KR101791153B1 - 급성 관상동맥 증후군 질환 진단용 다중 생체 대사체 플랫폼 - Google Patents

급성 관상동맥 증후군 질환 진단용 다중 생체 대사체 플랫폼 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 생체 대사체를 바이오 마커로 이용한 멀티-생체 대사체 플랫폼을 제공함으로써 체내 레벨 분석을 통해 급성 관상동맥 질환 및 그 발명 이전 징후까지 단계별로 간단하고 정확하게 진단할 수 있다.

Description

급성 관상동맥 증후군 질환 진단용 다중 생체 대사체 플랫폼{Multi-metabolites platform for diagnosis of acute coronary syndrome}
본 명세서 기재된 내용은 급성 관상동맥 증후군을 진단할 수 있는 다중 대사체 바이오마커 플랫폼에 관한 것이다.
심혈관 질환은 세계적으로 최고 사망률을 기록하고 있는데, 한국 통계청의 발표에 의하면 2012년 이후로 심혈관 질환에 의한 사망 환자가 뇌혈관 질환에 의한 사망 환자를 뛰어넘었다고 한다. 그 중 급성 관상동맥 증후군(acute coronary syndrome, ACS)은 급성 심근경색증(acute myocardial infarction, AMI)과 불안정 협심증(unstable angina)을 포함하는 질병으로 흉통을 호소하며 응급실을 방문하는 환자들의 대부분을 차지하고 있다. 급성 관상동맥 증후군은 관상동맥 혈류가 막혀서 심장 근육에 산소공급의 불균형이 일어나 비가역적인 심장 근육 세포 손상이 발생하는 것이 특징이다. 특히 높은 치사율과 사망률을 가지는 급성 심근경색은 급성 관상동맥 증후군의 30%를 차지하며 성인 돌연사 원인 1위를 차지하는 치명적인 질환으로 계속 증가하는 추세에 있다. 불안정형 협심증의 경우에는 병변의 크기가 작더라도 동맥경화반이 파열될 확률이 높기 때문에 매우 위험하지만 흉통과 같은 증상만으로 예측 진단하기 어려우며, 급성 심근경색이나 심하게는 심정지로 쉽게 발전할 가능성이 있다.
그러나 흉통을 호소하며 응급실을 찾은 불안정형 협심증 환자 또는 무증상 불안정형 협심증 환자의 경우 급성 심근경색으로의 발전 가능성을 예측하기 매우 어렵다. 그래서 실제 임상 상황에서 병원에 내원한 불안정형 협심증 환자를 급성 심근경색 발발의 가능성 때문에 입원시켜 경과를 지켜볼 것인지 주치의가 명확하게 판단하기 어려운 실정이다. 따라서 심근경색의 조기 진단과 마찬가지로 심근경색의 이전 단계인 불안정형 협심증의 변화를 예측할 수 있는 바이오마커 개발이 시급하다.
현재 심혈관 질환이나 심부전의 진단으로 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), LDH(lactate dehydrogenase), CK-MB(creatine kinase-MB), 트로포닌(troponin) I, 트로포닌 T, CRP(C-reative protein) 및 BNP(B-type natriuretic peptide)가 바이오마커로 사용되고 있지만, 이것들은 심근경색 또는 불안정형 협심증에 특이적인 바이오 마커가 아니다. 특히 트로포닌 단백질은 심장 근육 세포의 괴사(necrosis)가 발생한 경우에 나타나는 마커로 심근경색 진단에 사용되기는 하나, 조기 진단이 어렵고, 불안정형 협심증에서 심근경색으로 가는 질병 심화 단계에 따른 단계별 진단이 불가능하다.
또한 불안정형 협심증에서 자주 나타나는 취약성 경화반(vulnerable plaque)의 진단은 종래 혈관 내 심초음파방법(intravascular ultrasound, IVUS)을 이용하는 등의 침습적 방법으로만 이루어졌으며, 현재까지 혈액에서 분석되는 저분자 대사체 물질에 의한 진단 방법은 응용된 바 없다.
따라서 간단한 검사를 통해 빠르고 정확하게 급성 심근경색 및 불안정형 협심증과 그 위험요소를 조기에 파악할 수 있는 급성 심근경색 및 불안정형 협심증에 특이적인 생체 대사체 및 이를 임상 진단 결정에 활용할 수 있는 플랫폼 개발이 요구된다.
미국 특허공개번호 제2013-0345581호(2013.12.26. 공개)
일 측면에서, 본 발명의 목적은 급성 관상동맥 질환에 특이적인 생체 대사체를 바이오 마커로서 제공하고자 한다. 또한, 상기 생체 대사체들의 체내 레벨을 분석하여 급성 관상동맥 질환의 단계별 진단을 위한 멀티-바이오마커 플랫폼을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에서 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 급성 관상동맥 질환 (acute coronary syndrome) 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 일 측면에서 본 발명은 상기 진단용 조성물에, 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 더 포함하는 급성 관상동맥 질환 진단용 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체의 체내 레벨 측정부를 포함하는 급성 관상동맥 질환(acute coronary syndrome) 진단용 키트를 제공한다.
또한, 일 측면에서, 본 발명은 상기 진단용 키트에, 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체의 체내 레벨 측정부를 더 포함하는 급성 관상동맥 질환 진단용 키트를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 생체 시료로부터 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계; 및 상기 단계에서 측정한 생체 대사체의 레벨을 정상 대조군의 레벨과 비교하는 단계를 포함하는 급성 관상동맥 질환(acute coronary syndrome) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 일 측면에서, 본 발명은 상기 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계에, 생체 시료로부터 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계를 더 포함하는 급성 관상동맥 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 아미노산(amino acid) 또는 지질(lipid)과 같은 생체내 대사체들을 바이오 마커로서 사용하므로 체내로부터 쉽게 측정하고 분석할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 생체 대사체들은 대상자가 심근경색 및 협심증과 같은 관상동맥 질환을 갖는 경우 체내, 예를 들면 혈중 농도가 특이적으로 증가 또는 감소하므로, 그 체내 레벨을 비교, 분석하여 간단하면서도 정확하게 관상동맥 질환을 진단할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 단일 바이오 마커로 질병을 진단하던 기존의 진단법과는 달리 서로 다른 16종의 생체 대사체를 이용한 다변량 분석(multivariate analysis)을 통해 서로 다른 대사 경로를 가진 생체 대사체들의 체내 레벨 변화를 전체적으로 파악하고 이를 하나의 진단 플랫폼에 적용함으로써, 기존의 진단법에 비해 민감도, 특이성, 정확도가 우수하여 더 정확하게 진단할 수 있다.
