KR101660328B1 - 심혈관 질환 진단용 바이오 마커 - Google Patents

심혈관 질환 진단용 바이오 마커 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 생체 대사체인 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)은 대상자가 심근경색, 협심증과 같은 심혈관 질환을 갖는 경우 혈중 레벨이 증가 또는 감소하므로, 그 레벨의 비교를 이용하여 간단하면서도 정확하게 심혈관 질환을 진단할 수 있다. 더욱이 기존의 바이오 마커가 심근경색 여부만 진단할 수 있었던 것과 달리, 본 발명에 따른 생체 대사체는 심근경색뿐만 아니라 심근경색 발병 이전 징후인 불안정 협심증까지 단계별로 진단할 수 있다.

Description

심혈관 질환 진단용 바이오 마커{Biomarker for diagnosis of cardiovascular disease}
본 명세서 기재된 내용은 심혈관 질환을 진단할 수 있는 대사체에 관한 것이다.
심혈관 질환(cardiovascular disease, CVD)은 세계 최고 사망률을 기록하고 있는 질병으로 세계보건기구(WHO)의 보고에 의하면 2030년까지 2360만 명이 심혈관 질환으로 사망할 것으로 예상하고 있다. 그 중 심근경색증(myocardial infarction)은 성인 돌연사 원인 1위를 차지하는 치명적인 질환으로 계속 증가하는 추세에 있다. 이 질환은 관상동맥 혈류가 막혀서 심장 근육에 산소공급의 불균형이 일어나 비가역적인 심장 근육 세포 손상이 발생하는 것이 특징이다. 병변이 안정적으로 형성되어 반복적이고 특징적인 흉통으로 예측 진단할 수 있는 안정형 협심증(stable angina pectoris)과는 다르게, 심근경색의 경우에는 취약성 경화반(vulnerable plaque)이 파열되어 갑작스럽게 관상동맥 혈전성 폐색의 증상으로 나타난다. 이러한 취약성 경화반의 진단은 종래 혈관 내 심초음파방법(intravascular ultrasound, IVUS)을 이용하는 등의 침습적 방법으로만 이루어졌으며, 현재까지 발병 전에 미리 예측하고 진단할 수 있는 바이오마커가 없어 조기 진단에 어려움을 겪고 있다.
관상동맥질환이 진행되면 협심증의 증세를 보이게 되는데, 협심증은 안정형 협심증(stable angina pectoris)와 불안정형 협심증(unstable angina)으로 나눌 수 있다. 특히 불안정형 협심증은 병변의 크기가 작더라도 동맥경화반이 파열될 확률이 높기 때문에 안정형 협심증과는 달리 매우 위험한 질환이다. 따라서 심근경색의 조기 진단과 마찬가지로 심근경색의 이전 단계인 불안정형 협심증의 변화를 예측할 수 있는 바이오마커 개발이 시급하며, 이러한 연구 개발은 임상에서 심근경색 발병 이전이 조기 발견에도 매우 유용하게 이용될 수 있다.
현재 심혈관 질환이나 심부전의 진단으로 GOT(glutamic oxaloacetic transaminase), LDH(lactate dehydrogenase), CK-MB(creatine kinase-MB), 트로포닌(troponin) I, 트로포닌 T, CRP(C-reative protein) 및 BNP(B-type natriuretic peptide)가 바이오마커로 사용되고 있지만, 이것들은 심근경색에만 특이적인 바이오 마커가 아니거나 심근경색의 발생 이후에야 진단할 수 있는 마커들이다. 또한, 아직까지 혈액에서 발견되는 저분자 대사체를 이용한 진단 바이오마커에 대하여는 알려져 있지 않다. 따라서, 심근경색에 특이적이면서도, 심근경색 발생 이전에 병변 발생을 예측할 수 있는 마커가 필요하다.
