WO2005064344A1 - 脂質代謝異常症の予測方法 - Google Patents

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WO2005064344A1
WO2005064344A1 PCT/JP2004/019758 JP2004019758W WO2005064344A1 WO 2005064344 A1 WO2005064344 A1 WO 2005064344A1 JP 2004019758 W JP2004019758 W JP 2004019758W WO 2005064344 A1 WO2005064344 A1 WO 2005064344A1
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WO
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hippuric acid
compound
pag
ratio
dyslipidemia
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PCT/JP2004/019758
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Inventor
Akira Horinouchi
Ikuo Mori
Mika Murabayashi
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/5038—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving detection of metabolites per se
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting dyslipidemia and a tool therefor. More specifically, the present invention relates to a method for predicting dyslipidemia caused by a drug candidate compound, using a change in the balance of the fenilalanine metabolic pathway as an index, and lipidosis or hereditary lipidosis or fatty acid metabolism due to an existing drug. The present invention relates to a method for diagnosing dyslipidemia such as abnormal homeostasis and related diseases.
  • Background art
  • lipidosis disorders of lipid metabolism (lipidosis), in which lipids such as phospholipids, triglycerides, and sphingomyelins accumulate in living tissues due to the administration of drugs, are classified into phospholipidosis, It is called steatosis, sphingomyelin storage disease (sphingolipidosis), etc., and is sometimes collectively called drug-induced lipidosis (drug-induced lipidosis).
  • Many of the compounds that induce libidosis have a structure having both a hydrophobic region and a positively charged hydrophilic region in the molecule, that is, a so-called cationic amphiphilic drug (CAD) structure.
  • CAD cationic amphiphilic drug
  • toxicity evaluation tests for drug candidate compounds are usually conducted in experimental animals such as rats. Histopathological changes are examined by electron microscopy after administration of the compound.However, unless administered for a long period of time, histopathological changes in lipidosis often do not become apparent. There are drawbacks such as requiring labor. Particularly, in the early stage of drug discovery, in order to quickly predict the presence or absence of toxicity and to optimize the structure efficiently, it is essential to construct a screening system that can evaluate multiple samples more easily and in a shorter time. is there.
  • Non-invasive lipidosis prediction and diagnostic methods include, for example, detecting the appearance of lymphocytes with vacuolated cytoplasm in peripheral blood, but require microscopic observation of blood smears Not only is there a problem in terms of efficiency, for example, but it is known that among lipid-inducing compounds, there is no appearance of vacuolated lymphocytes in peripheral blood, and there are quite a few that target only specific organs. And the reliability of prediction and diagnosis is insufficient.
  • Metaponomics which comprehensively analyzes peripheral body fluids (urine, plasma, etc.) or organs, intracellular intermediates, and end metabolites, is a method to capture changes in biological reactions that are at the next stage of transcriptomics ⁇ ⁇ proteomics. It is being used in various fields of medicine and biology. In the field of toxicology, this technology has begun to be used to elucidate the mechanism of toxicity development and to study toxicity prediction.
  • Toxicogenomics-Toxicoproteomics together with conventional toxicological endpoints (symptoms, clinical tests, histopathology)
  • application to drug safety assessment and clinical diagnosis is expected (eg, JK Nicholson et al., Nat. Rev. Drug Discov., 1153-161, 2002 and JC Lindon et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., 187; 137-146, 2003).
  • Toxic phenomena are likely to involve independent changes in one metabolite, as well as integrated changes in various intermediate and end metabolites located in multiple metabolic pathways. Therefore, by using technologies that can simultaneously detect signals from almost all metabolites, such as nuclear magnetic resonance (NMR), it will be possible to comprehensively capture the behavior of biomolecules involved in the development of toxicity. Be expected.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • the present inventors analyzed the metabolite profile by analyzing the urine of rats administered with various types of drug compounds that induce or inhibit libidosis for 3 days by 1 H NMR, It was found that an increase in PAG and a decrease in hippuric acid were commonly observed in rats administered with the compound inducing libidosis. Thus, the present inventors calculated the ratio of PAG to hippuric acid in the urine of each rat and compared the results with the results of a peripheral blood test and histopathological examination. A good correlation was observed between lipid accumulation in cells of various target organs, demonstrating that interlocking changes in PAG and hippuric acid could be indicative of drug-induced dyslipidemia.
  • lipid-inducing compounds that did not show positive changes in peripheral blood and histopathological tests after a short-term administration for 3 days can be measured using the ratio of PAG to hippuric acid as an index. Toxic acid was found to be detectable, and it was clarified that it was useful for early determination of dyslipidemia caused by drugs.
  • a method for diagnosing dyslipidemia or a related disorder thereof in a mammal comprising:
  • dyslipidemia is hereditary lipidosis, drug-induced lipidosis or The method according to the above [6], wherein the fatty acid metabolism homeostasis is abnormal.
  • the disease is selected from the group consisting of hyperlipidemia, atherosclerosis, arteriosclerosis, myocardial infarction, fatty liver, hepatitis, cirrhosis, diabetes, dementia, azoletzheimer's disease, heart disease and chronic fatigue syndrome.
  • L-phenylalanine (hereinafter sometimes abbreviated as “Phe”; unless otherwise specified, the term “fenylalanine” is used herein to refer to L-phenylalanine. (Meaning fenilalanine)), which makes it possible to predict dyslipidemia with high accuracy and high sensitivity even when the physiological condition of the test animal is deteriorated by administering a high dose of the drug. is there.
  • the method for predicting and diagnosing the present invention it is possible to make a positive determination even for a compound that does not show a histopathological change in libido unless it is administered for a long period of time.
  • peripheral body fluids such as urine and plasma as samples makes non-invasive diagnosis in the clinical diagnosis of dyslipidemia and related diseases possible.
  • FIG. 1 shows the metabolic pathway of L-phenylalanine in mammals. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention relates to (a) PAG or PAGN, or from Phe to PAG or PAGN, in a sample collected from a mammal to which the compound has been administered or in a mammalian cell or tissue culture exposed to the compound. And any metabolic intermediate in the metabolic pathway from hippuric acid or Phe to hippuric acid (hereinafter sometimes referred to as the “analyte (a)”). , And “measurement substance (b)” in some cases) and predicting the lipid metabolism disorder-inducing property of the compound using the ratio of the two as an index.
  • the mammal to which the prediction method of the present invention is applied is not particularly limited in animal species as long as the compound has been administered in advance, and examples thereof include humans, monkeys, rats, mice, hamsters, guinea pigs, dogs, and the like. Examples include cats, egrets, stags, sheep, sheep, goats, magpies, and magpies. Preferred are humans, monkeys, rats, mice and the like.
  • the sex, age, weight, etc. of the animal are not particularly limited, and vary depending on the animal species.
  • normally healthy adult males are preferably selected from the viewpoint of maternal protection (female ⁇ Therapeutic drugs peculiar to children ⁇ ⁇ ⁇ This does not apply in the case of anticancer drugs, etc.).
  • those of about 2 to about 24 months and weighing about 100 to about 700 g are preferably used, but are not limited thereto.
  • inbred or closed colony animals In the case of rats, for example, inbred rats such as Sprague-Dawley (SD), Wistar, LEW, etc., and in the case of mice, Examples include, but are not limited to, inbred mice such as BALB, C57BL / 6, C3H / He, DBA / 2, SGe, and CBA, and closed colony mice such as DDY and ICR.
  • inbred mice such as BALB, C57BL / 6, C3H / He, DBA / 2, SGe, and CBA
  • closed colony mice such as DDY and ICR.
  • SPF specific pathogen free
  • a mammalian cell or tissue is a cell or tissue collected from the above-mentioned mammal, and includes all or part of the metabolic pathway from Phe to PAG or PAGN and the metabolic pathway from Phe to hippuric acid.
  • any cells eg, hepatocytes, spleen cells, neurons, glial cells, knee 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans Cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, obesity Cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, Synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, or any tissue in which these cells are present [For example, brain, various parts of the brain (eg, olfactory bulb, amygdala, basal
  • human cell lines include HepG2 cell line derived from liver cancer, HEK293 cell line derived from kidney, A549 Itoda cell line derived from lung cancer, U-937 cell line derived from lymphoma, THP-1 cell line derived from monocyte, colon Examples include, but are not limited to, Caco-2 cell lines derived from cancer, HeLa cell lines derived from cervical cancer, and the like.
  • Compounds to be administered to a mammal or exposed to mammalian cells or tissues include, for example, drug or veterinary drug candidate compounds (compounds in a clinical trial stage when a test animal is a human).
  • the method of administering the compound to the mammal is not particularly limited.
  • the test compound is orally or parenterally in the form of a solid, semi-solid, liquid, aerosol, etc. (eg, intravenous, intramuscular, intraperitoneal) , Intraarterial, subcutaneous, intradermal, and respiratory tracts).
  • the dose of the test compound varies depending on the compound type, species, weight, dosage form, administration period, etc.For example, in the case of a short-term administration of about 3 days, the cells of the target organ should be within a range in which the animal can survive. And the amount required to be able to be exposed to the highest concentration of test compound that can survive for a period of time or more.
  • various doses are selected within the range set based on the data obtained in preclinical trials.
  • Administration can be carried out once or in several divided doses.
  • the time from administration to sampling depends on the animal species and test Although it depends on the dose and pharmacokinetics of the compound, for example, in the case of a rat, when a high dose is administered for a short period of time, it is about 1 to about 7 days from the first administration, preferably about 3 to about 5 days.
  • a low dose is administered for a long period of time, about 1 month or more, preferably about 2 to about 6 months after the initial administration.
  • Feeding and feeding during the administration period There are no particular restrictions on feeding methods such as water supply and light / dark cycle.For example, in the case of rats and mice, give them free access to commercially available solid or powdered feed and fresh tap water or well water. 12 hour light period Z12 hour dark period cycle. If necessary, you can fast for a certain period of time or water. Further, the prediction method of the present invention has an advantage that it is not affected by individual differences in Phe intake as described later, but it is more preferable to use a feed capable of calculating Phe intake from feed intake.
  • the sample collected from the mammal used in the prediction method of the present invention is a metabolite of any of the metabolic pathways from Phe to PAG or PAGN.
  • a biological sample that can be detected.
  • samples include urine, plasma, serum, and other peripheral fluids, peripheral blood cells such as lymphocytes, monocytes, and liver, kidney, lung, and mesenteric lymph nodes.
  • biopsy samples of cells or tissues derived from the spleen, etc. are preferred.
  • Peripheral fluids and peripheral blood cells are preferred because they do not invade test animals, and peripheral fluids are more desirable because preparation of cell extracts is unnecessary. preferable.
  • a normal urinalysis method can be used for humans, and for non-human mammals, sacral stimulation or bladder compression after a certain period of time from administration of the compound.
  • Ability to forcibly collect fresh urine This can be done by using a metabolic cage to accumulate naturally excreted urine in a urine collection container for a certain period of time (for example, about 1 to about 24 hours, preferably about 3 to about 12 hours). it can. The latter is preferred because it does not require special procedures and there is little variation in data.
  • it is preferable to keep the urine collection container ice-cooled to prevent changes in urinary metabolites. Trace amounts of toluene, thymol, concentrated hydrochloric acid, etc.
  • the collected urine may be subjected to centrifugation or the like to purify the supernatant as necessary, and then used for measurement. If it takes time to measure the force, it may be stored frozen and thawed before use.
  • venous blood was collected from the back of the elbow or the back of the hand using normal blood collection methods for humans, and harmful to the tail vein, tail artery, and orbital venous plexus for non-human mammals and released Blood is collected using a capillary tube, etc. and, if necessary, added with an anticoagulant such as heparin, EDTA, sodium tenoate, etc., and then separated and removed by centrifugation or filtration through a plasma separation membrane. can do.
  • an anticoagulant such as heparin, EDTA, sodium tenoate, etc.
  • serum it can be prepared by leaving the collected blood in a similar manner for a certain period of time to form a clot, and then collecting the supernatant by centrifugation or the like. If it takes time to measure both plasma and serum, they can be stored frozen and thawed before use.
  • the sample is cells or tissues
  • Various blood cells obtained by the fractionation may be treated according to the method described below for mammalian cells or tissue culture to prepare a cell or tissue extract.
  • the extract may be stored frozen and thawed before use.
  • the method of exposing a mammalian cell or tissue to a compound is not particularly limited, but specifically, for example, when a cell line is used as a sample, the cell is cultured in a suitable medium in a suitable medium under suitable conditions. The cells are detached using trypsin-EDTA, etc., centrifuged, and the cells are collected.
  • an appropriate medium eg, MEM ⁇ Science, 122: 501 containing about 5 to about 20% fetal bovine serum (FBS)] (1952)), DMEM Virology, 8: 396 (1959)), RPMI 1640 ⁇ 3 ⁇ 4 (The Journal of the American Medical Association, 199: 519 (1967)), 199 medium ⁇ Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73 : 1 (1950)) etc. (as needed, penicillin, streptomy (An antibiotic such as syn or hygromycin may be further added.)], And the cells are suspended to a desired cell density.
  • the cell density is not particularly limited, but it is preferable to adjust the cells so that the cells maintain the cell growth state.
  • the preferred initial cell density depends on the growth rate of the cells to be used and the like, and can be easily set by those skilled in the art according to the cells to be used, but is usually about 5 ⁇ 10 4 to about l ⁇ 10 ⁇ ellsZ. mL.
  • the test compound dissolved in an appropriate solvent (or dispersed in a dispersion medium) is further diluted with a medium, and the final concentration is, for example, the highest concentration at which cells can survive. It determined so that a can) that was added to the cell suspension Nigoeki, under normal conditions, for example, in C0 2 incubator one, 5% C0 2/95% atmospheric air, 5% C0 2/5
  • the cells are cultured at about 30 to about 40 ° C.
  • a cell or fibrous tissue collected from a living body can be used as it is.
  • Mammalian cell or tissue culture exposed to the compound In the present invention, exposure to a compound necessarily involves a step of incubating the cell or tissue for a certain period of time. Is included in the culture here), depending on the type of the test substances (a) and (b), etc., either cell / tissue or culture supernatant is centrifuged, filtered, etc. And then subject the culture supernatant as it is, or after subjecting it to concentration or other treatment as necessary, prepare a soluble fraction of cells / tissues according to the usual extraction method, and submit it for measurement. Can be For example, in an ice-cold extraction buffer such as phosphate buffer, Tris-HCl buffer, acetate buffer, borate buffer, etc. After crushing, it can be obtained by collecting the supernatant by centrifugation.
  • an ice-cold extraction buffer such as phosphate buffer, Tris-HCl buffer, acetate buffer, borate buffer, etc. After crushing, it can be obtained by collecting the supernatant by centrifugation
  • PAG and / or PAGN in the sample obtained as described above or PAG from Phe Or any metabolic intermediate in the metabolic pathway leading to PAGN (analyte (a)) and any metabolic intermediate in the metabolic pathway from hippuric acid or Phe to hippuric acid (analyte (b)) .
  • Arbitrary metabolic intermediates in the metabolic pathway from Phe to PAG or PAGN include, specifically, 2-phenylethylamine, phenylacetoaldehyde, phenylacetate, and acetylacetate.
  • any metabolic intermediate in the metabolic pathway from Phe to hippuric acid is phenylpyruvic acid, phenyllactic acid, cinnamon Acid acid means any of benzoic acid (including their conjugates (excluding hippuric acid)).
