CN110997714B - 对肌营养不良蛋白聚糖和层粘连蛋白-2具有特异性的多特异性结合分子 - Google Patents
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Abstract
本文中提供了多特异性(例如双特异性)结合分子，其包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白‑2的第二结合结构域。本文中还提供了制备这种结合分子的方法以及这种结合分子用于治疗和/或预防α‑肌营养不良蛋白聚糖病的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请请求于2017年2月17日提交的美国临时申请系列号62/460,663和2018年2月16日提交的欧洲申请号EP18305168.9的优先权，上述每个申请以其整体通过提述并入本文。
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技术领域
本公开涉及多特异性(例如多特异性和三价的，或双特异性和二价的或四价的)结合分子，其包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域。本公开还涉及制造这类结合分子的方法以及这类结合分子用于治疗和/或预防α-肌营养不良蛋白聚糖病的用途。
背景技术
α-肌营养不良蛋白聚糖病是一种先天性肌营养不良症(CMD)的亚类，其特征为在α-肌营养不良蛋白聚糖(α-DG)中的黏蛋白样结构域中减少或缺乏O-糖基化(Muntoni,F.(2004)Acta.Myol.23(2),79-84；Toda,T.(2005) Rinsho Shinkeigaku 45(11),932-934；Muntoni,F.等人，(2007)Acta.Myol.26(3),129-135；Hewitt,J.E.(2009).Biochim.Biophys.Acta.1792(9),853-861；Godfrey,C.等人，(2011)Curr.Opin.Genet.Dev.21(3),278-285)。α-肌营养不良蛋白聚糖的缺乏或低糖基化导致其配体结合的丧失或减少，所述配体包括骨骼肌中的层粘连蛋白-2、聚集蛋白和基底膜蛋白聚糖，脑中的轴突蛋白和眼中的皮卡丘素。α-肌营养不良蛋白聚糖是所有肌肉和心脏共有的肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物(DGC)(图1A)的外周膜成分(Matsumura,K.等人，(1993)Neuromuscul.Disord.3(5-6),533-535)。在这些组织中，DGC复合物的作用是通过肌营养不良蛋白使肌纤维的丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)相关的细胞骨架经由层粘连蛋白-2与细胞外基质(ECM，也称为基膜)连接(图1B)。
在α-肌营养不良蛋白聚糖病中，在迄今为止鉴定的至少18个基因中的突变与α-DG上的O-糖基化的异常加工以及与其配体的结合缺乏相关，从而导致疾病。参见，例如Hara,Y.等人，(2011)N.Engl.J.Med.364(10),939-946；Kim,D.S.等人，(2004)Neurology 62(6),1009-1011；van Reeuwijk,J.等人，(2005)J.Med.Genet.42(12),907-912；Murakami,T.等人，(2009)Brain Dev.31(6),465-468；Yanagisawa,A.等人，(2009)Eur.J.Med.Genet.52(4),201-206；Clement,E.M.等人，(2008)Arch.Neurol.65(1),137-141；Endo,T.等人，(2010)Methods Enzymol.479,343-352；Saredi,S.等人，(2012)J.Neurol.Sci.318(1-2),45-50；Longman,C.等人，(2003)Hum.Mol.Genet.12(21),2853-2861；Lefeber,D.J.等人，(2009)Am.J.Hum.Genet.85(1),76-86；Barone,R.等人，(2012)Ann.Neurol.72(4),550-558；Toda,T.等人，(2003)Congenit.Anom.(Kyoto)43(2),97-104；Toda,T.(2007)RinshoShinkeigaku47(11),743-748；Puckett,R.L.等人，(2009)Neuromuscul.Disord.19(5),352-356；Toda,T.(2009)Rinsho Shinkeigaku 49(11),859-862；Yamamoto,T.等人，(2010)Cent.Nerv.Syst.Agents.Med.Chem.10(2),169-179；Kanagawa,M.等人，(2016)Cell.Rep.14(9),2209-2223；Yoshida-Moriguchi,T.等人，(2013)Science 341(6148),896-899)。这些基因包括例如许多糖基转移酶，如LARGE，其编码负责将木糖-葡糖醛酸重复添加至聚糖以促进配体结合的木糖基和葡糖醛酸基-双转移酶(Inamori,K.等人，(2012)Science 335(6064),93-96；Longman,C.等人，(2003)Hum.Mol.Genet.12(21),2853-2861)。糖基转移酶(例如LARGE)在这个途径中的主要生物学功能是正确装配在α-DG中的黏蛋白样结构域中的O-糖基化，其对于紧密结合肌肉基膜中的层粘连蛋白-2、神经肌肉接点中的聚集蛋白和基底膜蛋白聚糖、中枢神经系统中的轴突蛋白和眼中的皮卡丘素是必需的(Michele,D.E.等人，(2002)Nature 418(6896),417-422；Muntoni,F.等人，(2002)Lancet360(9343),1419-1421)。在由于上述任何基因的缺陷而缺乏适当的O-糖基化的情况下,α-DG与细胞外基质(ECM)中的层粘连蛋白-2的结合受损或丧失(图1C)，从而导致肌膜完整性所必需的机械连接的破坏。这使得肌肉容易受到收缩诱导的损伤，导致肌纤维的肌膜损伤和随之而来的肌营养不良(Barresi,R.和Campbell.K.P.(2006)J.Cell.Sci.119,199-207)。
由于遗传异质性，α-肌营养不良蛋白聚糖病包括许多疾病亚型，其显示出从具有中枢神经系统(CNS)和眼睛异常的非常严重的肌营养不良到没有CNS表现或眼睛问题的相对轻微的肌营养不良表型的多样而重叠的临床表现。在不同亚型的α-肌营养不良蛋白聚糖病之间没有严格的遗传和表型相关性。一个基因中的突变可能引起具有重叠的临床表现的不同疾病亚型，不同基因中的突变可以导致相同或相似的疾病(Godfrey,C.等人，(2007)Brain 130,2725-2735)。由于这种异质性，由个体基因中的突变引起的个体α-肌营养不良蛋白聚糖病的治疗策略对于药物开发因为成本效益低而不具有吸引力。
α-肌营养不良蛋白聚糖和β-肌营养不良蛋白聚糖由相同的基因DAG1编码，并作为完整的1型跨膜蛋白(即肌营养不良蛋白聚糖)从单一mRNA翻译而来。在到达细胞表面的途中，肌营养不良蛋白聚糖被蛋白水解切割而产生跨膜骨架(stud)β-肌营养不良蛋白聚糖和非共价结合的α-肌营养不良蛋白聚糖(Holt,K.H.等人，(2000)FEBS Lett.468(1),79-83)。理论上已经提出具有适当O-糖基化的重组α-肌营养不良蛋白聚糖作为用于α-肌营养不良蛋白聚糖病的蛋白替代疗法。然而，重组α-肌营养不良蛋白聚糖的全身性递送表明，这种蛋白未能到达肌间质间隙以掺入到肌膜上(Han,R.等人，(2009)PNAS 106(31),12573-12579)。因此，使用重组α-肌营养不良蛋白聚糖作为α-肌营养不良蛋白聚糖病的蛋白替代疗法在技术上被认为是不切实际的。
因此，对于用于预防和/或治疗α-肌营养不良蛋白聚糖病及其相关病状的治疗分子存在着需求。
本文中引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公开和UniProtKB/Swiss-Prot登录号在内，均通过提述以其整体并入本文，如同具体地且单独地指出将每个单独的参考文献通过提述并入本文一样。
发明内容
为了满足这种及其他需求，本文中特别提供了可以同时与层粘连蛋白-2和一种或多种肌营养不良蛋白聚糖结合的多特异性和双特异性结合分子(例如双特异性抗体)以及双功能生物制品。当将这种多特异性/双特异性抗体或双功能生物制品施用至患有α-肌营养不良蛋白聚糖病的患者时，其与基膜中的层粘连蛋白-2和肌膜上的肌营养不良蛋白聚糖(α-或β-)的同时结合可以使缺少的连接恢复(图1D和1E)。本公开证明，这种方法可以改善体内动物模型系统中α-肌营养不良蛋白聚糖病的特征症状。具体而言，已知抗体由于其与介导抗体再循环的新生儿Fc受体的结合而在体内具有延长的循环半衰期(长的药代动力学)。因此，这种多特异性/双特异性抗体策略(或替代性的，双功能生物制品策略)代表治疗α-肌营养不良蛋白聚糖病的新型治疗方法。
在一些实施方案中，本公开提供了一种多特异性结合分子，其包含至少一个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和至少一个结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域。在一些实施方案中，多特异性结合分子是包含一个或多个多肽链的多特异性结合蛋白。
在一些实施方案中，多特异性结合分子是包含三个抗原结合位点的多特异性三价结合蛋白。在一些实施方案中，该结合蛋白包含四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对；并且其中VH1和VL1形成一个抗原结合位点，其中VH2和VL2形成一个抗原结合位点，并且其中VH3和VL3形成一个抗原结合位点，总共三个抗原结合位点，并且其中所述三个抗原结合位点包括至少一个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗原结合位点和至少一个结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点。
在一些实施方案中，多特异性结合分子包含一个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的一个抗原结合位点和结合层粘连蛋白-2的两个抗原结合位点。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的两个抗原结合位点结合层粘连蛋白-2的不同表位。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的两个抗原结合位点结合层粘连蛋白-2的相同表位。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合层粘连蛋白-2的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成结合层粘连蛋白-2的第二抗原结合位点，并且VH3和VL3形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第三抗原结合位点。
在一些实施方案中，多特异性结合分子包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的两个抗原结合位点和结合层粘连蛋白-2的一个抗原结合位点。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的两个抗原结合位点结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的不同表位。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的两个抗原结合位点结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的相同表位。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第二抗原结合位点，并且VH3和VL3形成结合层粘连蛋白-2的第三抗原结合位点。
在一些实施方案中，当作为多特异性结合蛋白的一部分测定时，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点以低于约1μM的平衡解离常数(KD)结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点结合人和小鼠肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点结合β-肌营养不良蛋白聚糖。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点结合包含序列SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKALSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO:290)的多肽。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点结合包含序列
的多肽。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点结合α-肌营养不良蛋白聚糖。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点结合包含序列SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIPVVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291)的多肽。
在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，当作为多特异性结合蛋白的一部分测定时，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点以低于约1μM的平衡解离常数(KD)结合人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合小鼠和人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4、层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5或这两者的多肽。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4和层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合包含序列
的多肽。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合包含序列/>
的多肽。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合包含序列
的多肽。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点结合包含序列
的多肽。
在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含包含选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:9-17的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:18-27的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含包含选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38-42的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:43-50的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含选自SEQ ID NO:170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的序列；并且结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含选自SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的序列。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含包含SEQ ID NO:316的序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:318的序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:320的序列的CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含包含SEQ ID NO:332的序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:334的序列的CDR-L2和包含SEQ IDNO:336的序列的CDR-L3。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点包含人源化VH结构域和人源化VL结构域。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含SEQID NO:314的序列；并且结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含序列SEQID NO:330。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含序列SEQ ID NO:346；并且结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含序列SEQ ID NO:362。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含表A2、D2或I4中所示的AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含表A2、D2或I4中所示的AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含表D2或I4中所示的AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9 VH结构域的序列；并且结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含表D2或I4中所示的AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9 VL结构域的序列。
在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含包含选自SEQ ID NO:51-55和81-95的氨基酸序列的CDR-H1、 包含选自SEQ ID NO:56-60和96-110的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:61-65和111-125的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含包含选自SEQ ID NO:66-70和126-140的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38、71-75和141-154的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:76-80和155-169的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含选自下组的序列：SEQID NO:190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228；并且结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含选自下组的序列：SEQ ID NO: 191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ IDNO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、包含序列SEQ IDNO:398的CDR-L2和包含序列SEQID NO:400的CDR-L3。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含人源化VH结构域和人源化VL结构域。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含序列SEQ ID NO:378；并且结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含序列SEQ ID NO:394。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含人源化VH结构域和人源化VL结构域。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含序列SEQ ID NO:410；并且结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含序列SEQ ID NO:426。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含包含序列SEQ IDNO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:446的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:448的CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列SEQ IDNO:460的CDR-L1、包含序列SEQID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ IDNO:464的CDR-L3。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含人源化VH结构域和人源化VL结构域。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含序列SEQ IDNO:442；并且结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含序列SEQ ID NO:458。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含人源化VH结构域和人源化VL结构域。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含序列SEQ ID NO:474；并且结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含序列SEQ IDNO:490。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点包含：(a)重链可变结构域(VH)，其包含表A2、D2或I4中所示的C3_Hu10、C3_Hu11、C21_Hu11或C21_Hu21的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和(b)轻链可变结构域(VL)，其包含表A2、D2或I4中所示的C3_Hu10、C3_Hu11、C21_Hu11或C21_Hu21的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VH结构域包含表D2或I4中所示的C3_Hu10、C3_Hu11、C21_Hu11或C21_Hu21 VH结构域的序列；并且结合层粘连蛋白-2的至少一个抗原结合位点的VL结构域包含表D2或I4中所示的C3_Hu10、C3_Hu11、C21_Hu11或C21_Hu21 VL结构域的序列。
在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ IDNO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ IDNO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:384的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:378，VL1包含序列SEQ ID NO:394；VH2包含序列SEQ ID NO:378，VL2包含序列SEQID NO:394；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、 包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQID NO:400的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ IDNO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:446的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:448的CDR-H3，并且VL2包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:378，VL1包含序列SEQ ID NO:394；VH2包含序列SEQ ID NO:442，VL2包含序列SEQID NO:458；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、 包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ IDNO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:478的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:448的CDR-H3，并且VL2包含包含序列SEQ IDNO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ IDNO:334的CDR-L2和包含序列SEQID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQID NO:410，VL1包含序列SEQ ID NO:426；VH2包含序列SEQ ID NO:474，VL2包含序列SEQIDNO:490；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ IDNO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ IDNO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:384的CDR-H3，并且VL2包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ IDNO:400的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:442，VL1包含序列SEQ ID NO:458；VH2包含序列SEQ ID NO:410，VL2包含序列SEQID NO:426；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ IDNO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:384的CDR-H3，并且VL2包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:474，VL1包含序列SEQ ID NO:490；VH2包含序列SEQ ID NO:378，VL2包含序列SEQID NO:394；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，L1和L2包含序列DKTHT (SEQID NO:534)。在一些实施方案中，L3和L4包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，第二多肽链的CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W；并且其中第三多肽链的CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些实施方案中，第二多肽链的CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；并且其中第三多肽链的CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的CH3结构域是人IgG1或IgG4CH3结构域，并且其中所述CH3结构域中的仅一个在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436的位置包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的CH2结构域是人IgG1或IgG4CH2结构域，其包含根据EU索引编号的第297位的天冬酰胺残基、第298位的天冬酰胺残基、第299位的丙氨酸残基和第300位的丝氨酸或苏氨酸残基。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的CH2结构域是人IgG1或IgG4CH2结构域，其包含根据EU索引编号的第252位的酪氨酸残基、第254位的苏氨酸残基和第256位的谷氨酸残基。
在一些实施方案中，第一多肽链包含序列SEQ ID NO:500，第二多肽链包含序列SEQ ID NO:498，第三多肽链包含序列SEQ ID NO:499，并且第四多肽链包含序列SEQ IDNO:501。在一些实施方案中，第一多肽链包含序列SEQ ID NO:504，第二多肽链包含序列SEQID NO:502，第三多肽链包含序列SEQ ID NO:503，并且第四多肽链包含序列SEQ ID NO:505。在一些实施方案中，第一多肽链包含序列SEQ ID NO:508，第二多肽链包含序列SEQIDNO:506，第三多肽链包含序列SEQ ID NO:507，并且第四多肽链包含序列SEQID NO:509。在一些实施方案中，第一多肽链包含序列SEQ ID NO:512，第二多肽链包含序列SEQ ID NO:510，第三多肽链包含序列SEQ ID NO:511，并且第四多肽链包含序列SEQ ID NO:513。在一些实施方案中，第一多肽链包含序列SEQ ID NO:516，第二多肽链包含序列SEQ ID NO:514，第三多肽链包含序列SEQ ID NO:515，并且第四多肽链包含序列SEQ ID NO:517。在一些实施方案中，结合蛋白包含如表I2或I4所示的triAb 3407、3423、3429、3437或3439中的1、2、3或4个多肽。
在一些实施方案中，结合蛋白包含(a)第一抗体重链和第一抗体轻链，所述第一抗体重链包含第一重链可变(VH)结构域和包含第一CH3区的免疫球蛋白的第一Fc区的第一抗体重链、所述第一抗体轻链包含第一轻链可变(VL)结构域，其中所述第一VH和VL结构域形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一抗原结合结构域，和(b)第二抗体重链和第二抗体轻链，所述第二抗体重链包含第二重链可变(VH)结构域和包含第二CH3区的免疫球蛋白的第二Fc区，所述第二抗体轻链包含第二轻链可变(VL)结构域，其中所述第二VH和VL结构域形成结合层粘连蛋白-2的第二抗原结合结构域；其中所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用比所述第一和第二CH3区各自的同二聚体相互作用更强，并且其中所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有除了Lys、Leu或Met以外的氨基酸，并且所述第二同二聚体蛋白在选自366、368、370、399、405和407的位置处具有氨基酸取代，和/或其中所述第一和第二CH3区的序列使得所述CH3区各自的同二聚体相互作用的解离常数在0.01和10微摩尔之间。在一些实施方案中，第一抗体重链包含序列SEQ ID NO:518，其中第二抗体重链包含序列SEQ ID NO:519，其中第一抗体轻链包含序列SEQ ID NO:520，并且其中第二抗体轻链包含序列SEQ ID NO:521。在一些实施方案中，结合蛋白包含如表I3或I4中所示的AS30_Hu6 x C3_Hu10 Duobody、AS30_Hu6 xC21_Hu11 Duetmab、AS30_Hu6 x C3_Hu10 TBTI、AS30_Hu6 x C21_Hu11TBTI、AS30_Hu9 xC3_Hu11 CODV或AS30_Hu9 x C21_Hu21 CODV中的1、2、3或4个多肽。
本文中进一步提供了分离的核酸分子，其包含编码上述任一实施方案的多特异性结合分子的核苷酸序列。还提供了包含表G2或I4的核苷酸序列的分离的核酸分子。还提供了包含上述任一实施方案的核酸分子的表达载体。还提供了包含上述任一实施方案的核酸分子或表达载体的宿主细胞(例如分离的宿主细胞)。还提供了载体系统，其包含编码上述任一实施方案的多特异性结合分子的第一、第二、第三和第四多肽链的一个或多个载体。还提供了包含上述任一实施方案的载体系统的宿主细胞(例如分离的宿主细胞)。还提供了产生多特异性结合分子的方法，所述方法包括：在使得宿主细胞表现多特异性结合分子的条件下培养上述任一实施方案的宿主细胞；并且从宿主细胞分离多特异性结合分子。
本文中进一步提供了用于治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向个体施用上述任一实施方案的多特异性结合分子。本文中还提供了用于在个体中提供层粘连蛋白-2与肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分之间的连接的方法，所述方法包括向个体施用上述任一实施方案的多特异性结合分子。本文中还提供了上述任一实施方案的多特异性结合分子用于治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病的用途。本文中还提供了上述任一实施方案的多特异性结合分子用于在个体中提供层粘连蛋白-2与肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分之间的连接的用途。本文中还提供了上述任一实施方案的多特异性结合分子在制备用于治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病的药物中的用途。本文中还提供了上述任一实施方案的多特异性结合分子在制备用于在个体中提供层粘连蛋白-2与肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分之间的连接的药物中的用途。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，所述个体具有降低的α-肌营养不良蛋白聚糖表达。在一些实施方案中，所述个体中表达的α-肌营养不良蛋白聚糖具有受损或异常的O-糖基化。在一些实施方案中，所述个体具有在选自以下组的基因中的突变：肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-1(POMT1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-2(POMT2)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基1(POMGNT1)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶2(LARGE2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基1(DPM1)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基2(DPM2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基3(DPM3)、fukutin、fukutin相关蛋白(FKRP)、含类异戊二烯合酶结构域的蛋白(ISPD)、蛋白质O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基转移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。在一些实施方案中，通过静脉内输注施用多特异性结合分子。在一些实施方案中，通过肌内、腹膜内或皮下注射施用多特异性结合分子。在一些实施方案中，所述个体是人。
本文中进一步提供了包含上述任一实施方案的多特异性结合分子和药学上可接受的载体的药物组合物。还提供了包含上述任一实施方案的多特异性结合分子和用于治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病的说明书的套盒。在一些实施方案中，所述个体具有降低的α-肌营养不良蛋白聚糖表达。在一些实施方案中，所述个体中表达的α-肌营养不良蛋白聚糖具有受损或异常的O-糖基化。在一些实施方案中，所述个体具有在选自以下组的基因中的突变：肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-1(POMT1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-2(POMT2)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基1(POMGNT1)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶2(LARGE2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基1(DPM1)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基2(DPM2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基3(DPM3)、fukutin、fukutin相关蛋白(FKRP)、含类异戊二烯合酶结构域的蛋白(ISPD)、蛋白质O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基转移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。在一些实施方案中，所述个体是人。
本文中进一步提供了结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含重链可变结构域(VH)的抗体重链，所述重链可变结构域包含包含选自SEQID NO:1-8的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:9-17的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:18-27的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38-42的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:43-50的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO:170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的氨基酸序列；并且VL结构域包含选自SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含表A2、D2或I4中所示的结合结构域的1、2、3、4、5或6个CDR序列，或表D2或I4中所示的结合结构域的或由表G2中所示的多核苷酸序列编码的VH和/或VL结构域序列。
本文中进一步提供了结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含重链可变结构域(VH)的抗体重链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3；和(b)包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ IDNO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:314，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:330；或VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:346，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:362。在一些实施方案中，抗体包含表A2、D2或I4中所示的结合结构域的1、2、3、4、5或6个CDR序列，或表D2或I4中所示的结合结构域的或由表G2中所示的多核苷酸序列编码的VH和/或VL结构域序列。
本文中进一步提供了结合层粘连蛋白-2的抗体，其中所述抗体包含：(a)抗体重链，所述抗体重链包含包含选自SEQ ID NO:51-55和81-95的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:56-60和96-110的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:61-65和111-125的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含选自SEQ ID NO:66-70和126-140的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ IDNO:38、71-75和141-154的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:76-80和155-169的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO:190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的氨基酸序列；并且VL结构域包含选自SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含表A2、D2或I4中所示的结合结构域的1、2、3、4、5或6个CDR序列，或表D2或I4中所示结合结构域的或由表G2中所示的多核苷酸序列编码的VH和/或VL结构域序列。
本文中进一步提供了结合层粘连蛋白-2的抗体，其中所述抗体包含：(a)包含重链可变结构域(VH)的抗体重链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，和包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；(b)包含重链可变结构域(VH)的抗体重链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，和包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、包含序列SEQ IDNO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；(c)包含重链可变结构域(VH)的抗体重链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3，和包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；或(d)包含重链可变结构域(VH)的抗体重链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3，和包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3。在一些实施方案中，(a)VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:378，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:394；(b)VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:410，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:426；(c)VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:442，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:458；或(d)VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:474，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:490。在一些实施方案中，抗体包含表A2、D2或I4中所示的结合结构域的1、2、3、4、5或6个CDR序列，或表D2或I4中所示的结合结构域的或由表G2中所示的多核苷酸序列编码的VH和/或VL结构域序列。
本文中进一步提供了包含编码上述任一实施方案的抗体的核苷酸序列的分离的核酸分子。还提供了包含上述任一实施方案的核酸分子的表达载体。还提供了包含上述任一实施方案的核酸分子或表达载体的宿主细胞(例如分离的宿主细胞)。还提供了产生抗体的方法，所述方法包括：在使得宿主细胞表达抗体的条件下培养上述任一实施方案的宿主细胞；并且从宿主细胞分离抗体。
在一个实施方案中，本公开提供了双特异性结合分子，其包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域。在一些实施方案中，双特异性结合分子是包含一个或多个多肽链的双特异性结合蛋白。
在一些实施方案中，双特异性结合分子是包含两个或四个抗原结合位点的双特异性二价或四价结合蛋白。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域包含第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)和第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)，其中所述第二结合结构域包含第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)和第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)。在一些实施方案中，VH1结构域包含表A中所示抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR序列和/或VL1结构域包含表A中所示抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR序列。在一些实施方案中，VH2结构域包含表B或表C中所示抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR序列和/或VL2结构域包含表B或表C中所示抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR序列。
在一些实施方案中，双特异性结合分子包含形成四个抗原结合位点的四条多肽链，其中两条多肽链包含由下式表示的结构：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
并且两条多肽链包含由下式表示的结构：
VH2-L3-VH1-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；其中VH1和VL1结构域形成VH1/VL1结合对，并且其中VH2和VL2结构域形成VH2/VL2结合对。
在一些实施方案中，VH1和VL1结构域交叉以形成VH1/VL1结合对。在一些实施方案中，VH2和VL2结构域交叉以形成VH2/VL2结合对。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4的长度各自为0至50个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4的长度各自为0至25个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4的长度各自为0至14个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度为5个氨基酸残基；L2的长度为5个氨基酸残基；L3的长度为5个氨基酸残基；并且L4的长度为5个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1的长度为14个氨基酸残基；L2的长度为2个氨基酸残基；L3的长度为14个氨基酸残基；并且L4的长度为2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1和L3各自包含序列EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296)，并且其中L2和L4各自包含序列GG。在一些实施方案中，L1的长度为7个氨基酸残基；L2的长度为5个氨基酸残基；L3的长度为1个氨基酸残基；并且L4的长度为2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP (SEQID NO:297)；L2包含序列TKGPS (SEQ ID NO:298)；L3包含丝氨酸残基；并且L4包含序列RT。在一些实施方案中，L1的长度为10个氨基酸残基；L2的长度为10个氨基酸残基；L3的长度为0个氨基酸残基；并且L4的长度为0个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1和L2各自包含序列GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299)。在一些实施方案中，式I和/或式II的多肽的两个可变结构域之一或两者是人的、人源化的或小鼠的可变结构域。
在一些实施方案中，双特异性结合分子包含两条包含由下式表示的结构的轻链：
VL1-L5-VL2-L6-CL [III]
和两条包含由下式表示的结构的重链：
VH1-L7-VH2-L8-CH1-铰链-CH2-CH3 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L5、L6、L7和L8是氨基酸接头；其中VH1和VL1结构域形成VH1/VL1结合对，并且其中VH2和VL2结构域形成VH2/VL2结合对。
在一些实施方案中，L5、L6、L7和L8的长度各自为0至50个氨基酸残基。在一些实施方案中，L5、L6、L7和L8的长度各自为0至25个氨基酸残基。在一些实施方案中，L5、L6、L7和L8的长度各自为0至14个氨基酸残基。在一些实施方案中，L5和L7接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:294)，并且其中L6和L8接头的长度各自为0个氨基酸残基。在一些实施方案中，式III和/或式IV的多肽的两个可变结构域之一或两者是人的、人源化的或小鼠的可变结构域。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且其中VH2/VL2结合对结合层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对以小于约1μM的平衡解离常数(KD)结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合人和小鼠肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合β-肌营养不良蛋白聚糖。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含序列SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVAPPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD(SEQ ID NO:290)的多肽。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含序列SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGSGSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291)的多肽。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合α-肌营养不良蛋白聚糖。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对以小于约1μM的平衡解离常数(KD)结合人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合小鼠和人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4、层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5或这两者的多肽。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4和层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含序列
的多肽。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含序列/>/>
的多肽。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含序列
的多肽。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含序列/>
的多肽。