대한민국 등록특허공보 제 10-1051470 호 대한민국 등록특허공보 제 10-1040321 호 미국 공개특허공보 제 2011-0137131 호
Lewis GD, Wei R, Liu E, Yang E, Shi X, Martinovic M, Farrell L, Asnani A, Cyrille M, Ramanathan A, Shaham O, Berriz G, Lowry PA, Palacios IF, Ta?an M, Roth FP, Min J, Baumgartner C, Keshishian H, Addona T, Mootha VK, Rosenzweig A, Carr SA, Fifer MA, Sabatine MS, Gerszten RE. Metabolite profiling of blood from individuals undergoing planned myocardial infarction reveals early markers of myocardial injury. J Clin Invest. 2008;118(10):3503-12. Shah SH, Kraus WE, Newgard CB. Metabolomic Profiling for the Identification of Novel Biomarkers and Mechanisms Related to Common Cardiovascular Diseases. Circulation. 2012;126(9):1110-20. Jiang P, Dai W, Yan S, Chen Z, Xu R, Ding J, Xiang L, Wang S, Liu R, Zhang W. Potential biomarkers in the urine of myocardial infarction rats: a metabolomic method and its application. Mol Biosyst. 2011;7(3):824-31. Tan G, Lou Z, Liao W, Dong X, Zhu Z, Li W, Chai Y. Hydrophilic interaction and reversed-phase ultraperformance liquid chromatography TOF-MS for serum metabonomic analysis of myocardial infarction in rats and its applications. Mol Biosyst. 2012;8(2):548-56. Barderas MG, Laborde CM, Posada M, de la Cuesta F, Zubiri I, Vivanco F, Alvarez-Llamas G. Metabolomic Profiling for Identification of Novel Potential Biomarkers in Cardiovascular Diseases. J Biomed Biotechnol. 2011;2011:790132.
본 발명은 심혈관 질환의 진단에 바이오 마커로서 기능을 하는 생체 대사체와 이 생체 대사체의 혈액 내 정성 및 정량분석을 통하여 심혈관 질환의 단계별 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다. 또한, 본 발명은 상기 생체 대사체의 측정부를 포함하는 심혈관 질환 진단용 키트를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 라이소PC(lysophosphatidylcholine)(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(fatty acid)(16:1)(팔미테레이드산; palmitelaidic acid), 지방산(18:0)(스테아르산; stearic acid), 지방산(18:1)(올레산; oleic acid), 지방산(18:2)(리놀레산; linoleic acid) 및 지방산(22:6)(도코사헥사에노산; docosahexaenoic acid) 중 하나 이상의 생체 대사체의 측정부를 포함하는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예는 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 대상자로부터 채취한 혈액에서 라이소PC (18:0), 라이소PC (20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 생체 대사체 레벨을 확인하는 단계; 및
상기 단계에서 확인한 혈액내 생체 대사체 레벨을 정상 대조군의 혈액의 상기 생체 대사체 레벨과 대비하는 단계;
를 포함하는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 생체 대사체는 기존에 존재하던 단백질 기반의 지방단백질(Lipoprotein)이 아닌 지질(lipid)자체이므로, 혈액 내에서 쉽게 분석이 가능하다. 특히, 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)은 대상자가 심근경색, 협심증과 같은 심혈관 질환을 갖는 경우 혈중 레벨이 증가 또는 감소하므로, 그 혈중 레벨의 비교를 이용하여 간단하면서도 정확하게 심혈관 질환을 진단할 수 있다. 더욱이 기존의 바이오 마커가 심근경색 여부만 진단할 수 있었던 것과 달리, 본 발명에 따른 생체 대사체는 심근경색뿐만 아니라 심근경색 발병 이전 징후인 불안정 협심증까지 진단할 수 있으므로, 심근경색의 발병 이전부터 단계별로 조기 진단에 유용하다.
따라서, 본 발명에 따른 생체 대사체를 이용하면 대상자의 혈액 검사만으로 간단하게 심근경색 및 불안정 협심증의 예후를 예측하고, 나아가 치료효과, 질병 예방 성공 여부까지 진단할 수 있다.
도 1은 정상인 대조군 및 심근경색 환자군의 혈장의 생체 대사체를 분석한 결과를 바탕으로, 직교부분최소제곱판별 분석 (orthogonal partial least square-discriminant analysis; OPLS-DA) 방법을 이용해 다변량 통계분석(multivariate analysis)한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 대사체 바이오마커의 정상인 대조군과 불안정 협심증 및 심근경색 환자군의 혈중 상대적 양을 비교하여 나타낸 것이다(FA: 지방산, LysoPC: 라이소PC).