  • Phe is mainly oxidized to L-tyrosine (Tyr) by phenylalanine hydroxylase and further converted to catecholamines, melanin, etc., but some Phe contains phenylpyruvic acid, Is it ultimately metabolized to hippuric acid via phenyl lactic acid, cinnamic acid, and benzoic acid (path B in Fig.
  • the present inventors believe that the changes in PAG increase and hippuric acid decrease common in urine of rats treated with lipidosis-inducing compounds are due to the balance of Phe clearance, for some reason, the second pathway (which is usually a minor pathway). It was found that it was to incline in the direction to use more of the route A).
  • the quantitative ratio of the test substance (a) to the test substance (b) in the sample was measured and compared with that in the case where the compound was not administered, and as a result, the (a) / (b) ratio could be increased. If so, the compound can be predicted to be lipidogenic.
  • the increase in PAG could be used as an indicator to predict the PLsis-inducing properties of a compound. To date, there has been no idea that the increase in PAG / PAGN is regarded as a change in hippuric acid, and that such a change is regarded as a change in the balance of the Phe clearance pathway.
  • Phe is an essential amino acid for mammals and must be ingested from the diet.
  • Phe intake also decreases, and Tyr synthesis occurs.
  • the amount of Phe excreted without being used is also reduced. Therefore, when only the increase in PAG / PAGN is used as an index, the Phe inflow into Route A decreases despite the above (a) / (b) ratio increasing.
  • Phe intake must be closely monitored and measurements corrected for correct predictions.
  • the term "quantitative ratio of the test substance (a) to the test substance (b)” refers to not only the above (a) Ab) ratio but also the ratio of (a) or (b) to (a) + (b). The ratio is also included. Since (a) + (b) corresponds to the Phe intake, this ratio indicates how much of the Phe that has flowed into the clearance pathway has flowed into pathway A (or B).
  • Phe intake can be calculated, it is possible to measure only one of the substances (a) or (b) and compare the ratio of the measured value to the Phe intake.
  • a method of calculating the Phe intake there is a method of monitoring the food intake by feeding a diet containing the Phe-containing component uniformly.
  • the combination of the test substance (a) and the test substance (b) is not particularly limited, but it is necessary that both are contained in the sample.
  • the sample collected from the mammal to which the compound is administered is urine, serum or plasma
  • PAG / PAGN is preferable as the test substance (a)
  • hippuric acid is preferable as the test substance (b).
  • the substances (a) and (b) to be measured may be detected by any measurement method, both may be detected simultaneously, or each may be detected separately. Those who detect both at the same time Examples of the method include nuclear magnetic resonance (eg, 1 H NMR and 13 C NMR), gas chromatography (GC), gas chromatography ⁇ ⁇ mass spectrometry (GC-MS), and high-performance liquid chromatography (GC).
  • HPLC highLC
  • HPLC-NMR liquid mass chromatography-mass spectrometry
  • LC-MS-MS liquid mass chromatography-mass spectrometry
  • TLC-MS thin layer chromatography-mass spectrometry
  • CZE-MS single mass spectrometry
  • immnoathesi Those skilled in the art can easily and appropriately select measurement conditions such as various parameters in each detection method according to the type of the substance to be measured and the like.
  • hippuric acid When hippuric acid is detected by the LC-MS-MS method, it can be performed, for example, by the method described in f Rapid. Commun. Mass. Spectrom., 18: 265-272 (2004) or a method analogous thereto.
  • a sample collected from a mammal to which the compound has been administered or a mammalian cell or tissue culture exposed to the compound and (2) a sample collected from a mammal to which the compound has not been administered Measure and compare the ratio of the test substance (a) to the test substance (b) with the sample or the mammalian cell or tissue culture not exposed to the compound.
  • Increasing [or (a) / (a) + (b) ratio] or decreasing (b) / (a) + (b) ratio predicts that the compound will induce dyslipidemia Is done.
  • the variation ratio of the dose ratio is not particularly limited, and varies depending on the animal species, cell type, dosage, administration period, administration form, sample type, and the like.
  • the lipid metabolism disorder that can be predicted by the prediction method of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include PLsis, steatosis, and sphingomyelin storage disease.
  • the accuracy of the prediction method of the present invention is based on the estimation of disease in biopsy samples of various target organs collected from mammals to which the compound has been administered for a certain period (for example, about 3 days to about several months). 'Evaluation can be made by observing histological changes, etc., but it is preferable to use animals that have been administered the compound for a long period of time at a dose low enough to be actually used. In short-term, high-dose administration, as shown in the Examples below, compounds reported to induce PLsis may be negative for histopathological changes and vacuolated lymphocyte test.
  • the prediction method of the present invention a remarkable increase in the (a) / (b) ratio is observed even in a short-term large-dose administration, and it can be predicted that the substance is dyslipidemic.
  • the prediction method of the present invention can determine positive / negative with high accuracy in a shorter period of time, and thus can improve the efficiency of toxic screening in the initial stage of drug development.
  • the risk of developing dyslipidemia can be predicted before the manifestation of specific symptoms, and the risk to subjects can be reduced.
  • the present invention is based on the finding that, as described above, a change in the use of two metabolic pathways in the clearance of Phe can predict dyslipidemia. Therefore, the method of the present invention is not limited to dyslipidemia caused by a drug (ie, drug-induced libidosis), but is also broadly related to dyslipidemia and related diseases (ie, diseases caused by dyslipidemia, As a disease associated with dyslipidemia). Accordingly, the present invention also relates to (a) any metabolic intermediate in the metabolic pathway from PAG / PAGN or Phe to PAG or PAGN in a sample taken from a mammal; and (b) hippoic acid or Phe.
  • a drug ie, drug-induced libidosis
  • dyslipidemia and related diseases ie, diseases caused by dyslipidemia, As a disease associated with dyslipidemia. Accordingly, the present invention also relates to (a) any metabolic intermediate in the metabolic pathway from PAG / PAGN or Phe to PAG or PAGN in a sample taken from a mam
  • a method for diagnosing dyslipidemia or its related diseases in mammals characterized by detecting any metabolic intermediate in the metabolic pathway leading to hippuric acid and diagnosing using the quantitative ratio of the two as an index.
  • diagnosis means not only the determination of the presence or absence of disease, but also any diagnosis, such as the severity (degree of progression) after a definitive diagnosis, and the determination of whether the disease is likely to occur or develop in the future. Inclusive Used as a reminder.
  • lipid dystrophy abnormalities that can be diagnosed by the diagnostic method of the present invention include, for example, hereditary libidosis (eg, Goiché's disease, Niemann-Pick's disease (A- (type), Faipuri's disease, , Cholesterol ester storage disease, cerebrotendinous xanthomatosis, phytosterolemia, refutsum disease, T-sachs disease, systemic (GM1) gandariosidosis, sulfatridobiosis (metachromatic leukodystrophy), galactosylceramide Libidosis, etc.), drug-induced libidosis (eg, PLsis, steatosis, sphingomyelin storage disease, etc.), abnormal fatty acid metabolism homeostasis (eg, fatty acid] 8 oxidation abnormality, etc.).
  • hereditary libidosis eg, Goiché's disease, Niemann-Pick's disease (A- (type
  • disorders related to lipid dysfunction include disorders related to fatty acid metabolism ⁇ homeostasis, such as hyperlipidemia, atherosclerosis, arteriosclerosis, myocardial infarction, fatty liver, hepatitis, cirrhosis, Diabetes, dementia, Alzheimer's disease, heart disease and chronic fatigue syndrome, etc., and diseases (side effects) related to drug-induced libidosis include, for example, pulmonary fibrosis, blindness, encephalopathy, etc. , But not limited to them.
  • examples of the disease in a non-human mammal include hepatic lipidosis in pet animals such as cats and dogs.
  • the conversion of cinnamic acid to benzoic acid is performed by ⁇ -oxidation.
  • acidity of fatty acids is suppressed in dyslipidemia including PLsis, and the change in the use balance of the Phe clearance pathway in dyslipidemia is due to cinnamic acid. It may be because the metabolic pathway to PAG / PAGN is more utilized because the conversion of benzoic acid to benzoic acid is suppressed. Therefore, the diagnostic method of the present invention may be particularly useful for diagnosing a disease associated with the (3) fatty acid abnormality of fatty acids.
  • the numerical value of the (a) / (b) ratio which serves as a diagnostic criterion for, etc., differs depending on the animal species, age, sex, and the type of sample collected. For example, if the value is equal to or more than the average value of normal animals under the same conditions + 2SD, the ability to establish criteria for diagnosing dyslipidemia is not limited to this.
  • the present invention also provides a kit that can be suitably used for the prediction method and the diagnostic method of the present invention.
  • the kit of the present invention comprises: (a) a reagent for measuring any metabolic intermediate in the metabolic pathway from PAG / PAGN or Phe to PAG or PAGN; and (b) metabolism from hippuric acid or from Phe to hippuric acid. And a reagent for measuring any metabolic intermediate in the pathway.
  • the measuring reagent is not particularly limited as long as it allows quantitative analysis, but a reagent containing an antibody is preferable. If the measurement reagent contains an antibody, the antibody to the test substance (a) and the antibody to the test substance (b) must be measured to the extent that they do not interfere with the measurement of the (a) / (b) ratio.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and may or may not be labeled with a labeling agent.
  • the kit of the present invention may further include a labeling agent.
  • a labeling agent for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope e.g., [125 1], [131 1], C 3 H], [14 C] and the like are used.
  • a stable enzyme having a large specific activity is preferable, and for example, ⁇ -galactosidase, ⁇ -darcosidase, allyl phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate or the like is used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminophore derivative, luciferin, lucigeyun and the like are used.
  • a biotin- (strept) avidin system can be used for binding the antibody to the labeling agent.
  • the antibodies included in the kit of the present invention are described in, for example, US Pat. No. 5,100,807. It can be produced by the method described above or a method similar thereto. In this case, for example, according to the method described in JP-A-11-343300, it is previously verified that the cross-reactivity to the other measured substance is low enough to prevent the measurement of the (a) / (b) ratio. It is necessary to keep it.
  • the kit of the present invention can further include the test substance (a) and / or the test substance (b).
  • the test substance (a) and the test substance (b) may or may not be labeled with a labeling agent.
  • the kit of the present invention can further include a labeling agent.
  • the labeling agent is the same as described above.
  • the kit of the present invention further comprises a secondary antibody capable of specifically recognizing an antibody against the test substance (a) and an antibody (primary antibody) against Z or the test substance (b), or a solid phase for immobilizing the antibody.
  • Carriers eg, microtiter plates, glass beads, etc. may be included.
  • Example 1 Reference Example 1
  • the following 10 commercially available drugs were used as test compounds, and the presence or absence of PLsis induction was examined by histopathological examination and peripheral blood lymphocyte examination.
  • Amiodarone, imipramine, clomipramine, tamoxifen, chronorepromazine, quinacrine, chloroquine.amantadine and perhexiline were purchased from SIGMA, and fluoxetine from Wako Pure Chemical Industries.
  • fluoxetine from Wako Pure Chemical Industries.
  • three drugs that cause vasculitis / arteriopathy but have not been reported to cause dyslipidemia such as PLsis (flumilast (TO 95/01338), Arif mouth (W0 93/19749) Yolipoloram (Japanese Patent Publication No. 60-11028)) was used.
  • mice with no abnormalities were selected, and 7 groups each consisting of 4 males and 4 males for each test, and 6 groups each consisting of 3 males each for the satellite group for measuring drug concentration in plasma for each test and autopsy during the test
  • the animals were randomly divided into 20 groups, each consisting of 6 males and 6 males, for a total of 20 groups (88 in total).
  • the weight range at the age of 6 weeks at the start of dosing is 171 to 200 g (Test No. 32-207 / su: 172 to 198 g, Test No. 32-231 / su: 171 to 198 g, Test No.
  • the environmental conditions in the animal room are room temperature of 20 to 26 ° C, relative humidity of 40 to 70%, fresh air ventilation rate of 8 to 25 times / hour, and lighting time of 12 hours / day (lighting time: 7 am to 7 pm Time)
  • Animals were fed a gamma-irradiated powdered feed (CR-LPF, Oriental yeast) and allowed to shake freely with tap water.
  • -A dispersion medium / medium was added to each test substance and stirred to prepare a high dose.
  • the high-dose administration liquid was diluted about 3 times and 10-fold with a dispersion medium / solvent to prepare medium- and low-dose administration liquids.
  • the dose of each test substance was set as follows. [In addition, LD 5 . Referred to the Summary Basis of Approval (FDA) for each drug. ]
  • Amiodarone 100, 300 ⁇ Pi 1000 mg / kg / day (LD 50: 3000 mg / kg or more)
  • the dose that can be administered was set to a high dose, and was reduced by about 3 in the common ratio.
  • Imipramine 100, 300 ⁇ Pi 1000 mg / kg / day (LD 5:. 1807 mg / kg)
  • Tamoxifen 100, 300 and 1000 mg / kg / day (LD 5:. 1190 mg / kg)
  • the dose was reduced to about 3 in common ratio.
  • Chlorpromazine 10, 30 ⁇ Pi 100 mg / kg / day (LD 5:. 145 mg / kg)
  • the dose at which vasculitis / arteriopathy was observed was set to the high dose, and one third of the dose was set to the low dose.
  • Mouth mouth 30 and 100 mg / kg
  • the dose at which vasculitis / arteriopathy was observed was set to the high dose, and one third of the dose was set to the low dose.
  • the dose at which vasculitis / arteriopathy was observed was set to the high dose, and one third of the dose was set to the low dose.
  • Control group 0.5 w / vy. Methyl cellulose solution A dose of 10 mL / kg / 3 was administered by gavage once a day for 3 days (4 days for the negative control). Animal death, general condition was observed with weight, PM480O food consumption, etc. (main bets Ra) and EB3 2 00D (the Shimadzu Corporation).
  • liver, kidney, heart, spleen, lung and mesenteric lymph nodes in all animals liver, kidney, heart, spleen, lung (including bronchi), stomach (for negative control group) Including short gastric artery), mesentery and testis)
  • Other additional organs and tissues for each test substance Eyeball for imipramine, brain and eyeball for clomipramine, adrenal gland for tamoxifen, pituitary and eyeball, chlorpromazine
  • cerebral eyeballs for quinacrine, brain and thigh muscles, for cloquinine, for brain and eyeballs, for oleoresin, for brain and skin, and for fluoxetine, brain (necropsy for negative control groups)
  • the organs and tissues that have been changed at times are sampled, and the histopathological changes of the tissues sampled by light microscopy and electron microscopy using conventional methods are adjusted. It was.
  • the red blood cell count, hematocrit value, hemoglobin concentration, mean red blood cell hemoglobin (MCH), mean red blood cell hemoglobin concentration (MCHC), mean red blood cell volume (MCV ), Platelet count, leukocyte count, reticulocyte count, leukocyte percentage, vacuolated lymphocyte rate (PLsis-inducing compound only), etc. were performed.
  • Table 1 shows the results of histopathological changes (electron micrographs for lipid accumulation) and the percentage of vacuolated lymphocytes in the PLsis-induced compound administration group.
  • Table 1 shows the results of histopathological changes (electron micrographs for lipid accumulation) and the percentage of vacuolated lymphocytes in the PLsis-induced compound administration group.
