JP2004507251A - 癌の治療効果を増強するための方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、レチノイド処理によって発現が選択的にアップレギュレーションされている腫瘍抗原の同定に関する。本発明は、さらに、改良した癌治療の方法、及び、特に、レチノイン酸又は他のレチノイド類による、異常なＷｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる癌の治療の効果を高める方法に関する。

Description

【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、癌治療のための薬剤標的の同定に関する。特に、本発明は、レチノイド治療によって選択的に発現が増強する腫瘍抗原の同定、及びそのような抗原を標的化する治療方法に関する。
【０００２】
（関連するＡｒｔの記述）
癌の分子的機序を理解し、効果的な治療方法を考案する１つの手法は、癌細胞と正常細胞の間の遺伝子発現の相違を同定することである。定常期のｍＲＮＡレベルが正常と悪性細胞の間では異なるという仮定に基づいた方法は、特異的に発現した遺伝子をクローニングするために用いられ（Ｚｈａｎｇら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６： １２６８−１２７２（１９９７））、新規な薬剤標的の同定につながっている。
【０００３】
新生生物的な形質転換細胞の異常な成長と生存は、正常な細胞の恒常性を改変する潜在的な遺伝子の欠陥に起因する。Ｗｎｔシグナル伝達は、適切な動物及び細胞培養モデルが入手可能なヒト癌の高いパーセンテージの進行の一因である。Ｗｎｔシグナル伝達経路の重要な成分であるβ−カテニンは、転写因子であるＴＣＦ／ＬＥＦファミリーと相互作用し、Ｗｎｔ標的遺伝子の転写を活性化する。最近の研究によって、多くのタンパク質、例えば大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍サプレッサー、及びアキシンがＷｎｔシグナル伝達経路の制御に関わっていることが明らかになった。さらには、ＡＰＣ又はβ−カテニンでの変異が、多くのヒト癌の発生を担っていることが見出された。
【０００４】
例えば、結腸直腸癌の場合、ＡＰＣ腫瘍サプレッサーの不活性化は、腫瘍進行の早期におこり、サイクリンＤ及びｃ−ｍｙｃのような遺伝子の不適切な活性化から生じる生育の利点を提供する（Ｈｅ ら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１： １５０９−１５１２（１９９８）；Ｔｅｔｓｕ及びＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｎａｔｕｒｅ ３８：４２２−４２６（１９９９））。これらの遺伝子は、ＡＰＣによって通常はダウンレギュレーションされているタンパク質であるβ−カテニンとの相互作用によって活性化するＬＥＦ／ＴＣＦ転写因子の標的である（Ｂａｒｋｅｒら．， Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７７： １−２４（２０００）；Ｐｏｌａｋｉｓ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４： １８３７−１８５１（２０００））。癌でのこのシグナル伝達経路のアップレギュレーションは、β−カテニン遺伝子のミスセンス変異からも生じる可能性がある（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５： １７９０−１７９２（１９９７）；Ｋｏｒｉｎｅｋら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５：１７８４−１７８７（１９９７））。これらの変異は、β−カテニンタンパク質にＡＰＣによるダウンレギュレーションに対する不反応性を与える。β−カテニンは、幅広いヒト腫瘍で最近は同定されていて、特にヒト肝細胞癌に広く見られる（Ｐｏｌａｋｉｓ， ２０００， 上掲）。また、β−カテニンシグナル伝達の活性化は、細胞表面のフリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）レセプターが分泌Ｗｎｔリガンドによって刺激されておこる（Ｗｏｄａｒｚ及びＮｕｓｓｅ， Ａｎｎｕ Ｒｅｙ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １４：５９−８８（１９９８））。Ｗｎｔリガンドそれ自体がヒト癌の原因であるかどうか定かではないが、初期の実験は、、ネズミ乳腺でのその過剰発現が腫瘍形成性であることを示した（Ｎｕｓｓｅ及びＶａｒｍｕｓ， Ｃｅｌｌ ３１： ９９−１０９（１９８２））。結腸癌、乳癌、胃癌、肺癌、及びメラノーマを含む種々の癌の病因にＷｎｔシグナル伝達経路が関わっている。従って、種々の結腸直腸癌では、ＡＰＣ腫瘍サプレッサー又はβ−カテニンのどちらかをコードする遺伝子に変異を有する（Ｐｏｌａｋｉｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ９：１５−２１（１９９９））。β−カテニンの活性化変異は、卵巣及び子宮内膜の癌、ウィルムス腎臓腫瘍及びメラノーマでも同定されており、このことは、Ｗｎｔ−１シグナル伝達の欠損がこれらの癌の進行の原因であることを示している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら．， Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９０：５５−９（１９９９）； Ｋｏｅｓｔｅｒｓら．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９： ３８８０−２（１９９９）； Ｐａｌａｃｉｏｓ及びＨａｍａｌｌｏ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８： １３４４−７（１９９８）；Ｒｉｍｍら．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５４： ３２５−９（１９９９）；Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： １７３１−１７３４（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２： ６２５−９（１９９９））。
【０００５】
Ｗｎｔレセプターから発するシグナルは、ディシュベルド（ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）の活性化を介して起こると考えられていて、次にグリコーゲン合成キナーゼ３ｂ（ＧＳＫ３ｂ）をネガティブに制御する（Ｐｅｉｆｅｒ及びＰｏｌａｋｉｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７： １６０６−１６０９（２０００））。このキナーゼは、通常は、ユビキチン依存性分解に関するタンパク質を標的とするβ−カテニンの制御配列をリン酸化する（Ｍｉｌｌｅｒ及びＭｏｏｎ， Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ． １０： ２５２７−２５３９（１９９６））。従って、ＧＳＫ３ｂのネガティブ制御は、β−カテニンの安定性を増し、それによるＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子の活性化を引き延ばす（Ｍｏｌｅｎａａｒ，ら．， Ｃｅｌｌ ８６： ３９１−３９９（１９９６）； Ｂｅｈｒｅｎｓ，ら．， Ｎａｔｕｒｅ ３８２： ６３８−６４２（１９９６）。β−カテニンによるＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子の活性化は十分に立証されているが、さらなる機構がβ−カテニンが利用するであろう遺伝子活性化の転写因子とは無関係のままである。これら代替機構の１つが、レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）とβ−カテニンによるシグナル伝達間のクロストークの可能性の研究によって、Ｂｙｅｒｓ及び同僚達によって最近提案された（Ｅａｓｗａｒａｎ，ら．， Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ９：１４１５−１４１８（１９９９））。レチノイン酸応答エレメントを含有する合成レポーター遺伝子は、培養細胞株におけるβ−カテニンの過剰発現に続いて、レチノイドによってより強力に活性化される。
【０００６】
ヒトへの使用又は臨床試験の後期のどちらかのために認められた幾つかのモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）により、薬物療法としてのモノクローナル抗体の使用は、多く受け入れられるようになった。同種移植の拒絶反応の治療に関して、アメリカ合衆国食品医薬品庁（ＦＤＡ）が認可した最初のｍＡｂは１９８６年の抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）である。それ以来、ｍＡｂｓの分野の進歩のペースは相当に加速しており、特に１９９４年からの進歩はヒトの治療に関する更なる７つのｍＡｂｓの認可につながった。これらには、１９９４年の冠動脈血管形成の合併症の管理のためのレオプロ（ＲｅｏＰｒｏ）（登録商標）、１９９７年の同種移植の拒絶反応の予防のためのＺｅｎａｐａｘ（登録商標）（抗−ＣＤ２５）、１９９７年のＢ細胞非ホジキンリンパ腫の治療のためのリタキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（抗−ＣＤ２０）、最初は１９９８年のクローン病の治療のための、そしてその後に１９９９年のリュウマチ様関節炎の治療のためのインフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（登録商標）（抗−ＴＮＦ−α）、１９９８年の同種移植の拒絶反応の防ぐためのシムレクト（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ）（登録商標）（抗−ＣＤ２５）、１９９８年の呼吸感染症の治療のためのシナジス（Ｓｙｎａｇｉｓ）（登録商標）（呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳウイルス）の抗−Ｆタンパク質）、及び１９９８年のＨＥＲ２を過剰発現している転移性乳腫瘍の治療のためのハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（登録商標）（抗−ＨＥＲ２／ｎｅｕ）が含まれる（Ｇｌｅｎｎｉｅ及びＪｏｈｎｓｏｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２１： ４０３−４１０（２０００））。
【０００７】
臨床でのヒト癌の治療における治療抗体の証明された用途は、最近、免疫療法の発展と改良を目的とする強力な活性を拒絶した。理想的には、これらの療法は、体の至る所の正常組織上で存在しているのより、顕著により高いレベルで癌細胞上で発現する細胞表面抗原の存在を必要とする。正常細胞に対して腫瘍上での特異的発現に関するそのような基準は、免疫療法等の癌治療の標的として望ましいと考えられる抗原の数を明らかに限定する。従って、腫瘍細胞上での細胞表面抗原の発現を選択的に高める方法を見出すことは望ましい。特に、正常細胞に対して癌細胞の抗原発現のレベルを選択的に高める薬剤は、治療のための治療法指標、例えばこれら抗原に対する免疫療法剤の改善に大きな可能性を有する。
【０００８】
（発明の要約）
新規の薬剤の標的は、癌細胞株及び組織から単離したＲＮＡ転写物の特異的分析によって同定することができる。本発明の基礎を成す研究では、この手法を、形質転換及び非形質転換癌細胞の薬物療法に起因する遺伝子発現の違いを分析することによって発展させてきた。条件的にＷｎｔ−１プロトオンコジーンを発現する乳上皮細胞は、Ｗｎｔ−１発現の無い状態で９−シス レチノイン酸で未処理又は処理とした。細胞表面抗原を含む遺伝子の数は、Ｗｎｔ−１とレチノイン酸の組み合わせによって選択的にアップレギュレーションされた。この知見は、癌治療の効果、及び特に、Ｗｎｔシグナル伝達経路の関与によって特徴付けられる癌の免疫療法がレチノイン酸又は他のレチノイドの同時投与によって高めることができることを示している。
【０００９】
従って、本発明の一側面は、腫瘍細胞をレチノイドの有効量で治療することを含む、異常なＷｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる腫瘍細胞におけるタンパク質の発現の選択的増強の方法に関する。
特定の実施態様では、このタンパク質は、Ｗｎｔ−１とレチノイド処理の組み合わせによるその発現の相乗的な増強によって特徴付けられる。
好ましい実施態様では、このタンパク質は細胞表面タンパク質であり、対応する正常細胞と比較すると腫瘍で過剰発現する。例示的なタンパク質には、例えば、タンパク質４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、ＩＳＬＲ、オートタキシン及びＳｔｒａ６が含まれる。
【００１０】
この療法は、レチノイン酸を含む任意のレチノイドによっておこなうことができる。
特定の実施態様では、腫瘍は、例えば、卵巣癌、子宮体癌、ウィルムス腎臓腫瘍、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、又はメラノーマ等のヒト癌である。
その他の側面では、本発明は、Ｗｎｔ−１とレチノイド処理の組み合わせによって相乗的に発現が増強する腫瘍におけるタンパク質を標的とする抗腫瘍剤とレチノイドの組み合わせの有効量による腫瘍の治療を含む、異常なＷｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる腫瘍の治療のための方法に関する。
【００１１】
標的タンパク質は、好ましくは、例えば４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、ＩＳＬＲ、オートタキシン又はＳｔｒａ６等の細胞表面タンパク質である。レチノイドは、抗腫瘍剤の投与の前、と同時に、又はその後に投与されてもよい。
好ましい実施態様では、この抗腫瘍剤は抗体である。この開示を通して、「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディー、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多特異性抗体を含む。この抗体は、抗体断片を含むキメラ、ヒト化、又はヒト抗体であってもよい。
治療には、状況に応じて、例えば化学療法剤及び／又は放射線療法による付加的な治療が含まれる。
腫瘍は、好ましくは、例えば卵巣癌、子宮体癌、ウィルムス腎臓腫瘍、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、及びメラノーマ等のヒト癌である。
【００１２】
さらなる側面では、本発明は、腫瘍細胞をレチノイドと接触させ、そしてレチノイドによって選択的にアップレギュレーションされている遺伝子を同定することを含む、腫瘍治療のための標的遺伝子を同定する方法に関する。特に、標的遺伝子は、
（ａ）Ｗｎｔプロトオンコジーンを発現する細胞をレチノイドと接触させること；
（ｂ）細胞の遺伝子発現プロファイルを決定すること；及び
（ｃ）腫瘍治療の標的として、対応する未処理細胞と比較し、レチノイド処理によって選択的にアップレギュレーションされている遺伝子を同定することによって同定される。
【００１３】
好ましい実施態様では、腫瘍細胞をさらにＷｎｔ−１と接触させ、そしてレチノイド及びＷｎｔ−１によって発現が相乗的に増強するタンパク質を同定する。
よりその他の側面では、本発明は、
（ａ）腫瘍の試料をレチノイドとインキュベートすること；
（ｂ）インキュベーションの前及び後の試料の遺伝子発現プロファイルを決定すること；
（ｃ）レチノイドによって発現が増強する遺伝子を同定すること；及び
同定された遺伝子を標的化する抗腫瘍剤で患者を治療することの段階を含む、哺乳動物被検体の腫瘍の治療についての方法に関する。
【００１４】
好ましい実施態様では、試料をさらにＷｎｔ−１とインキュベートし、そしてレチノイド及びＷｎｔ−１の組み合わせによって発現が相乗的に増強する遺伝子が同定される。
前出の実施態様の通りに、抗腫瘍剤は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディー、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多特異性抗体を含む抗体であってもよい。この抗体又は抗体断片は、抗体断片を含むキメラ、ヒト化、又はヒト抗体であってもよい。
治療には、さらに、例えば、化学療法剤の投与で、その化学療法剤は、同定されたタンパク質と特異的に結合する抗体と状況に応じて融合している細胞毒性剤分子であってもよく、及び／又は放射線療法を含み得る。
【００１５】
よりその他の側面では、レチノイド処理によってアップレギュレーションされている腫瘍抗原の検出に基づく、哺乳動物患者の異常なＷｎｔシグナル伝達が関連している癌の診断の方法に関する。生物学的試料は、例えば、腫瘍又は組織であり得る。
よりさらなる側面では、本発明は、抗腫瘍剤を含む製造品、及びそのような抗腫瘍剤をレチノイン酸等のレチノイドの組み合わせで投与するための指示書に関する。製造品は、さらにレチノイドを含み得る。
【００１６】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ａ．定義
特に定義されなければ、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第２版．， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（ニューヨーク，ニューヨーク １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（コールド　スプリング　ハーバー，ニューヨーク １９８９）。本発明の目的のために、次の用語が下に定義されている。
「ＰＲＯ１０２８２ポリペプチド」、「ＰＲＯ１０２８２タンパク質」及び「ＰＲＯ１０２８２」、「Ｓｔｒａ６ポリペプチド」、「Ｓｔｒａ６タンパク質」及び「Ｓｔｒａ６」は互換的に用いられ、天然配列ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）及びＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチド変異体（ここでさらに定義される）を包含する。ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチドは、種々のソース、例えばヒト組織型、又はその他のソースから単離、又は組み換え体及び／又は合成法によって調製され得る。
【００１７】
「天然配列ＰＲＯ１０２８２」又は「天然配列Ｓｔｒａ６」は、天然由来のＰＲＯ１０２８２と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）は、自然から単離することもできるし、又は組換え又は合成手段により産生することもできる。「天然配列ＰＲＯ１０２８２」又は「天然配列Ｓｔｒａ６」という用語には、特に、特定のＰＲＯ１０２８２の自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異型（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様において、天然配列ＰＲＯ１０２８２は、図２（配列番号：２）のアミノ酸１から６６７を含む成熟又は完全長天然配列ＰＲＯ１０２８２である。本発明のその他の実施態様では、天然配列ＰＲＯ１０２８２ポリペプチドは、配列番号：５のアミノ酸１から６５８を含む成熟又は完全長ＰＲＯ１９５７８であり、配列番号：２の天然配列ＰＲＯ１０２８２の選択的にスプライシングされた形態であると考えられている。また、図２（配列番号：２）及び図７に開示のＰＲＯ１０２８２ポリペプチドがここでアミノ酸位置１として命名されているメチオニン残基で開始すると示されている一方で、図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）のアミノ酸位置１より上流又は下流のどちらかに位置する他のメチオニン残基がＰＲＯ１０２８２ポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられ得ることが考えられるし可能である。その５’末端で選択的にスプライシングされ得るすべてのＳｔｒａ６分子は、ここにおける定義に特に含まれている。
【００１８】
ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを原則的に有しないＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）の形態を指す。通常、ＰＲＯ１０２８２ＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを約１％未満、好ましくはそのようなドメインを約０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯ１０２８２に関する同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従って同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのどちらかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、本発明の一実施態様では、ＰＲＯ１０２８２ポリペプチドの細胞外ドメインは、Ｘが図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）のアミノ酸４９から５９の任意のアミノ酸である、アミノ酸１からＸを含む。
【００１９】
互換的に用いられる用語「ＰＲＯ１０２８２変異体ポリペプチド」又は「Ｓｔｒａ６変異体ポリペプチド」とは、（ａ）図２（配列番号：２）に示すＰＲＯ１０２８２ポリペプチドの残基１から６６７、又は図７（配列番号：５）の残基１から６５８、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）のアミノ酸４９から５９の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）の１からＸ、又は（ｃ）図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）に示すアミノ酸配列の他の特異的に誘導された断片のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する下記にて定義される活性ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチドを指す。このようなＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）変異体ポリペプチドには、例えば、図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）の配列の、１つ又はそれ以上の内部ドメイン内と同じく、Ｎ−及び／又はＣ−末端において１つ又は複数のアミノ酸残基が付加又は欠失したＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯ１０２８２ポリペプチド変異体は、（ａ）図２（配列番号：２）に示すＰＲＯ１０２８２ポリペプチドの残基１から６６７、又は図７（配列番号：５）の残基１から６５８、（ｂ）Ｘが図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）のアミノ酸４９から５９の任意のアミノ酸である、図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）の１からＸ、又は（ｃ）図２（配列番号：２）又は図７（配列番号：５）に示すアミノ酸配列の他の特異的に誘導された断片のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そしてより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ１０２８２変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長、たいていは少なくとも約３０アミノ酸長、たいていは少なくとも約４０アミノ酸長、たいていは少なくとも約５０アミノ酸長、たいていは少なくとも約６０アミノ酸長、たいていは少なくとも約７０アミノ酸長、たいていは少なくとも約８０アミノ酸長、たいていは少なくとも約９０アミノ酸長、たいていは少なくとも約１００アミノ酸長、たいていは少なくとも約１５０アミノ酸長、たいていは少なくとも約２００アミノ酸長、たいていは少なくとも約２５０アミノ酸長、たいていは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上であり、そして、Ｂｏｕｉｌｌｅｔら．， Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６３， １７３−１８６（１９９７）に開示されているマウスＳｔｒａ６配列の断片とは異なる。ここで開示されている他のポリペプチドの変異体は、類似様式で定義されている。
【００２０】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参考（例えばネガティブポリペプチド）配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基のパーセントとして定義されている。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが下記の図４Ａ−Ｏに提供されている配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所， ワシントンＤ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はジェネンテック社、サウス サン フランシスコ， カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の図４−Ｏに提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００２１】
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％ポジティブ値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによってポジティブであるとのスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なることは理解されるであろう。％アミノ酸配列同一性の計算の例として、図３Ａ−Ｂは、「比較タンパク質」と命名したアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と命名したアミノ酸配列との％アミノ酸配列同一性をどのようにして計算するのかを示している。
【００２２】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、上記のようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかし、％アミノ酸配列同一性値は、また、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードできる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
【００２３】
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００２４】
「４−１ＢＢリガンド」及び「４−１ＢＢＬ」という用語は互換的に用いられ、典型的には、抗原表示細胞及びその変異体上で発現し、腫瘍壊死因子スーパーファミリーに属する天然配列膜タンパク質を指す。天然ヒト４−１ＢＢリガンドの核酸及び推定アミノ酸配列は、Ｚｈｏｕら．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ４５： ６７−７３（１９９５）に開示されている。天然配列４−１ＢＢリガンドのアミノ酸配列変異体は、配列同一性を確かめるのと同じアルゴリズムを使用して、上にて論じたＳｔｒａ６タンパク質の類似体に基づいて定義されている。４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢ）のレセプターに対する抗体はマウスに定着した腫瘍を根絶することができ、そして４−１ＢＢ Ｔ細胞刺激経路は抗腫瘍免疫応答の増幅と関わっているとみなされている。
【００２５】
「エフリンｂ１」という用語は、Ｓｔｒａ６に関して上記で定義されている天然配列エフリンｂ１分子（「ｌｅｒｋ２」としても知られている）及びそれらの変異体についてここで説明するのに使用される。ヒトエフリンｂ１は、４５ｋＤａで、２４アミノ酸シグナル配列、２１１アミノ酸細胞外領域、２６アミノ酸膜貫通（ＴＭ）領域、そして８３アミノ酸細胞質セグメントを含む３４６アミノ酸グリコシル化ポリペプチドである（Ｄａｖｉｓ， ら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６： ８１６（１９９４）； Ｂｅｃｋｍａｎ， ら．， ＥＭＢＯ Ｊ １３：３６５７（１９９４））。マウスとヒトエフリンｂ１ポリペプチドの細胞外領域の間には、約９５％のアミノ酸配列同一性がある。エフリンｂ１上の潜在的なタンパク質分解性切断部位が同定されている（Ｂｅｃｋｍａｎら．， 上掲）。血管形成及び腫瘍進行でのエフリンの役割が、例えば、Ｌ’Ａｌｌｅｍａｉｎら．， Ｂｕｌｌ Ｃａｎｃｅｒ ８７： ５２９−５３０（２０００）で論じられている。
「ＩＳＬＲ」、「ロイシンリッチリピートを含有する免疫グロブリンスーパーファミリー」、及び「ＬＲＲを含有する免疫グロブリンスーパーファミリー」という用語は互換的に用いられ、上文で定義したように、天然配列ＩＳＬＲタンパク質及びそれらの変異体を指す。天然ヒトＩＳＬＲタンパク質のクローニング及びシーケンシングは、Ｎａｇａｓａｗａら．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４： １７３−１７９（１９９７）によって報告されている。さらなるヒト及びマウスＩＳＬＲ遺伝子がＮａｇａｓａｗａら．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４４： １７３−１７９（１９９７）に記載されている。
【００２６】
「オートタキシン」及び「ＡＴＸ」という用語は互換的に用いられ、上文で定義したように、任意の動物、及びオートタキシン変異体の天然配列オートタキシン分子を指す。オートタキシンは癌関連自己分泌型運動促進因子であり、細胞膜分化抗原ＰＣ−１と顕著な相同性を示す。ヒトオートタキシンは、元々はヒトメラノーマ細胞株から単離した１２５−ｋＤａで、９１５ａａの糖タンパク質である（Ｍｕｒａｔａら．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９： ３０４７９−８４（１９９４））。ヒト奇形芽腫細胞からのオートタキシンのクローニングは、Ｌｅｅら．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１８： ７１４−７１９（１９９６）によって報告されている。オートタキシンは、ＡＴＰのベータ−リン酸塩のどちらかの側にあるリン酸ジエステル結合の加水分解を触媒し、また、ＧＴＰのＧＤＰ及びＧＭＰへの、ＡＭＰ又はＰＰｉのＰｉへの加水分解、そしてＮＡＤのＡＭＰへの加水分解を触媒する。これら各基質は、オートタキシンのリン酸化におけるリン酸供与体としての役割を担う。オートタキシンは、潜在的な腫瘍モトゲンと考えられており、ｒａｓ−形質転換細胞の浸潤性と転移性を高める（Ｎａｍら．， １９： ２４１−２４７（２０００））。
【００２７】
「レチノイド」という用語は広い意味で用いられ、特に、限定せずに、レチノイン酸（トレチノイン、ビタミンＡ酸又はビタミンＡ１としても知られる）、及び頭−尾様式で結合している４つのイソプレノイド単位から成るレチノイン酸誘導体、例えばレチノール、レチナール、置換レチノイド、セコ−、ノーア、及びレトロ−レチノイドである。すべてのレチノイドは、５つの炭素−炭素二重結合及び非環式部分の末端に官能基を含む単環式親化合物から正式的に誘導され得る。レチノイドの命名法については、Ｍｏｓｓ， Ｇ．Ｐ．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２２４： ７２８−７３１（１９８３）； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １２９： １−５（１９８２）； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５８： ５３２９−５３３３（１９８３）； Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ． Ｃｈｅｍ．， ５５： ７２１−７２６（１９８３）； Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ， 第２版、Ｐｏｒｌａｎｄ Ｐｒｅｓｓ， １９９２， ２４７項−２５１項。「レチノイド」という用語には、特に、レチノイドの生物学的活性を保持している限り、天然で生じる分子及びそれらの誘導体が含まれる。
ここで定義される「レチノイドの生物学的活性」という用語は、胚形成、（上皮の）細胞増殖、細胞分化及び／又は発癌、特に、異常なＷｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる癌と関連している発癌作用との関わりを指す。
【００２８】