이를 통해 기존의 바이오 마커가 심근 세포 괴사에 따른 심근경색 여부만 진단할 수 있었던 것과 달리, 본 발명은 급성 심근경색뿐만 아니라 심근경색 발병 이전 징후인 불안정형 협심증까지 단계별로 진단할 수 있으므로, 심근경색의 발병 이전부터 단계별로 조기 진단에 유용하다. 따라서, 본 발명에 따른 멀티-생체 대사체 마커 진단 플랫폼을 이용하면 간단한 검사만으로 급성 심근경색 및 불안정형 협심증의 예후를 예측 및 진단하고, 치료효과, 질병 예방 성공 여부까지 판단할 수 있다.
도 1은 정상인 대조군 및 심근경색 환자군, 불안정형 협심증 환자군의 혈청의 생체 대사체를 분석한 결과를 바탕으로, 부분최소제곱판별 분석 (partial least square-discriminant analysis; PLS-DA) 방법을 이용해 다변량 통계분석(multivariate analysis)한 결과를 나타낸 도이다. 그룹별 클러스터를 3차원 스코어 플럿(score plot)으로 표현했다.
도 2 내지 도 4는 실시예 1에 따른 생체 대사체인 라이소PC(16:0)의 혈중 상대적 양을 비교 데이터를 활용하여 정상인 대조군과 불안정형 협심증 및 심근경색 환자군을 진단할 수 있는 단변량 수신자판단특성(receiver operating characteristics, ROC) 곡선을 나타낸 도이다. 도 2는 정상인 대조군에서 급성 심근경색을 진단할 때, 도 3은 정상인 대조군에서 불안정형 협심증을 진단할 때, 도 4는 불안정형 협심증과 급성 심근경색 환자군을 분리 진단할 때의 곡선을 가리킨다. 각 도에 표시된 AUC(area under the ROC curve)값은 정확도에 상응하는 의미의 값이며, 각각 민감도, 특이성, 정확도를 계산하여 표시하였다.
도 5 내지 도 7은 실시예 1에 따른 16종의 다중 대사체를 활용한 다변량 ROC 곡선을 나타낸 것으로, 정상인 대조군과 불안정형 협심증 및 심근경색 환자군의 혈중 상대적 양을 비교하여 진단할 수 있는 다변량 ROC 모델을 최적화하여 나타낸 도이다. 도 5는 정상인 대조군에서 급성 심근경색을 진단할 때, 도 6은 정상인 대조군에서 불안정형 협심증을 진단할 때, 도 7은 불안정형 협심증과 급성 심근경색 환자군을 분리 진단할 때의 곡선을 가리킨다. 각 도에 표시된 AUC값은 정확도에 상응하는 의미의 값이며, 각각 민감도, 특이성, 정확도를 계산하여 표시하였다.
도 8은 실시예 2에 따른 것이며 상기 도 1의 결과를 실험예 2의 다른 실험 참가자 군에서 재확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9 내지 도 11은 실시예 2에 따른 것이며 상기 도 2 내지 도 4의 각 결과를 실시예 2의 다른 실험 참가자 군에서 재확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12 내지도 도 14는 실시예 2에 따른 것이며 상기 도 5 내지 도 7의 각 결과를 실시예 2의 다른 실험 참가자 군에서 재확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 명세서에서 "레벨(level)"은 생체 대사체의 체내 수준 또는 생체 시료내 수준을 의미하는 것으로, 혈액 등의 대상자의 체내 또는 생체 시료에 포함된 생체 대사체의 농도, 질량 등 객관적인 수치 및 해당 물질의 타 물질에 대한 상대량을 모두 포함하는 최광의의 의미이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체를 포함하는 급성 관상동맥 질환 진단용 바이오 마커를 제공한다. 본 발명의 일 측면에 따른 상기 생체 대사체들은 심혈관 질환 중 급성 관상동맥 질환의 유무뿐만 아니라, 급성 관상동맥 질환 발병 위험요소를 가진 불안정형 협심증 및 무증상 불안정형 협심증까지 단계적인 진단이 가능하다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 생체 대사체들은 상기 질환에 한정되지 않고 심혈관계 질환이라면 모두 포함할 수 있다.
이에, 본 발명의 일 측면은 트립토판, 호모세린, 포스파티딜콜린(PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체의 체내 레벨(level) 측정부를 포함하는 급성 관상동맥 질환(acute coronary syndrome) 진단 플랫폼을 제공하며, 상기 플랫폼은 급성 관상동맥 질환 진단용 키트를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 상기 진단용 키트는 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체의 체내 레벨 측정부를 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 진단용 키트는 트립토판, 호모세린, 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 포스파티딜콜린(PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(16:0), 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 3종 이상, 6종 이상, 10종 이상, 12종 이상 또는 14종 이상의 생체 대사체의 체내 레벨을 측정하는 다중 생체 대사체 측정부를 포함할 수 있다. 또는, 상기 16종을 포함하는 생체 대사체의 체내 레벨을 측정하는 다중 생체 대사체 측정부를 포함할 수 있다.
일 측면에 따른 상기 생체 대사체 중 트립토판(tryptophan) 및 호모세린(homoserine)은 아미노산의 일종으로 체내에서는 L형으로 주로 존재한다. 특히 트립토판은 필수 아미노산의 하나로 체내 생체 대사에 중요한 역할을 하는 물질이다.