在一些实施方案中，VH1结构域包含包含选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:9-17的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:18-27的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL1结构域包含包含选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38-42的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:43-50的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1结构域包含选自SEQ ID NO:170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL1结构域包含选自SEQ IDNO:171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH1结构域由选自SEQ ID NO:230、232、234、236、238、240、242、244、246和248的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL1结构域由选自SEQ ID NO:231、233、235、237、239、241、243、245、247和249的核酸序列编码。在一些实施方案中，VH2结构域包含包含选自SEQ ID NO:51-55和81-95的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:56-60和96-110的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:61-65和111-125的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL2结构域包含包含选自SEQ ID NO:66-70和126-140的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38、71-75和141-154的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:76-80和155-169的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH2结构域包含选自SEQ ID NO:190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL2结构域包含选自SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域由选自SEQ ID NO:250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL2结构域由选自SEQ IDNO:251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289的核酸序列编码。
在任何上述实施方案的一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合层粘连蛋白-2，并且其中VH2/VL2结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对以小于约1μM的平衡解离常数(KD)结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合人和小鼠肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合β-肌营养不良蛋白聚糖。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含序列SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVAPPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD(SEQ ID NO:290)的多肽。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合包含序列SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGSGSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291)的多肽。在一些实施方案中，VH2/VL2结合对结合α-肌营养不良蛋白聚糖。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对以小于约1μM的平衡解离常数(KD)结合人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合小鼠和人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4、层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5或这两者的多肽。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4和层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含序列
的多肽。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含序列/>/>
的多肽。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含序列
的多肽。在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合包含序列/>
的多肽。
在一些实施方案中，VH2结构域包含包含选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:9-17的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:18-27的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL2结构域包含包含选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38-42的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:43-50的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH2结构域包含选自SEQ ID NO:170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL2结构域包含选自SEQ IDNO:171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域由选自SEQ ID NO:230、232、234、236、238、240、242、244、246和248的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL2结构域由选自SEQ ID NO:231、233、235、237、239、241、243、245、247和249的核酸序列编码。在一些实施方案中，VH1结构域包含包含选自SEQ ID NO:51-55和81-95的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:56-60和96-110的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:61-65和111-125的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL1结构域包含包含选自SEQ ID NO:66-70和126-140的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38、71-75和141-154的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:76-80和155-169的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH2结构域包含选自SEQ ID NO:190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL2结构域包含选自SEQ ID NO:191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域由选自SEQ ID NO:250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL2结构域由选自SEQ IDNO:251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289的核酸序列编码。
在一个实施方案中，本公开提供了分离的核酸分子，其包含编码根据上述任一实施方案的双特异性结合分子的核苷酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了表达载体，其包含编码根据上述任一实施方案的双特异性结合分子的核苷酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了分离的宿主细胞，其包含编码根据上述任一实施方案的双特异性结合分子的核苷酸序列或包含包含编码根据上述任一实施方案的双特异性结合分子的核苷酸序列的表达载体。在一个实施方案中，本公开提供了包含编码根据上述任一实施方案的双特异性结合分子的第一、第二、第三和第四多肽链的一个或多个载体的载体系统。在一个实施方案中，本公开提供了载体系统，其包含编码根据上述任一实施方案的双特异性结合分子的两条轻链和两条重链的一个或多个载体。在一个实施方案中，本公开提供了包含根据上述任一实施方案的载体系统的分离的宿主细胞。
在一个实施方案中，本公开提供了产生双特异性结合分子的方法，所述方法包括：a)在使得宿主细胞表达双特异性结合分子的条件下培养根据上述任一实施方案的宿主细胞；并且b)从宿主细胞分离双特异性结合分子。在一个实施方案中，本公开提供了产生双特异性结合蛋白的方法，所述双特异性结合蛋白包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域，所述方法包括：a)在这样的条件下培养包含编码包含第一结合结构域的第一多肽链的核酸分子的第一宿主细胞，使得宿主细胞表达作为具有第一CH3结构域的第一单特异性结合蛋白的一部分的所述第一多肽链；b)在这样的条件下培养包含编码包含第二结合结构域的第二多肽链的核酸分子的第二宿主细胞，使得宿主细胞表达作为具有第二CH3结构域的第二单特异性结合蛋白的一部分的所述第二多肽链；c)从第一宿主细胞分离第一单特异性结合蛋白；d)从第二宿主细胞分离第二单特异性结合蛋白；e)在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下温育分离的第一和第二单特异性结合蛋白；和f)获得双特异性结合蛋白，其中第一和第二CH3结构域是不同的并且使得所述第一和第二CH3结构域之间的异二聚体相互作用比所述第一和第二CH3结构域各自的同二聚体相互作用更强。
在一个实施方案中，本公开提供了用于治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向个体施用根据上述任一实施方案的双特异性结合分子。在一个实施方案中，本公开提供了用于在个体中提供层粘连蛋白-2与肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分之间的连接的方法，所述方法包括向个体施用根据上述任一实施方案的双特异性结合分子。在一些实施方案中，所述个体具有降低的α-肌营养不良蛋白聚糖表达。在一些实施方案中，所述个体中表达的α-肌营养不良蛋白聚糖具有受损或异常的O-糖基化。在一些实施方案中，所述个体具有在选自以下组的基因中的突变：肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-1(POMT1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-2(POMT2)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基1(POMGNT1)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶2(LARGE2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基1(DPM1)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基2(DPM2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基3(DPM3)、fukutin、fukutin相关蛋白(FKRP)、含类异戊二烯合酶结构域的蛋白(ISPD)、蛋白质O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基转移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。在一些实施方案中，藉由静脉内输注施用双特异性结合分子。在一些实施方案中，藉由肌内、腹膜内或皮下注射施用双特异性结合分子。在一些实施方案中，所述个体是人。
在一个实施方案中，本公开提供了药物组合物，其包含根据上述任一实施方案的双特异性结合分子和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本公开提供了在治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病中使用的包含根据上述任一实施方案的双特异性结合分子和说明书的套盒。在一些实施方案中，所述个体具有降低的α-肌营养不良蛋白聚糖表达。在一些实施方案中，所述个体中表达的α-肌营养不良蛋白聚糖具有受损或异常的O-糖基化。在一些实施方案中，所述个体具有在选自以下组的基因中的突变：肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-1(POMT1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-2(POMT2)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基1(POMGNT1)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶2(LARGE2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基1(DPM1)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基2(DPM2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基3(DPM3)、Fukutin、Fukutin相关蛋白(FKRP)、含类异戊二烯合酶结构域的蛋白(ISPD)、蛋白质O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基转移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。在一些实施方案中，所述个体是人。
根据以下对某些实施方案和权利要求的更详细描述，本发明的具体实施方案将变得明显。
应该理解，可以组合本文所述的各种实施方案的一个、一些或全部特性以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对于本领域的技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1A和1B显示了肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物的正常蛋白质相互作用和功能。α-肌营养不良蛋白聚糖的黏蛋白样结构域中的O-连接聚糖用作几种配体的受体，所述配体包括肌肉中的层粘连蛋白-2。图1A显示了肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物，其中肌营养不良蛋白聚糖的O-糖基化正常。图1B显示了与O-糖基化的α-肌营养不良蛋白聚糖相互作用的基膜中的层粘连蛋白-2。β-肌营养不良蛋白聚糖与肌营养不良蛋白相互作用，进而与细胞膜内的丝状肌动蛋白结合。
图1C显示了α-肌营养不良蛋白聚糖病的病因学。在α-肌营养不良蛋白聚糖上不存在O-连接糖基化的情况下，层粘连蛋白-2和α-肌营养不良蛋白聚糖的结合丧失，导致基膜从肌肉的肌膜脱离并导致在运动过程中的膜损伤和肌营养不良。
图1D和1E显示了采用多特异性或双特异性抗体治疗α-肌营养不良蛋白聚糖病的策略。双特异性和多特异性抗体以一个或多个臂特异性地识别和结合层粘连蛋白-2并且以一个或多个其他的臂特异性地识别和结合α-肌营养不良蛋白聚糖(图1D)或β-肌营养不良蛋白聚糖(图1E)，从而恢复层粘连蛋白-2与肌营养不良蛋白聚糖之间的连接，以便治疗α-肌营养不良蛋白聚糖病。
图2A显示了人和小鼠层粘连蛋白球形(LG)-4/5结构域的序列比对。人和小鼠LG-5的蛋白质序列具有显著的同源性，具有88％的同一性。人和鼠层粘连蛋白-2的α-2亚基中的加框序列用于蛋白质表达和抗体产生。显示了SEQ ID NO:305(上)和300(下)。图2B显示了人和小鼠β-肌营养不良蛋白聚糖(DG)细胞外结构域的序列比对。人和小鼠β-DG细胞外结构域的蛋白质序列是具有88.4％同一性的同源物。人和鼠β-DG中的加框序列用于蛋白质表达和抗体产生。显示了SEQ ID NO:303(上)和304(下)。
图3A和3B显示了与人(图3A)和小鼠(图3B)LG-4/5结合的衍生自杂交瘤克隆C21的抗层粘连蛋白-2抗体的表面等离子体共振(Biacore； GE Healthcare)动力学测定资料。
图3C显示了与HEK293细胞上表达的人和小鼠LG-4/5结合的衍生自杂交瘤克隆C21的抗层粘连蛋白-2抗体的荧光激活细胞分选(FACS)分析。
图3D显示了关于将不同量的重组人层粘连蛋白-2、鼠LG-5(mLG5)、人LG-5(hLG5)和人LG-4/5(hLG4/LG5)点到硝酸纤维素上然后用衍生自杂交瘤克隆C21的抗层粘连蛋白-2抗体加以探测的斑点印迹。C2C12细胞裂解物中的层粘连蛋白-2的量低于检测限。
图3E和3F显示了与人(图3F)和小鼠(图3G)LG-4/5结合的衍生自杂交瘤克隆C3的抗层粘连蛋白-2抗体的表面等离子体共振(Biacore； GE Healthcare)动力学测定资料。
图3G显示了与HEK293细胞上表达的人和小鼠LG-4/5结合的衍生自杂交瘤克隆C3的抗层粘连蛋白-2抗体的荧光激活细胞分选(FACS)分析。
图3H显示了关于将不同量的重组人层粘连蛋白-2(Hu 211)、鼠LG-5(mLG5)、人LG-5(hLG5)和人LG-4/5(hLG4/LG5)点到硝酸纤维素上然后用衍生自杂交瘤克隆C3的抗层粘连蛋白-2抗体加以探测的斑点印迹。C2C12细胞裂解物中的层粘连蛋白-2的量低于检测限。
图3I和3J显示了与人(图3I)和小鼠(图3J)β-DG结合的衍生自杂交瘤克隆AS30的抗β-DG抗体的表面等离子体共振(Biacore； GE Healthcare)动力学测定资料。
图3K显示了关于将不同量的重组鼠β-DG ECD(m βDG)、人β-DG ECD(Hu βDG)或重组肌营养不良蛋白聚糖(rhDG)点在硝酸纤维素上然后用衍生自杂交瘤克隆AS30的抗β-DG抗体加以探测的斑点印迹。C2C12细胞裂解物和胫骨前肌细胞裂解物(TA裂解物)中的βDG量低于检测限。法布瑞酶(agalsidase beta,Genzyme)用作阴性对照。
图3L显示了使用衍生自杂交瘤克隆AS30的抗β-DG抗体通过来自C2C12细胞裂解物的β-DG的免疫沉淀产生的样品的Western印迹。第一泳道显示了阳性对照，第二泳道显示了用衍生自噬菌体展示克隆B06(其对βDG具有低亲和力并因此对βDG和α-DG的下拉最小)的抗β-DG抗体探测的免疫沉淀样品，第三泳道显示了用衍生自杂交瘤克隆AS30(其中丰富的βDG和α-DG被免疫沉淀)的高亲和力抗β-DG抗体探测的免疫沉淀样品。
图3M和3N显示了与人(图3M)和小鼠(图3N)β-DG结合的衍生自杂交瘤克隆AS19的抗β-DG抗体的表面等离子体共振(Biacore；GE Healthcare)动力学测定资料。
图3O显示了关于将不同量的重组鼠β-DG ECD、人β-DG ECD或重组肌营养不良蛋白聚糖点在硝酸纤维素上然后用衍生自杂交瘤克隆AS19的抗β-DG抗体加以探测的斑点印迹。C2C12细胞裂解物，胫骨前肌细胞裂解物(TA裂解物)。法布瑞酶(agalsidase beta,Genzyme)用作阴性对照。
图3P显示了使用衍生自杂交瘤克隆AS19的抗β-DG抗体通过来自C2C12细胞裂解物的β-DG的免疫沉淀产生的样品的Western印迹。第一泳道显示了阳性对照，第二泳道显示了用衍生自噬菌体展示克隆B06(其对βDG具有低亲和力并因此对βDG和α-DG的下拉最小)的抗β-DG抗体探测的免疫沉淀样品，第三泳道显示了用衍生自杂交瘤克隆AS19的抗β-DG抗体探测的免疫沉淀样品。
图4A和4B显示了未固定的冷冻的人和小鼠肌肉组织切片，所述切片用衍生自杂交瘤克隆C21(图4A)和C3(图4B)的抗层粘连蛋白-2抗体染色，然后用荧光标记的抗小鼠IgG二级抗体加以检测。但二级抗体没有显现任何染色(未显示)。
图4C和4D显示了未固定的冷冻的人和小鼠肌肉组织切片，所述切片用衍生自杂交瘤克隆AS30(图4C)和AS19(图4D)的抗β-DG抗体染色，然后用荧光标记的抗小鼠IgG二级抗体加以检测。但仅二级抗体没有显现任何染色(未显示)。
图5A显示了根据一些实施方案对于β-DG和层粘连蛋白-2特异的四价双特异性串联IgG形式抗体(TBTI抗体)的方案设计。
图5B显示了根据一些实施方案对于β-DG和层粘连蛋白-2特异的交叉双可变结构域IgG形式(CODV)双特异性抗体的方案设计。
图6A和6B显示了针对人LG-4/5和人β-DG(图6A)或针对鼠LG-4/5和鼠β-DG(图6B)的亲本单克隆抗体(AS19、C3和C21)和双特异性抗体(T1T2、C5C6和T5T6)的序贯表面等离子体共振(Biacore；GE Healthcare)结合分析资料。
图7显示了LG-4/5和β-DG与双特异性抗体同时结合的双层夹心ELISA结果。测定了添加β-DG的亲本单克隆抗体(AS19、C3和C21)以及添加或不添加β-DG的双特异性抗体(T1T2、C5C6或T5T6)的结合。仅双特异性抗体T1T2、T5T6和C5C6显示出同时与LG-4/5和β-DG显著结合。
图8A和8B显示了野生型鼠肌肉组织(图8A)或LARGEmyd-3J/GrsrJ鼠肌肉组织(图8B)的未固定的冰冻切片，所述切片用亲本单克隆抗体(AS19、C3和C21)或双特异性抗体(T1T2、C5C6或T5T6)染色，并用荧光标记的抗小鼠IgG二级抗体检测。
图8C概述了用于测试双特异性抗体对运动诱发的肌肉损伤的影响的双特异性肌内注射研究计画。在实验的第1天和第4天将双特异性抗体肌内注射到LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的胫骨前(TA)肌中。在第5天注射伊文思蓝染料(EB)以追踪肌纤维损伤。小鼠经历了强制性跑步机运动，并在第6天被处死。
图8D显示了用双特异性抗体T1T2治疗与亲本单克隆抗体混合物(AS19和C3)治疗的伊文思蓝阳性(即损伤)肌纤维的平均数。用双特异性抗体治疗看到的损伤比用对照亲本抗体治疗更少。
图8E显示了用双特异性抗体T1T2或亲本单克隆抗体混合物(AS19和C3)治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的染色的肌肉组织。相比于用双特异性抗体T1T2，在用亲本单克隆抗体治疗的组织中的伊文思蓝染料染色(箭头)明显得多。显示了使用荧光二级抗体对双特异性抗体T1T2或亲本单克隆抗体混合物(AS19和C3)的染色。
图8F显示了双特异性抗体T1T2(通过尾静脉注射或腹膜内施用)和衍生自杂交瘤克隆AS19或C3的亲本抗体的全身性递送之后的药代动力学和生物分布。给药后4天，在血液中仍可检测到双特异性抗体。
图9A至9C显示了野生型小鼠(指向向下的三角形)、用对照单克隆亲本抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠(指向向上的三角形)和双特异性抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠(正方形)的行为测试。图9A显示与未治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠相比，双特异性抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠显示出握力测试的改善。图9B显示与未治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠相比，双特异性抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠显示出金属丝悬挂测试的改善。图9C显示与未治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠相比，双特异性抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠显示出跑步时间测试的改善。
图9D显示与未治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠相比，双特异性抗体治疗的LARGEmyd -3J/GrsrJ小鼠具有降低的肌酸激酶水准，表明较少的肌肉损伤。
图10显示了在来自用双特异性抗体T1T2(组1T1T2)与亲本单克隆抗体AS19和C3混合物(组2对照)治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的组织中伊文思蓝阳性(即损伤)肌纤维的平均数。将野生型未治疗小鼠(组3WT)用作对照。在LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠中，用双特异性抗体T1T2治疗看到的损伤比用对照亲本抗体治疗更少。
图11显示了在注射双特异性抗体T1T2、亲本单克隆抗体AS19或C3、或作为阴性对照的PBS之后4天的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠组织的免疫荧光染色。洗涤载玻片并使用具有DAPI(Vector Labs)的Vectashield封片剂加以封固。IV：静脉注射；IP：腹膜内注射。
图12A显示了与抗原人β-DG结合的AS30Fab的总体结构，其中抗原显示在重链和轻链之间。图12B显示了AS30Fab的CDR与抗原β-DG之间的相互作用的近视图。在该相互作用中涉及的残基显示为小棍；CDR中的箭头指示从N端到C端的方向。
图12C显示了与抗原人层粘连蛋白-2LG-5结构域结合的C21Fab的总体结构，其中抗原显示在重链和轻链之间。图12D显示了C21Fab的CDR与抗原层粘连蛋白-2LG-5结构域之间的相互作用的近视图。在该相互作用中涉及的残基显示为小棍；CDR中的箭头指示从N端到C端的方向。
图13显示了根据一些实施方案的包含形成用于结合层粘连蛋白-2或β-DG的三个抗原结合位点的四条多肽链的三价结合蛋白(triAb)的示意图。
图14A和14B显示了检验triAb与人LG4/5或β-DG结合的双结合夹心ELISA测定的结果。在图14A中，用生物素化的N’Avi-HPC4-人LG4/5包被平板，检测与人β-DG的结合。在图14B中，用人β-DG-HPC4-Avi-C’包被平板，检测与人LG4/5的结合。
图14C显示了triAb 3407、3437或3439与人LG4/5，然后是与人β-DG的依次结合。相反，单价抗LG4/5抗体C3_Hu11、C21_Hu11、C21_Hu21和C3_Hu10仅结合LG4/5，而单价抗β-DG抗体AS30_Hu6仅结合β-DG，并且阴性对照triAb未显示结合。
图15显示了使用握力测定法用triAb 3407、3437或3439治疗对LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的肌肉功能的影响。将指示的triAb给药与给予盐水或阴性对照triAb进行比较。还测量了在测定中的野生型小鼠的性能。
图16显示了使用金属丝悬挂测定法用triAb 3407、3437或3439治疗对LARGEmyd -3J/GrsrJ小鼠的肌肉功能的影响。将指示的triAb给药与给予盐水或阴性对照triAb进行比较。还测量了在测定中的野生型小鼠的性能。
图17显示了使用平板测定法用triAb 3407、3437或3439治疗对LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的肌肉功能的影响。将指示的triAb给药与给予盐水或阴性对照triAb进行比较。还测量了在测定中的野生型小鼠的性能。
发明详述
本公开提供了多特异性和双特异性结合分子，其包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域。在一些实施方案中，结合分子是双特异性的，并且包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域。在一些实施方案中，结合分子是多特异性的，并且包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域、结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域、和结合一个或多个另外的靶标的一个或多个另外的结合结构域。本公开提供了多特异性/双特异性结合分子的多种构型，其能够在体内模型系统中同时结合肌营养不良蛋白聚糖和层粘连蛋白-2并改善α-肌营养不良蛋白聚糖病的症状。
以下描述提出了示例性方法、参数等。然而，应该认识到，这样的描述并非旨在限制本公开的范围，而是提供为示例性实施方案的描述。
定义
除非另外指明，正如根据本公开所使用的，以下术语应理解为具有以下含义。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
如本文中使用的，术语“抗原”或“靶抗原”或“抗原靶”是指能够被结合蛋白结合的分子或分子的一部分，并且其还能在动物中用于产生能够结合该抗原的表位的抗体。靶抗原可具有一个或多个表位。关于被结合蛋白识别的每种靶抗原，结合蛋白能够与识别靶抗原的完整抗体竞争。本文所述的示例性靶抗原包括肌营养不良蛋白聚糖(例如其细胞外部分)和层粘连蛋白-2。
术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何决定簇，例如多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是被抗体或结合蛋白结合的抗原区域。在某些实施方案中，当结合蛋白优先识别在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的其靶抗原时，结合蛋白被视为特异性地结合抗原。在一些实施方案中，当平衡解离常数≤10-6M时，例如当平衡解离常数≤10-9M时，并且例如当解离常数≤10-10M时，结合蛋白被视为特异性地结合抗原。
例如，可以通过表面等离子体共振确定结合蛋白的解离常数(KD)。通常，表面等离子体共振分析使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor；Piscataway,NJ)通过表面等离子体共振(SPR)测量配体(生物感测器基质上的靶抗原)与分析物(溶液中的结合蛋白)之间的实时结合相互作用。也可以通过固定分析物(在生物感测器基质上的结合蛋白质)和呈现配体(靶抗原)进行表面等离振子分析。如本文中使用的，术语“KD”是指在特定结合蛋白和靶抗原之间相互作用的解离常数。
如本文中使用的，术语“特异性结合”指结合蛋白或其抗原结合片段以至少大约为1x 10-6M、1x 10-7M、1x 10-8M、1x 10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M、1x 10-12M、或更大的KD与含有表位的抗原结合和/或以比它与非特异性抗原的亲和力至少大两倍的亲和力与表位结合的能力。
如本文中使用的术语“结合蛋白”是指与至少一种靶抗原特异性结合的非天然存在的(或重组的或工程改造的)分子。
术语“单特异性结合蛋白”是指与一种抗原靶特异性结合的结合蛋白。
术语“单价结合蛋白”是指具有一个抗原结合位点的结合蛋白。
术语“双特异性结合蛋白”是指与两种不同的抗原靶特异性结合的结合蛋白。双特异性或双功能抗体通常是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点或表位的人工杂种抗体。双特异性抗体可以通过多种方法产生，包括但不限于杂交瘤的融合或F(ab′)片段的连接。
术语“二价结合蛋白”是指具有两个结合位点或结构域的结合蛋白。
如本文中使用的术语“多核苷酸”是指长度为至少10个核苷酸的单链或双链核酸聚合物。在某些实施方案中，构成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类核苷酸的修饰形式。这样的修饰包括碱基修饰如溴尿苷，核糖修饰如阿拉伯糖苷和2',3'-双脱氧核糖，以及核苷酸间连接修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。术语“多核苷酸”具体包括DNA的单链和双链形式。
“分离的多核苷酸”是基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某些组合，其：(1)不与所述分离的多核苷酸在自然界中存在于其中的多核苷酸的全部或部分结合，(2)与在自然界中未与该分离的多核苷酸连接的多核苷酸连接，或(3)在自然界中并不作为更大序列的一部分存在。
“分离的多肽”是指：其(1)不含至少一些通常与其一起存在的其他多肽，(2)基本上不含来自相同来源例如来自相同物种的其他多肽，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)与其在自然界中所结合的至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质分开，(5)不与在自然界中所述“分离的多肽”所结合的多肽的部分结合(通过共价或非共价相互作用)，(6)与在自然界中未与其结合的多肽可操作地结合(通过共价或非共价相互作用)，或(7)在自然界中不存在。这种分离的多肽可以由合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何组合编码。在一些实施方案中，分离的多肽基本上不含在其天然环境中发现的将会干扰其用途(治疗、诊断、预防、研究或其他)的多肽或其他污染物。
天然存在的抗体一般包括四聚体。每个这样的四聚体一般由相同的两对多肽链组成，每对具有一条全长“轻链”(通常具有约25kDa的分子量)和一条全长“重链”(通常具有约50-70kDa的分子量)。如本文中使用的术语“重链”和“轻链”是指具有足以赋予针对靶抗原特异性的可变结构域序列的任何免疫球蛋白多肽。每条轻链和重链的氨基末端部分通常包含通常负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变结构域。每条链的羧基末端部分通常限定负责效应器功能的恒定结构域。因此，在天然存在的抗体中，全长重链免疫球蛋白多肽包括一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，其中VH结构域位于多肽的氨基末端并且CH3结构域位于羧基末端，并且全长轻链免疫球蛋白多肽包括一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)，其中VL结构域位于多肽的氨基末端并且CL结构域位于羧基末端。
人轻链通常分类为κ轻链和λ轻链，人重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，并将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。类似地，IgA细分为亚类，包括但不限于IgA1和IgA2。在全长轻链和重链内，可变结构域和恒定结构域通常由约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括约10多个氨基酸的“D”区。参见，例如Fundamental Immunology(Paul,W.编辑，Raven Press，第2版，1989)，出于所有目的通过提述将其完整并入本文。每个轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。天然存在的抗体的可变结构域通常显示具有由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同的通用结构。来自每一对的两条链的CDR通常由框架区对齐，这可以使其能够与特异性表位结合。从氨基末端到羧基末端，轻链可变结构域和重链可变结构域两者通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
术语“CDR组”是指存在于能够结合抗原的单个可变区中的三个CDR的组。根据不同的系统对这些CDR的确切边界进行了不同的定义。由Kabat(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest (National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)和(1991))描述的系统不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和coworkers(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-17；Chothia等人，1989,Nature342:877-83)发现，Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有巨大的多样性。这些子部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区域可以被称为Chothia CDR，其具有与KabatCDR重迭的边界。与Kabat CDR重迭的定义CDR的其他边界已经由Padlan,1995,FASEBJ.9:133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5):732-45；和Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27:55-77描述。另有其他的CDR边界定义可能不严格遵循本文中的系统之一，但是仍然与Kabat CDR重迭，但是鉴于特定残基或者残基的基团或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，可以将它们缩短或延长。虽然某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR，但是本文中使用的方法可以利用根据任何这些系统定义的CDR。使用氨基酸序列鉴定预测的CDR是本领域熟知的，例如引自Martin,A.C."Protein sequenceand structure analysis of antibody variable domains,"In Antibody Engineering,Vol.2.Kontermann R.,Dübel S.,eds.Springer-Verlag,Berlin,p.33–51(2010)。还可以通过其他常规方法检查重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列以鉴定CDR的序列，该方法例如通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列进行比较来确定序列高变区。可以通过目测将编号的序列对齐，或者通过使用诸如CLUSTAL程序套件之一的对齐程序来对齐，正如Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22:4673-80中描述。常规地使用分子模型来正确描绘框架和CDR区，从而纠正基于序列的分配。
本文中使用的术语“Fc”是指包含由抗体消化产生的或通过其他手段产生的非抗原结合片段序列的分子，而不论是单体还是多聚体形式，并且可以含有铰链区。在一些实施方案中，天然Fc的原始免疫球蛋白来源是人来源的并且可以是任何免疫球蛋白，例如IgG1和IgG2。Fc分子由可通过共价(即二硫键)和非共价结合连接成二聚体或多聚体形式的单体多肽组成。取决于类(例如IgG、IgA和IgE)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1和IgGA2)，在天然Fc分子的单体亚基之间的分子间二硫键的数目为1至4。Fc的一个实例是由木瓜蛋白酶消化IgG产生的二硫键结合的二聚体。本文中使用的术语“Fc”对于单体、二聚体和多聚体形式是通用的。
F(ab)片段通常包含一条轻链和一条重链的VH和CH1结构域，其中F(ab)片段的VH-CH1重链部分不能与另一条重链多肽形成二硫键。如本文中使用的，F(ab)片段还可以包括含有由氨基酸接头分开的两个可变结构域的一条轻链，和含有由氨基酸接头和CH1结构域分开的两个可变结构域的一条重链。
F(ab')片段通常包括一条轻链和含有更多恒定区的一条重链的一部分(CH1和CH2结构域之间)，使得可在两条重链之间形成链间二硫键，从而形成F(ab')2分子。
“重组”分子是已经通过重组手段制备、表达、产生或分离的分子。
本公开的一个实施方案提供了具有针对一个和三个靶抗原的生物学和免疫学特异性的结合蛋白。本公开的另一个实施方案提供了包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列的核酸分子。本公开的另一个实施方案提供了表达载体，其包含包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核苷酸序列的核酸分子。本公开的又另一个实施方案提供了表达此类结合蛋白的宿主细胞(即，包含编码形成此类结合蛋白的多肽链的核酸分子或载体)。
如本文中使用的术语“可交换性”是指结合蛋白形式内可变结构域的可互换性，并且其中保留折叠和最终结合亲和力。“完全可交换性”是指在式I的多肽链或式II的多肽链中交换VH1和VH2结构域的顺序因此交换VL1和VL2结构域的顺序的能力(即，颠倒该顺序)，同时维持结合蛋白的全部功能性，正如保留结合亲和力所证明。此外，应该注意的是，名称VH和VL仅指处于最终形式的特定蛋白质链上的结构域的位置。例如，VH1和VH2可以衍生自亲本抗体中的VL1和VL2结构域并被置于结合蛋白中的VH1和VH2位置。同样，VL1和VL2可以衍生自亲本抗体中的VH1和VH2结构域并被置于结合蛋白中的VH1和VH2位置。因此，VH和VL名称是指当前位置，而不是亲本抗体中的原始位置。VH和VL结构域因此是“可交换的”。
“分离的”结合分子或蛋白质是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的结合分子或蛋白质。其天然环境的污染组分是将会干扰该结合蛋白的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶类、激素类、和其他蛋白性或非蛋白性溶质。在一些实施方案中，结合分子或蛋白质将被纯化：(1)达到正如藉由洛瑞法(Lowry Method)确定的按抗体的重量计大于95％，并且在一些实施方案中按重量计大于99％，(2)达到足以藉由使用转杯测序仪(spinning cup sequenator)获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)达到通过利用考马斯亮蓝或银染色在还原或非还原条件下进行的SDS-PAGE的同质性的程度。分离的结合分子或蛋白质包括重组细胞内的原位分子/蛋白质，因为天然环境的至少一种组分将不存在。
如本文中使用的，术语“基本上纯的”或“基本上纯化的”是指以主要种类存在(即，以摩尔为基础，其比组合物中任何其他单独的种类更丰富)的化合物或种类。在一些实施方案中，基本上纯化的部分是一种组合物，其中所述种类包含存在的所有大分子种类的至少约50％(以摩尔计)。在其他实施方案中，基本上纯的组合物将包含存在于所述组合物中的所有大分子种类的大于约80％、85％、90％、95％或99％。仍然在其他实施方案中，将所述种类纯化至基本同质性(通过常规检测方法不能在组合物中检测到污染物种类)，其中该组合物基本上由单一大分子种类组成。
如本文中使用的术语“载体”是指用于将编码信息转移至宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“载体”包括核酸分子，其能够运送与其连接的另一个核酸。一种类型的载体是“质粒”，其指的是另外的DNA区段可插入其中的环状双链DNA分子。另一种类型的载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA区段插入病毒基因组中。某些载体(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)能够在引入它们的宿主细胞中自主复制。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中之后整合到所述宿主细胞的基因组中，由此连同宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或者简单地称为“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术中的表达载体常常为质粒形式。术语“质粒”和“载体”在本文中可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本公开预期包括具有等同功能的其他形式的表达载体，比如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文中使用的短语“重组宿主细胞”(或“宿主细胞”)指的是其中已引入重组表达载体的细胞。重组宿主细胞或宿主细胞预期不仅意指特定的受试细胞，而且是指这样的细胞的后代。由于突变或环境影响而在后续世代中可能发生某些修饰，事实上这样的后代可能与亲本细胞不同，但是这样的细胞仍然被包括在本文中使用的术语“宿主细胞”的范围内。多种宿主细胞表达系统可用于表达结合蛋白，包括细菌、酵母、杆状病毒和哺乳动物表达系统(以及噬菌体展示表达系统)。适合的细菌表达载体的实例是pUC19。为了重组表达结合蛋白，用一种或多种携带编码结合蛋白的多肽链的DNA片段的重组表达载体转化或转染宿主细胞，使得多肽链在宿主细胞中表达并分泌到培养所述宿主细胞的培养基中，从培养基中可以回收结合蛋白。
如本文中使用的术语“转化”是指细胞遗传特征的变化，并且细胞在其被修饰为含有新的DNA时已经被转化。例如，在细胞从它的天然状态经历遗传修饰的情况下，所述细胞被转化。在转化后，转化DNA可以通过物理方式整合到细胞染色体中而与细胞的DNA重组，或者可以作为附加型元件短暂维持而不被复制，或者可以独立作为质粒复制。当DNA随着细胞分裂而复制时，认为细胞已被稳定转化。如本文中使用的术语“转染”是指由细胞摄取外来或外源DNA，并且当外源DNA已被引入到细胞膜以内时，该细胞已被“转染”。许多转染技术是本领域熟知的。这样的技术可用于将一个或多个外源DNA分子引入到适合的宿主细胞中。
如本文中使用并且应用于物体的术语“天然存在的”是指这样的事实，即所述物体可以在自然界中找到但是尚未被人操作。例如，可以从自然界的来源分离但是尚未被人有意修饰的存在于生物(包括病毒)中的多核苷酸或多肽是天然存在的。类似地，本文中使用的“非天然存在的”是指在自然界中未发现或已经被人进行结构修饰或合成的物体。
如本文中使用的，二十种常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。二十种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)；非天然氨基酸和类似物，比如α-,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是结合蛋白多肽链的适合组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。按照标准用法和惯例，在本文中使用的多肽符号中，左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
基于常见的侧链性质，天然存在的残基可以分为几类：
(1)疏水的：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；
(2)极性亲水的：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；
(3)脂肪族的：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；
(4)脂肪族疏水的：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；
(5)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(6)酸性的：Asp、Glu；
(7)碱性的：His、Lys、Arg；
(8)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(9)芳香族的：His、Trp、Tyr、Phe；以及
(10)芳香族疏水的：Phe、Trp、Tyr。
保守性氨基酸取代可涉及将这些类别之一的成员与同一类别的另一成员交换。非保守性取代可涉及将这些类别之一的成员与另一个类别的成员交换。
熟练技术人员将能够使用熟知的技术确定结合蛋白多肽链的适合的变体。例如，本领域技术人员可以鉴定通过靶向被认为对于活性不重要的区域在不破坏活性的情况下加以改变的多肽链的适当区域。或者，本领域技术人员可以鉴定在相似多肽中保守的分子的残基和部分。另外，在不破坏生物学活性或不会不利地影响多肽结构的情况下，即使对于生物学活性或结构可能重要的区域，也可以进行保守性氨基酸取代。
如本文中使用的术语“患者”(术语“个体”和“受试者”在本文中可互换使用)包括人和动物(例如哺乳动物，包括但不限于狗、猫和其他家养宠物；马、牛、山羊、兔子、水牛和其他家畜；以及研究动物，比如非人灵长类动物、小鼠等)受试者。
在一些实施方案中，如本文中使用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指治疗性处理，例如减轻或缓和一种或多种症状的严重性或存在。
在其他实施方案中，如本文中使用的术语“预防”可以指预防性或防止性措施，例如预防或延迟例如在处于发生本文所述的病理状况的风险的个体中的一种或多种症状的发作。
如本文中使用的术语“药物组合物”或“治疗组合物”是指在适当施用于患者时能够诱导期望的治疗效果的化合物或组合物。
如本文中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”是指一种或多种适合于实现或增强结合蛋白递送的制剂材料。
当用来提及包含一种或多种结合蛋白的药物组合物时，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以产生期望的治疗结果的量或剂量。更具体地说，治疗有效量是足以抑制与正在治疗的病症相关的一个或多个临床定义的病理过程持续一段时间的结合蛋白的量。有效量可以根据所使用的具体结合蛋白而变化，并且还取决于与被治疗患者有关的各种因素和状况以及疾患的严重程度。例如，如果将要在体内施用结合蛋白，则诸如患者的年龄、体重和健康等因素以及在临床前动物工作中获得的剂量反应曲线和毒性数据等因素将在要考虑的那些因素之中。给定药物组合物的有效量或治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
本公开的一个实施方案提供了药物组合物，其包含药学上可接受的载体和治疗有效量的结合分子。
结合分子
本公开的某些方面涉及多特异性结合分子，其包含一个或多个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的结合结构域和一个或多个结合层粘连蛋白-2的结合结构域。在一些实施方案中，多特异性结合分子是包含一个或多个多肽链的多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，多特异性结合分子是包含两个或四个抗原结合位点的二价或四价双特异性结合分子。在一些实施方案中，多特异性结合分子是包含三个抗原结合位点的三价多特异性结合分子。术语“结合结构域”和“结合位点”在本文中可互换使用。
多特异性结合蛋白的各种形式和构型是本领域已知的并且适合于如本文所述的用途。下面提供了示例性和非限制性形式的描述。在国际公开号WO2017/180913中描述的任何形式及其任选特征可在本文所述的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)中使用。
多特异性三价结合蛋白
在一些实施方案中，结合蛋白是多特异性结合蛋白。在一些实施方案中，多特异性结合蛋白是包含三个抗原结合位点并共同靶向两个或更多个靶抗原的三价结合蛋白。在一些实施方案中，结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含四条多肽链，其中第一多肽链包含由下式表示的结构：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
并且第二多肽链包含由下式表示的结构：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
并且第三多肽链包含由下式表示的结构：
VH3-CH1-铰链-CH2-CH3 [III]
并且第四多肽链包含由下式表示的结构：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL3是第三免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
VH3是第三免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头。
在一些实施方案中，式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，VH1和VL1形成抗原结合位点，VH2和VL2形成抗原结合位点，并且VH3和VL3形成抗原结合位点，总共三个抗原结合位点。在一些实施方案中，三个抗原结合位点包括至少一个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗原结合位点和至少一个结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点(例如一个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗原结合位点和两个结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点，或者两个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗原结合位点和一个结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点)。
在一些实施方案中，两个结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点结合层粘连蛋白-2的不同表位。在一些实施方案中，两个结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点结合层粘连蛋白-2的相同表位或重叠表位。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合层粘连蛋白-2的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成结合层粘连蛋白-2的第二抗原结合位点，并且VH3和VL3形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第三抗原结合位点。
