KR101051470B1 - 급성 심근경색 진단킷트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 급성 심근경색 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 관상동맥 환자 중에서도 심근경색 환자의 혈청에서만 특이적으로 일어나는 변화인 고밀도지단백질(HDL) 또는 저밀도지단백질(LDL)에서의 중성지방 농도 증가, HDL에서의 콜레스테롤 농도 감소, 인터루킨-6, CETP(CHOLESTERYL ESTER TRANSFER PROTEIN), apo(apolipoprotein) C-Ⅲ를 바이오마커로 사용하여 관상동맥질환이 심근경색으로 진행하는지의 여부를 예측 판단할 수 있는 급성 심근경색 진단킷트에 관한 것이다.

Description

급성 심근경색 진단킷트{Diagnostic tools for acute myocardial infarction}

본 발명은 급성 심근경색 진단킷트에 관한 것이다.

심근경색증(myocardial infarction)은 4, 50대 성인 돌연사의 원인 1위를 차지하는 치명적인 질환이고 날로 증가하는 추세이다. 허혈성 심장질환 중에서도 안정성 협심증과는 병태생리가 다르고 임상적 예후도 다르다. 안정성 협심증의 경우 반복적이며 특징적인 흉통으로 또는 통상적인 운동부하검사로 병을 예측 진단하고 치료할 수 있으나, 심근경색의 경우에는 소위 취약성 경화반(vulnerable plaque)이 갑자기 파열되어 관상동맥의 혈전성 폐색으로 임상 증상이 발현되는 경우이므로 통상적인 진단방법이나 혈청지질이나 현재까지 알려진 바이오마커 변화로는 예측이 불가능하다. 이러한 취약성 경화반을 찾을 수 있는 방법은 현재로서는 혈관 내 심초음파방법을 이용하는 등 침습적 방법뿐이다. 따라서, 발병 전에 이러한 변화를 예측할 수 있는 바이오마커가 없기 때문에 조기 진단이 매우 어려운 질환이라고 할 수 있다.

심근경색은 심장의 관상동맥 혈관내강이 콜레스테롤과 임파구의 괴사덩어리인 동맥경화반의 축적과 성장으로, 병변이 성장하면서 혈관내강이 좁아져 생기는 관상동맥질환(협심증 등)으로부터 유래되나, 병변의 섬유성막(fibrous cap)이 매우 불안정하여 쉽게 병변의 파열(rupture)이 일어나고 혈전의 형성이 일어나 혈관의 내강이 완전히 막히는 현상(thrombosis)으로 인하여 생긴다. 일단 심근경색이 발생하면 그 혈관의 하위지점에 있는 근육들은 산소와 영양이 공급되지 않아 심장근육의 괴사가 일어난다. 따라서, 심근경색은 죽상경화로 시작되어 장기적으로 진행 발병하나, 병변이 안정적으로 형성되어 섬유성막이 쉽게 파열되지 않는 협심증(angina pectoris)과 달리, 병변의 형성과 파열이 매우 쉽게 진행되는 취약성 동맥경화반(vulnerable plaque)의 형성이라는 점에서 혐심증과 차이가 있다.

특히, 한국인에게서 자주 볼 수 있는 심근경색의 특징은 미국이나 유럽의 환자들과 달리, 콜레스테롤 혈중농도가 높지 않거나(240 mg/dL 미만), HDL-콜레스테롤이 낮지 않은(40 mg/dL 이상) 심근경색증 환자들이 많고, 병변의 크기가 작은데도 불구하고, 병변 파열이 쉽게 일어나는 등 조기 진단에 어려움이 많아, 조기 진단 예측이 가능한 새로운 바이오마커가 절실히 필요하다. 따라서, 만성 관상동맥질환이 급성 심근경색으로 진행하는지의 여부와, 동맥병변의 크기가 작다고 할지라도 쉽게 파열되는 취약성 동맥경화반의 형성여부와 쉽게 파열될지의 진행여부를 조기에 진단 예측하는 것이 환자의 생명을 구하는데 매우 중요하다.