일 측면에 따른 상기 생체 대사체 중 PC(34:3), 라이소PC(16:0), 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4) 및 라이소PC(22:6)는 PC(phosphatidylcholine, 포스파티딜콜린) 및 라이소PC라는 세포막, 혈액 등에 존재하는 지질 대사 경로의 대사체 중 인지질 대사체의 일종이다. 그 중 PC는 화학식 1에 나타난 바와 같이 포스포콜린(phosphocholine) 그룹에 R’과 R”의 두 개의 지방산이 결합해 있는 것을 의미한다. 라이소PC(LysoPC)는 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)의 약어로서 PC는 포스파티딜콜린을 의미하며, PC에서 두 개 중 한 개의 지방산이 떨어져 나가 한 개의 지방산(하기 화학식 1의 R’만이 결합하고 있는 구조를 기본 구조로 가지고 있다. 상기 PC(34:3), 라이소PC(16:0), 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4) 및 라이소PC(22:6)는 탄소사슬 내 탄소수: 탄소사슬 내 이중결합의 수가 각각 34:3, 16:0, 18:0, 20:3, 20:4 및 22:6으로 존재하는 PC 또는 라이소PC를 의미하며, 이 수치에 따라 급성 관상동맥 질환 환자에게서 나타나는 체내 수준의 변화가 각각 다르게 나타난다.
Figure 112015037735409-pat00001
지방산(fatty acid, FA)은 1개의 카복시기(-COOH)를 가지는 탄화수소 사슬의 1가 카복실산을 의미하며, 생체 내 지방산회로에 의해서 분해되거나 합성된다. 라이소PC의 경우와 마찬가지로 탄화수소 사슬 내 탄소의 수: 탄화수소 사슬 내 이중결합 수로 표현된다. 상기 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)은 탄소사슬 내 탄소수: 탄소사슬 내에 이중결합의 수가 각각 16:1, 18:0, 18:1, 18:2 및 22:6으로 존재하는 지방산으로, 각각 팔미테레이드산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 도코사헥사에노산으로 불린다.
모노글리세라이드(monoglyceride, MG)는 글리세롤에서 유래된 대사체로 하기 화학식 2와 같이 글리세롤 구조에 R1 지방산이 한 개 결합된 구조를 나타내고 있다.
Figure 112015037735409-pat00002
스핑고마이엘린(sphingomyelin, SM)은 인지질 대사체의 일종으로, 상기 PC계열의 대사체와 비교했을 때 화학식 3과 같이 구조 상 아민 그룹이 추가되는 차이점이 있고 R’과 R”의 두 개 지방산이 존재하는 유사점이 있다.
Figure 112015037735409-pat00003
일 측면에서 상기 급성 관상동맥 질환은 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 및 상기 급성 심근경색 발생 이전 증상인 불안정형 협심증(unstable angina) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체적으로 16 종 생체 대사체는 각각 정상 대조군과 대비하여 급성 심근경색 환자와 불안정 협심증 환자의 체내 레벨 변화가 각각 다르게 나타날 수 있다. 또한, 상기 16종의 생체 대사체 간에도 동일 대상자의 체내 레벨 변화가 각각 다르게 나타날 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 생체 대사체의 체내 레벨 측정부는 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 등의 체내에서 상기 16종 생체 대사체 중 하나 이상을 검출할 수 있는 물질 또는 검출장치 등을 포함할 수 있으며, 질량분석기, 핵자기공명(Nuclear magnetic resonance, NMR)이나 분광광도계(Photodiode Array, PDA) 등 생체 대사체의 체내 레벨을 측정 또는 검출할 수 있는 것이면 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 일 측면은 상기 생체 대사체의 체내 레벨 측정부는 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 급성 관상동맥 질환 (acute coronary syndrome) 진단용 조성물을 포함할 수 있다.
일 측면에서 본 발명의 상기 진단용 조성물은 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에서, 상기 진단용 조성물은 트립토판, 호모세린, 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 포스파티딜콜린(PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(16:0), 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드 (18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 3종 이상, 6종 이상, 10종 이상, 12종 이상 또는 14종 이상의 다중 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 진단용 조성물은 상기 16종을 포함하는 다중 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 상기 진단용 조성물을 이용하여 상기 급성 관상동맥 질환은 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 및 상기 급성 심근경색 발생 이전 증상인 불안정형 협심증(unstable angina) 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 심혈관계 질환이라면 모두 포함할 수 있다. 나아가, 상기 다중 생체 대사체를 검출하는 물질을 모두 유효성분으로 포함하는 진단용 조성물은 상기 급성 관상동맥 질환 중 급성 심근경색 및 상기 급성 심근경색 발생 이전 증상인 불안정형 협심증을 단일 생체 대사체를 검출하는 물질을 포함하는 조성물보다 정확하게 판별할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 상기 진단용 키트는 일 측면에서 급성 관상동맥 질환 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함할 수 있다. 이때 상기 급성 관상동맥 질환은 심근경색 및 불안정형 협심증 중 하나 이상을 포함할 수 있으므로, 상기 지시서도 심근경색 및 불안정형 협심증 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 진단용 키트는 상기 질환에 한정되지 않고 심혈관계 질환(cardiovascular disease)의 진단이라면 상기 질환에 한정되지 않고 모두 활용될 수 있으므로, 상기 지시서는 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 죽상경화증(동맥경화증) 등의 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함할 수 있다.