도 3은 일 실시예에 따른 대사체 바이오마커의 정상인 대조군과 불안정 협심증 환자군의 혈중 상대적 양을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 일 실시예에 따른 대사체 바이오마커의 정상인 대조군과 심근경색 환자군의 혈중 상대적 양을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 일 실시예에 따른 대사체 바이오마커의 불안정 협심증 환자군과 심근경색 환자군의 혈중 상대적 양을 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 일 실시예에 따른 대사체 바이오마커 중 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(18:0)의 정상인 대조군과 불안정 협심증 환자군 및 심근경색 환자군의 혈중 상대적 양을 비교하여 나타낸 것이다.
도 7은 일 실시예에 따른 대사체 바이오마커 중 라이소PC(20:3)의 온라인 데이터베이스에서 제공하는 이론적 스펙트럼 패턴과 본 발명의 실험예 1에서 얻은 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것으로, 이 중 도 7의 (a) 및 (b)는 양이온 모드에서 얻은 스펙트럼이다. 데이터베이스에서 확인된 라이소PC(20:3)의 스펙트럼 패턴을 도 7의 (b)에 라이소PC(20:3)의 구조와 함께 나타내었다.
도 8은 일 실시예에 따른 대사체 바이오마커 중 라이소PC(20:3)의 온라인 데이터베이스에서 제공하는 이론적 스펙트럼 패턴과 본 발명의 실험예 1에서 얻은 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것으로, 이 중 도 8의 (c), (d), (e), (f)는 음이온 모드에서 얻은 스펙트럼이다. 데이터베이스에서 확인된 라이소PC(20:3)의 스펙트럼 패턴을 도 8의 (e), (f)에 라이소PC(20:3)의 구조와 함께 나타내었다.
본 명세서에서 "라이소PC(LysoPC)"는 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine)의 약어로서 PC는 포스파티딜콜린을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 "레벨(level)"은 바이오마커의 혈중 수준을 의미하는 것으로, 혈액 내에 포함된 바이오마커의 농도, 질량 등 객관적인 수치 및 해당 물질의 타 물질에 대한 상대량을 모두 포함하는 최광의의 의미이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예는 라이소PC(lysophosphatidylcholine; LysoPC)(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(fatty acid; FA)(16:1)(팔미테레이드산; palmitelaidic acid), 지방산(18:0)(스테아르산; stearic acid), 지방산(18:1)(올레산; oleic acid), 지방산(18:2)(리놀레산; linoleic acid) 및 지방산(22:6)(도코사헥사에노산; docosahexaenoic acid) 중 하나 이상의 생체 대사체를 포함하는 심혈관 질환 진단용 바이오 마커를 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 생체 대사체들은 심혈관 질환 중 심근경색 질환의 유무뿐만 아니라, 심근경색 발병 이전 단계인 불안정 협심증까지 단계적인 진단이 가능하다.
이에 본 발명의 일 실시예는 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 생체 대사체를 생체 대사체의 측정부를 포함하는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예로서 상기 심혈관 질환은 심근경색 및 상기 심근경색 발생 이전 증상인 불안정 협심증 중 하나 이상을 포함한다. 구체적으로 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)은 각각 정상 대조군과 대비하여 심근경색 환자와 불안정 협심증 환자의 혈중 레벨 변화가 각각 다르게 나타날 수 있다. 또한, 상기 7가지의 바이오 마커 간에도 동일 환자의 혈중 레벨 변화가 각각 다르게 나타날 수 있다.
본 발명의 일 실시예로서 상기 진단용 키트의 생체 대사체 측정부는 혈액 내에서 상기 7가지 생체 대사체 중 하나 이상을 검출할 수 있는 물질 또는 검출장치 등을 포함할 수 있으며, 질량분석기, 핵자기공명(Nuclear magnetic resonance, NMR)이나 분광광도계(Photodiode Array, PDA) 등 생체 대사체의 혈중 레벨을 측정 또는 검출할 수 있는 것이면 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 키트는 심혈관 질환 진단 방법을 포함하는 지시서를 더 포함할 수 있다. 이때 일 실시예로서 상기 심혈관 질환은 심근경색 및 불안정 협심증 중 하나 이상을 포함하므로, 상기 지시서도 심근경색 및 불안정 협심증 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 생체 대사체를 검출하는 물질을 유효성분으로 포함하는 심혈관 질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 라이소PC는 세포막, 혈액 등에 존재하는 지질 대사 경로의 대사체 중 인지질 대사체의 일종으로, 하기의 화학식 1에 나타난 바와 같이 PC(포스파티딜콜린)에서 두 개 중 한 개의 지방산이 떨어져 나가 한 개의 지방산(하기 화학식 1의 R)만이 결합하고 있는 구조를 기본 구조로 가지고 있다.
