스 UniProt Q60675, 아미노산 2725~3118; 인간 UniProt P24043, 아미노산 2729~3122), 및 포유류 발현을 위한 Tfr1 막통과 도메인을 함유하는 작제물의 코돈 최적화에 의해 인간 또는 쥣과 LG-4/5 표면 발현을 갖는 안정한 세포주를 생성하였다. 부착성 인간 배아 신장 세포(HEK)를 리포펙타민(Thermo Fisher)을 사용해서 전달감염시키고 세포를 제네티신(Gibco)으로 선택하였다. 생존 세포를 단세포 클론화를 위해 연속 희석하고 베타-DG의 표면 발현을 항-myc 유세포 측정에 의해 확인하였다.
마우스 면역화
Balb/c 및 Trianni 마우스를 h베타-DG, hLG-5, 또는 hLG-4/5로 면역화한 후, 2주마다 3~4회 이들 단백질로 추가접종하였다. hLG-4/5로 면역화된 마우스에 있어서, 마우스에 추가로 2주마다 인간 메로신으로 3회 그리고 인간 및 마우스 LG-5 간에 동일한 서열을 갖는 합성 펩티드(아미노산 서열 =GFAKAVGGFKVGLDLLVEFE; SEQ ID NO: 295)로 1회 추가접종하였다.
하이브리도마 생성
아데노신 포스포리보실트랜스퍼라제(APRT)가 결핍된 마우스 골수종 세포(센다이 바이러스와 융합된 Balb/c B-림프모구 세포주, SP2/0로부터)와 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마 세포를 제조하였다. HAT 선택(하이포잔틴, 아자세린, 및 티미딘) 및 연속 희석을 수행하여 단세포 클론화를 달성하였다.
ELISA 항체 결합 검정
ELISA 검정을 위해, 인간 베타-DG 또는 LG-4/5로 코팅된 플레이트를 PBS 중 5% 우태 혈청으로 차단하고, 각각의 웰을 개별 배양 상청액과 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고, HRP 콘주게이션된 항-마우스 Fc 이차 항체와 인큐베이션하고, PBS로 다시 세척하고, 비색 측정을 위해 발색시켰다.
형광 활성화 세포 정렬(FACS) 항체 결합 검정
FACS 검정을 위해, 인간 또는 쥣과 베타-DG 또는 LG-4/5 표면 발현을 갖는 안정한 세포(상기 참고)를 항체-함유 배양 상청액과 인큐베이션하고, PBS로 세척하고, FITC-콘주게이션된 항-마우스 Fc 이차 항체(Thermo Fisher)와 인큐베이션하고, PBS로 다시 세척하고, 유세포 측정장치 상에서 분석하였다.
표면 플라즈몬 공명(Biacore) 동력학 검정
제조업체의 프로토콜에 따라(GE Healthcare) Biacore 동력학 검정에 의해 항체/항원 결합 친화도 및 온/오프-율을 측정함으로써 하이브리도마 항체(배양 상청액에 함유됨)를 추가 특성규명하였다. 결합을 위해 사용된 항원은 인간 또는 쥣과 베타-DG 또는 LG-4/5였다.
모노클로날 항체 생성
하이브리도마 클론을 증식시키고 초저 IgG 우태 혈청 보충물질이 함유된 최종 플라스크에 씨드접종하였다. 7일 후, 상청액을 수확하고, HiTrap MabSelect SuRe 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 모노클로날 항체를 정제하였다. 생성 항체를 다시 ELISA, FACS, 및 Biacore 동력학 검정(GE Healthcare)에 의해 평가하여 항체 결합 특성을 확인하였다.
면역형광
미고정 냉동 인간 및 마우스 근육 조직 섹션으로 면역형광 염색을 수행하였다. 근육 조직 섹션을 베타-DG 또는 LG-4/5에 대한 정제 항체로 염색하고, 세척하고, 형광 표지된 항-마우스 IgG 이차 항체로 염색하고, 세척하고, 실장하고, 형광 현미경을 사용해서 조영하였다.
가변 영역 서열분석
RNeasy Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 고친화도 항체를 생성한 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 단리하고, SMARTer RACE cDNA 증폭 키트(Clontech)를 사용해서 제1쇄 cDNA를 합성하였다. 이소형 특이적 프라이머를 사용해서 cDNA 말단의 5'-신속 증폭(5'-RACE) PCR에 의해 VH 및 VL 유전자 분절을 증폭시켰다. 증폭된 PCR 단편을 클로닝하고 서열분석하였다. 예컨대, 클론 TDG-2, TDI-11, TDI-23, TDI-38, TLF39, TLF86, TLG3/TLG4, TLG26, TLI-3, TLI-7, TTLK71-4-6, TTLK123-3, TTLK145-6-3, TTLK170-2, WJL10, 및 WJL48을 참고한다.
키메라 항체 제조
5'-RACE PCR로부터 생성된 VH 및 VL 서열을 포유류 발현을 위해 코돈 최적화하고 합성하였다. VH 서열을 인간 IgG1과 함께 포유류 발현 벡터 내로 서브클로닝하고, VL 서열을 불변 인간 카파 사슬과 함께 포유류 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 엑스피펙타민 시약(Thermo Fisher)을 사용해서 이들 작제물로 Expi293F 세포를 공동-전달감염시켜 키메라 항체를 발현시켰다. 7일 발현 후, HiTrap MabSelect SuRe 컬럼(GE)으로 상청액으로부터 항체를 정제하였다. 정제 항체를 ELISA, FACS, 및 Biacore(GE Healthcare)에 의해 재스크리닝하여 베타-DG, LG-5, 또는 LG-4/5에 대한 결합 친화도를 확인하였다. 항체가 근육 조직에서 이의 각각의 항원에 결합했음을 확인하기 위해, 미고정 냉동 인간 및 마우스 근육 조직 섹션으로의 면역형광 염색을 수행하였다.
결과
베타-DG, LG-5, 또는 LG-4/5에 특이적인 항체를 생성한 하이브리도마를 스크리닝하고 선택하기 위해, ELISA, FACS 분석, 및 Biacore 동력학 검정을 사용해서 항체 결합을 평가하였다. ELISA 검정은 베타-DG, LG-5, 또는 LG-4/5에 대한 항체의 결합 친화도 범위를 나타내었고, 몇몇 샘플은 강력한 비색 신호를 제공하였다(3개 항체에 대한 예시적 데이터를 아래의 표 J에 제공함).
[표 J]
강력한 비색 신호를 제공하는 샘플을 이의 표면 상에서 베타-DG 또는 LG-4/5를 발현하는 세포로의 결합 친화도에 대해 FACS를 사용하여 검정하였다. FACS 분석은 클론 C21 및 C3으로부터 유래된 항체가 쥣과 및 인간 LG-4/5 둘 다에 대해 결합 친화도를 가짐을 드러내었다(각각 도 3c & 3g). 이들 항체는 미미한 형광 검출로 나타난 바와 같이, 베타-DG 또는 LG-4/5의 표면 발현이 없는 대조군 세포에 결합하지 않았다.
다양한 양의 재조합 인간 라미닌-2(Biolamina), 쥣과 LG-5, 인간 LG-5, 인간 LG4/5를 니트로셀룰로스막 상에 도트 블로팅하고 항-라미닌-2 항체로 탐침분석하였다. 결과는 항체가 라미닌-2 또는 LG-5를 함유하는 그 단편을 인식함을 시사하였다(도 3d, C21에 대해 상부). 항체 특이성을 결정하기 위해, 상이한 알파 사슬을 갖는 상이한 라미닌 이소형을 블롯 당에 도트처리하였다. 알파-2를 함유하는 mLG-5 및 인간 라미닌-2만 인식되어, 항체의 결합 특이성을 뒷받침하였다(도 3d, C21에 대해 하부; C3에 대해 도 3h).