  • chlorpromazine at least at high doses, there was a significant increase in vacuolated lymphocyte rates, and histopathological changes in any target organ.
  • chlorpromazine it was found that PLsis positive could not be discriminated by histopathological examination and vacuolated lymphocyte test at any dose after administration for a short period of 3 days. In the negative control group, no histopathological image showing dyslipidemia such as PLsis was observed. Histopathological changes (PLsis)
  • test substance was administered to the urine collection rats prepared in Example 1 (Reference Example 1) in the same manner, and after one and three administrations, urinary collection under fasting and water deprivation for about 6 hours was collected.
  • the container was kept under ice cooling and urine was collected. After collecting urine, centrifugation was performed at 1500 X g for 10 minutes, and 1 mL or more of the supernatant was collected and stored in a microtube in an ultra-low temperature freezer until freezing (-70 ° C or less).
  • urine was collected for 24 hours under ice-cooling, and after collection, stored at ⁇ 30 ° C. until measurement.
  • 3 ⁇ 4 NMR was performed as follows. The reagents described below were used without purification. Heavy water (D 2 0) is ISOTEC than INC (USA), NaH 2 P0 4 ⁇ 2H 2 0, Na 2 HP0 4 -. 12H 2 0 were purchased from Kanto Chemical (Tokyo). Sodium 3- (trimethylsilyl) —propionate-2, 2, 3, 3, -d 4 (TSP) was purchased from ISOTE INC (USA). The NMR spectrum was measured using Unity IN0VA600 (Varian) (3 ⁇ 4resonance frequency: 599.59 MHz).
  • TSP was dissolved in heavy water to a concentration of about 11 sol / L.
  • a urine sample (500 L) is collected in an Eppendorf, added with the above phosphate buffer (250 L), left at room temperature for about 10 minutes, and then centrifuged at about 10 ° C and 13,000 rpm for about 10 minutes. L was collected and transferred to an MR sample tube. Further, about 60 TSP heavy aqueous solution was added to the NMR sample tube, and the mixture was added.
  • a probe capable of measuring 1 H nuclei was set in advance so that ⁇ R measurement could be performed, and the temperature was set at 25 ° C.
  • Set the above MR sample tube on the spectrometer leave it for about 10 minutes until the temperature stabilizes, and then set the hardware side settings such as resolution, tuning, 90 ° pulse measurement, and adjusting the observation center to the water signal.
  • parameter —I prepared the data.
  • the measurement conditions were set as follows.
  • Phase adjustment, standard setting, etc. were performed using the methyl signal of TSP as Oppm.
  • PAG levels When calibrated for creatine, PAG levels may be reduced rather than administered at high doses of PLsis-inducing compound (see, eg, fluoxetine), but the PAG / hippuric acid ratio, PAG / (PAG + Using the (uric acid) ratio as an index, higher doses show higher values, indicating that the extent of PLsis expression is more accurately reflected.
  • the amount of food consumption decreased due to poor general condition, and the amount of Phe flowing into the clearance pathway itself decreased.
  • PLsis / steatosis induction was examined by histopathological examination and peripheral blood lymphocyte examination using the following two commercially available drugs as test compounds.
  • Amiodarone and perhexiline were purchased from SIGMA.
  • Animals were housed individually in metal cages at the bottom of the wire mesh for monkeys, and each cage was randomly placed between groups on a flush rack.
  • Environmental conditions in the animal room are room temperature of 20 to 26, relative humidity of 40 to 70%, fresh air ventilation rate of 8 to 25 times / hour, and lighting time of 12 hours / day (lighting time: 7 am to 7 pm Time) Animals were fed gamma-irradiated solid feed (Certified Primate Diet # 5048, PMI Feeds Inc.) and were allowed free access to tap water.
  • a dispersion medium / medium was added to each test substance and stirred to prepare a high dose.
  • the high dose solution was diluted with a dispersion medium / solvent to prepare a low dose solution.
  • the dose of each test substance was set as follows.
  • Amioda mouth 60 and 300 mg / kg / day
  • Control group 0.5 w / v% methylcellulose solution
  • a dose of 5 mL / kg / day was orally administered once a day for 7 days.
  • liver, kidney, heart, spleen, lung and mesenteric lymph nodes, eyes, testis and brain were collected from all animals, and histopathological changes were examined by light microscopy by a conventional method.
  • Blood was collected during the pre-dose period, on the first day of administration, on medications 2 and 6, blood smears were prepared, and the percentage of vacuolated lymphocytes was measured.
  • Table 4 shows the results of histopathological changes and the percentage of vacuolated lymphocytes in the group to which the PLsis / steatosis-inducing compound was administered.
  • the percentage of vacuolated lymphocytes increased, and histopathological changes were observed in any target organ.
  • 60 mg / kg of amiodarone no induction of PLsis / steatosis was observed.
  • the monkeys collected from the monkeys during the pre-dose period (Pre), the first day of administration (Day 0), the second and sixth doses of the administration (Days 2 and 6) under fasting for about 6 hours were collected. After collecting the urine, it was centrifuged at 1500 X g for 10 minutes, 1 mL or more of the supernatant was collected in a microtube, and stored frozen (-70 ° C or less) using an ultra-low temperature refrigerator until measurement.
  • MR was performed as follows. Reagents were used without purification. Heavy water (D 2 0) is ISOTEC. From INC (USA), NaH 2 P0 4 ⁇ 2H 2 0, Na 2 HP0 4 ⁇ 12H 2 0 were purchased from Kanto Chemical (Tokyo). Sodium 3- (trimethylsilyl)-propionate— 2, 2, 3, 3,-(TSP) was purchased from ISOTEC. INC (USA). Measurement of MR spectrum is Unity INOVA600 (Varian) resonance frequency 599.59 MHz) was used.
  • the phosphate buffer was prepared as follows. Na3 ⁇ 4P0 using 4 ⁇ 2H 2 0 and Na 2 HP0 4 ⁇ 12H 2 0 , after each of about 0. 2mol / L Na P0 4 solution Contact Yopi about 0. 2mol / L Na 2 HP0 4 solution to prepare The two solutions were mixed and adjusted to about pH 7.4 using a pH meter.
  • TSP was dissolved in heavy water to a concentration of 11 mmol / L.
  • Urine samples 500 / z L taken Etsu Eppendorf tube the mixture was allowed to stand at room temperature for about 10 minutes with the addition of phosphate buffer 250 teeth, about 10 ° C, then centrifuged for about 10 minutes at 13000r P m About 600 L of the supernatant was collected and transferred to an NMR sample tube. Further, about 60 parts of TSP heavy aqueous solution was added to the NMR sample tube.
  • a probe capable of measuring 1 H nucleus was set in advance so as to perform MR measurement, and the temperature was set to 25 ° C.
  • the settings and parameters for were prepared.
  • the measurement conditions were set as follows.
  • seqf il (synthesis state! J): tnnoesy, sspul (.steady state pulse): n years old, ss (prescan): 8 times, mix (mixing time): 100 msec, sw (observation width): 8000 Hz , Np (number of composite points): 65536 points, dl (waiting time): 4 ⁇ 904 sec, satpwr (irradiation power): 10 db, satdly (irradiation time): 1 sec, cumulative number: 64 times
  • PAGN is prepared according to the method of Example 1 of US Pat. No. 5,100,807. Horse uric acid is purchased from SIGMA. According to the method described in Example 2 of the patent specification, a PAGN-pserum serum albumin (BSA) conjugate is prepared, and hippuric acid-BSA conjugate is prepared. After mixing the obtained conjugate with an equal volume of complete Freund's adjuvant (FCA), the mixture is intradermally administered to female eels (three white seeds, weighing 2.7 to 2.8 kg).
  • BSA basic serum albumin
  • FCA complete Freund's adjuvant
  • Booster immunizations were performed at 3 week intervals.One week after the final immunization, whole blood was collected from the carotid artery under Nembutal anesthesia, incubated at room temperature for 2.5 hours, and centrifuged at 2000 X g (4000 rpm) for 10 minutes for anti-immunization. Obtain serum. After adding sodium sulfate to the serum little by little and dissolving it, centrifuging to collect the precipitate, dissolving it in phosphate buffer (pH 6.3), and dialysis against the same buffer at 4 C for 5 hours Change the external dialysis solution and dialyze overnight.
  • phosphate buffer pH 6.3
  • Animals were housed individually in metal cages at the bottom of the wire mesh, and each cage was randomly placed between groups on a flush rack installed in a clean booth. Animal room environmental conditions are room temperature 20
  • a dispersion medium / medium was added to each test substance and stirred to prepare a liquid for administration.
  • the dose of each test substance was set as follows.
  • Amioda mouth 300 mg / kg / day
  • Imipramine 100 mg / kg / day
  • Tamoxifen 100 mg / kg / day
  • Control group 0.5 w / v ° /. Methyl cell mouth solution
  • a dose of 10 mL / kg / 3 was administered by gavage once a day for 7 days.
  • Hippuric acid (Lot No. PKE1876, content 99.8%) and PAG (Lot No. PKG7583, content 99.4%) used as reference materials were identified as hippuric acid-d5 (Lot No. H63P3, d5) from Wako Pure Chemical Industries.
  • PAG-d4 (Lot No. B18607-060-17, d4 conversion ratio: 100.0%) was obtained in-house from CDN isotopes for the conversion ratio of 99.3%. Acetonitrile, ammonium formate, formic acid, ammonium acetate and methanol were all obtained from Wako Pure Chemical Industries.
  • HPLC system used was an LC-10AD system (Shimadzu Corporation), and the MS / MS system was an API3000 (AB / MDS SCIEX).
  • a standard calibration curve was prepared by adding hippuric acid, 20 ⁇ l of PAG diluted standard and 10 / ⁇ L of the internal standard solution to 20 L of a 10-mol / L ammonium acetate aqueous solution and treating the same in a similar manner.
  • a sample for the standard calibration curve of hippuric acid PAG was prepared to have the following final concentrations. Hippuric acid: 5000, 4000, 2000, 1000, 500, 200, 100 and 50 ⁇ g / mL, PAG concentration: 1000, 500, 400, 200, 100, 50, 20, 10 and 5 ig / mL.
  • QC-L concentrations of hippuric acid and PAG, which are the endogenous components of rat control oral urine, were measured using a standard calibration curve. And QC-M were prepared. Also, QC-H was diluted 20-fold with a 10 mM / L aqueous ammonium acetate solution to prepare QC-L.
  • the chromatographic separation by HPLC was performed in a gradient mode using L-Column 0DS (particle diameter; 5 ⁇ m, inner diameter; 2.1 mm, length;
  • the solution was sent at a flow rate of 0.2 mL / min.
  • the gradient program increased the mobile phase (B) concentration linearly from 0% (at the start of the analysis) 5% to 60% in 3 minutes and then to 80% by 3.2 minutes.
  • the solution was pumped at 80% for 5 minutes, decreased to 5% after 5.1 minutes, and pumped under the same conditions until the analysis end time (10 minutes).
  • the eluate with an analysis time of 3.0-4.5 minutes was introduced into MS / MS.
  • the analysis was performed at a column temperature of 40 ° C and a sample injection volume of 10 L.
  • ions were detected by selected reaction monitoring (SRM) in positive ion mode using turbo ion spray as the ionization mode. Zero air was used for ion spraying, and the voltage was 4.2 kV. Nitrogen was used for collision-induced decomposition of ions. Precursor ion and fragment ion as hippuric acid as monitor ions; 180 Da ⁇ 105 Da, PAG; 194 Da ⁇ 91 Da, hippuric acid d-5; 185 Da ⁇ 110 Da, PAG-d4; 198 Da ⁇ 93 Da.
  • SRM reaction monitoring
  • the concentration of hippuric acid PAG in each sample was calculated from the regression equation of the standard calibration curve (1 / weighting of concentration) using the peak area ratio between hippuric acid PAG and the respective IS. Table 5 shows the results.
  • the prediction method of the present invention enables highly accurate and highly sensitive prediction of dyslipidemia caused by a drug, and also administers a compound for which a histopathological change does not become apparent unless administered for a long period of time. Is useful as a screening means to quickly identify toxic compounds at the early stage of development and to make selection of lead compounds more efficient. Furthermore, the prediction / diagnosis method of the present invention enables non-invasive diagnosis using peripheral body fluids such as urine and plasma as a sample, and is therefore extremely useful in clinical diagnosis of dyslipidemia and related diseases. It is. This application is based on Japanese Patent Application No. 2003-434151 filed in Japan (filing date: December 26, 2003) and Japanese Patent Application No. 2004-168849 (filing date: June 7, 2004). The contents are all incorporated herein.