「Ｗｎｔ」という用語は、初期の胚発生の重要な側面に関わっている、高度に保存され、システインリッチである分泌糖タンパク質のファミリーを指す。Ｗｎｔ遺伝子は、癌にも関わっている。ここで用いられている「Ｗｎｔ」には、特に、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラット及び他のげっ歯類等を含む、すべてのヒト及び非ヒト動物種の遺伝子が含まれている。「Ｗｎｔ」という用語には、特に、天然ヒトＷｎｔ遺伝子及びコードされたポリペプチドが含まれ、それには、ヒトＷｎｔ−１（以前はｉｎｔ−１と呼ばれていた）（ｖａｎ Ｏｏｙｅｎら．， ＥＭＢＯ Ｊ ４： ２９０５−９（１９８５））；Ｗｎｔ−２（以前はＤｉｎｔ−１と呼ばれていた）（Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔら．，　ＥＭＢＯ Ｊ ７： １７４３−１７４８（１９８８））；Ｗｎｔ−１３（Ｋａｔｏｈら．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １３： ８７３−８７６（１９９６））；Ｗｎｔ−３（Ｒｏｅｌｉｎｋら．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７：７９０−７９２（１９９３））；Ｈｕｇｕｅｔら．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５４： ２６１５−２５２１（１９９４））；Ｗｎｔ−４（Ｈｕｇｕｅｔら．， １９９４， 上掲）；Ｗｎｔ−５Ａ（Ｃｌａｒｋら．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １８： ２４９−２６０（１９９３））；Ｗｎｔ−６（Ｒａｎｋｉｎら．， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ８４： ５０−５２（１９９９））；Ｗｎｔ−７Ａ（Ｉｋｅｇａｗａら．， Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ ７４： １４９−１５２（１９９６））；Ｗｎｔ−７Ｂ（Ｈｕｇｕｅｔら．， １９９４， 上掲）；Ｗｎｔ−８Ｂ（Ｌａｋｏら．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５： ３８６−３８８（１９９６））；Ｗｎｔ−１０Ｂ（Ｂｕｉら．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４： １２４９−１２５３（１９９７））；Ｗｎｔ−１１（Ｌａｋｏら．， Ｇｅｎｅ ２１９： １０１−１１０（１９９８））；Ｗｎｔ−１４（Ｂｅｒｇｓｔｅｉｎら．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４６： ４５０−４５８（１９９７））；及びＷｎｔ−１６（ＭｃＷｈｉｒｔｅｒら．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６： １１４６４−１１４６９（１９９９）； Ｆｅａｒら．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２７８： ８１４−８２０（２０００））、及びそれらの変異体、特にアミノ酸配列変異体で、配列同一性が上文で定義したような天然Ｗｎｔポリペプチドと、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、さらに、より好ましくは少なくとも約９８％、、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性有するものが含まれる。好ましい実施態様では、「Ｗｎｔ」という用語は、Ｗｏｎｇら．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：６２７−８６（１９９４）で論じられている任意のトランスフォーミング（オンコジーン）Ｗｎｔポリペプチドを指す。
【００２９】
遺伝的欠陥を有し、及び／又はＷｎｔシグナル伝達経路のどちらかのメンバーの変化した発現パターン（変異、増幅、過剰発現及び／又は抑制）を示すならば、癌は「異常なＷｎｔシグナル伝達によって特徴付け」られる。Ｗｎｔは、「フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）」と名付けられた細胞表面レセプターとの相互作用を介してそれらの作用を発揮する。構造的には、フリズルドレセプターは、細胞外Ｗｎｔ−結合ドメイン、７つの膜貫通架橋領域、そして細胞内Ｃ末端尾部を有する。フリズルドレセプター−Ｗｎｔ相互作用経路の付加的な成分は可溶性Ｗｎｔ阻害剤であり、それはフリズルドレセプターのリガンド結合ドメインのものに類似するシステインリッチドメイン（ＣＤＲ）を含有する分泌タンパク質で構成されている。これらのＷｎｔ阻害性タンパク質は、集約的にフリズルドレセプター様タンパク質（ＦＲＰｓ）と呼ばれている。フリズルドレセプターは、細胞内ドメインに酵素的モチーフを有しないので、Ｗｎｔシグナルは、ディシュベルド（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ）（ｄｓｈ）タンパク質とカップリングするレセプターを介して伝達されると考えられている。Ｗｎｔシグナル伝達カスケードの次の段階は、ディシュベルドによるセリン／スレオニンキナーゼであるグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３ｂ（ＧＳＫ−３ｂ）の阻害である。ＧＳＫ−３ｂ活性のＷｎｔ誘導による阻害の結果とは、カスケードの次のタンパク質であるβ−カテニンが安定していることである。β−カテニンの中央領域は、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）遺伝子座コードタンパク質、転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦ１、及びカルシウム依存性細胞接着分子であるカドへリンファミリーのの酸性領域と相互作用すると考えられているポジティブに負荷した溝を含んでいる。ＡＰＣ及びβ−カテニンを含むＷｎｔシグナル伝達経路は、結腸癌、乳癌、肝細胞癌、及びメラノーマを含む一連のヒト癌の症状に関係しているとみなされている（Ｍｏｒｉｎら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５： １７８７−１７９０（１９９７））。どちらかの遺伝子の特定領域での変異は、ＷＩＳＰ遺伝子のような、標的遺伝子の活性化を介するヒト発癌の原因であると考えられる細胞質内β−カテニンの安定化及び蓄積をおこすことが可能である（Ｐｅｎｎｉｃａら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １４１７−１４７２２（１９９８））。Ｗｎｔ−１遺伝子の変異は、子供に見られる腎臓癌であるウィルムス腫瘍の発生にも関係している。上にて論じたように、Ｗｎｔシグナル伝達経路のさらなるメンバーには、限定せずに、Ｗｎｔ遺伝子ファミリーの他のメンバー、フリズルドレセプター、細胞質内タンパク質ディシュベルド（Ｄｓｈ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３ｂ）、転写因子ＴＣＦ／ＬＥＦ１、及び転写によって活性化された経路の下流の成分、例えばノーダル（ｎｏｄａｌ）−関連３遺伝子、Ｘｎｒ３、ホメオボックス遺伝子、ｅｎｇｒａｉｌｅｄ、グースコイド（ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ）、ｔｗｉｎ （Ｘｔｗｎ） 遺伝子、及びｓｉａｍｏｉｓ、ｃ−ｍｙｃ、ＷＩＳＰ−１及びＷＩＳＰ−２などのＷＩＳＰ遺伝子が含まれる。「異常Ｗｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる」という用語には、今日知られている又は下文で同定される、遺伝的欠陥及び／又はＷｎｔシグナル伝達経路のこれらメンバーのどちらかの改変発現パターン（変異、増殖、過剰発現及び／又は抑制を含む）、又は任意の他のメンバーが含まれる。
【００３０】
腫瘍、例えば癌での抗原の発現の増大は、腫瘍細胞でのそのような抗原の発現レベルの増大が正常細胞より顕著に高いならば、「選択的」である。好ましくは、腫瘍細胞での標的抗原（例えば、細胞表面抗原）の発現レベルの増大は、対応する正常（非腫瘍性）細胞又は組織と比べて、腫瘍細胞又は組織において少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約３倍、さらにより好ましくは少なくとも約５倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍の過剰発現を引き起こす。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
【００３１】
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定な例としては、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。特に、本発明による治療を施せる癌には、卵巣癌、子宮内膜腫瘍、ウィルムス腎臓腫瘍、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、及びメラノーマが含まれる。
【００３２】
「治療」とは、疾患の病理の進展を予防すること、或いはそれを改善することを意図することを行う介入である。従って、「治療」とは、治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治療を必要するものは、既に疾患に罹っているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。腫瘍（例えば、癌）治療では、治療薬は直接に腫瘍細胞の病理を低下させ得るし、又は腫瘍細胞を他の治療媒介物、例えば放射線及び／又は化学治療に対してより敏感にし得る。
癌の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化などを含む。
【００３３】
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
１つ又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
「抗体」（Ａｂ）と「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンは、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含むものである。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
【００３４】
「天然抗体及び天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンの異種四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、異なる免疫グロブリンアイソタイプ重鎖中のジスルフィド結合の数は相違する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した部位との間で鎖内ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインに続いて可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａら．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８６： ６５１［１９８５］； Ｎｏｖｏｔｏｎｙ及びＨａｂｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８２： ４５９２［１９８５］； Ｃｈｏｔｈｉａら．， Ｎａｔｕｒｅ ３４２： ８７７−８８３［１９８９］）。
【００３５】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を称する。しかし、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲ領域をそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔ等， （１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害活性への抗体の関与を示す。
【００３６】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、α，δ，ε，γ及びμとそれぞれ呼ばれている。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元構造は良く知られている。
【００３７】
「抗体」という用語には、無傷の免疫グロブリンのすべてのクラス及びサブクラスが含まれる。また、「抗体」という用語は、抗体断片を含む。「抗体」という用語は、特に抗体断片クローンを含むモノクローナル抗体を含む。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００３８】
ここで用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（又は抗体断片）を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらには、概して異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来型（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性の他に、ハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによる混入がないという点で、モノクロナール抗体は有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示すものであって、ある特定の方法による抗体の産生を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６： ４９５ ［１９７５］に最初に記載されたハイブリドーマ法によって作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作成してもよい。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２： ６２４−６２８ ［１９９１］及び Ｍａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１−５９７ （１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離した抗体断片（Ｆｖクローン）を含む抗原認識及び結合部位のクローンを含む。
【００３９】
ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、それは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、それらの抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： ６８５１−６８５５ ［１９８４］）。
【００４０】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントＣＤＲ由来の残基が、マウス、ラット又はウサギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移植されるＣＤＲ又は枠配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有するであろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ ３２１： ５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ ３３２： ３２３−３２９ （１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２： ５９３−５９６ （１９９２）；及びＣｌａｒｋ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ２１： ３９７−４０２（２０００）を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が対象である抗原で免疫化したマカクザルによって産生された抗体から誘導したＰｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商品名）抗体が含まれる。
【００４１】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ及びＣａｒｔｅｒ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ８： ４４３−４５０（１９９８）、及びＨｕｄｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１：５４８−５５７（１９９９）を参照のこと。
【００４２】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を不可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）に更に詳細に記載されている。
【００４３】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の夾雑成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー（Ｌｏｗｒｙ）法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは（３）非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色によって、均一になるまで精製されうる。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００４４】
「中和抗体」とは、それが結合する標的抗原のエフェクター機能を除く又は顕著に減じることができる抗体分子を意味する。
ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸バッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００４５】
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、「標識」抗体が生成されるように、抗体に直接又は間接的に抱合している検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
【００４６】
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
【００４７】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯ１０２８２ポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
「アップレギュレーション」という用語は、広い意味で用いられ、例えば、ｍＲＮＡレベルの定量化によって測定される遺伝子発現の誘導及び／又は増大を指す。
「遺伝子増幅」及び「遺伝子重複」なる語句は互換的に用いられ、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系で生成されるプロセスを意味する。重複された領域（増幅されたＤＮＡの伸長）は、しばしば「単位複製配列」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
【００４８】
「抗腫瘍剤」又は「抗癌剤」という用語は広い意味で用いられ、癌の治療に有用な任意の分子含む。そのような分子には、限定されずに、ポリペプチド（タンパク質を含む）、例えば抗体、ペプチド、有機及び無機小分子、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子等が含まれる。
ここで用いられる「細胞傷害性剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。限定されることなく、この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとされる。この用語には特に、メイタンシン及びメイタンシノイド、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチン、及びエスペラマイシ（米国特許第５，８７７，２９６号）と同じように米国特許第５，０５３，３９５号及び５，７７０，７１０号に記載の薬剤のファミリーが含まれる。
【００４９】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、タキソイド類、例えばパクリタキセル（タキソール， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，　プリンストン， ニュージャージー）及びドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）（タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）， Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， アントニー， フランス）、トキソテール、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、カルボプラチン、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、ダウノマイシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、５−ＦＵ、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、アクチノマイシンＤ、ＶＰ−１６、クロランブシル、メルファラン、及び他の関連したナイトロジェンマスタードが含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン及びオナプリストーン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）が含まれる。
【００５０】
ここで使用される場合の「成長阻害剤」とは、インビトロ又はインビボのどちらかにおいて、特にここで同定された任意の遺伝子を過剰発現する細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、成長阻害剤とは、Ｓ期におけるそのような遺伝子の過剰発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。成長阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行をブロックする薬剤（Ｓ期以外の場所において）、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、及びａｒａ−ＣがＳ期停止へも波及する。更なる情報は、Ｍｕｒａｋａｍｉらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬（Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ）」と題された、癌の分子的基礎（Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ編、第１章（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）、特に１３頁に見出すことができる。
【００５１】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、（８Ｓ−シス）−１０−［（３−アミノ−２，３，６−トリデオキシ−Ｌ−リキソ−ヘキサピラノシル）オキシ］−７，８，９，１０−テトラヒドロ−６，８，１１−トリヒドロキシ−８−（ヒドロキシアセチル）−１−メトキシ−５，１２−ナフタセンジオンである。
【００５２】
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−α及び−β；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦｓ）；インシュリン様成長因子−Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘発因子；インターフェロン−α、−β、及び−γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；及び顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ−α及びＴＮＦ−β；及びＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的な活性等価物を含む。
【００５３】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Ｗｉｌｍａｎ， 「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ， １４， ：３７５−３８２， ６１５ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ， Ｂｅｌｆａｓｔ （１９８６），及びＳｔｅｌｌａ 等， 「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ： Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ等（編）， ２４７−２６７項， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ （１９８５）参照。本発明のプロドラッグは、これらに限られないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞傷害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００５４】
ここに開示されるポリペプチドの「有効量」とは、腫瘍性細胞成長、腫瘍又は癌細胞成長の阻害に関しては、標的細胞の成長をある程度阻害できる量である。この用語には、標的細胞の成長阻害、細胞分裂停止及び／又は細胞傷害性効果及び／又はアポトーシスを誘起することのできる量が含まれる。腫瘍性細胞成長、腫瘍又は癌細胞成長の阻害に関するポリペプチドアンタゴニストの「有効量」は、経験的に、そして常套手段によって決定することができる。
【００５５】
「治療的有効量」は、腫瘍の治療に関しては、次の効果：（１）遅延化及び完全な成長停止を含む、腫瘍成長の或る程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの縮小；（４）腫瘍細胞の末梢器官への浸潤の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な停止）；（５）転移の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な停止）；（６）抗腫瘍免疫反応の促進、これは、腫瘍の退行又は拒絶をもたらしてもよいが、必ずしも必要ではない；及び／又は（７）疾患に伴う徴候の１つ又は複数の或る程度の軽減の１つ又は複数を誘起することのできる量を意味する。腫瘍の治療を目的とした、抗腫瘍剤の「治療的有効量」は、経験的に、そして常套手段によって決定することができる。
【００５６】
抗腫瘍剤の「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害できる量である。
抗腫瘍剤の「細胞傷害性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のための「細胞傷害性量」は、経験的に日常的手法で決定できる。
【００５７】
「アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド」又は「アンチセンスオリゴヌクレオチド」（互換的に使用される用語である）は配列特異的な方法で標的遺伝子の転移及び／又は翻訳を抑制することができる核酸分子と定義される。「アンチセンス」なる用語は、核酸が標的遺伝子のコード化（「センス」）遺伝子配列に相補的であることを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドはワトソン−クリック塩基対から新生ｍＲＮＡに対して逆方向にハイブリダイズする。標的ｍＲＮＡ鋳型の結合により、アンチセンスオリゴヌクレオチドはコードタンパク質の最終的な翻訳を阻害する。この用語には、特に、天然の自己スプライシング活性を有する配列の付加によって標的ＲＮＡの触媒切断を誘発するとして命名された「リボゾーム」と呼ばれるアンチセンス物質が含まれる（Ｗａｒｚｏｃｈａ 及び Ｗｏｔｏｗｉｅｃ， 「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ」ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．」Ｌｅｕｋ． Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２４：２６７−２８１［１９９７］）。
「治療指標」という用語は、毒性濃度と治療抗体等の薬物の有効濃度の間の割合を指す。
【００５８】
Ｂ．詳細な説明
上にて論じたように、Ｗｎｔシグナル伝達経路の幾つかの成分は、ヒト腫瘍又は実験用癌モデルに関わっているとみなされている。Ｗｎｔ−１は、マウス乳癌のマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）によって活性化されるオンコジーンとして見出された（Ｎｕｓｓｅ及びＶａｒｍｕｓ， Ｃｅｌｌ ３１： ９９−１０９（１９８２））。Ｗｎｔの他のメンバーである、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍サプレッサーは、最初はヒト結腸癌から単離された（Ｐｏｌａｋｉｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３３２（３）： Ｆ１２７−４７（１９９７）に概説されている）。ＡＰＣとβ−カテニンが互いに結合することが証明された後、ヒトβ−カテニン遺伝子の活性化変異がヒト結腸癌及びメラノーマに見出された（Ｍｏｒｉｎら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５： １７５−５３（１９９７））。癌におけるＷｎｔシグナル伝達の役割の概説については、例えばＰｏｌａｋｉｓ， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １４： １８３７−５１（２０００）及びＢｉｅｎｚ及びＣｌｅｖｅｒｓ， Ｃｅｌｌ １０３： ３１１−２０（２０００）を参照せよ。
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達によって引き起こされる腫瘍の、免疫療法のような治療の効果の強化に関する。
【００５９】
１．腫瘍治療のための遺伝子標的の同定
本発明の一側面では、腫瘍治療のための薬物の標的は、腫瘍細胞のレチノイド処理に起因する遺伝子発現の違いを分析することで同定される。特に、本発明は、癌治療の標的としてのＷｎｔ形質転換細胞をレチノイン酸等のレチノイドで処理することによって優先的にアップレギュレーションされる抗原の同定に関する。好ましい遺伝子標的は、細胞表面タンパク質を発現し、レチノイド処理とＷｎｔシグナル伝達によって相乗的にアップレギュレーションされるものである。
【００６０】
ａ．遺伝子発現プロファイリング
試料中のｍＲＮＡ発現を定量化するために、当該分野で最も広く用いられている方法には、ノーザンブロット及びインサイツハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ ＆ Ｂａｒｎｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６： ２４７−２８３（１９９９）；リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ｈｏｄ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３： ８５２−８５４（１９９２）；及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ？ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８： ２６３−２６４（１９９２））が含まれる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ濡重鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識できる抗体を用いてもよい。
【００６１】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ − ＰＣＲ）
上に列挙した技術の中で、最も感度があって、最も柔軟性がある定量方法はＲＴ−ＰＣＲであり、それは、遺伝子発現もパターンを特徴付け、密接に関連しているｍＲＮＡ間を区別し、そしてＲＮＡ構造を分析するために、薬物療法が伴う又は伴わずに、異なる試料集団、正常及び腫瘍組織のｍＲＮＡレベルを比較するために用いることができる。
最初の段階は、標的試料からのｍＲＮＡの単離である。出発材料は、概して、ヒト腫瘍又は腫瘍細胞株、及び対応する正常組織又は細胞株からそれぞれ単離した全ＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、健康な供与体のプールしたＤＮＡとともに、乳房、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮等の腫瘍、又は腫瘍細胞株を含む種々の原発腫瘍から単離できる。ｍＲＮＡのソースが原発腫瘍であるならば、ｍＲＮＡは、例えば、凍結又は所定期間パラフィン包理及び固定（例えば、ホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。
【００６２】
腫瘍細胞株は、すべてＡＴＣＣから入手可能なＡ５４９（ＳＲＣＣ７６８）、Ｃａｌｕ−１（ＳＲＣＣ７６９）、Ｃａｌｕ−６（ＳＲＣＣ７７０）、Ｈ１５７（ＳＲＣＣ７７１）、Ｈ４４１（ＳＲＣＣ７７２）、Ｈ４６０（ＳＲＣＣ７７３）、ＳＫＭＥＳ−１（ＳＲＣＣ７７４）、ＳＷ９００（ＳＲＣＣ７７５）、Ｈ５２２（ＳＲＣＣ８３２）、及びＨ８１０（ＳＲＣＣ８３３）等のヒト肺癌細胞株を含む種々の原発腫瘍から単離できる。原発肺腫瘍細胞は、通常は腺癌、扁平上皮細胞癌、大細胞癌、非−小細胞癌、小細胞癌、及び気管支肺胞癌から誘導され、例えば、ＳＲＣＣ７２４（「ＡｄｅｎｏＣａ」と略記される扁平上皮細胞癌）（ＬＴ１）、ＳＲＣＣ７２５（「ＳｑＣＣａ」と略記される非−小細胞癌）（ＬＴ１ａ）、ＳＲＣＣ７２６（「ＡｄｅｎｏＣａ」と略記される腺癌）（ＬＴ２）、ＳＲＣＣ ７２７（腺癌）（ＬＴ３）、ＳＲＣＣ７２８（腺癌）（ＬＴ４）、ＳＲＣＣ７２９（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ６）、ＳＲＣＣ７３０（腺／扁平上皮細胞癌）（ＬＴ７）、ＳＲＣＣ７３１（腺癌）（ＬＴ９）、ＳＲＣＣ７３２（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ１０）、ＳＲＣＣ７３３（ＬＴ１１）、ＳＲＣＣ７３４（腺癌）（ＬＴ１２）、ＳＲＣＣ７３５（腺／扁平上皮細胞癌）（ＬＴ１３）、ＳＲＣＣ７３６（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ１５）、ＳＲＣＣ７３７（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ１６）、ＳＲＣＣ７３８（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ１７）、ＳＲＣＣ７３９（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ１８）、ＳＲＣＣ７４０（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ１９）、ＳＲＣＣ７４１（肺細胞癌、「ＬＣＣａ」と略記）（ＬＴ２１）、ＳＲＣＣ８１１（腺癌）（ＬＴ２２）、ＳＲＣＣ８２５（腺癌）（ＬＴ８）、ＳＲＣＣ８８６（腺癌）（ＬＴ２５）、ＳＲＣＣ８８７（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ２６）、ＳＲＣＣ８８８（ａｄｅｎｏ−ＢＡＣ癌）（ＬＴ２７）、ＳＲＣＣ８８９（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ２８）、ＳＲＣＣ８９０（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ２９）、ＳＲＣＣ８９１（腺癌）（ＬＴ３０）、ＳＲＣＣ８９２（扁平上皮細胞癌）（ＬＴ３１）、ＳＲＣＣ８９４（腺癌）（ＬＴ３３）を含む。また、ＳＲＣＣ１１２５［ＨＦ−０００６３１］、ＳＲＣＣ１１２７［ＨＦ−０００６４１］、ＳＲＣＣ１１２９［ＨＦ−０００６４３］、ＳＲＣＣ１１３３［ＨＦ−０００８４０］、ＳＲＣＣ１１３５［ＨＦ−０００８４２］、ＳＲＣＣ１２２７［ＨＦ−００１２９１］、ＳＲＣＣ１２２９［ＨＦ−００１２９３］、ＳＲＣＣ１２３０［ＨＦ−００１２９４］、ＳＲＣＣ１２３１［ＨＦ−００１２９５］、ＳＲＣＣ１２３２［ＨＦ−００１２９６］、ＳＲＣＣ１２３３［ＨＦ−００１２９７］、ＳＲＣＣ１２３５［ＨＦ−００１２９９］、及びＳＲＣＣ１２３６［ＨＦ−００１３００］と命名されたヒト肺腫瘍も含まれる。