항-디스트로글리칸 항체 클론을 또한 특성규명하였다. 동력학은 평가된 모든 항체가 이의 각각의 항원에 대해 고친화도를 나타냄을 드러내었으며, 표 K 및 도 3i & 3j(클론 AS30) 및 3m & 3n(클론 AS19)에 나타낸 바와 같이 대부분의 KD는 10-9 M 범위였다(나노몰 농도 감도). 또한, 매우 높은 온-율 및 오프-율을 가진 항-베타-DG 클론 AS19를 제외하고(표 K), 평가된 항체에 대한 온-율 및 오프-율은 고친화도 항체에 있어서 매우 전형적이었다.
[표 K]
클론 AS30 및 AS19를 특성규명하기 위해, 다양한 양의 재조합 마우스 또는 인간 베타-DG ECD, 재조합 디스트로글리칸(R&D Systems), C2C12 세포 용해물, TA 용해물 및 음성 대조군으로서 파브라자임(Fabrazyme)을 니트로셀룰로스막 상에 도트 블로팅하고 항-베타-DG 항체로 탐침분석하였다(AS30에 대해 도 3k; AS19에 대해 도 3o). 결과는 베타-DG를 함유하는 모든 단백질이 검출되었음을 시사한다. C2C12 또는 TA 용해물로는 신호가 검출되지 않았으며, 이는 이들 샘플 내의 매우 소량의 베타-DG에 기인할 수 있다. 예상되는 바와 같이, 항체는 음성 대조군 파라자임도 검출하지 않았다.
비-변성 조건 하에 가용화된 C2C12 세포 용해물로부터의 베타-DG의 면역침전을 항-베타-DG 클론 AS30 또는 AS19로 수행하였다. 베타-DG/항체 복합체를 단백질 A 비드에 의해 포획하여 SDS-PAGE를 수행한 후, R&D Systems의 항-알파-DG 및 항-베타-DG로 재탐침분석하였다. 알파-DG 및 베타-DG가 모두 면역침전되어, 이들이 가용화 후 복합체 중에 유지됨을 시사하였고, 항-베타-DG 항체 클론의 결합은 알파-DG의 베타-DG로의 결합을 방해하지 않았다(AS30에 대해 도 3l; AS19에 대해 도 3p).
하이브리도마 클론을 증식시키고 모노클로날 항체를 정제한 후, 항체를 ELISA, FACS, 및 Biacore에 의해 재스크리닝하여 결합 친화도를 확인하였다. 결과는 배양 상청액으로부터의 항체에 대해 생성된 것과 극히 유사하여, 항체가 증폭 후 이의 동력학 특징을 유지하였음을 확인시켜주었다.
항체가 풍부한 베타-DG 및 LG-4/5를 함유하는 근육 조직에 결합할 수 있는지를 결정하기 위해, 정제 항체를 사용하여 마우스 및 인간 근육 조직 상에서 면역형광 염색을 수행하였다. 미고정 조직은 천연 항원 입체형태가 보존되도록 사용하였다. 특징적인 근육 근육속막 염색이 인간 및 마우스 조직에 대해 실증되어, C21(도 4a) 및 C3(도 4b)에 대해 특이적인 LG-4/5 결합, 및 AS30(도 4c) 및 AS19(도 4d)에 대해 특이적인 베타-DG 결합을 시사하였다. 이차 항체로만 염색된 섹션은 임의의 형광 신호를 드러내지 않았다.
실시예 3: 라미닌-2 알파 서브유닛의 베타-DG 및 LG-4/5 도메인을 인식하는 이중특이적 항체의 생성
방법
4가 이중특이적 일렬 Ig(TBTI) 항체 생성
생성된 하이브리도마 세포로부터 수득된 VH 및 VL 서열을 포유류 발현을 위해 코돈-최적화하고 합성하였다(Genscript). 경쇄를 발현하는 작제물을 생성하기 위해, 베타-DG에 특이적인 하나의 VL 서열, (G4S)2 링커, LG-4/5에 특이적인 하나의 VL 서열, 및 인간 카파 사슬(Genbank Q502W4) 또는 쥣과 카파 사슬(Genbank BAB33404)을 함께 융합시키고 Durocher 등에 의해 기재된 pTT 벡터(Nucl. Acids Res. 2002, 30(2), E9)의 유사체인 일시적 에피솜 발현 벡터 pXL 내로 클로닝하였다. 중쇄를 발현하는 작제물을 생성하기 위해, 베타-DG에 특이적인 하나의 VH 서열, (G4S)2 링커, LG-4/5에 특이적인 하나의 VH 서열, 및 인간 IgG1(Genbank Q569F4) 또는 쥣과 IgG1(GenBank AAA75163.1)을 함께 융합시키고(도 4a) 발현 벡터 pXL 내로 클로닝하였다. 사용된 VH 및 VL 서열은 LG-4/5-특이적 결합에 대해 클론 AN01, C3, 및 C21, 및 베타-DG-특이적 결합에 대해 클론 B6, AS19, 및 AS30으로부터 수득하였다.
이들 작제물을 HEK293 FreeStyle 293-F 또는 Expi293 세포(Thermo Fisher) 내로 공동-전달감염시켰다. 7일 발현 후, HiTrap MabSelect™ SuRe™ 단백질 A 컬럼(GE Healthcare)으로 상청액으로부터 항체를 정제하였다.
교차 이중 가변 도메인 Ig(CODVIg) 항체 생성
생성된 하이브리도마 세포로부터 수득된 VH 및 VL 서열을 포유류 발현을 위해 코돈-최적화하고 합성하였다(Genscript). 경쇄를 발현하는 작제물을 생성하기 위해, LG-4/5에 특이적인 하나의 VL 서열, L1 링커, 베타-DG에 특이적인 하나의 VL 서열, L2 링커, 및 인간 카파 사슬(Genbank Q502W4) 또는 쥣과 카파 사슬(Genbank BAB33404)을 함께 융합시키고 발현 벡터 pXL 내로 클로닝하였다. 중쇄를 발현하는 작제물을 생성하기 위해, 베타-DG에 특이적인 하나의 VH 서열, L3 링커, LG-4/5에 특이적인 하나의 VH 서열, L4 링커, 및 인간 IgG1(Genbank Q569F4) 또는 쥣과 IgG1(GenBank AAA75163.1)을 함께 융합시키고 발현 벡터 pXL 내로 클로닝하였다. 사용된 링커 서열의 특정 조합을 아래에 제공한다.
이들 작제물을 HEK293 FreeStyle 293-F 또는 Expi293 세포(Thermo Fisher) 내로 공동-전달감염시켰다. 7일 발현 후, HiTrap MabSelect™ SuRe™ 단백질 A 컬럼(GE Healthcare)으로 상청액으로부터 항체를 정제하였다.
순차적 Biacore 결합 분석
모체 모노클로날 항체(AS19, C3 및 C21) 및 3개의 이중특이적 항체(TBTI로 AS19 × C3 및 AS30 × C3, 및 CODVIg로 AS30 × C3)를 각각 개별 CM5 시리즈 S Biacore 칩(GE Healthcare) 상에 고정하였다. 인간 또는 쥣과 LG-4/5에 이어 인간 또는 쥣과 베타-DG의 순서로 각각의 칩에 걸쳐 흘리고, 결합을 평가하였다.