在一些实施方案中，两个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗原结合位点结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的不同表位。在一些实施方案中，两个结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗原结合位点结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的相同表位或重叠表位。在一些实施方案中，VH1和VL1形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一抗原结合位点，VH2和VL2形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第二抗原结合位点，并且VH3和VL3形成结合层粘连蛋白-2的第三抗原结合位点。
本文所述的任何抗原结合位点均可用于本文所述的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)，例如包括但不限于包含根据上文所述的式I、II、III和/或IV的多肽的结合蛋白。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含：重链可变结构域(VH)，其包含包含序列GFTFTDSV (SEQ ID NO:316)的CDR-H1、包含序列IYPGSGNF(SEQ ID NO:318)的CDR-H2和包含序列AMRRSS (SEQ ID NO:320)的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列QTIVHSNSKTY (SEQ ID NO:332)的CDR-L1、包含序列KVS (SEQID NO:334)的CDR-L2和包含序列FQGSHVPLT (SEQ ID NO:336)的CDR-L3。在一些实施方案中，VH和VL结构域形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗原结合位点(例如VH1和VL1、VH2和VL2或VH3和VL3)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表A2中所示的抗体AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9的1、2、3、4、5或6个CDR序列。
在一些实施方案中，VH和/或VL结构域是人源化的。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含与氨基酸序列SEQ ID NO:314具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:330具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含与氨基酸序列SEQ ID NO: 346具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:362具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表D2中所示的抗体AS30SS_Hu6或AS30SS_Hu9的VH和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO:306编码的VH结构域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO:322编码的VL结构域。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO:338编码的VH结构域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO:354编码的VL结构域。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含：重链可变结构域(VH)，其包含包含序列GFTFSSYT (SEQ ID NO:380)的CDR-H1、包含序列ISSSGSNT(SEQ ID NO:382)的CDR-H2和包含序列ARFDYGSSLDS (SEQ ID NO:384)的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列QSISNN (SEQ ID NO:396)的CDR-L1、包含序列YAS (SEQ IDNO:398)的CDR-L2和包含序列QQSKSWPRT (SEQ ID NO:400)的CDR-L3。在一些实施方案中，VH和VL结构域形成结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点(例如VH1和VL1、VH2和VL2、或VH3和VL3)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表A2中所示的抗体C3_Hu10的1、2、3、4、5或6个CDR序列。
在一些实施方案中，VH和/或VL结构域是人源化的。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含与氨基酸序列SEQ ID NO:378具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:394具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表D2中所示的抗体C3_Hu10的VH和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO:370编码的VH结构域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO:386编码的VL结构域。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含：重链可变结构域(VH)，其包含包含序列GFTFSSYT (SEQ ID NO:380)的CDR-H1、包含序列ISSSGSNT(SEQ ID NO:382)的CDR-H2和包含序列ARFDYGSSLDS (SEQ ID NO:384)的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列QSIGNN (SEQ ID NO:428)的CDR-L1、包含序列YAS (SEQ IDNO:398)的CDR-L2和包含序列QQSKSWPRT (SEQ ID NO:400)的CDR-L3。在一些实施方案中，VH和VL结构域形成结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点(例如VH1和VL1、VH2和VL2或VH3和VL3)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表A2中所示的抗体C3_Hu11的1、2、3、4、5或6个CDR序列。
在一些实施方案中，VH和/或VL结构域是人源化的。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含与氨基酸序列SEQ ID NO:410具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:426具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表D2中所示的抗体C3_Hu11的VH和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO:402编码的VH结构域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO:418编码的VL结构域。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含：重链可变结构域(VH)，其包含包含序列GFTFSSYT (SEQ ID NO:444)的CDR-H1、包含序列ISSSGSNT(SEQ ID NO:446)的CDR-H2和包含序列ARFDYGSSLDS (SEQ ID NO:448)的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列QSISNY (SEQ ID NO:460)的CDR-L1、包含序列YAS (SEQ IDNO:462)的CDR-L2和包含序列QQSKSWPRT (SEQ ID NO:464)的CDR-L3。在一些实施方案中，VH和VL结构域形成结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点(例如VH1和VL1、VH2和VL2或VH3和VL3)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表A2中所示的抗体C21_Hu11的1、2、3、4、5或6个CDR序列。
在一些实施方案中，VH和/或VL结构域是人源化的。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含与氨基酸序列SEQ ID NO:442具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:458具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表D2中所示的抗体C21_Hu11的VH和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO:434编码的VH结构域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO:450编码的VL结构域。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含：重链可变结构域(VH)，其包含包含序列GFTFSSYT (SEQ ID NO:444)的CDR-H1、包含序列ISSSGDNT(SEQ ID NO:478)的CDR-H2和包含序列ARFDYGSSLDS (SEQ ID NO:448)的CDR-H3；和轻链可变结构域(VL)，其包含包含序列QSISNY (SEQ ID NO:460)的CDR-L1、包含序列YAS (SEQ IDNO:462)的CDR-L2和包含序列QQSKSWPRT (SEQ ID NO:464)的CDR-L3。在一些实施方案中，VH和VL结构域形成结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点(例如VH1和VL1、VH2和VL2、或VH3和VL3)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表A2中所示的抗体C21_Hu21的1、2、3、4、5或6个CDR序列。
在一些实施方案中，VH和/或VL结构域是人源化的。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含与氨基酸序列SEQ ID NO:474具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:490具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表D2中所示的抗体C21_Hu21的VH和/或VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含由多核苷酸序列SEQ ID NO:466编码的VH结构域和/或由多核苷酸序列SEQ ID NO:482编码的VL结构域。
在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ IDNO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:384的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQ ID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:378，VL1包含序列SEQ ID NO:394；VH2包含序列SEQ ID NO:378，VL2包含序列SEQ ID NO:394；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含：包含序列SEQ ID NO:500的第一多肽链、包含序列SEQ ID NO:498的第二多肽链、包含序列SEQ ID NO:499的第三多肽链和包含序列SEQ ID NO:501的第四多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白包含triAb 3407的1、2、3或4个多肽链，例如，如表I2或I4所示。
在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ IDNO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:446的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:448的CDR-H3，并且VL2包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQ ID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:378，VL1包含序列SEQ ID NO:394；VH2包含序列SEQ ID NO:442，VL2包含序列SEQ ID NO:458；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO:504的第一多肽链、包含序列SEQ ID NO:502的第二多肽链、包含序列SEQ ID NO:503的第三多肽链和包含序列SEQ ID NO:505的第四多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白包含triAb 3423的1、2、3或4个多肽链，例如，如表I2或I4所示。
在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ IDNO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:478的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:448的CDR-H3，并且VL2包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQ ID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:410，VL1包含序列SEQ ID NO:426；VH2包含序列SEQ ID NO:474，VL2包含序列SEQ ID NO:490；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO:508的第一多肽链、包含序列SEQ ID NO:506的第二多肽链、包含序列SEQ ID NO:507的第三多肽链和包含序列SEQ ID NO:509的第四多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白包含triAb 3429的1、2、3或4个多肽链，例如，如表I2或I4所示。
在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ IDNO:446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:384的CDR-H3，并且VL2包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:442，VL1包含序列SEQ ID NO:458；VH2包含序列SEQ ID NO:410，VL2包含序列SEQ ID NO:426；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，并且VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO:512的第一多肽链、包含序列SEQ ID NO:510的第二多肽链、包含序列SEQ ID NO:511的第三多肽链和包含序列SEQ ID NO:513的第四多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白包含triAb 3437的1、2、3或4个多肽链，例如，如表I2或I4所示。
在一些实施方案中，VH1包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ IDNO:478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3，并且VL1包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3；VH2包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ IDNO:384的CDR-H3，并且VL2包含包含序列SEQ ID NO:396的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3；并且VH3包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3，并且VL3包含包含序列SEQ ID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH1包含序列SEQ ID NO:474，VL1包含序列SEQ ID NO:490；VH2包含序列SEQ ID NO:378，VL2包含序列SEQ ID NO:394；并且VH3包含序列SEQ ID NO:314，VL3包含序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含包含序列SEQ ID NO:516的第一多肽链、包含序列SEQ ID NO:514的第二多肽链、包含序列SEQ ID NO:515的第三多肽链和包含序列SEQ ID NO:517的第四多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白包含triAb 3439的1、2、3或4个多肽链，例如，如表I2或I4所示。
双特异性结合蛋白
在一些实施方案中，结合蛋白是双特异性结合蛋白。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白是包含两个抗原结合位点并共同靶向两种靶抗原的二价结合蛋白。在一些实施方案中，双特异性结合蛋白是包含四个抗原结合位点并共同靶向两种靶抗原的四价结合蛋白。
在一些实施方案中，双特异性结合分子包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域，其中所述第一结合结构域包含第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)和第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)，其中所述第二结合结构域包含第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)和第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)。在一些实施方案中，双特异性结合分子是双特异性结合蛋白，比如双特异性抗体。
在一些实施方案中，双特异性结合分子包含形成四个抗原结合位点的四条多肽链，其中两条多肽链包含由下式表示的结构：
VL1-L1-VL2-L2-CL [I]
并且两条多肽链包含由下式表示的结构：
VH2-L3-VH1-L4-CH1-铰链-CH2-CH3 [II]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L1、L2、L3和L4是氨基酸接头；
其中VH1和VL1结构域形成VH1/VL1结合对，并且其中VH2和VL2结构域形成VH2/VL2结合对。
在一些实施方案中，式I和式II按照从N端到C端的顺序描述各自多肽链内的结构域的排列。在一些实施方案中，一个或多个多肽链可以包含另外的一条或多条序列，例如在N端或C端。
对于这种形式的示例性描述，参见，例如，国际公开号WO2012/135345、美国专利号9,221,917和欧洲专利号EP2691416B1。
在一些实施方案中，双特异性结合分子包含两条包含序列SEQ ID NO:530的根据式II的多肽链和两条包含序列SEQ ID NO:531的根据式I的多肽链。在一些实施方案中，双特异性结合分子包含两条包含序列SEQ ID NO:532的根据式II的多肽链和两条包含序列SEQ ID NO:533的根据式I的多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白包含两条针对表I3或I4中的AS30_Hu9xC3_Hu11 CODV或AS30_Hu9xC21_Hu21 CODV所示的多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白包含包含表A2中所示的1、2、3、4、5或6个CDR序列的可变结构域。在一些实施方案中，结合蛋白包含表D2、I3或I4中所示的1、2、3或4个可变结构域。
在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且VH2/VL2结合对结合层粘连蛋白-2。在其他实施方案中，VH2/VL2结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且VH1/VL1结合对结合层粘连蛋白-2。
在上文所述的任何多特异性和/或双特异性结合分子的一些实施方案中，式I的多肽和式II的多肽形成交叉轻链-重链对。在一些实施方案中，VH1和VL1结构域交叉以形成VH1/VL1结合对。在一些实施方案中，VH2和VL2结构域交叉以形成VH2/VL2结合对。在一些实施方案中，如本文中提及以上形式使用的术语接头是指插入免疫球蛋白结构域之间的一个或多个氨基酸残基，从而为轻链和重链的结构域提供足够的移动性以折叠成交叉双可变区免疫球蛋白。在序列水平分别在可变结构域之间或在可变结构域与恒定结构域之间的转变处插入接头。可以鉴定结构域之间的转变，因为已充分了解免疫球蛋白结构域的近似大小。正如实验数据所证明，或者正如可以通过建模或二级结构预测技术所假定，可以通过定位不形成诸如β-片层或α-螺旋等二级结构元件的肽段，来确定结构域转变的精确位置。接头L1、L2、L3和L4是独立的，但它们在某些情况下可能具有相同的序列和/或长度。
在一些实施方案中，本公开的接头包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在一些实施方案中，L1和L2包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在一些实施方案中，L3和L4包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在国际公开号WO2017/180913中描述的任何接头和接头组合可在本文所述的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)中使用。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自长度为0至50个氨基酸残基，长度为0至40个氨基酸残基，长度为0至30个氨基酸残基，长度为0至25个氨基酸残基，长度为0至20个氨基酸残基，长度为0至18个氨基酸残基，长度为0至16个氨基酸残基，或长度为0至14个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头L1、L2、L3和L4的长度范围为从没有氨基酸(长度＝0)至约100个氨基酸，或少于100、50、40、30、20个或15个氨基酸或更少。接头长度也可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2个或1个氨基酸。在一个结合蛋白中的L1、L2、L3和L4可以全部都具有相同的氨基酸序列或者可以全部都具有不同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，L1的长度为5个氨基酸残基，L2的长度为5个氨基酸残基，L3的长度为5个氨基酸残基，L4的长度为5个氨基酸残基。在某些实施方案中，L1的长度为14个氨基酸残基，L2的长度为2个氨基酸残基，L3的长度为14个氨基酸残基，L4的长度为2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1和L3各自包含序列EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296)，和/或L2和L4各自包含序列GG。在某些实施方案中，L1的长度为7个氨基酸残基，L2的长度为5个氨基酸残基，L3的长度为1个氨基酸残基，并且L4的长度为2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP (SEQ ID NO:297)，L2包含序列TKGPS (SEQ ID NO:298)，L3包含丝氨酸残基(例如序列S)，并且L4包含序列RT。在某些实施方案中，L1的长度为10个氨基酸残基，L2的长度为10个氨基酸残基，L3的长度为0个氨基酸残基，并且L4的长度为0个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1和L2各自包含序列GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299)。
在一些实施方案中，式I和/或式II的多肽的两个可变结构域之一或两者是人的、人源化的或小鼠的可变结构域。
在一些实施方案中，双特异性结合分子包含两条包含由下式表示的结构的轻链：
VL1-L5-VL2-L6-CL [III]
和两条包含由下式表示的结构的重链：
VH1-L7-VH2-L8-CH1-铰链-CH2-CH3 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L5、L6、L7和L8是氨基酸接头；
其中VH1和VL1结构域形成VH1/VL1结合对，并且其中VH2和VL2结构域形成VH2/VL2结合对。
在一些实施方案中，式III和式IV按照从N端到C端的顺序描述各自多肽链内的结构域的排列。在一些实施方案中，这些多肽链中一个或多个可以包含另外的一个或多个序列，例如在N端或C端。
对于这种形式的示例性描述，参见，例如，US PG公开号US20130209469。
在一些实施方案中，双特异性结合分子包含两条包含序列SEQ ID NO:522的重链和两条包含序列SEQ ID NO:523的轻链。在一些实施方案中，双特异性结合分子包含两条包含序列SEQ ID NO:528的重链和两条包含序列SEQ ID NO:529的轻链。在一些实施方案中，结合蛋白包含两条针对表I3或I4中的AS30_Hu6xC3_Hu10或AS30_Hu6xC21_Hu11所示的多肽链。在一些实施方案中，结合蛋白包含包含表A2中所示的1、2、3、4、5或6个CDR序列的可变结构域。在一些实施方案中，结合蛋白包含表D2、I3或I4中所示的1、2、3或4个可变结构域。
在一些实施方案中，VH1/VL1结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且VH2/VL2结合对结合层粘连蛋白-2。在其他实施方案中，VH2/VL2结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且VH1/VL1结合对结合层粘连蛋白-2。
在一些实施方案中，式III和/或式IV的多肽的两个可变结构域之一或两者是人的、人源化的或小鼠的可变结构域。
接头
在一些实施方案中，L5、L6、L7和L8各自长度为0至50个氨基酸残基，长度为0至40个氨基酸残基，长度为0至30个氨基酸残基，长度为0至25个氨基酸残基，长度为0至20个氨基酸残基，长度为0至18个氨基酸残基，长度为0至16个氨基酸残基，或长度为0至14个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头L5、L6、L7和L8的长度范围为从没有氨基酸(长度＝0)至约100个氨基酸，或少于100、50、40、30、20个或15个氨基酸或更少。接头长度也可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2个或1个氨基酸。在一个结合蛋白中的L5、L6、L7和L8可以全部都具有相同的氨基酸序列或者可以全部都具有不同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的接头包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在一些实施方案中，L1和L2包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在一些实施方案中，L3和L4包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4包含序列DKTHT (SEQ ID NO:534)。在国际公开号WO2017/180913中描述的任何接头和接头组合可在本文所述的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)中使用。
在一些实施方案中，L1、L2、L3和L4各自长度为0至50个氨基酸残基，长度为0至40个氨基酸残基，长度为0至30个氨基酸残基，长度为0至25个氨基酸残基，长度为0至20个氨基酸残基，长度为0至18个氨基酸残基，长度为0至16个氨基酸残基，或长度为0至14个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头L1、L2、L3和L4的长度范围为从没有氨基酸(长度＝0)至约100个氨基酸，或少于100、50、40、30、20个或15个氨基酸或更少。接头长度也可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2个或1个氨基酸。在一个结合蛋白中的L1、L2、L3和L4可以全部都具有相同的氨基酸序列或者可以全部都具有不同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，L1的长度为5个氨基酸残基，L2的长度为5个氨基酸残基，L3的长度为5个氨基酸残基，L4的长度为5个氨基酸残基。在某些实施方案中，L1的长度为14个氨基酸残基，L2的长度为2个氨基酸残基，L3的长度为14个氨基酸残基，L4的长度为2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1和L3各自包含序列EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296)，和/或L2和L4各自包含序列GG。在某些实施方案中，L1的长度为7个氨基酸残基，L2的长度为5个氨基酸残基，L3的长度为1个氨基酸残基，并且L4的长度为2个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1包含序列GQPKAAP (SEQ ID NO:297)，L2包含序列TKGPS (SEQ ID NO:298)，L3包含丝氨酸残基(例如序列S)，并且L4包含序列RT。在某些实施方案中，L1的长度为10个氨基酸残基，L2的长度为10个氨基酸残基，L3的长度为0个氨基酸残基，并且L4的长度为0个氨基酸残基。在一些实施方案中，L1和L2各自包含序列GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299)。
在某些实施方案中，L5和L7接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:294)，和/或L6和L8接头的长度各自为0个氨基酸残基。
上面列举的实例(例如，对于L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7或L8)并非意图以任何方式限制本公开的范围，并且包含选自缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和脯氨酸的随机选择的氨基酸的接头适用于结合蛋白。
接头中的氨基酸残基的身份和序列可以取决于在接头中需实现的二级结构元件的类型而变化。例如，甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸用于柔性接头。如果需要更具刚性的延长的接头，那么甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸和丝氨酸的一些组合是有用的。任何氨基酸残基可以考虑作为与其他氨基酸残基组合的接头，以便在需要时根据期望的性质构建更大的肽接头。
恒定/Fc区
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含第二多肽链上的“隆突”突变和第三多肽链上的“穴”突变。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含第三多肽链上的“隆突”突变和第二多肽链上的“穴”突变。在一些实施方案中，“隆突”突变包含在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和/或366的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S354C、T366W、T366Y、S354C和T366W、或S354C和T366Y。在一些实施方案中，“隆突”突变包含在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，“穴”突变包含在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置407以及任选地349、366和/或368的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y407V或Y407T和任选的Y349C、T366S和/或L368A。在一些实施方案中，“穴”突变包含在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在一些实施方案中，第二多肽链的CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含氨基酸取代(例如S354C和T366W)；并且第三多肽链的CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含氨基酸取代(例如Y349C、T366S、L368A和Y407V)。在一些实施方案中，第二多肽链的CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置包含氨基酸取代(例如Y349C、T366S、L368A和Y407V)；并且第三多肽链的CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置354和366的位置包含氨基酸取代(例如S354C和T366W)。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含一个或多个突变，以便例如通过调节对纯化试剂的亲和力来改善纯化。例如，已知如果异二聚体形式的两个Fc区之一含有降低或消除与蛋白A结合的突变，那么异二聚体结合蛋白可以选择性地离开它们的同二聚体形式而被纯化，因为异二聚体形式相比于任一同二聚体形式对基于蛋白A的纯化具有中等亲和力并且可以例如藉由使用不同的pH而从蛋白A选择性地洗脱出来(参见例如，Smith,E.J.等人(2015)Sci.Rep.5:17943)。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG1 Fc区。在一些实施方案中，第一和/或第二Fc区是人IgG4Fc区。在一些实施方案中，所述突变包含在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436的位置处的取代，其中氨基酸取代是H435R和Y436F。在一些实施方案中，第二和第三多肽链的CH3结构域是人IgG1或IgG4 CH3结构域，并且仅一个CH3结构域在对应于根据EU索引的人IgG1或IgG4的位置435和436的位置包含氨基酸取代(例如H435R和Y436F)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含隆突和穴突变以及一个或多个改善纯化的突变。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含一个或多个增加半衰期例如体内半衰期的突变。在一些实施方案中，结合蛋白包含在美国专利号7,083,784中描述的一个或多个突变。例如，在一些实施方案中，第二和第三多肽链的CH2结构域是人IgG1或IgG4 CH2结构域，其包含根据EU索引编号的第252位的酪氨酸残基、第254位的苏氨酸残基和第256位的谷氨酸残基。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含一个或多个突变，所述突变导致具有改变的糖基化和/或降低的效应器功能的Fc区。在一些实施方案中，结合蛋白包含在美国专利号9,790,268中描述的一个或多个突变。例如，在一些实施方案中，第二和第三多肽链的CH2结构域是人IgG1或IgG4CH2结构域，其包含根据EU索引编号的第297位的天冬酰胺残基、第298位的天冬酰胺残基、第299位的丙氨酸残基和第300位的丝氨酸或苏氨酸残基。
考虑在本文中使用的另一种双特异性结合蛋白平台描述于US PG公开号US2013/0039913和Labrijn,A.F.等人，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.110:5145-5150中。在这种方法中，每个结合结构域以同二聚体形式产生，然后在体外装配而形成异二聚体双特异性结合蛋白。这种方法采用特定突变(例如，在抗体CH3结构域中)来促进Fab臂交换，从而产生比任一同二聚体形式更稳定的异二聚体结合蛋白。在一些实施方案中，根据Kabat等人所述的EU索引，这些突变发生在例如位置366、368、370、399、405、407和/或409。特定突变更详细地描述于US PG公开号US2013/0039913和Labrijn,A.F.等人，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.110:5145-5150中。
考虑在本文中使用的另外的双特异性结合蛋白平台简要描述于下文。一个策略由Carter等人提出(Ridgway等人，1996,Protein Eng.9(7):617-21；Carter,2011,J.Immunol.Methods248(1-2):7-15)，以使用Fc的CH3结构域中的一组“隆突入穴”突变而产生Fc异二聚体。这些突变导致结构保守的疏水核内CH3结构域界面之间的残基堆积互补性的改变，从而形成异二聚体与同二聚体相比是有利的，从而实现来自哺乳动物细胞培养物的良好异二聚体表达。虽然该策略导致异二聚体产率更高，但同二聚体并未完全受到抑制(Merchant等人，1998,Nat.Biotechnol.16(7):677-81)。
为了提高结合蛋白的产率，在一些实施方案中，可以通过“隆突入穴”技术来改变CH3结构域，该技术在若干实例中有详细描述，例如国际公开号WO 96/027011,Ridgway等人，1996,Protein Eng.9:617-21；和Merchant等人，1998,Nat.Biotechnol.16:677-81。具体地说，改变两个CH3结构域的相互作用表面，从而增加包含这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域的每一个都可以是“隆突”，而另一个是“穴”。二硫桥的引入进一步稳定了异二聚体(Merchant等人，1998；Atwell等人，1997,J.Mol.Biol.270:26-35)并且增加了产率。在特定实施方案中，隆突位于一条多肽链的CH3结构域上。在其他实施方案中，隆突位于具有交叉定向的第一对多肽上。仍然在其他实施方案中，CH3结构域不包含在穴中的隆突。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含在一条多肽链上的“隆突”突变和在另一条多肽链上的“穴”突变。在一些实施方案中，“隆突”突变包含在对应于根据EU索引的人IgG1的位置354和366的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是S354C和T366W。在一些实施方案中，“穴”突变包含在对应于根据EU索引的人IgG1的位置349、366、368和407的位置处的取代。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个改善血清半衰期的突变(参见例如，Hinton,P.R.等人，(2006)J.Immunol.176(1):346-56)。在一些实施方案中，所述突变包含在对应于根据EU索引的人IgG1的位置428和434的位置处的取代，其中氨基酸取代是M428L和N434S。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白包含隆突和穴突变以及一个或多个改善血清半衰期的突变。
考虑在本文中使用的另一种双特异性结合蛋白平台是在WO2011131746中描述的异二聚体的二价抗体含Fc的形式。本文所述的任何抗原结合位点可以在这种异二聚体的双特异性形式中组合。在一些实施方案中，本公开的多特异性(例如，双特异性)结合蛋白包含：包含第一重链可变(VH)结构域和包含第一CH3区的免疫球蛋白的第一Fc区的第一抗体重链，和包含第一轻链可变(VL)结构域的第一抗体轻链，其中所述第一VH和VL结构域形成结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一抗原结合结构域，以及包含第二重链可变(VH)结构域和包含第二CH3区的免疫球蛋白的第二Fc区的第二抗体重链，和包含第二轻链可变(VL)结构域的第二抗体轻链，其中所述第二VH和VL结构域形成结合层粘连蛋白-2的第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚相互作用比所述第一和第二CH3区各自的同二聚相互作用更强。在一些实施方案中，第一同二聚体蛋白在409位具有除了Lys、Leu或Met以外的氨基酸，第二同二聚体蛋白在选自366、368、370、399、405和407的位置处具有氨基酸取代，和/或所述第一和第二CH3区的序列使得CH3区各自的同二聚相互作用的解离常数在0.01和10微摩尔之间。在一些实施方案中，第一抗体重链包含序列SEQ ID NO:518，第二抗体重链包含序列SEQ ID NO:519，第一抗体轻链包含序列SEQ ID NO:520，并且第二抗体轻链包含序列SEQID NO:521。在一些实施方案中，结合蛋白包含针对表I3中的AS30_Hu6xC3_Hu10双体(duobody)显示的两条抗体轻链和两条抗体重链。
考虑在本文中使用的另一种双特异性结合蛋白平台是“DuetMab”设计(Mazor, Y.等人，(2015) MAbs 7:377-389)。简言之，将上述“隆突入穴”方法与用工程改造的二硫键替代CH1-CL界面之一中的天然二硫键相结合，以提高同源重链和轻链配对的效率。在一些实施方案中，根据Kabat编号，一个结合结构域的重链具有F126C突变，并且该结合结构域的同源轻链具有S121C突变。例如，在一些实施方案中，本公开的多特异性(例如，双特异性)结合蛋白包含包含序列SEQ ID NO:524的第一抗体重链，包含序列SEQ ID NO:525的第二抗体重链，包含序列SEQ ID NO:526的第一抗体轻链，和包含序列SEQ ID NO:527的第二抗体轻链。在一些实施方案中，结合蛋白包含针对表I3中的AS30_Hu6xC21_Hu11 duetmab显示的两条抗体轻链和两条抗体重链。
Gunasekaran等人探索了在通过改变在CH3结构域界面处的电荷互补性来驱动Fc异二聚体的形成的同时保持疏水核心完整性的可行性(Gunasekaran等人，2010, J. Biol.Chem. 285(25):19637-46)。利用静电转向机制，通过两对周边定位的带电残基的突变，这些构建体显示有效促进了具有最低同二聚体污染的Fc异二聚体形成。与隆突入穴设计相反，同二聚体由于静电排斥机制的性质而受到均匀抑制，但未完全避免。
Davis等人描述了通过使人IgG和IgA CH3结构域的β链段互相交叉而将Fc同二聚体转变成异二聚体的抗体工程方法，其中无需引入额外的链间二硫键(Davis等人，2010,Protein Eng.Des.Sel.23(4):195-202)。藉由哺乳动物细胞表达SEEDbody(Sb)融合蛋白以高产率产生了Sb异二聚体，所述异二聚体易于被纯化而消除次要副产物。
美国专利申请公开号US2010/331527A1描述了基于CH3结构域的异二聚化的双特异性抗体，在一条重链中在CH3结构域内引入了突变H95R和Y96F。这些氨基酸取代来源于IgG3亚型的CH3结构域，并将与IgG1主链异二聚化。易于与每条重链配对的共同轻链是基于通过CH3结构域进行异二聚化的所有形式的先决条件。因此总共产生了三种类型的抗体：50％具有纯IgG1主链，三分之一具有纯H95R和Y96F突变的主链，以及三分之一具有两种不同的重链(双特异性)。期望的异二聚体可以从这种混合物中纯化出来，因为它与蛋白A的结合特性与亲本抗体不同：IgG3衍生的CH3结构域不与蛋白A结合，而IgG1与蛋白A结合。因此，异二聚体与蛋白A结合，但相比于纯IgG1同二聚体在更高的pH下洗脱，这使得选择性地纯化双特异性异二聚体是可能的。
美国专利号7,612,181描述了一种双重可变结构域IgG(DVD-IgG)双特异性抗体，其以美国专利号5,989,830中描述的双重Fv形式为基础。在美国专利申请公开号US2010/0226923A1中也描述了类似的双特异性形式。将恒定结构域添加至双重Fv的对应链(CH1-Fc添加至重链，并且κ或λ恒定结构域添加至轻链)产生功能性双特异性抗体，无需任何另外的修饰(即，显而易见地，添加恒定结构域来增强稳定性)。以DVD-Ig/TBTI形式表达的一些抗体显示出对第二(或最里面的)抗原结合位置(Fv2)的位置效应。取决于被Fv2位置识别的抗原的序列和性质，这种抗体结构域对其抗原显示出降低的亲和力(即，与亲本抗体相比，结合率(on-rate)丧失)。该观察结果的一种可能的解释是，VL1和VL2之间的接头突入到Fv2的CDR区中，使得Fv2对较大的抗原有点不可接近。
在美国专利号5,989,830中描述的双特异性抗体片段的第二种构型为交叉双头(CODH)，其在两条链上表现的可变结构域具有以下方向：
对于轻链的VL1-接头-VL2，和
对于重链的VH2-接头-VH1。
CDR、VH和VL结构域序列
下文描述的是可以任何数量、组合或构型用于本公开的任何多特异性或双特异性结合蛋白中的示例性CDR、VH结构域和VL结构域序列。
在本文所述的任何形式的一些实施方案中，本公开的VH1/VL1结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且本公开的VH2/VL2结合对结合层粘连蛋白-2。
在一些实施方案中，VH1结构域包含包含选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:9-17的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:18-27的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL1结构域包含包含选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38-42的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:43-50的氨基酸序列的CDR-L3。在本文所述的任何形式的一些实施方案中，VH1结构域包含选自SEQ IDNO:170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL1结构域包含选自SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187和 189的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH1结构域由选自SEQ ID NO:230、232、234、236、238、240、242、244、246和248的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL1结构域由选自SEQ ID NO:231、233、235、237、239、241、243、245、247和249的核酸序列编码。
在本文所述的任何形式的一些实施方案中，本公开的VH1/VL1结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且本公开的VH2/VL2结合对结合层粘连蛋白-2(例如，层粘连蛋白G样(LG)结构域5或LG-5)。在本文所述的任何形式的一些实施方案中，VH2结构域包含包含选自SEQ ID NO:51-55的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:56-60的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:61-65的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL2结构域包含包含选自SEQ ID NO:66-70的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:71-75的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:76-80的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH2结构域包含选自SEQ ID NO:190、192、194、196和198的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL2结构域包含选自SEQ ID NO:191、193、195、197和199的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域由选自SEQ ID NO:250、252、254、256和258的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL2结构域由选自SEQ ID NO:251、253、255、257和259的核酸序列编码。
在本文所述的任何形式的一些实施方案中，本公开的VH1/VL1结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且本公开的VH2/VL2结合对结合层粘连蛋白-2(例如，层粘连蛋白G样(LG)结构域4和/或5，或LG-4/5)。在本文所述的任何形式的一些实施方案中，VH2结构域包含包含选自SEQ ID NO:81-95的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:96-110的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:111-125的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL2结构域包含包含选自SEQ ID NO:126-140的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:141-154的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:155-169的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH2结构域包含选自SEQ ID NO:200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL2结构域包含选自SEQ ID NO:201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域由选自SEQ ID NO:260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL2结构域由选自SEQ ID NO:261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289的核酸序列编码。
在本文所述的任何形式的一些实施方案中，本公开的VH2/VL2结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且本公开的VH1/VL1结合对结合层粘连蛋白-2。在本文所述的任何形式的一些实施方案中，VH2结构域包含包含选自SEQ ID NO:1-8的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:9-17的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:18-27的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL2结构域包含包含选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38-42的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:43-50的氨基酸序列的CDR-L3。在本文所述的任何形式的一些实施方案中，VH2结构域包含选自SEQ IDNO:170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL2结构域包含选自SEQID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域由选自SEQ ID NO:230、232、234、236、238、240、242、244、246和248的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL2结构域由选自SEQ ID NO:231、233、235、237、239、241、243、245、247和249的核酸序列编码。