【００６３】
結腸癌細胞系は、例えば、ＡＴＣＣ細胞系ＳＷ４８０（腺癌、ＳＲＣＣ７７６）、ＳＷ６２０（結腸腺癌のリンパ節転移、ＳＲＣ７７７）、Ｃｏｌｏ３２０（癌、ＳＲＣＣ７７８）、ＨＴ２９（腺癌、ＳＲＣＣ７７９）、ＨＭ７（ＡＴＣＣ大腸腺癌細胞系ＬＳ１７４Ｔの高ムシン産生変異体、ＳＲＣＣ７８０、Ｒｏｂｅｒｔ Ｗａｒｒｅｎ博士， ＵＣＳＦから得た）、ＣａＷｉＤｒ（腺癌、ＳＲＣＣ７８１）、ＨＣＴ１１６（癌、ＳＲＣＣ７８２）、ＳＫＣＯ１（腺癌、ＳＲＣＣ７８３）、ＳＷ４０３（腺癌、ＳＲＣＣ７８４）、ＬＳ１７４Ｔ（癌、ＳＲＣＣ７８５）、Ｃｏｌｏ２０５（癌、ＳＲＣＣ８２８）、ＨＣＴ１５（癌、ＳＲＣＣ８２９）、ＨＣＣ２９９８（癌、ＳＲＣＣ８３０）、及びＫＭ１２（癌、ＳＲＣＣ８３１）を含む。原発結腸腫瘍は、ＣＴ２（ＳＲＣＣ７４２）、ＣＴ３（ＳＲＣＣ７４３）、ＣＴ８（ＳＲＣＣ７４４）、ＣＴ１０（ＳＲＣＣ７４５）、ＣＴ１２（ＳＲＣＣ７４６）、ＣＴ１４（ＳＲＣＣ７４７）、ＣＴ１５（ＳＲＣＣ７４８）、ＣＴ１６（ＳＲＣＣ７４９）、ＣＴ１７（ＳＲＣＣ７５０）、ＣＴ１（ＳＲＣＣ７５１）、ＣＴ４（ＳＲＣＣ７５２）、ＣＴ５（ＳＲＣＣ７５３）、ＣＴ６（ＳＲＣＣ７５４）、ＣＴ７（ＳＲＣＣ７５５）、ＣＴ９（ＳＲＣＣ７５６）、ＣＴ１１（ＳＲＣＣ７５７）、ＣＴ１８（ＳＲＣＣ７５８） 、ＣＴ１９（腺癌、ＳＲＣＣ９０６）、ＣＴ２０（腺癌、ＳＲＣＣ９０７）、ＣＴ２１（腺癌、ＳＲＣＣ９０８）、ＣＴ２２（腺癌、ＳＲＣＣ９０９）、ＣＴ２３（腺癌、ＳＲＣＣ９１０）、ＣＴ２４（腺癌、ＳＲＣＣ９１１）、ＣＴ２５（腺癌、ＳＲＣＣ９１２）、ＣＴ２６（腺癌、ＳＲＣＣ９１３）、ＣＴ２７（腺癌、ＳＲＣＣ９１４）、ＣＴ２８（腺癌、ＳＲＣＣ９１５）、ＣＴ２９（腺癌、ＳＲＣＣ９１６）、ＣＴ３０（腺癌、ＳＲＣＣ９１７）、ＣＴ３１（腺癌、ＳＲＣＣ９１８）、ＣＴ３２（腺癌、ＳＲＣＣ９１９）、ＣＴ３３（腺癌、ＳＲＣＣ９２０）、ＣＴ３５（腺癌、ＳＲＣＣ９２１）及びＣＴ３６（腺癌、ＳＲＣＣ９２２）と称される結腸腺癌を含む。ＳＲＣＣ１０５１［ＨＦ−０００４９９］、ＳＲＣＣ１０５２［ＨＦ−０００５３９］、ＳＲＣＣ１０５３［ＨＦ−０００５７５］、ＳＲＣＣ１０５４［ＨＦ−０００６９８］、ＳＲＣ１０５９［ＨＦ−０００７５５］、ＳＲＣＣ１０６０［ＨＦ−０００７５６］、ＳＲＣ１１４２［ＨＦ−０００７６２］、ＳＲＣＣ１１４４［ＨＦ−０００７８９］、ＳＲＣ１１４６［ＨＦ−０００７９５］及びＳＲＣＣ１１４８［ＨＦ−０００８１１］と称されるヒト結腸腫瘍も含まれる。
【００６４】
ヒト乳癌細胞株は、例えば、ＨＢＬ１００（ＳＲＣＣ７５９）、ＭＢ４３５ｓ（ＳＲＣＣ７６０）、Ｔ４７Ｄ（ＳＲＣＣ７６１）、ＭＢ４６８（ＳＲＣＣ７６２）、ＭＢ１７５（ＳＲＣＣ７６３）、ＭＢ３６１（ＳＲＣＣ７６４）、ＢＴ２０（ＳＲＣＣ７６５）、ＭＣＦ７（ＳＲＣＣ７６６）、及びＳＫＢＲ３（ＳＲＣＣ７６７）、及びＳＲＣＣ１０５７［ＨＦ−０００５４５］と称されるヒト乳腫瘍中心を含む。また、ＳＲＣＣ１０９４、ＳＲＣＣ１０９５、ＳＲＣＣ１０９６、ＳＲＣＣ１０９７、ＳＲＣＣ１０９８、ＳＲＣＣ１０９９、ＳＲＣＣ１１００、ＳＲＣＣ１１０１と称されるヒト乳腫瘍、及びＳＲＣＣ８９３［ＬＴ３２］と称されるｂｒｅａｓｔ−ｍｅｔ−ｌｕｎｇ−ＮＳ腫瘍が含まれる。
ヒト腎臓腫瘍中心は、ＳＲＣＣ９８９［ＨＦ−０００６１１］及びＳＲＣＣ１０１４［ＨＦ−０００６１３］を含む。
ヒト精巣腫瘍中心はＳＲＣＣ１００１［ＨＦ−０００７３３］、そして精巣腫瘍辺縁はＳＲＣＣ９９９［ＨＦ−０００７１６］を含む。
ヒト上皮小体腫瘍はＳＲＣＣ１００２［ＨＦ−０００８３１］及びＳＲＣＣ１００３［ＨＦ−０００８３２］を含む。
【００６５】
ｍＲＮＡ抽出に関する方法は当該分野で良く知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）を含む分子生物学の標準的教科書に開示されている。パラフィン包理組織からＲＮＡを抽出に関する方法は、例えば、Ｒｕｐｐ及びＬｏｃｋｅｒ， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ５６： Ａ６７（１９８７）、及びＤｅ Ａｎｄｒｅｓ ら．， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：４２０４４（１９９５）に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ等の営業生産業者の精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを、製造業者の指示書に従って使用することでおこなうことができる。例えば、培養中の細胞からの全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ カラムを使用することで単離できる。組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離できる。腫瘍から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離できる。
【００６６】
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達によって引き起こされる腫瘍細胞において、レチノイド処理によって発現が選択的に高められる遺伝子、好ましくは細胞表面抗原を同定する方法を提供する。従って、ｍＲＮＡの好ましいソースは、腫瘍から誘導された組織試料又は細胞株であって、その腫瘍の発生及び／又は進行はＷｎｔシグナル伝達経路の欠損に関連している。上で論じたように、例えば、β−カテニンの活性化変異は、卵巣及び子宮内膜の癌、ウィルムス腎臓腫瘍及びメラノーマで同定されており、このことは、Ｗｎｔ−１シグナル伝達の欠損がこれら癌の進行の一因になっていることを示している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら．， Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９０： ５５−９（１９９９）；Ｋｏｅｓｔｅｒｓら．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９： ３８８０−２（１９９９）；Ｐａｌａｃｉｏｓ及びＨａｍａｌｌｏ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８： １３４４−７（１９９８）；Ｒｉｍｍら． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５４： ３２５−９ （１９９９）；Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： １７３１−１７３４［１９９３］；Ｗｒｉｇｈｔら．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２： ６２５−９（１９９９））。同様に、ある結腸直腸癌は、欠損Ｗｎｔ−１シグナル伝達によって特徴付けられている。従って、そのような腫瘍からの凍結又はパラフィン包理試料又は腫瘍細胞株は、本発明の発現プロファイリングアッセイにとって好ましいｍＲＮＡのソースである。あるいは、条件によってＷｎｔ（例えばＷｎｔ−１）プロトオンコジーンを発現するように操作した腫瘍及び正常細胞は、レチノイド処理の前後、及びＷｎｔ（例えばＷｎｔ−１）発現のない場合に、ｍＲＮＡのソースとなれる。
【００６７】
ＲＮＡはＰＣＲのテンプレートとして機能しないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの最初のステップはＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写、それに続くＰＣＲ反応でのそれの指数関数的な増幅である。２つの最も広く用いられている逆転写酵素はトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）及びマウス白血球ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写段階は、発現プロファイリングの環境及び目的に依存し、概して特異的プライマー、ランダムヘキサマー、又はオリゴ−ｄＴプライマーを使用してプライムされる。例えば、製造者指示書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲ キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， カリフォルニア， アメリカ合衆国）を使用して抽出ＲＮＡを逆転写することができる。この誘導したｃＤＮＡは、後のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用できる。
【００６８】
ＰＣＲでは、種々の熱安定性ＤＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、ＰＣＲでは、典型的には、５’−３’ ヌクレアーゼ活性を有するが３’−５’ プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる。従って、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲでは、典型的には、Ｔａｑ又はＴｔｈポリメラーゼの５’ −ヌクレアーゼ活性を用いて、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、５’ ヌクレアーゼ活性と同等の任意の酵素を用いることができる。ＰＣＲ反応にとって典型的なアンプリコンを生成するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。三番目のオリゴヌクレオチド、又はプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。このプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長せず、レポーター蛍光色素及び消光蛍光色素で標識される。このレポーター色素のどんなレーザー誘導放射も、プローブ上でこの２つの色素が近接して位置している場合には、消光色素によって消光する。増幅反応の間、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存様式でプローブを切断する。この結果生じたプローブ断片は溶液中で解離し、遊離したレポーター色素からのシグナルは、二番目のフルオロフォアの消光効果とは無関係である。新しい分子が合成される度にレポーター色素の１分子が遊離し、消光しないレポーター色素の検出がデータの定量的な解釈の基礎を示すことになる。
【００６９】
ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００（商品名）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， フォスターシティー， カリフォルニア， アメリカ合衆国）、又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， マンハイム， ドイツ）等の商業的に入手可能な装置を使用しておこなうことができる。好ましい実施態様では、５’ ヌクレアーゼ手法は、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００（商品名）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）等のリアルタイム定量ＰＣＲ装置ですすめられる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ及びコンピューターで構成される。このシステムでは、サーモサイクラー上の９６−ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅の間、９６ウェル全てに関する光ファイバーケーブルを通してレーザー励起した蛍光シグナルがリアルタイムで収集され、そしてＣＣＤカメラで検出される。このシステムは、装置を作動し、データを分析するソフトウェアを装備している。
【００７０】
５’−ヌクレアーゼアッセイのデータは、Ｃｔ又は閾値サイクルとして最初に表される。上で論じたように、蛍光値は毎サイクルの間に記録され、増幅反応においてそのポイントまでに増幅した産物の総量を表す。蛍光シグナルが極めて重要だとして最初に記録されたポイントが閾値サイクル（Ｃｔ）である。この△Ｃｔ値は、癌細胞のＲＮＡの発現を正常細胞のそれと比べる場合に、核酸中の特定の標的配列の開始コピーの相対数の定量的測定として用いられる。
エラー及び試料と試料間の変化による効果を最小限にするために、大抵は内部標準を使用してＲＴ−ＰＣＲをおこなう。理想的な内部標準は、異なる組織間では一定のレベルで発現し、実験上の処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを均質化するために最も頻繁に使用されているＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【００７１】
マイクロアレイ
特異的遺伝子発現も、マイクロアレイ技術を用いて同定、又は確かめることができる。この方法では、対象であるヌクレオチド配列をマイクロチップの基板上にプレートし、整列させる。次いで、この整列させた配列を、対象である細胞又は組織からの特定のＤＮＡプローブでハイブリダイズする。本発明によって標的にされた遺伝子は、腫瘍細胞又は組織、及び健康な検体の細胞又は組織から抽出したｍＲＮＡから均質及びサブトラクトｃＤＮＡライブラリを構築すること；ｃＤＮＡからＤＮＡを精製し；そうでなければレチノイドと同一の条件の下で腫瘍と健康な試料を処理すること；発現分析のために精製ＤＮＡをマイクロアレイすること；そして対応する正常細胞又は組織に比べて、レチノイド処理によって選択的にアップレギュレーションするクローンからその遺伝子を同定するためにマイクロアレイを探索することによって同定することができる。ちょうどＲＴ−ＰＣＲ法のように、ｍＲＮＡのソースは、概して、ヒト腫瘍又は腫瘍細胞株、対応する正常な組織又は細胞株から単離した全ＲＮＡである。従って、上に列挙したものを含め、種々の原発腫瘍又は腫瘍細胞株からＲＮＡを単離することができる。ｍＲＮＡのソースが原発腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、日常的に毎日の臨床実習で調製そして保存した凍結又は記録保存したパラフィン包理及び固定した（例えばホルマリン固定）組織試料から抽出することができる。
【００７２】
マイクロアレイ技術の特別な実施態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲで増幅した挿入部分を高密度アレイの基板へ貼り付けた。好ましくは、少なくとも１０，０００ヌクレオチド配列を基板へ貼り付ける。それぞれ１０，０００エレメントがマイクロチップ上に固定化された、マイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするのに適している。蛍光標識したｃＤＮＡプローブは、対象である組織から抽出したＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドを取り込むことで作成できる。チップへ貼り付けた標識したｃＤＮＡプローブは、アレイ上の各スポットのＤＮＡと特異性によってハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除くためにストリンジェントに洗浄した後、チップを共焦点レーザー顕微鏡によってスキャンする。各整列したエレメントのハイブリダイゼーションの定量化によって、対応するｍＲＮＡ発生量の評価が可能となる。二色蛍光によって、２つのソースのＲＮＡから作成した別々の標識したｃＤＮＡプローブを２つ１組でアレイへハイブリダイズする。従って、各特定の遺伝子に対応する２つのソースからの転写物の相対発生量は、同時に確かめるられる。小型化したハイブリダイゼーションのスケールによって、多くの遺伝子に関する発現パターンの簡便で迅速な評価が可能となる。このような方法が、細胞当たり少しのコピーが発現する希な転写物の検出、及び発現レベルにおいて少なくともおよそ２倍の違いを再現可能に検出するのに必要な感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（２０）： １０６−４９（１９９６））。
【００７３】
核酸のハイブリダイゼーションの方法論及びマイクロアレイ技術は、当該分野で良く知られている。１つの例では、ハイブリダイゼーション及びプローブ、スライド、及びハイブリダイゼーション条件のための核酸の特別な調製は、２００１年３月３０日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２に詳細に示されており、その全ての内容は、ここに明確に参考文献として取り入れられている。
【００７４】
ｂ．レチノイド処理
遺伝子発現プロファイリングのために、そしてｍＲＮＡ転写を定量化するために選ばれた方法にもかかわらず、本発明の外殻は、正常細胞と比べて、Ｗｎｔシグナル伝達によって引き起こされている癌細胞において、レチノイド処理によって発現が選択的に高まる遺伝子の同定である。特に、Ｗｎｔ シグナル伝達経路の関与によって特徴付けられる腫瘍細胞の遺伝子発現プロファルは、Ｗｎｔ、例えばＷｎｔ−１発現の存在及び存在しなくても、そしてレチノイド処理があってもなくても確かめられる。遺伝子発現データの定量化の後、遺伝子が同定され、その発現は、レチノイド処理した正常細胞、そして好ましくはレチノイド処理した又はしていないＷｎｔを発現しない腫瘍細胞と比較しても、Ｗｎｔ発現腫瘍細胞のレチノイド処理によって選択的にアップレギュレーションされる。前出にて論じたように、このレチノイドはレチノイン酸（トレチノイン、ビタミンＡ酸又はビタミンＡ１としても知られる）であってもよく、それにはオール−トランス−レチノイン酸（オール−トランス−ＲＡ）及び９−シス−レチノイン酸（９−シス−ＲＡ）の双方、及び頭−尾様式で結合している４つのイソプレノイド単位から成るレチノイン酸誘導体、例えばレチノール、レチナール、置換レチノイド、セコ−、ノーア、及びレトロ−レチノイドが含まれる。すべてのレチノイドは、５つの炭素−炭素二重結合及び非環式部分の末端に官能基を含む単環式親化合物から正式的に誘導され得る。
【００７５】
ｃ．細胞ベースの腫瘍アッセイ
本発明及びここでの処理方法によって同定した遺伝子標的は、さらに細胞ベースの腫瘍アッセイで確証することができる。ここで同定された遺伝子産物の腫瘍又は癌の進行及び病理における役割は、ここで遺伝子を増幅すると同定された原発腫瘍細胞又は細胞系を用いて試験することができる。このような細胞は、例えば、上記した乳房及び前立腺癌細胞及び細胞系を含む。
【００７６】
異なる方法では、特定の腫瘍に関連することが知られた細胞型の細胞をここのｃＤＮＡで形質移入し、これらのｃＤＮＡの過剰成長誘発能力を分析する。適当な細胞は、例えば、Ｂ１０４−１−１細胞株（ｎｅｕプロトオンコジーンで形質移入された安定なＮＩＨ−３Ｔ３細胞系）及びｒａｓ−形質移入ＮＩＨ−３Ｔ３細胞等の安定な腫瘍細胞系を含み、これらは所望の遺伝子で形質移入し、そして腫瘍形成的成長を観察できる。このような形質移入細胞系は、次いで、形質転換細胞の成長に対する細胞分裂停止又は細胞傷害性活性の発揮により、又は抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の媒介により、ポリ−又はモノクローナル抗体又は抗体組成物の腫瘍形成細胞成長を阻害する能力を試験するのに使用できる。ここに同定した遺伝子のコード化配列で形質移入した細胞は、さらに、癌治療用の候補薬の同定に使用できる。
さらに、（下記のような）トランスジェニック動物の腫瘍に由来する初代培養は、ここでの細胞ベースアッセイに使用できるが、安定な細胞系が好ましい。トランスジェニック動物から連続細胞系を誘導する技術はこの分野で良く知られている（例えば、Ｓｍａｌｌ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５： ６４２−６４８ ［１９８５］参照）。
【００７７】
ｄ．動物モデル
種々の良く知られた動物モデルが、腫瘍の進行及び病原に関しここで同定された遺伝子の役割を更に理解するために利用でき、さらに抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニストを含む候補治療薬の有効性を試験するために使用することができる。これらのモデルのインビボ性質により、特にヒト患者における反応を予測できる。腫瘍及び癌（例えば、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌など）の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。このようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、腹膜内移植、腎被膜下移植、又はオルトピン（ｏｒｔｈｏｐｉｎ）移植、例えば大腸組織に移植された大腸癌細胞により、腫瘍細胞を同系マウスに導入することにより作成される。（例えば、１９９７年９月１８日に発行されたＰＣＴ公報国際公開９７／３３５５１参照。）
【００７８】
癌遺伝子の研究におそらく最もしばしば用いられる動物種は、免疫不全マウス、特にヌードマウスである。低下／形成不全を持つヌードマウスがヒト腫瘍異種移植の宿主としての役割を演じるという観察は、この目的のための広い用途を導いた。常染色体劣性ｎｕ遺伝子が、例えば、ＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、ＤＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ、Ｐ、ＲＩＩＩ及びＳＪＬを含むヌードマウスの極めて多数の異なる共通遺伝子系統に導入された。さらに、ヌードマウス以外の遺伝的な免疫不全を持つ広範な他の動物が生育され、腫瘍異種移植のレシピエントとして用いられた。さらなる詳細については、例えば、Ｔｈｅ Ｎｕｄｅ Ｍｏｕｓｅ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｅ． Ｂｏｖｅｎ 及び Ｂ． Ｗｉｎｏｇｒａｄ 編， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９１を参照。
【００７９】
これらの動物に導入される細胞は、周知の腫瘍／癌細胞系、例えば、安定的にＷｎｔ−１を発現するここでの実施例で用いるＷｎｔ−１トランスフェクトマウスＣ５７ＭＧ乳房上皮細胞株（Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３： ６０２５−６０３０（１９９６）も参照せよ）、又はＷｎｔ−１でトランスフェクトした次のＡＴＣＣヒト細胞株から誘導することができる：ＳＷ４０、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ、ＨＴ−２９、ＷｉＤｒ、及びＳＷ４０３（結腸腺癌）、ＳＷ６２０（リンパ節転移、結腸腺癌）、ＨＴ １１６（結腸癌）、ＳＫ−Ｃｏ−１（結腸腺癌、腹水）、及びＨＭ７（ＡＴＣＣ結腸腺癌細胞株ＬＳ １７４Ｔ）。腫瘍又は癌細胞の試料は、手術を受けている患者から、液体窒素中での凍結及び保存を含む標準的な条件を用いて得ることができる（Ｋａｒｍａｌｉ等， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４８， ６８９−６９６ ［１９８３］）。
【００８０】
腫瘍細胞は、ヌードマウスなどの動物に、種々の手法によって導入できる。マウスの皮下（ｓ．ｃ．）空間は、腫瘍移植に非常に好ましい。腫瘍は、固体ブロックとして、トロチャー（ｔｒｏｃｈａｒ）を用いてニードル生検として、細胞懸濁物としてｓ．ｃ．移植できる。固体ブロック又はトロチャー移植のために、適切な大きさの腫瘍組織断片がｓ．ｃ．空間に導入される。細胞懸濁物は、原発腫瘍又は安定な腫瘍細胞系から新たに調製され、皮下注射される。また腫瘍細胞は、皮下移植として注射することもできる。この位置において、移植細胞が皮膚結合組織の下層とｓ．ｃ．組織との間に着床される。Ｂｏｖｅｎ及びＷｉｎｏｇｒａｄ （１９９１）， 上掲。
【００８１】
乳癌の動物モデルは、例えば、ラット神経芽腫細胞（それからｎｅｕ癌遺伝子が最初に単離される）、又はｎｅｕ形質転換ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をヌードマウスに移植することにより、基本的にはＤｒｅｂｉｎ等， ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８３， ９１２９−９１３３ （１９８６）に記載されているように生成される。
同様に、大腸癌の動物モデルは、大腸癌細胞を動物、例えばヌードマウスに継代し、これらの動物における腫瘍の発現を導くことにより生成される。ヌードマウスにおけるヒト大腸癌の同所性移植モデルは、例えば、Ｗａｎｇ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４， ４７２６−４７２８ （１９９４）及びＴｏｏ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５， ６８１−６８４ （１９９５）に記載されている。このモデルは、いわゆるＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ， Ｉｎｃ． （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販の「ＭＥＴＡＭＯＵＳＥ（商品名）」に基づく。
動物に生じた腫瘍は、取り出してインビトロで培養することができる。インビトロ培地からの細胞は、次いで動物に継代することができる。これらの腫瘍は、さらなる試験及び薬物スクリーニングの標的として提供され得る。あるいは、継代から得られる腫瘍は単離でき、継代前細胞及び１又はそれ以上の継代後に単離した細胞のＲＮＡを、対象とする遺伝子の識別可能な発現について分析する。このような継代技術は、周知の腫瘍又は癌細胞系で実施することができる。
【００８２】
例えば、ＭｅｔｈＡ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１、及びＷＥＨＩ−１６４がＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの線維肉腫に化学的に導入され（ＤｅＬｅｏ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １４６， ７２０ ［１９７７］）、それは、種々の薬剤の抗腫瘍活性の研究のための高度に制御可能なモデル系を提供する（Ｐａｌｌａｄｉｎｏ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８， ４０２３−４０３２ ［１９８７］）。簡便には、腫瘍細胞は細胞培地中でインビトロで成長させる。動物に注射する前に、細胞系は洗浄してバッファー中に約１０ｘ１０６から１０ｘ１０７細胞／ｍｌの細胞密度で懸濁する。次いで動物を１０から１００μｌの細胞懸濁物で皮下感染し、腫瘍が現れるまで１から３週間放置する。
さらに、最も完全に研究された実験的腫瘍の一つであるマウスのルイス肺（３ＬＬ）癌腫は、研究用腫瘍モデルとして用いることができる。この腫瘍モデルにおける有効性は、肺の小細胞癌腫（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の治療における有利な効果と相関していた。この腫瘍は、影響を受けたマウスからの腫瘍断片又は培養により維持された細胞を注射することで正常マウスに導入でき（Ｚｕｐｉ等， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ４１： ｓｕｐｐｌ． ４： ３０９ ［１９８０］）、証拠は、腫瘍が一つの細胞の注射からでも開始され、極めて高い割合で感染した腫瘍細胞が生存することを示している。この腫瘍モデルに関する更なる情報については、Ｚａｃｈａｒｓｋｉ， Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １６， ３００−３２０ ［１９８６］を参照のこと。
【００８３】
移植された腫瘍の動物モデルにおける被験化合物の有効性を評価する一つの方法は、治療前後での腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植した腫瘍の大きさは、二又は三次元のスライドキャリパーで測定される。二次元に制限された測定は、腫瘍の大きさを正確に反映せず、従って、通常は数式を用いて対応する容積に換算される。しかしながら、腫瘍の大きさの測定は極めて不正確である。候補薬の治療効果は、治療−誘発性の成長遅延及び特異的な成長遅延としてより良く記述できる。腫瘍成長の記述における他の重要な変数は、腫瘍容積倍加時間である。Ｒｙｇａａｒｄ及びＳｐａｎｇ−Ｔｈｏｍｓｅｎ， Ｐｒｏｃ． ６ｔｈ Ｉｎｔ． Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ａｎｉｍａｌｓ， Ｗｕ及びＳｈｅｎｇ編， Ｂａｓｅｌ， １９８９， ３０１によって報告されたプログラムなどの、腫瘍成長の計算及び記述のためのコンピュータプログラムも利用可能である。しかし、処置後の壊死及び炎症反応が実際には少なくとも初期に腫瘍の大きさを増大させ得ることを注記しておく。従って、これらの変化は、形態学的方法及びフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く観察する必要がある。
【００８４】
組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコード部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とする動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック操作の標的として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ、ヤギ、及び非−ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及びサルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術は、全核マイクロインジェクション（Ｈｏｐｐｅ及びＷａｎｇｅｒ， 米国特許第４，８７３，１９１号）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２， ６１４８−６１５ ［１９８５］）；胚性肝細胞での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等， Ｃｅｌｌ ５６， ３１３−３２１ ［１９８９］）；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌ． Ｂｉｏｌ． ３， １８０３−１８１４ ［１９８３］）；精子媒介遺伝子転移（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ等， Ｃｅｌｌ ５７， ７１７−７３ ［１９８９］）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号を参照のこと。
【００８５】
本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又はコンカテマー、例えば頭部対頭部又は頭部対尾部の直列型として組み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Ｌａｓｋｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ６２３２−６３６ （１９９２）の技術に従って可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣＲ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッダイゼーション、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて分析できる。動物は、腫瘍又は癌発生の徴候についてさらに試験される。
【００８６】
あるいは、動物の胚性細胞に導入された同タンパク質をコードする変更ゲノムＤＮＡと、そのタンパク質（例えば、細胞表面タンパク質）をコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ここに同定するタンパク質をコードする欠陥又は変更遺伝子を有する「ノックアウト」動物を作成することができる。例えば、そのようなタンパク質をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従ってこのタンパク質をコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。特定のタンパク質をコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを確認するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは変異の無いフランキングＤＮＡ（５’と３’末端の両方）を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはＴｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ， ５１： ５０３ （１９８７）を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞系に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Ｌｉ等， Ｃｅｌｌ，６９：９１５ （１９９２）参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入され、キメラ集合体を形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８７）， ｐｐ． １１３−１５２参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、非不在タンパク質が存在しないことによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【００８７】