심근경색의 진단은 바이오마커 단백질의 증가를 측정하는 효소적 방법과 혈관내 심초음파(intravascular ultrasound, IVUS)나 관상동맥 조영술 등의 침습적 방법과 병행 사용하여 확진하므로, 심도자를 혈관으로 삽입하기 위해 환자를 마취해야 하는 등의 불편함 때문에 통증 발생 이전에는 조기 진단이 사실상 불가능하고, 현재 사용되고 있는 바이오마커들(GOT, LDH, CK-MB, troponin I, troponin T)은 심근경색에만 특이적이지 않거나 심근경색의 발생 이후에야 진단할 수 있는 마커들이므로, 심근경색에 특이적이면서도, 심근경색 발생 이전에 변화를 측정하고 발생을 예측할 수 있는 마커가 절실히 필요하다.

관상동맥질환의 발생 원인에는 여러 가지 학설이 제기되고 있으나, 관상동맥 혈관내벽에 콜레스테롤을 많이 함유하는 산화된 LDL과 대식세포의 괴사덩어리(일명 거품세포)들이 오랜 세월동안 축적되고 성장하면서, 동맥병변 혹은 동맥경화반 (atherosclerotic plaque)을 형성하고, 노화와 면역 염증의 진행과 함께 동맥경화반이 점차 커져, 동맥내강을 막으면서 협심증으로 진행하며, 혈관의 막힘이 심해짐과 동시에 동맥경화반이 터져(rupture) 혈전 형성(thrombosis)이 일어나게 되면 하위 혈관의 심근이 산소와 영양부족으로 근육 괴사가 일어나게 된다. 현재 사용하고 있는 심근경색의 진단 방법은 심근근육의 괴사를 사후에 알려주는 지표단백질(troponin I와 troponin T)이므로 발병 후에 진단이 가능하다. 그러나, 불행히도 동맥경화반의 성장과 혈관 내강의 막힘 정도를 예측할 수 있는 바이오마커는 없고, 혈청 콜레스테롤 수치와 LDL-콜레스테롤의 수치가 높은 것을 위험인자로 사용 참고하는 정도이다.

관상동맥질환이 진행하면서 병변의 크기가 증가되어 동맥 내강의 75% 이상을 막으면 협심증의 증세를 보이는데, 협심증은 다시 증가된 병변의 캡(cap)이 안정되게 유지되는 안정형 협심증(stable angina)과 불안정형 혐심증(unstable angina)으로 나뉜다. 불안정형 협심증은 병변의 크기가 상대적으로 작아도, 동맥경화반이 파열(rupture)될 수 있는 확률이 높기 때문에 안정성 협십증과는 병태생리가 다른 매우 위험한 질환이다. 따라서, 안정형 병변을 불안정형으로 변하게 하는 원인을 알아내기 위한 연구가 활발히 진행 중이며, 그러한 변화를 조기에 예측할 수 있는 바이오마커의 개발은 임상에서 심근경색환자의 조기 발견에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

죽상경화(atherosclerosis)가 관상동맥질환의 근원적인 원인이 되고, 죽상경화는 LDL-콜레스테롤이 증가하면서 더욱 악화되고, HDL-콜레스테롤이 증가하면서 호전되는 것으로 잘 알려져 있다. 게다가 중성지방이 풍부한 지단백질들이 증가하는 것이 죽상경화를 악화시키는 것으로 보고되고 있으며(Circulation 2002;106:2137-2142), 염증 지표의 증가가 죽상경화 및 관상동맥질환을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, 관상동맥질환 중에서도 심근경색과 협심증의 위험성을 특이적으로 판별할 수 있는 바이오마커는 아직 문헌상에 보고되거나 특허 출원된 바 없다.

심혈관 질환 중에서 가장 만성적이고, 조기 진단이 어려운 질환이 관상동맥질환이고 그 중에서도 허혈성 심근경색은 특히 발병 시 목숨을 위협하는 중대한 질병이면서도 조기 진단을 할 수 있는 바이오마커가 개발되어 있지 않다.