在本文所述的任何形式的一些实施方案中，本公开的VH2/VL2结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且本公开的VH1/VL1结合对结合层粘连蛋白-2(例如，层粘连蛋白G样(LG)结构域5或LG-5)。在本文所述的任何形式的一些实施方案中，VH2结构域包含包含选自SEQ ID NO:51-55的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:56-60的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:61-65的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL2结构域包含包含选自SEQ ID NO:66-70的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:71-75的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:76-80的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH2结构域包含选自SEQ ID NO:190、192、194、196和198的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL2结构域包含选自SEQ ID NO:191、193、195、197和199的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域由选自SEQ ID NO:250、252、254、256和258的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL2结构域由选自SEQ ID NO:251、253、255、257和259的核酸序列编码。
在本文所述的任何形式的一些实施方案中，本公开的VH2/VL2结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且本公开的VH1/VL1结合对结合层粘连蛋白-2(例如，层粘连蛋白G样(LG)结构域4和/或5或LG-4/5)。在本文所述的任何形式的一些实施方案中，VH2结构域包含包含选自SEQ ID NO:81-95的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:96-110的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:111-125的氨基酸序列的CDR-H3；和/或其中VL2结构域包含包含选自SEQ ID NO:126-140的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:141-154的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:155-169的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH2结构域包含选自SEQ ID NO:200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的氨基酸序列。在一些实施方案中，VL2结构域包含选自SEQ ID NO:201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的氨基酸序列。在一些实施方案中，VH2结构域由选自SEQ ID NO:260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286和288的核酸序列编码。在一些实施方案中，VL2结构域由选自SEQ ID NO:261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287和289的核酸序列编码。
适用于本公开的结合蛋白的示例性CDR序列提供在以下表A-C中。适用于本公开的结合蛋白的示例性VH和VL序列(多肽和核酸)提供在以下表D-I中。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的结合结构域，其中所述结合结构域包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域包含以下表A中所示的抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR序列，所述VL结构域包含以下表A中所示抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含结合层粘连蛋白-2的结合结构域，其中所述结合结构域包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域包含以下表B或表C中所示抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR序列，所述VL结构域包含以下表B或表C中所示抗体的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或6个CDR序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的结合结构域，其中所述结合结构域包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域包含与以下表D中所示的VH序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列，所述VL结构域包含与以下表D中所示的VL序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含结合层粘连蛋白-2的结合结构域，其中所述结合结构域包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域包含与以下表E或表F中所示的VH序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列，所述VL结构域包含与以下表E或表F中所示的VL序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的结合结构域，其中所述结合结构域包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域包含与由以下表G中所示的多核苷酸序列编码的VH序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列，所述VL结构域包含与由以下表G中所示的多核苷酸序列编码的VL序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含结合层粘连蛋白-2的结合结构域，其中所述结合结构域包含VH结构域和/或VL结构域，所述VH结构域包含与由以下表H或表I中所示的多核苷酸序列编码的VH序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列，所述VL结构域包含与由以下表H或表I中所示的多核苷酸序列编码的VL序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:9的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:18的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:28的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:170具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:171具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:230编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:231编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:10的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:19的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:29的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:43的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:172具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:173具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:232编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:233编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:2的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:11的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:20的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:30的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:39的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:44的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:174具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:175具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:234编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:235编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:12的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:21的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:31的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:45的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:176具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:177具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:236编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:237编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:22的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:32的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:178具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:179具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:238编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:239编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:4的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:13的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:23的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:33的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:41的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:46的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:180具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:181具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:240编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:241编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:14的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:24的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:34的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:42的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:47的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:182具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:183具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:242编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:243编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:6的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:15的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:25的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:35的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:48的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:184具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:185具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:244编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:245编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:7的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:16的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:26的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:36的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:49的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:186具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:187具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:246编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:247编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:8的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:17的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:27的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:37的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:40的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:50的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:188具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:189具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:248编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:249编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:51的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ IDNO:56的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:61的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:66的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:71的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:76的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:190具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:191具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ ID NO:250编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:251编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:52的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:57的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:62的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:67的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:72的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:77的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:192具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:193具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ IDNO:252编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:253编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:53的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:58的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:63的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:68的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:73的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:78的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:194具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:195具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ IDNO:254编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:255编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:54的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:59的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:64的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:69的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:74的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:79的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:196具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:197具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ IDNO:256编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:257编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:55的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:60的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:65的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:70的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:75的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:80的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:198具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:199具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ IDNO:258编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:259编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:81的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:96的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:111的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:126的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:141的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:155的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:200具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:201具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:260编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:261编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:82的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:97的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:112的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:127的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:142的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:156的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:202具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:203具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:262编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:263编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:83的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:98的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:113的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:128的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:143的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:157的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:204具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:205具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:264编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:265编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:84的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:99的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:114的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:129的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:144的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:158的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:206具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:207具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:266编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:267编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:85的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:100的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:115的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:130的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:145的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:159的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:208具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQID NO:209具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ IDNO:268编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:269编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:86的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:101的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:116的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:131的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:146的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:160的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:210具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:211具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:270编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:271编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:87的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:102的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:117的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:132的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:147的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:161的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:212具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:213具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:272编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:273编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:88的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:103的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:118的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:133的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:148的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:162的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:214具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:215具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:274编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:275编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:89的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:104的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:119的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:134的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:149的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:163的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:216具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:217具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:276编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:277编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:90的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:105的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:120的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:135的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:150的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:164的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:218具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:219具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:278编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:279编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:91的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:106的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:121的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:136的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:151的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:165的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:220具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:221具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:280编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:281编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:92的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:107的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:122的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:137的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:152的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:166的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:222具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:223具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:282编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:283编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:93的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:108的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:123的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:138的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:153的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:167的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:224具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:225具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:284编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:285编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:94的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:109的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:124的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:139的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:38的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:168的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:226具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:227具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQ IDNO:286编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:287编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含(a)VH结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:95的CDR-H1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:110的CDR-H2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:125的CDR-H3；和/或(b)VL结构域，其包含(i)包含氨基酸序列SEQ ID NO:140的CDR-L1、(ii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:154的CDR-L2和(iii)包含氨基酸序列SEQ ID NO:169的CDR-L3。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与氨基酸序列SEQ ID NO:228具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与氨基酸序列SEQ ID NO:229具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。在一些实施方案中，本公开的双特异性结合蛋白包含与由多核苷酸序列SEQID NO:288编码的VH结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VH结构域序列和/或与由多核苷酸序列SEQ ID NO:289编码的VL结构域序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的VL结构域序列。
本领域技术人员将会理解，本文所述的任何抗肌营养不良蛋白聚糖抗体的CDR和/或VH/VL结构域可以以任何组合或构型在双特异性结合蛋白中与本文所述的任何抗层粘连蛋白-2抗体(例如，结合层粘连蛋白-2的LG-4/5和/或LG-5结构域的抗体)的CDR和/或VH/VL结构域组合(例如，具有对肌营养不良蛋白聚糖的细胞外结构域特异的VH1/VL1结合对和对层粘连蛋白-2特异的VH2/VL2结合对，或者具有对肌营养不良蛋白聚糖的细胞外结构域特异的VH2/VL2结合对和对层粘连蛋白-2特异的VH1/VL1结合对)。
本领域技术人员将会理解，本文所述的任何抗肌营养不良蛋白聚糖抗体的CDR和/或VH/VL结构域可以以任何组合或构型在多特异性结合蛋白中与本文所述的任何抗层粘连蛋白-2抗体(例如，结合层粘连蛋白-2的LG-4/5和/或LG-5结构域的抗体)的CDR和/或VH/VL结构域组合。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表A2中所示的或来自表D2、I2、I3或I4中所示的可变结构域或多肽序列的1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个CDR。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表D2、I2、I3或I4中所示的1个、2个、3个、4个、5个或6个可变结构域序列，或由表G2中所示的多核苷酸编码的1个、2个、3个、4个、5个或6个可变结构域序列(例如1个、2个或3个VH/VL结合对，各自包含VH和VL域)。在一些实施方案中，本公开的结合蛋白(例如，多特异性结合蛋白)包含表I4中所示的1个、2个、3个或4个可变结构域框架序列。
表A.抗β-DG VH和VL区的CDR序列。
表A2.人源化抗体的CDR序列
表B.抗LG-5 VH和VL区的CDR序列
表C.抗LG-4/5 VH和VL区的CDR序列
表D.抗β-DG VH和VL区的氨基酸序列
表D2.人源化VH和VL区的氨基酸序列
表E.抗LG-5 VH和VL区的氨基酸序列
表F.抗LG-4/5 VH和VL区的氨基酸序列
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表G.抗β-DG VH和VL区的核酸序列
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表G2.人源化VH和VL区的核酸序列
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表H.抗LG-5 VH和VL区的核酸序列
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表I.抗LG-4/5 VH和VL区的核酸序列
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表I2.人源化的多特异性结合蛋白的氨基酸序列
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表I3.人源化的多特异性结合蛋白的氨基酸序列
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表I4.人源化的多特异性和双特异性结合蛋白的氨基酸和DNA序列
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靶蛋白
本文中提供了包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的结合结构域和结合层粘连蛋白-2的结合结构域的多特异性结合分子(例如，结合蛋白)。术语“结合”和“特异性结合”在本文中可互换使用。在一些实施方案中，“结合”抗原(例如，层粘连蛋白-2或肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分)的结合结构域以小于或等于约1x 10-6M的KD与抗原结合。在一些实施方案中，使用单价抗体或其抗原结合片段中的抗原结合结构域来测定抗原结合结构域与抗原(例如，抗原表位)的结合亲和力(例如，KD)。在一些实施方案中，使用本公开的多特异性形式的抗原结合结构域来测定抗原结合结构域与抗原(例如，抗原表位)的结合亲和力(例如，KD)。
如本文中使用的，肌营养不良蛋白聚糖(DG)是指肌营养不良蛋白相关蛋白，其用作将细胞外基质(ECM，也称为基膜)与肌纤维的F-肌动蛋白相关细胞骨架连接的肌营养不良蛋白复合物的组分。肌营养不良蛋白聚糖包含两个亚基：α肌营养不良蛋白聚糖和β肌营养不良蛋白聚糖，它们在翻译后被切割并且彼此非共价结合。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白聚糖是人肌营养不良蛋白聚糖(例如由NCBI Ref.Seq.Gene ID No.1605中列出的人DAG1基因编码的蛋白质，或与UniProt Entry Q14118对应的蛋白质)。在一些实施方案中，肌营养不良蛋白聚糖是小鼠肌营养不良蛋白聚糖(例如由NCBI Ref.Seq.Gene IDNo.13138中列出的小鼠Dag1基因编码的蛋白质，或与UniProt Entry Q62165对应的蛋白质)。
在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合α-肌营养不良蛋白聚糖。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合β-肌营养不良蛋白聚糖。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合包含序列SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKALSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO:290)的多肽。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合序列SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIADENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVA PPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQID NO:290)内的表位或区域。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合包含序列SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIPVVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291)的多肽。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合序列SIVVEWT NNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDFKATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSE APPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO:291)内的表位或区域。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合小鼠肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合人和小鼠肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
在一些实施方案中，本公开的结合结构域以低于约1μM、低于约500nM、低于约400nM、低于约300nM、低于约200nM、低于约100nM、低于约50nM、低于约25nM、低于约10nM或低于约1nM的平衡解离常数(KD)结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，当结合结构域处于双特异性形式而不是作为单特异性结合结构域(如单特异性抗体)时，测量本公开的结合结构域与人肌营养不良蛋白聚糖的胞外部分之间的结合亲和力。在一些实施方案中，当作为多特异性结合蛋白的一部分测定时，本公开的结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的抗原结合位点以低于约1μM、低于约500nM、低于约400nM、低于约300nM、低于约200nM、低于约100nM、低于约50nM、低于约25nM、低于约10nM或低于约1nM的平衡解离常数(KD)结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
如本文中使用的，层粘连蛋白-2(也称为分层蛋白)是指与肌营养不良蛋白聚糖结合的细胞外基底膜蛋白。层粘连蛋白-2由三个亚基组成：α、β和γ。在一些实施方案中，层粘连蛋白-2是人层粘连蛋白亚基α2(例如由NCBI Ref.Seq.Gene ID No.3908中列出的人LAMA2基因编码的蛋白质，或与UniProt Entry P24043对应的蛋白质)。在一些实施方案中，层粘连蛋白-2是小鼠层粘连蛋白亚基α2(例如由NCBI Ref.Seq.Gene ID No.16773中列出的小鼠Lama2基因编码的蛋白质，或与UniProt Entry Q60675对应的蛋白质)。
在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4、层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5或这两者的多肽。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合包含序列/>
的多肽。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合序列/>
内的表位或区域。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合包含序列/>
的多肽。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合序列/>
内的表位或区域。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合包含序列/>/>
的多肽。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合序列/>
内的表位或区域。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合包含序列/>
的多肽。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合序列/>
内的表位或区域。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合小鼠层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，本公开的结合结构域结合人和小鼠层粘连蛋白-2。/>