이중 덱(deck) 샌드위치 ELISA
96-웰 플레이트를 50 ng 인간 LG-4/5로 코팅하고 PBS 중 5% 우태 혈청으로 차단하였다. 각각의 웰을 1 ㎍의 생성된 이중특이적 항체(쥣과 IgG 골격)와 인큐베이션하였다. 2시간 후, 웰을 PBS로 세척하고 웰 당 16 ng 내지 1 ㎍의 인간 hIgG1 Fc 항체 영역에 융합된 인간 베타-DG(h베타-DG-hFc)와 재-인큐베이션하였다. 2시간 후, 웰을 PBS로 세척하고, 45분 동안 HRP 콘주게이션된 항-hFc 이차 항체와 인큐베이션하고, PBS로 다시 세척하고, 비색 측정을 위해 발색시켰다.
결과
항체를 상술된 바와 같은 4가 이중특이적 일렬 IgG 포맷(TBTI; 도 5a)뿐만 아니라 교차 이중 가변 도메인 IgG 포맷(CODVIg; 도 5b)을 포함하는 여러 이중특이적 포맷으로 조작하였다. 이들 포맷을 생성하기 위해, 각각의 작제물에 대한 경쇄 및 중쇄 플라스미드를 합성하였다. 기재된 모노클로날 서열로부터의 항-βDG의 가변 경쇄 영역에 이어 링커, 이어서 항-LG4/5 모노클로날로부터의 가변 경쇄 영역에 이어 추가 링커, 이어서 불변 경쇄 도메인을 갖는 것. 동일한 원리를 사용하여 중쇄 플라스미드를 개발한 후 이들의 발현을 위해 포유류 세포에서 공동-전달감염시켰다. 다중 링커 조합을 시도하였고, 두 가변 영역 배향을 모두 평가하였다(즉, 항-βDG 가변 영역보다 불변 영역에서 더 먼 항-LG4/5를 갖는 배향 및 반대 배향).
베타-DG(클론B06, AS19, 및 AS30 사용) 및 LG-4/5(클론 AN01, C3, 및 C21 사용)를 인식하는 이중특이적 항체(biAb)를 TBTI 또는 CODVIg 포맷으로 생성하였다.
여러 링커 조합을 시도하였고, 두 가변 영역 배향을 모두 평가하였다(즉, 항-βDG 가변 영역보다 불변 영역에서 더 먼 항-LG4/5를 갖는 배향 및 반대 배향). TBTI(T1T2 및 T5T6)에 있어서, 글리신 또는 세린인 10개의 잔기(예컨대, GGGGSGGGGS; SEQ ID NO: 294)로 구성된 경쇄 가변 영역 간에 링커를 사용하였고 제2 가변 영역 및 불변 영역 간에는 링커를 사용하지 않았다. 중쇄 가변 영역 간에 동일한 링커(글리신 또는 세린인 10개의 잔기)를 사용하였고 제2 중쇄 가변 및 불변 영역 간에는 링커를 사용하지 않았다. CODVIg 포맷에 있어서, 2개 세트의 링커 길이: 10-10-0-0 및 7-5-1-2(L1-L2-L3-L4에 대한 잔기 #)를 사용하였다. CODVIg C5C6 링커는 가변 경쇄 간 글리신 또는 세린인 10개의 잔기 및 제2 가변 영역과 경쇄 불변 영역 간 글리신 또는 세린인 10개의 잔기로 구성되었다. 중쇄 상에서는 링커를 사용하지 않았다. 이들 조합에 대한 링커 서열은 하기와 같다(L1, L2, L3, L4로 표시함): GQPKAAP(SEQ ID NO: 297), TKGPS(SEQ ID NO: 298), S, RT; GGSGSSGSGG(SEQ ID NO: 299), GGSGSSGSGG(SEQ ID NO: 299), 0,0; 및 EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO: 296), GG, EPKSDKTHTSPPSP(SEQ ID NO: 296), GG. 생성된 이중특이적 항체의 목록을 아래에서 표 L에 제공한다.
[표 L]
biAb가 LG-4/5 및 베타-DG에 동시에 결합하는 능력을 가짐을 확인하기 위해, 순차적 Biacore 분석(GE Healthcare) 및 이중 덱 샌드위치 ELISA 검정을 수행하였다.
LG-4/5 또는 베타-DG에 대한 모체 mAb 및 항-LG4/5 및 베타-DG의 biAb를 biacore 칩 상에서 포획한 후 인간 LG4/5 및 인간 베타-DG를 순차적으로 흘려서 두 항원에 대한 이의 동시적 결합을 결정하였다. 순차적 Biacore 분석은 이중특이적 항체가 인간(1st 피크, 도 6a) 또는 쥣과 LG-4/5(1st 피크, 도 6b)에 먼저 결합할 수 있고, 이어서 인간(2nd 피크, 도 6a) 또는 쥣과 베타-DG(2nd 피크, 도 6b)와 추가 연합할 수 있음을 드러내었다. 대조적으로, 모체 모노클로날 항체는 LG-4/5(도 6a 및 도 6b에서 C3 및 C21) 또는 베타-DG(도 6a 및 도 6b에서 AS19) 중 하나의 표적에만 결합할 수 있었다.
이중 덱 샌드위치 ELISA는 이중특이적 항체가 hLG-4/5 및 h베타-DG에 동시에 결합할 수 있음을 드러내었다. 비색 신호는 hLG-4/5 및 h베타-DG-hFc가 둘 다 검정에 첨가되는 경우에만 검출될 수 있었다(도 7). 모체 모노클로날 항체가 사용되는 경우 또는 h베타-DG-hFc가 생략되는 경우에는 신호가 검출되지 않았다. 3개의 이중특이적 항체(biAb), T1T2, T5T6, 및 C5C6이 신호에 참여하여 두 표적 모두에 대한 동시적 결합을 시사하였다. 모체 항-LG4/5 또는 항-베타-DG mAb, 또는 2번째 단계에서 베타-DG-hFc가 없는 biAb는 모두 상기 검정에서 음성이었다.
실시예 4: 이중 특이적 항체의 LARGE myd-3J/GrsrJ 마우스 내로의 근육내 주사.
방법
LARGE myd-3J/GrsrJ 마우스 모델
Jackson lab의 LARGEmyd-3J/GrsrJ(스톡 #008581) 마우스는 LARGE 유전자에서의 돌연변이에 의해 유도된 알파-디스트로글리칸병증의 마우스 모델이다. LARGE 유전자의 돌연변이는 각각 44.4 Mb 및 83.8 Mb에서의 마커를 갖는 D8Mit65 및 DMit249 사이에 맵핑된다; LARGE 유전자는 75.7 Mb에 위치한다. LARGE에 대해 동종접합성인 마우스는 일반적으로 2 내지 3월령에 근육 퇴행의 증거를 나타내지 시작하지만, 일부 동물은 이유기만큼 일찍 증상을 나타낼 수 있다. 꼬리로 들어올렸을 때 뒷다리를 바깥쪽으로 벌리지 못하는 무능이 초기 표현형이며 이는 연령 증가와 함께 흔들리는 걸음걸이, 이어서 뒷다리 끌기를 포함하여 진행된다.
이중특이적 항체 주사
10마리 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스의 1개 군에 왼쪽 및 오른쪽 앞정강(TA)근 내로 근육내 주사를 놓았다. 왼쪽 TA에는 주사 당 50 ㎕ 식염수 중 0.7 ㎍/㎕의 biAb(T1T2; 쥣과 Fc 골격)를 2회 주사하였다. 오른쪽 TA에는 주사 당 50 ㎕ 식염수 중 0.7 ㎍/㎕의 모체 AS19 및 C3 항체의 1:1 중량 대 중량 혼합물을 2회 대조군 주사하였다. 2회 주사는 3일 간격으로 놓았다.