ここに同定されるタンパク質に特異的に結合する抗体、及び他の候補薬の有効性も、自然発生の動物腫瘍の治療において調べることができる。このような研究のための適切な標的は、ネコ口腔扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ネコ口腔ＳＣＣは高度に浸潤性の悪性腫瘍で、ネコに最も普通に見られる口腔悪性腫瘍であり、この種に報告される口腔腫瘍の６０％以上を占める。それは、離れた部位には殆ど転移しないが、この転移の低い発生率は単にこの腫瘍を持つネコの短い生存期間を反映しているにすぎない。これらの腫瘍は通常手術できないが、主にネコの口腔の解剖学的形状による。現在では、この腫瘍の有効な治療法は存在しない。研究に入る前に、各々のネコに完全な臨床検査、生体組織検査を施し、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）によりスキャンした。舌下口腔扁平上皮細胞腫瘍を持つと診断されたネコは研究から排除した。舌はこの腫瘍のために麻痺し始め、治療によりこの腫瘍が消滅した後でも、動物は自分で餌を取ることができないであろう。各々のネコを長期にわたって繰り返し治療する。治療期間中、毎日及び引き続き行われる再チェックの時点で腫瘍の写真を撮影した。治療の後、各ネコに再度ＣＴスキャンを施した。ＣＴスキャン及び胸部レントゲンは、その後８週間ごとに評価した。データは、対照群と比較した生存数、反応性及び毒性における相違について評価した。ポジティブ反応は、腫瘍の縮小、好ましくは生存の質の向上又は生存期間の延長を必要とする。
【００８８】
さらに、他の自発的動物腫瘍、例えばイヌ、ネコ、及びヒヒの線維肉腫、腺癌、リンパ腫、クロンドローマ（ｃｈｒｏｎｄｒｏｍａ）、平滑筋肉腫も試験できる。これらのイヌ及びネコでの乳腺癌は、その発現及び挙動がヒトのものに極めて類似しているので、好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの型の腫瘍の発生率によって制限される。
【００８９】
２．同定した腫瘍抗原を標的化する薬剤
正常細胞と比べて、レチノイド処理によってここで同定した腫瘍抗原の発現が高まることによってこれら抗原に対する癌療法の効果及び治療指標を改善することが期待できるために、ここで同定した腫瘍抗原は、癌治療にとって望ましい標的である。これは、本発明によって同定した腫瘍抗原のどんなアンタゴニストにとっても広く当てはまることである。
【００９０】
ａ．アンタゴニスト
アンタゴニストには、腫瘍抗原と結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定せずに、ポリ−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びそのような抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体が含まれる。あるいは、潜在的なアンタゴニストは、極めて関連したタンパク質、例えば、そのレセプターを認識するが、何の作用も示さない腫瘍抗原の変異体（例えば、ｓｔｒａ６，エフリンｂ１，４−１ＢＢリガンド，オートタキシン又はＩＳＲＬ変異体）であり、それ故に腫瘍抗原の作用を完全に阻害する。
【００９１】
他のアンタゴニストは、アンチセンス技術を使用して調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡコンストラクトであり、ここで、例えばアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質におけるその翻訳を妨げて、ｍＲＮＡの翻訳を直接ブロックするように作用する。アンチセンス技術は３重らせんの形成を通して発現する遺伝子又はアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをコントロールするために使用することができ、その両方の方法はＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドに結合に基づいている。例えば、ここで成熟腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、約１０〜４０塩基対長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補的であるように設計され（３重らせん−Ｌｅｅら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１）を参照）、よって標的ポリペプチドの転写及び生成が妨げられる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子の標的ポリペプチドへの翻訳をブロックする（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ． １９８８））。アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがインビボ発現し、標的ポリペプチドの生成を阻害するように、前掲のオリゴヌクレオチドを細胞に送達させることもできる。アンチセンスＤＮＡが使用される場合は、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０〜＋１０間の、翻訳開始部位から誘導したオリゴデオキシリボヌクレオチド、が好ましい。
【００９２】
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、一般的に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、又はそれ以上である。
【００９３】
潜在的アンタゴニストは、ここで同定した腫瘍抗原の活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それにより腫瘍抗原の正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。これら小分子は、当該分野の熟練者に良く知られたスクリーニング技術によって同定することができる。
【００９４】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４： ４６９−４７１ （１９９４）及びＰＣＴ公報、国際公開９７／３３５５１（１９９７年９月１８日発行）を参照。
【００９５】
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、国際公開 ９７／３３５５１， 上掲を参照。
好ましい実施態様では、本発明の治療方法で用いられるアンタゴニストは、本発明に従って同定した主要抗原と特異的に結合する抗体である。レチノイド（例えばレチノイン酸）療法は、同定した腫瘍抗原を選択的にアップレギュレーションし、このような抗原に対する抗体の効果及び治療指標を改善する。
【００９６】
ｂ．抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤には、本発明によって同定したポリペプチド、又はその融合タンパク質が含まれ得る。この免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に結合させるのが有用であろう。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００９７】
モノクローナル抗体
抗体は、あるいはモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
【００９８】
免疫化剤は、典型的には抗体が結合するポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６） ｐｐ． ５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００９９】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８７） ｐｐ． ５１−６３］。
【０１００】
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯ１０２８２に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１０１】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ， 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１０２】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
【０１０３】
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０１０４】
ヒト及びヒト化抗体
本発明の治療方法は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含み得る。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２９ （１９８８）； 及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３−５９６ （１９９２）］。
【０１０５】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター（ｗｉｎｔｅｒ）及び共同研究者［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６ （１９８８）］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【０１０６】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９１）；Ｍａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Ｃｏｌｅ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５（１９９１） ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇ等， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５−９３ （１９９５）に記載されている。
【０１０７】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方は標的タンパク質に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９ （１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等， ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５６ （１９９１）に開示されている。
【０１０８】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０１０９】
国際公開９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１１０】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１（１９８５） は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１１１】
大腸菌からＦａｂ’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５：２１７−２２５ （１９９２）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０１１２】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して産生されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの産生に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８ （１９９４）を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）。
【０１１３】
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合し得る。あるいは、標的ポリペプチドに結合する抗体のアームは、特定のポリペプチドを発現する細胞へ細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子又はＦｃＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧ（ＦｃＲ）に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は、本発明によって同定した特定の抗体を発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用され得る。これらの抗体は抗体結合アーム、及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。対象となる他の二重特異性抗体は標的ポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１１４】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開９１／００３６０；国際公開９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６，９８０号に開示されているものが含まれる。
【０１１５】
エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Ｃａｒｏｎ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６： １１９１−１１９５ （１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８： ２９１８−２９２２ （１９９２）参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Ｗｏｌｆｆ等， Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３： ２５６０−２５６５ （１９９３）に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３： ２１９−２３０ （１９８９）参照。
【０１１６】
免疫コンジュゲート
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲートにも関する。
このような免疫コンジュゲートの生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性コンジュゲート抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０１１７】
抗体及び細胞毒性薬のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １０９８ （１９８７）に記載されたように調製することができる。カーボン−１４−標識１−−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲートのためのキレート剤の例である。国際公開 ９４／１１０２６参照。
【０１１８】
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体を「レセプター」（ストレプトアビジン等）とコンジュゲートさせてもよく、その抗体−レセプターコンジュゲートを患者に投与し、その後で清澄化剤を用いて未結合コンジュゲートを循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）にコンジュゲートしている「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０１１９】
好ましい免疫コンジュゲートは抗体−メイタンシノイドコンジュゲートである。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート、及びそれらの治療上の用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号；５，４１６，０６４号；そして欧州特許第０４２５２３５Ｂ１に開示されており、その開示は出典明示してここに取り入れられている。Ｌｉｕら．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２と結合したＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。このコンジュゲートは、培養結腸癌細胞に対して高い細胞毒性があることが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉら．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２： １２７−１３１（１９９２）には、メイタンシノイドがジスルフィド結合を介してヒト結腸癌細胞株上の抗原と結合しているマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ−２／ｎｅｕオンコジーンと結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１とコンジュゲートした免疫コンジュゲートが記載されている。
【０１２０】
抗体−メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子いずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、化学的に抗体とメイタンシノイド分子を結合させることによって調製する。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞傷害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞傷害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、４，１３７，２３０；４，２４８，８７０；４，２５６，７４６；４，２６０，６０８；４，２６５，８１４；４，２９４，７４７；４，３０７，０１６；４，３０８，２６８；４，３０８，２６９；４，３０９，４２８；４，３１３，９４６；４，３１５，９２９；４，３１７，８２１；４，３２２，３４８；４，３３１，５９８；４，３６１，６５０；４，３６４，８６６；４，４２４，２１９；４，４５０，２５４；４，３６２，６６３；及び４，３７１，５３３に開示されており、それらは出典明示してここに取り入れられている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等のメイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０１２１】
関心ある他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ−ピコモルの濃度で二重ストランドＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５，７１２，３７４号、同５，７１４，５８６号、同５，７３９，１１６号、同５，７６７，２８５号、同５，７７０，７０１号、同５，７７３，００１号、同５，８７７，２９６号を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１ １、α２ １、α３ １、Ｎ−アセチル−γ１ １、ＰＳＡＧ及びθ１ １（Ｈｉｎｍａｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅら． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５８：２９２５−２９２８（１９９８）及び上述した米国特許）が含まれる。
【０１２２】
抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方とも細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞傷害効果が大きく向上する。
本発明のよる標的ポリペプチド、例えば細胞抗原のアップレギュレーションは、免疫コンジュゲートの有効量を低減し、それによって細胞毒性剤又は細胞毒性剤を含有する免疫コンジュゲートの投与にしばしばつきまとう毒性の問題が取り除かれるか又は減少する。
【０１２３】
免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）；Ｈｗａｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）； 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８ （１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Ｇａｂｉｚｏｎら， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（１９） １４８４ （１９８９）参照。
【０１２４】
抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ治療法 （ ＡＤＥＰＴ ）
また、本発明の抗体は、プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５を参照）を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、ＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。例えばＷＯ８８／０７３７８及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照されたい。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
【０１２５】
限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヒトリソソーム、ヒトグルクロニダーゼ、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌剤５−フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（例えば、カルボキシペプチダーゼＧ２及びカルボキシペプチダーゼＡ）及びカテプシン（例えば、カテプシンＢ及びＬ）で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ， Ｎａｔｕｒｅ ３２８：４５７−４５８［１９８７］を参照）。抗体−アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【０１２６】
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８［１９８４］）。
【０１２７】
３．製薬的組成物
本発明によって同定した腫瘍抗原を標的とする他の分子と同様に、本発明によって同定した腫瘍抗原と特異的に結合する抗体は、製薬的組成物の形態で種々の疾患の治療のために投与できる。
【０１２８】
抗原性タンパク質が細胞内であり、すべての抗体が阻害剤として使用されるならば、内在化する抗体が好まれる。しかしながら、リポソームも抗体、又は抗体断片を細胞へ送達することに使用することができる。抗体断片が使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインと特異的に結合する最も小さな阻害性断片が好まれる。例えば、抗体の可変領域配列に基づき、標的タンパク質配列と結合する能力を保持するように、ペプチド分子を設計することができる。このようはペプチドは、化学的に合成及び／又は組み換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら．， Ｐｒｏｃ．， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ７８８９−７８９３（１９９３）を参照せよ。また、ここでの製剤形態は、治療される特定の徴候のために必要な複数の活性化合物を含み、好ましくは互いに逆作用しない相補的な活性を含む。或いは、又は加えて、組成物は、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤のような機能を高める薬剤を含むことができる。そのような分子は、目的とする意図に対して効果的な量の組み合わせで適当に存在する。
【０１２９】
また、活性成分を、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括することができる。
インビボ投与に使用される製剤は無菌であることが大いに好まれる。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
【０１３０】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−（−）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０１３１】
４．治療方法
本発明の抗体及び他の抗腫瘍化合物は、ここで同定される増幅遺伝子の過剰発現及び／又は活性化を特徴とするものを含む種々の状態の治療に用いてもよいと考えられる。このような抗体及び、これらに限られないが有機及び無機小分子、ペプチド、アンチセンス分子等を含む他の化合物で治療される状態又は疾患の例としては、良性又は悪性腫瘍（例えば、腎臓（ｒｅｎａｌ）、肝臓、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、膀胱、乳房、胃、卵巣、大腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、甲状、肝臓の癌；肉腫；膠芽細胞腫；及び種々の頭部及び頸部の腫瘍）；白血病及びリンパ悪性疾患；ニューロン、グリア、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔の他の疾患；及び炎症、脈管形成及び免疫学的な疾患が含まれる。本発明の抗体及び他のアンタゴニストによる治療の特に好ましい標的は、Ｗｎｔ−１経路に遺伝的欠損を有するもの（例えば、β−カテニンシグナル伝達の異常な活性化につながる）及び／又はここで同定した腫瘍抗原を過剰発現するものである。従って、例えば、Ｗｎｔ−１経路に遺伝的欠損を有するヒト癌が、一般的には腫瘍抗原Ｓｔｒａ６の過剰発現も示すが、すべてのＳｔｒａ６を過剰発現する腫瘍にＷｎｔ−１経路の変異が関与しているのではないことは知られている。特に標的抗原がＷｎｔ−１及びレチノイド処理の組み合わせによってその発現が相乗的に高まることで特徴付けられる場合、本発明のアンタゴニストは、Ｗｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる腫瘍の治療について大きな可能性を有する。そのような腫瘍の好ましいグループには、結腸直腸腫瘍、卵巣、子宮内膜、及びウィルムス腎臓腫瘍、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、メラノーマ、及び褐色細胞腫（副腎髄質より誘導した腫瘍）が含まれる。
【０１３２】
本発明の抗腫瘍剤、例えば抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトへ例えばレチノイド、レチノイド酸との組み合わせで、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。レチノイドは、同じ異なる経路の投与によって投与することができる。実施例では、１５オール−トランス−レチノイド酸（ＡＴＲＡ）は、経口投与では有効であると示されている。この実験上の知見を基に、またその簡便さの観点から、レチノイドの経口投与が好ましい。選択的に又は付加的に、レチノイドはまた、腫瘍周囲注射によって投与してもよい。
【０１３３】
レチノイド処理は、抗腫瘍剤、例えば抗体、による処理の前又は後であってもよく、又は同時であってもよい。レチノイド処理の主要な目的が腫瘍治療の効果を高めるために標的抗原をアップレギュレーションすることであるので、レチノイドは、好ましくは抗腫瘍剤による治療の前又はそれと同時に投与される。レチノイドの有効量は定期試験によって決定することができ、概して、体重の約１５ｍｇ／ｋｇ及び約４００ｍｇ／ｋｇの間、好ましくは約２０ｋｇ／ｋｇ及び約２００ｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは約２５ｍｇ／ｋｇ及び約１５０ｍｇ／ｋｇである。さらに、レチノイド及びＷｎｔ、例えばＷｎｔ−１の同時投与がここで同定した遺伝子を相乗的に誘導することから、この治療は、Ｗｎｔ、例えばＷｎｔ−１の投与を含む。同時投与には、同時投与、又は投与順を問わない２つの薬剤の連続投与が含まれる。
【０１３４】
現在、癌の段階によるが、癌治療は次の治療のうちの１つ又は組み合わせを含む：癌性組織を除去するための手術、放射線治療、及び化学療法である。本発明の治療方法は、抗体などの抗腫瘍剤の治療指標を向上させ、それによって投与すべき有効量の低減を可能にする。従って、ここでの治療方法は、高齢な患者及び化学療法の毒性及び副作用に耐えられない他の患者の治療、そして放射線療法の有用性に限界がある転移性の疾患にとって特に有用である。
【０１３５】
他の治療的養生法を抗癌剤、例えば本発明の抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば、このような抗癌剤で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｍ．Ｃ． Ｐｅｒｒｙ編， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， ボルティモア， メリーランド （１９９２）にも記載されている。化学治療薬は、本発明の抗腫瘍剤、例えば抗体の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。抗体は、タモキシフェン等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン（欧州特許第６１６８１２号参照）の、それらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。
【０１３６】
また、腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。あるいは、又は加えて、患者に、ここで開示される同一の又は２以上の異なる抗原に結合する２以上の抗体を一緒に投与してもよい。ときどきは、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、ここでの抗体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗体を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明の抗体を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
【０１３７】
疾患の予防又は治療のための、抗腫瘍剤、例えばここでの抗体の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、予防又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。薬剤は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば、１又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に観察される。
【０１３８】
５．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は本発明の抗腫瘍剤である。容器上又は添付されるラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１３９】
６．診断方法
細胞表面抗原、例えばある腫瘍で過剰発現する成長レセプターが薬剤候補（例えば癌）又は治療にとって優れた標的である一方で、腫瘍細胞で増幅した遺伝子にコードされている分泌タンパク質に加えて同じタンパク質が腫瘍の診断及び予後においてさらなる用途が見出された。例えば、腫瘍細胞で増幅した遺伝子のタンパク質産物に対する抗体は、腫瘍の診断又は予後に使用することができる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、増幅遺伝子によってコードされたタンパク質の発現の定性的及び定量的（「マーカー遺伝子産物」）検出に使用することができる。抗体は、好ましくは、検出可能な例えば蛍光標識を備えており、結合は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又は当該分野で知られた他の技術によってモニターすることができる。増幅遺伝子が細胞表面タンパク質、例えば成長因子をコードするならば、これらの技術は特に適している。このような結合アッセイは、原則的に上文に記載したようにしておこなわれる。
【０１４０】
本発明の診断的アッセイは、レチノイド、例えばレチノイン酸がここで同定した腫瘍抗原を選択的にアップレギュレーションする。従って、この診断アッセイはレチノイド処理との連動しておこなわれ、このレチノイド処理は、対応する抗体等の腫瘍抗原を標的とする診断用薬の投与の前、それと同時に、又はその後にしてもよい。レチノイド処理による腫瘍抗原のこの選択的なアップレギュレーションは、診断アッセイの選択性を大きく向上させ、そうでなかったならば検出できなかった腫瘍抗原の検出を可能にする。これは、言い換えると、同定した腫瘍抗原を標的とすることを含む腫瘍の早期検出及び最も適切な治療法を用いる早期処置をを可能にする。
【０１４１】
マーカー遺伝子産物と結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光検査法又は免疫電子顕微鏡によっておこなうことができる。この目的のために、組織学的標本を患者から取り出し、標識抗体をそれへ取り付け、好ましくは、生物学的試料にその抗体をかぶせる。この手法は、検査する組織のマーカー遺伝子産物の分布を確定することをを可能にする。幅広い種々の組織学的方法がインサイツ検出で容易に利用できることは、当該分野に熟練した者にとって明かである。
【０１４２】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１４３】
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。以下の実施例では、、特別の定めのない限り、「Ｓｔｒａ６」は天然配列ＰＲＯ１０２８２ポリペプチドを指す。
【０１４４】
実施例１：　ヒトＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンの単離
天然ヒトＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ１４８３８０−２８２７及びＤＮＡ１４８３８９−２８２７−１）を、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優先的に示すヒト子宮ｃＤＮＡライブラリで、酵母スクリーニングを使用して同定した。