일 측면에서, 상기 지시서는 상기 생체 대사체의 체내 레벨 측정부에 의해 측정된 대사체 중 트립토판, PC(34:3), 라이소PC(16:0) 및 라이소PC(18:0) 중 하나 이상의 체내 레벨이 정상 대조군보다 적으면 급성 관상동맥 질환이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수 있다. 또는, 상기 지시서는 호모세린, 지방산 (16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), PC(34:2), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0) 중 하나 이상의 체내 레벨이 정상 대조군보다 많으면 급성 관상동맥 질환이 있다고 진단하는 감별방법을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 생체 대사체들은 정상 대조군과 급성 관상동맥 질환 환자군, 구체적으로 급성 심근경색 환자군과 불안정형 협심증 환자군의 혈청을 분석하여 대사체학적 접근법으로 데이터를 해석하여 발굴한 것이다. 대사체학은 유전적 차이와 더불어 생리적 또는 환경적 조건의 변화에 의해 나타나는 체내 저분자량 대사체의 조성과 레벨을 분석하여 다양한 체내 생리적 변화의 원인을 규명하는 연구 분야이므로, 대사체학을 기반으로 생체 대사체를 선별함으로써 실험 대상의 관상동맥 질환의 발생에 따른 대사 경로의 변화를 효과적으로 분석할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따르면, 상기 진단용 키트는 상기 생체 대사체 측정부에서 측정된 생체 대사체들의 체내 레벨을 분석하는 다변량 분석(multivariate analysis) 시스템을 더 포함할 수 있다.
상기 다변량 분석 시스템은 급성 관상동맥 질환의 발병 또는 발병 가능성 여부에 따라 특이적으로 변화하는 상기 16종의 생체 대사체들 중 둘 이상의 체내 레벨 변화를 동시에 분석하는 통계적 시스템을 의미한다. 상기 다변량 분석은 급성 관상동맥 질환뿐만 아니라 이외 다른 특별한 질환이 없는 건강한 자들로 구성된 정상 대조군의 상기 생체 대사체의 체내 레벨 정보를 기초로 그 상대적인 체내 레벨 차이를 분석함으로써 수행될 수 있으나, 상기 16종의 생체 대사체들의 체내 레벨 변화에 따른 급성 관상동맥 질환의 발병여부를 감별할 수 있다면 이에 한정되지 않는다. 상기 다변량 분석은 한가지 생체 대사체 또는 바이오마커만을 분석하는 단변량 분석(univariate analysis)와 대비되는 개념으로서, 상기 16종의 생체 대사체들 중 둘 이상의 체내 레벨 변화를 동시에 분석하는 통계적 시스템이라면 모두 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 다변량 분석은 상기 16종의 생체 대사체들의 체내 레벨 변화를 모두 분석하는 통계적 시스템일 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 다변량 분석 시스템은 몬테-카를로스 밸리데이션(Monte-Carlos validation) 방법을 통해 반복적인 검증을 통해 상기 16종의 생체 대사체에 최적화된 다변량 ROC 곡선(multivariate ROC curve) 모델일 수 있다.
단일 바이오 마커를 이용하여 일반적인 단변량 분석 방법을 통해 급성 관상동맥 질환을 진단하면 충분한 민감도, 특이성, 정확도를 확보할 수 없어 급성 관상동맥 질환의 발전정도에 따른 정확한 단계별 진단을 내리는 것이 어렵다. 반면, 본 발명의 일 측면에 따른 상기 다변량 분석 시스템에 의해 상기 생체 대사체 측정부에서 측정된 생체 대사체들의 체내 레벨을 분석하면 민감도, 특이성 및 정확도가 모두 확보되므로 급성 심근경색 진단 뿐만 아니라 불안정형 협심증과 급성 심근경색까지 질환의 발전정도에 따라 단계별로 판별 및 진단하는데 활용될 수 있다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 생체 시료로부터 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계; 및 상기 단계에서 측정한 생체 대사체의 레벨을 정상 대조군의 레벨과 비교하는 단계를 포함하는 급성 관상동맥 질환(acute coronary syndrome) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계는, 생체 시료로부터 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계는, 트립토판, 호모세린, 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 포스파티딜콜린(PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(16:0), 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 3종 이상, 6종 이상, 10종 이상, 12종 이상, 14종 이상의 생체 대사체의 레벨을 측정하는 다중 생체 대사체 측정 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계는 상기 16종을 포함하는 다중 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일 측면에서, 상기 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계의 생체 시료는 인간 또는 인간을 제외한 동물로부터 채취한 시료일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 생체 시료는 인간 또는 인간을 제외한 동물로부터 채취한 혈액, 혈청, 혈장, 뇨 등을 포함할 수 있다. 상기 생체 대사체의 레벨은 생체 대사체의 혈액 내에 포함된 바이오 마커의 농도, 질량 등 객관적인 수치 및 해당 물질의 타 물질에 대한 상대량 등을 예로 들 수 있다. 또한, 상기 레벨을 측정하는 방법은 대상자의 혈액을 채취한 다음 이를 분석하여 상기 생체 대사체의 함량 또는 농도를 분석하는 것을 포함할 수 있다. 상기 채취 부위는 상기 혈액 이외에 조직, 뇨 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 측면에서, 상기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 생체 대사체의 레벨을 정상 대조군의 레벨과 비교하는 단계 이후, 상기 측정된 생체 대사체 중 트립토판, PC(34:3), 라이소PC(16:0) 및 라이소PC(18:0)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 레벨이 정상 대조군보다 낮은 경우 급성 관상동맥 질환이 있다고 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 생체 대사체의 레벨을 정상 대조군의 레벨과 비교하는 단계 이후, 상기 측정된 생체 대사체 중 호모세린, 지방산 (16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), PC(34:2), 모노글리세라이드(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0) 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 레벨이 정상 대조군보다 높으면, 급성 관상동맥 질환이 있다고 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또는, 상기 16종의 생체 대사체의 혈중 레벨을 동시 대비하여 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때 본 발명의 일 측면에서 정상 대조군은 특별한 질환없이 건강한 자의 집합을 의미한다.