운동-유도 조직 손상
마지막 근육내 주사 1일 후, 모든 마우스가 체중 10 g 당 50 ㎕로 제공되는 에반스 블루 염료(EBD) 10 ㎎/㎖의 복강내 주사(IP)를 수여받았다. EBD의 IP 1일 후, 모든 마우스가 지칠 때까지 강제 트레드밀을 통해 운동시켰다. 동물을 표준 IACUC 프로토콜에 따라 CO2로 안락사시켰다.
조직 제조 및 면역형광 염색
안락사 후, TA 근육을 제거하고, 절단하고, 최적 절단 온도 화합물에 배치하였다. 이어서 조직을 2-메틸 부탄 드라이 아이스조를 통해 급속 냉동하였다. 조직을 10 마이크론 두께로, 크리오스타트에서 동결-섹션처리하였다. TA로부터 10 마이크론씩 거리를 두고 4개의 상이한 수준에서 절단하였다(3개씩).
슬라이드 섹션을 저온 PBS 내로 빠르게 침지시키고 15분 동안 빙냉 아세톤 중에 고정하였다. 슬라이드를 세척하고 4℃에서 하룻밤 동안 차단하였다(PBS 중 2% BSA 및 1% 일반 염소 혈청). 다음 날, 슬라이드를 2시간 동안(실온에서) 1:100 희석도의 항-mIgG Alexa Fluor 488(Invitrogen)과 인큐베이션하였다. 슬라이드를 세척하고, DAPI(Vector Labs) 함유 Vectashield 실장 배지를 사용하여 실장하였다. 슬라이드를 적절한 필터 세트를 이용하여 도립 현미경(Olympus IX71)으로 가시화하였다.
에반스 블루 염료(EBD) 근섬유 손상 평가
조직 섹션을 면역형광 염색하지 않는 것을 제외하고 상기와 같이 가공하였다. 각 섹션 상의 모든 EBD 양성 섬유를 왼쪽 TA(biAb IM) 및 오른쪽 TA(모노클로날 모체 항체 IM) 모두에 대해 수동 계수하였다
결과
biAb가 마우스 근육 조직에서 천연 항원에 결합할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 야생형 또는 알파-디스트로글리칸병증의 쥣과 모델인 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스의 미고정 냉동 섹션을 biAb(T1T2, T5T6, C5C6) 또는 모체 mAb로 염색하였다. 결과는 biAb뿐만 아니라 단일특이적 모체 mAb가 야생형(도 8a) 및 LARGEmyd-3J/GrsrJ(도 8b) 마우스 근육 조직 섹션 모두에서 결합할 수 있음을 시사하였다.
이어서 이중특이적 항체를 야생형 또는 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에 근육내 투여하였다(연구 개요는 도 8c에 나타냄). 운동-유도 조직 손상에 대한 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위해, 면역형광 및 에반스 블루 염료 근섬유 염색을 운동시킨 마우스로부터의 조직 상에서 수행하였다. 면역형광은 이중특이적 항체가 마우스 근육 조직(왼쪽 또는 오른쪽 앞정강(TA)근)에 잘 결합하며 마지막 항체 주사 2일 후 검출 가능함을 드러내었다(도 8e). biAb 처리 왼쪽 TA는 오른쪽의 반대쪽 대조군 TA에 비해 유의미하게 더 적은 EBD 양성 섬유를 가졌다(도 8d). 에반스 블루 염료는 모체 항체 혼합물로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 조직의 여러 근섬유에 침투하여, 염료가 막 손상을 갖는 근섬유만 침투하여 염색시키므로 운동-유도된 손상을 시사하였다(도 8e). 대조적으로, 에반스 블루 염료는 이중특이적 항체로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 조직의 유의미하게 더 적은 근섬유를 침투하였다(도 8e). 이는 모체 모노클로날 항체가 아니라 이중특이적 항체의 국소 주사가 알파-디스트로글리칸병증에 대한 생체내 포유류 모델에서 운동-유도된 손상으로부터 근육을 보호하였음을 시사한다.
실시예 5: 이중특이적 항체의 LARGE myd-3J/GrsrJ 마우스 내로의 전신 전달.
방법
항체 전달
운동-유도 조직 손상 평가를 위해, LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스의 4개의 상이한 군에 측면 꼬리 정맥(IV)을 통해 단회 용량의 모체 또는 이중특이적 항체(쥣과 Fc 영역 포함)를 정맥내 또는 복강내(IP) 주사하였다. 각각의 군은 하기: 모체 항-LG-4/5(클론 C3, IV), 모체 항-베타-DG(클론 AS19, IV), biAb(AS19 × C3, IV), 및 biAb(AS19 × C3, IP) 중 하나를 수여받았다. 주사 1일 후, 모든 마우스가 체중 10 g 당 50 ㎕로 제공되는 에반스 블루 염료(EBD) 10 ㎎/㎖의 복강내 주사(IP)를 수여받았다.
거동 평가, 크레아틴 키나제 측정, 및 생체분포 면역형광 실험을 위해, LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스(11~19주령)를 처리 전 2개 군(n=16)으로 무작위화하였다. 1개 군의 마우스에 7주 동안 주 2회 마우스 ㎏ 당 30 ㎎ biAb(T1T2)를 투여하였다. 제2 군의 마우스에는 7주 동안 주 2회 모체 모노클로날 항체 혼합물(AS19 및 C3, 각각의 마우스 ㎏ 당 15 ㎎)을 투여하였다. 아나필락시스 반응을 예방하기 위해, 5 ㎎/㎏의 디펜하이드라민을 항체 투여 10분 전에 복강내로 사전-투여하였다. 야생형 마우스를 대조군으로서 식염수로 처리하였다.
운동-유도 조직 손상
복강내 EBD 주사 1일 후, 모든 마우스가 지칠 때까지 강제로 트레드밀을 통해 운동시켰다. 동물을 표준 IACUC 프로토콜에 따라 CO2로 안락사시켰다.
거동 평가 및 크레아틴 키나제 측정
그립 강도 평가를 위해, 마우스를 평가 전 10분 동안 평가실에서 순응하도록 두었다. 그립 강도 미터(Columbia Instruments, Columbus, OH)를 안정한 표면 상에 수평으로 실장하였다. 평가 마우스를 그 앞발톱 및 뒷발톱이 모두 그리드 상에서 쥘 수 있도록 하며 그리드 상부에 온건히 배치하였다. 이어서 그립을 풀 때까지 동물 꼬리를 잡고 온건히 뒤로 당겼다. 그립이 풀리는 시점에 생성되는 힘의 양을 장력 게이지(그램)에서 기록하였다. 각 동물에 대해 상기 절차를 3회 수행하였고, 이어서 그립 힘 값을 3회 평가의 평균으로 계산하였다.
와이어 행 평가를 위해, 각각의 동물을 와이어 스크린 상에 놓고, 동물이 와이어를 잡을 때까지 이를 온건하게 한 쪽에서 다른 쪽으로 흔들었다. 이어서 와이어-스크린을 쿠션 패드 위 약 2피트까지 올리고 위 아래를 뒤집었다. 동물이 와이어 스크린에서 쿠션 패드로 떨어지는 시간(대기시간)을 기록하였고, 최대 컷-오프 시간은 60초였다. 평가 사이에 적어도 5분의 휴식기를 두고, 각각의 동물로 2회 평가하였다.