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Abstract

本発明は、化合物を投与された哺乳動物より採取した試料または化合物に曝露された哺乳動物細胞もしくは組織培養物中の(a)フェニルアセチルグリシンおよび／もしくはフェニルアセチルグルタミン、またはフェニルアラニンからフェニルアセチルグリシンもしくはフェニルアセチルグルタミンに至る代謝経路における任意の代謝中間体と、(b)馬尿酸またはフェニルアラニンから馬尿酸に至る代謝経路における任意の代謝中間体とを検出し、両者の量比を指標として該化合物の脂質代謝異常症誘発性を予測することを特徴とする、化合物による脂質代謝異常症の予測方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物より採取した試料中の上記(a)および(b)を検出し、両者の量比を指標として診断を行うことを特徴とする、脂質代謝異常症およびその関連疾患の診断方法を提供する。

Description

明細書
脂質代謝異常症の予測方法 技術分野
本発明は、 脂質代謝異常症の予測方法おょぴそのためのツールに関する。 より 詳細には、 本発明は、 フエ二ルァラニン代謝経路のパランス変化を指標とした、 医薬候補化合物に起因する脂質代謝異常症の予測方法、 並びに既存の薬物による リピドーシス、 あるいは遺伝性リピドーシスや脂肪酸代謝ホメォスタシス異常等 の脂質代謝異常症およびその関連疾患の診断方法に関する。 背景技術
薬物の投与により生体組織内にリン脂質、 中性脂肪、 スフインゴミエリンなど の脂質が蓄積する脂質代謝異常症（リピドーシス）は、 蓄積する脂質の種類に応 じてそれぞれリン脂質症 （phospholipidosis) 、 脂肪症 （steatosis) 、 スフィ ンゴミエリン蓄積症 （sphingolipidosis) などと呼ばれ、 薬物起因性脂質代謝 異常症（薬物起因性リビドーシス ： drug - induced lipidosis) と総称されること もある。 リビドーシスを誘発する化合物の多くは、 分子内に疎水性領域と陽性荷 電した親水性領域とを併せ持つ構造、 いわゆる cationic amphiphilic drug (CAD) 構造を有する。
近年、 ゲノム解析の進展に伴いォーファン受容体の創薬ターゲットとしての価 値が認識され、 受容体に対する作動薬もしくは拮抗薬の開発が進められている力 そのような化合物は、 CAD構造を有する場合があり、 リピドーシス惹起につなが り、 結果的に医薬品開発の妨げになるケースがある。 また、 既に認可されている 医薬品の中にも副作用として脂質代謝異常症を惹き起こすことが報告されている ものがある。
現在、 医薬品候補化合物の毒性評価試験では、 通常、 ラット等の実験動物に化 合物を投与してその病理組織学的変化を電顕的に調べるが、 長期間投与でなけれ ばリピドーシスの病理組織学的変化が顕在化しないことが多く、 さらに組織標本 作製 '検出にも時間、 労力を要する等の欠点がある。 特に、 創薬の初期段階にお いて、 毒性の有無を迅速に予測し、 構造の最適化を効率よく行うには、 多検体を より簡便かつ短時間で評価し得るスクリーニング系の構築が必須である。
また、 臨床試験における毒性試験や投薬患者における副作用の診断においては、 生検標本の採取を必要とする上記の方法は、 外科的侵襲が大きいためにその適用 は非常に限定される。 従って、 薬物起因性リビドーシスを効率よく、 且つ非侵襲 的に予測または診断し得る評価系の開発が急務である。
非侵襲的なリピドーシスの予測 ·診断方法としては、 例えば末梢血における細 胞質が空胞化したリンパ球の出現を検出する方法が挙げられるが、 血液塗沫標本 の顕微鏡学的観察を必要とするなど効率面で問題があるだけでなく、 リピドーシ ス誘発化合物の中には末梢血液中に空胞化リンパ球の出現を認めず、 特定器官の みを標的とするものが相当程度存在することが知られており、 予測 ·診断の信頼 性の面でも不十分である。
末梢体液 （尿、 血漿など） あるいは臓器 ·細胞内の中間 ·最終代謝産物を網羅 的に解析するメタポノミクス （metabonomics) は、 トランスクリプトミクス ' プロテオミクスの次の段階に来る生体反応の変化を捉える手法として、 医学 ·生 物学の種々の分野で利用されつつある。 毒性学の分野でも、 毒性発現メカニズム の解明や毒性予測の研究に本技術が活用され始めており、 トキシコゲノミクス - トキシコプロテオミクスとともに、 従来の毒性学的エンドポイント （症状、 臨床 検査、 病理組織学的検查など） に代わる分子毒性学的エンドポイントへの示唆を 与える技術として、 薬物の安全性評価や臨床診断への応用が期待されている （例 えば、 J. K. Nicholson et al. , Nat. Rev. Drug Discov. , 1 153 - 161, 2002 および J. C. Lindon et al. , Toxicol. Appl. Pharmacol. , 187; 137—146， 2003参照） 。 毒性現象には、 1つの代謝物の独立した変化だけでなく、 複数の代謝経路に位 置する様々な中間および最終代謝産物の一体的な変動が伴うものと考えられる。 そのため、 核磁気共鳴 （NMR) 法などの、 ほぼすベての代謝物のシグナルを同時 に検出できる技術を用いることで、 毒性発現に関わる生体分子の挙動を包括的に 捉えることが可能になると期待される。
薬物起因性リビドーシスとの関連では、 リン脂質症 （以下、 「PLsis」 と略記 する場合がある） を誘発することが知られている薬物を投与したラットの尿をプ 口トン MR H NMR)を用いて解析した結果、 種々の代謝物に変動が認められ、 特 にフエナセツル酸 （フエ二ルァセチルダリシン； PAG) が薬物投与により共通し て増加することが報告されており （J. R. Espina et al. , Magn. Reson. Chem. r 39： 559-565, 2001) 、 PAGが薬物の PLsis誘発性のバイオマーカーとして利用で きることが示唆されている。 しかしながら、 多数の薬物に関する知見はなく、 実 際のマーカーとしての信頼性については未知数のままである （例えば、 Society of Toxicology 43rd Annual Meeting Abstracts/Toxicology 194 (2004) 206 - 207では、 尿中 PAGfま、 PLsisだけでなく、 その他の lipidosisのバイオマーカー としても有効であると記載されているのに対し、 Analytical Chemis try, 75： 4784-4792 (2003)では、 PAGはせいぜレ、 PLsisの弱いバイオマーカーであるにす ぎないと評されている） 。 発明の開示
本発明の目的の 1つは、 医薬候補化合物の毒性スクリーユングに有用な、 化合 物による脂質代謝異常症の予測方法を提供することである。 本発明の別の目的は、 既存の医薬品による副作用としての脂質代謝異常症の診断方法、 特に非侵襲的な 診断方法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、 薬物起因性リピド 一シスだけでなく、 遺伝性リビドーシスや脂肪酸代謝ホメォスタシス異常など、 広く脂質代謝異常症およびその関連疾患を診断することができる診断方法を提供 することである。
本発明者らは、 上記の目的を達成すべく、 種々のリビドーシス誘発性もしくは 非誘発性の医薬品化合物を 3日間投与したラットの尿を1 H NMRで分析して代謝物 プロファイルを調べた結果、 リビドーシス誘発性化合物を投与したラットに共通 して PAGの増加と馬尿酸の減少とが観察されることを見出した。 そこで、 本発明 者らは、 各ラットの尿における PAGと馬尿酸との量比を算出し、 末梢血検査およ び病理組織学的検査の結果と比較したところ、 空胞化リンパ球の出現および種々 の標的器官の細胞における脂質蓄積との間に良好な相関を認め、 PAGと馬尿酸の 連動的変化が薬物による脂質代謝異常症の指標となり得ることを実証した。 さらに、 意外なことに、 3日間の短期間投与では末梢血検査および病理組織学 的検査において陽性変化が認められなかったリピドーシス誘発性化合物について も、 PAGと馬尿酸との量比を指標とすれば毒性を検出し得ることが見出され、 薬 物による脂質代謝異常症の早期判定に有用であることが明らかとなった。
また、 サルについて同様の薬物投与試験を行い、 尿中のフエ二ルァセチルダル タミン （以下、 「PAGN l と略記する場合がある。 ヒトゃサル等では、 フエニル ァセチル CoAはダリシン抱合ではなくグルタミン抱合を受けて PAGNとして尿中に 排泄される） と馬尿酸とを測定 ·量比を算出したところ、 リビドーシス誘発性化 合物を投与したサルに共通して PAGN/馬尿酸比の有意な増加が認められた。 従つ て、 PAG (PAGN) /馬尿酸比は、 ラットだけでなく、 ヒ トを含めた哺乳動物一般 において、 薬物による脂質代謝異常症の指標となり得ることが示された。
本発明者らは、 これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、 本発明を完 成するに至った。
すなわち、 本発明は、
[ 1 ] 化合物による脂質代謝異常症の予測方法であって、
( 1 ) 化合物を投与された哺乳動物より採取した試料または化合物に曝露された 哺乳動物細胞もしくは組織培養物中の（a)フエュルァセチルグリシンぉょぴ Zも しくはフエ二ルァセチルダルタミン、 またはフエ二ルァラユンからフエ二ルァセ チルダリシンもしくはフエニルァセチルグルタミンに至る代謝経路における任意 の代謝中間体と、 （b)馬尿酸またはフエュルァラニンから馬尿酸に至る代謝経路 における任意の代謝中間体とを検出し、
(2) 両者の量比を指標として該化合物の脂質代謝異常症誘発性を予測すること を特徴とする方法、
[2] フエ-ルァセチルグリシンおよぴノもしくはフエ-ルァセチルダルタミ ンと馬尿酸との量比を指標とする上記 [1] 記載の方法、
[3] 試料が尿、 血清または血漿である上記 [1] 記載の方法、
[4] 細胞もしくは組織が肝臓、 腎臓または肺由来のもの、 あるいはリンパ球 である上記 [1] 記載の方法、
[ 5 ] 脂質代謝異常症がリン脂質症、 脂肪症およびスフインゴミエリン蓄積症 からなる群より選択される 1以上の病態として発現するものである上記 [1] 記 載の方法、
[6] 哺乳動物における脂質代謝異常症またはその関連疾患の診断方法であつ て、
(1) 哺乳動物より採取した試料中の（a)フエ二ルァセチルダリシンおよび/も しくはフエ二ルァセチルダルタミン、 またはフエニノレアラニンからフエ二ルァセ チルダリシンもしくはフエ二ルァセチルダルタミンに至る代謝経路における任意 の代謝中間体と、 （b)馬尿酸またはフエ二ルァラニンから馬尿酸に至る代謝経路 における任意の代謝中間体とを検出し、
( 2 ) 両者の量比を指標として診断を行うことを特徴とする方法、
[7] フエ二ルァセチルダリシンおょぴ Zもしくはフエ二ルァセチルダルタミ ンと馬尿酸との量比を指標とする上記 [6] 記載の方法、
[8] 試料が尿、 血清または血漿である上記 [6] 記載の方法、
[9] 脂質代謝異常症が遺伝性リピドーシス、 薬物起因性リピドーシスまたは 脂肪酸代謝ホメォスタシス異常である上記 [ 6 ] 記載の方法、
[ 1 0 ] 疾患が高脂血症、 粥状硬化症、 動脈硬化、 心筋梗塞、 脂肪肝、 肝炎、 肝硬変、 糖尿病、 痴呆症、 ァゾレツハイマー病、 心臓病おょぴ慢性疲労症候群から なる群より選択される上記 [ 6 ] 記載の方法、
などを提供する。
本発明の予測 ·診断方法は、 L -フエ二ルァラニン （以下、 「Phe」 と略記する 場合がある；また、 特にことわらない限り、 本明細書において 「フエ二ルァラ二 ン」 とは L-フエ二ルァラニンを意味する） の摂取量の影響を受けないので、 高 用量の薬物投与により被験動物の生理状態が悪化している場合でも高確度且つ高 感度に脂質代謝異常症の予測が可能である。 また、 本癸明の予測 ·診断方法によ れば、 長期間投与でなければリビドーシスの病理組織学的変化が顕在化しない化 合物についても短期間投与で陽性判定が可能である。 さらに、 尿や血漿などの末 梢体液を試料とすれば、 脂質代謝異常症およびその関連疾患の臨床診断において 非侵襲的な診断が可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 哺乳動物における L-フエ二ルァラニンの代謝経路を示す。 発明を実施するための最良の 態
本発明は、 化合物を投与された哺乳動物より採取した試料または化合物に曝露 された哺乳動物細胞もしくは組織培養物中の（a) PAGおょぴノもしくは PAGN、 ま たは Pheから PAGもしくは PAGNに至る代謝経路における任意の代謝中間体 （以下、 「測定物質 (a)」 と総称する場合がある） と、 （b)馬尿酸または Pheから馬尿酸に 至る代謝経路における任意の代謝中間体 （以下、 「測定物質 (b)」 と総称する場 合がある） とを検出し、 両者の量比を指標として該化合物の脂質代謝異常症誘発 性を予測する方法に関する。 本発明の予測方法の適用対象となる哺乳動物は、 事前に化合物を投与されたも のであれば動物種に特に制限はなく、 例えばヒト、 サル、 ラット、 マウス、 ハム スター、 モルモット、 ィヌ、 ネコ、 ゥサギ、 プタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥマ、 ゥシ等 が挙げられる。 好ましくはヒト、 サル、 ラット、 マウス等である。 動物の性別、 齢、 体重等は特に制限されず、 動物種によっても異なるが、 例えばヒトの場合、 母体保護の観点などから、 第 I相試験では、 通常健常成人男性が好ましく選択さ れる （女性 ·小児特有の疾患治療薬ゃ抗癌剤などの場合はこの限りでない） 。 ま た、 ラットの場合は、 約 2〜約 2 4月齢、 体重約 1 0 0〜約 7 0 0 gのものが好 ましく用いられるが、 これに限定されない。
哺乳動物がヒト以外である場合、 遺伝学的おょぴ微生物学的に統御されている 動物個体群を用いることが好ましい。 例えば、 遺伝学的には近交系、 クローズド コロニーの動物を用いることが好ましく、 ラットの場合、 例えば Sprague - Dawley (SD) 、 Wistar、 LEW等の近交系ラットが挙げられ、 マウスの場合、 BALB 、 C57BL/6, C3H/He、 DBA/2, S几、 CBA等の近交系マウスおよび DDY、 ICR 等のクローズドコロニーマウスが挙げられるが、 これらに限定されない。 また、 微生物学的にはコンベンショナル動物であってもよいが、 感染症の影響を排除す る観点から、 SPF (specific pathogen free) もしくはノトパイオートグレード のものを用いるのがより.好ましい。
一方、 哺乳動物細胞もしくは組織は、 上記の哺乳動物から採取された細胞もし くは組織であって、 Pheから PAGもしくは PAGNに至る代謝経路の全部もしくは一 部および Pheから馬尿酸に至る代謝経路の全部もしくは一部を有する細胞を含有 するものであれば特に制限はなく、 あらゆる細胞 [例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神 経細胞、 グリア細胞、 膝臓3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハン ス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 線維芽細胞、 線 維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 間質細胞、 また はこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしく は癌細胞など] もしくはそれらの細胞が 存在するあらゆる組織 [例えば、 脳、脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底 球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆嚢、 骨髄、 副腎、 皮膚、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂肪組織、 骨格筋など] 、 あるいは上記の細胞 ·組織から樹立 される細胞株などが例示される。 好ましくは、 肝臓、 腎臓、 肺、 腸間膜リンパ節、 脾臓等に由来する細胞もしくは組織、 あるいは末梢血リンパ球、 単球等が挙げら れる。 また、 再現性の良さや （特にヒト細胞の場合） 入手の容易さ等から細胞株 の使用が好ましい。 例えば、 ヒト細胞株としては、 肝癌由来の HepG2細胞株、 腎 由来の HEK293細胞株、 肺癌由来の A549糸田胞株、 リンパ腫由来の U- 937細胞株、 単 球由来の THP- 1細胞株、 大腸癌由来の Caco- 2細胞株、 子宮頸癌由来の HeLa細胞株 等が挙げられるが、 これらに限定されない。