일 측면에서, 상기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 다중 생체 대사체 측정 단계에서 측정된 생체 대사체들의 레벨을 다변량 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계를 통하여, 본 발명의 일 측면은 상기 급성 관상동맥 질환 중 급성 심근경색 및 상기 급성 심근경색 발생 이전 증상인 불안정형 협심증을 판별하기 위한 정보를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 측면에 따르면 상기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상술된 본 발명의 일 측면들에 따른 급성 관상동맥 질환 진단용 조성물 또는 키트를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
본 발명의 일 측면에 따른 16 종 생체 대사체인, 트립토판, 호모세린, 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), PC(34:2), PC(34:3), 라이소PC(16:0), 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0))의 급성 심근경색의 단계별 진단 바이오 마커로서의 기능을 확인하고 이를 멀티-생체 대사체 플랫폼으로 활용하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
1. 실험대상 선정
본 실험에서 실험 참가자로 심혈관 질환이 없는 정상 대조군과 급성 관상동맥 환자군인 불안정형 협심증과 급성 심근경색 환자들을 대한민국 서울에 소재한 고려대학교 구로병원에서 모집하였다. 급성 관상동맥 환자군은 남녀 불안정형 협심증 환자 23명, 심근경색 환자 42명으로 구성되었고, 정상 대조군은 건강한 남녀 40명으로 구성되었다. 환자군과 대조군의 나이를 동일한 조건인 45세 이상으로 제한하여 나이에 의해 발생될 수 있는 그룹간 차이를 최소화하여 데이터 해석 오류를 방지하고자 하였다. 환자군 및 대조군의 나이를 45세로 제한한 이유는 심근경색이나 협심증 질환과 같은 심혈관 질환은 보통 청년층 보다는 중년 및 노년층의 환자에서 주로 나타나고, 45세 이상에서 유의적 차이를 나타내기 때문이다.
2. 분석대상물질 혈청 시료의 제조
본 실험의 참가자인 환자군과 정상 대조군으로부터 정맥혈을 얻어 원심분리를 시행하여 혈청 시료를 각각 얻었다. 모든 혈청 시료는 분석 이전까지 -80℃에 보관하였다. 그리고 메탄올을 이용한 제단백 방법으로 상기 혈청 시료를 전처리 하였다. 구체적인 전처리 방법은 다음과 같다. 상온으로 녹인 혈청 시료에 3배 부피의 차가운 메탄올(ice-cold methanol)을 첨가하고 완전히 섞어 준 뒤 원심분리를 시행하였다. 그 후, 상층액 일정량을 수집하고 상층액의 반(1/2) 부피의 증류수를 추가하여 희석하였다.
3. 초고속액체크로마토그램 -질량분석기( UPLC - QTOF - MS )를 통한 생체 대사체 분석
상기 전처리된 환자군과 정상 대조군의 각 혈청 시료는 초고속액체크로마토그램-질량분석기(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry; UPLC-QTOF-MS; Waters사의 ACQUITY UPLC system, Synapt G2 MS system)를 사용하여 분석을 수행하였다.
혈청 시료에 포함된 생체 대사체들은 UPLC (ultra performance liquid chromatography) 시스템을 통과하면서 머무름 시간에 따라 분리되었고, Synapt G2 MS system을 거치면서 질량 대 전하 비율로 검출되었다. 구체적으로, UPLC 시스템에서 컬럼은 ACQUITY BEH C18(2.1×100 mm, 1.7 μm)를 사용하였고, 컬럼 온도와 오토-샘플러(auto-sampler) 온도는 각각 50℃, 4℃로 설정하였다. 이동상으로는 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 증류수(이동상 A)와 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 메탄올(이동상 B)을 사용하였다. 그리고 이 두 이동상을 UPLC 시스템 내에서 분석 시간에 따라 다른 비율로 혼합하여 흘려주는 기울기 용리 (gradient elution) 방법으로 진행하였다. 무작위 순서로 주입하여 주입 순서에 따라 경향성을 배제하였다. 상기 혈장 시료에 포함된 생체 대사체들의 Synapt G2 시스템 내에서의 검출은 질량 분석기의 포지티브 이온화(positive ionization)와 네거티브 이온화(negative ionization) 모드에서 각각 진행하여 MSE mode로 분석하였다.
상기 Synapt G2 시스템의 구체적인 분석조건은 다음과 같다.
수집 모드(Acquisition mode) ESI (+/-) mode
모세관 전압(Capillary voltage) (+) 3.2 kV / (-) 2.5 kV
샘플 콘 전압(Sample con voltage) 40 V
소스온도(Source temperature) 120 ℃
탈용매 온도(Desolvation temperature) 350 ℃
콘 가스 유량(Cone gas flow) 100 L/h
탈용매 가스 유량(Desolvation gas flow) 800 L/h
구체적으로, 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI)방법을 통하여 모세관 전압(capillary voltage)을 포지티브 이온화 모드(positive ionization mode)에서 (+) 3.2 kV, 네거티브 이온화 모드(negative ionization mode)에서 (-) 2.5 kV로 설정하고, 콘 전압(cone voltage)은 40 V로 분석하였다. 소스(Source)의 온도와 탈용매(desolvation) 온도 조건은 각각 120℃, 350℃로 설정하였고, 콘 가스(cone gas)의 유량 및 탈용매 가스 (desolvation gas) 유량도 각각 100 L/h, 800 L/h로 분석하였다. 그리고 상기 초고속액체크로마토그램-질량분석기(UPLC-QTOF-MS)를 이용한 혈장 분석 결과로부터 크로마토그램 및 질량 스펙트럼 분석 데이터를 얻었다.
4. 불안정형 협심증 및 심근경색 환자군과 정상 대조군의 혈청 시료 중 생체 대사체 분석
상기 불안정형 협심증 및 심근경색 환자군, 정상 대조군의 혈청시료에서 얻은 대사체 분석 데이터를 MassLynxTM(Mass Spectrometry Software, Waters사) 및 MarkerLynxTM(Waters사)프로그램을 이용하여 크로마토그램 및 스펙트럼 데이터를 디콘볼루션(deconvolution)하여 검출된 대사체 마커 후보들의 데이터를 얻었다. 각 마커 후보들의 피크 면적(peak area)을 전체 크로마토그램 피크 면적(peak area)으로 보정하여 샘플 간 데이터 오차를 줄이고 표준화하였다. 그리고 표준화시킨 모든 마커 데이터로 부분최소제곱판별 분석 (partial least square-discriminant analysis, PLS-DA) 방법을 이용해 다변량 통계분석(multivariate analysis)을 하였다. 도 1은 상기 다변량 통계분석 결과를 3차원으로 나타낸 것으로, 도 1의 그래프(score plot)에서 세 그룹이 잘 분리된 클러스터(cluster) 형태를 나타냈으므로 세 그룹 간 마커의 차이가 확연하다는 것을 알 수 있다.