크레아틴 키나제(CK) 수준을 연구 시작 시(이중특이적 항체 처리 전) 및 연구 말기에(이중특이적 항체 처리 7주 후 1 hr 트레드밀 운동-후) 표준 비색 검정을 통해 측정하였다.
조직 제조 및 면역형광 염색
표적 기관에서 이중특이적 항체의 검출을 위해, 이중특이적 항체의 마지막 근육내 주사 4일 후 동물을 안락사시켰다. TA 근육을 제거하고, 절단하고, 최적 절단 온도 화합물에 배치하였다. 이어서 조직을 2-메틸 부탄 드라이아이스조를 통해 급속 냉동하였다. 조직을 10 마이크론 두께로, 크리오스타트에서 동결-섹션처리하였다.
운동-유도 조직 손상 샘플에 대해, 운동 후 TA 근육을 제거하고, 절단하고, 최적 절단 온도 화합물에 배치하였다. 이어서 조직을 2-메틸 부탄 드라이아이스조를 통해 급속 냉동하였다. 조직을 10 마이크론 두께로, 크리오스타트에서 동결-섹션처리하였다. TA로부터 10 마이크론씩 거리를 두고 4개의 상이한 수준에서 절단하였다(3개씩).
두 세트의 조직 샘플 모두에 대해, 슬라이드를 세척하고 4℃에서 하룻밤 동안 차단하였다(PBS 중 2% BSA 및 1% 일반 염소 혈청). 다음 날, 슬라이드를 2시간 동안(실온에서) 1:100 희석도의 항-mIgG Alexa Fluor 488(Invitrogen)과 인큐베이션하였다. 슬라이드를 세척하고, DAPI(Vector Labs) 함유 Vectashield 실장 배지를 사용하여 실장하였다. 슬라이드를 적절한 필터 세트를 이용하여 도립 현미경(Olympus IX71)으로 가시화하였다.
에반스 블루 염료(EBD) 근섬유 손상 평가
조직 섹션을 면역형광 염색하지 않는 것을 제외하고 상기와 같이 가공하였다. 각 섹션 상의 모든 EBD 양성 섬유를 왼쪽 TA(biAb IM) 및 오른쪽 TA(모노클로날 모체 항체 IM) 모두에 대해 수동 계수하였다
결과
LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에 30 ㎎/kg의 biAb(T1T2) 및 대조군으로서 모체 항체를 꼬리 정맥 주사에 의해(IV) 또는 비교를 위해 복강내로(IP) 투여하였다. 투여 24, 48, 72, 및 96 hr 후 안구 방혈에 의해 혈액 샘플을 수집하고, 베타-DG(도 8f) 또는 LG4/5(나타내지 않음)로 코팅된 ELISA에 의해 항체 수준을 측정하였다. biAb는 모체 mAb와 유사한 제거율을 가졌다. IP 투여는 고농도를 생성했으나, biAb의 전체 약동학은 IV에 의한 투여에서와 유사하였다. 예상된 바와 같이 베타-DG가 코팅을 위해 사용되는 경우 항-LG4/5 모체 mAb는 신호를 갖지 않았다.
다음으로 이중특이적 항체를 야생형 또는 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에 IV 투여하였다. 거동 평가는 이중특이적 항체가 투여된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스가 모노클로날 모체 항체가 투여된 마우스(도 9a & 9b)에 비해, 근육 기능의 척도인 그립 강도 평가 및 와이어 행 평가에서 더 우수한 수행능력을 드러내었다(도 9a & 9b). 식염수로 처리된 대조군 야생형 마우스를 또한 도 9a & 9b에 나타낸다. 이들 데이터는 이중특이적 항체가 근육 기능을 개선시켰음을 실증한다. 이중특이적 항체가 투여된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스는 또한 트레드밀 평가에서 수행능력을 유지한 반면, 대조군 항체로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스는 수행능력 저하를 나타내었다(도 9c).
트레드밀 평가에서의 불량한 수행능력에도 불구하고, 대조군 항체로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스는 증가된 CK 수준을 나타내었다. 혈청 CK 수준의 유의미한 상승은 근육속막 보호의 부재로 인한 급성 근육 손상을 시사한다. 연구 말기에, 크레아틴 키나제 수준은 모노클로날 모체 항체로 처리된 마우스에 비해 이중특이적 항체로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에 있어서 유의미하게 더 낮았다(도 9d). 이중특이적 항체로의 처리는 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스에서 크레아틴 키나제 수준을 낮추어, 이중특이적 항체가 근육을 손상으로부터 보호하는 것을 도움을 시사하였다.
운동-유도 조직 손상에 대한 이중특이적 항체의 효과를 연구하기 위해, 에반스 블루 염료 근섬유 염색을 운동시킨 마우스로부터의 조직 상에서 수행하였다. 에반스 블루 염료는 염료가 막 손상을 갖는 근섬유만 침투하여 염색시키므로, 모체 항체 혼합물로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 조직의 여러 근섬유에 침투하여 운동-유도된 손상을 시사하였다 대조적으로, 에반스 블루 염료는 모체 항체로 처리된 마우스에서에 비해 이중특이적 항체로 처리된 LARGEmyd-3J/GrsrJ 마우스 조직의 유의미하게 더 적은 근섬유를 침투하였다(도 10). 이는 모체 모노클로날 항체가 아닌 이중특이적 항체의 전신 전달이 근육을 운동-유도 손상으로부터 보호하였음을 시사한다.
표적 기관에서 이중특이적 항체의 검출을 위해, 이중특이적 항체의 마지막 근육내 주사 4일 후 동물을 안락사시키고 면역형광 염색을 수행하였다. 염색은 4일 후에도, IV 또는 복강내 투여된 이중특이적 항체 T1T2(AS19×C3)가 여전히 사두근, TA, 횡경막, 및 심장에서 근육 조직에 특이적으로 결합됨을 드러내었지만, 음성 대조군으로 사용된 뇌 조직은 염색시키지 않았다(도 11, 첫 번째 및 두 번째 열). 모체 모노클로날 항체 AS19는 잠재적으로 항체의 빠른 오프-율에 기인하여(표 K 참고), 근육 조직도 염색시키지 않았다(도 11, 세 번째 열). 그러나, 모체 모노클로날 항체 C3은 도 4b와 일치하게, 근육 조직도 잘 염색시켰다(도 11, 네 번째 열).
항원 베타-DG에 결합된 AS30 Fab의 전체 구조를 결정하였고, 중쇄 및 경쇄 사이에 항원을 나타낸다(도 12a). 도 12b는 CDR 영역 및 항원의 클로즈업 도면을 나타낸다. AS30 Fab 및 인간 βDG를 1:1 몰 비로 혼합하고 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후 4℃에서 SEC Superdex 200 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare)을 거쳤다. AS30:βDG 복합체를 결정화하고, 그 구조를 분자 대체로 결정하여 2.55 Å까지 정련하였다. AS30 Fab 및 βDG 서열 D738RDPEKSSEDD748(SEQ ID NO: 302)는 전자 밀도 지도에서 볼 수 있었다. 결정 구조는 AS30 항체가 βDG에서 선형 펩티드D738RDPEKSSEDD748(SEQ ID NO: 302)를 인식함을 나타낸다.
또한, 항원 인간 라미닌-2 LG-5 도메인에 결합된 C21 Fab의 전체 구조를 결정하였고, 중쇄 및 경쇄 사이에 항원을 나타낸다(도 12ac). 도 12d는 CDR 영역 및 항원의 클로즈업 도면을 나타낸다. C21:LG5 복합체 구조를 AS30:βDG와 유사한 방식으로 수득하였고, 2.70 Å까지 정련하였다. C21Fab 및 인간 LG5는 둘 다 전자밀도에서 볼 수 있었고, C21은 LG5 상의 입체형태 에피토프를 인식한다.