이에, 현재까지는 심근경색증 발병 후의 바이오마커를 사용하거나, 심전도 측정 혹은 침습적인 관상동맥 조영술의 사용으로 환자의 불편이나 비용적인 면에서 매우 불리하였으므로, 본 발명자들은 간편하고 빠르게 심근경색의 발병을 예측할 수 있는 진단킷트를 제공하기 위한 바이오마커를 찾기 위하여 관상동맥질환자 중에서도 협심증 환자군과 심근경색 환자군의 혈청과 지단백질의 각종 리피드와 단백질 지표를 비교한 결과, 고밀도지단백질(HDL) 또는 저밀도지단백질(LDL)에서의 중성지방 농도 증가, HDL에서의 콜레스테롤 농도 감소, 인터루킨-6, CETP, apoC-Ⅲ이 협심증과 심근경색의 진단을 차별화시킬 수 있는 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 심근경색으로의 전이를 쉽게 예측 진단 가능하게 하는 진단킷트를 제공하고 있다.

본 발명은 고밀도지단백질(HDL) 또는 저밀도지단백질(LDL)에서의 중성지방 농도 증가, HDL에서의 콜레스테롤 농도 감소, 인터루킨-6, CETP, apoC-Ⅲ를 바이오마커로 이용한 급성 심근경색 진단킷트를 그 특징으로 한다.

본 발명은 관상동맥질환자 중에서 치명적이면서도 조기 진단이 어려웠던 심근경색 환자의 특이적 바이오마커를 밝혀냄으로써 심근경색으로의 전이를 쉽게 예측 진단할 수 있는 바, 심근경색의 정확한 조기 진단이 가능하고, 침습적 방법의 사용에 따른 환자의 불편을 최소화하는 것이 가능하여, 막대한 경제적, 사회적 기여 효과가 기대된다.

도 1은 환자군으로부터 파라옥시나제(paraoxonase) 활성의 측정한 결과이다.
도 2는 환자군으로부터 레시틴 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(lecithin:cholesterol acyltransferase)의 활성 비교를 나타낸 것이다.
도 3은 지단백질에서의 CETP 단백질 검출을 나타낸 것이다.
도 4는 지단백질 분획에서 apoC-Ⅲ 단백질의 발현 패턴을 나타낸 것이다.
도 5는 환자군 간의 LDL 산화정도 비교한 것이다.
도 6은 환자 LDL의 이동상을 비교한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 관상동맥 환자 중에서도 심근경색 환자의 혈청에서만 특이적으로 일어나는 변화인 고밀도지단백질(HDL) 또는 저밀도지단백질(LDL)에서의 중성지방 농도 증가, HDL에서의 콜레스테롤 농도 감소, 인터루킨-6, CETP, apoC-Ⅲ를 바이오마커로 사용하여 관상동맥질환이 심근경색으로 진행하는지의 여부를 예측 판단할 수 있는 급성 심근경색 진단킷트에 관한 것이다.

본 발명에서는 2007년 1월부터 6월까지 영남대학교 부속의료원 순환기내과에 흉통과 동통을 호소하며 내원한 환자들 중 관상동맥 조영술과 혈청 검사로 확진받은 남자 협심증 환자들(n=14)과 남자 심근경색 환자들(n=5)을 선발하여 연구 참여의 서면동의를 받고, 혈액을 채취하여, 혈액과 지단백질 분획을 분석, 비교하여 심근경색 환자가 갖는 고유한 바이오마커와 특성을 찾고자 연구를 수행하였다.

사용한 실험방법은 다음과 같다.