그 다음, 상기 통계 분석의 데이터에서 그룹 간 차이를 나타내는 마커 후보들 중 통계적으로 유의한 차이를 가장 크게 보이는 대사체 바이오 마커를 선택하고, 정상군과 환자군 또는 각 단계별 환자군에서 어떤 방향으로 변화하는지 분석하였다. 즉, 선별한 후보들 중에서 인간 메타볼롬 데이터베이스(Human metabolome database; HMDB), METLIN(Metabolite Database) 등의 데이터베이스에서 검색하여 심근경색과 불안정 협심증과 관련 있는 바이오 마커를 비교 및 확인하였다.
이 중 상대적인 양 비교에서 정상 대조군과 환자군 사이에 통계적으로 유의적인 차이가 있는 바이오 마커 16종의 레벨 평균값을 하기 표 2에 나타내었다. 16종 이때 유의적 차이는 Kruskal-Wallis(크루스컬 왈리스)검정 및 스튜던트 t-test를 통해 검증하였는데 그 중 유의적인 차이를 보인 12종의 바이오 마커에 대한 p-value를 표 3에 나타내었다. 하기 표의 각 평균값들은 보정된 피크 면적(peak area)값이다.
물질명 정상대조군 불안정형 협심증
환자군		 급성 심근경색
환자군		 변화
평균 표준
편차		 평균 표준
편차		 평균 표준
편차
L-Tryptophan 19.1 9.5 17.4 10.9 5.0 5.4 감소
L-Homoserine 5.7 3.3 5.0 4.0 14.9 11.5 증가
FA(16:1)
(Palmitelaidic acid)		 67.9 35.8 90.7 57.9 120.7 54.3 증가
FA(18:0)
(Stearic acid)		 45.9 10.2 54.6 18.2 62.3 12.2 증가
FA(18:1)
(Oleic acid)		 236.9 86.3 308.3 173.8 478.4 212.2 증가
FA(18:2)
(Linoleic acid)		 223.7 63.4 262.3 93.2 343.7 105.1 증가
FA(22:6)
(Docosahexaenoic acid)		 168.4 62.0 209.1 122.2 259.4 98.1 증가
PC(34:2) 204.5 49.1 208.1 34.4 210.1 32.6 증가
PC(34:3) 10.6 4.6 8.5 5.0 7.9 4.8 감소
LPC(16:0) 529.7 82.1 480.4 96.9 449.6 128.9 감소
LPC(18:0) 184.8 45.3 164.5 34.9 128.3 64.0 감소
LPC(20:3) 4.3 1.8 5.9 3.0 8.4 5.2 증가
LPC(20:4) 14.6 5.2 20.6 12.6 27.2 21.1 증가
LPC(22:6) 8.6 3.6 27.8 38.9 37.3 34.0 증가
MG(18:1/0:0/0:0) 27.1 35.4 51.1 85.2 134.1 109.2 증가
SM(d18:2/16:0) 7.0 2.7 9.7 4.9 11.8 4.3 증가
물질명 Kruskal-Wallis test Student's t-test
정상 대조군
vs
급성 심근경색군		 정상 대조군
vs
불안정형 협심증군		 급성 심근경색군
vs
불안정형 협심증군
L-Tryptophan <0.001 <0.001 0.526 <0.001
L-Homoserine <0.001 <0.001 0.508 <0.001
FA(18:0)
(Stearic acid)		 <0.001 <0.001 0.073 0.047
FA(18:1)
(Oleic acid)		 <0.001 <0.001 0.076 0.002
FA(18:2)
(Linoleic acid)		 <0.001 <0.001 0.087 0.003
FA(22:6)
(Docosahexaenoic acid)		 <0.001 <0.001 0.147 0.075
PC(34:3) 0.022 0.012 0.086 0.681
LPC(16:0) <0.001 0.001 0.031 <0.001
LPC(18:0) <0.001 <0.001 0.068 0.005
LPC(20:3) <0.001 <0.001 0.028 0.017
LPC(20:4) 0.002 <0.001 0.038 0.119
MG(18:1/0:0/0:0) <0.001 <0.001 0.208 0.002
상기 표 2에서 나타난 바와 같이, 불안정형 협심증 환자군 및 심근경색 환자군에서 정상 대조군에 비해 증가하거나 감소한 생체 대사체들이 검출되었다. 대부분 아미노산, 인지질, 지방산 종류가 많았다. 인지질 중에는 PC, 라이소PC, 스핑고마이엘린(sphingomyelin, SM)이 포함되는데, 라이소PC의 경우 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6)과 같은 불포화 라이소PC는 정상 대조군에 비해 환자군에서 증가하였고, 라이소PC(16:0), 라이소PC(18:0)과 같은 포화 라이소PC는 감소하였다. PC 계열의 PC(34:2)는 증가하고 PC(34:3)은 감소하는 경향을 보였다. 반면, 모노글리세라이드(MG)(18:1/0:0/0:0), 스핑고마이엘린(SM)(d18:2/16:0)과 지방산 계열의 대사체들은 모두 증가하는 경향을 보였다.
표 3에서 나타난 12종의 바이오 마커는 표 2의 16종의 대사체 중 크루스컬-왈리스 검정을 통해 그룹별로 유의적인 차이를 보인 것을 나타낸 것이다. 비모수 검정을 통해 전체적인 그룹별 유의성을 알 수 있는 크루스컬-왈리스 검정과 달리, 스튜던트 t-test로 세부적인 질병 단계별 유의성을 판단하였다. 크루스컬-왈리스 검정에서는 모든 12종의 바이오 마커들이 유의적인 차이를 보인 반면, 각각의 세부 질병 단계별 차이에서는 p-value<0.05의 유의성을 보이지 않는 바이오 마커들도 있었다.