Figure 112014003715791-pat00001
그리고 이 중 본 발명의 바이오마커인 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3)은 탄소사슬 내 탄소수: 탄소사슬 내에 이중결합의 수가 각각 18:0, 20:3으로 존재하는 라이소PC를 의미하며, 이 수치에 따라 심혈관 질환 환자에게서 나타나는 농도의 변화가 각각 다르게 나타난다.
지방산은 1개의 카복시기(-COOH)를 가지는 탄화수소 사슬의 1가 카복실산을 말하는데, 생체 내 지방산회로에 의해서 분해되거나 합성된다. 라이소 PC의 경우와 마찬가지로 탄화수소 사슬 내 탄소의 수: 탄화수소 사슬 내 이중결합 수로 표현된다. 본 발명의 바이오마커인 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)은 탄소사슬 내 탄소수: 탄소사슬 내에 이중결합의 수가 각각 16:1, 18:0, 18:1, 18:2, 22:6으로 존재하는 지방산으로, 각각 팔미테레이드산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 도코사헥사에노산으로 불린다.
본 발명의 일 실시예로서 상기 대상자로부터 채취한 혈액에서 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 생체 대사체 레벨을 확인하는 단계에서 대상자는 인간 또는 인간을 제외한 동물일 수 있다. 또한, 상기 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)는 혈액에서 채취한 것이나, 혈액외 조직 등 그 채취부위는 한정되지 않는다.
상기와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 바이오마커는 정상 대조군과 심혈관 질환 환자군, 구체적으로 심근경색 환자군 및 불안정 협심증 환자군의 혈장을 분석하여 데이터를 대사체학적 접근법으로 발굴한 것이다. 이때 대사체학은 유전적 차이와 더불어 생리적 또는 환경적 조건의 변화에 의해 나타나는 생체 내 저분자량 대사체의 조성과 농도를 분석하여 다양한 체내 생리적 변화의 원인을 규명하는 연구 분야이므로, 대사체학을 기초로 생체 대사체를 선별함으로써 대상의 심혈관 질환의 발생에 따른 대사경로의 변화를 효과적으로 파악할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예는 상기 바이오마커를 사용하여 심혈관 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 대상자로부터 채취한 혈액에서 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 생체 대사체 레벨을 확인하는 단계;및 상기 단계에서 확인한 혈액내 생체 대사체 레벨을 정상 대조군의 혈액의 상기 생체 대사체 레벨과 대비하는 단계;를 포함하는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 실시예로서 상기 생체 대사체 레벨은 생체 대사체의 혈액 내에 포함된 바이오마커의 농도, 질량 등 객관적인 수치 및 해당 물질의 타 물질에 대한 상대량 등을 예로 들 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 상기 생체 대사체 레벨을 대비하는 단계는 대상자의 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 혈중 레벨이 정상 대조군에 비해 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 일 실시예로서 상기 생체 대사체 레벨을 대비하는 단계는 대상자의 라이소PC(18:0) 및 지방산(18:0) 중 하나 이상의 혈중 레벨이 정상 대조군에 비해 낮으면 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또는, 상기 7가지 생체 대사체의 혈중 레벨을 동시 대비하여 진단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때 본 발명의 일 실시예로서 정상 대조군은 특별한 질환없이 건강한 자의 집합을 의미한다.
이하, 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험예 1]
본 발명의 일 실시예에 따른 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)의 심근경색의 단계별 진단 바이오마커로서의 기능을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
1. 실험대상 선정
본 실험에서 실험 참가자로 환자군인 안정형 협심증, 불안정형 협심증, 심근경색 환자들 및 이와 같은 질환이 없는 정상 대조군인 정상인들은 대한민국 서울에 소재한 고려대학교 구로병원에서 모집하였다. 환자군은 남녀 안정형 협심증 환자 72명, 불안정형 협심증 환자 23명, 심근경색 환자 42명으로 구성되었고, 정상 대조군은 고혈압, 당뇨병, 심혈관질환, 뇌혈관질환, 만성 신장질환, 감염성 질환 등의 과거 병력이 없는 건강한 남녀 40명으로 구성되었다. 환자군과 대조군 모두 45세 이상으로 나이를 제한하였다. 환자군 및 대조군의 나이를 45세로 제한한 이유는 심근경색이나 협심증 질환이 보통 청년층보다는 중년 및 노년층의 환자군에서 주로 나타나고, 45세 이상에서 유의적 차이를 나타내기 때문이다. 그리고 환자군과 대조군의 나이를 동일한 조건으로 제한함으로써 나이에 의해 발생될 수 있는 그룹간 차이를 최소화하여 데이터 해석 오류를 방지하고자 하였다.