哺乳動物に投与または哺乳動物細胞もしくは組織が曝露される化合物としては、 例えば医薬または動物薬の候補化合物 （被験動物がヒトの場合は臨床試験段階の 化合物） などが挙げられる。
哺乳動物に化合物を投与する方法は特に制限されず、 例えば、 試験化合物を固 形、 半固形、 液状、 エアロゾル等の形餱で経口的もしくは非経口的 （例：静脈内、 筋肉内、 腹腔内、 動脈内、 皮下、 皮内、 気道内等） に投与することができる。 試 験化合物の投与量は、 化合物の種類、 勳物種、 体重、 投与形態、 投与期間などに よって異なり、 例えば 3日間程度の短期間投与の場合、 動物が生存し得る範囲で、 標的器官の細胞が生存し得る最高濃度の試験化合物に一定時間以上曝露され得る のに必要な量などが挙げられる。 臨床試験においては、 前臨床試験で得られたデ ータに基づいて設定された範囲内で種々の投与量が選択される。 投与は 1回ない し数回に分けて行うことができる。 投与から試料採取までの時間は動物種、 試験 化合物の投与量、 体内動態等によって異なるが、 例えばラットの場合、 高用量を 短期間投与する場合は、 初回投与から約 1〜約 7日間、 好ましくは約 3〜約 5日間 である。 また、 低用量を長期間投与する場合は、 初回投与から約 1ヶ月以上、 好 ましくは約 2〜約 6ヶ月程度が挙げられる。
投与期間中の給餌 ·給水、 明暗周期などの飼育方法は特に制限されないが、 例 えばラットゃマウスなどの場合、 巿販の固形もしくは粉末飼料と新鮮な水道水も しくは井戸水を自由摂取させ、 12時間明期 Z12時間暗期のサイクルで飼育する 方法が挙げられる。 必要に応じて一定時間絶食おょぴ Zまたは絶水させることも できる。 また、 本発明の予測方法は、 後述するように Phe摂取量の個体差に影響 されないという利点を有するが、 摂餌量から Phe摂取量を計算し得る飼料を用い ることがより好ましい。
本発明の予測方法に用いられる哺乳動物より採取される試料は、 Pheから PAG もしくは PAGNに至る代謝経路のいずれかの代謝産物おょぴ Pheから馬尿酸に至る 代謝経路のいずれかの代謝産物が検出され得る生体試料であれば特に制限はなく、 例えば、 尿、 血漿、 血清などの末=肖体液、 リンパ球、 単球などの末梢血細胞ある いは肝臓、 腎臓、 肺、 腸間膜リンパ節、 脾臓等に由来する細胞もしくは組織の生 検サンプルなどが挙げられる力 被験動物への侵襲が少ないことから末梢体液や 末梢血細胞が好ましく、 細胞抽出液の調製が不要であることから末梢体液がより 好ましい。
末梢体液の採取方法としては、 例えば尿の場合、 ヒトであれば通常の検尿の方 法が挙げられ、 非ヒト哺乳動物であれば、 化合物の投与から一定時間経過後に仙 椎刺激もしくは膀胱圧迫により新鮮尿を強制採取する力 代謝ケージを用いて採 尿容器内に一定時間 （例えば約 1〜約 24時間、 好ましくは約 3〜約 12時間） 内の 自然排泄尿を蓄尿することにより行うことができる。 特殊な手技を必要としない ことやデータのばらつきが少ない等の点では後者が好ましい。 蓄尿する場合、 尿 中代謝物の変化を防ぐために採尿容器を氷冷しておくことが好ましく、 また、 防 腐剤としてトルエン、 チモール、 濃塩酸等を微量滴下しておいてもよい。 さらに、 尿の蒸発を防ぐために採尿容器に少量の流動パラフィンを添加することもできる。 採取した尿は必要に応じて遠心分離等により上清を精製した後測定に供される力 測定までに時間を要する場合は凍結保存し、 用時融解して用いてもよい。
血漿の場合は、 ヒトであれば通常の採血方法により肘の裏側や手の甲等から静 脈血を採取し、 非ヒト哺乳動物であれば、 尾静脈、 尾動脈、 眼窩静脈叢を傷つけ て流出した血液を毛細管などを用いて採取し、 必要に応じてへパリン、 EDTA、 タエン酸ナトリゥム等の抗凝固剤を添カ卩して遠心分離もしくは血漿分離膜による 濾過により血球を分離除去することにより調製することができる。 血清の場合は、 同様に採取した血液を一定時間以上放置して血餅を形成させた後、 遠心分離等に より上清を採取することにより調製することができる。 血漿、 血清とも測定まで に時間を要する場合は凍結保存して用時融解して用いることができる。
一方、 試料が細胞もしくは組織の場合は、 生検により得られた各種器官由来の 細胞もしくは組織、 あるいは上記のようにして採取した血液から血漿を分離した 後の血球画分をさらに常法により分画して得られる各種血液細胞を、 哺乳動物細 胞もしくは組織培養物について後述する方法に準じて処理し、 細胞もしくは組織 抽出液を調製すればよい。 当該抽出液は凍結保存して用時融解して用いることも できる。
哺乳動物細胞もしくは組織を化合物に曝露させる方法も特に制限はないが、 具 体的には、 例えば、 細胞株を試料として用いる場合、 適当な培地中、 好適な条件 下で培養した細胞増殖期の細胞を、 トリプシン - EDTAなどを用いて剥離させ、 遠 心して細胞を回収した後、 適当な培地 [例：約 5〜約 20%の胎仔ゥシ血清 （FBS) を含む MEM {Science, 122： 501 (1952) ) 、 DMEM Virology, 8： 396 (1959) ) 、 RPMI 1640 ίρ ¾ { The Journal of the American Medical Association, 199： 519 (1967) ) 、 199培地 ^Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73： 1 (1950) ) など （必要に応じて、 ペニシリ ン、 ストレプトマイ シン、 ハイグロマイシン等の抗生物質をさらに添加してもよい） ] を加えて所望 の細胞密度となるように懸濁する。 細胞密度 ίま特に限定されないが、 細胞が細胞 増殖期の状態を保つように調整することが好ましい。 したがって、 好ましい当初 細胞密度は使用する細胞の増殖速度等によって異なり、 当業者であれば使用する 細胞に応じて容易に設定することができるが、 通常約 5 X 104〜約 l X lO^ellsZ mLである。 適当な溶媒に溶解 （もしくは分散媒に分散） した試験化合物を培地 でさらに希釈し、 終濃度が、 例えば細胞が生存し得る最高濃度 （当該濃度は、 另 IJ 途病理組織学的観察を行って決定することができる） となるように、 上記細胞懸 濁液に添加して、 通常条件下、 例えば、 C02インキュベータ一中で、 5%C02/95%大 気、 5%C02/5%02/90%大気等の雰囲気下、 約 30〜約 40°Cで、 約 3〜約 168時間、 好ま しくは約 6〜約 72時間、 より好ましくは約 12〜約 48時間培養する。 また、 哺乳動 物細胞もしくは組織としては、 生体から採取した細胞もしくは糸且織をそのまま用 いることもできる。
化合物に曝露された哺乳動物細胞もしくは組織培養物 （本発明において、 化合 物への曝露は、 細胞もしくは組織を一定時間ィンキュベートする工程を必然的に 伴うので、 生体から採取した細胞もしくは組織をそのまま化合物に曝露する場合 も、 ここでいう培養物に包含される） は、 測定物質 (a)および (b)の種類等に応 じて細胞/組織または培養上清のいずれかを遠心分離、 濾過等により適宜分取し、 培養上清についてはそのまま、 あるいは必要に応じて濃縮等の処理を施した後で、 細胞/組織については通常の抽出方法に従つて可溶性画分を調製し、 測定に供す ることができる。 例えば、 氷冷したリン酸緩衝液、 トリス-塩酸緩衝液、 酢酸緩 衝液、 ホウ酸緩衝液等の抽出用緩衝液中で、 必要により超音波処理や界面活性剤 等を用いて細胞 Z組織を破碎した後、 遠心分離して上清を回収することにより得 ることができる。
本発明の予測方法では、 上記のようにして得られた検体中の PAGおよびノもし くは PAGN (以下、 「PAG/PAGN」 と略記する場合がある） または Pheから PAGもし くは PAGNに至る代謝経路における任意の代謝中間体 （測定物質 (a) ) と、 馬尿酸 または Pheから馬尿酸に至る代謝経路における任意の代謝中間体 （測定物質 (b) ) とを検出する。 Pheから PAGもしくは PAGNに至る代謝経路における任意の代 謝中間体とは、 具体的には、 2 -フエニルェチルァミン、 フエニルァセトアルデ ヒ ド、 フエ-ル酢酸おょぴフエュルァセチル CoA (それらの抱合体 （PAGおよび PAGNを除く） を含む） のいずれかを意味し、 Pheから馬尿酸に至る代謝経路にお ける任意の代謝中間体とは、 フエニルピルビン酸、 フエニル乳酸、 桂皮酸おょぴ 安息香酸 （それらの抱合体 （馬尿酸を除く） を含む） のいずれかを意味する。 哺乳動物においては、 Pheは主としてフエ二ルァラニンヒドロキシラーゼによ り L-チロシン （Tyr) に酸化され、 さらにカテコールアミンやメラニンなどに変 換されるが、 一部の Pheは、 フエニルピルビン酸、 フエニル乳酸、 桂皮酸、 安息 香酸を経て最終的に馬尿酸に代謝されるか （図 1の経路 B) 、 あるいは 2 -フエ二 ルェチルァミン、 フエニルァセトアルデヒ ド、 フエニル酢酸、 フエニノレアセチノレ CoAを経て最終的に PAG (ラット、 マウス、 ィヌなどの場合） および Zまたは PAGN (ヒト、 サルなどの場合） に代謝されて （図 1の経路 A) 、 尿中に排泄され ることが知られている。 例えばヒトゃラットの場合、 正常の状態では、 Tyr合成 に利用されない Pheの多くは経路 Bを通じて代謝 '排泄 (クリァランス) される ので、 尿中 PAG (PAGN) /馬尿酸比は馬尿酸側に偏っている。 本発明者らは、 リ ピドーシス誘発性化合物投与ラットの尿に共通する PAG増加と馬尿酸減少という 変化は、 Pheクリアランスのパランスが、 何らかの理由によって、 通常はマイナ 一経路である第二の経路 （経路 A) をより多く利用する方向に傾くためであるこ とを見出した。
従って、 検体中の測定物質 (a)と測定物質 (b)との量比を測定して化合物非投 与の場合のそれと比較し、 その結果 (a) / (b)比が増加していれば、 その化合物は リピドーシス誘発性であると予測することができる。 前述の通り、 PAGの増加を 指標として化合物の PLsis誘発性を予測し得ることが示唆されてはいたが、 PAG/PAGNの増加を馬尿酸減少との連動的変化として捉える思想、 さらにかかる 連動性を Pheクリアランス経路のパランス変化として捉える思想はこれまでに皆 無である。 また、 哺乳動物にとって Pheは必須アミノ酸であり、 食餌から摂取す る必要があるので、 例えば脂質代謝異常症以外の状態悪化や給餌制限等によって 摂食量が減少すると Phe摂取量も減少し、 Tyr合成に利用されずに排泄される Phe 量も減少する。 従って、 PAG/PAGNの増加のみを指標とした場合には、 上記 (a) / (b)比が増加しているにもかかわらず、 経路 Aへの Pheの流入量が減少してい るために、 みかけ上 PAG/PAGN量の変化が認められない場合があり、 予測の確度 が低下するという問題が生じる。 そのため、 正しい予測結果を得るためには、 Phe摂取量を厳密にモニターして測定値を補正しなければならない。 これに対し、 (a) / (b)比を指標とすれば、 Phe摂取量に関係なく測定値の変化のみで陽性 Z陰 性の判定が可能であり （後記実施例 4を参照） 、 簡便性の面で格別に優れている。 本明細書において 「測定物質 (a)と測定物質 (b)の量比」 という場合、 上記 (a) Ab)比だけでなく、 （a) + (b)に対する（a)もしくは（b)の比も含まれる。 (a) + (b)は Phe摂取量に対応するものであるから、 かかる比率は、 クリアランス 経路に流入した Pheのうち経路 A (もしくは B) に流入する割合がどれだけ変化し たかを示す。 Phe摂取量を算出し得る場合には、 測定物質（a)または（b)の一方の みを測定し、 Phe摂取量に対する当該測定値の比で比較することも可能である。 Phe摂取量を算出する方法としては、 Phe含有成分を均一に含んでなる食餌を与 えて摂餌量をモニターすることなどが挙げられる。
測定物質 (a)と測定物質 (b)の組み合わせは特に限定されないが、 検体中に両 者が含まれていることが必要である。 例えば、 化合物を投与された哺乳動物から 採取された試料が尿、 血清または血漿である場合、 測定物質（a)としては PAG/PAGN、 測定物質 (b)としては馬尿酸が好ましいが、 これらに限定されない。 測定物質 (a)およぴ (b)はいかなる測定方法によつて検出してもよく、 両者を 同時検出してもよいし、 それぞれ別個に検出してもよい。 両者を同時検出する方 法としては、 例えば核磁気共鳴法 （例： 1 H NMR、 13C NMR) 、 ガスクロマトグラフ ィー （GC) 法、 ガスクロマトグラフィ^ ^一質量分析 (GC-MS) 法、 高速液体クロ マトグラフィー （HPLC) 法、 HPLC- NMR法、 液体ク口マトグラフィ一一質量分析 (LC-MS) 法、 LC - MS - MS法、 薄層クロマトグラフィ一一質量分析 （TLC- MS) 法、 キヤピラリーゾーン電気泳動一質量分析 （CZE-MS) 法、 ィムノアツセィを利用 する方法等が挙げられるが、 これらに限定されない。 各検出方法における各種パ ラメータなどの測定条件については、 測定物質の種類等に応じて当業者は容易に 適宜選択して行うことができる。
例えば、 ¾ NMR法により PAGと馬尿酸とを検出する場合、 例えば J. R. Espina et al. (2001；上述） 、 Drug Metabolism and Disposition, 26 ： 1134— 1143 (1998)に記載された方法あるいはこれらに準じた方法により行うことがで きる。 具体的には、 後記実施例に記載の方法等が挙げられる。 13C NMR法により PAGと馬尿酸を検出する場合、 例え Drug Metabolism and Disposition (1998；上述）に記載された方法あるいはそれに準じた方法により、 また、 フエ ニル酢酸を検出する場合は、 例えば、 Am J Physiol. , 275(5 Pt 1) : E843-E852 (1998) に記載された方法あるいはそれに準じた方法により行うことができる。
HPLCにより PAGと馬尿酸とを検出する場合、 例え Drug Metabolism and Disposition (1998；上述）に記載された方法あるいはそれに準じた方法により、 また、 馬尿酸または安息香酸を検出する場合は、 ¾ Drug Metabolism and Disposition, 31 (8)： 987 - 992 (2003)、 J. Pharmacol. Exp. Ther. , 305(1)： 279-289 (2003)に記載された方法あるいはこれらに準じた方法により行うこと ができる。
HPLC-麗 R法により馬尿酸等を検出する場合は、 例え
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Biochem. , 291： 245-252 (2001)に記載された方法あるいはそれに準じた方法により行うことが できる。