실시예 6: 베타-DG 및 라미닌-2를 인식하는 3가, 다중특이적 항체의 생성
방법
항체 인간화
선도 하이브리도마 항체의 인간화를 CDR 그래프팅 및 3D 모델링 기법을 모두 사용해서 수행하였다. 항체 인간화 방법은 문헌[Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988); Sims et al., J Immunol 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J Mol Biol 196: 901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151: 2623 (1993)]; U.S. 특허 제5,589,205호; 제5,565,332호; 제6,180,370호; 제6,632,927호; 제7,241,877호; 제7,244,615호; 제7,244,832호; 제7,262,050호; 및 U.S. 특허 공개 제2004/0236078호(2004년 4월 30일에 출원됨)에 기재되어 있다.
항체 발현 및 정제
홀-내-놉, NNAS, YTE, 및 RF 변이체 및 경쇄 불변 영역을 함유하는 중쇄 불변 영역을 갖는 포유류 발현 벡터를 생성함으로써 aDG 3가 항체를 구축하였다. 원하는 링커를 갖는 DNA 가변 도메인을 합성하고 원하는 중쇄 및 경쇄 벡터에 삽입하였다. 각각의 triAb의 구성을 표 M에 나타낸다(도 13에서의 다이어그램에 따른 항원 결합 도메인의 넘버링, 즉, VH1/VL1 및 VH2/VL2는 CODV 암을 형성하며, VH3/VL3은 Fab 암을 형성함). triab의 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열을 표 I2에 제공한다.
[표 M]
엑스피펙타민(Thermo Fisher Scientific, A14635)으로 Expi293F 세포에서 4개 플라스미드의 일시적 공동전달감염에 의해 3가 항체를 제조하였다. 항체를 MabSelect SuRe 컬럼(GE Healthcare, 11003494)에 이어 HiTrap SP HP 컬럼(GE Healthcare, 17115201)으로의 양이온 교환으로 정제하였다. 이어서 모든 단백질을 농도, 순도, 및 응집도에 대해 평가하였다.
인간 항원에 대한 항체의 이중 결합
2 ㎍/㎖의 바이오틴화 N'Avi-HPC4-인간 LG4/5 또는 바이오틴화 인간-베타 DG-HPC4-Avi-C'으로 Thermo Nunc 고정화 SA 96 웰 플레이트를 코팅함으로써 이중 결합 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 4℃에서 하룻밤 인큐베이션 후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS+1% BSA+0.1% Tween으로 차단하였다. PBS로 세척 후(BioTek ELx405 Select CW), 3가 또는 모체 항체를 8 ㎍/㎖에서 시작해서 플레이트에 첨가하고, 플레이트에 걸쳐 2배 희석을 수행하고, 항체를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 제2 항원 베타-DG-mFc(도 1a) 또는 LG4/5-mFc를 5 ㎍/㎖로 첨가하였다. 제2 항원 후, 1:2,000 희석도의 당나귀 항-마우스(Jackson ImmunoResearch) 이차 항체를 30분 동안 첨가하였다. ABTS를 ABTS 완충액(Roche) 중에 재현탁하고, 검출을 위해 웰에 첨가하였다. 생성 신호를 405 nm에서 Perkin Elmer EnVision Multimode 플레이트 판독기로 판독하였다.
3가 항체에 대한 항원의 순차적 이중 결합을 위해, 시리즈 S 센서 단백질 G 칩(GE Healthcare, 29179315)을 T100 Biacore와 함께 사용하였다. 상기 칩을 사용해서 3가 또는 모체 항체를 표면에 고정하였다(5 ㎍/㎖의 항체로 60초). 포획 후, 200 nM의 LG4/5를 60초 동안 칩 상에 흘린 후 200 nM의 베타-DG를 60초 동안 흘렸다. 3가 항체에 대한 결합을 칩 상에서 검출된 질량 변화의 상대 단위(RU)로 관찰하였다.
결합 동력학 검정
항체(10 ㎍/㎖)를 센서 S 단백질 G 칩 상에 고정한 후 칩 상으로 항원의 연속 희석물을 흘려서(LG4/5: 80 nM~1.25 nM, BDG: 5 nM~0.31 nM 및 4 nM~0.25 nM) 3가 항체로 표면 플라즈몬 공명("SPR;" T100 Biacore; GE Healthcare) 동력학 검정 데이터를 수행하였다. BIAevaluation 소프트웨어를 사용해서 1:1 결합 모델로 데이터를 평가하였다.
결과
도 13에 나타내는 포맷에 따라 3가 항체(triAb)를 생성하였다. 이들 triAb는 2개의 구별되는 항-라미닌-2 항원 결합 도메인(도 13에서 VH-1/VL-1 및 VH-2/VL-2)을 갖는 CODV 암 및 항-베타-DG 항원 결합 도메인을 갖는 Fab 암(도 13에서 VH-3/VL-3)을 가졌다.
두 항원 모두에 대한 triAb의 결합을 나타내기 위해, 2 ㎍/㎖의 바이오틴화 N'Avi-HPC4-인간 LG4/5(도 14a) 또는 바이오틴화 인간-베타 DG-HPC4-Avi-C'(도 14b)를 사용하여 상술된 바와 같이 이중 결합 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 두 배향에서 모두, 평가된 모든 triAb는 동시적인 이중 결합을 나타내었다.
추가로, 표면 플라즈몬 공명을 수행해서 인간 라미닌-2 및 베타-DG 항원의 순차 결합을 나타내었다(도 1c). triAb는 두 항원 모두에 대한 결합을 나타낸 반면, 모노클로날 항체(라미닌-2에 결합하기 위한 인간화된 C3 및 C21 변이체 및 베타-DG에 결합하기 위한 인간화된 AS30 변이체)는 이의 각각의 항원에만 결합하였다.
SPR을 상술된 바와 같이 사용하여, 라미닌-2(표 N) 또는 베타-DG(표 O)에 대한 triAb 결합의 동력학을 분석하였다.
[표 N]
[표 O]
표 N에 나타낸 바와 같이, 5개의 triAb는 1가 항체 포맷으로 사용된 인간화된 AS30 항원 결합 도메인의 친화도(0.8 nM)와 필적하는, 나노몰 농도 친화도(KD 1.3~2.1 nM)로 인간 베타-DG에 결합할 수 있었다. 유사하게, 표 O는 동일한 triAb가 또한 1가 항체 포맷으로 사용된 인간화된 C3 및 C21 항원 결합 도메인의 친화도(각각 9.8 nM 및 9.0 nM)와 필적하는, 나노몰 농도 친화도(KD 10.2~14.9 nM)로 인간 라미닌-2에 결합할 수 있었음을 나타낸다.
이들 데이터는 도 13에 예시된 3가 포맷의 이중특이적 항-라미닌-2/베타-DG 항체가 전통적인 1가 항체 포맷과 유사한 결합 친화도로 이의 표적에 동시에 이중 결합할 수 있었음을 실증한다.