2. 분석대상물질 표준용액(혈액시료)의 제조
본 실험의 참가자인 환자군과 정상대조군으로부터 정맥혈을 얻어 항응고제가 표면 처리된 멸균 플라스틱 시험관에 채집하였고, 곧바로 원심분리를 시행하여 혈장 시료를 각각 얻었다. 모든 시료는 분석 이전까지 -80 ℃에 보관하였다. 그리고 메탄올을 이용한 제단백 방법으로 상기 혈장 시료를 전처리하였다. 구체적으로, 상온으로 녹인 혈장 시료에 3배 부피의 차가운 메탄올(ice-cold methanol)을 첨가하고 완전히 섞어 준 뒤 원심분리를 시행하였다. 그 다음, 상층액 일정량을 수집하고 상층액의 반(1/2) 부피의 증류수를 추가하여 희석하였다.
3. 초고속액체크로마토그램 -질량분석기( UPLC - QTOF - MS )를 통한 생체 대사체 분석
상기 전처리된 환자군과 정상대조군의 각 혈장시료는 초고속액체크로마토그램-질량분석기(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry; UPLC-QTOF-MS; Waters사의 ACQUITY UPLC system, Synapt G2 MS system)를 사용하여 분석을 수행하였다.
혈장 시료에 포함된 생체 대사체들은 UPLC(ultra performance liquid chromatography) 시스템을 거치면서 머무름 시간에 따라 분리되었고, Synapt G2 시스템을 거치면서 질량 대 전하 비율로 검출되었다. 구체적으로, UPLC 시스템에서 UPLC 컬럼은 ACQUITY BEH C18(2.1×100 mm, 1.7 μm)를 사용하였고, 컬럼 온도와 오토-샘플러(auto-sampler) 온도는 각각 50℃, 4℃로 설정하였다. 이동상으로는 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 증류수(이동상 A)와 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 메탄올(이동상 B)을 사용하였다. 그리고 이 두 이동상을 UPLC 시스템 내에서 분석 시간에 따라 다른 비율로 혼합하여 흘려주는 기울기 용리(gradient elution) 방법으로 진행하였다. 무작위 순서로 주입하여 주입 순서에 따라 경향성을 배제하였다. 상기 혈장 시료에 포함된 생체 대사체들의 Synapt G2 시스템 내에서의 검출은 질량 분석기의 포지티브 이온화(positive ionization)와 네거티브 이온화(negative ionization) 모드에서 각각 진행하여 MSE mode로 분석하였다.
상기 Synapt G2 시스템의 구체적인 분석조건은 다음과 같다.
수집 모드(Acquisition mode) ESI (+/-) mode
모세관 전압(Capillary voltage) (+) 3.2 kV / (-) 2.5 kV
샘플 콘 전압(Sample con voltage) 40 V
소스온도(Source temperature) 120 ℃
탈용매 온도(Desolvation temperature) 350 ℃
콘 가스 유량(Cone gas flow) 100 L/h
탈용매 가스 유량(Desolvation gas flow) 800 L/h
구체적으로, 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI)방법을 통하여 모세관 전압(capillary voltage)을 포지티브 이온화 모드(positive ionization mode)에서 (+) 3.2 kV, 네거티브 이온화 모드(negative ionization mode)에서 (-) 2.5 kV로 설정하고, 콘 전압(cone voltage)은 40 V로 분석하였다. 소스(Source)의 온도와 탈용매 온도 조건은 각각 120℃, 350℃로 설정하였고, 콘 가스의 유량은 100 L/h, 탈용매 가스 유량은 800 L/h로 분석하였다. 그리고 상기 초고속액체크로마토그램-질량분석기(UPLC-QTOF-MS)를 이용한 혈장 분석 결과로부터 크로마토그램 및 질량 스펙트럼 분석 데이터를 얻었다.