1. 혈청의 효소적 특성, 리피드 성분의 조성 비교

2. 혈청의 염증 바이오 마커분석

3. 혈청으로부터 초원심분리를 통해 지단백질 분획의 분리

4. 분리된 지단백질 분획들(VLDL, LDL, HDL₂, HDL₃)의 리피드 조성 분석

5. 지단백질 분획들의 효소활성 비교. LCAT (lecithin:cholesterol acyltransferase), CETP (cholesteryl ester transfer protein), PON (paraoxonase), Lp-PLA2 (lipoprotein-associated phospholipase A2)활성 분석

6. 웨스턴 블랏팅을 이용한 지단백질 분획들의 단백질 발현 분석

이러한 실험을 거쳐 본 발명자들은 고밀도지단백질(HDL) 또는 저밀도지단백질(LDL)에서의 중성지방 농도 증가, HDL에서의 콜레스테롤 농도 감소, 인터루킨-6, CETP, apoC-Ⅲ이 협심증과 심근경색의 진단을 차별화시킬 수 있는 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명은 검체의 혈청으로부터 인터루킨-6의 양을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)법을 수행하여 검출하는 급성 심근경색 진단킷트를 그 특징으로 한다.

특히, 심근경색 환자의 경우에는 상기 인터루킨-6의 양이 10 pg/ml 이상으로 나타나 협심증과 차별화된 수치를 보였다.

또한, 혈청 내 지단백질(lipoprotein)을 분획 시 밀도를 d < 1.019 g/mL 로 조정하여 초원심분리하고 남은 분획에 대해 밀도(g/mL）를 1.019 < d < 1.063으로 조정하여 LDL을 분리하고, 남은 분획의 밀도(g/mL）를 1.063 < d < 1.125로 조정하여 HDL₂를 분리하고, 다시 남은 분획에 대하여 밀도(g/mL）를 1.125 < d < 1.225 조정하여 HDL₃을 분리하였다.

상기 지단백질의 분획물을 전기영동 후에 분획물에 대한 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질(CETP) 또는 apoC-Ⅲ 단백질의 발현을 확인하여 심근경색의 바이오마커로 사용될 수 있음을 확인하였다. 지단백질의 분획물 중 LDL 혹은 HDL₃이 더욱 바람직하다.

따라서, 본 발명은 콜레스테롤 에스테르 전이 단백질(CETP) 또는 apoC-Ⅲ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 급성 심근경색 진단킷트를 또 다른 특징으로 한다.

상기 단백질은 웨스턴 블랏팅(Western blotting)법을 수행하여 발현되며, 상기 CETP에 특이적으로 결합하는 항체로는 CETP 단백질의 아미노 말단 혹은 카르복실 말단에 결합할 수 있는 다중클론 항체 혹은 모노클론 항체로서 상업적으로 구입 가능한 제품이면 무방하며, 본 발명에서는 ABcam 사(영국)의 다중클론 항체(Ab19012-100)를 사용하였다. 또한, apoC-Ⅲ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체로는 apoC-Ⅲ 단백질의 아미노 말단 혹은 카르복실 말단에 결합할 수 있는 다중클론 항체 혹은 모노클론 항체로서 상업적으로 구입 가능한 제품이면 무방하며, 본 발명에서는 Chemicon 사 (미국)의 다중클론 항체(AB821)를 사용하였다.

또한, 본 발명은 검체 혈청의 고밀도지단백질２(HDL₂) 분획에서의 중성지방 농도 증가와 콜레스테롤 농도 감소 및 저밀도지단백질(LDL) 분획에서의 중성지방 농도 증가가 심근경색의 진단 마커로서 사용될 수 있음을 확인함으로써 상기 마커를 이용한 급성 심근경색 진단킷트를 포함한다.

검체 혈청의 HDL₂ 분획에서 중성지방 농도가 혈청자동분석기(Electa biochemical analyzer, Italy) 혹은 중성지방 농도 측정　킷트(TG-S, 아산제약AM157S-K)를 통하여 62 ~ 80 mg/dL 로 측정되어 관상동맥질환의 하나인 협심증에서의 HDL₂ 중성지방 농도에 비해 월등히 증가된 수치임을 확인할 수 있었다.