각각의 단일 바이오 마커 레벨 변화가 급성 심근경색 환자군 및 불안정형 협심증 환자군을 단계별로 진단하는 바이오 마커로써의 정확도를 파악하기 위하여 수신자판단특성(receiver operating characteristics, ROC) 분석을 진행하였다. 먼저, 크루스컬-왈리스 검정 및 스튜던트 t-test에서 모두 질병별 유의적인 차이를 보인 단일 바이오 마커 라이소PC(16:0)으로 단변량 ROC곡선(univariate ROC curve)을 그리고 이를 통한 민감도(sensitivity), 특이성(specificit), 정확도(accuracy)를 계산하였고 도 2 내지 도 4에 나타내었다. 이때, 도 2는 정상 대조군에서 급성 심근경색 환자군, 도 3은 정상 대조군에서 불안정형 협심증 환자군, 도 4는 불안정형 협심증 환자군과 급성 심근경색 환자군을 비교하여 진단한 결과를 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 4에서 나타낸 일반적인 단변량 통계 분석 방법을 통해 단일 바이오 마커로 진단을 하면 충분한 민감도, 특이성, 정확도를 확보하지 못하기 때문에, 본 발명에서 발견한 16종의 다중-생체대사체를 활용하여 다변량 ROC 곡선(multivariate ROC curve) 모델을 만들어 민감도, 특이성, 정확도를 계산하여 도 5 내지 도 7에 나타내었다. 이때, 도 5는 정상 대조군에서 급성 심근경색 환자군, 도 6은 정상 대조군에서 불안정형 협심증 환자군, 도 7은 불안정형 협심증 환자군과 급성 심근경색 환자군을 비교하여 진단한 결과를 나타낸 것이다. 이때 사용한 다중-대사체를 활용한 다변량 ROC 곡선 모델은 몬테-카를로스 밸리데이션(Monte-Carlos validation) 방법을 통해 50회의 반복적인 검증을 통해 16종의 다중-대사체에 최적화된 것이다.
상기 도 2 내지 도 4와 도 5 내지 도 7의 결과로부터, 상기 다중-대사체를 활용한 다변량 ROC 곡선 모델을 통해 분석한 결과가 단일 바이오 마커를 활용한 단변량 ROC 곡선에 비해 정확도 측면에서 약 3.8%-23.1% 증가하였음을 알 수 있다. 이는 상기 16종의 다중-대사체를 활용한 다변량 분석 시스템이 멀티-바이오 마커 진단 플랫폼으로 활용될 수 있음을 의미하며, 상기 진단 플랫폼은 정상 대조군에서의 급성 심근경색 진단뿐만 아니라 불안정형 협심증과 급성 심근경색을 특이적으로 판별 및 진단하는데 활용될 수 있다.
[실시예 2]
본 실험에서는 상기 실시예 1의 결과를 재확인하기 위하여 다른 실험 참가자들을 재모집하여 분석하였다. 실시예 1과 동일하게 본 실험의 실험 참가자로 심혈관 질환이 없는 정상 대조군과 환자군인 불안정형 협심증, 심근경색 환자들을 대한민국 서울에 소재한 고려대학교 구로병원에서 모집하였다. 환자군은 남녀 불안정형 협심증 환자 23명, 심근경색 환자 15명으로 구성되었고, 정상 대조군은 건강한 남녀 61명으로 구성되었다.
분석 조건 및 데이터 처리 방법은 상기 실시예 1과 동일하다.
3차원으로 나타낸 PLS-DA 스코어 플럿(score plot)을 보면(도 8), 본 실험 결과 역시 상기 실시예 1과 동일하게 세 그룹이 잘 분리된 클러스터(cluster) 형태를 나타냈으므로 세 그룹 간 마커의 차이가 확연하다는 것을 알 수 있다.
그 다음, 표 4에서 나타내는 바와 같이 16종의 생체 대사체를 발굴하였으며, 정상 대조군 및 불안정형 협심증 환자군, 급성 심근경색 환자군에서 각 생체 대사체의 레벨 변화를 나타내었다. 또한 크루스컬-왈리스 테스트 및 스튜던트 t-test 검정 결과를 표 5에 나타내었다.