실시예 7: 베타-DG 및 라미닌-2를 인식하는 3가, 다중특이적 항체로의 처리 후 거동 평가 상에서 LARGE myd-3J/GrsrJ 마우스의 근육 기능의 개선
방법
항체 투여
실시예 4에 기재된 LARGE/myd-3j 마우스(8~16주령)를 이의 뒷다리 끌기 스코어, 와이어-행 스코어, 그립-강도 및 트레드밀에 기반해서 이들 스코어가 처리 전 군(n=11) 간에 유사함을 확실히 하도록 5개 군으로 무작위화하였다. 이어서 마우스에 TriAb(3407, 3437, 및 3439) 및 미관련 단백질 표적을 인식하는 대조군 TriAb뿐만 아니라 대조군으로서 식염수 군을 7회 용량으로 최대 3.5주 동안 꼬리 정맥 주사를 통해 주 2회(월요일 및 목요일) 30 ㎎/kg으로 투여하였다. 또한, 야생형 마우스 군(n=6)을 거동 평가를 위한 벤치마크로 포함시켰다. 아나필락시스 반응을 예방하기 위해, 5 ㎎/㎏의 디펜하이드라민을 항체 투여 10분 전에 IP로 사전-투여하였다. 그립-강도 및 와이어-행을 -2주에 시작하여 매주 평가하였다. 다양한 거동 평가를 위한 벤치마크로서 야생형을 식염수로 처리하였다.
거동 평가
뒷다리 끌기 평가를 위해, 마우스 꼬리를 잡아 들어올리고, 신체 대비 뒷다리의 위치를 기록하여 등급화하였다.
와이어 그리드 상에 마우스를 배치하고 1분 동안 순응시켜 와이어-행 평가를 수행하였다; 이어서, 위에 마우스가 매달린 와이어 그리드를 정의된 속도 2초로 천천히 위 아래로 뒤집고, 마우스가 그리드 상에서 유지되는 시간을 기록하였으며, 컷오프 시간은 60초였다. 각각의 마우스에 대해 평가를 3회 반복하고, 결과를 평균내었다.
마우스를 그립 강도 미터(Columbus Instruments) 상에 배치하고, 마우스가 금속 그리드를 단단히 쥘 수 있도록 하여, 마우스가 놓여날 때까지 꼬리를 수평으로 당겨서 그립 강도를 평가하였다; 이어서, 힘을 기록하였다. 평가를 5회 반복하고, 그 사이에 1분 휴지기를 두었다. 각각의 마우스에 대해 최고 및 최저 판독치를 제거하였고, 결과는 나머지 3회 판독치의 평균이었다.
트레드밀 구보 시간을 위해, 마우스를 전기 충격 그리드(Model 1055SRM Exer-3/6, Columbus Instruments)가 장착된 드레드밀의 개별 레인 상에 배치하였다. 동물을 5분 동안 트레드밀에 순응시킨 후, 속도를 증가시키면서 정의된 프로토콜로 마우스를 평가하였다. 마우스가 구보할 수 없는 상태로 충격 그리드 상에서 3초 넘게 있는 경우, 충격 그리드를 끄고 총 구보 시간을 기록하였다.
마우스 정체 및 처리에 대해 맹검처리한 상태로 모든 거동 평가를 수행하였고, 평가 후 결과는 맹검처리를 해제하였다.
결과
실시예 6에서 생성된 triAb를 LARGE/myd-3j 마우스에서 근육 기능에 대한 이의 효과에 대해 평가하였다.
Large/myd-3j 마우스는 이전에 기재된 biAb 처리로 관찰된 바와 같이(실시예 5 참고), TriAb 3407, 3437, 또는 3439로의 2주 처리 후 그립 강도(도 15) 및 와이어-행(도 16)에서 유의미하게 개선된 수행능력을 나타내었다. TriAb 처리로 트레드밀 수행능력은 유지되거나 약간 개선되었으나(도 17), 대신 약간의 저하를 실증한 대조군에 비해 통계적 유의성은 없었다. 전형적으로, 트레드밀 구보 시간에 대한 통계적으로 유의미한 개선은 더 긴 처리 시간을 필요로 한다.
종합하면, 다중 기능 검정의 결과는 3가, 이중특이적 항-라미닌-2/베타-DG 항체로의 처리가 알파-디스트로글리칸병증에 대한 쥣과 모델에서 개선된 근육 기능을 야기함을 실증하였다.
본 발명은 다양한 구현예를 포함하지만, 변화 및 변형이 일어날 것임이 당업자에게 이해된다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 범위 내에 있는 모든 그러한 동등한 변화를 커버하는 것으로 의도된다. 게다가, 본원에서 사용된 섹션의 제목은 단지 구조적 목적을 위한 것으로서, 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되지는 않는다.
본원에서 기재된 각각의 구현예는, 명백하게 반대로 지시되지 않는 한 임의의 다른 구현예와 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 나타낸 임의의 특성 또는 구현예는, 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, 바람직하거나 유리한 것으로 나타낸 임의의 다른 특성 또는 특성들 또는 구현예 또는 구현예들과 조합될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Sanofi BEIL, Christian BRONDYK, William CHEN, Yangde CHEN, Seng H. CONNORS, Timothy D. DEVAUD, Catherine HOFFMANN, Dietmar LANGE, Christian MAGNAY, Maureen MAGNAY, Tristan PRADES, Catherine RAO, Ercole SEVIGNY, Leila ZHU, Yunxiang WEI, Ronnie ZHAO, Hongmei ZHU, Yunxiang <120> MULTISPECIFIC BINDING MOLECULES HAVING SPECIFICITY TO DYSTROGLYCAN AND LAMININ-2 <130> 183952028140 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/460,663 <151> 2017-02-17 <160> 534 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser Val 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 3 Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr Trp 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Glu Ile Asn Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Leu Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Thr Pro Gly Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ala 115 <210> 227 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 227 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Glu Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 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ctgtccgtgt ctccaggcga gagagccacc 60 ctgagctgca gagccagcca gagcgtgtcc agcaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120 ggccaggccc ccagactgct gatgtacggc gccagcacca gagccaccgg catccctgcc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240 gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcac tacaacaacc tgcccctgac cttcggcgga 300 ggcaccaagg tggacctgaa g 321 <210> 238 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 238 gaagtccaac tccaacagtc tggggcagaa cttgtcaaac ctggggcttc agtaaaattg 60 agttgcacag caagtggctt taacatcaaa gacacatata ttcattgggt gaagcaacga 120 ccagaacaag gcttggagtg gatcggtagg attgaccctg caaacgggaa tacaaaatat 180 gaccctaaat tccagggaaa ggctacaata acagcagaca ccagcagtaa cattgtctat 240 gtgcaattta gctctcttac ctctgaggac actgctgtct attattgcgg acgtagtggc 300 gggaattatg tgggttattg gggccagggg acaacactca ccgtatcctc t 351 <210> 239 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 239 gatatagtaa tgtcccagtc tccttcatca cctactgtgt 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ctgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggcctctca ggacatccgg aacgacctgg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gcttccagtc tccagtccgg cgtgccctcc 180 agattctccg gcaatggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cctccagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgtctccaa gacttcaact tccccttcac cttcggccct 300 ggcaccaccg tggacatcaa c 321 <210> 244 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 244 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagt ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa aacggtgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagaaggg 300 atggttcggg gagccctctt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 245 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 245 gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tatcctggta ccaacagaaa 120 cctgggcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ccagggccac tggcatccca 180 gccaggttca gtggcagtgg gtctgggcca gacctcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag caggattata acttaccgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaa 324 <210> 246 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 246 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagttttact agttactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatgggagtc atctatcctg gtgactctga taccagatat 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatg tcagccgaca agtccatcag taccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac agcgccatgt attactgtgc gagacagcta 300 cgagactact acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 247 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 247 gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gactatcagc agcaactact tttcctggta ccagcagaaa 120 cctgggcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ccagggccac tggcattcca 180 gccaggttca gtggcagtgg gtctgagaca gacttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag caggattata acttacctcg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 248 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 248 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcactgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacagcta 300 cgagactact acagtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 249 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 249 gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tatcctggta ccagcagaaa 120 cctgggcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ccagggccac tggcattgca 180 gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag caggattata acttacctcg gacgttcggc 300 caagggacca aggtggaaat caaa 324 <210> 250 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 250 gaggtgcagc tgcagcagag cggccctgag ctggtgaaac ctggcgccag cgtgaagatg 60 agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tccactgggt gaaacagaag 120 cccggccagg gcctggaatg gattggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 180 agcgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accagcgaca gaagcagcag caccgcctac 240 atggaagtgt ccagcctgac ctccgaggac agcgccgtgt actactgcgc catctacggc 300 aacagctact ggggccaggg cagcaccctg accgtgtcca gc 342 <210> 251 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 251 gacatcgtga tgacccaggc tgcccccagc atccccgtga cacctggcga gtccgtgtcc 60 