クローンＤＮＡ１４８３８０−２８２７は、ヌクレオチド位置４９−５１に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置２０５０−２０５２に見かけの停止コドンを有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図１）。予測されるポリペプチド前駆体は６６７アミノ酸長である（図２）。図２に示す完全長ＰＲＯ１０２８２配列は、約７３５０２ダルトンの推定分子量及び約９．２６のｐＩを有する。図２（配列番号：２）に示す完全長ＰＲＯ１０２８２配列の分析によって、重要なポリペプチドドメインに関する位置が上記のようにおおよそである、図２に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らになる。クローンＤＮＡ１４８３８０−２８２７は２０００年１月１１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１１８１が付与されている。
【０１４５】
クローンＤＮＡ１４８３８９−２８２７−１は、ヌクレオチド位置１８６−１８８に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置２１６０−２１６２に見かけの停止コドンを有する単一のオープンリーディングフレームを含む（図６、配列番号：４）。予測されるポリペプチド前駆体は６５８アミノ酸長である（図７、配列番号：５）。図７に示す完全長ＰＲＯ１９５７８配列は、約７２５８３ダルトンの推定分子量及び約９．３６のｐＩを有する。図７（配列番号：５）に示す完全長ＰＲＯ１９５７８配列の分析によって、重要なポリペプチドドメインに関する位置が上記のようにおおよそである、図７に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになる。注目すべきことは、ヒトとそれに相当するマウス配列の間で保存されている９の潜在的な膜貫通ドメイン及び１４のシステイン残基の存在である。マウスＳｔｒａ６が３の潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位を有する一方で、ヒトＰＲＯ１９５７８（天然ヒトＳｔｒａ６）ポリペプチドは１を有している。クローンＤＮＡ１４８３８９−２８２７−１は、２０００年２月２３日にＡＴＣＣへ寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１４０２が付与されている。
【０１４６】
図２（配列番号：２）に示す完全長配列、及び図７（配列番号：５）に示す完全長配列のＡＬＩＧＮ−２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析によって、ＰＲＯ１０２８２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列の間の配列同一性が明かになった：ＡＦ０６２４７６，Ｐ＿Ｗ８８５５９及びＨＧＳ＿ＲＥ２５９。
図８に示すように、完全長ヒトＰＲＯ１０２８２とＰＲＯ１９５７８ポリペプチドの比較によって、ＰＲＯ１９５７８がＰＲＯ１０２８２アミノ酸配列の位置８９−９７にある９のアミノ酸（ＳＰＶＤＦＬＡＧＤ；配列番号：１３）を欠いていることが示される。さらに、ＰＲＯ１９５７８は、ＰＲＯ１０２８２の対応する位置（位置５２７）にあるメチオニン（Ｍ）に代わってアミノ酸位置５１８にイソロイシン（Ｉ）を含み、これはその位置のＧ／Ａ多型に起因している。ＰＲＯ１０２８２及び天然配列ＰＲＯ１９５７８ポリペプチドの双方は、マウスＳｔｒａ６ポリペプチドのヒト相同体であると考えられており、それ故に、双方は「Ｓｔｒａ６」とも呼ばれている。マウスＳｔｒａ６とＤＮＡ１４８３４０−２８２７によってコードされている完全長ＰＲＯ１０２８２ポリペプチドは、約７４％のアミノ酸配列同一性を示す。
【０１４７】
図９は、手短に「ヒトＳｔｒａ６」と呼ばれている、ＤＮＡ１４３８０−２８２７によってコードされている天然配列ヒト完全長ＰＲＯ１０２８２ポリペプチドのハイドロホビシティープロットを示す。図９に示すように、この６６７アミノ酸長ポリペプチドのアミノ酸残基の約５０％が疎水性である。
ヒトＳｔｒａ６遺伝子を、ＵＮＩＧＥＮＥによって決定した通りに染色体１５ｑ２３に特定した。予備的な精度の良いマッピングによって、Ｓｔｒａ６はＳＴＳインターバルＤ１５Ｓ１２４−Ｄ１５Ｓ１６０及びＧ３マップ上の２４４．５２に一致するＧｅｎｅＭａｐ’９８の位置に位置することが示されている。
【０１４８】
実施例２：　ＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８のハイブリダイゼーションプローブとしての用途
以下の方法は、ＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８をコードする核酸配列のハイブリダイゼーションプローブとしての用途を示す。
ここに開示されている全長又は成熟ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８をコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの同種ＤＮＡ（ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８の天然発生変異体をコードするもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。
ハイブリダイゼーション及びどちらかのライブラリＤＮＡを含むフィルターの洗浄を、次の高いストリンジェントな条件下で実施する。放射標識ＰＲＯ１０２８２誘導プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で４２℃で２０時間実施する。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ水溶液中で４２℃で実施する。
次いで、完全長天然配列ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られている標準的技術を用いて同定することができる。
【０１４９】
実施例３：　大腸菌におけるＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８の発現
この実施例は、大腸菌中における組み換え発現によるＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８の非グリコシル化型の調製を例証する。
ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８をコード化するＤＮＡ配列を選択したＰＣＲプライマーを利用して最初に増幅する。このプライマーは、選択した発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含まなければならない。様々な発現ベクターを使用することができる。適したベクターの例としては、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性に対する遺伝子を含むｐＢＲ３２２（大腸菌由来；Ｂｏｌｉｖａｒら， Ｇｅｎｅ， ２：９５ （１９９７）を参照のこと）がある。このベクターを制限酵素で消化し、脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅配列をベクターへライゲーションする。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓリーダー、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８コード領域、ラムダ転写集結因子及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。
【０１５０】
次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 上記に記載されている方法を用いて、選択した大腸菌株を形質転換するために、このライゲーション混合物を利用した。形質転換体をＬＢ部レート上でのその成長能力によって同定し、次いで抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、それを制限分析及びＤＮＡシーケンシングによって確認することができる。
選択したクローンを、抗生物質が補充したＬＢブロスのような液体培地で一晩かけて成長させることができる。この一晩の培養を、次により大きなスケールでの培養を播種するために使用してもよい。そして、細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作用し始める。
更に数時間にわたって細胞を培養した後に、遠心分離によって細胞を収集することが可能である。遠心分離によって得られた細胞ペレットは、当該分野で公知の様々な薬剤を使用して可溶化でき、次いで、この溶解したＰＲＯ１０２８２タンパク質を、タンパク質の堅固な結合を可能にする条件下において金属キレート化カラムを用いて精製すること可能である。
【０１５１】
以下の手法を用いて、ポリ−Ｈｉｓタグ形態でＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を大腸菌で発現させてもよい。ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８をコードするＤＮＡを、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。このプライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いで、ＰＣＲ増幅されたポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターへ結合させ、これを株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体を、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中で、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させる。ついで培養液をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中で５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪して約２０−３０時間わたって成長させる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認するために試料を取り出し、細胞がペレットとなるようにバルク培地を遠心分離する。精製及びリフォールディング（再折りたたみ）まで、細胞ペレットを凍結させる。
【０１５２】
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁する。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、この溶液を４℃で終夜撹拌する。この工程により、すべてのシステイン残基が亜硫酸でブロックされた変性タンパク質が生じる。溶液をベックマン超遠心機で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮する。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、透明にするために０．２２ミクロンフィルターを通して濾過する。透明抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷する。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（カルバイオケム， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄する。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もる。
【０１５３】
試料を２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再生バッファー中で徐々に希釈することによって、タンパク質を再生させる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択する。リフォールディング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させる。タンパク質をさらに精製する前に、この溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度が２−１０％となるよう添加する。再生したタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配による溶離によってクロマトグラフにかける。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再生タンパク質を含有する画分をプールする。一般的に、殆どの正しく再生したタンパク質種は、逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているその疎水性内面でこれらの種が最もコンパクトであるために、アセトニトリルの最低濃度によって溶離する。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離する。誤って再生したタンパク質を所望の形態から分離することの他に、逆相工程ではエンドトキシンも試料から除去する。
【０１５４】
所望の再生したＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドを含有する画分をプールし、この溶液に窒素の弱い気流をあててアセトニトリルを除去する。タンパク質を、透析によって、又は調製バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（ファルマシア ）樹脂によるゲル濾過及び滅菌濾過によって、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ６．８に調製する。
【０１５５】
特に、天然ヒトＳｔｒａ６タンパク質ＰＲＯ１０２８２の２つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）であるペプチドＡ（アミノ酸２２９−２９５）及びペプチドＢ（アミノ酸５３２−６６７）が、アミノ酸配列ＭＫＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＨＱＭＨＱ（配列番号：１２）を有するＮ末端ポリヒスチジンリーダーを有するペプチドとして大腸菌細胞質で別々に発現した。このリーダーは、最適翻訳開始、ニッケルキレートカラムでの精製、そして望むならばＴＡＧＺｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕｎｉｚｙｍｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）による効率的な除去を規定する。転写は、大腸菌アルカリフォスファターゼプロモーターによって制御され（Ｋｉｋｕｃｈｉら．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：５６７１−５６７８［１９８１］）、ｔｒｐオペロンリボゾーム結合部位（Ｙａｎｏｆｋｙら．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：６６４７−６６６８［１９８１］）は翻訳を規定する。翻訳終結コドンの下流は、λｔｏ転写ターミネーター（Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋ及びＧｒｏｓｓｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：３１８５［１９８７］）で、その後に珍しいｔＲＮＡ遺伝子ｐｒｏ２、ａｒｇＵ、及びｇｌｙＴが続く（Ｋｏｍｉｎｅら．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１２：５７９−５９８［１９９０］；Ｆｏｕｒｎｉｅｒ及びＯｚｅｋｉ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ４９：３７９−３９７［１９８５］）。
【０１５６】
２つのＳｔｒａ６ ＥＣＤコード化配列のＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって完全長ｃＤＮＡクローンから調製し、ｐＳＴ２３９と命名した上記の発現ベクターへ挿入した。ＤＮＡ配列を確認した後、ＰＥ１４８３８０Ａ及びＰＥ１４８３８０Ｂと命名した新しいＳｔｒａ６発現ベクターを、大腸菌株５８Ｆ３（（ｆｈｕＡΔ（ｔｏｎＡΔ）ｌｏｎΔ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ΔｃｌｐＰ ｌａｃＩｑ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ΔｓｌｙＤ）へ形質転換した。形質転換体のルリア培養液培地を最初に３０℃で終夜生育させ、次にリン酸制限培地で１００倍希釈しアルカリホスファターゼプロモーターを誘導した。３０℃で振盪し２４時間後に、この培地を遠心分離し、次にこの細胞ペレットをペプチドの精製を開始するまで凍結した。
【０１５７】
精製のために、大腸菌ペースト（６−１０ｇｍペレット）を７ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭ トリス，ｐＨ８のバッファーの１０容量（Ｗ／Ｖ）に懸濁した。これに固体硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナトリウムを添加し、各々の最終濃度を０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、この溶液を４℃で終夜に渡って攪拌した。この溶液を遠心分離によって浄化し、６Ｍグアニジン、ＨＣｌ、２０ｍＭ トリス、ｐＨ７．４で平衡化したＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷した。このカラムを５０ｍＭイミダゾール（カルバイオケム， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含むさらなるバッファーで洗浄した。タンパク質は、２５０ｍＭイミダゾールを含むバッファーで溶出した。所望するタンパク質を含む分画をプールし、これを１ｍＭ ＨＣｌで透析し、４℃で貯蔵した。
【０１５８】
実施例４：　哺乳動物でのＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８の発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現による潜在的にグリコシル化した形態のＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８の調製を例証する。
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（１９８９年３月１５日公開の欧州特許第３０７，２４７号を参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載のライゲーション方法を用いてＰＲＯ１０２８２ＤＮＡを挿入する。得られたベクターは、それぞれｐＲＫ５−ＰＲＯ１０２８２及びｐＲＫ５−ＰＲＯ１９５７８と呼ばれる。
【０１５９】
一実施態様では、選択した宿主細胞を２９３細胞であってもよい。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）を、ウシ胎児血清、そして場合によっては栄養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地で、組織培養プレートで成長させてコンフルエントにする。約１０ｇのｐＲＫ５−ＰＲＯ１０２８２又はｐＲＫ５−ＰＲＯ１９５７８ ＤＮＡを約１ｇのＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａら， Ｃｅｌｌ， ３１：５４３ （１９８２）］と混合し、５００μｌの１ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ２に溶解する。この混合物に、滴状の５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を添加し、２５℃、１０分間で析出物を形成させる。この析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させる。培地を吸引し、２ｍｌの２０％グリセロールのＰＢＳを３０秒間添加した。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートする。
【０１６０】
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、その培養上清を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯ１０２８２ポリペプチドの存在を明らかにするために選択した時間にわたってフィルムにさらしてもよい。形質転換した細胞を含む培地に、更なるインキュベーションを施してもよく（無血清培地で）、培地を選択したバイオアッセイで試験した。
【０１６１】
これに換わる技術では、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を、Ｓｏｍｐａｒｙｒａｃら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １２：７５７５ （１９８１）に記載のデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入する。２９３細胞をスピナーフラスコ内で最大密度なるまで成長させ、７００ｇのｐＲＫ５−ＰＲＯ１０２８２又はｐＲＫ５−ＰＲＯ１９５７８ＤＮＡを添加する。この細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。この細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培地で洗浄し、組織培地、５ｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１ｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入する。約４日後に、その培養上清を遠心分離及び濾過して細胞と細胞片を除去する。次いで、発現したＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を含む試料を、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって濃縮及び精製することができる。
【０１６２】
他の実施態様では、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８をＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯ１０２８２又はｐＲＫ５−ＰＲＯ１９５７８を、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上に記載のように、この細胞培地をインキュベートし、その培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地で置換することができる。ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドの存在を同定した後、培地を無血清培地で置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いでその培養上清を収集する。次いで、発現したＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を含む培地を、任意の選択した方法によって濃縮及び精製することができる。
【０１６３】
また、エピトープタグＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を宿主ＣＨＯ細胞で発現させてもよい。このＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８は、ｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。このサブクローン挿入物は、ＰＣＲを施してポリ−ｈｉｓタグ等の選択したエピトープタグとフレーム単位でバキュロウイルス発現ベクターへ融合させることができる。このポリ−ｈｉｓタグＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターへサブクローニングすることができる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入することができる。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現したポリ−ｈｉｓタグＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を含む培地は、次いでＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択した方法により、濃縮及び精製することができる。
【０１６４】
またＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８は、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
ＣＨＯ細胞における安定な発現を以下の方法を用いて実施する。タンパク質は、それぞれのタンパク質の可溶化形態のコード配列（例えば、細胞外ドメイン）がヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列と融合した及び／又はポリ−Ｈｉｓタグ形態である、ＩｇＧ１コンストラクト（イムノアドヘシン）として発現する。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ ３．１６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に記載のような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ＣＨＯ細胞でのベクターを用いた発現は、Ｌｕｃａｓら， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４： ９， １７７４−１７７９ （１９９６）に記載の通りであり、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）を発現する制御ためにＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入の後のプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
【０１６５】
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）， Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）又はＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（べーリンガー・マンハイム）を使用して約１千万のＣＨＯ細胞へ導入する。細胞は、上記のＬｕｃａｓ等に記載のように成長させる。約３ｘ１０− ７細胞を、下記のような更なる成長及び産生のためにアンプル中で凍結させる。
【０１６６】
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０ｍＬの培地を含む遠心管にピペットし、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その上清を吸引して、細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁する。次いでこの細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍＬスピナーに等分する。１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地で満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートする。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種する。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、産生培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２年６月１６日に発行された米国特許第５，１２２，４６９号に記載の産生培地を使用してもよい。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種する。０日目に、細胞数とｐＨを測定する。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を開始する。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、３０ｍＬの５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、ダウコーニング ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を用いる。産生を通して、ｐＨを７．２近傍を維持するように調節する。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収し、０．２２μｍフィルターで濾過する。この濾過物は、４℃で貯蔵するか、又は即座に精製用カラムに充填する。
【０１６７】
ポリ−Ｈｉｓタグコンストラクトについて、タンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製する。精製の前に、イミダゾールを培養上清に５ｍＭの濃度になるまで添加する。この培養上清を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムへ４−５ｍｌ／分の流速で４℃でポンプ供給する。充填後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。この高度に精製したタンパク質を、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトール，ｐＨ６．８を含む貯蔵バッファーによって２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（ファルマシア ）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。
【０１６８】
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）コンストラクトを、以下の通りに培養上清から精製する。培養上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（ファルマシア ）へポンプ注入する。充填後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸，ｐＨ３．５で溶離する。この溶離したタンパク質は、２７５μＬの１Ｍトリスバッファー，ｐＨ９を含む管で１ｍｌの画分を回収することにより即座に中性化する。この高度に精製したタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタンパク質に関して上記したように、貯蔵バッファー中で脱塩した。その均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン分解によるＮ−末端アミノ酸配列決定により評価する。
【０１６９】
実施例５：　酵母でのＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８の発現
以下の方法は、酵母でのＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８の組換え発現を示す。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターによるＰＲＯ１０２８２の細胞内産生又は分泌のための酵母発現ベクターを作成する。ＰＲＯ１０２８２（ＰＲＯ１９５７８を含む）をコードするＤＮＡとプロモーターを、選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ１０２８２の細胞内発現を方向付ける。分泌のために、ＰＲＯ１０２８２をコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＰＲＯ１０２８２シグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母α因子又はインベルターゼ分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯ１０２８２の発現のためのリンカー配列とともに、選択したプラスミドへクローニングすることができる。
【０１７０】
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択した発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母上清は、１０％トリクロロ酢酸による沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析することができ、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
組換えＰＲＯ１０２８２（ＰＲＯ１９５７８を含む）は、引き続いて、、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択したカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することで単離及び精製できる。ＰＲＯ１０２８２（例えばＰＲＯ１９５７８）を含む濃縮物は、選択したカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１７１】
実施例６：　バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８の発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８の組換え発現を示す。
ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８コードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグは、ポリ−ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）などの市販で入手可能なプラスミドから誘導したプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８、又はＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８コード配列の望ましい部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などを、５’及び３’領域に相補的なプライマーによるＰＣＲで増幅する。５’プライマーは、隣接する（選択した）制限酵素部位を包含していてもよい。この生産物を、次いで、選択した制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローニングする。