在一些实施方案中，本公开的结合结构域以低于约1μM、低于约500nM、低于约400nM、低于约300nM、低于约200nM、低于约100nM、低于约50nM、低于约25nM、低于约10nM或低于约1nM的平衡解离常数(KD)结合人层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，当结合结构域处于双特异性形式而不是作为单特异性结合结构域(如单特异性抗体)时，测量本公开的结合结构域与人层粘连蛋白-2之间的结合亲和力。在一些实施方案中，当作为多特异性结合蛋白的一部分测定时，本公开的结合层粘连蛋白-2的抗原结合位点以低于约1μM、低于约500nM、低于约400nM、低于约300nM、低于约200nM、低于约100nM、低于约50nM、低于约25nM、低于约10nM或低于约1nM的平衡解离常数(KD)结合人层粘连蛋白-2。
在一些实施方案中，本公开的VH1/VL1结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且本公开的VH2/VL2结合对结合层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，本公开的VH2/VL2结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且本公开的VH1/VL1结合对结合层粘连蛋白-2。
抗体
本公开还提供了包含表A2、D2或I4中所示结合结构域的1、2、3、4、5或6个CDR序列，或表D2或I4中所示结合结构域的VH和/或VL结构域序列，或由表G2中所示多核苷酸序列编码的抗体(例如，单价和/或单克隆抗体)。在一些实施方案中，抗体结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。在一些实施方案中，抗体结合层粘连蛋白-2。在一些实施方案中，抗体包含(a)包含重链可变结构域(VH)的抗体重链，所述重链可变结构域包含包含选自SEQ IDNO:1-8的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:9-17的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:18-27的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38-42的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:43-50的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO:170、172、174、176、178、180、182、184、186和188的氨基酸序列；并且VL结构域包含选自SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187和189的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含(a)包含重链可变结构域(VH)的抗体重链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:316的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:318的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:320的CDR-H3；和(b)包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:332的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:334的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:336的CDR-L3。在一些实施方案中，VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:314，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:330。在一些实施方案中，VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:346，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:362。在一些实施方案中，抗体包含(a)抗体重链，所述抗体重链包含包含选自SEQ ID NO:51-55和81-95的氨基酸序列的CDR-H1、包含选自SEQ ID NO:56-60和96-110的氨基酸序列的CDR-H2、和包含选自SEQ ID NO:61-65和111-125的氨基酸序列的CDR-H3；和(b)包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述轻链可变结构域包含包含选自SEQ ID NO:66-70和126-140的氨基酸序列的CDR-L1、包含选自SEQ ID NO:38、71-75和141-154的氨基酸序列的CDR-L2、和包含选自SEQ ID NO:76-80和155-169的氨基酸序列的CDR-L3。在一些实施方案中，VH结构域包含选自SEQ ID NO:190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226和228的氨基酸序列；并且VL域包含选自SEQ IDNO: 191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227和229的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包含包含重链可变结构域(VH)的抗体重链和包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3。在一些实施方案中，抗体包含包含重链可变结构域(VH)的抗体重链和包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:380的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:382的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:384的CDR-H3，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:428的CDR-L1、包含序列SEQ IDNO:398的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:400的CDR-L3。在一些实施方案中，抗体包含包含重链可变结构域(VH)的抗体重链和包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:446的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3。在一些实施方案中，抗体包含包含重链可变结构域(VH)的抗体重链和包含轻链可变结构域(VL)的抗体轻链，所述重链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:444的CDR-H1、包含序列SEQ ID NO:478的CDR-H2和包含序列SEQ ID NO:448的CDR-H3，所述轻链可变结构域包含包含序列SEQ ID NO:460的CDR-L1、包含序列SEQ ID NO:462的CDR-L2和包含序列SEQ ID NO:464的CDR-L3。在一些实施方案中，VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:378，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQID NO:394。在一些实施方案中，VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:410，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:426。在一些实施方案中，VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:442，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:458。在一些实施方案中，VH结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:474，并且VL结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:490。
核酸
本文中提供了包含编码本公开的任何多特异性(例如，双特异性)结合分子(例如，双特异性结合蛋白)的核苷酸序列的分离的核酸分子。
使用标准重组DNA方法来构建编码形成结合蛋白的多肽的多核苷酸，将这些多核苷酸整合到重组表达载体中，并将这样的载体引入宿主细胞中。参见例如，Sambrook等人，2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 3rd ed.)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书如本领域通常所完成、或如本文所述来进行。除非提供具体的定义，否则所使用的与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域熟知和常用的那些。类似地，常规技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制、递送和患者的治疗。
本公开的其他方面涉及包含编码本文所述的任何结合蛋白或其多肽链的核苷酸序列的分离的核酸分子。在一些实施方案中，分离的核酸可与异源启动子可操作连接以指导编码结合蛋白的核酸序列的转录。启动子可以指的是指导核酸转录的核酸控制序列。当第一核酸序列置于与第二核酸序列的功能性关系中时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响结合蛋白的编码序列的转录或表达，那么该启动子与该编码序列可操作连接。启动子的实例可以包括但不限于：从病毒(比如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等)的基因组获得的启动子，来自异源真核启动子(比如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子，来自热休克启动子等)，CAG启动子(Niwa等人，Gene 108(2):193-9,1991)，磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，四环素诱导型启动子(Masui等人，NucleicAcids Res.33:e43,2005)，lac系统，trp系统，tac系统，trc系统，λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域，3-磷酸甘油酸激酶启动子，酵母酸性磷酸酶启动子以及酵母α-交配因数启动子。编码本公开内容的结合蛋白的多核苷酸可处于组成型启动子、诱导型启动子、或本文所述的任何其他适合的启动子或本领域技术人员将容易认识到的其他适合的启动子的控制之下。
在一些实施方案中，将分离的核酸并入载体中。在一些实施方案中，载体是表达载体。表达载体可以包括一个或多个与待表达的多核苷酸可操作连接的调控序列。术语“调控序列”包括启动子、增强子、和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。适合的增强子的实例可以包括但不限于来自哺乳动物基因(诸如珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白、胰岛素等)的增强子序列，以及来自真核细胞病毒的增强子序列(比如在复制起点迟侧(lateside)(bp100-270)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点迟侧的多瘤增强子、腺病毒增强子等)。适合的载体的实例可以包括例如质粒、黏粒、附加体、转座子和病毒载体(例如腺病毒、牛痘病毒、辛德毕斯病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒载体等)。表达载体可用于转染宿主细胞，诸如例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。能够在宿主中表达和复制的生物功能性病毒载体和质粒DNA载体是本领域已知的，并且可以用于转染任何感兴趣的细胞。
本文中进一步提供了包含多个载体的载体系统，其中多个载体共同编码本公开的双特异性结合蛋白。例如，在一些实施方案中，载体系统包含编码本公开的双特异性结合分子的第一、第二、第三和第四多肽链的一个或多个载体。在一些实施方案中，载体系统包含本公开的双特异性结合分子的第一、第二、第三和第四多肽链。
宿主细胞和产生结合蛋白的方法
本公开的其他方面涉及包含本文所述的一个或多个分离的多核苷酸、载体和/或载体系统的宿主细胞(例如分离的宿主细胞)。在一些实施方案中，将本公开的分离的宿主细胞在体外培养。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞(例如，酿酒酵母细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是昆虫细胞。昆虫宿主细胞的实例可以包括例如果蝇(Drosophila)细胞(例如，S2细胞)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(例如，High FiveTM细胞)和草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞(例如，Sf21或Sf9细胞)。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。哺乳动物宿主细胞的实例可以包括例如人胚肾细胞(例如，293细胞或亚克隆用于悬浮培养生长的293细胞)、Expi293TM细胞、CHO细胞、幼仓鼠肾细胞(例如，BHK，ATCC CCL10)、小鼠塞尔托利(Sertoli)细胞(例如，TM4细胞)、猴肾细胞(例如，CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如，VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(例如，HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(例如，MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalo rat)肝细胞(例如，BRL3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如，W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(例如，Hep G2,HB 8065)、小鼠乳腺肿瘤细胞(例如，MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞、MRC 5细胞、FS4细胞、人肝细胞瘤系(例如，Hep G2)和骨髓瘤细胞(例如，NS0和Sp2/0细胞)。
本公开的其他方面涉及产生本文所述的任何结合蛋白的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：a)在使得所述宿主细胞表达结合分子的条件下培养包含分离的核酸、载体和/或载体系统(例如，本文所述的分离的核酸、载体和/或载体系统的任一者)的宿主细胞(例如，本文所述的任何宿主细胞)；和b)从所述宿主细胞分离所述结合分子。
在一些实施方案中，可以使用多种宿主细胞产生双特异性结合分子(例如，蛋白质)的组分，然后将所述组分装配成双特异性结合分子。在一些实施方案中，本文中提供了产生双特异性结合蛋白的方法，所述双特异性结合蛋白包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域，所述方法包括：a)在使得宿主细胞表达作为具有第一CH3结构域的第一单特异性结合蛋白的一部分的所述第一多肽链的条件下，培养包含编码包含第一结合结构域的第一多肽链的核酸分子的第一宿主细胞；b)在使得宿主细胞表达作为具有第二CH3结构域的第二单特异性结合蛋白的一部分的第二多肽链的条件下培养包含编码包含第二结合结构域的第二多肽链的核酸分子的第二宿主细胞，；c)从第一宿主细胞分离第一单特异性结合蛋白；d)从第二宿主细胞分离第二单特异性结合蛋白；e)在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下温育分离的第一和第二单特异性结合蛋白；和f)获得双特异性结合蛋白，其中第一和第二CH3结构域是不同的并且使得所述第一和第二CH3结构域之间的异二聚体相互作用比所述第一和第二CH3结构域各自的同二聚体相互作用更强。关于更详细的描述，参见例如，US PG公开号US2013/0039913和Labrijn,A.F.等人，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.110:5145-5150。
在表达蛋白质的条件下培养宿主细胞的方法是本领域普通技术人员熟知的。从培养的宿主细胞中分离蛋白质的方法是本领域普通技术人员熟知的，包括例如亲和色谱法(例如，包括蛋白A亲和色谱随后是尺寸排阻色谱的两步亲和色谱法)。
结合蛋白的用途
本文中进一步提供了用于治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向个体施用本公开的双特异性结合分子。本文中还提供了用于在个体中提供层粘连蛋白-2与肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分之间的连接的方法，所述方法包括向个体施用本公开的双特异性结合分子。本文中进一步提供了在治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病中使用的包含本公开的双特异性结合分子和说明书的套盒。在一些实施方案中，所述个体是人。
本文中进一步提供了用于治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病的方法，所述方法包括向个体施用本公开的多特异性结合分子。本文中还提供了用于在个体中提供层粘连蛋白-2与肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分之间的连接的方法，所述方法包括向个体施用本公开的多特异性结合分子。本文中进一步提供了在治疗或预防个体中的α-肌营养不良蛋白聚糖病中使用的包含本公开的多特异性结合分子和说明书的套盒。在一些实施方案中，所述个体是人。
在一些实施方案中，所述个体具有降低的α-肌营养不良蛋白聚糖表达(例如，与对照个体或缺乏本文所述基因突变的个体中的表达相比)。在一些实施方案中，表达是指在一种或多种组织例如肌肉组织中的表达。
在一些实施方案中，在所述个体中表达的α-肌营养不良蛋白聚糖具有受损或异常的O-糖基化(例如，与对照个体或缺乏本文所述基因突变的个体中的表达相比)。
在一些实施方案中，所述个体患有、已被诊断为α-肌营养不良蛋白聚糖病或具有发生α-肌营养不良蛋白聚糖病的倾向。在一些实施方案中，所述个体具有在选自以下组的基因中的突变：肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-1(POMT1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-2(POMT2)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基1(POMGNT1)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基2(POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶1(LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶2(LARGE2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基1(DPM1)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基2(DPM2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基3(DPM3)、fukutin、fukutin相关蛋白(FKRP)、含类异戊二烯合酶结构域的蛋白(ISPD)、蛋白质O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2(B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基转移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5(TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B(GMPPB)。
在一些实施方案中，藉由静脉输注、肌内注射、腹膜内注射或皮下注射施用本公开的双特异性结合分子。
所述结合蛋白可以在任何已知的测定方法中使用，比如用于检测和定量一种或多种靶抗原的竞争性结合测定、直接和间接夹心测定、以及免疫沉淀测定。所述结合蛋白将以适用于所采用的测定方法的亲和力结合一种或多种靶抗原。
本文中还提供了包含本公开的双特异性结合分子和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。
本文中还提供了包含本公开的多特异性结合分子和任选的药学上可接受的载体的药物组合物。
所述药物组合物可以含有用于改变、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、黏度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。适合的制剂材料包括但不限于氨基酸(比如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(比如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(比如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、增容剂(比如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(比如乙二胺四乙酸(EDTA))、络合剂(比如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单糖、二糖和其他碳水化合物(比如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(比如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味剂和稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(比如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐反荷离子(比如钠)、防腐剂(比如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(比如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(比如甘露醇或山梨糖醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克类；PEG；脱水山梨糖醇酯；聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80；triton；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、稳定性增强剂(比如蔗糖或山梨糖醇)、张度增强剂(比如碱金属卤化物-例如氯化钠或氯化钾-或甘露醇山梨糖醇)、递送载体、稀释剂、赋形剂和/或药物佐剂(参见例如Remington's PharmaceuticalSciences(第18版，A.R.Gennaro编，Mack Publishing Company 1990)及其后续版本，出于任何目的通过提述将其并入本文)。在所采用的剂量和浓度下，可接受的制剂材料对接受者是无毒的。
本领域技术人员将会根据例如预期的给药途径、递送形式和期望剂量来确定最佳药物组合物。这样的组合物可能影响结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
药物组合物中的主要媒介物或载体在性质上可以是水性或非水性的。例如，用于注射的适合的媒介物或载体可以是水、生理盐水溶液或人工脑脊液，其可能补充有用于肠胃外给药的组合物中常见的其他物质。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性媒介物。其他示例性药物组合物包含约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH 4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可进一步包含山梨糖醇或适合的替代物。在本公开的一个实施方案中，可以通过将具有期望纯度的选定组合物与冻干饼或水溶液形式的任选的配制剂混合来制备用于储存的结合蛋白组合物。此外，可以使用适当的赋形剂如蔗糖将结合蛋白配制为冻干物。
配制组分以给药部位可接受的浓度存在。例如，使用缓冲剂将组合物保持在生理pH或稍低的pH下，通常在约5至约8的pH范围内。
当考虑肠胃外给药时，供使用的治疗组合物可以是无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式，其包含在药学上可接受的载体中的期望的结合蛋白。用于肠胃外注射的特别适合的媒介物是无菌蒸馏水，其中结合蛋白被配制为适当保存的无菌等渗溶液。还有另一种制剂可涉及以作用剂配制期望的分子，所述作用剂例如可注射微球、可生物蚀解的颗粒、高分子化合物(比如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠子或脂质体，这些作用剂为产品提供控制释放或持续释放，然后可以通过积存注射来递送产品。也可以使用透明质酸，这可以具有促进持久的回圈持续时间的作用。用于引入期望的分子的其他适合的手段包括可植入药物递送装置。
也考虑到某些制剂可以口服施用。在本公开的一个实施方案中，以这种方式施用的结合蛋白可以配制有(或没有)通常用于调配固体剂型(如片剂和胶囊)的那些载体。例如，胶囊可设计成在胃肠道中的一定位置处释放制剂的活性部分，在所述位置处的生物利用度被最大化并且系统前降解被最小化。可以包括另外的作用剂以促进结合蛋白的吸收。也可以使用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和黏合剂。
另一种药物组合物可以包含有效量的结合蛋白与适合制造片剂的无毒赋形剂的混合物。通过将片剂溶解在无菌水或其他适当的媒介物中，可以以单位剂量形式制备溶液。适合的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，比如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或黏合剂，比如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，比如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
本公开的另外的药物组合物对于本领域技术人员将是显而易见的，包括处于持续或控制递送制剂形式的包含结合蛋白的配方。用于配制各种其他持续或控制递送手段(比如脂质体载体、生物可蚀解的微粒或多孔珠和积存注射剂)的技术也是本领域技术人员已知的。另外的持续释放制剂的实例包括呈成形物品的形式的半透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物还可以包括脂质体，其可以通过本领域已知的几种方法中的任何一种来制备。
用于体内施用的药物组合物通常必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜的过滤来实现。在组合物被冻干的情况下，可以在冻干和复原之前或之后使用这种方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以以冻干形式或溶液形式储存。另外，通常将肠胃外组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
一旦配制了药物组合物，其可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。这种制剂可以以即用形式或以施用前需要复原的形式(例如，冻干)储存。
本公开还包括用于产生单-剂量施用单位的套盒。套盒可以各自容纳具有干燥蛋白质的第一容器和具有含水制剂的第二容器这两者。在本公开范围内还包括容纳单室和多室预填充注射器(例如液体注射器和冻干剂注射器)的套盒。
例如，在治疗上采用的结合蛋白药物组合物的有效量将取决于治疗背景和目标。本领域技术人员将理解，治疗的适当剂量水准因此部分地取决于所递送的分子、正在使用的结合蛋白的适应症、给药途径以及患者的大小(体重、体表或器官大小)和状况(年龄和一般健康状况)而变化。因此，临床医师可以逐步增加剂量并修改给药途径以获得最佳治疗效果。
给药频率将取决于所用制剂中结合蛋白的药代动力学参数。通常，临床医师将施用组合物直至达到实现预期效果的剂量为止。因此，组合物可以作为单剂量施用，随着时间的推移作为两个或更多个剂量(其可以含有或不含相同量的期望的分子)施用，或经由植入装置或导管连续输注。常规地由本领域普通技术人员做出适当剂量的进一步改进，并且这在他们常规进行的任务范围内。通过使用适当的剂量-反应资料可以确定适当的剂量。
实施例
通过参考以下实施例将更充分地理解本公开。然而，它们不应被解释为限制本公开的范围。可以理解的是，在本文中描述的实施例和实施方案仅用于说明的目的，依照它们的各种修改或改变将对本领域技术人员作出暗示并且将被包括在本申请的精神和许可权以及所附权利要求书的范围内。
实施例1：抗β-DG ECD、抗LG-5和抗LG-4/5抗体的鉴定。
方法
蛋白质表达
为了表达鼠β-DG细胞外结构域(mβ-DG ECD)，产生了含有大肠杆菌密码子优化的盒的构建体，所述盒编码N端麦芽糖结合蛋白、TEV切割位点、mβ-DG (UniProt Q62165，氨基酸652-746)和C端HPC4标签，以pET22b作为亲本载体骨架。将构建体转化到化学感受态Origami B(DE3)pLysS细胞(Novagen)中。在37℃进行表达，在OD＝0.6时进行IPTG诱导。使细胞形成片状沉淀并重悬于含有不含EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)的裂解缓冲液中并通过超声裂解。通过如下步骤从澄清的细胞裂解物中纯化mβ-DG-HPC4：在直链淀粉树脂柱(NewEngland Biolabs)上处理细胞裂解物，用Turbo TEV蛋白酶(EtonBiosciences)切割麦芽糖结合蛋白，在直链淀粉树脂和His-Trap FastFlow柱(GE Healthcare)上处理消化物以去除未消化的融合蛋白和切割的麦芽糖结合蛋白，并且在与小鼠抗HPC4抗体偶联的NHS活化的Sepharose 4FastFlow树脂(GE Healthcare)上处理流出物。在Superdex 75尺寸排阻柱(GEHealthcare)上进行进一步纯化，收集和合并具有高度纯化的mβ-DG-HPC4(如通过使级分样品在SDS-PAGE凝胶上流动和考马斯染色测定的)的洗脱级分。
为了表达鼠或人层粘连蛋白G样结构域5(mLG-5或hLG-5)，产生了含有哺乳动物密码子优化的盒的构建体，所述盒编码N端Avi和HPC4标签以及mLG-5(参见UniProt Q60675，氨基酸2932-3118；SEQ ID NO:292)或hLG-5(UniProt P24043，氨基酸2936-3122；SEQ IDNO:293)。将构建体用于使用Expifectamine试剂(Thermo Fisher)转染Expi293F细胞。表达7天后，用与小鼠抗HPC4抗体偶联的NHS活化的Sepharose 4FastFlow树脂(GE Healthcare)从上清液纯化可溶性生物素化蛋白质。
为了表达鼠或人层粘连蛋白G样4和5结构域5(mLG-4/5或hLG-4/5)，产生了含有哺乳动物密码子优化的盒的构建体，所述盒编码N端mIgG2a融合配偶体、TEV切割位点、Avi标签、HPC4标签以及mLG-4/5(参见UniProt Q60675，氨基酸2725-3118；SEQ ID NO:292)或hLG-4/5(UniProt P24043，氨基酸2729-3122；SEQ ID NO:293)。将构建体用于使用Expifectamine试剂(Thermo Fisher)转染Expi293F细胞。表达7天后，用HiTrap MabSelectSuRe柱(GE Healthcare)从上清液中纯化可溶性蛋白。使用Turbo TEV蛋白酶(NacalaiUSA)将mIgG2a从mLG-4/5蛋白切下，在MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare)和Ni-NTA树脂(Qiagen)上处理消化物以从纯化的mLG-4/5中去除mIgG2a和TEV蛋白酶。
噬菌体展示
将纯化的mβ-DG、mLG-5或mLG-4/5和hLG-4/5(例如，在使用小鼠和人肽之间交替)与甲苯磺酰基活化的磁珠(Invitrogen)偶联并用于富集针对mβ-DG、mLG-5或mLG-4/5结合物的噬菌体展示文库。将抗体噬菌体展示文库用于mβ-DG选择，将Dyax FAB 310抗体噬菌体展示文库用于hLG-4/5和mLG-4/5选择。首先使用未包被的珠子和带HPC4-6xHis-Avi标签的无关蛋白质耗尽文库的非特异性结合物。然后对耗尽的文库进行三轮选择，每轮使用递减浓度的抗原(从第1轮的500nM抗原至第3轮的1nM抗原)。将富集的文库接种在平板上，挑取单独的文库克隆并以96孔格式培养，产生针对每个克隆的噬菌体单克隆抗体用于噬菌体ELISA结合测定。
噬菌体ELISA结合测定
将纯化的抗原(mβ-DG、mLG-5、hLG-5、mLG-4/5或hLG-4/5)以1μg/ml包被在NuncMaxiSorp 96-孔ELISA板(Thermo Scientific)上。将来自选定文库克隆的噬菌体单克隆抗体加入到每个孔中，使用抗M13铕标记的二级抗体(GE Healthcare，通过Perkin Elmer定制标记的抗体)检测阳性或阴性结合。
可变区测序
将阳性结合克隆的细菌原液PCR扩增并测序，鉴定出独特的可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列。
结果
鉴定了若干个对β-DG、LG-5和LG-4/5具有特异性结合亲和力的噬菌体文库克隆：10个特异性结合β-DG的克隆和15个特异性结合LG-4/5的克隆。这些克隆的测序显示，每个克隆的重链可变区和轻链可变区是不同的，如上文表D至I所示(参见例如，克隆B04、B06、CL-40968、CL-40992、CL-41136、CL-41400和CL-41500)。在上文表A至C中鉴定了这些克隆的互补决定区(CDR)。
实施例2：靶向β-DG、LG-5和LG-4/5的杂交瘤、单克隆抗体和嵌合抗体的产生。
方法
细胞系生产
通过将含有N端myc标签和β-DG的细胞外和内源跨膜结构域(小鼠UniProtQ62165，氨基酸652-893；人UniProt Q14118，氨基酸654-895)的构建体进行密码子优化，建立具有人或鼠β-DG表面表达的稳定细胞系。使用脂质转染胺试剂(lipofectamine)(ThermoFisher)转染贴壁的人胚肾细胞(HEK)和贴壁的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)，并且用遗传霉素(Gibco)选择细胞。将存活的细胞连续稀释以达到单细胞无性系形成能力，并通过抗myc流式细胞术证实β-DG的表面表达。
通过将含有N端myc标签、Gly/Ser接头、LG-5(小鼠UniProt Q60675，氨基酸2932-3118；人UniProt P24043，氨基酸2936-3122)和用于哺乳动物表达的Tfr1跨膜结构域的构建体进行密码子优化，建立具有人或鼠LG-5表面表达的稳定细胞系。使用脂质转染胺试剂(Thermo Fisher)转染贴壁的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)，并且用遗传霉素(Gibco)选择细胞。将存活的细胞连续稀释以达到单细胞无性系形成能力，并通过抗myc流式细胞术证实β-DG的表面表达。
通过将含有N端myc标签、Gly/Ser接头、LG-4/5(小鼠UniProt Q60675，氨基酸2725-3118；人UniProt P24043，氨基酸2729-3122)和用于哺乳动物表达的Tfr1跨膜结构域的构建体进行密码子优化，建立具有人或鼠LG-4/5表面表达的稳定细胞系。使用脂质转染胺试剂(Thermo Fisher)转染贴壁的人胚肾细胞(HEK)，并且用遗传霉素(Gibco)选择细胞。将存活的细胞连续稀释以达到单细胞无性系形成能力，并通过抗myc流式细胞术证实β-DG的表面表达。
小鼠免疫
用hβ-DG、hLG-5或hLG-4/5免疫Balb/c和Trianni小鼠，然后每两周用这些蛋白质加强3-4次。对于用hLG-4/5免疫的小鼠，另外将小鼠每2周用人分层蛋白加强3次，并且用具有在人和小鼠LG-5之间的相同序列的合成肽(氨基酸序列＝GFAKAVGGFKVGLDLLVEFE；SEQID NO:295)加强一次。
杂交瘤产生
通过将腺苷磷酸核糖基转移酶(APRT)缺陷的小鼠骨髓瘤细胞(来自Balb/c B淋巴母细胞系，SP2/0，与仙台病毒融合)与来自免疫小鼠的脾细胞融合来制备杂交瘤细胞。进行HAT选择(次黄嘌呤、重氮丝氨酸和胸腺嘧啶)和连续稀释以实现单细胞无性系形成能力。
ELISA抗体结合测定
对于ELISA测定，用PBS中的5％胎牛血清阻断在人β-DG或LG-4/5中包被的平板，并将每个孔用不同的培养上清液温育。用PBS洗涤平板，用HRP缀合的抗小鼠Fc二级抗体温育，再次用PBS洗涤，并显色以进行比色测量。
荧光激活细胞分选(FACS)抗体结合测定
对于FACS分析，将具有人或鼠β-DG或LG-4/5表面表达的稳定细胞(见上文)与含有抗体的培养物上清液一起温育，用PBS洗涤，用FITC缀合的抗小鼠Fc二级抗体(ThermoFisher)温育，再次用PBS洗涤，并在流式细胞仪上分析。
表面等离子体共振(Biacore)动力学测定
根据制造商的方案(GE Healthcare)，通过Biacore动力学测定法测量抗体/抗原结合亲和力和结合速率/解离速率，进一步表征杂交瘤抗体(包含在培养上清液中)。用于结合的抗原是人或鼠β-DG或LG-4/5。
单克隆抗体产生
将杂交瘤克隆扩增并接种到具有超低IgG胎牛血清补充物的末端烧瓶中。7天后，收获上清液并使用HiTrap MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)纯化单克隆抗体。通过ELISA、FACS和Biacore动力学测定(GE Healthcare)再次测试所得的抗体以证实抗体的结合特性。
免疫荧光
用未固定的冷冻人和小鼠肌肉组织切片进行免疫荧光染色。用针对β-DG或LG-4/5的纯化抗体将肌肉组织切片染色，洗涤，用荧光标记的抗小鼠IgG二级抗体染色，洗涤，封片，并使用荧光显微镜成像。
可变区测序
使用RNeasy Mini Kit (Qiagen)从产生高亲和力抗体的杂交瘤细胞中分离总RNA，使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)合成第一链cDNA。使用同种型特异性引物通过5'cDNA末端快速扩增(5'-RACE)PCR扩增VH和VL基因区段。将扩增的PCR片段克隆并测序。参见例如，克隆TDG-2、TDI-11、TDI-23、TDI-38、TLF39、TLF86、TLG3/TLG4、TLG26、TLI-3、TLI-7、TTLK71-4-6、TTLK123-3、TTLK145-6-3、TTLK170-2、WJL10和WJL48。
嵌合抗体生产
将从5'-RACE PCR产生的VH和VL序列针对哺乳动物表达进行密码子优化并合成。将VH序列亚克隆到具有人IgG1的哺乳动物表达载体中，并将VL序列亚克隆到具有恒定人κ链的哺乳动物表达载体中。使用Expifectamine试剂(Thermo Fisher)，用这些构建体共转染Expi293F细胞以表达嵌合抗体。表达7天后，用HiTrap MabSelect SuRe柱(GE)从上清液中纯化抗体。通过ELISA、FACS和Biacore (GE Healthcare)重新筛选纯化的抗体以证实对β-DG、LG-5或LG-4/5的结合亲和力。为了证实肌肉组织中与其对应抗原结合的抗体，用未固定的冰冻的人和小鼠肌肉组织切片进行免疫荧光染色。
结果
为了筛选和选择产生对β-DG、LG-5或LG-4/5特异的抗体的杂交瘤，使用ELISA、FACS分析和Biacore动力学测定来评估抗体结合。ELISA测定显示了抗体与β-DG、LG-5或LG-4/5的一系列结合亲和力，其中几个样品产生强比色信号(三种抗体的示例性数据提供在下表J中)。
表J.单克隆抗体抗LG-5结合动力学
nb：没有结合.
对于产生强比色信号的样品，使用FACS测定了抗体与细胞表面上表达β-DG或LG-4/5的细胞的结合亲和力。FACS分析显示，衍生自克隆C21和C3的抗体对鼠和人LG-4/5两者都具有结合亲和力(分别见图3C和3G)。这些抗体不结合缺乏β-DG或LG-4/5表面表达的对照细胞，正如通过不显著的荧光检测所示。
将不同量的重组人层粘连蛋白-2(来自Biolamina)、鼠LG-5、人LG-5、人LG4/5斑点印迹到硝酸纤维素膜上，并用抗层粘连蛋白-2抗体进行探测。结果表明，抗体识别层粘连蛋白-2或其含有LG-5的片段(图3D,顶部为C21)。为了确定抗体特异性，将具有不同α链的不同层粘连蛋白同种型点到印迹上。只有含α-2的mLG-5和人层粘连蛋白-2才被识别，这支持抗体的结合特异性(图3D，底部为C21；图3H为C3)。
抗肌营养不良蛋白聚糖抗体克隆也被表征。动力学显示，所有测试的抗体显示出针对其对应的抗原的高亲和力，其中大多数KD在10-9M范围内(纳摩尔灵敏度)，正如在表K以及图3I和3J(克隆AS30)以及图3M和3N(克隆AS19)中所示。另外，除了具有非常高的结合和解离速率的抗β-DG克隆AS19之外，测试抗体的结合和解离速率对于高亲和力抗体相当具有代表性(表K)。
表K.单克隆抗体抗β-DG结合动力学。
为了将克隆AS30和AS19表征，将不同量的重组小鼠或人β-DG ECD、重组肌营养不良蛋白聚糖(来自R&D Systems)、C2C12细胞裂解物、TA裂解物和作为阴性对照的法布瑞酶点印到硝酸纤维素膜上，并且用抗β-DG抗体进行探测(图3K为AS30；图3O为AS19)。结果表明，所有含β-DG的蛋白质均被检出。对于C2C12或TA裂解物检测不到信号，原因可能在于这些样品中的β-DG量很低。正如预期，抗体也未检出阴性对照法布瑞酶。
利用抗β-DG克隆AS30或AS19，进行在非变性条件下溶解的来自C2C12细胞裂解物的β-DG的免疫沉淀。β-DG/抗体复合物被蛋白A珠捕获并在SDS-PAGE上运行，然后用来自R&DSystems的抗α-DG和抗β-DG再次探测。α-DG和β-DG两者都被免疫沉淀，表明它们溶解后保留在复合物中，并且抗β-DG抗体克隆的结合不干扰α-DG与β-DG的结合(图3L为AS30；图3P为AS19)。
在扩增杂交瘤克隆并且纯化单克隆抗体之后，通过ELISA、FACS和Biacore重新筛选抗体以证实结合亲和力。结果与来自培养物上清液的抗体所产生的结果极为相似，证实扩增后的抗体保留了它们的动力学特征。
为了确定抗体是否能够与含有丰富的β-DG和LG-4/5的肌肉组织结合，使用纯化抗体对小鼠和人肌肉组织进行免疫荧光染色。使用未固定的组织以保持天然抗原构象。清楚地证明了对于人和小鼠组织的特征性的肌膜染色，表明针对C21(图4A)和C3(图4B)的特异性LG-4/5结合以及针对AS30(图4C)和AS19(图4D)的特异性β-DG结合。仅用二级抗体染色的切片没有显示任何荧光信号。
实施例3：识别β-DG和层粘连蛋白-2α亚基的LG-4/5结构域的双特异性抗体的产生
方法
四价双特异性串联Ig(TBTI)抗体的产生
将获自产生的杂交瘤细胞的VH和VL序列针对哺乳动物表达进行密码子优化和合成(Genscript)。为了产生表达轻链的构建体，将一个对β-DG特异的VL序列、(G4S)2接头、一个对LG-4/5特异的VL序列、和人κ链(Genbank Q502W4)或鼠κ链(Genbank BAB33404)融合在一起并克隆到瞬时附加型表达载体pXL中，所述表达载体为由Durocher等人(Nucl.AcidsRes.2002,30(2),E9)描述的pTT载体的类似物。为了产生表达重链的构建体，将一个对β-DG特异的VH序列、(G4S)2接头、一个对LG-4/5特异的VH序列和人IgG1 (Genbank Q569F4)或鼠IgG1(GenBank AAA75163.1)融合在一起(图4A)并克隆到表达载体pXL中。针对LG-4/5-特异性结合所使用的VH和VL序列获自克隆AN01、C3和C21，并且针对β-DG特异性结合的VH和VL序列获自克隆B6、AS19和AS30。
将这些构建体共转染到HEK293 FreeStyle 293-F或Expi293细胞(ThermoFisher)中。表达7天后，用HiTrap MabSelectTM SuReTM蛋白A柱(GE Healthcare)从上清液中纯化抗体。
交叉双重可变结构域Ig(CODVIg)抗体的产生
将获自产生的杂交瘤细胞的VH和VL序列针对哺乳动物表达进行密码子优化和合成(Genscript)。为了产生表达轻链的构建体，将一个对LG-4/5特异的VL序列、L1接头、一个对β-DG特异的VL序列、L2接头和人κ链(Genbank Q502W4)或鼠κ链(Genbank BAB33404)融合在一起并克隆到表达载体pXL中。为了产生表达重链的构建体，将一个对β-DG特异的VH序列、L3接头、一个对LG-4/5特异的VH序列、L4接头和人IgG1 (Genbank Q569F4)或鼠IgG1(GenBank AAA75163.1)融合在一起并克隆到表达载体pXL中。所使用的接头序列的具体组合提供在下文。
将这些构建体共转染到HEK293 FreeStyle 293-F或Expi293细胞(ThermoFisher)中。表达7天后，用HiTrap MabSelectTM SuReTM蛋白A柱(GE Healthcare)从上清液中纯化抗体。
连续Biacore结合分析
将亲本单克隆抗体(AS19、C3和C21)和三种双特异性抗体(TBTI中的AS19x C3和AS30x C3以及CODVIg中的的AS30x C3)各自固定到单独的CM5系列S Biacore芯片(GEHealthcare)上。使人或鼠LG-4/5，随后依次为人或鼠β-DG流过每个芯片，然后评估结合。
双层夹心ELISA
将96孔板用50ng人LG-4/5包被并用PBS中的5％胎牛血清封闭。将每个孔用1μg所产生的双特异性抗体(鼠IgG主链)温育。2小时后，将孔用PBS洗涤并用每孔16ng至1μg的与人hIgG1Fc抗体区(hβ-DG-hFc)融合的人β-DG再次温育。2小时后，将孔用PBS洗涤，用HRP缀合的抗hFc二级抗体温育45分钟，再次用PBS洗涤，并显色以进行比色测量。
结果
如上所述，将抗体工程改造为多种双特异性形式，包括四价双特异性串联IgG形式(TBTI；图5A)以及交叉双重可变结构域IgG形式(CODVIg；图5B)。为了产生这些形式，合成了针对每种构建体的轻链和重链质粒。一个构建体具有来自列举的单克隆序列的抗βDG的轻链可变区，接着是接头，然后是来自抗LG4/5单克隆抗体的轻链可变区，接着是另一个接头，然后是轻链恒定结构域。使用相同的原理来开发重链质粒，然后为了表达，将它们共转染到哺乳动物细胞中。尝试了多个接头组合，并且测试了两个可变区取向(即，使抗LG4/5远离恒定区而不是抗βDG可变区，反之亦然)。
以TBTI或CODVIg形式产生识别β-DG(使用克隆B06、AS19和AS30)和LG-4/5(使用克隆AN01、C3和C21)的双特异性抗体(biAb)。
尝试了多个接头组合，并且测试了两个可变区取向(即，使抗LG4/5远离恒定区而不是抗βDG可变区，反之亦然)。对于TBTI，(T1T2和T5T6)，在轻链可变区之间的接头的组成为甘氨酸或丝氨酸的10个残基(例如，GGGGSGGGGS；SEQ ID NO:294)，而在第二可变区与恒定区之间不使用接头。在重链可变区之间使用相同的接头(甘氨酸或丝氨酸的10个残基)，而在第二重链可变区与恒定区之间不使用接头。对于CODVIg形式，使用两组接头长度：10-10-0-0和7-5-1-2(针对L1-L2-L3-L4的残基编号)。CODVIg C5C6接头的组成为轻链可变区之间的为甘氨酸或丝氨酸的10个残基以及第二可变区与轻链恒定区之间的为甘氨酸或丝氨酸的10个残基。在重链上没有使用接头。这些组合的接头序列如下(描述为L1、L2、L3、L4)：GQPKAAP (SEQ ID NO:297)、TKGPS (SEQ ID NO:298)、S、RT；GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299)、GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:299)、0、0；和EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296)、GG、EPKSDKTHTSPPSP (SEQ ID NO:296)、GG。建立的双特异性抗体的清单提供在以下表L中。
表L。测试的CODV和TBTI双特异性抗体构型。
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为了证实biAb能够同时结合LG-4/5和β-DG，进行连续Biacore分析(GEHealthcare)和双层夹心ELISA测定。
将针对LG-4/5或β-DG的亲本mAb和抗LG4/5和β-DG的biAb捕获到biacore芯片上，然后依次与人LG4/5和人β-DG一起流动以确定它们与两种抗原的同时结合。连续Biacore分析显示，双特异性抗体可以首先结合人LG-4/5(第一峰，图6A)或鼠LG-4/5(第一峰，图6B)，然后进一步与人β-DG(第二峰，图6A)或鼠β-DG(第二峰，图6B)结合。相反，亲本单克隆抗体仅能结合一个靶标，即LG-4/5(图6A和6B中的C3和C21)或β-DG(图6A和6B中的AS19)。
双层夹心ELISA显示，双特异性抗体可以同时结合hLG-4/5和hβ-DG。在测定中只有当加入hLG-4/5和hβ-DG-hFc这两者时才能检测到比色信号(图7)。当使用亲本单克隆抗体或当省去hβ-DG-hFc时，没有检测到信号。三种双特异性抗体(biAb)：T1T2、T5T6和C5C6具有预期的信号，表明与两种靶标的同时结合。在第二步中不含β-DG-hFc的亲本抗LG4/5或抗β-DG mAb或biAb在该测定中均为阴性。
实施例4：LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的双特异性抗体肌内注射.
方法
LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠模型
来自Jackson实验室的LARGEmyd-3J/GrsrJ(货号008581)小鼠是由LARGE基因突变引起的α-肌营养不良蛋白聚糖病的小鼠模型。LARGE基因的突变定位在D8Mit65和DMit249之间，其标志物分别在44.4Mb和83.8Mb；LARGE基因位于75.7Mb处。LARGE纯合小鼠通常在2-3个月龄时开始出现肌肉退化的证据，不过一些动物可能早在断奶期就表达出症状。在通过尾巴提起时不能向外展开后肢为初始表型，并且这会随着年龄的增长而进展，包括步态摇摆，然后是拖动后肢。
双特异性抗体注射
在一组10只LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的左侧和右侧胫骨前肌(TA)肌肉中给予肌内注射。左侧TA接受两次注射，每次注射50μl盐水中的0.7μg/μl的biAb(T1T2；鼠Fc骨架)。右侧TA接受两次对照注射，每次注射50μl盐水中的0.7μg/μl的亲本AS19和C3抗体的1:1重量的混合物。两次注射相隔3天。
运动诱发的组织损伤
最后一次肌内注射后一天，所有小鼠接受10mg/ml的伊文思蓝染料(EBD)腹膜内注射(IP)，每10g体重给予50μl。在EBD的IP后一天，所有小鼠通过强制性跑步机运动直到疲惫为止。按照标准IACUC方案用CO2使动物安乐死。
组织制备和免疫荧光染色
安乐死之后，将TA肌肉移除，切割，并置于最佳切割温度化合物中。然后通过2-甲基丁烷干冰浴使组织快速冷冻。将组织在低温恒温器中冷冻切片为10微米厚度。将四个不同的层次以100微米的间隔从TA切下(一式三份)。
将载玻片切片迅速浸入冷PBS中，并在冰冷的丙酮中固定15分钟。将载玻片洗涤并在4℃过夜封闭(PBS中的2％BSA和1％正常山羊血清)过夜。第二天，将载玻片与1:100稀释的抗mIgG Alexa Fluor 488 (Invitrogen)温育2小时(室温)。洗涤载玻片并使用具有DAPI(Vector Labs)的Vectashield封片剂加以封固。利用适当的滤光片组用倒置显微镜(Olympus IX71)观察载玻片。
伊文思蓝染料(EBD)肌纤维损伤评估
除了没有免疫荧光染色之外，如上处理组织切片。对左侧TA(biAb IM)和右侧TA(单克隆亲本抗体IM)手动计数每个切片上的所有EBD阳性纤维。
结果
为了确定biAb是否能够结合小鼠肌肉组织中的天然抗原，将野生型或LARGEmyd -3J/GrsrJ小鼠(其为α-肌营养不良蛋白聚糖病的鼠模型)的未固定的冷冻切片用biAb(T1T2、T5T6、C5C6)或亲本mAb染色。结果表明，biAb也能够结合野生型(图8A)和LARGEmyd-3J/GrsrJ(图8B)小鼠肌肉组织切片二者中的单特异性亲本mAb。
然后将双特异性抗体肌内施用于野生型或LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠(研究概要显示在图8C中)。为了评估双特异性抗体对运动诱导的组织损伤的影响，对来自运动小鼠的组织进行免疫荧光和伊文思蓝染料肌纤维染色。免疫荧光显示，双特异性抗体与小鼠肌肉组织(左或右胫骨前肌(TA)肌肉)结合良好并且在最后一次抗体注射后2天可检测到(图8E)。与右对侧对照TA相比，biAb治疗的左侧TA具有显著更少的EBD阳性纤维(图8D)。伊文思蓝染料穿透许多用亲本抗体混合物治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠组织的肌纤维，表明了运动诱发的损伤，因为染料仅穿透具有膜损伤的肌纤维并使其染色(图8E)。相比之下，伊文思蓝染料穿透显著更少的用双特异性抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠组织的肌纤维(图8E)。这表明在α-肌营养不良蛋白聚糖病的体内哺乳动物模型中，局部注射双特异性抗体而非亲本单克隆抗体保护了肌肉免于运动诱发的损伤。
实施例5：LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的双特异性抗体全身性递送.