GC法、 GC - MS法により PAGと馬尿酸とを検出する場合、 執 lDrug Metabolism and Disposition (1998；上述)、 Drug Metabolism and Disposition (2003；上 述）に記載された方法あるいはこれらに準じた方法により行うことができる。
LC-MS-MS法により馬尿酸を検出する場合、 例え f Rapid. Commun. Mass. Spectrom. , 18： 265-272 (2004)に記載された方法あるいはこれらに準じた方法 により行うことができる。
ィムノアツセィを利用して PAGNを検出する場合、 例えば米国特許第 5, 100, 807 号明細書に記載された方法あるいはこれらに準じた方法により行うことができる。 この場合、 PAG/PAGNと馬尿酸のそれぞれを抗体を用いて検出する場合、 例えば 特開平 11- 343300号公報に記載の方法等に準じて他方の化合物に対する交叉反応 性がないことを予め検証しておくことが必要である。
上記のいずれかの方法により、 （1)化合物を投与された哺乳動物から採取した 試料または化合物に曝露された哺乳動物細胞もしくは組織培養物と、 （2)化合物 を投与されていない哺乳動物から採取した試料または化合物に曝露されていない 哺乳動物細胞もしくは組織培養物とで、 それぞれ測定物質 (a)と測定物質 (b)と の量比を測定 ·比較して、 （a) / (b)比 [もしくは（a) / (a) + (b)比] が増加または (b) / (a) + (b)比が減少していれば、 当該化合物は脂質代謝異常症を誘発すること が予測される。 ここで量比の変動率は特に制限されず、 動物種、 細胞種、 投与量、 投与期間、 投与形態、 試料の種類などによっても異なるが、 例えば化合物を 3日 間投与されたラットの尿を試料とする場合には、 （a) (=PAG) / (b) (=馬尿酸）比が 約 0. 3以上、 化合物を 7日間投与されたサルの尿を試料とする場合には、 (a) (=PAGN) / (b) (=馬尿酸）比が約 4. 0以上であれば、 脂質代謝異常症誘発性であ ると予測することができる。
本発明の予測方法により予測することができる脂質代謝異常症は特に制限され ないが、 例えば PLsis、 脂肪症およびスフインゴミエリン蓄積症等が挙げられる。 本発明の予測方法の確度は、 化合物を一定期間 （例えば、 約 3日〜約数ヶ月 間） 投与された哺乳動物から採取した各種標的器官の生検サンプルについての病 '理組織学的変化の観察などにより評価することができるが、 化合物を実際に使用 される程度の低用量で長期間投与された動物を用いて評価することが好ましい。 短期間の大量投与においては、 後記実施例に示される通り、 PLsisを誘発するこ とが報告されている化合物について病理組織学的変化、 空胞化リンパ球検査とも 陰性である場合がある。
他方、 本発明の予測方法によれば、 短期間の大量投与においても（a) / (b)比の 顕著な増大が認められ、 脂質代謝異常症誘発性であると予測することができる。 このように、 本発明の予測方法は、 より短期間に陽性 ·陰性の確度の高い判定が 可能であり、 従って医薬品開発の初期段階においては毒性スク リーニングの効率 化を図ることができ、 一方、 臨床試験段階においては、 具体的な症状を発現する 以前に脂質代謝異常症の発症リスクを予見することができ、 被験者の危険を低減 することができる。
本発明は、 上述のように、 Pheのクリアランスにおける 2つの代謝経路の利用 パランスが変化することにより、 脂質代謝異常症を予測し得ることを見出したこ とに基づく。 従って、 本発明の方法は、 薬物による脂質代謝異常症 （即ち、 薬物 起因性リビドーシス） に限らず、 広く脂質代謝異常症、 さらにはその関連疾患 (即ち、 脂質代謝異常症に起因する疾患、 結果として脂質代謝異常症を伴う疾患 など） の診断に使用することができる。 従って、 本発明はまた、 哺乳動物より採 取した試料中の（a) PAG/PAGNまたは Pheから PAGもしくは PAGNに至る代謝経路にお ける任意の代謝中間体と、 （b)馬尿酸または Pheから馬尿酸に至る代謝経路にお ける任意の代謝中間体とを検出し、 両者の量比を指標として診断を行うことを特 徴とする、 哺乳動物における脂質代謝異常症またはその関連疾患の診断方法を提 供する。 ここで、 哺乳動物、 哺乳動物から採取される試料、 任意の代謝中間体、 量比はいずれも上記本発明の予測方法において記載したと同様である。 また、 こ こで 「診断」 とは、 罹患の有無の判定に限らず、 確定診断後の重症度 （進行度） 、 将来罹患 ·発症する可能性が高いか否かの判定など、 あらゆる診断を包含する概 念として用いられる。
本発明の診断方法により診断することができる脂質代靆ォ異常症としては、 例え ば遺伝性リビドーシス （例： ゴ一シェ病、 ニーマンピック病 （A〜(型） 、 ファ 一プリ病、 ウォルマン病、 コレステロールエステル蓄積症、 脳腱黄色腫症、 フィ トステロール血症、 レフサム症、 ティ-サックス病、 全身性 (GM1) ガンダリオ シドーシス、 サルファチドリビドーシス （異染性白質萎縮症） 、 ガラクトシルセ ラミドリビドーシスなど） 、 薬物起因性リビドーシス （例： PLsis、 脂肪症、 ス フインゴミエリン蓄積症など） 、 脂肪酸代謝ホメォスタシス異常 （例：脂肪酸 ]8 酸化異常など） 等が挙げられる。 ここで 「薬物」 とは、 医薬品もしくは動物薬と して既に認可され使用されている薬物のほか、 被験動物が誤って服用ないし環境 中から吸収した任意の薬物などが挙げられる。
また、 脂質代窗す異常症の関連疾患としては、 脂肪酸代篛 ίホメォスタシス異常に 関連する疾患として、 例えば高脂血症、 粥状硬化症、 動脈硬化、 心筋梗塞、 脂肪 肝、 肝炎、 肝硬変、 糖尿病、 痴呆症、 アルツハイマー病、 心臓病おょぴ慢性疲労 症候群などが、 また、 薬物起因性リビドーシスに関連する疾患 （副作用症状） と して、 例えば肺線維症、 失明、 脳症などが挙げられるが、 それらに限定されない。 また、 非ヒト哺乳動物における疾患としては、 例えばネコ、 ィヌなどのペット動 物における肝リピドーシス等も挙げられる。
図 1に示されるように、 Pheから馬尿酸に至る代謝経路において、 桂皮酸から 安息香酸への変換は β酸化により行われる。 PLsisをはじめとする脂質代謝異常 症においては、 脂肪酸の 酸ィヒが抑制されることが各種文献において報告されて いることから、 脂質代謝異常症における Pheクリアランス経路の利用パランスの 変化は、 桂皮酸から安息香酸への変換が抑制されるために、 PAG/PAGNへ至る代 謝経路がより利用されるからである可能性がある。 従って、 本発明の診断方法は、 特に脂肪酸の )3酸ィヒ異常に関連する疾患の診断に有用であるかもしれない。
脂質代謝異常症またはその関連疾患に罹患している （罹患する可能性が高い） 等の診断基準となる（a) / (b)比の数値は、 動物種、 齢、 性別、 採取する試料の種 類などによって異なる。 例えば、 同一条件下の正常動物における平均値 + 2SD以 上であれば、 脂質代謝異常症であると診断する等の基準を設けることができる力 それに限定されない。
本発明はまた、 本発明の予測方法および診断方法に好適に用いること できる キットを提供する。 本発明のキットは、 （a) PAG/PAGNまたは Pheから PAGも しくは PAGNに至る代謝経路における任意の代謝中間体の測定用試薬と、 （b)馬尿酸また は Pheから馬尿酸に至る代謝経路における任意の代謝中間体の測定用試薬とを含 むことを特徴とする。 測定用試薬としては、 定量的解析を可能とするものである 限り特に限定されないが、 抗体を含むものが好ましい。 測定用試薬が抗体を含む ものである場合、 測定物質 (a)に対する抗体、 および測定物質 (b)に対する抗体 は、 （a) / (b)比の測定に差し支えない程度に、他方の測定物質に対し交叉反応性 が低いものがそれぞれ用いられる。 抗体はまた、 ポリクローナル抗体、 モノクロ ーナル抗体のいずれでもよく、 標識剤で標識されていても標識されていなくとも よい。 測定物質 (a)に対する抗体および Zまたは測定物質 (b)に対する抗体が標 識剤で標識されていない場合、 本発明のキットは、 標識剤をさらに含むこともで きる。 標識剤としては、 例えば、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質な どが用いられる。 放射性同位元素としては、 例えば、 〔125 1〕 、 〔131 1〕 、 C3 H〕 、 〔14C〕 などが用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなも のが好ましく、 例えば、 β一ガラクトシダーゼ、 β一ダルコシダーゼ、 アル力リ フォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチ矛シァネ ートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミノール、 ルミ Ζ—ル誘 導体、 ルシフェリン、 ルシゲユンなどが用いられる。 さらに、 抗体と標識剤との 結合にビォチン一 （ストレプト） アビジン系を用いることもできる。
本発明のキットに含まれる抗体は、 例えば米国特許第 5， 100， 807号明細書に記 載された方法あるいはこれらに準じた方法により作製することができる。 この場 合、 例えば特開平 11- 343300号公報に記載の方法等に準じて、 （a) / (b)比の測定 に差し支えない程度に他方の測定物質に対する交叉反応性が低いことを予め検証 しておくことが必要である。
本発明のキットはまた、 測定物質 (a)、 および/または測定物質 (b)をさらに 含むこともできる。 この場合、 測定物質 (a)、 測定物質 (b)は、 標識剤で標識さ れていても標識されていなくともよい。 測定物質 (a)および Zまたは測定物質 (b)が標識剤で標識されていない場合、 本発明のキットは、 標識剤をさらに含む こともできる。 標識剤は上述と同様である。 本発明のキットはさらに、 測定物質 (a)に対する抗体、 および Zまたは測定物質 (b)に対する抗体 （一次抗体） を特 異的に認識し得る二次抗体、 あるいは抗体を固相化するための担体 （例：マイク ロタイタ一プレート、 ガラスビーズなど） を含んでいてもよい。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 これらは単なる例 示であつて本発明の範囲を何ら限定するものではない。 実施例 1 (参考例 1 )
PLsis誘発性化合物投与ラットにおける病理組織学的検査および末梢血リンパ球 検査
以下の 1 0種の市販薬を試験化合物として、 PLsis誘発性の有無を病理組織学 的検査および末梢血リンパ球検査により調べた。 アミオダロン、 イミプラミン、 クロミプラミン、 タモキシフェン、 クロノレプロマジン、 キナク リン、 クロロキン. ァマンタジンおょぴペルへキシリンは SIGMA社より、 フルォキセチンは和光純薬 工業よりそれぞれ購入した。 陰性対照として、 血管炎/動脈症を引き起こすが PLsis等の脂質代謝異常症を引き起こすことは報告されていない 3種の薬物 （口 フルミラスト （TO 95/01338) 、 ァリフ口 （W0 93/19749) およぴロリプラム (特公昭 60- 11028) ) を使用した。 5週齢の Crj : CD (SD) IGSラット （日本チャールズリパー株式会社、 閉鎖澴境下 生産） 雄 475例 （2002年 9月 3日 ： 95匹；試験番号 32- 207/su、 10月 15日 ： 95匹； 試験番号 32- 231/su、 11月 5 S ： 95匹；試験番号 32 - 233/su、 11月 12日 ： 95 ；試 験番号 32- 234/su、 11月 28日 ： 95匹；試験番号 32- 232/su) を入手し、 約 1週間馴 化飼育した。 その間に検疫を実施するとともに一般状態の観察及び体重測定を行 つた。 異常の認められなかった動物を選択し、 試験ごとに採尿用として 1群雄各 4例からなる 7群、 血漿中薬物濃度測定用サテライト群として 1群雄各 3例 ¾ らな る 6群及び途中剖検動物として 1群雄各 6例からなる 7群の合計 20群 （計 88例） に 無作為に群分けした。 投薬開始時の 6週齢での体重範囲は、 171〜200 g (試験番 号 32- 207/su： 172〜198 g、 試験番号 32- 231/su： 171〜198 g、 試験番号 32 - 232/su： 176〜200 g、 試験番号 32- 233/su： 178〜： 199 g、 試験番号 32- 234ノ su： 172〜； 197 g) であった。 このうち、 途中剖検動物を用いて以下の実験を行った。 動物は金網底の金属製ケージに個別に収容し、 各ケージはクリーンブース内に 設置した水洗式ラックに群間で無作為に配置した。 動物室の環境条件は室温 20 〜26°C、 相対湿度 40〜70%、 新鮮空気の換気回数 8〜25回/時間とし、 照明時間 は 12時間/日 （点灯時間：午前 7時〜午後 7時） とした。 動物には γ線照射した 粉末飼料 （CR-LPF, オリエンタル酵母） を与え、 水道水とともに自由に擾取さ せた。 - 各被検物質に分散媒 /媒体を加えて撹拌し高用量を調製した。 高用量投与液を 分散媒 /溶媒で約 3倍及び 10倍に希釈して中 ·低用量投与液を調製した。 各被検 物質の用量は以下の通りに設定した。 [尚、 LD5。は各薬剤の Summary Bas is of Approval (FDA)を参照した。 ]
アミオダロン： 100、 300及ぴ 1000 mg/kg/日 （LD50: 3000 mg/kg以上）
理由：投薬可能な量を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。
イミプラミン： 100、 300及ぴ 1000 mg/kg/日 （LD5。： 1807 mg/kg)
理由： LD5。の約半量を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。 クロミプラミン： 100、 300及ぴ 1000 mg/kg/ Θ (LD5。： 914 mg/kg) 理由： LD5。を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。
タモキシフェン： 100、 300及び 1000 mg/kg/日 （LD5。： 1190 mg/kg)
理由： LD5。を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。
クロルプロマジン： 10、 30及ぴ 100 mg/kg/日 （LD5。： 145 mg/kg)
理由： LD5。の約 2/3量を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。
キナクリン： 60、 200及ぴ 600 mg/kg/日 (LDS0: 900 mg/kg)
理由： LD5。の約 2/3量を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。
クロ口キン： 25、 75及ぴ 250 mg/kg/ 0 (LD50: 330 mg/kg)
理由： LD5。の約 2/3量を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。
ァマンタジン： 75、 250及ぴ 750 mg/kg/日 （LD5。： 1275 mg/kg)
理由： LD5。の約 2/3量を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。
ペルへキシリン： 60、 200及ぴ 600 mg/kg/日 （LD5(): 不明）
理由： 1週間投与で病変がみられる量を高用量とし以下、 公比約 3で咸じた。 フルォキセチン： 30、 100及ぴ 300 mg/kg/日 （LD5。： 452 mg/kg)
理由： LD5。の約 2/3量を高用量とし以下、 公比約 3で減じた。
ロフノレミラスト ： 1及ぴ 3 mg/kg
理由 ：血管炎/動脈症がみられる用量を高用量とし、 その 1/3用量を低用量 とした。