【０１７２】
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商品名）ウイルスＤＮＡ（ファーミンジェン）をリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販）を用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）へ同時形質移入することにより作成される。２８℃での４−５日間のインキュベーションの後、放出されたウイルスを回収して更なる増幅に用いる。ウイルス感染及びタンパク質発現は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ： オックスフォード大学出版局 （１９９４）に記載のように実施する。
【０１７３】
次に、発現したＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリ−ｈｉｓタグを、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーによって次のように精製する。抽出は、Ｒｕｐｅｒｔら， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２：１７５−１７９ （１９９３）に記載のように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄して、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％のＮＰ−４０；０．４ＭのＫＣｌ）に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理する。この超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡化する。濾過した細胞抽出物を、毎分０．５ｍＬでこのカラムに負荷する。このカラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中での０から５００ｍＭイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Ｑｉａｇｅｎ）とコンジュゲートしたＮｉ２＋−ＮＴＡによるウェスタンブロットで分析する。その溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を含む分画をプールして負荷バッファーで透析する。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１７４】
実施例７：　ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８に結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の産生のための技術は、この分野で知られており、例えば、上記のＧｏｄｉｎｇに記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
【０１７５】
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ハミルトン， モンタナ）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗−ＰＲＯ１０２８２抗体又は抗−ＰＲＯ１９５７８抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１７６】
適当な抗体力価を検出した後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を取り出す。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択したマウス骨髄腫株化細胞と融合させる。この融合によってハイブリドーマ細胞が生成し、そのハイブリドーマ細胞はその後にＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートにプレートすることができて、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【０１７７】
このハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８に対する反応性に関するＥＬＩＳＡによってスクリーニングされる。ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８に対して所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の判定は、技術常識の範囲内である。
抗−ＰＲＯ１０２８２又は抗−ＰＲＯ１９５７８モノクローナル抗体を含む腹水を生成するために、ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成したモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１７８】
特に、５匹のＢａｌｂｃ／マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ウィルミントン， デラウェア）を、ヒトＳｔｒａ６のアミノ酸５３２−６６７に一致するＲｉｂｉアジュバンドのＵｎｉｚｙｍｅ−コンジュゲートアミノ酸ペプチド（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， ハミルトン， ミズーリ）で過免疫化した。前出に記載のようにして（Ｈｏｎｇｏ． Ｊ．Ｓ．ら．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １４： ２５３−２６０［１９９５］）、膝窩リンパ節のＢ細胞をマウスメラノーマ細胞（Ｘ６３．Ａｇ８．６５３；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ロックビル，メリーランド）と融合させた。１０−１４日後に、上清を収集し、直接酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）によって標準技術抗体産生に関してスクリーニングした。
限界希釈による第二ラウンド目のサブクローニングの後に、直接ＥＬＩＳＡ及び免疫組織化学によって最も高い免疫結合親和性を示す８つのポジティブクローンを、ｍＡｂのインビボ産生のためにプリスタンで初回刺激したマウスへ注射した（Ｆｒｅｕｎｄ，及びＢｌａｉｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２９： ２８２６−２８３０（１９８２））。その腹水をプールし、前出に記載のようにして （Ｈｏｎｇｏら．， 上掲）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆａｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＦＰＬＣ）；ファルマシア ， ウップラサ，スウェーデン）によって精製した。この精製抗体調製物を無菌的に濾過し（０．２−μｍ粒子サイズ；Ｎａｌｇｅｎｅ， ロチェスター，ニューヨーク）、そしてリン酸バッファー化生理的食塩水（ＰＢＳ）で４℃で貯蔵した。
【０１７９】
実施例８：　特異的抗体を用いたＰＲＯ１０２８２及びＰＲＯ１９５７８ポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製し得る。例えば、プロ−ＰＲＯ１０２８２又はプロ−ＰＲＯ１９５７８ポリペプチド、成熟ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチド、又はプロ−ＰＲＯ１０２８２又はプロ−ＰＲＯ１９５７８ポリペプチドは、対象とするＰＲＯ１０２８２ポリペプチドに特異的な抗体を用いる免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは、抗−ＰＲＯ１０２８２又は抗−ＰＲＯ１９５７８ポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成する。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿による精製、又は固定化プロテインＡ（ファルマシア ＬＫＢ バイオテクノロジー， ピスカタウェイ， ニュージャージー）による精製のどちらかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製した免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ−活性化セファロース（商品名）（ファルマシア ＬＫＢ バイオテクノロジー）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合している。抗体が樹脂に結合し、樹脂がブロックされていて、誘導体樹脂を製造者の指示に従って洗浄する。
【０１８０】
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドを含有する細胞から画分を調製することによってＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドを精製することに利用する。その調製物は、洗浄剤の添加による微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化によって、又はこの分野で公知の方法によって誘導される。あるいは、シグナル配列を含有する可溶性ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌され得る。
可溶性ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチド含有調製物を免疫親和性カラムに流し、そのカラムをＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドの優先的な吸着を可能にする条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄する。次いで、このカラムを抗体／ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離し、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドを回収する。
【０１８１】
実施例９：　薬物スクリーニング
本発明は、ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチド（ＰＲＯ１９５７８）又はその結合断片を任意の種々の薬物スクリーニング技術で使用して化合物のスクリーニングすることにとって特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯ１０２８２ポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、又はは細胞内に位置していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法では、ＰＲＯ１０２８２ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入されている真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤をそのような形質移入細胞に対して競合的結合アッセイでスクリーニングする。生存可能又は固定化形態のどちらかのこのような細胞を標準的な結合アッセイで使用できる。例えば、ＰＲＯ１０２８２ポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定することができる。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯ１０２８２ポリペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成の減少を調べることができる。
【０１８２】
従って、本発明は、ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチド関連疾患又は障害に作用し得る薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、当該分野で良く知られており、その試薬をＳｔｒａ６ポリペプチド又はその断片と接触させ、（ｉ）試薬とＳｔｒａ６ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は（ｉｉ）Ｓｔｒａ６ポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在についてアッセイすることを含む。これらの競合結合アッセイでは、Ｓｔｒａ６ポリペプチド又は断片が通常は標識される。適切なインキュベーションの後、遊離しているＳｔｒａ６ポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、遊離又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＳｔｒａ６ポリペプチドに結合する又はＳｔｒａ６ポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１８３】
薬剤スクリーニングに関する他の技術は、ポリペプチドに対して適切な結合親和性を有する化合物に関する高スループットスクリーニングを提供し、１９８４年９月１３日に公開された国際公開８４／０３５６４に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物は、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＳｔｒａ６ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＳｔｒａ６ポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＳｔｒａ６ポリペプチドを、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、Ｓｔｒａ６ポリペプチドに結合可能な中和抗体がＳｔｒａ６ポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、Ｓｔｒａ６ポリペプチドと１つ又は複数の抗原決定基を共有する持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１８４】
実施例１０： 合理的薬物設計
合理的薬物設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）ポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドの機能を促進又は阻害する薬物の創作に使用できる（参考、Ｈｏｄｇｓｏｎ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： １９−２１ （１９９１））。
【０１８５】
１つの方法において、天然配列ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチド、又はＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチド−インヒビター複合体の三次元構造がｘ線結晶学により、コンピュータモデリングにより、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、天然ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯ１０２８２又はＰＲＯ１９５７８ポリペプチドの構造に関する有用な情報が、相同タンパク質の構造に基づいたモデルデリングによって得られることもあり得る。両方の場合では、関連する構造の情報を、類似ＰＲＯ１０２８２ポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの同定に使用する。合理的な薬剤設計の有用な例は、Ｂｒａｘｔｏｎ及びＷｅｌｌｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３１： ７７９６−７８０１ （１９９２）に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はＡｔｈａｕｄａら，Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１３： ７４２−７４６ （１９９３）に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
【０１８６】
また、上記のような機能アッセイによって選択した標的特異的抗体を単離し、その結晶構造を解明することもできる。原理的には、この方法は、後に続く薬剤設計が準拠することのできるファーマコア（ｐｈａｒｍａｃｏｒｅ）を生成する。機能的、薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体（抗−ｉｄｓ）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗−ｉｄｓの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗−ｉｄは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離したペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明によって、Ｘ線結晶学などの分析実験を実施するために十分な量のＰＲＯ１０２８２ポリペプチド（ＰＲＯ１９５７８を含む）が入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯ１０２８２ポリペプチドアミノ酸配列の知識は、Ｘ線結晶学に代わる又はそれに加わるコンピュータモデル化技術で用いられるガイダンスを提供する。
【０１８７】
実施例１１：　組織発現分布
定量ＰＣＲ増幅反応用の添付した図面に示すＰＲＯ１０２８２ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチドプローブを構築した。標準的ＰＣＲ反応で対応するテンプレートの３’ 末端から約２００−６００塩基対の増幅断片が生じるように、このオリゴヌクレオチドプローブを選択した。このオリゴヌクレオチドプローブを異なる成人ヒト組織ソースから単離したＣｌｏｎｔｅｃｈＲＮＡによる標準的な定量ＰＣＲ増幅反応に用い、種々の試験した組織でのＰＲＯ１０２８２ポリペプチドコード化核酸の発現のレベルの定量を得るためにアガロースゲル電気泳動による分析をおこなった。種々の異なるヒト組織型でのＰＲＯ１０２８２ポリペプチドコード化核酸の発現パターン又は特異的発現の知識は、他の組織特異的マーカーが有っても無くても、転移性腫瘍の原発組織ソース等を決定するための組織適合性試験にとって有用な診断上のマーカーを提供する。これらアッセイの結果（図１０）は、ＤＮＡ１４８３８０−２８２７分子が成人腎臓、睾丸及び子宮で高く発現し；乳房、前立腺及び気管で顕著に発現し；脳、心臓、肺及び胸腺で弱く発現し；肝臓、骨髄、結腸、骨格筋、小腸、脾臓及び胃で発現しないことを示した。
【０１８８】
全ＲＮＡはＣｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト，カリフォルニア）から購入し、次のＰＣＲ増幅用のプライマー／プローブセットを使用して分析した：
ｈ．Ｓｔｒａ６．ｔｍｆ３：　５’ ＣＡＣＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＡＴＡＴＴＴＴ　（配列番号：６）
ｈ．Ｓｔｒａ５．ｔｍｒ４：　５’ ＡＡＣＡＡＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣ　（配列番号：７）
ｈ．Ｓｔｒａ６．ｔｍｐ４：　５’ ＴＧＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＧＣＣＴＴＴＧＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＧＡＧＧＴ
（配列番号：８）
ｔｍｆ＝正方向プライマー
ｔｍｒ＝逆方向プライマー
ｔｍｐ＝プローブ
【０１８９】
下の実施例１２に記載のようにして実施したインサイツハイブリダイゼーションによって、尿細管上皮細胞、子宮筋、及び乳管及び小葉の周りの間質細胞でＳｔｒａ６発現が確かめられ、その一方で脳、肝臓、脾臓、膵臓、心臓、肺、胃、小腸、結腸、前立腺、脾臓、及び副腎皮質では発現が検出されなかった（データは示されず）。インサイツハイブリダイゼーションによる正常組織の検査によって、最も高い発現のレベルが胎盤及び副腎髄質で見出され、それらはＰＣＲ分析には含まれなかった。
【０１９０】
実施例１２：　ヒト腫瘍での天然ヒトＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）転写物の過剰発現
この実施例は、天然ヒト完全長ＰＲＯ１０２８２（Ｓｔｒａ６）をコードする遺伝子があるヒト結腸腫瘍、そして結腸、肺、腎臓及び乳房等の種々のヒト腫瘍に由来する細胞株でも顕著に過剰発現していることを示す。
スクリーニングのための出発材料は、ヒト結腸腫瘍、又は種々のヒト結腸、腎臓、乳房、又は肺腫瘍細胞株から単離した全ＲＮＡであった。結腸腫瘍組織では、Ｓｔｒａ６ＲＮＡ発現を、同じ患者の正常結腸組織（粘膜）のＲＮＡと関連して測定した。種々の腫瘍細胞株でのＳｔｒａ６ＲＮＡ発現は、種々の正常細胞株（すなわち、正常結腸、腎臓及び肺細胞株）と比較して測定した。
【０１９１】
Ｔａｑｍａｎアッセイ試薬を使用し、正常細胞とある癌又は癌細胞株に由来する細胞でのＰＲＯ１０２９２（Ｓｔｒａ６）コード化遺伝子（ＤＮＡ１４８３８０−２８２７に一致）の発現のレベルの定量的相違をモニターするために、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ，例えば、ＴＡＱＭＡＮ ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００（商品名）配列検出システム（商品名）［パーキンエルマー、アプライドバイオシステムディビジョン，フォスターシティー，カリフォルニア］）を使用した。５０μｌ ＲＴ−ＰＣＲ反応は、５μｌの１０ｘＴａｑｍａｎバッファーＡ、３００μＭの各ｄＮＴＦ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ユニットのリボヌクレアーゼインヒビター、１２．５ユニットのＭｕＬＶ逆転写酵素、１２．５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭ プローブ、５００ｎＭ プライマー及び１００ｎｇ ＲＮＡから成った。反応条件は、４８℃で３０分間の逆転写、９５℃で２５秒間及び６５℃で１分間の変性から成った。反応産物を４−２０％のポリアクリルアミドゲル上で分析した（Ｎｏｖｅｘ）。
【０１９２】
分析した各試料のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ハウスキーピングジーンと同様に対象である各遺伝子の発現の相対的レベルを測定するために標準曲線を使用した。相対標準単位は、対象であるｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルによって割ることで得られた。誘導倍数を決定するために相対標準単位を実験試料とコントロールの間で比較した。
【０１９３】
ｍＲＮＡコード化ＰＲＯ１０２８２がスクリーニングした任意の原発結腸癌又は結腸、腎臓、乳房、又は肺癌細胞株で過剰発現しているかどうかを確かめるために、結果を利用した。分析（図１１及び１２を参照せよ）に使用した幾つかの一致したヒト正常及び結腸腫瘍試料の組織学を下に示す：
番号　　　　　　　　　　　　　組織学
８５０　　　　　浸潤性の腺癌；ネクローシスがない；良好な保存。
８５１　　　　　浸潤性の腺癌；最小のネクローシス；良好な状態。
８９２　　　　　浸潤性の腺癌；最小のネクローシス；良好な状態。
８６９　　　　　浸潤性の腺癌；最小のネクローシス；良好な状態。
８９３　　　　　正常な粘膜−形成異常−浸潤性の腺癌；最小のネクローシス；良好な状態。
８７０　　　　　腺癌−重傷の形成異常；最小のネクローシス；良好な状態。
８７１　　　　　腺癌−形成異常−正常な粘膜；ネクローシスがない；良好な状態。
８７２　　　　　浸潤性の腺癌；約７０％の腫瘍がネクローシス性；全体的に良い保存。
８４８　　　　　腺癌−絨毛腺腫が起こると思われる；正常な粘膜／粘膜下組織；ネクローシスがない，良好な状態。
７７８　　　　　腺癌−通常は乳頭の形態ではない；正常／ハイパープラスティック粘膜；
最小のネクローシス；許容可能な保存。
１７　　　　　　中程度に良く分化した腺癌。
１８　　　　　　良く分化した腺癌。
６４　　　　　　中程度に良く分化した腺癌。
７６　　　　　　中程度に良く分化した腺癌。
【０１９４】
ヒト肺細胞株には、正常ヒト肺線維芽細胞株ＭＲＣ５（ＣＣＬ−１７１）及びＩＭＲ９０（ＣＣＬ−１８６）、ヒト肺癌上皮細胞株Ａ５４９（ＳＲＣＣ７６８、ＣＣＬ−１８５）、ヒト類表皮肺癌細胞株Ｃａｌｕ−１（ＳＲＣＣ７６９；ＨＴＢ−５４）、ヒト未分化細胞株Ｃａｌｕ−６（ＳＲＣＣ７７０、ＨＴＢ−５６−おそらくは肺）、肺の絨毛腺腫の患者の心臓周囲体液から誘導したヒト上皮細胞株ＮＣＩ−Ｈ４４１（ＳＲＣＣ７７２；ＨＴＢ−１７４）、及びヒト肺扁平上皮細胞癌細胞株ＳＷ９００（ＳＲＣＣ７７５；ＨＴＢ−５９）が含まれ、これらすべてはＡＴＣＣから入手可能である。
【０１９５】
結腸細胞株には、例えば、正常結腸線維芽細胞株ＣＣＤ１１２Ｃｏ（ＣＲＬ−１５４１），ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＣａＣｏ−２（ＨＴＢ−３７）、ヒト結腸直腸腺腫細胞株ＷｉＤｒ（ＣＣＬ−２１８）、ヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＣＣＬ−２４７）、ヒト結腸直腸腺腫細胞株ＳＫ−Ｃｏ１（ＨＴＢ−３９）、ヒト結腸直腸腺腫細胞株ＣＯＬＯ３２０（ＳＲＣＣ７７８；ＣＣＬ−２２０）、ヒト結腸直腸腺腫細胞株ＨＴ２９（ＳＲＣＣ７７９；ＨＴＢ−３８）、ヒト結腸直腸腺腫細胞株ＳＷ４０３（ＣＣＬ−２３０）、ヒト結腸癌細胞株ＮＣＩ／ＨＣＣ２９９８、及びヒト結腸直腸腺腫細胞株Ｃｏｌｏ３２０ＤＭ（ＣＣＬ−２２０）が含まれ、これらすべてはＡＴＣＣ又は他の公的ソースから入手可能である。
ヒト乳癌細胞株には、ヒト乳腺癌細胞株ＭＣＦ７（ＳＲＣＣ７６６；ＨＴＢ−２２）、及びヒト乳癌細胞株ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳが含まれ、双方ともに公的に入手可能である。
腎臓株には、アデノウイルス５ＤＮＡで形質転換した２９３細胞株（ＣＲＬ−１５７３）が含まれる。２つのウィルムス腫瘍細胞株、Ｇ４０１（ＣＲＬ−１４４１）及びＳＫ−ＮＥＰ−１（ＣＲＬ−１５７３）も分析に含まれていた。
【０１９６】
ＲＮＡ調製：
ＲＮＡは前記の培養細胞株から調製した。その単離は、製造者指示書及び下記に従って、Ｑｉａｇｅｎの精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用いておこなった。さらに具体的には、培養液の細胞の全ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ−カラムを用いて単離した。組織試料の全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて単離した。腫瘍から調製したＲＮＡは、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離した。
【０１９７】
固体ヒト腫瘍試料調製及び可溶化：
腫瘍試料の重さを量り、５０ｍｌのコニカルチューブに配して氷で固定した。処理は、調製当たりちょうど２５０ｍｇの組織に限定した（１チップ／調製）。新鮮なプロテアーゼ溶液は、６．２５ｍｌの 冷ｄｄＨ２Ｏで２０μｇ／ｍｌの最終濃度に希釈することで調製し、４℃で貯蔵した。Ｇ２バッファー（２０ｍｌ）は、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）Ａを希釈して２００μｇ／ｍｌの最終濃度（１００ｍｇ／ｍｌのストックから）とすることによって調製した。腫瘍組織を、エアロゾルの吸引を避けるために、流層ＴＣフードでポリトロンの大きな先を用いて、１０ｍｌのＧ２バッファーの中で６０秒間ホモジナイズし、室温に置いた。試料処理の間に、２ＬのｄｄＨ２Ｏ、その後にＧ２バッファー（５０ｍｌ）によりそれぞれ２ｘ３０秒毎で回転させることによって、そのポリトロンを洗浄した。組織がまだ発生装置の先にあった場合は、その装置を分解して洗浄した。
Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ（上記のようにして調製、１．０ｍｌ）を添加し、続いてボルテックスし、５０℃で３時間にわたってインキュベーションした。可溶化液が透明になるまで、インキュベーションと遠心分離を繰り返した（例えば、さらに３０−６０分のインキュベーション、４℃、１０分間の３０００ｘｇでペレット化）。
【０１９８】
定量化
ＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析から得た結果は、最初はデルタＣＴ単位で表した。１単位は、１回のＰＣＲサイクル又は正常値に対して２倍増幅に一致し、２単位は４倍に一致し、３単位は８倍に一致する等である。データは培差に変換し、それで示した。最初に、逆転写酵素を使用して、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして用い、１００ｎｇの全ＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。次いで、得られたｃＤＮＡをＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＰＲＯ１０２８２コード化配列の３’−非翻訳領域から誘導したプライマー、及びそれぞれの介在配列に対応するＴＡＱＭＡＮ（商品名）蛍光プローブを使用して定量化を達成した。３’ 領域を用いることは、どちらかというとゲノムＤＮＡのイントロン−エキソン境界を横断することを避けることであり、この方法の利用によるＲＮＡ発現の正確な評価にとって不可欠な必要条件である。ＰＲＯ１０２８２コード化遺伝子の増幅に用いるプライマー及びプローブ（正方向、逆方向、及びプローブ）は次の通りである：
一組は、それぞれ配列番号：６、７及び８として上記の実施例１１に記載の前方向及び逆方向プライマー及びプローブを含む。
その他の組は：
ｈＳｔｒａ６．ｔｍｆｌ１： ５’ ＡＧＡＣＣＡＧＧＴＣＣＣＡＣＡＣＴＧＡ（配列番号：９）
ｈＳｔｒａ６．ｔｍｒ１：　５’ ＴＴＣＡＴＡＡＴＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＡＴＡＡＡＡ（配列番号：１０）、及び
ｈＳｔｒａ６．ｔｍｐ１：　５’ ＣＴＧＣＣＣＡＣＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＡＴ（配列番号：１１）
ヒトＧＡＰＤＨ：
正方向プライマー：５’−ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ−３’ （配列番号：１４）
逆方向プライマー：５’−ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ−３’　（配列番号：１５）
プローブ： ５’−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−３’　　（配列番号：１６）
【０１９９】
５’ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光ＰＣＲ−ベース技術であり、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性を使用してリアルタイムで増幅をモニターする。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応では標準的な単位複製配列を生成する。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブを設計し、２つのＰＣＲプライマー間に局在化したヌクレオチド配列の検出に用いる。このプローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素による延長が不可能であり、リポーター蛍光色素及び消光剤蛍光色素で標識される。２つの色素がプローブ上で接近して位置している場合、リポーター色素からの任意のレーザー励起放出は消光色素で消光される。増幅反応の間、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素はテンプレート依存的にプローブを切断する。得られたプローブ断片は、溶液中で分解し、放出したリポーター色素のシグナルは第２のフルオロフォアの消光効果の作用を受けない。新たな分子が合成されるごとにリポーター色素の１分子が遊離し、消光されていないリポーター色素の検出がデータの定量的解釈の根拠を提供する。
【０２００】
上に記したように、５’ヌクレアーゼ法は、ＡＢＩ Ｐｒｉｚｍ ７７００（商品名） Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）のようなリアルタイム定量的ＰＣＲ装置で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ及びコンピュータからなる。このシステムは、試料をサーモサイクラー上の９６ウェルフォーマットで増幅する。増幅の間、レーザー励起蛍光シグナルが、９６ウェルすべての光ファイバーケーブルを通してリアルタイムで回収され、ＣＣＤカメラで検出される。このシステムは、器具を作動させ、データを分析するソフトウェアを備えている。
５’ヌクレオチドアッセイのデータは、最初にＣｔ又は閾値サイクルとして示される。これは、リポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドレベルを超えて蓄積するサイクルとして定義される。癌細胞でのＲＮＡの発現を正常細胞のものと比較する場合に、Ｃｔ値は、核酸試料の特定標的配列の出発コピー相対数の定量的尺度として用いられる。
【０２０１】
結果
対応する正常ヒト結腸組織と比較した場合、ヒトＳｔｒａ６ ＲＮＡ（ＤＮＡ１４８３８０−２８２７と一致）はヒト結腸腫瘍組織で強い過剰発現を示す。図１１に示すように、患者の一致する正常な結腸直腸粘膜のＲＮＡと比較して、ヒトＳｔｒａ６ ＲＮＡ（ＤＮＡ１４８３８０−２８２７と一致）は、検査したすべての１４のヒト腫瘍結腸組織で過剰発現することが見出された。この過剰発現は、２及び１７０倍の間で変動し、１４の腫瘍組織試料のうちの７つでは、少なくとも１０倍であった。定量ＰＣＲで得られたサイクル閾値は、Ｓｔｒａ６ ｍＲＮＡレベルが、多くの正常粘膜試料では極めて低いか又は無い可能性があることを示していた。