4. 불안정 협심증 및 심근경색 환자군과 정상 대조군의 혈장 시료 중 대사체 농도 분석
상기 불안정 협심증 및 심근경색 환자군과 정상 대조군의 혈장시료에서 얻은 대사체 분석 데이터를 MassLynxTM(Mass Spectrometry Software, Waters사) 및 MarkerLynxTM(Waters사)프로그램을 이용하여 데이터를 얼라인(align)하여 질량분석 크로마토그램과 스펙트럼에서 유의적인 차이가 있는 바이오마커 후보들을 선별했다. 구체적으로, 각 마커 후보들의 피크 면적(peak area)을 전체 크로마토그램 피크 면적(peak area)으로 보정하여 샘플 간 데이터 오차를 줄이고 표준화하였다. 그리고 표준화시킨 모든 마커 데이터로 직교부분최소제곱판별 분석 (orthogonal partial least square-discriminant analysis, OPLS-DA) 방법을 이용해 다변량 통계분석(multivariate analysis)을 하였다. 도 1은 상기 다변량 통계분석 결과를 나타낸 것으로, 도 1의 그래프(score plot)에서 두 그룹이 y축을 기준으로 분리되어 나타났으므로 두 그룹 간 마커의 차이가 확연하다는 것을 알 수 있다.
그 다음, 상기 통계 분석의 데이터에서 그룹 간 차이를 나타내는 마커 후보들 중 통계적으로 유의한 차이를 가장 크게 보이는 바이오 마커를 선택하고, 정상군과 환자군 또는 각 단계별 환자군에서 어떤 방향으로 변화하는지 분석하였다. 즉, 선별한 후보들 중에서 인간 메타볼롬 데이터베이스(Human metabolome database; HMDB), METLIN(Metabolite Database) 등의 데이터베이스에서 검색하여 심근경색과 불안정 협심증과 관련 있는 바이오마커를 비교 및 확인하였다.
이 중 상대적인 양 비교에서 정상 대조군과 환자군 사이에 통계적으로 유의적인 차이가 있는 바이오마커인 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 양의 평균값을 하기 표 2에 나타내었다. 이때 유의적 차이는 스튜던트 t-test를 통해 검증하였다. 그리고 정상 대조군(정상군), 불안정 협심증 환자군 및 심근경색 환자군의 각 혈장시료 내 상기 바이오마커들의 레벨을 도 2 내지 도 5에 나타내었고, 이 중 지방산(18:0), 라이소PC(18:0) 및 라이소PC(20:3)의 불안정 협심증 환자군 및 심근경색 환자군의 각 혈장시료 내 레벨을 도 6에 나타내었다. 하기 표의 각 평균값들은 보정된 피크 면적(peak area)값이다.
물질명 정상대조군 불안정 협심증
환자군		 심근경색
환자군		 P-값 (P-value) 변화
평균 표준
편차		 평균 표준
편차		 평균 표준
편차		 정상군
vs
불안정
협심증
환자군		 정상군
vs
심근경색
환자군		 불안정
협심증
환자군
vs
심근경색
환자군
FA(18:0)
(Stearic acid)		 62.27 10.18 49.11 24.12 45.81 11.86 0.012 <0.001 0.043 감소
LysoPC
(18:0)		 345.23 64.35 293.66 63.20 220.88 92.98 0.003 <0.001 0.001 감소
LysoPC
(20:3)		 5.60 2.34 8.62 5.33 13.38 9.36 0.016 <0.001 0.010 증가
FA(16:1)
(Palmitelaidic acid)		 67.91 35.76 78.72 61.03 122.97 53.30 0.412 <0.001 0.025 증가
FA(18:1)
(Oleic acid)		 236.88 86.34 270.14 188.16 481.05 207.46 0.396 <0.001 0.001 증가
FA(18:2)
(Linoleic acid)		 223.74 63.43 230.44 119.97 349.67 109.17 0.791 <0.001 0.002 증가
FA(22:6)
(Docosahexaenoic acid)		 168.41 62.00 183.57 130.79 268.52 101.46 0.578 <0.001 0.037 증가
상기 표에서 나타난 바와 같이, 정상 대조군이나 불안정형 협심증 환자군에 비해 심근경색 환자군에서 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:1), 지방산(18:2), 지방산(22:6)의 양은 유의적으로 증가하였고, 라이소PC(18:0)과 지방산(18:0)의 양은 유의적으로 감소하였다. 이는 상기 7가지 물질들은 심근경색 환자군을 특이적으로 진단 및 판별할 수 있는 바이오마커로 활용될 수 있음을 의미한다.