ァリフ口 ： 30及ぴ 100 mg/kg
理由 ：血管炎/動脈症がみられる用量を高用量とし、 その 1/3用量を低用量 とした。
ロリプラム： 30及ぴ 100 mg/kg
理由 ：血管炎/動脈症がみられる用量を高用量とし、 その 1/3用量を低用量 とした。
対照群： 0. 5 w/vy。メチルセルロース溶液 投与液量 10 mL/kg/ 3を 1日 1回、 3日間 （陰性対照については 4日間） 強制経口 投与により投与した。 動物の生死、 一般状態、 体重、 摂餌量等を PM480O (メ ト ラー） および EB3200D (島津製作所） を用いて観察した。
投与終了後、 すべての動物について肝臓、 腎臓、 心臓、 脾臓、 肺おょぴ腸間膜 リンパ節 （陰性対照投与群については肝臓、 腎臓、 心臓、 脾臓、 肺 （気管支を含 む） 、 胃 （短胃動脈を含む） 、 腸間膜および精巣） その他各被検物質における追 加器官 ·組織として、 イミプラミンでは眼球、 クロミプラミンでは脳おょぴ眼球、 タモキシフェンでは副腎、 下垂体おょぴ眼球、 クロルプロマジンでは脳おょぴ眼 球、 キナクリンでは脳および大腿部筋肉、 クロ口キンでは脳おょぴ眼球、 ぺノレへ キシリンでは脳おょぴ皮膚、 フルォキセチンでは脳 （陰性対照投与群については、 剖検時に変化のみられた器官 '組織） をサンプリングし、 常法により光学顕微鏡 及び電子顕微鏡学的にサンプリングした組織の病理組織学的変化を調べた。
また、 ADVIA120 (パイエルメディカル) 、 E - 4000 (シスメッタス) を用いて、 赤血球数、 へマトクリツト値、 へモグロビン濃度、 平均赤血球血色素量（MCH)、 平均赤血球血色素濃度 (MCHC)、 平均赤血球容積 (MCV)、 血小板数、 白血球数、 網 状赤血球数、 白血球百分比、 空胞化リンパ球率 （PLsis誘発性化合物のみ） など の血液学的検查を実施した。
PLsis誘発性化合物投与群における病理組織学的変化 （脂質蓄積を承す電顕 像） およぴ空胞化リンパ球率の結果を表 1に示す。 クロルプロマジンを除く 9種 の化合物について、 少なくとも高用量では空胞化リンパ球率の顕著な増加おょぴ いずれかの標的器官における病理組織学的変化が認められた。 クロルプロマジン については、 3日間という短期間投与では、 いずれの用量でも病理組織学的検査 およぴ空胞化リンパ球検查によって PLsis陽性を判別できないことがわかった。 陰性対照投与群においては、 PLsisなどの脂質代謝異常症を示す病理組織像は観 察されなかった。 病理組維学的変化 (PLsis)
兩暈 平均空胞化リンパ球率 (％)
化合物 (mg kg/日） 肺 リンパ班 肝臓 脾臟 その他
75 1 ― 一 一 ァマンタジン 250 1
750(死亡） 61 + 一 一
100 1 一 ― ― - アミ才ダロン 300 33 + 一 一 ―
1000 40 + 一 + ―
25 5 一 -- -- ―
ク キン 75 24 ― + 一 十
250 66 ― + + ―
10 2 一 ― ― クロルプロマジン 30 2 ― ― ― 一 一
100 1 一 一 一 ― 一
100 2 ― 一 一 クロミプラミン 300 30 + + ―
1000 (死亡〉 38 + +
30 7 + + 一
フル才キセチン 100 28 + + 一 脳
300 31 一 + ― 一
100 20
イミブラミン . + +
300 40 + + 一
1000(死亡） ND ND ND ND
60 2 一 ― - -- ペルへキシリン 200 4 +
600 52 + + ― +
60 14 + 一 + 一 ― キナクリン 200 32 + + ―
600 52 + ― ―
100 20 + + 一 ― ― タモキシフェン 300 39 + 一
1000 40 + + + - 一
1 ND
口フルミラスト ―
3 D 一 ― 一
30 D
ァリフ口 100 -- ND 一 ― - -
30
ロリプラム ND ― ―
100 一
実施例 2
PLsis誘発およぴ非誘発化合物投与による尿中 PAG/馬尿酸比の発現変動
実施例 1 (参考例 1 ) で準備した採尿用ラットに同様の方法により被検物質を 投与し、 1回及び 3回投与後に約 6時間の絶食、 絶水下の蓄尿を採取した。 容器を 氷冷下の状態にして蓄尿した。 採尿後、 1500 X g、 10分間遠心し、 上清を 1 mL 以上採取してマイクロチューブで超低温フリーザーにて測定まで凍結保存 （- 70°C以下） した。 陰性対照投与群については、 24時間の尿を氷冷下で採取し、 採尿後、 測定まで- 30°Cで保存した。
¾ NMRは以下のようにして実施した。 以下に記载する試薬類は精製をせずに使 用した。 重水 （D20) は ISOTEC. INC (USA) より、 NaH2P04 · 2H20, Na2HP04 - 12H20 は関東化学 （東京） から購入した。 Sodium 3- (trimethylsilyl)— propionate - 2, 2, 3, 3, -d4 (TSP) は ISOTE INC (USA) から購入した。 NMRスペクトルの測定 は Unity IN0VA600 (Varian) (¾共鳴周波数 599. 59 MHz) を使用した。
リン酸緩衝液は以下のように調製した。 NaH2P04 · 2 0を使用して約 0. 2mol/L Na P04溶液およぴ Na2HP04 · 12H20を使用して約 0. 2mol/L Na2HP04溶液を調製した 後、 両液を混合し、 pHメータを用いて約 PH=7. 4に調整した。
内部標準溶液として、 TSPを約 11讓 ol/ Lの濃度となるように重水中に溶解さ せた。
尿試料 500 Lをエツペンドルフに採取し、 上記リン酸緩衝液 250 Lを添加し て約 10分間室温で放置した後、 約 10°C、 13000rpmで約 10分間遠心分離し、 上澄 みを約 600 L採取して MR試料管に移した。 さらに NMR試料管に TSP重水溶液を約 60 し添カ卩した。
核磁気共鳴装置は、 丽 R測定が行えるよう1 H核の測定が行えるプローブをあ らかじめセットし、 25°Cに設定しておいた。 上記の MR試料管を分光計にセット し、 温度が安定するまで約 10分放置した後、 分解能、 チューニング、 90° パル スの測定、 観測中心を水シグナルに合わせる等、 ハードウェア側の設定やパラメ —タを準備した。 測定条件は以下のようにセットした。 seqfil (パルス系 列) ： tnnoesy, sspul (steady state pulse) ： n (オフ) ， ss (プレス ヤ ン） ： 8回， mix (混合時間） ： 100ms, sw (観測幅） ： 8000Hz， np (複合ポィン ト数） ： 65536ポイント， dl (待ち時間） ： 4. 904sec， satpwr (照射パワー） ： 10dB, satdly (照射時間） ： 1 sec, 積算回数： 64回
測定データを保存した後、 以下の条件でフーリエ変換を行った。
ポイント数 ： 65536ポィント， ウィンドウ関数 ： exponential window function lb=0. 2Hz
位相調整、 TSPのメチルシグナルを Oppmとして基準の設定等を行った。
ACD/SpecManager (ACD Labs, Canada) を使用し、 ベースライン補正後、 PAG (3. 68ppm) 、 クレアチニン （4. 06PPm) 、 馬尿酸 （7. 83ppm) のシグナノレ強度を 求め、 比を計算した。 その結果を表 2および 3に示す。
用 M PAG/馬尿酸（％) 1) PAG+馬尿 ¾ /クレアチニン1 ) 化合物 PAG/PAG+馬尿酸（ 0/6) 1 )
(mg/kg/日） ( PAG +馬尿酸） コントロール (非投与） 0 12, 15 10.74 1.52 ( 0.16 + 1.35 )
75 19.31 16.17 1,44 ( 0.23 + 1.21 ) ァマンタジン 250 19.69 16.18 1.21 ( 0,20 + 1.02 )
750 130.33 56.58 0.37 ( 0.21 + 0.16 )
100 16.12 13.68 1.69 ( 0.23 + 1.47 ) オダロン 300 33.94 * 1.56 ( 0.53 + 1.04 )
1000 53.66 * 1.32 ( 0.71 + 0.60 )
25 15.42 13.25 1.34 ( 0.18 + 1.16 ) クロ口キン 75 23.95 * 1.23 ( 0.24 + 1.00 )
250 40.08 * 1 9 ( 0.52 + 0.76 )
10 14.93 12.80 1.45 ( 0.18 + 1.27 ) クロルプロマジン 30 14.51 12.57 1.63 ( 0.21 + 1.42 )
100 42.20 * 0.86 * ( 0.30 + 0.56 )
100 16.79 14.27 1,42 ( 0.20 + 1.22 ) クロミプラミン
300 62.72 * 33.36 * 0.74 * ( 0.20 + 0.52 )
30 15.60 * 1.13 ( 0.17 + 0.96 ) フル才キセチン 100 36 oo.86 * 25.90 * 1.06 ( 0.27 + 0.79 )
300 56. b3o2 oo * 31.88 * 0.67 * ( 0.20 + 0.47
100 39.63 * 28.23 * 1.21 ( 0.34 + 0.87 ) イミブラミン
300 55.27 * 0.71 * ( 0.40 + 0.31 )
60 11.39 10.16 1.47 ( 0.15 + 1.31 ) ペルへキシリン 200 18.49 15.59 * 1.52 ( 0.24 + 1.28 )
600 146.97 * 45.67 * 0.75 * 0.31 + 0.44 )
60 28.35 * 21.82 * 1.45 ( 0.32 + 1.13 ) キナクリン 200 46.42 * 1.58 ( 0.75 + 0.83 )
600 441.69 * 1.07 * ( 0.83 + 0.24 )
100 30.76 * 23.35 * 1.34 ( 0.31 + 1.02 ) タモキシフェン 300 1.16 ( 0.63 + 0.53 )
1000 54.00 * 1.58 ( 0.91 + 0.67 ) υ平均値（π=3- 4 :コントロールのみ π=20)
* ρく 0.025 (Williams検定） vsコント口一ル（非投与群)
PAG：フエニルァセチルグリシン
Figure imgf000028_0001
すべての PLsis誘発性化合物について、 非投与群と比較して PAG/馬尿酸比、 PAG/ (PAG+馬尿酸)比が顕著に増大した （表 2 ) 。 一方、 PLsis非誘発性化合物投 与群においては、 高用量投与によっても非投与群との間に有意な差は認められな かった （表 3 ) 。 クレアチュン量で校正した場合、 PAG量は PLsis誘発性化合物 の高用量投与により中用量投与よりむしろ減少する場合があるが （例えば、 フル ォキセチン参照） 、 PAG/馬尿酸比、 PAG/ (PAG+馬尿酸）比を指標とすると高用量 投与の方がより高値を示し、 PLsis発現の程度をより的確に反映することがわか る。 高用量投与群では一般状態の悪ィ匕により摂餌量が減少し、 クリアランス経路 に流入する Phe量自体が減少しているため、 PAG量の変化を単独の指標とした場 合、 予測の確度が低下する可能性があるのに対し、 PAG/馬尿酸比を指標とした 場合、 Phe摂取量の変化に影響を受けず、 また PAG/ (PAG+馬尿酸)比を指標とした 場合、 （PAG+馬尿酸） 量が Phe摂取量を反映するので、 被験動物の摂餌状態に関 係なく正確な判定が可能である。
また、 PAG/馬尿酸比、 PAG/ (PAG+馬尿酸）比を指標とすると、 クロルプロマジ ンについても高用量投与群では顕著な増加が認められ、 この方法を用いれば、 3 日間投与で PLsis誘発性の有無を迅速に判定することが可能であることがわかつ た。 実施例 3 (参考例 2 )
PLsis/steatosis誘発性化合物投与サルにおける病理組織学的検査および末梢血 リンパ球検査
以下の 2種の市販薬を試験化合物として、 PLsis/steatosis誘発性の有無を病 理組織学的検査およぴ末梢血リンパ球検査により調べた。 アミオダロンおよぴぺ ルへキシリンは SIGMA社より購入した。
3〜 5年齢の力二クイザル （シコンブレック、 日本野生動物研究所、 ナフォパ ニー） 雄 7例を入手し、 約 1週間馴化飼育した。 その間に検疫を実施するととも に一般状態の観察及び体重測定を行った。 その後対照群 2例、 各投薬群 1群雄各 1例からなる 4群 （計 5例） に振り分けた。
動物はサル用金網底の金属製ケージに個別に収容し、 各ケージは水洗式ラック に群間で無作為に配置した。 動物室の環境条件は室温 20〜26で、 相対湿度 40〜 70%、 新鮮空気の換気回数 8 ~25回/時間とし、 照明時間は 12時間/日 （点灯時 間：午前 7時〜午後 7時） とした。 動物には γ線照射した固形飼料 （Certified Primate Diet #5048, PMI Feeds Inc. ) を与え、 水道水とともに自由に摂取さ せた。
各被検物質に分散媒 /媒体を加えて撹拌し、 高用量を調製した。 高用量投与液 を分散媒 /溶媒で希釈して低用量投与液を調製した。 各被検物質の用量は以下の 通りに設定した。
ァミオダ口ン： 60及ぴ 300 mg/kg/日
理由： ヒトでの臨床投与量の約 10倍及ぴ 50倍とした。
ペルへキシリン： 60 mg/kg/日
理由： ヒトでの臨床量の 10倍とした。
対照群： 0. 5 w/v%メチルセルロース溶液
投与液量 5 mL/kg/日を 1日 1回、 7日間強制経口投与した。
投与終了後、 すべての動物について肝臓、 腎臓、 心臓、 脾臓、 肺および腸間膜 リンパ節、 眼球、 精巣及び脳を採取し、 常法により光学顕微鏡で病理組織学的変 化を調べた。 また、 投薬前期間、 投与初日、 投薬 2及び 6曰に採血し、 血液塗抹 標本を作製し、 空胞化リンパ球率の測定を実施した。
PLsis/steatosis誘発性ィヒ合物投与群における病理組織学的変化および空胞化 リンパ球率の結果を表 4に示す。 了ミオダ口ンの 300 mg/kg及びペルへキシリン の 60 mg/kg群では空胞化リンパ球率の増加おょぴいずれかの標的器官における 病理組織学的変化が認められた。 ア ミ オダロ ンの 60 mg/kgでは、 PLsis/steatosisの誘発はみら れなかっ た。 対照群においては、 PLsis/steatosisなどの脂質代謝異常症を示す病理組織像は観察されなかった。 表 4
Figure imgf000031_0002
一：異常なし、 † ：高値、 1 ：低値、 PAG : フエニルァセチルグルタミン
10： 0. 5
Figure imgf000031_0001
実施例 4
PLsis/steatosis誘発による尿中 PAGN/馬尿酸比の変動
実施例サルの投薬前期間 （Pre) 、 投与初日 （Day 0) 、 投薬 2及ぴ 6 Θ (Day 2， 6) の約 6時間絶食下の蓄尿を採取した。 採尿後、 1500 X g、 10分間遠心し、 上清 1 mL以上をマイクロチューブに分取後、 超低温フリ一ザ一にて測定まで凍結保 存 （- 70°C以下） した。
MRは以下のように実施した。 試薬類は精製をせずに使用した。 重水 (D20) は ISOTEC. INC (USA) より、 NaH2P04 · 2H20, Na2HP04 · 12H20は関東化学 (東京) から購入した。 Sodium 3- (trimethylsilyl) - propionate— 2, 2， 3， 3, - (TSP) は ISOTEC. INC (USA) から購入した。 MRスぺク トルの測定は Unity INOVA600 (Varian) 共鳴周波数 599. 59 MHz) を使用した。
リン酸緩衝液は以下のように調製した。 Na¾P04 · 2H20および Na2HP04 · 12H20を 使用して、 各々約 0. 2mol /L Na P04溶液おょぴ約 0. 2mol/L Na2HP04溶液を調製し た後、 両液を混合し、 pHメータを用いて約 pH 7. 4に調整した。