方法
抗体递送
为了运动诱发的组织损伤测试，将四个不同组的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠通过侧尾静脉(IV)或腹膜内(IP)注射单剂量的亲本或双特异性抗体(具有鼠Fc区)。每组接受下列之一：亲本抗LG-4/5(克隆C3，IV)、亲本抗β-DG(克隆AS19，IV)、biAb(AS19x C3，IV)和biAb(AS19x C3，IP)。注射后一天，所有小鼠接受10mg/ml的伊文思蓝染料(EBD)腹膜内注射(IP)，每10g体重给予50μl。
为了行为测试、肌酸激酶测量和生物分布免疫荧光实验，在治疗前将LARGEmyd -3J/GrsrJ小鼠(11-19周龄)随机分为两组(n＝16)。一组小鼠以30mgbiAb(T1T2)/kg小鼠每周两次给药7周。第二组小鼠以亲本单克隆抗体混合物(AS19和C3，各自15mg抗体/kg小鼠)每周两次给药7周。为了预防过敏反应，在施用抗体前10分钟腹膜内预先给予5mg/kg的苯海拉明。用盐水治疗的野生型小鼠用作对照。
运动诱发的组织损伤
在腹膜内注射EBD后1天，所有小鼠通过强制性跑步机运动直到疲惫为止。按照标准IACUC方案用CO2使动物安乐死。
行为测试和肌酸激酶测量
为了握力测试，在测试前使小鼠适应测试室10分钟。将握力计(ColumbiaInstruments,Columbus,OH)水准安装在稳定的表面上。将测试鼠轻轻地放在网格的顶部，使其前爪和后爪能够紧握在网格上。然后通过动物的尾部将其轻轻向后拉，直到抓握被释放时为止。在应变计上记录在释放点产生的力的量值(克)。该程式对每只动物进行3次，然后将握力值计算为三次测试的平均值。
为了金属丝悬挂测试，将每只动物放在金属丝网上，轻轻地左右移动直到动物抓住金属丝时为止。然后将金属丝网提升到缓冲垫上方约2英尺并翻转。记录动物从金属丝网上掉落到缓冲垫上的时间(延迟时间)，最大截止时间为60秒。每只动物测试两次，其中在两次测试之间的休息时间为至少5分钟。
在研究开始时(在双特异性抗体治疗之前)和研究结束时(在双特异性抗体治疗7周后在跑步机运动后1小时)通过标准比色测定测量肌酸激酶(CK)水准。
组织制备和免疫荧光染色
为了检测靶器官中的双特异性抗体，在最后一次双特异性抗体肌内注射后4天使动物安乐死。将TA肌肉移除，切割，并置于最佳切割温度化合物中。然后通过2-甲基丁烷干冰浴使组织快速冷冻。将组织在低温恒温器中冷冻切片为10微米厚度。
对于运动诱发的组织损伤样品，在运动后将TA肌肉移除，切割，并置于最佳切割温度化合物中。然后通过2-甲基丁烷干冰浴使组织快速冷冻。将组织在低温恒温器中冷冻切片为10微米厚度。将四个不同的层次以100微米的间隔从TA切下(一式三份)。
对于两套盒织样品，将载玻片洗涤并在4℃过夜封闭(PBS中的2％BSA和1％正常山羊血清)过夜。第二天，将载玻片与1:100稀释的抗mIgG Alexa Fluor488(Invitrogen)温育2小时(室温)。洗涤载玻片并使用具有DAPI (Vector Labs)的Vectashield封片剂加以封固。利用适当的滤光片组用倒置显微镜(Olympus IX71)观察载玻片。
伊文思蓝染料(EBD)肌纤维损伤评估
除了没有免疫荧光染色之外，如上处理组织切片。对左侧TA(biAb IM)和右侧TA(单克隆亲本抗体IM)手动计数每个切片上的所有EBD阳性纤维。
结果
将30mg/kg的biAb(T1T2)和作为对照的亲本抗体给予LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠，通过尾静脉注射(IV)或腹膜内(IP)注射进行比较。在给药后24、48、72和96小时通过眼球放血收集血液样品，并通过用β-DG(图8F)或LG4/5(未显示)包被的ELISA测量抗体水准。biAb具有相似的亲本mAb清除率。biAb的IP给药导致高浓度，但其总体药代动力学类似于IV给药。正如预期，当使用β-DG用于包被时，抗LG4/5亲本mAb无信号。
接着将双特异性抗体静脉内给予野生型或LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠。行为测试显示，在作为肌肉功能量度的握力测试和金属丝悬挂测试(图9A和9B)方面，施用双特异性抗体的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠比用单克隆亲本抗体治疗的小鼠表现得更好(图9A和9B)。在图9A和9B中还显示了用盐水治疗的对照野生型小鼠。这些资料证明，双特异性抗体改善了肌肉功能。施用双特异性抗体的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠在跑步机测试方面也保持了行为表现，而用对照抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠表现出行为表现的恶化(图9C)。
尽管跑步机测试的行为表现不佳，但用对照抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠显示CK水准增加。血清CK水准的显著升高表明急性肌肉损伤，是缺乏肌膜保护的结果。在研究结束时，与用单克隆亲本抗体治疗的小鼠相比，用双特异性抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的肌酸激酶水准显著较低(图9D)。用双特异性抗体治疗降低了LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠的肌酸激酶水准，表明双特异性抗体有助于保护肌肉免受损伤。
为了评估双特异性抗体对运动诱导的组织损伤的影响，对来自运动小鼠的组织进行伊文思蓝染料肌纤维染色。伊文思蓝染料穿透许多用亲本抗体混合物治疗的LARGEmyd -3J/GrsrJ小鼠组织的肌纤维，表明了运动诱发的损伤，因为染料仅穿透具有膜损伤的肌纤维并使其染色。相比之下，与用亲本抗体治疗的小鼠相比，伊文思蓝染料穿透显著更少的用双特异性抗体治疗的LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠组织的肌纤维(图10)。这表明，双特异性抗体而不是亲本单克隆抗体的全身性递送保护了肌肉免于运动诱发的损伤。
为了检测靶器官中的双特异性抗体，在最后一次双特异性抗体肌内注射后4天使动物安乐死，并进行免疫荧光染色。染色显示，甚至在4天后，通过IV或腹膜内施用的双特异性抗体T1T2(AS19xC3)仍然特异性结合四头肌、TA、膈肌和心脏中的肌肉组织，但对用作阴性对照的脑组织不染色(图11，第一行和第二行)。亲本单克隆抗体AS19未使肌肉组织良好地染色(图11，第三行)，这可能是由于抗体的快速解离速率所致(参见表K)。然而，与图4B一致，亲本单克隆抗体C3使肌肉组织良好地染色(图11，第四行)。
确定了与抗原人β-DG结合的AS30Fab的总体结构，其中抗原显示在重链和轻链之间(图12A)。图12B显示了CDR区和抗原的近视图。将AS30Fab和人βDG以1:1的摩尔比混合并在冰上温育30分钟，然后在4℃下进行SECSuperdex 20010/300GL柱(GE Healthcare)色谱。使AS30:βDG复合物结晶，并通过分子置换确定其结构，并且精确至在电子密度图中可见AS30 Fab和βDG序列D738RDPEKSSEDD748 (SEQ ID NO:302)。晶体结构显示，AS30抗体识别βDG中的线性肽D738RDPEKSSEDD748 (SEQ ID NO:302)。
另外，确定了与抗原人层粘连蛋白-2LG-5结构域结合的C21Fab的总体结构，其中抗原显示在重链和轻链之间(图12AC)。图12D显示了CDR区和抗原的近视图。以与AS30:βDG类似的方式获得C21:LG5复合物的结构，并且精确至C21Fab和人LG5在电子密度中均可见，并且C21识别LG5上的构象表位。
实施例6：识别β-DG和层粘连蛋白-2的三价多特异性抗体的产生
方法
抗体人源化
使用CDR移植和3D建模技术来进行先导杂交瘤抗体的人源化。抗体人源化的方法描述于Jones等人，Nature 321:522(1986)；Verhoeyen等人，Science 239:1534(1988)；Sims等人，J Immunol 151:2296(1993)；Chothia和Lesk,J Mol Biol 196:901(1987)；Carter等人，Proc Natl Acad Sci USA 89:4285(1992)；Presta等人，J Immunol 151:2623(1993)；美国专利No.5,589,205；5,565,332；6,180,370；6,632,927；7,241,877；7,244,615；7,244,832；7,262,050；和美国专利公开号2004/0236078(2004年4月30日提交)。
抗体表达和纯化
通过产生具有含有隆突入穴、NNAS、YTE和RF变体的重链恒定区以及轻链恒定区的哺乳动物表达载体来构建aDG三价抗体。合成具有期望接头的DNA可变结构域并插入期望的重链或轻链载体中。每个triAb的构型示于表M中(根据图13中图解的抗原结合结构域的编号，即VH1/VL1和VH2/VL2形成CODV臂，并且VH3/VL3形成Fab臂)。表I2中提供了triab的多肽链的氨基酸序列。
表M.triAb构型。
通过用Expifectamine(Thermo Fisher Scientific,A14635)在Expi293F细胞中瞬时共转染四种质粒来产生三价抗体。用MabSelect SuRe柱(GE Healthcare,11003494)纯化抗体，然后用HiTrap SP HP柱(GE Healthcare,17115201)进行阳离子交换。然后评估所有蛋白质的浓度、纯度和聚集。
抗体与人抗原的双重结合
通过用2μg/mL生物素化的N’Avi-HPC4-人LG4/5或生物素化的人β-DG-HPC4-Avi-C'包被Thermo Nunc固定化SA 96孔板进行双重结合夹心ELISA。在4℃过夜温育后，在室温下用PBS+1％BSA+0.1％Tween将平板封闭1小时。在用PBS洗涤(BioTek ELx405Select CW)后，将三价或亲本抗体以8μg/mL开始加入平板，并在平板上进行2倍稀释，将抗体在室温下温育1小时。洗涤后，以5μg/mL添加第二抗原β-DG-mFc(图1A)或LG4/5-mFc。在第二抗原之后，加入1:2000稀释的驴抗小鼠二级抗体(Jackson ImmunoResearch)，保持30分钟。将ABTS重悬于ABTS缓冲液(Roche)中并加入孔中进行检测。使用Perkin Elmer EnVision多模式读板仪在405nm处读取所得信号。
对于抗原与三价抗体的连续双重结合，将系列S感测器蛋白G芯片(GEHealthcare,29179315)与T100 Biacore一起使用。该芯片用于将三价或亲本抗体固定到表面(用5μg/mL抗体，60秒)上。捕获后，使200nM的LG4/5在芯片上流过60秒，随后使200nM的β-DG流过60秒。通过以相对单位(RU)表示的在芯片上检测到的品质变化来观察与三价抗体的结合。
结合动力学测定
通过将抗体(10μg/mL)固定在感测器S蛋白G芯片上，然后使连续稀释的抗原(LG4/5:80nM-1.25nM,BDG:5nM-0.31nM和4nM-0.25nM)流过该芯片来完成关于三价抗体的表面等离子体共振(“SPR；”T100Biacore；GE Healthcare)动力学测定资料。使用BIAevaluation软体以1:1结合模型评估资料。
结果
根据图13所示的形式产生三价抗体(triAb)。这些triAb具有带有两个不同的抗层粘连蛋白-2抗原结合结构域(图13中的VH-1/VL-1和VH-2/VL-2)的CODV臂和带有抗-β-DG抗原结合结构域的Fab臂(图13中的VH-3/VL-3)。
为了显示triAb与两种抗原的结合，如上所述使用2μg/mL生物素化的N’Avi-HPC4-人LG4/5(图14A)或生物素化的人βDG-HPC4-Avi-C’(图14B)进行双重结合夹心ELISA。在两种取向中，所有测试的triAb均显示出同时的双重结合。
另外，进行表面等离子体共振来显示人层粘连蛋白-2和β-DG抗原的依次结合(图1C)。triAb显示与两种抗原都结合，而单克隆抗体(用于结合层粘连蛋白-2的人源化C3和C21变体以及用于结合β-DG的人源化AS30变体)仅结合它们对应的抗原。
如上所述使用SPR来分析triAb与层粘连蛋白-2(表N)或β-DG(表O)结合的动力学。
表N.triAb与层粘连蛋白-2的结合(SPR)。
| ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | |
| 3407 | 1.57E+06 | 3.26E-03 | 2.08E-09 |
| 3423 | 2.70E+06 | 4.33E-03 | 1.60E-09 |
| 3429 | 2.13E+06 | 4.04E-03 | 1.90E-09 |
| 3437 | 2.41E+06 | 4.50E-03 | 1.87E-09 |
| 3439 | 3.07E+06 | 4.00E-03 | 1.30E-09 |
| AS30Hu6 | 2.54E+06 | 2.02E-03 | 7.96E-10 |
表O.triAb与β-DG的结合(SPR)。
| ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | |
| 3407 | 1.70E+05 | 2.53E-03 | 1.49E-08 |
| 3423 | 1.85E+05 | 2.28E-03 | 1.23E-08 |
| 3429 | 1.97E+05 | 2.19E-03 | 1.11E-08 |
| 3437 | 1.70E+05 | 2.31E-03 | 1.36E-08 |
| 3439 | 2.83E+05 | 2.89E-03 | 1.02E-08 |
| C3Hu11 | 1.19E+05 | 1.17E-03 | 9.83E-09 |
| C21Hu21 | 1.60E+05 | 1.44E-03 | 8.99E-09 |
如表N中所示，五种triAb能够以纳摩尔亲和力结合人β-DG(KD在1.3-2.1nM之间)，与在单价抗体形式中使用的人源化AS30抗原结合结构域相当(0.8nM)。类似地，表O显示，相同的triAb也能够以纳摩尔亲和力结合人层粘连蛋白-2(KD在10.2-14.9nM之间)，与在单价抗体形式中使用的人源化C3和C21抗原结合结构域相当(分别为9.8nM和9.0nM)。
这些资料表明，与传统的单价抗体形式相比，在图13中展示的三价形式的双特异性抗层粘连蛋白-2/β-DG抗体能够以相似的结合亲和力同时与其靶标双重结合。
实施例7：LARGEmyd-3J/GrsrJ小鼠在用识别β-DG和层粘连蛋白-2的三价多特异性抗体治疗后的行为测试中肌肉功能的改善
方法
抗体施用
将实施例4中描述的LARGE/myd-3j小鼠(8-16周龄)根据它们的后肢展开评分、金属丝悬挂评分、握力和跑步机随机分成五个组，以确保这些评分在治疗之前的各组(n＝11)中相似。然后用TriAb(3407、3437和3439)和识别无关蛋白靶标的对照TriAb以及盐水组作为对照通过尾静脉注射以30mg/kg每周两次对小鼠给药(星期一和星期四)，共7个剂量达3.5周。另外，还包括野生型小鼠组(n＝6)作为行为测试的基准。为了预防过敏反应，在施用抗体前10分钟腹膜内预先给予5mg/kg的苯海拉明。从第2周开始每周测试握力和金属丝悬挂。用盐水处理野生型作为不同行为测试的基准。
行为测试
为了后肢展开测试，通过其尾巴将小鼠提起，记录后肢相对于身体的位置并进行分级。
通过如下步骤进行金属丝悬挂测试：将小鼠置于金属丝网格上并适应1分钟；然后，将小鼠抓住的金属丝网格以2秒的限定速度缓慢翻转，记录小鼠保持在网格上的时间，截止时间为60秒。每只小鼠重复测试3次，结果取平均值。
通过如下步骤评价握力：将小鼠置于Grip Strength Meter (ColumbusInstruments)上，使小鼠紧紧抓住金属网格，水准拉动尾部直到小鼠放开为止；然后记录握力。重复测试5次，其间间隔1分钟。去除每只小鼠的最高读数和最低读数，结果为剩余三个读数的平均值。
对于在跑步机上的跑步时间，将小鼠放置在装备有电击格栅(型号1055SRM Exer-3/6，Columbus Instruments)的跑步机的单独跑道上。使动物适应跑步机5分钟，然后以增加的速度用确定的方案测试小鼠。当小鼠在电击网格上不能跑步超过3秒时，关闭电击网格并记录总跑步时间。
所有的行为测试都是在对小鼠身份和治疗设盲的情况下进行的，测试后的结果是不设盲的。
结果
测试了在实施例6中产生的triAb在LARGE/myd-3j小鼠中对肌肉功能的作用。
正如先前所述用biAb治疗所观察到的，在用TriAb 3407、3437或3439治疗两周后，Large/myd-3j小鼠表现出在握力(图15)和金属丝悬挂(图16)方面的显著改善的行为表现(见实施例5)。用TriAb治疗维持了或略微改善了在跑步机上的行为表现(图17)，但与对照相比没有统计学显著性，反而证明了轻微退化。通常，在跑步机上的跑步时间的统计学显著改善需要更长时间的治疗。
综上所述，多次功能测定的结果证明，用三价双特异性抗层粘连蛋白-2/β-DG抗体治疗导致α-肌营养不良蛋白聚糖病鼠模型中肌肉功能的改善。
虽然本公开包括不同的实施方案，但应理解的是，本领域技术人员将想到各种变化和修改。因此预期的是，所附权利要求书涵盖落入本公开范围内的所有这些等同变化。另外，在本文中使用的部分标题仅仅是出于组织的目的，而不应当解释为限制所描述的主题。
本文中描述的每个实施方案可以与任何其他实施方案或多个实施方案组合，除非明确地指示相反。具体而言，被指示为优选或有利的任何特征或实施方案可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征或一个或多个实施方案组合，除非明确地指示相反。
序列表
<110> 赛诺菲（Sanofi）
BEIL, Christian
BRONDYK, William
CHEN, Yangde
CHEN, Seng H.
CONNORS, Timothy D.
DEVAUD, Catherine
HOFFMANN, Dietmar
LANGE, Christian
MAGNAY, Maureen
MAGNAY, Tristan
PRADES, Catherine
RAO, Ercole
SEVIGNY, Leila
ZHU, Yunxiang
WEI, Ronnie
ZHAO, Hongmei
ZHU, Yunxiang
<120> 对肌营养不良蛋白聚糖和层粘连蛋白-2具有特异性的多特异性结合分子
<130> 183952028140
<140> 尚未指定
<141> 同时提交
<150> US 62/460,663
<151> 2017-02-17
<160> 534
<170> FastSEQ for Windows版本4.0
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<223> 合成构建体
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<220>
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<223> 合成构建体
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Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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Val
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 120
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 121
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 122
Ala Lys Asp Phe Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Tyr Asn Trp
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Phe Asp Pro
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<211> 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 123
Ala Arg Thr Ser Asp Tyr Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
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<210> 124
<211> 8
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 124
Ala Arg His Thr Pro Gly Ala Phe
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<211> 17
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 125
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Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 126
Gln Ser Val Ser Ser Tyr
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<211> 6
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 127
Gln Ser Ile Asp Thr Tyr
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 128
Gln Ser Val Ser Asn Trp
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 129
Gln Ser Ile Asp Thr Trp
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 130
Gln Asp Ile Arg Asn Trp
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 131
Gln Gly Ile Ser Asn Ser
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 132
Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 133
Gln Gly Ile Ser Ser Ala
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 134
Gln Gly Ile Ser Ser Trp
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 137
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 138
Ser Gly Ile Asn Leu Gly Arg Tyr Arg
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 139
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asp Thr Tyr
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<211> 6
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gln Asp Ile Ser Asn Phe
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 141
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 142
Ala Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 143
Lys Ala Ser
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 144
Ser Ala Ser
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 145
Ala Ala Ser
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 146
Ala Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Ala Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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Asp Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 149
Ala Ala Ser
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<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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Asp Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Ala Ala Ser
1
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 152
Lys Ala Ser
1
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 153
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1 5
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 154
Tyr Thr Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 155
Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 156
Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Gly Ile Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 158
Gln Gln Tyr Lys Thr Tyr Pro Phe Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gln Gln Tyr Lys Ser Tyr Pro Tyr Thr
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<220>
<223> 合成构建体
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Ser Leu Lys Ile Ala Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asn Tyr
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ser Gly Arg
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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<223> 合成构建体
<400> 188
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Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
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<223> 合成构建体
<400> 189
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
<400> 191
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Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
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<211> 118
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 192
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1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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35 40 45
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 193
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 194
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<211> 107
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 195
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<223> 合成构建体
<400> 196
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<210> 197
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 197
Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
<223> 合成构建体
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
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<220>
<223> 合成构建体
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50 55 60
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Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Thr Phe
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 200
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
20 25 30
Ser Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 204
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Trp Pro Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Pro Val
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 205
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Trp
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 206
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 207
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 208
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<220>
<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<211> 107
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 211
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ser
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Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 212
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 213
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 214
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 215
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 216
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 217
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 218
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 219
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 220
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 221
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 222
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Arg Phe
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<210> 223
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 223
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 224
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 225
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Thr Ser Leu Ser Asp Gly Ala Ser Ala
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Ser Tyr Tyr Ser Asp Ser Ser Lys His Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ser Asn Ala Gly Ile Leu Val
65 70 75 80
Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Ile
85 90 95
Trp His Arg Ser Ala Leu Phe Ile Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr
100 105 110
Val Leu
<210> 226
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 226
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Glu Ile Asn Trp Leu Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Thr Pro Gly Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala
115
<210> 227
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 227
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Glu Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 228
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 228
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile His Tyr Gly Glu Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Val Leu Phe Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Phe Phe Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 229
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 229
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Ser Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 230
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 230
caggtgcagc tgcagcagag cggtcccgag ctggtgaaac ctggcgcatc agtcaaaatg 60
agctgcaagg cctccggctt cacttttacc gactcagtga tcagctgggt caagcagcga 120
accggtcagg gactggagtg gatcggagaa atctaccctg gatctgggag tatctactat 180
aacgagaagt tcaaagggaa ggcaacactg actgccgaca aaagctccaa tacagcctat 240
atgcagctgc gatccctgac ttctgaagat agcgccgtgt acttttgcgc aatgcggagg 300
tcctattggg gtcagggcac cctggtgaca gtctctgct 339
<210> 231
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 231
gacgtgctga tgacccagac acccctgagt ctgcctgtct cactgggaga tcaggcttct 60
atcagttgcc gaagctccca gagcatcgtg cattccaacg gaaataccta cctggagtgg 120
tatctgcaga agccagggca gtcccccaag ctgctgatct acaaagtgtc taaccggttc 180
agtggcgtcc cagacaggtt ttcaggtagc ggctccggaa ctgatttcac cctgaaaatt 240
tcccgggtgg aggcagaaga cctgggtgtc tactattgct tccagggcag ccatgtgccc 300
ctgacttttg gggccggtac caagctggag ctgaaa 336
<210> 232
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 232
cagatccagc tgcagcagtc cggtcccgag ctggtgaaac ctggcgcatc tgtcaagatg 60
agttgcgaag cctcaggctt cacttttacc gactccgtga ttacctgggt caaacagcgc 120
ccaggccagg gactggagtg gatcggagaa atctaccccg gatctgggaa cttctactat 180
aatgagaagt ttaaagggaa ggcaacactg actgccgaca agagctccaa caccgcctac 240
atgcagctgc gatcactgac aagcgaagat agcgccgtgt acttctgcgc aatgcggagg 300
tctagttggg gtcagggcac cctggtgaca gtctctgct 339
<210> 233
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 233
gacgtgctga tgacccagac acccctgtct ctgcctgtca gtctgggaga tcaggcttct 60
atcagttgcc gaagctccca gaccatcgtg cattcaaaca gcaagacata cctggagtgg 120
tatctgcaga aaccaggcca gtcccccaag ctgctgatct acaaagtgtc aaatcggttc 180
tctggagtcc cagacaggtt ttccggttct ggcagtggaa ctgatttcac cctgaagatt 240
tctcgggtgg aggcagaaga cctgggtgtc tactattgct tccaggggag ccatgtgccc 300
ctgacttttg gggccggtac caagctggag ctgaaa 336
<210> 234
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 234
caggtgcagc tgcagcagtc ggggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccgtc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaggctagga 300
tattgtagta gtaccagctg ctatttgtct gcttttgata tctggggcca agggacaatg 360
gtcaccgtct cttca 375
<210> 235
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 235
gaaattgtgt tgacacagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 236
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 236
cagatccagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ctggcaagag cctgaagatc 60
gcctgcaagg gctccggcta cagcttcagc aactactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cctggaaaag gactggaatg gatgggcatt atctaccctg gcgacagcga cacccggtac 180
agccccagct tccacggcca ggtgacaatc agcgccgaca agagcatctc caccgcctac 240
ctgcagtggt cctccctgaa ggccagcgac accgccatgt actattgtgc cagaggcgtg 300
atcatcaacg gcaccaccag cggcttcgac tattggggac agggcaccct ggtgatcgtg 360
tcctcc 366
<210> 237
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 237
gagacaaccc tgacccagag ccccgccacc ctgtccgtgt ctccaggcga gagagccacc 60
ctgagctgca gagccagcca gagcgtgtcc agcaacctgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggccaggccc ccagactgct gatgtacggc gccagcacca gagccaccgg catccctgcc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagagc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcac tacaacaacc tgcccctgac cttcggcgga 300
ggcaccaagg tggacctgaa g 321
<210> 238
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 238
gaagtccaac tccaacagtc tggggcagaa cttgtcaaac ctggggcttc agtaaaattg 60
agttgcacag caagtggctt taacatcaaa gacacatata ttcattgggt gaagcaacga 120
ccagaacaag gcttggagtg gatcggtagg attgaccctg caaacgggaa tacaaaatat 180
gaccctaaat tccagggaaa ggctacaata acagcagaca ccagcagtaa cattgtctat 240
gtgcaattta gctctcttac ctctgaggac actgctgtct attattgcgg acgtagtggc 300
gggaattatg tgggttattg gggccagggg acaacactca ccgtatcctc t 351
<210> 239
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 239
gatatagtaa tgtcccagtc tccttcatca cctactgtgt cagttggaga aaaagtcacc 60
atgacctgta agtcctcaca gtccctcttg gacagcggga atcagaaaaa ttatctcgca 120
tggtatcagc aaaagccagg gcagtcccct aagctgttga tctattgggc aagtacaagg 180
aaaagtggcg tgcctgatag attcacaggg agcggcagcg ggacagactt cactttgagc 240
atctcttcag taaaagccga agacctggca gtgtactact gtcagcaata ttatacctac 300
ccttggactt ttggtggcgg gaccaaactg gaaataaaa 339
<210> 240
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 240
gaggttcaac ttcagcaatc aggggctgag cttgtaaaac ctggagcctc tgtaaaactc 60
tcttgtaccg cctccgggtt caacataaaa gatacatata tgcactgggt aaaggagcgg 120
cccgaacagg gactcgaatg gatcgggagg attgacccag ctaacggaaa taccaagtat 180
gatccaaaat ttcaggggaa agctacaata accgccgata cttctagtaa tacagcatat 240
cttcagctca gcagcttgac aagcgaagat accgcagttt actactgcgg tcgatcccga 300
gggaattatt ttgactactg gggccagggt actactctca cagtaagtag c 351
<210> 241
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 241
gacatagtaa tgagccagcc acctagttca cttgccgtaa gtgtgggtga aaaggtgact 60
atgacctgta aaagtagtca gagcctcctt tactcatcaa atcagaagaa ttacttggcc 120
tggtatcaac agaaacctgg acaaagcccc aaactcctca tatactgggc ctctacccga 180
gagtccggcg taccagatcg gtttaccggt tctggatcag gtacagactt tacacttacc 240
atctcttcag tgaaggctga ggacttggcc gtgtattatt gtcaacaata ttatacatat 300
ccttggactt ttggcggagg gacaaagctc gaaataaag 339
<210> 242
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 242
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ccggcacctc cgtgaaggtg 60
tcctgcaagg cttccggcta cacctttacc acctactaca tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacagg gcctggaatg gatgggcctg atcaaccctt ccgccggcaa caccagaaac 180
gcccagaaat tccagggcag agtgaccatg acccgggaca cctccaccaa caccgtgtac 240
atggaactgt cctccctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagagagctg 300
gacatctggg gccagggcac caaagtgacc gtgtcctct 339
<210> 243
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 243
gccatccaga tgacccagtc ccccagctcc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggcctctca ggacatccgg aacgacctgg gctggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gcttccagtc tccagtccgg cgtgccctcc 180
agattctccg gcaatggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatcaactc cctccagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgtctccaa gacttcaact tccccttcac cttcggccct 300
ggcaccaccg tggacatcaa c 321
<210> 244
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 244
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagt ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa aacggtgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggctgttt attactgtgc gagagaaggg 300
atggttcggg gagccctctt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 245
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 245
gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tatcctggta ccaacagaaa 120
cctgggcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ccagggccac tggcatccca 180
gccaggttca gtggcagtgg gtctgggcca gacctcactc tcaccatcag cagcctgcag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag caggattata acttaccgta cacttttggc 300
caggggacca agctggagat caaa 324
<210> 246
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 246
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagttttact agttactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggagtc atctatcctg gtgactctga taccagatat 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatg tcagccgaca agtccatcag taccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac agcgccatgt attactgtgc gagacagcta 300
cgagactact acggtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 247
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 247
gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gactatcagc agcaactact tttcctggta ccagcagaaa 120
cctgggcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ccagggccac tggcattcca 180
gccaggttca gtggcagtgg gtctgagaca gacttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag caggattata acttacctcg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 248
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 248
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcactgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacagcta 300
cgagactact acagtatgga cgtctggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctca 357
<210> 249
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 249
gaaattgtaa tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tatcctggta ccagcagaaa 120
cctgggcagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca ccagggccac tggcattgca 180
gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240
cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag caggattata acttacctcg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
<210> 250
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 250
gaggtgcagc tgcagcagag cggccctgag ctggtgaaac ctggcgccag cgtgaagatg 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tccactgggt gaaacagaag 120
cccggccagg gcctggaatg gattggctac atcaacccct acaacgacgg caccaagtac 180
agcgagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accagcgaca gaagcagcag caccgcctac 240
atggaagtgt ccagcctgac ctccgaggac agcgccgtgt actactgcgc catctacggc 300
aacagctact ggggccaggg cagcaccctg accgtgtcca gc 342
<210> 251
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 251
gacatcgtga tgacccaggc tgcccccagc atccccgtga cacctggcga gtccgtgtcc 60
atcagctgca gaagcagcaa gagcctgctg cacagcaacg gcaataccta cctgtactgg 120
ttcctgcagc ggcctggcca gtccccccag cggctgatct actacatgag caacctggac 180
agcggcgtgc ccgaccggtt tagcggcaga ggcagcggca cagactttac cctgcggatc 240
agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgca tgcagggcct ggaatacccc 300
tacacctttg gaggcggcac caagctggaa atcaag 336
<210> 252
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 252
gacgtgatgc tggtcgagag cggcggagat ctggtcaaac ccgggggttc tctgaagctg 60
agttgtgccg cttcaggctt cactttttct agttacacca tgagctgggt gcgacagacc 120
ccagagaagc ggctggaatg ggtcgctagc atctcaagcg gcggagggaa cacctactat 180
cccgactctg tgaaaggcag attcacaatt agtcgcgata atgcaaagaa caatctgtac 240
ctgcagatgt cctctctgag gtccgaagat actgccctgt actattgtgc tagatttgac 300
tatggaagtt cactggattc ttggggacag gggaccacac tgacagtgag ctcc 354
<210> 253
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 253
gacatcgtcc tgacccagag tcctgccacc ctgtctgtga caccaggcga ttctgtcagt 60
ctgtcatgta gagctagcca gtccatctct aacaatctgc actggtacca gcagaagtca 120
catgaaagcc ccagactgct gatcaagtat gccagtcagt caatcagcgg tattccttcc 180
cgcttctccg gctctggaag tgggacagac tttactctgt ccatcaactc tgtggagaca 240
gaagatttcg gcatgtattt ttgtcagcag agcaagaatt ggcccaggac atttggcgga 300
gggactaagc tggagatcaa g 321
<210> 254
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 254
gaagtgatgc tggtcgaaag tggaggagga ctggtgaaac caggtggaag cctgaagctg 60
tcctgtgccg cttctggctt cactttttca agctatacca tgagctgggt gcgacagaca 120
cctgagaagc ggctggaatg ggtcgctaca atctcctctg gaggggacaa cacttactat 180
ccagatagcg tgaaaggcag attcactatt tcccgcgaca atgcaaagaa caatctgtac 240
ctgcagatga gttcactgag gagcgaggat accgccctgt actattgcgc tagatttgac 300
tatggaagct ccctggattg ttggggacag gggaccacac tgaccgtgtc tagt 354
<210> 255
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 255
gacatcgtcc tgactcagag ccctgccacc ctgtccgtga caccaggcga ttcagtcagc 60
ctgtcctgta gagcttctca gagtatctca aactacctgc actggtatca gcagaagagt 120
catgaatcac ccagactgct gatcaagtac gccagccagt ccatctctgg gattcctagc 180
cgcttcagtg gctcaggaag cgggacagac tttactctga gcatcaattc cgtggagaca 240
gaagatttcg gcatgtattt ttgtcagcag tccaagtctt ggcccaggac atttggcgga 300
gggactgagc tggagatcaa g 321
<210> 256
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 256
gaggtgcaac tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120
cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacgcggg 300
tatcgcagca gctggtactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 257
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 257
gccatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattaga aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tacaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc aggcacagat ttcactttca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtctacaa gattacaatt acccgctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 258
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 258
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggt gtggtacggc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatggca tgagctgggt ccgccaagct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctctggt attaattgga atggtggtag cacaggttat 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagtctgag agccgaggac acggccttgt atcactgtgc gagagaaggg 300
ggggagctat taatggacta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
<210> 259
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 259
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc acctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccaccc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctcctac tttcggcgga 300
gggaccacgg tggagatcaa a 321
<210> 260
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 260
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattactcta tggtttgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttat atctatcctt ctggtggcac ttcgtatgct 180
gactccgtta aaggtcgctt cactatctct agagacaact ctaagaatac tctctacttg 240
cagatgaaca gcttaagggc tgaggacacg gccgtgtatt actgtgcgag acattggcgg 300
gggtatagca gcagctggta ccacccggcg tactttgact actggggcca gggcaccctg 360
gtcaccgtct caagc 375
<210> 261
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 261
gacatccaga tgacccagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcctctcac tttcggcgga 300
gggaccaagg tggagatcaa a 321
<210> 262
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 262
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacccta tgatgtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctatcctt ctggtggcac tactacttat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaggtcgtat 300
tactatgata gtagtggtta ttactcacat gatgcttttg atatctgggg ccaagggaca 360
atggtcaccg tctcaagc 378
<210> 263
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 263
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcgcc 60
atcacttgcc gcgcaagtca gagcatcgac acctatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccaagt tggaagacgg ggtcccatca 180
agattcagtg gcagtggaac tgggacagat ttcactctca ccatcagaag tctgcaacct 240
gaagattttg caagttattt ctgtcaacag agctactcta gtccagggat cactttcggc 300
cctgggacca aggtggagat caaa 324
<210> 264
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 264
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct gattacgaga tgcattgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctggcctt ctggtggcct tactaagtat 180
gctgaccccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagattcc 300
tattactatg atagtagtgg tgctcttggc tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcaagc 366
<210> 265
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 265
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtgttagt aactggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatcg 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgcctacag tatgtgagtt atcccctcac ttttggcgga 300
gggaccaagg tggacatcaa a 321
<210> 266
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 266
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tattacgata tgtattgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctattctt ctggtggcca tacttggtat 180
gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240
ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggctgtgt attactgtgc gaggcccggg 300
tatagcagtg gctggtacga tggcacctac tttgactact ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcaa gc 372
<210> 267
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 267
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgttggcga cagagtcacc 60
attacttgtc gggccagtca gagtattgat acttggctgg cctggtatcg gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaatgtcgt aattcattcc gcgtctactt tacaaagtgg cgtccccgca 180
aggttcagcg gcagtggatt tgggacagaa tggactctca ctatcaccaa cctgcagcct 240
gatgattttg ccacctatta ttgccaacaa tataagactt atccgttcac ttttggccag 300
gggacgaagc tggagatcaa g 321
<210> 268
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 268
gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60
tcttgcgctg cttccggatt cactttctct cattaccaga tggagtgggt tcgccaagct 120
cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atctctcctt ctggtggctt tacttcttat 180
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ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccgtgt attactgtac gagagagccg 300
gggaggttgt gggcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcaagc 357
<210> 269
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 269
gacatccaga tgacccagtc tccatctttc gtgtctgcat ctgtcggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca ggatattcgt aattggctag cctggtatca acaggagtcc 120
gggaaagccc ctcggctcct gatctctgct gcatccagta ggcacagtgg cgtctcatct 180
agattcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcaccctca ccatcaccag tctgcagcct 240
gaagattcag caacttattt ttgtcaacag gctgacagtt cccctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 270
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 270
caggtgcaac tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggcag ggtcaccatg accagggaca cgtccatcaa cacagcctac 240
atggaactga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc ggtctttggt 300
tcggggagtt cttggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 271
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 271
gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc aattctttag cctggtttca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgccaacaa tataagagtt acccgtacac atttggccag 300
gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 272
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 272
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggaaa caccttcacc ggctactata tacactgggt tcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg attaaaccta gtactggtga cacaaactat 180
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tcggggagtt cttggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345
<210> 273