第二の検出方法のように、定量ＰＣＲ反応（各４０サイクル）の完了後に得られた産物をポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド染色によって視覚化した。図１２Ａに示すように、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現を標準として用いて、その正常な対照物と比較して、実質的により多量のＰＣＲ産物が腫瘍試料のＳｔｒａ６ ｍＲＮＡから生成された。対照的に、すべての試料から、内部コントロールＧＡＰＤＨのｍＲＮＡからの比較可能なレベルの産物が生成した。
【０２０２】
以下のようなインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を実施することによって、結腸腺癌でのＳｔｒａ６発現を上皮腫瘍細胞に特定した。３２Ｐ標識センス及びアンチセンスリボプローブは、ＤＮＡ１４８３８０−２８２７によってコードされているヒトＳｔｒａ６ポリペプチドのコード化配列のヌクレオチド４３２−１２４７と一致する８７４ｂｐのＰＣＲ産物から転写された。ホルマリン固定化したパラフィン包埋組織切片を前出のようにして処理した（Ｐｅｎｎｉｃａら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １４７１７−２２［１９９８］）。その結果は図１２Ｂに示す。
図１３に示すように、ヒトＳｔｒａ６ ＲＮＡ（ＤＮＡ１４８３８０−２８２７と一致）は、種々の乳、腎臓、結腸及び肺腫瘍細胞株でも顕著に過剰発現している。「相対的ＲＮＡ発現」は、正常及び腫瘍組織でのＲＮＡ発現を、任意に選んだ標準細胞株ＳＷ４８０での発現と比較して示す。
【０２０３】
種々の腫瘍切片で得られたインサイツハイブリダイゼーションも図１６に示す。結腸腺癌以外の幾つかの腫瘍型も、高いレベルのＳｔｒａ６の発現を示した。これらには、３つのメラノーマのうちの３つ（図１６Ａ及びＢ）、４つの子宮内膜腺癌のうちの３つ（図１６Ｃ及びＤ）、３つの卵巣腺癌のうちの２つ、そして腎臓のウィルムス腫瘍（図１６Ｅ及びＦ）が含まれる。これらの腫瘍のＳｔｒａ６インサイツハイブリダイゼーションシグナルは、正常腎臓及び子宮での相対的に高い発現レベル及び正常結腸での低いレベルを示すデータと一致する結腸腺癌のそれよりもかなり大きかった。Ｓｔｒａ６が正常な副腎髄質で検出されたことから、我々は、副腎髄質に由来する腫瘍である２つの褐色細胞腫も調べた。これらの腫瘍では、Ｓｔｒａ６発現がこの研究で調べた他のどの腫瘍又は組織のＳｔｒａ６発現をも超えていた。Ｓｔｒａ６は正常な腎臓で検出され、ウィルムス腫瘍で強力に発現していたが、腎細胞癌腫では検出されなかった。腎臓移行上皮癌では、腫瘍上皮細胞よりも腫瘍関連間質細胞がＳｔｒａ６を発現した（データは示さず）。
【０２０４】
ＰＲＯ１０２８２をコードするｍＲＮＡ ＤＮＡ１４８３８０−２８２７が、多くの腫瘍由来細胞株だけでなく種々の腫瘍で過剰発現するので、それは腫瘍形成及び／又は成長と関連しているようである。結果として、ＤＮＡ１４８３８０−２８２７（ＰＲＯ１０２８２）によってコードされたタンパク質に対するアンタゴニスト（例えば、抗体、有機及び無機小分子、Ｓｔｒａ６変異体等のペプチド及びポリペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）、又はＤＮＡ１４８３８９−２８２７−１によってコードされているＰＲＯ１９５７８等のこのタンパク質の他の天然発生変異体は、癌、特に限定せずに結腸、肺、乳及び／又は腎臓癌の診断、予防及び／又は治療において有用であると期待されている。
ＤＮＡ１４８３８０−２８２７（ＰＲＯ１０２８２）によってコードされているタンパク質に対する治療用抗体等のアンタゴニストの効果は、ＰＲＯ１０２８２をコードする遺伝子の発現を刺激する薬剤によって高めることができる。例えば、９−シス−レチノイン酸又はオール−トランスレチノイン酸によるヒト結腸直腸癌細胞株の治療は、Ｓｔｒａ６ ｍＲＮＡの発現の劇的な増大を引き起こした（図１５）。従って、ＰＲＯ１０２８２に対する治療用抗体と適切なレチノイドとの組み合わせによる癌患者の治療は、抗体による腫瘍の死滅を高めると期待できるであろう。同じことが、ＤＮＡ１４８３８９−２８２７−１によってコードされているヒトスプライスバリアント等の種々の腫瘍で過剰発現している他の天然Ｓｔｒａ６ポリペプチドに対する抗体に関してもあてはまる。
【０２０５】
実施例１３：　Ｗｎｔ−１及びレチノイドによるＳｔｒａ６の相乗的誘導
材料及び方法
細胞培養
Ｃ５７ＭＧ及びＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び２．５μｇ／ｍｌピューロマイシンを補充したダルベッコ改良イーグル培地で生育させた（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。テトラサイクリン抑制性Ｗｎｔ−１発現であるＣ５７ＭＧ細胞を、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、及び５０ｎｇ／ｍｌ テトラサイクリンを補充したピューロマイシンを含まない完全培地で生育させた（Ｋｏｒｉｎｅｋら．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８： １２４８−５６［１９９８］）。Ｗｎｔ−１誘導研究のために、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、テトラサイクリンを含まない培地で１０，２４，４８，７２，及び９６時間培養して収集した。０時間のコントロールシャーレは、テトラサイクリンを含有する培地でもっぱら保存した。すべてのシャーレを同時に収集し、各タイムポイントで全ＲＮＡを抽出した。Ｗｎｔ−１、Ｓｔｒａ６、及びＧＡＰＤＨ特異的プライマー及びプローブによって、各試料の１００ｎｇの全ＲＮＡに関してＲＴ−ＰＣＲをおこなった。
【０２０６】
ヒト結腸腺癌細胞株ＨＣＴ１１６及びＷｉＤｒ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した。ＨＣＴ１１６細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したマッコイ５Ａ培地で維持した。ＷｉＤｒ細胞は、１０％ＦＢＳを補充したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）で維持した。レチノイン酸誘導研究に関しては、１０５の細胞を２．５ｍｌの培地を含有する６０ｍｍシャーレにプレートし、２４時間にわたって生育させた。指示時間の間、細胞をビタミンＤ３、オール−トランス−ＲＡ（Ｓｐｅｃｔｒａｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、又は９−シス−ＲＡ（トロントリサーチ ケミカルス インコーポレーテッド）（ＤＭＳＯで１μＭの最終濃度）で処理した。コントロール細胞は、等容量のＤＭＳＯで処理した。
Ｗｎｔ−３ａの条件培地によるＣ５７ＭＧ／親細胞の処理に関しては、１μＭの９−シス−ＲＡの存在又は非存在下で、Ｌ−細胞又はＬ−Ｗ３Ａ細胞の通常の培養液又は条件培地で細胞をインキュベートした。条件培地は、前記のようにして調製した（Ｗｉｌｌｅｒｔら．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １３： １７６８−７３［１９９９］）。４８時間目に、細胞をフッ化ナトリウム及びバナジウム酸塩を含有するＰＢＳで破壊することによって収集し、液体窒素で急凍結した。ＲＮＡは、製造者指示書に従ったカラムでのさらなるデオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅＩ）処理を含むＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。
【０２０７】
ウェスタンブロッティング
Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１ ＴＥＴ細胞株に関しては、０，２４，４８，又は７２時間にわたってテトラサイクリン無しで細胞を培養することによって、Ｗｎｔ−１発現を誘導した。細胞は、トリトンＸ−１００可溶化バッファー［２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム、５０ｍＭ フッ化ナトリウムで可溶化し、コンプリート プロテアーゼインヒビターカクテル（べーリンガー・マンハイム）及びタンパク質相当物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングに供した。ブロットを、０．２μｇ／ｍｌのアフィニティー精製したβ−カテニンに対するウサギポリクローナル抗体（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： １７３１−１７３４［１９９３］）、０．１μｇ／ｍｌ 抗−ＥＲＫ２モノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、又は１：２０００ウサギポリクローナル抗血清ＲＡＲγ−１（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）のどちらかとともにインキュベーションした。ＷｉＤｒ細胞株に関しては、細胞を４８時間にわたって１μＭ オール−トランス−ＲＡで処理し、次いでトリトンＸ−１００可溶化バッファーで可溶化し、上記のようにして処理した。ブロットは、１：５０抗−Ｓｔｒａ６ペプチドＢモノクローナルハイブリドーマ培養上澄み（クローン１２Ｆ４．２Ｈ９．１Ｄ５）とともにインキュベーションした。
【０２０８】
免疫組織化学
ＷｉＤｒ細胞を９−シス−レチノイン酸又はＤＭＳＯで処理し、次いで、低速度遠心分離によって脱着させてペレット化した。細胞ペレットを、一晩中、１０％中性緩衝化ホルマリンで固定化し、脱水し、そしてパラフィンに包埋した。免疫組織化学は、抗−Ｓｔｒａ６ペプチドＢモノクローナルハイブリドーマ培養上澄み（クローン１２Ｆ４．２Ｈ９．１Ｄ５）、又は非特異的マウスアイソタイプＩｇＧ２Ａを一次抗体として用いておこない、前出に記載のように続いてジアミノベンジジンを色素原とするアビジン−ビオチン複合体法（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ キット，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた検出をおこなった（Ｅｂｅｒｈａｒｄら．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １４５：６４０−９［１９９４］）。切片は、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０２０９】
Ｗｎｔ−１ トランスジェニックマウス
乳腺にＷｎｔ−１プロトオンコジーンを発現するトランスジェニックマウスは、通常は過形成性病変を示し、この組織に腫瘍を発生させる（Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら．， Ｃｅｌｌ ５５：６１９−６２５［１９８８］）。そのようなマウスを、次の実験で用いた。
【０２１０】
結果
ＭＣＦ−７を変異β−カテニンで同時トランスフェクションし、レチノイドで処理した場合、合成レチノイン酸応答性レポーター遺伝子の活性化が高まることを、Ｅａｓｗａｒａｎらが以前報告した（Ｅａｓｗａｒａｎら．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ９：１４１５−１４１８［１９９９］）。Ｓｔｒａ６がレチノイン酸誘導遺伝子（Ｂｏｕｉｌｌｅｔら．， Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ． ６３：１７３−１８６［１９９７］）であるという独自の同定とともにこの報告を考えると、我々は、Ｃ５７ＭＧ細胞株では、レチノイン酸がＷｎｔ−１と協同してＳｔｒａ６のレベルを高めるのかどうかを問うた。ＤＭＳＯ及びビタミンＤ３は効果を示さなかったが、４８時間にわたる９−シス−ＲＡ又はオール−トランス−ＲＡ（ＡＴＲＡ）のどちらかによる親Ｃ５７ＭＧの処理では、Ｓｔｒａ６ ｍＲＮＡのレベルが顕著に増加した（図１７Ａ）。期待した通りに、ＤＭＳＯ又はビタミンＤ３のどちらかで処理したＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞は、親細胞株に比べてＳｔｒａ６ｍＲＮＡのレベルが高くなった。Ｗｎｔ−１によるＳｔｒａ６誘導のレベルは、９−シス−ＲＡによる親Ｃ５７ＭＧ細胞の刺激で観察されたことに相当する。しかし、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞株の９−シス−ＲＡ処理によって、未処理Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１又は９−シス−ＲＡ処理Ｃ５７ＭＧ親細胞のどちらかに比べて、Ｓｔｒａ６ｍＲＮＡのさらに１０倍増加が誘導された。同様な結果がオール−トランス−ＲＡによって得られた。
【０２１１】
Ｗｎｔ−１発現に関連していないＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞株の潜在的なクローン変異体が、親コントロール細胞と比べたレチノイン酸に対するそれらのデファレンシャルレスポンスの原因となる可能性はあった。これを解決するために、我々は、９−シス−ＲＡの存在又は非存在下で、可溶性Ｗｎｔ−３ａによる刺激に対する親Ｃ５７ＭＧ細胞の反応を試験した。Ｗｎｔ−３ａは、Ｗｎｔ−１に類似した形質転換特性を示すＷｎｔ−１相同体であり、マウスＬ細胞で可溶性リガンドとして産生できる。コントロールＬ−細胞ではなく、Ｗｎｔ−３ａを発現する培養したＬ−細胞の条件培地は、Ｃ５７ＭＧ細胞でＳｔｒａ６の発現を誘導した（図１７Ｂ）。９−シス−ＲＡによるＣ５７ＭＧ細胞の処理で、僅かにより高いレベルの誘導が観察された。しかし、９−シス−ＲＡとＷｎｔ−３ａの組み合わせは、どんな薬剤単独でも見出されるかなり過度のＳｔｒａ６転写物のレベルが生じた。
【０２１２】
増大したβ−カテニンのレベルによって、レチノイン酸で処理したＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ１細胞におけるＳｔｒａ６の誘導が増強したならば、β−カテニン又はＡＰＣのどちらかに変異を持つヒト結腸癌腫で、レチノイン酸に対する応答において同じようなＳｔｒａ６の誘導を期待してもよい。これが起こるかどうかを確かめるために、β−カテニンに活性化変異を持つＨＣＴ１１６細胞、及び野生型ＡＰＣの両コピーを失ったＷｉＤｒ細胞のレチノイン酸処理の前後でＳｔｒａ６ ｍＲＮＡのレベルを測定した。両細胞株では、ＤＭＳＯ又はビタミンＤ３と比べて、ＡＴＲＡ又は９−シス−ＲＡのどちらかによる処理の後で、Ｓｔｒａ６ ｍＲＮＡレベルの顕著な増加が見られた（図１７Ｃ）。ＨＣＴ１１６細胞株でのＡＴＲＡによるＳｔｒａ６遺伝子の活性化は、インサイツハイブリダイゼーションによって確かめられた（図１７Ｄ）。ＡＴＲＡで処理したＷｉＤｒ細胞での予測７３ｋＤａＳｔｒａ６タンパク質バンドの誘導は、Ｓｔｒａ６特異的モノクローナル抗体によるウェスタンブロット分析によって検出された（図１７Ｅ）。ＷｉＤｒ細胞の免疫化学分析によって、レチノイン酸に対するＳｔｒａ６タンパク質の応答の増加が形質膜に局在化していることが明らかになった（図１７Ｆ）。
【０２１３】
ＲＡＲγ遺伝子は、アフリカツメガエル胚のＷｎｔシグナル伝達の標的だといわれて、レチノイドによるＳｔｒａ６の誘導は、このレチノイン酸レセプターサブタイプの存在に依存することが示された（ＭｃＧｒｅｗら．， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． ８７：２１−３２［１９９９］；Ｔａｎｅｊａら．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：７８５４−８［１９９５］）。さらに、これらの知見は、Ｗｎｔ及びレチノイドによるＳｔｒａ６の相乗的活性化は、Ｗｎｔシグナル伝達によるＲＡＲγ発現の活性化に起因するであろうことを示唆している。Ｗｎｔ−１シグナル伝達が、哺乳動物細胞のＲＡＲγのレベルに対する何らかの作用を有するかどうかを確かめるために、我々は、条件によってＷｎｔ−１を発現するＣ５７ＭＧ細胞から調製した可溶化物のレセプターに対するウェスタンブロットをおこなった。Ｗｎｔ−１の発現中、ＲＡＲγ−１に対して特異的な抗体と反応し、明らかに６４ｋＤａの分子量のものと移動するタンパク質は２４時間目に誘導され、その発現は４８時間目に増加した（図１８Ａ）。我々は、Ｗｎｔ−１トランスジェニックマウスから得た過形成性乳腺及び乳腺腫瘍を分析し、正常な乳腺と比べて、これらの組織でＲＡＲγｍＲＮＡのレベルが上昇していることを検出した（図１８Ｂ）。１９の腺癌から単離した等量ＲＮＡに存在するＲＡＲγ転写物のレベルは、定量ＰＣＲによって評価した。特に、ＲＡＲγｍＲＮＡ発現は、調べたヒト結腸腫瘍の１９のうちの１４（７４％）で正常ヒト結腸組織と比較しておよそ２−４倍の増加があった（図１８Ｃ）。これらの結果は、Ｗｎｔ−１シグナル伝達はＲＡＲγの発現を促進するので、レセプターはＷｎｔ−１経路で促進されるマウス及びヒト腫瘍で上昇していることを示す。
【０２１４】
実験で見出されたことの考察
遺伝子発現プロファイリング手法は、ｍＲＮＡ転写物の偏りのない検出に基づいており、それ故に、遺伝子活性化がおこる機構に関する予期せぬ見識を引き出す。ここでは、Ｗｎｔによって誘導されるシグナル伝達経路とレチノイン酸の間の関連を示唆する、Ｗｎｔ−１がレチノイン酸応答遺伝子Ｓｔｒａ６の誘導を促進したことが示されてきている。この関連は、Ｗｎｔとレチノイン酸の組み合わせによるＳｔｒａ６の相乗的誘導を示すことによって、さらに裏付けられた。この相乗性を説明し得る少なくとも３つの選択肢がある：ｉ）Ｗｎｔに対して直接に応答する転写因子、例えばＴＣＦ／ＬＥＦｓは、Ｓｔｒａ６遺伝子のプロモーターエレメントと結合してそれを活性化し得る；ｉｉ）Ｗｎｔ経路のシグナル伝達経路は、適切なレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）と直接相互作用し、ＲＡＲによって媒介される遺伝子活性化を増強する；又はｉｉｉ）Ｗｎｔ−１によるシグナル伝達経路は適切なＲＡＲの発現を活性化し、それによって細胞にレチノイン酸に対する感作性を与える。ここに示すデータが、Ｗｎｔ−１シグナル伝達がＲＡＲγレセプターの発現を迅速に誘導することを示すためにこの最後の案が好ましいが、本発明は、任意の特定の理論又は作用機構によって限定されない。
【０２１５】
これまでの研究によると、ＲＡＲγ遺伝子の特異的な破壊によってレチノイドによるＳｔｒａ６遺伝子の誘導を大幅に減少し、これは，後にこのレセプターの再発現によって復活する（Ｔａｎｅｊａら．， 上掲）。しかし、ＲＡＲγのＷｎｔ−１誘導発現以外の機構も、観察された相乗性の一因となり得る可能性がある。β−カテニンがレチノイン酸レセプターと結合するという案は魅力的であるが、我々は、我々の細胞株において、内因性のＲＡＲγのβ−カテニンとのいかなる特異的な関連性も観察しなかった。しかし、インビトロで示されたβ−カテニンのＲＡＲγとの結合（Ｅａｓｗａｒａｎら．， １９９９， 上掲）は、Ｗｎｔ−１によるＳｔｒａ６の活性化と関連し得る。ＲＡＲγの無いトランスジェニック哺乳動物でのＳｔｒａ６の発現パターンは、野生型の同腹子で観察されたものよりも広く分布しており、レチノイン酸によるＳｔｒａ６の誘導は、コントロールと比較してヌル哺乳動物の細胞で増大していた（Ｂｏｕｉｌｌｅｔら．， １９９７， 上掲；Ｔａｎｅｊａら．， １９９５， 上掲）。従って、ＲＡＲγは、Ｓｔｒａ６発現に対して阻害性があり得て、β−カテニンがＲＡＲγ機能を阻害した場合には、Ｗｎｔ−１によるβ−カテニンの活性化は、この阻害を緩和する可能性があり得る。
【０２１６】
Ｗｎｔ−１シグナル伝達によるレチノイン酸応答遺伝子の相乗的誘導は、Ｗｎｔ−１経路に遺伝的欠陥を有するヒト癌はＳｔｒａ６の過剰発現を示すであろうことを意味する。結腸直腸腫瘍の殆どは、ＡＰＣ腫瘍サプレッサー又はβ−カテニンのどちらかをコードする遺伝子に変異を有しており（Ｐｏｌａｋｉｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｔ． Ｄｅｖ． ９：１５−２１［１９９９］）、よって、我々は、一致する正常組織に対して、１４の結腸直腸腫瘍のうちの１４にＳｔｒａ６転写物の過剰発現を検出した（実施例１２を参照せよ）。β−カテニンの変異を活性化は、卵巣及び子宮内膜の癌、ウィルムス腎臓腫瘍及びメラノーマでも同定されており、このことは、Ｗｎｔ−１シグナル伝達の欠損がこれらの癌の進行の一因であることを示している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら．， Ｊｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ９０：５５−９（１９９９）； Ｋｏｅｓｔｅｒｓら．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５９： ３８８０−２（１９９９）； Ｐａｌａｃｉｏｓ及びＨａｍａｌｌｏ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８： １３４４−７（１９９８）；Ｒｉｍｍら．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １５４： ３２５−９（１９９９）；Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２： １７３１−１７３４（１９９３）；Ｗｒｉｇｈｔら．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８２： ６２５−９（１９９９））。インサイツハイブリダイゼーションによって、これらヒト癌のうち４つすべてがＳｔｒａ６ｍＲＮＡの過剰発現を示した（実施例１２を参照）。副腎髄質由来の腫瘍である褐色細胞腫は、極めて高いレベルのＳｔｒａ６ ｍＲＮＡを示したが、Ｗｎｔ−１シグナル伝達経路の変異に関するこれら腫瘍の状態については報告がなかった。メラノーマ及び褐色細胞腫を生じる細胞型が共に神経冠から発生学的に誘導したことは、興味をもたらすことである。特に、腎臓のウィルムス腫瘍、褐色細胞腫、及び子宮内膜癌腫のすべては、Ｓｔｒａ６ が正常に発現している臓器で発生する。これは、例えばＷｎｔ−１経路によって作動する腫瘍化シグナル伝達系が分化を担うシグナルと相互作用することができ、よってＳｔｒａ６ の発現を過剰に活性化することを示唆している。
【０２１７】
ヒトＳｔｒａ６タンパク質に対する特異的なモノクローナル抗体による結腸直腸癌細胞の染色で確かめられるように、ヒトＳｔｒａ６タンパク質は細胞表面にある。さらには、細胞膜で観察された染色強度は、レチノイン酸による細胞の処理の後で増加した。従って、Ｓｔｒａ６ は、細胞表面に局在化するマルチパス膜貫通タンパク質をコードするようである。
本スクリーニングで同定した１つの遺伝子であるＩＳＲＬがＳｔｒａ６遺伝子と隣接していることが見出されたことが知られている。Ｓｔｒａ６及び／又はＩＳＲＬに隣接する任意の他の遺伝子、又はＳｔｒａ６及び／又はＩＳＲＬと極めて接近して位置する任意の遺伝子が、本発明の方法にとって良い候補であると考えられている。
【０２１８】
実施例１４：　Ｗｎｔ−１及びレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）シグナル伝達によって相乗的に誘導されるさらなる遺伝子の同定
上の実施例１３に開示のデータは、内因性レチノイン酸応答遺伝子Ｓｔｒａ６がＷｎｔ−１発現によって活性化されることを示す。さらには、Ｓｔｒａ６は、レチノイン酸とＷｎｔ−１の組み合わせによって相乗的に活性化された。このｓｔｒａ６の相乗的活性化は、細胞内シグナル伝達成分の過剰発現を必要とせず、それ故に、もっぱら対応するレセプターに対して応答性のある内因性シグナル伝達分子によって媒介される。また、異常に活発なＷｎｔシグナル伝達を示すヒト結腸直腸癌細胞は、高レベルのＳｔｒａ６タンパク質を産生することによって、レチノイン酸処理に反応した。これは、正常な生理学的又は病理学的症状の下では、ＲＡＲとＷｎｔシグナル伝達経路の間で本物のクロストークが起こり得たことを示唆している。
【０２１９】
レチノイン酸によるＳｔｒａ６発現の誘導がオンコジーンの前歴があるとより強力であったことは、我々に、この効果を利用することができる可能性のある治療的用途を考えることを促す。Ｓｔｒａ６遺伝子が細胞表面タンパク質をコードするので、適切な用途は癌における免疫治療である。臨床でのヒト癌治療において証明済みの治療用抗体の有用性によって、最近、免疫治療の開発及び改良を目的とする極めて強い活性が否定された。理想的には、これらの療法は、身体中で、正常な組織に存在する細胞表面抗原よりも、癌細胞上の細胞表面抗原が極めて高いレベルで存在することを必要とする。正常組織と対比した腫瘍上での特異的発現に関するそのような判断基準は、明らかに免疫療法にとって望ましいと考えられる抗原の数を限定する。従って、正常細胞と比べて癌細胞の抗原発現のレベルを選択的に高める薬剤は、これら抗原に対する免疫療法に関する治療上の指標を改善すると期待される。最後に、我々は、Ｗｎｔ−１形質転換細胞をレチノイン酸で処理することによって優先的にアップレギュレーションされるさらなる抗原を同定するために、スクリーニングをおこなった。
【０２２０】
材料及び方法
細胞培養
マウスＣ５７ＭＧ乳房上皮細胞株を操作し、細胞培養培地（Ｋｏｒｉｎｅｋら．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８： １２４８−５６［１９９８］）からのテトラサイクリンの回収によってＷｎｔ−１プロトオンコジーンが発現するようにした。この細胞は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２００ｎｇ／ｍｌテトラサイクリン、４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８、及び１００μｇ／ｍｌハイグロマイシンＢを補充したダルベッコ改良イーグル培地の１０ｃｍシャーレで、およそ６０％のコンフルエントになるまで生育させた。細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、４８時間にわたって、１μＭ オール−トランス−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）又は等容量のＤＭＳＯのどちらかを含むテトラサイクリンを含まない培地で培養し、収集した。コントロールの細胞は、１μＭ のＡＴＲＡ又はＤＭＳＯのどちらかを含むテトラサイクリンを含む培地でもっぱら維持した。すべてのシャーレを同時に収集し、全ＲＮＡを抽出した。細胞の生育及び処理、そしてそれらからのＲＮＡの精製は、２つの別々時間でおこなった。これらの実験以外に、上記の条件下で生育した細胞が２４，４８，７２時間目に収集されて、タイムコースがおこなわれた。この実験だけの４８時間の結果と、上記の２つの４８時間の実験の結果が三組のデータセットを構成し、結果の部分に示されている。
【０２２１】
全ＲＮＡ抽出
細胞を３．５ｍｌの可溶化バッファー（４Ｍ チオシアン酸グアニジン、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム、０．５％ Ｎ−ラウリル サルコシン、０．７％ ２−メルカプトエタノール）で可溶化し、１．５ｍｌの５．７Ｍ 塩化セシウム／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液で層状にした。この可溶化液を１５０，０００ｘｇで終夜スピンした。ＲＮＡペレットを乾燥させ、水に再懸濁し、フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿した。このＲＮＡは、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度となるように再懸濁し、−７０℃で保存した。
【０２２２】
オリゴヌクレオチドアレイ
およそ１０ｍｇの各ＲＮＡ試料は、アフィメトリクス（サンタ　クララ，カリフォルニア）のマイクロアレイシステムでのオリゴヌクレオチドアレイ分析に必要なプローブの調製のための出発物質として役立つ。プローブは、前出で記載のプロトコールに従って調製した（Ｗｏｄｉｃｋａら． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：１３５９−１３６７（１９９７））。ハイブリダイゼーションに続いて、このアレイを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで染色し、その後でＧｅｎｅ Ａｒｒａｙ スキャナー（アジレント・テクノロジー）でスキャンした。アフィメトリクス　データ分析ソフトウエアパッケージで示されたデフォルトパラメーターを、アベレージ　ディファレンスと呼ばれているシグナル強度、及びアフィメトリクス「Ａ」Ｍｕ７４チップ上に設定されている１２，０００遺伝子プローブセットのフォールド　ディファレンスの測定に応用した。ＡＴＲＡの存在又は非存在下でＷｎｔ−１を発現している細胞、又はＷｎｔ−１発現の非存在下でＡＴＲＡで処理した細胞から誘導したプローブで得たアベレージ　ディファレンスを、未処理コントロール細胞から得たアベレージ　ディファレンスに対してベースライン化し、各遺伝子の判定に関するフォールド　ディファレンスを作成した。
【０２２３】
逆転写酵素 − ＰＣＲ（ＲＴ − ＰＣＲ）分析
パーキンエルマー，アプライドバイオシステムズのＡＢＩ７７００配列検出装置のＴａｑｍａｎアッセイ試薬を使用する定量ＲＴ−ＰＣＲを利用して、遺伝子発現の確認をおこなった。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、１００ｎｇ ＲＮＡ、５μｌ １０ｘ ＴａｑｍａｎバッファーＡ、３００μＭの各ｄＮＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ユニットのリボヌクレアーゼインヒビター、１２．５ユニットのＭｕＬＶ逆転写酵素、１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、２００ｎＭ プローブ、及び５００ｎＭ プライマーで構成した。反応条件は、３０分間にわたる４８℃での逆転写酵素、１０分間にわたる９５℃での変性、並びに４０サイクルの２５秒間の９５℃及び１分間の６５℃で構成した。反応産物は、４−２０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。
【０２２４】
すべての試料を、最初に、各試料のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のレベルにノーマライズしたΔΔＣｔ法を用いて、倍数誘導を得た。次いで、実験試料とそのコントロールとの間で相対標準単位を比較した。マウスＧＡＰＤＨ、エフリン Ｂ１、４−１ＢＢリガンド、並びにＩＳＬＲプライマー及びプローブ配列は次の通りである：
ＧＡＰＤＨ正方向プライマー：５’−ＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ−３’（配列番号：１７）
逆プライマー：５’−ＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣ−３’（配列番号：１８）
プローブ：５’−ＣＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＣ −３’（配列番号：１９）
エフリンＢ１前方向プライマー：５’−ＧＴＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＴＡＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号：２０）
逆プライマー：５’−ＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＡＡＡＡ−３’（配列番号：２１）
プローブ：５’−ＴＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴ−３’（配列番号：２２）
４１ＢＢリガンド前方向プライマー：５’−ＴＣＧＣＣＡＡＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＡＡ−３’（配列番号：２３）
逆プライマー：５’−ＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＡＧＴＴＣＡ−３’（配列番号：２４）
プローブ：５’−ＡＡＣＣＡＡＧＣＡＴＣＧＴＴＧＴＧＣＡＡＴＡＣＡＡＣＴＣ−３’（配列番号：２５）
ＩＳＬＲ前方向プライマー：５’−ＧＣＣＡＧＴＡＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＡＧ−３’（配列番号：２６）
逆プライマー：５’−ＣＡＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＴＣＴＡＡＡＡ−３’（配列番号：２７）
プローブ：５’−ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＡ−３’（配列番号：２８）
【０２２５】
ウェスタンブロッティング
指示された処置に従い、細胞をトリトンＸ−１００溶解バッファー（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１０％グリセロール、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ バナジウム酸ナトリウム、５０ｍＭ フッ化ナトリウム、及びコンプリート プロテアーゼインヒビターカクテル（べーリンガー・マンハイム、マンハイム　ドイツ））で可溶化し、タンパク質相当物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティングに供した。ブロットは、０．１μｇ／ｍｌ抗−ＥＲＫ２モノクローナル抗体（トランスダクションラボラトリーズ、レキシントン、ケンタッキー）、抗−ｍｙｃタグモノクローナル抗体とインキュベートした。ＥＣＬシステム（アマシャム）を使用して、ブロットを展開した。
【０２２６】
ルシェフェラーゼ活性
ＲＡＲ−依存性転写活性化を確かめるために、製造者指示書に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）トランスフェクション試薬を使用し、Ｃｏｓ−７細胞を、指示された発現プラスミド及びＴＲＥｐａｌルシェフェラーゼレポーターコンストラクト（Ｂｅｙｅｒｓ）を同時トランスフェクトした。発現プラスミドは、どこにでも記載されている。細胞を、トランスフェクションの日に１μＭ ＡＴＲＡ又はＤＭＳＯコントロールで処理し、７２時間後にトリトンＸ−１００可溶化バッファーに溶解することによって収集した。Ｔｒｏｐｉｘ ＴＲ７１７マイクロプレートルミノメーター１０μｌの可溶化液のルシェフェラーゼ活性を分析した。活性は、ＳＶ４０−Ｒｅｎｉｌｌａルシェフェラーゼで同時トランスフェクションによって、Ｒｅｎｉｌｌａルシェフェラーゼ活性に対してノーマライズした。ＬＥＦ／ＴＣＦ−依存性転写活性は、指示されたプラスミド及びＴｏｐ−ｔｋ−ルシェフェラーゼプラスミドによる同時トランスフェクションによって確かめた。活性は、上記のようにして測定した。
【０２２７】
結果