内部標準溶液として、 TSPを 11 mmol/Lの濃度となるように重水中に溶解させ た。
尿試料 500 /z Lをエツペンドルフチューブに採取し、 上記リン酸緩衝液 250 し を添加して約 10分間室温で放置した後、 約 10°C、 13000rPmで約 10分間遠心分離 し、 上清を約 600 L採取して NMR試料管に移した。 さらに NMR試料管に TSP重水溶 液を約 60 し添加した。
核磁気共鳴装置は、 MR測定が行えるよう1 H核の測定が行えるプローブをあ らかじめセットし、 25°Cに設定した。 上記の MR試料管を分光計にセットし、 温 度が安定するまで約 10分放置した後、 分解能、 チューニング、 90° パルスの測 定、 観測中心を水シグナ^^に合わせる等、 ハードウェア側の設定やパラメータを 準備した。 測定条件は以下のようにセットした。
seqf i l (ノヽノレス糸歹 !J) ： tnnoesy, sspul (.steady state pulse) ： n 才フ) ， ss (プレスキャン) ： 8回， mix (混合時間） ： 100msec, sw (観測幅） ： 8000Hz， np (複合ポイント数） ： 65536ポイント， dl (待ち時間） ： 4· 904sec， satpwr (照射パワー） ： 10db, satdly (照射時間） ： 1 sec, 積算回数： 64回
測定データを保存した後、 以下の条件でフーリエ変換を行った。 ポイント数： 65536ポィント， ウィンドウ関数： exponent ial window function lb=0. 2Hz 位相調整、 TSPのメチノレシグナルを Oppmとして基準の設定等を行った。
ACD/SpecManager (ACD Labs, Canada) を使用し、 ベースライン補正後、 PAGN については 7. 42ppm (t, 8. OHz) 馬尿酸については 7. 55ppm (t， 8. 0Hz)のシグ ナルの積分値から両者の比 （PAGN/馬尿酸比） を計算した。 その結果を表 4に示 す。 PLsis/steatosis誘発動物 （アミオダロン； 300 mg/kg， ペルへキシリン； 60 mg/kg投与動物） では、 対照群と比較して PAGN/馬尿酸比が増大した （表 4 ) 。 一方、 PLsis/steatosis非誘発動物 （アミオダロン； 60 mg/kg投与動物） では、 対照群と比較して PAGN/馬尿酸比に有意な差は認められなかった （表 4 ) 。
尚、 PLsis/steatosis誘発動物では、 対照群と比較して馬尿酸と PAGNの総排泄 量が減少していた。 これは、 薬物投与により摂餌量が対照群に比べて顕著に減少 したことにより Tyr合成に利用されない余剰の Phe量自体が減少したためである と考えられた。 しかしながら、 PAGN量の減少率に比して馬尿酸量の減少率がき わめて顕著であったため、 PAGN/馬尿酸比を指標と した場合には、 PLsis/steatosis誘発化合物を正しく判定することができた。 この結果は、 PAG もしくは PAGNの増加のみを指標とする従来の PLsis/steatosis予測方法に対する 本発明の優位性を実証するものであるといえる。 実施例 5
( 1 ) 抗 PAGN抗体、 抗馬尿酸抗体の調製
PAGNを米国特許第 5, 100, 807号明細書の実施例 1の方法に従って調製する。 馬 尿酸は SIGMA社より購入する。 同特許明細書の実施例 2に記載の方法に準じて PAGN-ゥシ血清アルブミン （BSA) コンジュゲートおょぴ馬尿酸- BSAコンジュゲ ートを作製する。 得られたコンジュゲートを等量の完全フロイントアジュパント (FCA) と混和した後、 雌性ゥサギ （3本白色種、 体重 2. 7〜2. 8kg) に皮内投与 する。 3週間間隔で追加免疫を行い、 最終免疫の 1週間後にネンブタール麻酔下、 頸動脈より全血を採取し、 室温で 2. 5時間保温後、 2000 X g (4000 rpm)で 10分間 遠心して抗血清を得る。 血清に硫酸ナトリゥムを少量ずつ添加して溶解させ後、 遠心分離して沈殿を回収し、 リン酸緩衝液 （pH6. 3) に溶解後、 同緩衝液に対し て 4 Cで 5時間透析した後、 透析外液を交換してさらに一夜透析する。 上清を同 緩衝液で平衡化した DE52-セルロースカラムのクロマトグラフィ一に付し、 IgG 画分を得る。 各 IgGを固相化した後、 PAGNまたは馬尿酸と常法により調製した HRP標識 PAGN (馬尿酸） とを競合的に反応させてペルォキシダーゼ活性を測定し、 両抗体とも交叉反応性を示さないことを確認する。
( 2 ) PAGN, '轉尿酸の検出
上記 （ 1 ) で得られたゥサギ抗 PAGN IgGおよぴゥサギ抗馬尿酸 IgGの BSA含有 PBS溶液、 実施例 4で採取した尿試料、 並びに常法により調製したフルォレセィ ン標識 PAGNおよぴピレン標識馬尿酸をチューブに加えて 60分間反応させた後、 Full-Range BEACON (登録商標） 2000を用いて、 フルォレセインの蛍光を励起波 長： 490 nm、 光波長： 520 nmで、 ピレンの蛍光を励起波長： 350 nm、 蛍光波 長： 390 nmでそれぞれ測定する。 予め PAGNおよび馬尿酸の標準溶液を用いて作 成した検量線カゝら尿試料中の PAGNおよぴ馬尿酸量をそれぞれ算出する。 実施例 6
PLs i s誘発化合物投与による尿中馬尿酸おょぴ PAG濃度の LC - MS/MSによる測定 実施例 1にお \ /、て病理組織学的変化の認められたアミオダロン、 イミプラミン、 タモキシフェンおょぴキナクリンを試験化合物として、 高速液体クロマトグラフ ィー /3連四重極型質量分析計 (LC- MS/MS)を用いた定量法によりラット尿中馬尿 酸およぴ PAG濃度を測定した。
5週齢の Crj : CD (SD) IGSラット （日本チャールズリパー株式会社、 閉鎖環境下 生産） 雄 100例 （2004年 11月 16日 ；試験番号 34 - 351/su) を入手し、 約 1週間馴化 飼育した。 その間に検疫を実施するとともに一般状態の観察及び体重測定を行つ た。 異常の認められなかった動物を選択し、 採尿用として 1群雄各 4例からなる
5群に無作為に群分けした。
動物は金網底の金属製ケージに個別に収容し、 各ケージはクリーンブース内に 設置した水洗式ラックに群間で無作為に配置した。 動物室の環境条件は室温 20
〜26°C、 相対湿度 40〜70%、 新鮮空気の換気回数 8〜25回/時間とし、 照明時間 は 12時間/日 （点灯時間：午前 7時〜午後 7時） とした。 動物には γ線照射した粉 末飼料 （CR - LPF、 オリエンタル酵母） を与え、 水道水とともに自由に摂取させ た。
各被検物質に分散媒 /媒体を加えて撹拌し、投与液を調製した。 各被検物質の 用量は以下の通りに設定した。
ァミオダ口ン： 300 mg/kg/日
イミプラミン： 100 mg/kg/日
タモキシフェン： 100 mg/kg/日
キナクリン： 60 mg/kg/日
対照群： 0. 5 w/v°/。メチルセル口ース溶液
投与液量 10 mL/kg/ 3を 1日 1回、 7日間強制経口投与により投与した。
投与終了後、 すべての動物について約 6時間の絶食、 絶水下の蓄尿を氷冷採取 した。
採尿後、 1500 X g、 10分間遠心し、 上清を 1 mL以上採取してマイクロチュー プで低温フリーザーにて測定まで凍結保存 （- 15°C以下） した。
LC- MS/MSによるラット尿中馬尿酸、 PAGの定量分析は以下のようにして実施し た。 標準物質として使用した馬尿酸（Lot No. PKE1876、 含量 99. 8%)および PAG (Lot No. PKG7583、 含量 99. 4%)は和光純薬より、馬尿酸- d5 (Lot No. H63P3、 d5化率 99. 3%)は CDN isotopesより、 PAG- d4 (Lot No. B18607- 060- 17、 d4化率 100. 0%)はインハウスで合成したものをそれぞれ入手した。 ァセトニトリル、蟻 酸アンモニゥム、蟻酸、酢酸アンモユウムおよびメタノールはいずれも和光純薬 より入手した。
HPLCシステムは LC- 10AD システム（島津製作所）を、 MS/MSシステムは API3000 (AB/MDS SCIEX)を使用した。
尿試料または QC試料 20 /i Lに 50%ァセトニトリルを 20 L、馬尿酸 - d5および PAG- d5の 50%ァセトニトリル溶液（内部標準液， I. S. )を 10 /^ Lおよび 50%ァセト -トリル 1 mLを添加し、 5秒間攪拌した後、室温で 13000 rpm、 5分間遠心分離した。 遠心上清 20 しを採取し、11?し(移動相（^) : (8) =95 : 5、 ）を1 mL加え、 10秒間撩 拌した試料溶液を LC/MS/MS分析に供した。
また 10 腿 ol/L酢酸アンモニゥム水溶液 20 Lに馬尿酸， PAG希釈標準 20 μ ΐ および内部標準液 10 /^ Lを加えて同様に処理した試料を標準検量線用試料とし た。 馬尿酸おょぴ PAGの標準検量線用試料は以下の終濃度となるように調製した。 馬尿酸： 5000、 4000、 2000、 1000、 500、 200、 100及ぴ 50 ^ g/mL、 PAG濃度： 1000、 500、 400、 200、 100、 50、 20、 10及ぴ 5 i g/mL。
QC試料は、標準検量線を用いてラットコント口ール尿の内因性成分である馬尿 酸及ぴ PAG濃度を測定し、 本試料に馬尿酸、 PAG希釈標準溶液を添加して QC- Hおよ ぴ QC- Mを調製した。 また QC- Hを 10 膽 ol/L酢酸アンモニゥム水溶液で 20倍に希釈 し、 QC- Lを調製した。
HPLCによるクロマト分離には分離力ラムとして L - Column 0DS (粒子径； 5 μ m、 内径； 2. 1 mm, 長さ ； 50 膽、化学物質検査機構）を用い、グラジェントモードで 実施した。 移動相（A)には 10 膽 ol/L蟻酸アンモニゥム /蟻酸 （500: 1、 v/v)を、移 動相（B)にはァセトニトリル/蟻酸 (500 : 1、 v/v)を用い、流速 0. 2 mL/min.で送液 した。 グラジェントプログラムは移動相 (B)濃度を 0分 (分析開始時) 5%から 3分間 で 60%、その後 3. 2分までに 80%まで直線的に上昇させた。 その後 5分まで 80%で送 液し、 5. 1分後に 5%まで低下させ、分析終了時間（10分）まで同条件で送液させた。 なお、スィツチングパルプを用い、分析時間 3. 0 - 4. 5分の溶出液を MS/MSに導入さ せた。 カラム温度は 40°C、サンプル注入量は 10 Lで分析を実施した。
MS/MS分析はイオン化モードとしてターボイオンスプレーを用い、陽イオンモ ードでの selected reaction monitoring (SRM)によりイオンを検出した。 イオン スプレーにはゼロエアーを用い、電圧は 4. 2 kVで実施した。 イオンの衝突誘起分 解には窒素を用いた。 モニターイオンとしてプリカーサ一イオン、フラグメント イオンをそれぞれ馬尿酸； 180 Da→105 Da, PAG； 194 Da→91 Da、馬尿酸 d- 5； 185 Da→110 Da、PAG- d4； 198 Da→93Daに設定した。
馬尿酸おょぴ PAGとそれぞれの I. S.とのピーク面積比を用い、標準検量線の回 帰式（1/濃度の重み付け）から各試料の馬尿酸おょぴ PAGの濃度を算出した。 その 結果を表 5に示す。
表 5
化合物 馬尿酸1)，2) PAG1)'2) PAGん毒尿酸比 1〉 iン卜口ール 1401. 3±729. 4 92. 5+ 46. 6 0. 0709±0. 0334 アミオダロン 894. 9 ± 144. 2 765. 9±301. 6 0. 8850±0. 4434 イミプラミン 888· 9±249. 2 291. 9土 75. 7 0. 3385±0. 0977 タモキシフェン 800. 3±483. 2 292. 6± 178. 1 0. 5169±0. 5311 キナクリン 869. 3 ±240. 8 188. 0+ 78. 1 0. 2178±0. 0919
1〉平均値土 SD (n=4)
2)単位： /i g/mL コントローノレ群と比較してアミオダロン、 イミプラミン、 タモキシフェン、 キ ナクリン投与群の PAG/馬尿酸濃度比は増大した（表 5 )。 また馬尿酸および PAGの 尿中濃度の増減についても正確に評価することが出来た。 本分析法は 1分析あた りの時間が 10分と短時間での分析が可能であり、かつ尿中の馬尿酸、 PAGの絶対濃 度が評価できるため、 Plsis/steatosis予測法における、 PLsis誘発性の有無を迅 速に判定することが可能であることがわかった。
産業上の利用可能性
本発明の予測方法は、 薬物による脂質代謝異常症の高確度且つ高感度な予測が 可能であり、 また、 長期間投与でなければ病理組織学的変化が顕在化しない化合 物についても短期間投与で陽性判定が可能であることから、 開発初期段階で迅速 に毒性化合物を峻別し、 リ一ド化合物の選択を効率化するスクリ一二ング手段と して有用である。 さらに、 本発明の予測 ·診断方法は、 尿や血漿などの末梢体液を試料とすれば 非侵襲的な診断が可能となることから、 脂質代謝異常症およびその関連疾患の臨 床診断においてきわめて有用である。 本出願は、 日本で出願された特願 2003— 434151 (出願日 ： 2003 年 12月 26日） およぴ特願 2004-168849 (出願日 ： 2004年 6月 7日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲
1 . 化合物による脂質代謝異常症の予測方法であって、
( 1 ) 化合物を投与された哺乳動物より採取した試料または化合物に曝露された 哺乳動物細胞もしくは組織培養物中の（a)フエ二ルァセチルダリシンおよび/も しくはフエニノレアセチルグルタミン、 またはフエ二ルァラニンからフエ二ルァセ チルダリシンもしくはフエ二ルァセチルダルタミンに至る代謝経路における任意 の代謝中間体と、 （b)馬尿酸またはフエ二ルァラニンから馬尿酸に至る代謝経路 における任意の代謝中間体とを検出し、
( 2 ) 両者の量比を指標として該化合物の脂質代謝異常症誘発性を予測すること を特徴とする方法。
2 . フエ二ルァセチルダリシンおょぴ Zもしくはフエニルァセチルグルタミンと 馬尿酸との量比を指標とする請求の範囲 1記載の方法。
3 . 試料が尿、 血清または血漿である請求の範囲 1記載の方法。
4 . 細胞もしくは組織が肝臓、 腎臓または肺由来のもの、 あるいはリンパ球であ る請求の範囲 1記載の方法。
5 . 脂質代謝異常症がリン脂質症、 脂肪症およびスフインゴミエリン蓄積症から なる群より選択される 1以上の病態として発現するものである請求の範囲 1記載 の方法。
6 . 哺乳動物における脂質代謝異常症またはその関連疾患の診断方法であって、 ( 1 ) 哺乳動物より採取した試料中の（a)フエ-ルァセチルダリシンおよぴノも しくはフエュルァセチルダルタミン、 またはフエ二ルァラニンからフエ二ルァセ チルダリシンもしくはフエ二ルァセチルダルタミンに至る代謝経路における任意 の代謝中間体と、 （b)馬尿酸またはフエニルァラ二ンから馬尿酸に至る代謝経路 における任意の代謝中間体とを検出し、
( 2 ) 両者の量比を指標として診断を行うことを特徴とする方法。
7 . フエ二ルァセチルダリシンおょぴ もしくはフエ二ルァセチルダルタミンと 馬尿酸との量比を指標とする請求の範囲 6記載の方法。
8 . 試料が尿、 血清または血漿である請求の範囲 6記載の方法。
9 . 脂質代謝異常症が遺伝性リビドーシス、 薬物起因性リビドーシスまたは脂肪 酸代謝ホメォスタシス異常である請求の範囲 6記載の方法。
1 0 . 疾患が高脂血症、 粥状硬化症、 動脈硬化、 心筋梗塞、 脂肪肝、 肝炎、 肝硬 変、 糖尿病、 痴呆症、 アルツハイマー病、 心臓病おょぴ慢性疲労症候群からなる 群より選択される請求の範囲 6記載の方法。
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