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 273
gacatccaca tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ttgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
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gggaccaagc tggagatcaa a 321
<210> 274
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 274
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180
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ggctggtacg gcggggacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 275
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 275
gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcatcag tttaataatt acccattcac tttcggccct 300
gggaccaaag tggatatcaa a 321
<210> 276
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 276
gaagtgcagc tgctggaatc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgtgtgg cctccggctt caccttctcc agctacgcca tgtcctgggt gcgacaggct 120
cctggcaagg gcctggaatg ggtgtccggc atctctggca ggggcggctc tcctaactac 180
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ctccagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgtgc taaggacggc 300
gacggctccg gccctcccta ctactttgat tactggggcc agggcaccct cgtgaccgtg 360
tcatct 366
<210> 277
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 277
gacatccaga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgtc gggcctccca gggcatctct tcttggctgg cctggtatca gcagaagccc 120
gagaaggccc ccaagtccct gatctacgcc gccagctctc tccagtctgg cgtgccctcc 180
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gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaactcct acccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagc tggaaatcaa g 321
<210> 278
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 278
caggtgcagc tgatggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt ggctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtctg atggaagtaa tagatactat 180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtct 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg 300
gggattacta tggttcgggg acttattata aaatactact actactacgg tttggacgtc 360
tggggccaag ggacctcggt caccgtctcc tca 393
<210> 279
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 279
gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120
ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240
gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggtggacgtt cggccaaggg 300
accaaggtgg aaatcaaa 318
<210> 280
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 280
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt caccttcagt agctttggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatactatg atggaagtaa taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatgac 300
aactggaacg acggggactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 281
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 281
gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gggcattagt agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240
gaagattttg caacttatta ctgtcaacag cttaatagtt accctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 282
<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 282
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggagtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttaac agatttgtca tgagttgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaact attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatttt 300
acgtattact atggttcggg gaattattat aactggttcg accccagggg ccagggaacc 360
ctggtcaccg tctcctca 378
<210> 283
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 283
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctacat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attctcggac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa a 321
<210> 284
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 284
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgctg tctatggtgg gtcctttagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaggcac caactacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca cttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag aactagtgac 300
tacgattact actactacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 285
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 285
cagcctgtgc tgactcagcc aacttccctc tcagcatctc ctggagcatc agccagactc 60
acctgcacct tgcgcagtgg catcaatctt ggtcgctaca ggatattctg gtaccagcag 120
aagccagaga gccctccccg gtatctcctg agctactact cagactcaag taagcatcag 180
ggctctggag tccccagccg cttctctgga tccaaagatg cttcgagcaa tgcagggatt 240
ttagtcatct ctgggctcca gtctgaggat gaggctgact attactgtat gatttggcac 300
aggagtgctt tgtttatttt cggcagtgga accaaggtca ctgtccta 348
<210> 286
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 286
caggttcagc tacagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60
tcctgcaagg cttctggtta caccttcaca agctacgaga taaactggtt gaagcagagg 120
cctggacagg gacttgagtg gattggattg atttatccta gagatggaga tactaagtac 180
aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgcagaca catcctccag cacagcgtac 240
atggagctcc acagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacacacc 300
ccaggggctt tctggggcca agggactctg gtcactgtct ctgca 345
<210> 287
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 287
gatgttgtga tgacccaaac tcccctctcc ctgccggtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgtt cacagtaatg gagacaccta tttacattgg 120
tacctacaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctggaaatt tatttctgct ctcaaagcac acatgttccg 300
tacacgttcg gaggggggac caaactggaa ataaaa 336
<210> 288
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 288
gacgtgaagc tggtggagtc tggggaaggc ttagtgaagc ccggagggtc cctgaaactc 60
tcttgtgcag cctctggatt cactttcagt aggtatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagaaaaga ggctggaatg ggtcgcatat attagtagtg gaggtgatta catccactat 180
ggagaaactg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca atgccaggaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagttctc 300
ttttattatt acggcagtag ctacgtcttt tttgactact ggggccaagg caccactctc 360
acagtctcct ca 372
<210> 289
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 289
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtcagtct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacatcagc aattttctaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaatctcct gatctactac acatcaaaat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcggtgggtc tggaagagat tattctctca ccattaataa cctggagcaa 240
gaagatattg cctcttactt ttgccaacag ggtcatacgc ttccgtatac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa a 321
<210> 290
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 290
Ser Ile Val Val Glu Trp Thr Asn Asn Thr Leu Pro Leu Glu Pro Cys
1 5 10 15
Pro Lys Glu Gln Ile Ile Gly Leu Ser Arg Arg Ile Ala Asp Glu Asn
20 25 30
Gly Lys Pro Arg Pro Ala Phe Ser Asn Ala Leu Glu Pro Asp Phe Lys
35 40 45
Ala Leu Ser Ile Ala Val Thr Gly Ser Gly Ser Cys Arg His Leu Gln
50 55 60
Phe Ile Pro Val Ala Pro Pro Ser Pro Gly Ser Ser Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Thr Glu Val Pro Asp Arg Asp Pro Glu Lys Ser Ser Glu Asp Asp
85 90 95
<210> 291
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 291
Ser Ile Val Val Glu Trp Thr Asn Asn Thr Leu Pro Leu Glu Pro Cys
1 5 10 15
Pro Lys Glu Gln Ile Ala Gly Leu Ser Arg Arg Ile Ala Glu Asp Asp
20 25 30
Gly Lys Pro Arg Pro Ala Phe Ser Asn Ala Leu Glu Pro Asp Phe Lys
35 40 45
Ala Thr Ser Ile Thr Val Thr Gly Ser Gly Ser Cys Arg His Leu Gln
50 55 60
Phe Ile Pro Val Val Pro Pro Arg Arg Val Pro Ser Glu Ala Pro Pro
65 70 75 80
Thr Glu Val Pro Asp Arg Asp Pro Glu Lys Ser Ser Glu Asp Asp Val
85 90 95
<210> 292
<211> 183
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 292
Ala Asn Ala Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Asp Gly Thr Gly Phe Ala Lys
1 5 10 15
Ala Val Gly Gly Phe Lys Val Gly Leu Asp Leu Leu Val Glu Phe Glu
20 25 30
Phe Arg Thr Trp Thr Gly Val Leu Leu Gly Val Ser Ser Gln Lys Met
35 40 45
Asp Gly Met Gly Ile Glu Met Ile Asp Glu Lys Leu Met Phe His Val
50 55 60
Asp Asn Gly Ala Gly Arg Phe Thr Ala Ile Tyr Asp Ala Gly Ile Pro
65 70 75 80
Gly His Met Cys Asn Gly Gln Trp His Lys Val Thr Ala Lys Lys Ile
85 90 95
Lys Asn Arg Leu Glu Leu Val Val Asp Gly Asn Gln Val Asp Ala Gln
100 105 110
Ser Pro Asn Ser Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Asn Asp Pro Val Phe
115 120 125
Val Gly Gly Phe Pro Gly Gln Gln Phe Gly Leu Thr Thr Asn Ile Arg
130 135 140
Phe Arg Gly Cys Ile Arg Ser Leu Lys Leu Thr Lys Gly Thr Gly Lys
145 150 155 160
Pro Leu Glu Val Asn Phe Ala Lys Ala Leu Glu Leu Arg Gly Val Gln
165 170 175
Pro Val Ser Cys Pro Thr Thr
180
<210> 293
<211> 187
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 293
Ala Asn Ala Gln Arg Gly Thr Tyr Phe Asp Gly Thr Gly Phe Ala Lys
1 5 10 15
Ala Val Gly Gly Phe Lys Val Gly Leu Asp Leu Leu Val Glu Phe Glu
20 25 30
Phe Arg Thr Thr Thr Thr Thr Gly Val Leu Leu Gly Ile Ser Ser Gln
35 40 45
Lys Met Asp Gly Met Gly Ile Glu Met Ile Asp Glu Lys Leu Met Phe
50 55 60
His Val Asp Asn Gly Ala Gly Arg Phe Thr Ala Val Tyr Asp Ala Gly
65 70 75 80
Val Pro Gly His Leu Cys Asp Gly Gln Trp His Lys Val Thr Ala Asn
85 90 95
Lys Ile Lys His Arg Ile Glu Leu Thr Val Asp Gly Asn Gln Val Glu
100 105 110
Ala Gln Ser Pro Asn Pro Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Asn Asp Pro
115 120 125
Val Phe Val Gly Gly Phe Pro Asp Asp Leu Lys Gln Phe Gly Leu Thr
130 135 140
Thr Ser Ile Pro Phe Arg Gly Cys Ile Arg Ser Leu Lys Leu Thr Lys
145 150 155 160
Gly Thr Gly Lys Pro Leu Glu Val Asn Phe Ala Lys Ala Leu Glu Leu
165 170 175
Arg Gly Val Gln Pro Val Ser Cys Pro Ala Asn
180 185
<210> 294
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 294
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 295
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 295
Gly Phe Ala Lys Ala Val Gly Gly Phe Lys Val Gly Leu Asp Leu Leu
1 5 10 15
Val Glu Phe Glu
20
<210> 296
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 296
Glu Pro Lys Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro
1 5 10
<210> 297
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 297
Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro
1 5
<210> 298
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 298
Thr Lys Gly Pro Ser
1 5
<210> 299
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 299
Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 300
<211> 390
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 300
Val Gln Pro Gln Pro Val Pro Thr Pro Ala Phe Pro Phe Pro Ala Pro
1 5 10 15
Thr Met Val His Gly Pro Cys Val Ala Glu Ser Glu Pro Ala Leu Leu
20 25 30
Thr Gly Ser Lys Gln Phe Gly Leu Ser Arg Asn Ser His Ile Ala Ile
35 40 45
Ala Phe Asp Asp Thr Lys Val Lys Asn Arg Leu Thr Ile Glu Leu Glu
50 55 60
Val Arg Thr Glu Ala Glu Ser Gly Leu Leu Phe Tyr Met Ala Arg Ile
65 70 75 80
Asn His Ala Asp Phe Ala Thr Val Gln Leu Arg Asn Gly Phe Pro Tyr
85 90 95
Phe Ser Tyr Asp Leu Gly Ser Gly Asp Thr Ser Thr Met Ile Pro Thr
100 105 110
Lys Ile Asn Asp Gly Gln Trp His Lys Ile Lys Ile Val Arg Val Lys
115 120 125
Gln Glu Gly Ile Leu Tyr Val Asp Asp Ala Ser Ser Gln Thr Ile Ser
130 135 140
Pro Lys Lys Ala Asp Ile Leu Asp Val Val Gly Ile Leu Tyr Val Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Ile Asn Tyr Thr Thr Arg Arg Ile Gly Pro Val Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Asp Gly Cys Val Arg Asn Leu His Met Glu Gln Ala Pro Val
180 185 190
Asp Leu Asp Gln Pro Thr Ser Ser Phe His Val Gly Thr Cys Phe Ala
195 200 205
Asn Ala Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Asp Gly Thr Gly Phe Ala Lys Ala
210 215 220
Val Gly Gly Phe Lys Val Gly Leu Asp Leu Leu Val Glu Phe Glu Phe
225 230 235 240
Arg Thr Trp Thr Gly Val Leu Leu Gly Val Ser Ser Gln Lys Met Asp
245 250 255
Gly Met Gly Ile Glu Met Ile Asp Glu Lys Leu Met Phe His Val Asp
260 265 270
Asn Gly Ala Gly Arg Phe Thr Ala Ile Tyr Asp Ala Gly Ile Pro Gly
275 280 285
His Met Cys Asn Gly Gln Trp His Lys Val Thr Ala Lys Lys Ile Lys
290 295 300
Asn Arg Leu Glu Leu Val Val Asp Gly Asn Gln Val Asp Ala Gln Ser
305 310 315 320
Pro Asn Ser Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Asn Asp Pro Val Phe Val
325 330 335
Gly Gly Phe Pro Gly Gln Gln Phe Gly Leu Thr Thr Asn Ile Arg Phe
340 345 350
Arg Gly Cys Ile Arg Ser Leu Lys Leu Thr Lys Gly Thr Gly Lys Pro
355 360 365
Leu Glu Val Asn Phe Ala Lys Ala Leu Glu Leu Arg Gly Val Gln Pro
370 375 380
Val Ser Cys Pro Thr Thr
385 390
<210> 301
<211> 391
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 301
Gln Pro Glu Pro Val Pro Thr Pro Ala Phe Pro Thr Pro Thr Pro Val
1 5 10 15
Leu Thr His Gly Pro Cys Ala Ala Glu Ser Glu Pro Ala Leu Leu Ile
20 25 30
Gly Ser Lys Gln Phe Gly Leu Ser Arg Asn Ser His Ile Ala Ile Ala
35 40 45
Phe Asp Asp Thr Lys Val Lys Asn Arg Leu Thr Ile Glu Leu Glu Val
50 55 60
Arg Thr Glu Ala Glu Ser Gly Leu Leu Phe Tyr Met Ala Arg Ile Asn
65 70 75 80
His Ala Asp Phe Ala Thr Val Gln Leu Arg Asn Gly Leu Pro Tyr Phe
85 90 95
Ser Tyr Asp Leu Gly Ser Gly Asp Thr His Thr Met Ile Pro Thr Lys
100 105 110
Ile Asn Asp Gly Gln Trp His Lys Ile Lys Ile Met Arg Ser Lys Gln
115 120 125
Glu Gly Ile Leu Tyr Val Asp Gly Asn Arg Thr Ile Ser Pro Lys Lys
130 135 140
Ala Asp Ile Leu Asp Val Val Gly Met Leu Tyr Val Gly Gly Leu Pro
145 150 155 160
Ile Asn Tyr Thr Thr Arg Arg Ile Gly Pro Val Thr Tyr Ser Ile Asp
165 170 175
Gly Cys Val Arg Asn Leu His Met Ala Glu Ala Pro Ala Asp Leu Glu
180 185 190
Gln Pro Thr Ser Ser Phe His Val Gly Thr Cys Phe Ala Asn Ala Gln
195 200 205
Arg Gly Thr Tyr Phe Asp Gly Thr Gly Phe Ala Lys Ala Val Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Val Gly Leu Asp Leu Leu Val Glu Phe Glu Phe Arg Thr Thr
225 230 235 240
Thr Thr Thr Gly Val Leu Leu Gly Ile Ser Ser Gln Lys Met Asp Gly
245 250 255
Met Gly Ile Glu Met Ile Asp Glu Lys Leu Met Phe His Val Asp Asn
260 265 270
Gly Ala Gly Arg Phe Thr Ala Val Tyr Asp Ala Gly Val Pro Gly His
275 280 285
Leu Cys Asp Gly Gln Trp His Lys Val Thr Ala Asn Lys Ile Lys His
290 295 300
Arg Ile Glu Leu Thr Val Asp Gly Asn Gln Val Glu Ala Gln Ser Pro
305 310 315 320
Asn Pro Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Asn Asp Pro Val Phe Val Gly
325 330 335
Gly Phe Pro Asp Asp Leu Lys Gln Phe Gly Leu Thr Thr Ser Ile Pro
340 345 350
Phe Arg Gly Cys Ile Arg Ser Leu Lys Leu Thr Lys Gly Thr Gly Lys
355 360 365
Pro Leu Glu Val Asn Phe Ala Lys Ala Leu Glu Leu Arg Gly Val Gln
370 375 380
Pro Val Ser Cys Pro Ala Asn
385 390
<210> 302
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 302
Asp Arg Asp Pro Glu Lys Ser Ser Glu Asp Asp
1 5 10
<210> 303
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 303
Gly Asp Arg Ala Pro Ala Arg Phe Lys Ala Lys Phe Val Gly Asp Pro
1 5 10 15
Ala Leu Val Leu Asn Asp Ile His Lys Lys Ile Ala Leu Val Lys Lys
20 25 30
Leu Ala Phe Ala Phe Gly Asp Arg Asn Cys Ser Thr Ile Thr Leu Gln
35 40 45
Asn Ile Thr Arg Gly Ser Ile Val Val Glu Trp Thr Asn Asn Thr Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Pro Cys Pro Lys Glu Gln Ile Ala Gly Leu Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Ala Glu Asp Asp Gly Lys Pro Arg Pro Ala Phe Ser Asn Ala Leu
85 90 95
Glu Pro Asp Phe Lys Ala Thr Ser Ile Thr Val Thr Gly Ser Gly Ser
100 105 110
Cys Arg His Leu Gln Phe Ile Pro Val Val Pro Pro Arg Arg Val Pro
115 120 125
Ser Glu Ala Pro Pro Thr Glu Val Pro Asp Arg Asp Pro Glu Lys Ser
130 135 140
Ser Glu Asp Asp Val Tyr Leu His Thr Val Ile Pro Ala Val Val Val
145 150 155 160
Ala Ala Ile Leu Leu Ile Ala Gly Ile Ile Ala Met Ile Cys Tyr Arg
165 170 175
Lys Lys Arg Lys
180
<210> 304
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 304
Gly Asp Lys Ala Pro Ala Arg Phe Lys Ala Arg Leu Ala Gly Asp Pro
1 5 10 15
Ala Pro Val Val Asn Asp Ile His Lys Lys Ile Ala Leu Val Lys Lys
20 25 30
Leu Ala Phe Ala Phe Gly Asp Arg Asn Cys Ser Ser Ile Thr Leu Gln
35 40 45
Asn Ile Thr Arg Gly Ser Ile Val Val Glu Trp Thr Asn Asn Thr Leu
50 55 60
Pro Leu Glu Pro Cys Pro Lys Glu Gln Ile Ile Gly Leu Ser Arg Arg
65 70 75 80
Ile Ala Asp Glu Asn Gly Lys Pro Arg Pro Ala Phe Ser Asn Ala Leu
85 90 95
Glu Pro Asp Phe Lys Ala Leu Ser Ile Ala Val Thr Gly Ser Gly Ser
100 105 110
Cys Arg His Leu Gln Phe Ile Pro Val Ala Pro Pro Ser Pro Gly Ser
115 120 125
Ser Ala Ala Pro Ala Thr Glu Val Pro Asp Arg Asp Pro Glu Lys Ser
130 135 140
Ser Glu Asp Asp Val Tyr Leu His Thr Val Ile Pro Ala Val Val Val
145 150 155 160
Ala Ala Ile Leu Leu Ile Ala Gly Ile Ile Ala Met Ile Cys Tyr Arg
165 170 175
Lys Lys Arg Lys
180
<210> 305
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 305
Ile Gln Pro Glu Pro Val Pro Thr Pro Ala Phe Pro Thr Pro Thr Pro
1 5 10 15
Val Leu Thr His Gly Pro Cys Ala Ala Glu Ser Glu Pro Ala Leu Leu
20 25 30
Ile Gly Ser Lys Gln Phe Gly Leu Ser Arg Asn Ser His Ile Ala Ile
35 40 45
Ala Phe Asp Asp Thr Lys Val Lys Asn Arg Leu Thr Ile Glu Leu Glu
50 55 60
Val Arg Thr Glu Ala Glu Ser Gly Leu Leu Phe Tyr Met Ala Arg Ile
65 70 75 80
Asn His Ala Asp Phe Ala Thr Val Gln Leu Arg Asn Gly Leu Pro Tyr
85 90 95
Phe Ser Tyr Asp Leu Gly Ser Gly Asp Thr His Thr Met Ile Pro Thr
100 105 110
Lys Ile Asn Asp Gly Gln Trp His Lys Ile Lys Ile Met Arg Ser Lys
115 120 125
Gln Glu Gly Ile Leu Tyr Val Asp Gly Asn Arg Thr Ile Ser Pro Lys
130 135 140
Lys Ala Asp Ile Leu Asp Val Val Gly Met Leu Tyr Val Gly Gly Leu
145 150 155 160
Pro Ile Asn Tyr Thr Thr Arg Arg Ile Gly Pro Val Thr Tyr Ser Ile
165 170 175
Asp Gly Cys Val Arg Asn Leu His Met Ala Glu Ala Pro Ala Asp Leu
180 185 190
Glu Gln Pro Thr Ser Ser Phe His Val Gly Thr Cys Phe Ala Asn Ala
195 200 205
Gln Arg Gly Thr Tyr Phe Asp Gly Thr Gly Phe Ala Lys Ala Val Gly
210 215 220
Gly Phe Lys Val Gly Leu Asp Leu Leu Val Glu Phe Glu Phe Arg Thr
225 230 235 240
Thr Thr Thr Thr Gly Val Leu Leu Gly Ile Ser Ser Gln Lys Met Asp
245 250 255
Gly Met Gly Ile Glu Met Ile Asp Glu Lys Leu Met Phe His Val Asp
260 265 270
Asn Gly Ala Gly Arg Phe Thr Ala Val Tyr Asp Ala Gly Val Pro Gly
275 280 285
His Leu Cys Asp Gly Gln Trp His Lys Val Thr Ala Asn Lys Ile Lys
290 295 300
His Arg Ile Glu Leu Thr Val Asp Gly Asn Gln Val Glu Ala Gln Ser
305 310 315 320
Pro Asn Pro Ala Ser Thr Ser Ala Asp Thr Asn Asp Pro Val Phe Val
325 330 335
Gly Gly Phe Pro Asp Asp Leu Lys Gln Phe Gly Leu Thr Thr Ser Ile
340 345 350
Pro Phe Arg Gly Cys Ile Arg Ser Leu Lys Leu Thr Lys Gly Thr Gly
355 360 365
Lys Pro Leu Glu Val Asn Phe Ala Lys Ala Leu Glu Leu Arg Gly Val
370 375 380
Gln Pro Val Ser Cys Pro Ala Asn
385 390
<210> 306
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 306
caagtacaac tggttcaatc aggcgcagaa gtcgtaaaac ctggttccag cgtaaaagtc 60
agttgtgagg ctagtggatt caccttcacc gatagcgtta ttacatgggt tcgtcagcgc 120
ccaggtcaag ggctcgagtg gattggggaa atttacccag gaagtggaaa tttctactac 180
aatgaaaaat ttcaaggccg ggtgaccatc actgctgata aaagcacttc aacagcctat 240
atggaattgt ccagcttgcg ctccgaagac actgccgttt atttctgcgc catgcgtagg 300
tcttcctggg gacagggtac acttgtaact gtcagctct 339
<210> 307
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 307
caagtacaac tggttcaatc aggcgcagaa gtcgtaaaac ctggttccag cgtaaaagtc 60
agttgtgagg ctagt 75
<210> 308
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 308
ggattcacct tcaccgatag cgtt 24
<210> 309
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 309
attacatggg ttcgtcagcg cccaggtcaa gggctcgagt ggattgggga a 51
<210> 310
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 310
atttacccag gaagtggaaa tttc 24
<210> 311
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 311
tactacaatg aaaaatttca aggccgggtg accatcactg ctgataaaag cacttcaaca 60
gcctatatgg aattgtccag cttgcgctcc gaagacactg ccgtttattt ctgc 114
<210> 312
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 312
gccatgcgta ggtcttcc 18
<210> 313
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 313
tggggacagg gtacacttgt aactgtcagc tct 33
<210> 314
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 314
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Val Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Met Arg Arg Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 315
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 315
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser
20 25
<210> 316
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 316
Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser Val
1 5
<210> 317
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 317
Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Glu
<210> 318
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 318
Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe
1 5
<210> 319
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 319
Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 320
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 320
Ala Met Arg Arg Ser Ser
1 5
<210> 321
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 321
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 322
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 322
gacgtcgtaa tgactcaaac acccctctct ctttctgtta cccccggaca gcctgcttca 60
atcagttgta aatcatccca aaccatagtt cattctaata gtaaaactta cctcgaatgg 120
tatctccaaa aacctggtca gtcaccacag ctccttattt acaaggttag ttccagattc 180
tctggcgtcc ctgaccgctt ctctggctcc ggttcaggca ccgactttac tctgaaaatc 240
tcacgggttg aagctgaaga tgttggagtg tactactgct tccagggttc tcacgtccca 300
ttgacctttg gacagggaac taagctcgaa ataaaa 336
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gacgtcgtaa tgactcaaac acccctctct ctttctgtta cccccggaca gcctgcttca 60
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
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<220>
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 330
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
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<220>
<223> 合成构建体
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Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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Tyr
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<220>
<223> 合成构建体
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Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
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tcttcctggg gacagggtac acttgtaact gtcagctct 339
<210> 339
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<220>
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<400> 339
caagtacaac tggttcaatc aggcgcagaa gtcgtaaaac ctggttccag cgtaaaagtc 60
agttgtgagg ctagt 75
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<212> DNA
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<220>
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<223> 合成构建体
<400> 346
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
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35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
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Ser
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser
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<220>
<223> 合成构建体
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Glu
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 351
Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
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<220>
<223> 合成构建体
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<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 355
gatgtggtga tgactcagac acccctgagt ctcagcgtaa cacctggtca acccgcctct 60
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 362
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
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65 70 75 80
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 365
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Tyr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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1
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 371
gaagttcaac tggtcgagtc tggaggaggc ctcgtgaagc cgggcggtag tttgcgcctc 60
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 372
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<210> 374
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 374
atctctagta gcggcagcaa tact 24
<210> 375
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 375
tattatcctg atagtgtgaa ggggaggttt accatctcac gggataacgc taagaacaac 60
ctgtatcttc aaatgaatag cctccgagca gaggatacag cactttacta ctgc 114
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 378
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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50 55 60
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100 105 110
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 379
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
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<220>
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1 5 10 15
Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 382
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asn Thr
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<220>
<223> 合成构建体
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 384
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser
1 5 10
<210> 385
<211> 11
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 385
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser
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<220>
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ctcacctgcc gagcaagcca gtctattagt aacaatttgc actggtatca gcagaagagt 120
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gaggatgccg ccacgtattt ttgtcagcaa tcaaagagtt ggccccggac atttggaggg 300
ggaactaagc tggagattaa g 321
<210> 387
<211> 78
<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 387
gagatcgttc ttacccaatc cccggatttc ctttctgtga cccccaaaga aaaagtcaca 60
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<220>
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cagtctatta gtaacaat 18
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 390
tacgcctct 9
<210> 391
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 391
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ctcactatca attcagtgga ggctgaggat gccgccacgt atttttgt 108
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 392
cagcaatcaa agagttggcc ccggaca 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 393
tttggagggg gaactaagct ggagattaag 30
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 394
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 395
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Lys
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Tyr Ala Ser
1
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 399
Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 400
Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg Thr
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 401
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 402
gaagttcaac tggtcgagtc tggaggaggc ctcgtgaagc cgggcggtag tttgcgcctc 60
tcttgtgccg cctcagggtt tacgttctct agttatacta tgagttgggt gcggcaggca 120
ccgggaaaag ggctggaatg ggtggcctca atctctagta gcggcagcaa tacttattat 180
cctgatagtg tgaaggggag gtttaccatc tcacgggata acgctaagaa caacctgtat 240
cttcaaatga atagcctccg agcagaggat acagcacttt actactgcgc tcgctttgac 300
tatggcagca gtcttgatag ttgggggcag ggcaccttgc ttacggtttc atcc 354
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<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 403
gaagttcaac tggtcgagtc tggaggaggc ctcgtgaagc cgggcggtag tttgcgcctc 60
tcttgtgccg cctca 75
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 404
gggtttacgt tctctagtta tact 24
<210> 405
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 405
atgagttggg tgcggcaggc accgggaaaa gggctggaat gggtggcctc a 51
<210> 406
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 406
atctctagta gcggcagcaa tact 24
<210> 407
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 407
tattatcctg atagtgtgaa ggggaggttt accatctcac gggataacgc taagaacaac 60
ctgtatcttc aaatgaatag cctccgagca gaggatacag cactttacta ctgc 114
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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gctcgctttg actatggcag cagtcttgat agt 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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tgggggcagg gcaccttgct tacggtttca tcc 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 410
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
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115
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
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Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 414
Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asn Thr
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 415
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 416
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 417
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 418
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ctgacttgca gggcctcaca atccattggc aataaccttc actggtatca gcagaagtcc 120
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<210> 419
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 419
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 420
caatccattg gcaataac 18
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<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 421
cttcactggt atcagcagaa gtccgaccag tctccgaaac tcctcatcaa g 51
<210> 422
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 422
tatgccagc 9
<210> 423
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 423
cagtcaatta gcggaatacc gtctcggttt agcggatctg ggtctggtac tgacttcacg 60
ctgacgatca atagcgtgga agcggaggac gccgccacct atttctgc 108
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 424
cagcaatcta agtcctggcc gagaacg 27
<210> 425
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 425
ttcggaggcg gtactaaact tgagatcaag 30
<210> 426
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 426
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 427
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gln Ser Ile Gly Asn Asn
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 429
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Lys
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 430
Tyr Ala Ser
1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 431
Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 432
Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg Thr
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 433
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<210> 434
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 434
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tcctgtgcag catccggatt cacgttttct tcttatacga tgagttgggt ccggcaggca 120
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ccagactcag ttaaaggtcg cttcacgata agtcgggaca acgctaaaaa taacctgtat 240
ttgcaaatga acagcttgcg agctgaggac accgccctct actactgtgc ccgatttgat 300
tatggatcaa gtttggattc atggggccaa gggaccctgc tcacagtaag ctct 354
<210> 435
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 435
gaggtacagc tcgtcgaaag tggcggcggt cttgtcaagc cgggaggaag tttgcgcctg 60
tcctgtgcag catcc 75
<210> 436
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 436
ggattcacgt tttcttctta tacg 24
<210> 437
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 437
atgagttggg tccggcaggc accggggaaa ggattggaat gggttgcgtc t 51
<210> 438
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 438
attagtagct ctggatctaa caca 24
<210> 439
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 439
tactacccag actcagttaa aggtcgcttc acgataagtc gggacaacgc taaaaataac 60
ctgtatttgc aaatgaacag cttgcgagct gaggacaccg ccctctacta ctgt 114
<210> 440
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 440
gcccgatttg attatggatc aagtttggat tca 33
<210> 441
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 441
tggggccaag ggaccctgct cacagtaagc tct 33
<210> 442
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 442
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 443
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 443
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
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<210> 444
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 444
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
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<210> 445
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 445
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1 5 10 15
Ser
<210> 446
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 446
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<210> 447
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 447
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1 5 10 15
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20 25 30
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35
<210> 448
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 448
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser
1 5 10
<210> 449
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 449
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 450
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 450
gaaatcgttc ttactcagtc cccggatttt ttgagtgtaa cgcctaaaga gaaggtgacc 60
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aggttttccg gtagcggtag tggcacagac ttcacattga gcataaacag cgtggaagcc 240
gaggatgcag caacatactt ttgccaacag agcaagtcct ggccgaggac gttcggtggg 300
ggcaccaaat tggaaataaa g 321
<210> 451
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 451
gaaatcgttc ttactcagtc cccggatttt ttgagtgtaa cgcctaaaga gaaggtgacc 60
ctgtcctgcc gcgcttcc 78
<210> 452
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 452
caatctatat caaactat 18
<210> 453
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 453
cttcattggt accagcaaaa aagcgaccag tccccgaaac tgctcatcaa a 51
<210> 454
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 454
tacgctagc 9
<210> 455
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 455
caatcaataa gcggcatccc tagcaggttt tccggtagcg gtagtggcac agacttcaca 60
ttgagcataa acagcgtgga agccgaggat gcagcaacat acttttgc 108
<210> 456
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 456
caacagagca agtcctggcc gaggacg 27
<210> 457
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 457
ttcggtgggg gcaccaaatt ggaaataaag 30
<210> 458
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 458
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 459
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 459
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 460
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 460
Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 461
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 461
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Lys
<210> 462
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 462
Tyr Ala Ser
1
<210> 463
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 463
Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 464
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 464
Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 465
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 465
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 466
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 466
gaggtccaac ttgttgaatc cggtggaggg ctggtgcagc ctggtggatc cctccgcctt 60
tcctgtgcag catcaggttt tactttttcc tcatacacca tgtcttgggt tcgccaggct 120
ccagggaaag gattggaatg ggtggcaact atcagtagta gcggggacaa tacatactat 180