물질명 정상대조군 불안정형 협심증
환자군		 급성 심근경색
환자군		 변화
평균 표준
편차		 평균 표준
편차		 평균 표준
편차
L-Tryptophan 22.4 5.1 19.5 5.8 16.5 8.0 감소
L-Homoserine 5.0 1.1 5.5 1.4 6.4 2.4 증가
FA(16:1)
(Palmitelaidic acid)		 12.9 10.1 14.3 11.1 24.7 15.7 증가
FA(18:0)
(Stearic acid)		 6.1 2.2 12.4 3.9 15.5 5.6 증가
FA(18:1)
(Oleic acid)		 98.7 44.6 129.3 69.3 216.8 119.8 증가
FA(18:2)
(Linoleic acid)		 88.5 32.3 106.6 67.7 165.0 59.1 증가
FA(22:6)
(Docosahexaenoic acid)		 74.8 35.6 71.5 21.7 156.8 85.5 증가
PC(34:2) 159.1 34.9 166.8 25.6 187.8 33.1 증가
PC(34:3) 16.4 7.4 15.3 4.9 14.5 5.4 감소
LPC(16:0) 314.8 51.0 283.8 42.3 230.8 62.4 감소
LPC(18:0) 95.6 26.0 82.1 22.7 61.7 25.6 감소
LPC(20:3) 6.7 2.0 7.7 2.8 14.8 9.4 증가
LPC(20:4) 11.4 6.1 9.9 5.2 14.8 7.5 증가
LPC(22:6) 6.3 2.3 5.2 1.4 9.6 8.2 증가
MG(18:1/0:0/0:0) 6.6 5.3 13.3 27.1 85.2 74.6 증가
SM(d18:2/16:0) 19.2 5.6 19.9 7.2 21.1 6.6 증가
물질명 Kruskal-Wallis test Student's t-test
정상 대조군
vs
급성 심근경색군		 정상 대조군
vs
불안정형 협심증군		 급성 심근경색군
vs
불안정형 협심증군
L-Tryptophan <0.001 0.014 0.025 0.195
L-Homoserine 0.043 0.036 0.070 0.192
FA(18:0)
(Stearic acid)		 <0.001 <0.001 <0.001 0.050
FA(18:1)
(Oleic acid)		 0.001 0.002 0.058 0.018
FA(18:2)
(Linoleic acid)		 0.007 <0.001 0.230 0.010
FA(22:6)
(Docosahexaenoic acid)		 0.014 0.002 0.608 0.002
PC(34:3) 0.021 0.332 0.396 0.639
LPC(16:0) <0.001 <0.001 0.011 0.003
LPC(18:0) <0.001 <0.001 0.032 0.014
LPC(20:3) 0.010 0.005 0.134 0.012
LPC(20:4) 0.019 0.075 0.292 0.024
MG(18:1/0:0/0:0) <0.001 0.001 0.256 0.002
표 4와 표 5의 결과로 볼 때, 환자군에 따른 마커들의 변화가 실시예 1에서의 데이터와 유사 또는 일치하고 통계적 유의성을 나타내는 마커가 동일하게 나타났다. 이는 실시예 1의 분석 결과를 다른 실험 참가자를 통한 실시예 2의 결과로 재확인하고 성공적으로 밸리데이션 되었음을 의미한다.
또한 도 9 내지 도 14를 비교하여 볼 때, 단일 생체 대사체를 이용한 단변량 분석결과를 나타낸 도 9 내지 도 11의 결과에 비해 다중 생체 대사체를 이용한 다변량 분석결과를 나타낸 도 12 내지 도 14의 결과가 정확도의 측면에서 약 8.9-17.4%가 증가했음을 알 수 있다. 이는 다중 생체 대사체를 활용한 다변량 분석 시스템이 더 정확하다는 상기 실시예 1의 결과를 입증하는 데이터로써, 본 발명에서의 멀티-바이오 마커 진단 플랫폼을 성공적으로 밸리데이션 했음을 의미한다.

Claims (19)

  1. 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0), 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0), 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)를 포함하는 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하고,
    상기 생체 대사체들의 체내 레벨을 분석하는 다변량 분석(multivariate analysis) 시스템을 통해 급성 관상동맥 질환 중 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 및 상기 급성 심근경색 발생 이전 증상인 불안정형 협심증(unstable angina)을 판별하는 용도인,
    급성 관상동맥 질환 (acute coronary syndrome) 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0), 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0), 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)를 포함하는 생체 대사체의 체내 레벨(level) 측정부를 포함하고,
    상기 생체 대사체 측정부에서 측정된 생체 대사체들의 체내 레벨을 분석하는 다변량 분석(multivariate analysis) 시스템을 더 포함하며,
    급성 관상동맥 질환 중 급성 심근경색(acute myocardial infarction) 및 상기 급성 심근경색 발생 이전 증상인 불안정형 협심증(unstable angina)을 판별하는 용도인,
    급성 관상동맥 질환(acute coronary syndrome) 진단용 키트.
  6. 삭제
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 생체 대사체의 체내 레벨 측정부는,
    제 1 항의 급성 관상동맥 질환 진단용 조성물을 포함하는,
    급성 관상동맥 질환 진단용 키트.
  8. 삭제
  9. 제 5 항에 있어서, 상기 진단용 키트는,
    급성 관상동맥 질환 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함하는,
    급성 관상동맥 질환 진단용 키트.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 지시서는,
    상기 측정된 대사체 중 트립토판, PC(34:3), 라이소PC(16:0) 및 라이소PC(18:0) 중 하나 이상의 체내 레벨이 정상 대조군보다 적거나, 호모세린, 지방산 (16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), PC(34:2), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0) 중 하나 이상의 체내 레벨이 정상 대조군보다 많으면 급성 관상동맥 질환이 있다고 진단하는 감별방법을 포함하는,
    급성 관상동맥 질환 진단용 키트.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 급성 관상동맥 질환(acute coronary syndrome) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로,
    생체 시료로부터 트립토판(tryptophan), 호모세린(homoserine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)(34:2), PC(34:3), 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(16:0), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), 모노글리세라이드(monoglyceride)(18:1/0:0/0:0), 스핑고마이엘린(sphingomyelin)(d18:2/16:0), 지방산(fatty acid)(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)를 포함하는 생체 대사체의 레벨을 측정하는 단계; 및
    상기 단계에서 측정한 생체 대사체의 레벨을 정상 대조군의 레벨과 비교하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 생체 대사체 측정 단계는 측정된 생체 대사체들의 레벨을 다변량 분석(multivariate analysis)하는 단계를 더 포함하며,
    상기 방법은 급성 관상동맥 질환 중 급성 심근경색 및 상기 급성 심근경색 발생 이전 증상인 불안정형 협심증을 판별하기 위한 정보를 제공하는 방법인, 급성 관상동맥 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  15. 삭제
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법은 상기 생체 대사체의 레벨을 정상 대조군의 레벨과 비교하는 단계 이후,
    상기 측정된 생체 대사체 중 트립토판, PC(34:3), 라이소PC(16:0) 및 라이소PC(18:0)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 레벨이 정상 대조군보다 낮거나, 호모세린, 지방산 (16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6), 라이소PC(20:3), 라이소PC(20:4), 라이소PC(22:6), PC(34:2) 모노글리세라이드(18:1/0:0/0:0) 및 스핑고마이엘린(d18:2/16:0)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 레벨이 정상 대조군보다 높으면, 급성 관상동맥 질환이 있다고 진단하는 단계를 더 포함하는,
    급성 관상동맥 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
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