또한, 상기 바이오마커 중 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3) 및 지방산(18:0)은 정상 대조군과 심근경색 환자군 뿐만 아니라 불안정형 협심증 환자군간에서도 유의적인 변화를 나타내었다. 이는 라이소PC(18:0)과 지방산(18:0)이 불안정 협심증과 심근경색의 진행 정도까지 판별하는 바이오마커로 활용될 수 있음을 의미한다.
[실험예 2]
본 발명의 일 실시예에 따른 바이오마커인 라이소PC(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)의 심근경색의 단계별 진단 바이오마커로서의 기능에 대한 정확한 확인을 위하여, 시중에서 판매하는 표준품을 혈장시료를 이용한 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 분석하였다.
하기 표 3은 상기 표준품과 실험예 1의 혈장시료의 라이소PC(18:0), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6)의 비교분석결과를 나타낸 것이다.
물질명 m/z Adduct 머무름시간(분) 내부표준물질
머무름시간과의 비율
혈장시료 표준품 혈장시료 표준품
LysoPC(18:0) 524.371 [M+H]+ 10.84 11.09 2.00 2.02
FA(16:1)
Palmitoleidic acid		 253.217 [M-H]- 10.17 10.33 1.89 1.89
FA(22:6)
Docosahexaenoic acid		 327.233 [M-H]- 10.44 10.57 1.94 1.93
FA(18:2)
Linoleic acid		 279.232 [M-H]- 10.60 10.71 1.97 1.95
FA(18:1)
Oleic acid		 281.248 [M-H]- 11.25 11.38 2.09 2.08
FA(18:0)
Stearic acid		 283.264 [M-H]- 11.96 12.1 2.22 2.20
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 각 바이오마커 피크의 머무름시간과 각 분석에서 내부표준물질의 머무름시간의 비율을 계산하였을 때 혈장시료의 데이터와 표준품의 데이터가 일치하는 결과를 얻었으므로, 본 발명의 바이오마커가 정확함을 확인할 수 있다.
또한, 라이소PC(20:3)의 경우에는 시중에서 판매하는 표준품이 없어 온라인 데이터베이스(Human metabolome Database (http://www.hmdb.ca/), METLIN (http://metlin.scripps.edu/index.php))에서 제공하는 이론적 스펙트럼 패턴과 본 발명의 실험예 1에서 얻은 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이다. 데이터베이스에서 확인된 라이소PC(20:3)의 스펙트럼 패턴을 도 7의 (b), 도 8의 (e), (f)에 라이소PC(20:3)의 구조와 함께 나타내어 비교한 것으로, 상기 온라인 데이터베이스에서 제공하는 스펙트럼 패턴과 본 발명의 실험예 1에서 얻은 라이소PC(20:3)의 스펙트럼이 일치하므로, 본 발명의 바이오마커가 정확함을 확인할 수 있다.

Claims (9)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 대상자로부터 채취한 혈액에서 라이소PC(lysophosphatidycholine)(18:0), 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:0), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 생체 대사체 레벨(level)을 초고속액체크로마토그램-질량분석기(ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-offlight mass spectrometry; UPLC-QTOF-MS)로 확인하는 단계;및
    상기 단계에서 확인한 혈액내 생체 대사체 레벨을 정상 대조군의 혈액의 상기 생체 대사체 레벨과 대비하는 단계;를 포함하고,
    상기 생체 대사체의 레벨을 대비하는 단계에서, 상기 대상자의 라이소PC(20:3), 지방산(16:1), 지방산(18:1), 지방산(18:2) 및 지방산(22:6) 중 하나 이상의 혈중 레벨이 정상 대조군에 비해 높으면 심혈관 질환이 있다고 진단하고, 상기 대상자의 라이소PC(18:0) 및 지방산(18:0) 중 하나 이상의 혈중 레벨이 정상 대조군에 비해 낮으면 심혈관 질환이 있다고 진단하는 단계를 더 포함하는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서,
    상기 심혈관 질환은 심근경색(myocardial infarction) 및 상기 심근경색 발생 이전 증상인 불안정 협심증(unstable angina) 중 하나 이상을 포함하는 심혈관 질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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