atcagctgca gaagcagcaa gagcctgctg cacagcaacg gcaataccta cctgtactgg 120 ttcctgcagc ggcctggcca gtccccccag cggctgatct actacatgag caacctggac 180 agcggcgtgc ccgaccggtt tagcggcaga ggcagcggca cagactttac cctgcggatc 240 agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgca tgcagggcct ggaatacccc 300 tacacctttg gaggcggcac caagctggaa atcaag 336 <210> 252 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 252 gacgtgatgc tggtcgagag cggcggagat ctggtcaaac ccgggggttc tctgaagctg 60 agttgtgccg cttcaggctt cactttttct agttacacca tgagctgggt gcgacagacc 120 ccagagaagc ggctggaatg ggtcgctagc atctcaagcg gcggagggaa cacctactat 180 cccgactctg tgaaaggcag attcacaatt agtcgcgata atgcaaagaa caatctgtac 240 ctgcagatgt cctctctgag gtccgaagat actgccctgt actattgtgc tagatttgac 300 tatggaagtt cactggattc ttggggacag gggaccacac tgacagtgag ctcc 354 <210> 253 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 253 gacatcgtcc tgacccagag tcctgccacc ctgtctgtga caccaggcga ttctgtcagt 60 ctgtcatgta gagctagcca gtccatctct aacaatctgc actggtacca gcagaagtca 120 catgaaagcc ccagactgct gatcaagtat gccagtcagt caatcagcgg tattccttcc 180 cgcttctccg gctctggaag tgggacagac tttactctgt ccatcaactc tgtggagaca 240 gaagatttcg gcatgtattt ttgtcagcag agcaagaatt ggcccaggac atttggcgga 300 gggactaagc tggagatcaa g 321 <210> 254 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 254 gaagtgatgc tggtcgaaag tggaggagga ctggtgaaac caggtggaag cctgaagctg 60 tcctgtgccg cttctggctt cactttttca agctatacca tgagctgggt gcgacagaca 120 cctgagaagc ggctggaatg ggtcgctaca atctcctctg gaggggacaa cacttactat 180 ccagatagcg tgaaaggcag attcactatt tcccgcgaca atgcaaagaa caatctgtac 240 ctgcagatga gttcactgag gagcgaggat accgccctgt actattgcgc tagatttgac 300 tatggaagct ccctggattg ttggggacag gggaccacac tgaccgtgtc tagt 354 <210> 255 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 255 gacatcgtcc tgactcagag ccctgccacc ctgtccgtga caccaggcga ttcagtcagc 60 ctgtcctgta gagcttctca gagtatctca aactacctgc actggtatca gcagaagagt 120 catgaatcac ccagactgct gatcaagtac gccagccagt ccatctctgg gattcctagc 180 cgcttcagtg gctcaggaag cgggacagac tttactctga gcatcaattc cgtggagaca 240 gaagatttcg gcatgtattt ttgtcagcag tccaagtctt ggcccaggac atttggcgga 300 gggactgagc tggagatcaa g 321 <210> 256 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 256 gaggtgcaac tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacgcggg 300 tatcgcagca gctggtactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 257 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 257 gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc aggcacagat ttcactttca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gattacaatt acccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 258 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 258 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag cacaggttat 180 gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt atcactgtgc gagagaaggg 300 ggggagctat taatggacta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354 <210> 259 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 259 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc acctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccaccc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctcctac tttcggcgga 300 gggaccacgg tggagatcaa a 321 <210> 260 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 260 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattactcta tggtttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctatcctt ctggtggcac ttcgtatgct 180 gactccgtta aaggtcgctt cactatctct agagacaact ctaagaatac tctctacttg 240 cagatgaaca gcttaagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag acattggcgg 300 gggtatagca gcagctggta ccacccggcg tactttgact actggggcca gggcaccctg 360 gtcaccgtct caagc 375 <210> 261 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 261 gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 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gtgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcgagtca ggatattcgt aattggctag cctggtatca acaggagtcc 120 gggaaagccc ctcggctcct gatctctgct gcatccagta ggcacagtgg cgtctcatct 180 agattcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcaccctca ccatcaccag tctgcagcct 240 gaagattcag caacttattt ttgtcaacag gctgacagtt cccctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 270 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 270 caggtgcaac tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180 gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcaa cacagcctac 240 atggaactga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc ggtctttggt 300 tcggggagtt cttggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 271 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 271 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtgggaga 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atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcatcag tttaataatt acccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321 <210> 276 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 276 gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60 tcctgtgtgg cctccggctt caccttctcc agctacgcca tgtcctgggt gcgacaggct 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccggc atctctggca ggggcggctc tcctaactac 180 gccgactctg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctccagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc taaggacggc 300 gacggctccg gccctcccta ctactttgat tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 360 tcatct 366 <210> 277 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 277 gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgtc gggcctccca gggcatctct tcttggctgg cctggtatca gcagaagccc 120 gagaaggccc ccaagtccct gatctacgcc gccagctctc tccagtctgg cgtgccctcc 180 agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctccagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaactcct acccctacac cttcggccag 300 ggcaccaagc tggaaatcaa g 321 <210> 278 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 278 caggtgcagc tgatggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt ggctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtctg atggaagtaa tagatactat 180 acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtct 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg 300 gggattacta tggttcgggg acttattata aaatactact actactacgg tttggacgtc 360 tggggccaag ggacctcggt caccgtctcc tca 393 <210> 279 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 279 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc 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Construct <400> 289 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtcagtct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gggcaagtca ggacatcagc aattttctaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaatctcct gatctactac acatcaaaat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcggtgggtc tggaagagat tattctctca ccattaataa cctggagcaa 240 gaagatattg cctcttactt ttgccaacag ggtcatacgc ttccgtatac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaataaa a 321 <210> 290 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 290 Ser Ile Val Val Glu Trp Thr Asn Asn Thr Leu Pro Leu Glu Pro Cys 1 5 10 15 Pro Lys Glu Gln Ile Ile Gly Leu Ser Arg Arg Ile Ala Asp Glu Asn 20 25 30 Gly Lys Pro Arg Pro Ala Phe Ser Asn Ala Leu Glu Pro Asp Phe Lys 35 40 45 Ala Leu Ser Ile Ala Val Thr Gly Ser Gly Ser Cys Arg His Leu Gln 50 55 60 Phe Ile Pro Val Ala Pro Pro Ser Pro Gly Ser Ser Ala Ala Pro Ala 65 70 75 80 Thr Glu Val Pro Asp Arg Asp Pro Glu Lys Ser Ser Glu Asp Asp 85 90 95 <210> 291 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 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  1. 인간을 치료하는 방법.
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