マウスＣ５７ＭＧ乳房上皮細胞株は、種々のＷｎｔ遺伝子の発現に応答して、形態学的な形質転換を起こす（Ｗｏｎｇら．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４：６２７８−６２８６（１９９４））。培養培地からのテトラサイクリンの除去に応答してＷｎｔ−１を条件的に発現するように操作したこの細胞株の変形を、遺伝子発現プロファイリング実験に用いた。レチノイン酸とＷｎｔ−１シグナル伝達の組み合わせによって優先的に活性化された遺伝子を同定するために、細胞の処理に関する４つの異なる条件を確立した。コントロールとして、細胞を、テトラサイクリンに加えてレチノイン酸の溶媒であるＤＭＳＯを含有する培地に放置した。細胞の二番目のシャーレを、テトラサイクリンの存在下で１００ｎＭ オール−トランス−レチノイン酸（ＡＴＲＡ）で処理し、その一方で、三番目のシャーレはＤＭＳＯコントロールを受け取り、そのテトラサイクリンを取り除いてＷｎｔ−１の発現を活性化した。最後に、４番目のシャーレの細胞をＡＴＲＡで処理し、そのテトラサイクリンを取り除いた。４８時間のインキュベーション期間に続いて、細胞を収集し、ＲＮＡを抽出して精製した。ＲＮＡから合成したプローブを、１２，０００オリゴヌクレオチドプローブセットを含むアフィメトリクス　マウス　ジーンチップ「Ａ」Ｍｕ７４へハイブリダイズした。細胞の成長及び処理から始まる実験を、３回別々におこなった。すべての実験の未処理細胞と比較して少なくとも２倍増加又は５０％増加が起こったｍＲＮＡ転写物に関して、データを示す。さらに、ＲＮＡを処理細胞から収集した２４、４８、及び７２時間目にタイムコースをおこなった。選択遺伝子のみに関して、これらのデータは含まれている。
レチノイン酸のみによるＣ５７ＭＧ細胞の処理は、多くの遺伝子の強い活性化を引き起こした（表１）。
【０２２８】
Figure 2004507251
【０２２９】
Figure 2004507251
【０２３０】
Figure 2004507251
【０２３１】
いくつかの遺伝子、例えば、デコリン（Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｄ．及びＳａｓｓｅ， Ｊ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６７：２５３６４−２５３７０（１９９２））、ＣＯＵＰＴＦ−１（Ｃｌｏｔｍａｎら．， Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌ Ｔｅｒａｔｏｌ ２０：５９１−５９９（１９９８））、１１−ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｔｒｅｍｂｌａｙら．， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ ６０：５４１−５４５（１９９９））、３−Ｏ−スルフォトランスフェラーゼ（Ｚｈａｎｇら．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：２７９９８−２８００３（１９９８））、Ａｂｃａ１（Ｗａｄｅ， Ｄ． Ｐ．及びＯｗｅｎ， Ｊ． Ｓ．， Ｌａｎｃｅｔ ３５７：１６１−１６３（２００１））及びセルロプラスミン（Ｋｏｊら．， Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ ３７４：１９３−２０１（１９９３））が他の細胞型のレチノイン酸によってアップレギュレーションされていることが、以前、報告されている。我々のスクリーニングでのこれら遺伝子の同定は、Ｃ５７ＭＧ細胞が適切にレチノイン酸に応答し、レチノイン酸のシグナル伝達に関する共通の終点が多様な細胞型に存在していることを示す。レチナール短鎖デヒドロゲナーゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ３等のレチノイン酸によって誘導される他の遺伝子は、レチノイドの代謝に関わり、その結果、レチノイン酸そのものへのフィードバック又はフィードフォワード応答を示し得る酵素をコードする（Ｄｕｅｓｔｅｒ， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：４３１５−４３２４（２０００））。最終的には、レチノイン酸によって誘導される幾つかの遺伝子、例えば、オートタキシン（ａｕｔｏｔａｘｉｎ）、チオエーテルＳ−メチルトランスフェラーゼ及びアンギオテンシノーゲンは、レチノイン酸のシグナル伝達又は代謝と何ら明白な関係がなく、レチノイン酸に応答性のレセプターによって活性化されたという報告は以前にはなかった。
【０２３２】
Ｗｎｔ−１によって誘導される遺伝子を同定するために、レチノイン酸の非存在下で、細胞からテトラサイクリンを取り除いた。これらの条件下では、３つすべての実験のコントロール細胞と比較して、２倍又はより高いレベルで発現している１３の転写物が同定された。これは、これら細胞でＷｎｔ−１シグナル伝達によって実際に誘導された遺伝子の数の過小評価だと思われる。実際に、Ｗｎｔ−１シグナル伝達の標的であるサイクリンＤ１を含む多くのさらなる遺伝子（Ｔｅｔｓｕ Ｏ．及びＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｆ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８：４２２−４２６（１９９９））は、３つのうち２つの実験のみで同定されるか、又は２倍カットオフに足りなかった。我々のスクリーニングで同定された２つの遺伝子であるＴＣＦ１及びＢＴＥＢ２転写因子は、以前、Ｗｎｔシグナル伝達の標的であると報告された（Ｚｉｅｍｅｒら．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２１：５６２−５７４（２００１）； Ｒｏｏｓｅら．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１９２３−１９２６（１９９９））。
【０２３３】
ＤＮＡに結合するが、β−カテニン結合部位を欠くＴＣＦ−１のスプライスバリアントは、Ｗｎｔ−１シグナル伝達でネガティブフィードバックを示し、その結果、腫瘍サプレッサーとして機能する。さらには、Ｗｎｔレセプターの１つであるフリズルド−２（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−２）も、Ｃ５７ＭＧ細胞株では、Ｗｎｔシグナル伝達によってアップレギュレーションされていた。
ＧＡＤＤ４５ガンマ及び４−１ＢＢリガンド等のＷｎｔ−１によってアップレギュレーションされている幾つかの遺伝子は、Ｗｎｔ−１の過剰発現に起因する不適切な成長シグナル伝達に対する応答を示し得る。この４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７）は、種々のヒト細胞株で発現し、腫瘍拒絶でのＴ細胞応答を刺激するＴＮＦスーパーファミリーメンバーである。ＧＡＤＤ４５γ／ＣＲ６の活性化は、Ｗｎｔシグナル伝達がＤＮＡ複製の忠実度に作用するエラーを促進する。実際に、ｐ５３の変異はＷｎｔ−１の過剰発現と協同し、染色体不安定性を示すマウスの腫瘍を生成する（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ９：８８２−８９５（１９９５））。Ｗｎｔ−１、セマフォリンＥ及びオートタキシンによってアップレギュレーションされている２つのさらなる遺伝子は、癌細胞の運動性及び転移性の伝播を助長する因子として、ヒト腫瘍の進行と結びつけられてきた（Ｍａｒｔｉｎ−Ｓａｔｕｅ， Ｍ．及びＢｌａｎｃｏ， Ｊ．， Ｊ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ ７２：１８−２３（１９９９）；Ｙａｍａｄａら．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：１４７１３−１４７１８（１９９７）；Ｎａｍら．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：２４１−２４７（２０００））。
【０２３４】
上記のように、我々は、Ｗｎｔ−１シグナル伝達によって活性化される遺伝子としてｓｔｒａ６を同定した。Ｓｔｒａ６は、レチノイン酸レセプターシグナル伝達によって誘導されるｍＲＮＡ転写物を検出するために設計されたスクリーニングで同定された（Ｂｏｕｉｌｌｅｔら．， Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １７０：４２０−４３３（１９９５））。我々はレチノイン酸がｓｔｒａ６の発現を誘導することを見出したが、Ｗｎｔ−１及びレチノイン酸の組み合わせによるその相乗的活性化も示した（上掲の実施例１３を参照せよ）。従って、我々は、ｓｔｒａ６以外に遺伝子が同じような様式で活性化されるかどうかに関心を持っていた。我々の以前の成果と一致し、これら薬剤の組み合わせは、結果としてどちらかの薬剤のみで観察されたことを大幅に超える発現レベルを引き起こしたが、ｓｔｒａ６はレチノイン酸又はＷｎｔ−１のどちらかによって活性化された（図１９）。同じパターンの発現がオートタキシンに関しても観察され、レチノイン酸又はＷｎｔ−１のみの存在下では中程度の活性化が起こったが、両刺激に対する応答ではより強い誘導が起こった（図２０）。オートタキシンの相乗的活性化は、発現プロファイリングスクリーニングで利用されたのと同じ処理に供したＣ５７ＭＧ細胞から抽出したＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲ分析をおこなうことによって確かめられた。レチノイン酸のみでは４１ＢＢリガンド及びエフリンｂ１の発現には顕著な作用を示さなかったが、４１ＢＢリガンド及びエフリンｂ１は、また、Ｗｎｔ−１及びレチノイン酸によって相乗的に誘導された（図２１及び２２）。これら２つの遺伝子の相乗的活性化も、ＲＴ−ＰＣＲによって確かめられた。エフリンｂ１の場合には、抗体は商業的に入手可能であり、タンパク質発現のレベルでの相乗的活性化を示すのに使用された（図２２）。エフリンｂ１及び４１ＢＢリガンドの活性化とは対照的に、ＩＳＬＲ遺伝子はＷｎｔではなく、レチノイン酸に対して応答性があり、その一方で、両薬剤の組み合わせは、結果としてレチノイン酸のみの場合を超える活性化を引き起こす（図２３）。Ｍ−ｒａｓ及びタイト結合タンパク質ＺＯ−１等の幾つかの遺伝子は、レチノイン酸又はＷｎｔ−１のみのどちらかに対しては顕著に応答しないようで、組み合わせによる処理によってのみ活性化した（図２４）。
【０２３５】
その効果を媒介するシグナル伝達機構は明確に定義されていないが、レチノイン酸及びＷｎｔ−１の組み合わせによってある遺伝子が相乗的活性化を起こすことは明白である。我々は、Ｗｎｔ−１発現によって活性化されるＲＡＲｇタンパク質のレベルの増加を見出した（データは開示せず）。従って、Ｗｎｔによって活性化される細胞は、ＲＡＲｇのより高いレベルのために、レチノイン酸に対してより反応性があり得る。しかし、Ｗｎｔ−１及びレチノイン酸によるｓｔｒａ６の相乗的活性化は、ＲＡＲｇのどんな観察可能な増加も越え、さらなる機構が作用していることを示唆した。さらには、ｓｔｒａ６を活性化するＷｎｔ−１のみの能力は、ＲＡＲシグナル伝達のパン−アンタゴニストによって阻害された。これは、外因的に添加したＲＡの非存在下でさえも、ｓｔｒａ６の誘導に関して、Ｗｎｔ−１がレチノインＲＡＲに依存していることを示唆している。従って、β−カテニンがＴＣＦ／ＬＥＦ転写因子と相互作用する標準的なＷｎｔ−１経路が関与しないＲＡＲシグナル伝達を、Ｗｎｔが促進することは想像できる。これを検討するために、我々はβ−カテニンの発癌遺伝子を過剰発現させ、過剰発現したＬＥＦの存在及び非存在下でのＲＡＲ応答エレメント（ＲＡＲＥ）の活性化を測定した。ルシェフェラーゼの産生の増加によって確めたように、β−カテニンの発現はＲＡＲＥを活性化した（図２５Ａ）。しかし、β−カテニンの同時発現はＲＡＲＥ活性を増強しなかったが、逆に、β−カテニンによってその活性化を阻害した。これは、ＬＥＦのβ−カテニンとの同時発現によってさらに活性化する、ＬＥＦ応答エレメントであるＴｏｐＦｌａｓｈにはあてはまらなかった（図２５Ｂ）。この結果は、ＬＥＦが関与しない形でβ−カテニンが幾つかのレチノイン酸応答遺伝子の活性化に関わっていることを示す。β−カテニンによってＲＡＲＥの活性化を阻害するＬＥＦの能力は、ＬＥＦ上のβ−カテニン結合部位がこの効果にとって必要であったように、競合結合に起因する可能性が最も高い（データは示さず）。この結果は、β−カテニンとＲＡＲシグナル伝達成分の相互作用を妨げ、その結果としてそれがＲＡＲシグナル伝達を増強することを阻止する形でＬＥＦがβ−カテニンと結合することを示唆する。
【０２３６】
実施例１５：　移植した乳腺腫瘍でのＳｔｒａ６の誘導
上の実施例１４に示したＣ５７ＭＧ細胞株での結果は、Ｗｎｔ及びレチノイン酸によって相乗的に誘導されるｍＲＮＡ転写物の高いレベルの発現によって、Ｗｎｔシグナル伝達によって誘導された腫瘍がレチノイン酸に対して応答する可能性があることを示唆している。これを検討するために、実施例１３に記載のように作製したＷｎｔ−１トランスジェニックマウスから誘導した哺乳動物腫瘍を、後にレチノイン酸を投与した天然マウスの乳腺脂肪体へ移植した。溶媒コントロールではなく、レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の投与は、結果として移植したマウス乳腫瘍でＳｔｒａ６ｍＲＮＡのアップレギュレーションを引き起こしたが、正常な乳腺組織ではＳｔｒａ６発現に対して顕著な作用を示さなかった。
【０２３７】
図２６に示したデータは、１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ（約１０ｍｇ計／２５グラム マウス）のオール−トランスレチノイン酸の腫瘍周囲への注射の後のＳｔｒａ６の誘導の効果を示す。我々は、レチノイン酸のみに応答するコントロール遺伝子であるレチナールＤＨＲが、正常乳腺組織で誘導されることも見出した（データは示さず）。図２６では、「Ｔｕｍ」は移植したマウス乳腫瘍を意味する；「ＭＧ」は正常乳腺組織を意味し、「ＰＴ」は腫瘍周囲を意味し、そして「ＭＧ」及び「Ｔｕｍ」の直ぐ前の数は、試料を取り出した特定の動物を指すために用いられている。示されたデータは、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨに対してノーマライズしたｍＲＮＡの発現レベルである。特に、標準曲線を使用して、分析される各試料に対するＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子と共に、対象である各遺伝子の発現の相対的レベルを測定した。相対標準単位は、対象である遺伝子のｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルで割ることによって得た。処理の８時間後に、腫瘍及び正常な近接する乳腺を収集した。
【０２３８】
図２７は、ＷｉＤｒ異種移植片を有するヌードマウスへのＡＴＲＡの投与によってもＳｔｒａ６が誘導されることを示す。特に、マウスにＡＴＲＡをｐｅｒ ｏｒｕｍ（ＰＯ）で４００ｍｇ／ｋｇ与えた。処理の１２時間後に、腫瘍を収集した。この実験では、腫瘍周囲への投与とともに、ＡＴＲＡ（ＰＯ）の経口投与を試験した（データ示さず）。図２７に示したデータは、未処理コントロールと比較して、４００ｍｇ／ｋｇのＡＴＲＡの経口投与が選択的にＳｔｒａ６ｍＲＮＡをアップレギュレートすることを示す。上で論じたように、ｍＲＮＡ発現レベルをノーマライズした。
【０２３９】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，１０８０１　ユニバーシティー ブルバード， マナサッス， バージニア， ２０１１０−２２０９ アメリカ合衆国（ＡＴＣＣ）に寄託した：
Figure 2004507251
【０２４０】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６　ＯＧ　６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０２４１】
本出願の譲受人は、寄託した材料が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託材料の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０２４２】
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。
本発明の教示の特定の課題又は状況へ応用することが、ここに包含されている教示の観点から、当該分野の通常の技術を有する者の能力の範囲内にあることは理解されている。本発明の方法及び産物の例を本発明を限定するよう構成されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヌクレオチド配列（配列番号：１）がここで「ＤＮＡ１４８３８０−２８２７」と命名されているクローンである、天然配列ＰＲＯ１０２８２（ｓｔｒａ６）をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド１−２７３２）を含有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。また、太字及び下線で表されているのは、それぞれの開始及び終止コドン。
【図２】配列番号：１のコード化配列から誘導した天然配列ＰＲＯ１０２８２（ｓｔｒａ６）ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）。また、示されているのは、種々の他の重要なポリペプチドドメインのおおよその位置である。
【図３Ａ−Ｄ】「ＰＲＯ」が対象である仮説的ＰＲＯ１０２８２ポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象である「ＰＲＯ」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」が対象である仮説的ＰＲＯ１０２８２コード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象である「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を表し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」のそれぞれが異なる仮説的アミノ酸残基を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」のそれぞれが異なる仮説的ヌクレオチドを表す、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムを用いる％アミノ酸配列同一性（図３Ａ−Ｂ）及び％核酸配列同一性（図３Ｃ−Ｄ）を決定するために下記の方法を使用することに関する仮説的例を示す。
【図４Ａ−Ｑ】ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータープログラムに関する完全なソースコードを提供する。このソースコードは、ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを提供するために、ＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のために日常的にコンパイルされ得る。
【図５】ここでＤＮＡ１０００３８（配列番号：３）と命名されているヌクレオチド配列を示す。
【図６】ヌクレオチド配列（配列番号：４）がここで「ＤＮＡ１４８３８９−２８２７−１」と命名されている、天然配列ヒトＳｔｒａ６ポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド１−２７７８）を含有するｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４）を示す。
【図７】配列番号：４のコード化配列から誘導された天然配列ヒトＳｔｒａ６ポリペプチド変異体のアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。また、示されているのは、種々の他の重要なポリペプチドドメインのおおよその位置である。
【図８】マウスＳｔｒａ６の概略図、及びＤＮＡ１４８３８０−２８２７（天然ヒトＰＲＯ１０２８２）によってコードされているヒトＳｔｒａ６タンパク質を示す。
【図９】ＤＮＡ１４８３８０−２８２７（天然ヒトＰＲＯ１０２８２）によってコードされている天然配列ヒトＳｔｒａ６タンパク質のハイドロパシープロットを示す。
【図１０】種々の正常ヒト組織のＤＮＡ１４８３８０−２８２７によってコードされている天然配列ヒトＳｔｒａ６タンパク質に関する相対ＲＮＡ発現プロファイルを示す。
【図１１】定量ＰＣＲによってアッセイされた、同じ患者の正常な粘膜でのＲＮＡ発現に対するヒト結腸腫瘍組織のＤＮＡ１４８３８０−２８２７によってコードされている天然配列ヒトＳｔｒａ６タンパク質に関するＲＮＡ倍数発現を示す。このデータは、三通りにおこなった１つの実験からである。実験は、異なるＰＣＲプライマーの組みによって少なくとも２回繰り返された。
【図１２Ａ】ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨをコントロールとして使用した、同じ患者の正常な粘膜でのＲＮＡ発現に対するヒト結腸腫瘍組織のＤＮＡ１４８３８０−２８２７によってコードされている天然配列ヒトＳｔｒａ６タンパク質に関するＲＮＡ発現を示す。
【図１２Ｂ】インサイツハイブリダイゼーションによる、結腸腺癌の上皮腫瘍細胞へのＳｔｒａ６の局在化を示す。
【図１３】正常細胞株に対するヒト乳房、腎臓、結腸及び肺腫瘍細胞株のＤＮＡ１４８３８０−２８２７によってコードされている天然ヒトＳｔｒａ６タンパク質に関するＲＮＡ発現を示す。
【図１４】大腸菌での、ＤＮＡ１４８３８０−２８２７によってコードされている天然配列ヒトＳｔｒａ６タンパク質から誘導されるペプチド断片の発現を例示している。
【図１５】オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）及び９−シス−レチノイン酸（９ｃＲＡ）のそれぞれが存在及び存在しない下でのヒト結腸癌細胞のＳｔｒａ６ ＲＮＡ発現を例示する。
【図１６】腫瘍切片のＳｔｒａ６に関するインサイツハイブリダイゼーション。銀目を示している暗領域画像（Ａ，Ｃ，Ｅ，Ｇ）は、対応するヘマトキシリン／エオジン染色明領域画像（Ｂ，Ｄ，Ｆ，Ｈ）とともに示されている。銀目の中程度の密度は、悪性メラノーマの血管ではなく腫瘍細胞の上に横たわっている（Ａ，Ｂ）。子宮内膜腺癌の腫瘍性上皮組織は中程度に標識されているのに対して、腫瘍間質はネガティブである（Ｃ，Ｄ）。ウィルムス腫瘍の再生芽領域は高い発現レベルを示すのに対して、腫瘍間質はネガティブである（Ｅ，Ｆ）。褐色細胞腫が非常に高いＳｔｒａ６ｍＲＮＡ発現を示し、その一方で近接する正常副腎皮質はネガティブである（Ｇ，Ｈ）。スケール棒＝１００ミクロン。
【図１７】（Ａ）Ｃ５７ＭＧ／親及びＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞での、９−シス−ＲＡ又はオールトランス型−ＲＡへの応答によるＳｔｒａ６ｍＲＮＡ発現の誘導。（Ｂ）Ｗｎｔ−３Ａ条件付き培地及び９−シス−ＲＡへの応答によるＣ５７ＭＧ／親細胞でのＳｔｒａ６ｍＲＮＡ発現の誘導。（Ｃ）ＨＣＴ１１６及びＷｉＤｒ結腸腺癌細胞のレチノイン酸処理後のＳｔｒａ６ｍＲＮＡ発現の誘導。（Ｄ）レチノイン酸による処理前（上のパネル）及び後（下のパネル）のＨＣＴ１１６細胞でのインサイツハイブリダイゼーションによるＳｔｒａ６発現を示す暗領域画像。（Ｅ）ヒトＳｔｒａ６ペプチドＢに対するモノクローナル抗体によるウェスタンブロットによって視覚化された、レチノイン酸による処理前（−ＲＡ）及び後（＋ＲＡ）のＷｉＤｒ細胞でのＳｔｒａ６タンパク質発現。（Ｆ）レチノイン酸で未処理（左のパネル）又は処理（右のパネル）したＷｉＤｒ細胞でのＳｔｒａ６膜の局在化。免疫組織化学は、抗−ヒトＳｔｒａ６ペプチドＢモノクローナルハイブリドーマ培養上清によっておこなった（クローン１２Ｆ４．２Ｈ９．１Ｄ５）。Ａ−Ｆに示す実験に関しては、細胞をレチノイン酸で４８時間処理した。定量ＰＣＲ反応の完了後に得られたＳｔｒａ６産物は、各Ａ−Ｃの下に示されている。
【図１８】（Ａ）Ｗｎｔ−１はＲＡＲγ−１発現を誘導する。０，２４，４８，又は７２時間にわたってテトラサイクリンが存在しない下でのテトラサイクリン抑制性Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞からの全細胞可溶化物のタンパク質等量をＳＤＳ−ＰＡＧＥへ供し、ＲＡＲγ−１及びＥＲＫ２について免疫ブロットした。（Ｂ）Ｗｎｔ−１トランスジェニックマウスの過形成乳腺及び乳腺腫瘍でのＲＡＲγ−１ ｍＲＮＡの発現。ｍＲＮＡの発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲにとって確かめられ、そのデータは、野生型乳腺でのｍＲＮＡ発現に対する倍数発現で表されている。
【図１９】レチノイン酸（ＲＡ）及びＷｎｔ−１処理によるｓｔｒａ６の相乗的誘導を例示する。
【図２０】レチノイン酸（ＲＡ）及びＷｎｔ−１（Ｗｎｔ）によるオートタキシンの相乗的誘導を例示する。
【図２１】レチノイン酸（ＲＡ）及びＷｎｔ−１（Ｗｎｔ）による４１ＢＢリガンド（４１ｂｂ）の相乗的誘導を例示する。
【図２２】レチノイン酸（ＲＡ）及びＷｎｔ−１（Ｗｎｔ）によるエフリンｂ１の相乗的誘導を例示する。
【図２３】ＩＳＲＬ遺伝子がレチノイン酸（ＲＡ）に対して応答性があるがＷｎｔ−１（Ｗｎｔ）に対してはなく、その一方で、両薬剤の組み合わせによってレチノイン酸単独による場合を上回る活性化を引き起こすことを示す。
【図２４】タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１及びＭ−ｒａｓ遺伝子がレチノイン酸（ＲＡ）又はＷｎｔ−１のどちらか単独へは顕著に応答しないが、組み合わせの処理によって活性化することを示す。
【図２５Ａ】ルシェフェラーゼの増加した産生によって確かめられた、β−カテニンによるＲＡＲ応答エレメント（ＲＡＲＥ）の活性化を示す。
【図２５Ｂ】ＬＥＦ応答エレメントＴｏｐＦｌａｓｈが活性化するのはβ−カテニンのみによってだけではなく、ＬＥＦのβ−カテニンとの同時発現によってさらに活性化したことを示す。
【図２６】オールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）の種々の投与量による、腫瘍及び正常乳腺でのＳｔｒａ６ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示す。
【図２７】４００ｍｇ／ｋｇのＡＴＲＡで経口投与したマウスのＷｉＤｒ異種移植片でのＳｔｒａ６ ｍＲＮＡのアップレギュレーションを示す。

Claims (66)

  1. 異常Ｗｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる腫瘍細胞をレチノイドの有効量で処理する方法を含んでなる、前記細胞におけるタンパク質発現の選択的増強に関する方法。
  2. 前記タンパク質がＷｎｔ−１の組み換え及び前記レチノイドによってその発現の相乗的増強によって特徴付けられる、請求項１の方法。
  3. 前記タンパク質が細胞表面タンパク質である、請求項２の方法。
  4. 前記タンパク質が対応する正常細胞と比較して腫瘍細胞で過剰発現している、請求項２の方法。
  5. 前記タンパク質が４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、ＩＳＬＲ、オートタキシン、及びＳｔｒａ６より成る群から選択される、請求項２の方法。
  6. 前記タンパク質が４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、ＩＳＬＲ、及びＳｔｒａ６より成る群から選択される、請求項５の方法。
  7. 前記タンパク質が４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、及びＩＳＬＲより成る群から選択される、請求項６の方法。
  8. 前記レチノイドがレチノイン酸である、請求項１の方法。
  9. 前記腫瘍がヒト癌である請求項１の方法。
  10. 前記ヒト癌が卵巣癌、子宮体癌、ウィルムス腎臓腫瘍、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、又はメラノーマより成る群から選択される、請求項９の方法。
  11. レチノイド及び抗腫瘍剤の組み合わせの有効量で異常なＷｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる腫瘍を処理することを含んでなり、抗腫瘍剤がレチノイド処理によって発現が増強する前記腫瘍のタンパク質を標的とする、前記腫瘍の処置に関する方法。
  12. Ｗｎｔ−１及びレチノイドの組み合わせによって前記タンパク質の発現が相乗的に増強する、請求項１１の方法。
  13. 前記タンパク質が細胞表面タンパク質である、請求項１１の方法。
  14. 前記タンパク質が４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、ＩＳＬＲ、オートタキシン、及びＳｔｒａ６より成る群から選択される、請求項１１の方法。
  15. 前記タンパク質が４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、ＩＳＬＲ、及びＳｔｒａ６より成る群から選択される、請求項１４の方法。
  16. 前記タンパク質が４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、及びＩＳＬＲより成る群から選択される、請求項１５の方法。
  17. 前記レチノイドを前記抗腫瘍剤の投与前に投与する、請求項１１の方法。
  18. 前記レチノイドを前記抗腫瘍剤と同時に投与する、請求項１１の方法。
  19. 前記レチノイドを前記抗腫瘍剤の投与後に投与する、請求項１１の方法。
  20. 前記抗腫瘍剤が抗体である、請求項１１の方法。
  21. 前記抗体が抗体断片である、請求項２０の方法。
  22. 前記抗体がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディー、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多特異性抗体より成る群から選択される、請求項２１の方法。
  23. 前記抗体がキメラ抗体である、請求項２０の方法。
  24. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項２０の方法。
  25. 前記抗体がヒト抗体である、請求項２０の方法。
  26. 前記抗体が細胞傷害性剤とコンジュゲートしている、請求項２０の方法。
  27. 前記細胞傷害性剤が毒素である、請求項２６の方法。
  28. 前記毒素がメイタンシノイドである、請求項２７の方法。
  29. 前記抗体がＣＨＯ細胞で産生される、請求項２０の方法。
  30. 前記抗体が細菌で産生される、請求項２０の方法。
  31. 化学療法剤による処理をさらに含んでなる、請求項２０の方法。
  32. 放射線療法をさらに含んでなる、請求項２０の方法。
  33. 前記腫瘍がヒト癌である、請求項１１の方法。
  34. 前記ヒト癌が卵巣癌、子宮体癌、ウィルムス腎臓腫瘍、結腸癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、又はメラノーマより成る群から選択される、請求項３３の方法。
  35. （ａ）Ｗｎｔプロトオンコジーンを発現している細胞をレチノイドと接触させ；
    （ｂ）前記細胞の遺伝子発現プロファイルを決定し；及び
    （ｃ）腫瘍処置の標的として、対応する未処理細胞での遺伝子の発現と比較して、前記レチノイド処置によって発現が増強する遺伝子を同定することを含んでなる、腫瘍処置の標的となる遺伝子を同定するための方法。
  36. 前記細胞が前記Ｗｎｔプロトオンコジーンを条件的に発現するように操作されている、請求項３５の方法。
  37. 前記プロトオンコジーンがＷｎｔ−１である、請求項３６の方法。
  38. 腫瘍処置の標的として、前記Ｗｎｔ−１の発現を誘導する段階、及び前記腫瘍処置及びＷｎｔ−１シグナル伝達によって発現が相乗的に増強する遺伝子を同定することをさらに含んでなる、請求項３６の方法。
  39. 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項３５の方法。
  40. 腫瘍処置の標的として、前記レチノイドで処理した正常細胞と比較して、前記レチノイド処理によって発現が選択的に増強する遺伝子を同定することを含んでなる、請求項３５の方法。
  41. 前記腫瘍細胞が凍結腫瘍試料である、請求項３９の方法。
  42. 前記腫瘍細胞がパラフィン包理、ホルマリン固定腫瘍組織である、請求項４１の方法。
  43. 遺伝子発現プロファイルが逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析によって決定される、請求項３５の方法。
  44. 遺伝子発現プロファイルがインサイツハイブリダイゼーションによって決定される、請求項３５の方法。
  45. 遺伝子発現プロファイルがノーザンブロッティングによって決定される、請求項３５の方法。
  46. （ａ）前記腫瘍の試料をレチノイドとインキュベートし；
    （ｂ）前記インキュベーションの前後で前記試料の遺伝子発現プロファイルを決定し；
    （ｃ）前記レチノイドによって発現が増強している遺伝子を同定すること；及び
    （ｄ）前記遺伝子を標的とするレチノイド及び抗腫瘍剤の組み合わせで前記患者を処置する段階を含んでなる、哺乳動物被検体の腫瘍を処置する方法。
  47. 前記試料をＷｎｔ−１で付加的にインキュベートする、請求項４６の方法。
  48. 段階（ｃ）の前記レチノイド及びＷｎｔ−１の組み合わせによって発現が相乗的に増強する遺伝子を同定することを含んでなる、請求項４７の方法。
  49. 前記抗腫瘍剤が抗体である、請求項４６の方法。
  50. 前記抗体が抗体断片である、請求項４９の方法。
  51. 前記抗体断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディー、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成される多特異性抗体より成る群から選択される、請求項５０の方法。
  52. 前記抗体がキメラ抗体である、請求項４９の方法。
  53. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項４９の方法。
  54. 前記抗体がヒト抗体である、請求項４９の方法。
  55. 前記抗体が細胞傷害性剤とコンジュゲートしている、請求項４９の方法。
  56. 前記細胞傷害性剤が毒素である、請求項５５の方法。
  57. 前記毒素がメイタンシノイドである、請求項５６の方法。
  58. 前記抗体がＣＨＯ細胞で産生される、請求項４９の方法。
  59. 前記抗体が細菌で産生される、請求項５０の方法。
  60. 化学療法剤による処置をさらに含んでなる、請求項４６の方法。
  61. 放射線量法をさらに含んでなる、請求項４６の方法。
  62. （ａ）前記患者から得た生物学的な試料とレチノイン酸を接触させ；
    （ｂ）遺伝子発現プロファイルを検出することが前記生物学的試料であり；及び
    （ｃ）発現が前記レチノイド処理によって増強する腫瘍抗原を検出することを含んでなる、哺乳動物被検体における異常なＷｎｔシグナル伝達によって特徴付けられる癌を診断するための方法。
  63. 前記腫瘍抗原が４−１ＢＢリガンド、エフリンｂ１、ＥＳＬＲ、オートタキシン、及びＳｔｒａ６より成る群から選択される、請求項６２の方法。
  64. 容器；
    前記容器に含まれる抗腫瘍剤；及び
    レチノイドとの組み合わせで前記抗腫瘍剤を投与するための指示書を含んでなる製造品。
  65. レチノイドをさらに含んでなる請求項６４の製造品。
  66. 前記レチノイドがレチノイン酸である、請求項６５の製造品。
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