cccgattccg tgaaagggag atttacgatt tcacgcgaca acagcaaaaa taccctttac 240
ctgcaaatga gttccttgcg ggccgaggac actgccctct actactgcgc tcgcttcgat 300
tacggttcca gcctggactc atggggtcaa gggactacac tgactgtttc ttcc 354
<210> 467
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 467
gaggtccaac ttgttgaatc cggtggaggg ctggtgcagc ctggtggatc cctccgcctt 60
tcctgtgcag catca 75
<210> 468
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 468
ggttttactt tttcctcata cacc 24
<210> 469
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 469
atgtcttggg ttcgccaggc tccagggaaa ggattggaat gggtggcaac t 51
<210> 470
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 470
atcagtagta gcggggacaa taca 24
<210> 471
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 471
tactatcccg attccgtgaa agggagattt acgatttcac gcgacaacag caaaaatacc 60
ctttacctgc aaatgagttc cttgcgggcc gaggacactg ccctctacta ctgc 114
<210> 472
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 472
gctcgcttcg attacggttc cagcctggac tca 33
<210> 473
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 473
tggggtcaag ggactacact gactgtttct tcc 33
<210> 474
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 474
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 475
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 475
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 476
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 476
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 477
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 477
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10 15
Thr
<210> 478
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 478
Ile Ser Ser Ser Gly Asp Asn Thr
1 5
<210> 479
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 479
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 480
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 480
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser
1 5 10
<210> 481
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 481
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 482
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 482
gagatcgtgc tcacccaatc tcctgacttc cttagcgtta caccagggga gaaagtaact 60
cttacgtgcc gggcctccca gagcatctcc aattatttgc attggtacca gcaaaagagt 120
gaccagagcc ctaagctgct catcaaatac gcatcacaga gtattagcgg cgttccctca 180
cggttctctg gctccggttc cggtacagac ttcactttga cgatttcaag tgtagaggcc 240
gaggacttcg caacttactt ttgtcagcaa agcaaatcct ggcctcgaac tttcggcggg 300
ggtacaaaac tcgaaatcaa g 321
<210> 483
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 483
gagatcgtgc tcacccaatc tcctgacttc cttagcgtta caccagggga gaaagtaact 60
cttacgtgcc gggcctcc 78
<210> 484
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 484
cagagcatct ccaattat 18
<210> 485
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 485
ttgcattggt accagcaaaa gagtgaccag agccctaagc tgctcatcaa a 51
<210> 486
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 486
tacgcatca 9
<210> 487
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 487
cagagtatta gcggcgttcc ctcacggttc tctggctccg gttccggtac agacttcact 60
ttgacgattt caagtgtaga ggccgaggac ttcgcaactt acttttgt 108
<210> 488
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 488
cagcaaagca aatcctggcc tcgaact 27
<210> 489
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 489
ttcggcgggg gtacaaaact cgaaatcaag 30
<210> 490
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 490
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 491
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 491
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser
20 25
<210> 492
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 492
Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 493
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 493
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Lys
<210> 494
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 494
Tyr Ala Ser
1
<210> 495
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 495
Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Phe Cys
35
<210> 496
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 496
Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg Thr
1 5
<210> 497
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 497
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 498
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 498
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr
210 215 220
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Asp Lys Thr His Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
245 250 255
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
260 265 270
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
275 280 285
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
290 295 300
Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 499
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 499
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Val Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Met Arg Arg Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 500
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 500
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Lys Thr His Thr
100 105 110
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
115 120 125
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
130 135 140
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
145 150 155 160
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
165 170 175
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
180 185 190
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
225 230 235 240
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
245 250 255
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
260 265 270
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
275 280 285
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
290 295 300
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
305 310 315 320
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330
<210> 501
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 501
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Ser Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 502
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 502
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr
210 215 220
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Asp Lys Thr His Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
245 250 255
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
260 265 270
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
275 280 285
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
290 295 300
Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 503
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 503
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
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Val Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Met Arg Arg Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
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210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
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370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
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420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 504
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 504
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 505
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
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115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 506
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser
165 170 175
Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr
210 215 220
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Asp Lys Thr His Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
245 250 255
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
260 265 270
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
275 280 285
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
290 295 300
Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 507
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 507
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Val Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Met Arg Arg Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
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210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 508
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 508
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Lys Thr His Thr
100 105 110
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
115 120 125
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
130 135 140
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
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180 185 190
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
245 250 255
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260 265 270
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
275 280 285
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
290 295 300
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
305 310 315 320
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330
<210> 509
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 509
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 510
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 510
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr
210 215 220
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Asp Lys Thr His Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
245 250 255
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
260 265 270
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
275 280 285
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
290 295 300
Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
305 310 315 320
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
325 330 335
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Gly Ser Phe Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
530 535 540
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
545 550 555 560
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565 570
<210> 511
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 511
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
180 185 190
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
195 200 205
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 512
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 512
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
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Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Lys Thr His Thr
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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
115 120 125
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
130 135 140
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
145 150 155 160
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
165 170 175
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ala
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Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Asp Lys Thr His Thr
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
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325 330
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 513
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Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 514
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
485 490 495
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 515
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420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 516
<211> 331
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 516
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 517
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165 170 175
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195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
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<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 518
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1 5 10 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 519
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275 280 285
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290 295 300
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<211> 219
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210 215
<210> 521
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 521
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
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100 105 110
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130 135 140
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165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 522
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 522
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Val Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Met Arg Arg Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr
210 215 220
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
245 250 255
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
260 265 270
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
305 310 315 320
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
325 330 335
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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485 490 495
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515 520 525
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
530 535 540
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545 550 555 560
Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565
<210> 523
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 523
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Ser Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
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65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
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Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Leu Thr
130 135 140
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser
165 170 175
Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
195 200 205
Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr
210 215 220
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
245 250 255
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
275 280 285
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
290 295 300
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
305 310 315 320
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330 335
<210> 524
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 524
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
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Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
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275 280 285
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
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Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435
<210> 525
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 525
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 526
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 526
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Ser Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Cys Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Val
210 215
<210> 527
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 527
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 528
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 528
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Val Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Met Arg Arg Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr
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Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser
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Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
245 250 255
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
260 265 270
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
275 280 285
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu
290 295 300
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr
305 310 315 320
Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
325 330 335
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
450 455 460
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
485 490 495
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
500 505 510
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Lys
515 520 525
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
530 535 540
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly
565
<210> 529
<211> 336
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 529
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Thr Ile Val His Ser
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100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln
115 120 125
Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys Glu Lys Val Thr Leu Ser
130 135 140
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln
145 150 155 160
Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser
165 170 175
Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
180 185 190
Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
195 200 205
Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr
210 215 220
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
245 250 255
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
260 265 270
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
275 280 285
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
290 295 300
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
305 310 315 320
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
325 330 335
<210> 530
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 530
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
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100 105 110
Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro
115 120 125
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
130 135 140
Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
145 150 155 160
Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp
165 170 175
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn
180 185 190
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
195 200 205
Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Leu Leu Thr Val Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
245 250 255
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
260 265 270
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
275 280 285
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
290 295 300
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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340 345 350
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355 360 365
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
370 375 380
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
385 390 395 400
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg
405 410 415
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
420 425 430
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
545 550 555
<210> 531
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 531
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Ala Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
115 120 125
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val
130 135 140
His Ser Asn Ser Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
165 170 175
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
180 185 190
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
195 200 205
Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
210 215 220
Ile Lys Thr Lys Gly Pro Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
245 250 255
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
260 265 270
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
275 280 285
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
290 295 300
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
305 310 315 320
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
325 330 335
Glu Cys
<210> 532
<211> 559
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 532
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Ser
20 25 30
Val Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Met Arg Arg Ser Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
115 120 125
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
130 135 140
Ser Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
145 150 155 160
Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ser Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp
165 170 175
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
180 185 190
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
195 200 205
Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Gly Ser Ser Leu Asp Ser Trp Gly Gln
210 215 220
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
245 250 255
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
260 265 270
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
275 280 285
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
290 295 300
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
305 310 315 320
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
325 330 335
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
340 345 350
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
355 360 365
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
370 375 380
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
385 390 395 400
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg
405 410 415
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
420 425 430
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
435 440 445
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
450 455 460
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
465 470 475 480
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
485 490 495
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
500 505 510
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
515 520 525
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
530 535 540
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
545 550 555
<210> 533
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 533
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys Ser Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gln Pro Lys Ala
100 105 110
Ala Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
115 120 125
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val
130 135 140
His Ser Asn Ser Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
145 150 155 160
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
165 170 175
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
180 185 190
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe
195 200 205
Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
210 215 220
Ile Lys Thr Lys Gly Pro Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
245 250 255
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
260 265 270
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
275 280 285
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
290 295 300
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
305 310 315 320
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
325 330 335
Glu Cys
<210> 534
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 534
Asp Lys Thr His Thr
1 5
Claims (76)
1.一种包含结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分的第一结合结构域和结合层粘连蛋白-2的第二结合结构域的双特异性结合分子，其中所述双特异性结合分子是包含一条或多条多肽链的双特异性结合蛋白，并且其中所述双特异性结合分子包含两条包含由下式表示的结构的轻链：
VL1-L5-VL2-L6-CL [III]
和两条包含由下式表示的结构的重链：
VH1-L7-VH2-L8-CH1-铰链-CH2-CH3 [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
VL2是第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH1是第一免疫球蛋白重链可变结构域；
VH2是第二免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH1是免疫球蛋白CH1重链恒定结构域；
CH2是免疫球蛋白CH2重链恒定结构域；
CH3是免疫球蛋白CH3重链恒定结构域；
铰链是连接CH1和CH2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
L5、L6、L7和L8是氨基酸接头；
其中VH1和VL1结构域形成VH1/VL1结合对，并且其中VH2和VL2结构域形成VH2/VL2结合对；而且其中：
(a) 所述VH1结构域包括：由氨基酸序列SEQ ID NO: 1组成的CDR-H1，由氨基酸序列SEQID NO: 9组成的CDR-H2，和由氨基酸序列SEQ ID NO: 18组成的CDR-H3；所述VL1结构域包括：由氨基酸序列SEQ ID NO: 28组成的CDR-L1，由氨基酸序列SEQ ID NO: 38组成的CDR-L2，和由氨基酸序列SEQ ID NO: 43组成的CDR-L3；所述VH2结构域包括：由氨基酸序列SEQID NO: 52组成的CDR-H1，由氨基酸序列SEQ ID NO: 57组成的CDR-H2，和由氨基酸序列SEQID NO: 62组成的CDR-H3；所述VL2结构域包括：由氨基酸序列SEQ ID NO: 67组成的CDR-L1，由氨基酸序列SEQ ID NO: 72组成的CDR-L2，和由氨基酸序列SEQ ID NO: 77组成的CDR-L3；或者
(b) 所述VH2结构域包括：由氨基酸序列SEQ ID NO: 1组成的CDR-H1，由氨基酸序列SEQID NO: 9组成的CDR-H2，和由氨基酸序列SEQ ID NO: 18组成的CDR-H3；所述VL2结构域包括：由氨基酸序列SEQ ID NO: 28组成的CDR-L1，由氨基酸序列SEQ ID NO: 38组成的CDR-L2，和由氨基酸序列SEQ ID NO: 43组成的CDR-L3；所述VH1结构域包括：由氨基酸序列SEQID NO: 52组成的CDR-H1，由氨基酸序列SEQ ID NO: 57组成的CDR-H2，和由氨基酸序列SEQID NO: 62组成的CDR-H3；所述VL1结构域包括：由氨基酸序列SEQ ID NO: 67组成的CDR-L1，由氨基酸序列SEQ ID NO: 72组成的CDR-L2，和由氨基酸序列SEQ ID NO: 77组成的CDR-L3。
2.如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中L5、L6、L7和L8的长度各自为0到50个氨基酸残基。
3.如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中L5、L6、L7和L8的长度各自为0到25个氨基酸残基。
4.如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中L5、L6、L7和L8的长度各自为0到14个氨基酸残基。
5. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中L5和L7接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 294)，并且其中L6和L8接头的长度各自为0个氨基酸残基。
6.如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中式III和/或式IV的多肽的两个可变结构域之一或两者是人源化的或小鼠的可变结构域。
7.如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分，并且其中VH2/VL2结合对结合层粘连蛋白-2。
8.如权利要求7所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
9. 如权利要求8所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对以低于1 µM的平衡解离常数(KD)结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
10.如权利要求7所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合人和小鼠肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
11.如权利要求7所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合β-肌营养不良蛋白聚糖。
12. 如权利要求11所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含序列SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVAPPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO: 290)的多肽。
13. 如权利要求11所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含序列SIVVEWTNNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSEAPPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO: 291)的多肽。
14.如权利要求7所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合α-肌营养不良蛋白聚糖。
15.如权利要求7所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合人层粘连蛋白-2。
16. 如权利要求15的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对以低于1 µM的平衡解离常数(KD)结合人层粘连蛋白-2。
17.如权利要求7所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合小鼠和人层粘连蛋白-2。
18.如权利要求7所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4、层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5或这两者的多肽。
19.如权利要求18所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4和层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。
20. 如权利要求18所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含序列VQPQPVPTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFYMARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPKKADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYFDGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDAGIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRFRGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO: 300)的多肽。
21. 如权利要求18所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含序列QPEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESGLLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRTISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQRGTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTAVYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTTSIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO: 301)的多肽。
22.如权利要求18所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。
23. 如权利要求22所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含序列ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNGAGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLNQFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO: 292)的多肽。
24. 如权利要求22所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含序列ANAQRGTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTAVYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTTSIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO: 293)的多肽。
25. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH1结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:170组成。
26. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VL1结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:171、173、175、177、179、181、183、185、187或189组成。
27. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH1结构域由核酸序列SEQ ID NO:230编码。
28. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VL1结构域由核酸序列SEQ ID NO:231编码。
29. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:192组成。
30. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VL2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:193组成。
31. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH2结构域由核酸序列SEQ ID NO:252编码。
32. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VL2结构域由核酸序列SEQ ID NO:253编码。
33.如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合层粘连蛋白-2，并且其中VH2/VL2结合对结合肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
34.如权利要求33所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
35. 如权利要求34所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对以低于1 µM的平衡解离常数(KD)结合人肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
36.如权利要求33所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合人和小鼠肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分。
37.如权利要求33所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合β-肌营养不良蛋白聚糖。
38. 如权利要求37所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含序列SIVVEWTNN TLPLEPCPKE QIIGLSRRIA DENGKPRPAF SNALEPDFKA LSIAVTGSGS CRHLQFIPVAPPSPGSSAAP ATEVPDRDPE KSSEDD (SEQ ID NO: 290)的多肽。
39. 如权利要求37所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合包含序列SIVVEWTNNTLPLEPCP KEQIAGLSRR IAEDDGKPRP AFSNALEPDF KATSITVTGS GSCRHLQFIP VVPPRRVPSEAPPTEVPDRD PEKSSEDDV (SEQ ID NO: 291)的多肽。
40.如权利要求33所述的双特异性结合分子，其中VH2/VL2结合对结合α-肌营养不良蛋白聚糖。
41.如权利要求33所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合人层粘连蛋白-2。
42. 如权利要求41所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对以低于1 µM的平衡解离常数(KD)结合人层粘连蛋白-2。
43.如权利要求33所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合小鼠和人层粘连蛋白-2。
44.如权利要求33所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4、层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5或这两者的多肽。
45.如权利要求44所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域4和层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。
46. 如权利要求45所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含序列VQPQPVPTPAFPFPAP TMVHGPCVAE SEPALLTGSK QFGLSRNSHI AIAFDDTKVK NRLTIELEVR TEAESGLLFYMARINHADFA TVQLRNGFPY FSYDLGSGDT STMIPTKIND GQWHKIKIVR VKQEGILYVD DASSQTISPKKADILDVVGI LYVGGLPINY TTRRIGPVTY SLDGCVRNLH MEQAPVDLDQ PTSSFHVGTC FANAESGTYFDGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNG AGRFTAIYDAGIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLN QFGLTTNIRFRGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO: 300)的多肽。
47. 如权利要求45所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含序列QPEPVPTPAFP TPTPVLTHGP CAAESEPALL IGSKQFGLSR NSHIAIAFDD TKVKNRLTIE LEVRTEAESGLLFYMARINH ADFATVQLRN GLPYFSYDLG SGDTHTMIPT KINDGQWHKI KIMRSKQEGI LYVDGASNRTISPKKADILD VVGMLYVGGL PINYTTRRIG PVTYSIDGCV RNLHMAEAPA DLEQPTSSFH VGTCFANAQRGTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTAVYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTTSIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO: 301)的多肽。
48.如权利要求44所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含层粘连蛋白-2的层粘连蛋白G样(LG)结构域5的多肽。
49. 如权利要求48所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含序列ANAESGTYF DGTGFAKAVG GFKVGLDLLV EFEFRTTRPT GVLLGVSSQK MDGMGIEMID EKLMFHVDNGAGRFTAIYDA GIPGHMCNGQ WHKVTAKKIK NRLELVVDGN QVDAQSPNSA STSADTNDPV FVGGFPGGLNQFGLTTNIRF RGCIRSLKLT KGTGKPLEVN FAKALELRGV QPVSCPTT (SEQ ID NO: 292)的多肽。
50. 如权利要求48所述的双特异性结合分子，其中VH1/VL1结合对结合包含序列ANAQRGTYFDGTGFA KAVGGFKVGL DLLVEFEFRT TTTTGVLLGI SSQKMDGMGI EMIDEKLMFH VDNGAGRFTAVYDAGVPGHL CDGQWHKVTA NKIKHRIELT VDGNQVEAQS PNPASTSADT NDPVFVGGFP DDLKQFGLTTSIPFRGCIRS LKLTKGTGKP LEVNFAKALE LRGVQPVSCP AN (SEQ ID NO: 293)的多肽。
51. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:170组成。
52. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VL2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:171组成。
53. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH2结构域由核酸序列SEQ ID NO:230编码。
54. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VL2结构域由核酸序列SEQ ID NO:231编码。
55. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:192组成。
56. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VL2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO:193组成。
57. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VH2结构域由核酸序列SEQ ID NO:252编码。
58. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中VL2结构域由核酸序列SEQ ID NO:253编码。
59. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述VH1结构域由氨基酸序列SEQ IDNO: 170组成，所述VL1结构域由氨基酸序列SEQ ID NO: 171组成，所述VH2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO: 192组成，和所述VL2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO: 193组成。
60. 如权利要求1所述的双特异性结合分子，其中所述VH2结构域由氨基酸序列SEQ IDNO: 170组成，所述VL2结构域由氨基酸序列SEQ ID NO: 171组成，所述VH1结构域由氨基酸序列SEQ ID NO: 192组成，和所述VL1结构域由氨基酸序列SEQ ID NO: 193组成。
61.一种分离的核酸分子，其包含编码如权利要求1-60中任一项的双特异性结合分子的核苷酸序列。
62.一种包含如权利要求61的核酸分子的表达载体。
63.一种包含如权利要求61的核酸分子的分离的宿主细胞。
64.一种包含如权利要求62的表达载体的分离的宿主细胞。
65.一种载体系统，其包含编码如权利要求1的双特异性结合分子的两条轻链和两条重链的一种或多种载体。
66.一种分离的宿主细胞，其包含如权利要求65的载体系统。
67. 一种产生双特异性结合分子的方法，所述方法包括：
a) 在条件下培养如权利要求63所述的宿主细胞，所述条件使得所述宿主细胞表达所述双特异性结合分子；并且
b) 从所述宿主细胞分离所述双特异性结合分子。
68. 一种产生双特异性结合分子的方法，所述方法包括：
a) 在条件下培养如权利要求64所述的宿主细胞，所述条件使得所述宿主细胞表达所述双特异性结合分子；并且
b) 从所述宿主细胞分离所述双特异性结合分子。
69. 一种产生双特异性结合分子的方法，所述方法包括：
a) 在条件下培养如权利要求66所述的宿主细胞，所述条件使得所述宿主细胞表达所述双特异性结合分子；并且
b) 从所述宿主细胞分离所述双特异性结合分子。
70.如权利要求1-60中任一项的双特异性结合分子在制备用于在个体中治疗或预防α-肌营养不良蛋白聚糖病的药物中的用途。
71.如权利要求1-60中任一项的双特异性结合分子在制备用于在个体中提供层粘连蛋白-2与肌营养不良蛋白聚糖的细胞外部分之间的连接的药物中的用途。
72.如权利要求70或71所述的用途，其中所述个体具有降低的α-肌营养不良蛋白聚糖表达。
73.如权利要求70或71所述的用途，其中所述个体中表达的α-肌营养不良蛋白聚糖具有受损或异常的O-糖基化。
74. 如权利要求70或71所述的用途，其中所述个体具有在选自由肌营养不良蛋白聚糖(DAG1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-1 (POMT1)、蛋白质O-甘露糖基转移酶-2 (POMT2)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基1 (POMGNT1)、蛋白质O-连接的甘露糖β1,4-N-乙酰葡糖胺基转移酶亚基2 (POMGNT2)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶1 (LARGE1)、木糖基和葡糖醛酸基转移酶2 (LARGE2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基1 (DPM1)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基2 (DPM2)、磷酸多萜醇甘露糖基转移酶亚基3 (DPM3)、Fukutin、Fukutin相关蛋白(FKRP)、含类异戊二烯合酶结构域的蛋白(ISPD)、蛋白质O-甘露糖激酶(POMK)、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶2 (B3GALNT2)、β-1,4-葡糖醛酸基转移酶1(B4GAT1)、多萜醇激酶(DOLK)、跨膜蛋白5 (TMEM5)和GDP-甘露糖焦磷酸化酶B (GMPPB)组成的组的基因中的突变。
75.如权利要求70或71所述的用途，其中所述个体是人。
76.一种药物组合物，其包含如权利要求1-60中任一项所述的双特异性结合分子和药学上可接受的载体。
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