또한, 검체 혈청의 LDL 분획에서 중성지방 농도가 혈청자동분석기(Electa biochemical analyzer, Italy) 혹은 중성지방 농도 측정　킷트(TG-S, 아산제약AM157S-K) 을 통하여 185 ~ 305 mg/dL로 측정되어 관상동맥질환의 하나인 협심증에서의 중성지방 농도에 비해 월등히 증가된 수치임을 확인할 수 있었다.

또한, 검체 혈청의 HDL₂ 분획에서 콜레스테롤 농도가 혈청자동분석기(Electa biochemical analyzer, Italy) 혹은 총콜레스테롤 측정　킷트(Total cholesterol, 아산제약 AM202-K)를 통하여 46 ~ 58 mg/dL로 측정되어 관상동맥질환의 하나인 협심증에서의 콜레스테롤 농도에 비해 월등히 감소된 수치임을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 관상동맥질환자 중에서 치명적이면서도 조기 진단이 어려웠던 심근경색 환자의 특이적 바이오마커를 밝혀냄으로써 심근경색으로의 전이를 쉽게 예측 진단할 수 있는 바, 심근경색의 정확한 조기 진단이 가능하고, 침습적 방법의 사용에 따른 환자의 불편을 최소화하는 것이 가능하여, 막대한 경제적, 사회적 기여 효과가 기대된다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 환자 혈청의 리피드 프로필 분석

환자의 혈액을 EDTA가 포함된 진공채혈관(Beckton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)을 통해 분리하였고, 저속원심분리(6000 g)를 통해 혈청을 분리하였다. 이들 환자들의 혈액 리피드와 주요 바이오마커의 프로필은 다음 표 1과 같고, 분석기기는 화학 분석기(Chemistry analyzer) AU4500(Olympus, Japan)을 사용하였다.

[표 1]

상기 표 1에서 보는 바와 같이 심근경색 환자군과 협심증 환자군은 비만지수(body mass index, BMI 수치)나, 혈중 LDL-콜레스테롤(LDL-C), HDL-콜레스테롤(HDL-C), 글루코오스의 농도는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 그러나, 심근경색 환자군은 협심증 환자에 비해 혈중 총 콜레스테롤의 농도가 24% 증가하였고, TG의 농도가 30% 증가하였고, HDL-콜레스테롤이 총 콜레스테롤 내에서 차지하는 비율이 30 ± 2%에서 25 ± 3%로 낮아져 있었다. 그러나, 심근경색 환자군의 총콜레스테롤 농도는 미국 심장재단(American Heart Association)의 권고기준인 NCEP (National cholesterol education program)-Adult treatment panel(ATP)-Ⅲ)에서 정한 고콜레스테롤 혈증의 기준(혈청농도 240 mg/dL 이상) 보다 높지 않아 혈청 콜레스테롤의 농도, 혹은 LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 농도가 심근경색의 진단마커로 사용되기에는 한계가 있음을 보여준다. 심근경색 환자의 중성지방 농도는 NCEP-ATP-Ⅲ의 권고기준(150 mg/dL) 보다 높은 값(175 ± 49 mg/dL)을 보여주었다. 또한, 혈당 수치도 협심증과 심근경색 환자군 간에 유의적인 차이를 보여주지 않았다.

실험예 2: 환자 혈청의 단백질, 효소량 분석

환자들의 염증 지표 단백질과 간기능 지표 단백질을 자동혈청 분석기와 ELISA 킷트를 구입하여 정량하였다.

자동혈청 분석기를 사용한 검사결과, 심근경색 환자들의 경우 협심증 환자들 보다 GOT, LDH의 수치가 수배 높고, 트로포닌(Troponin) I(Dimension Expand 사, Dade Behring, Deerfield, IL, USA)와 트로포닌 T(Elecsys 2010, Hitachi, Tokyo, Japan), CK-MB(Dimension Expand 사, Dade Behring, Deerfield, IL, USA) 값들이 수백 배 이상 높아 전형적인 허혈성 심근 괴사의 결과 양상을 보여주었다.

최근에 와서 각광 받는 염증지표 중의 하나인 MPO(myeloperoxidase)의 혈청 내 농도를 측정하기 위해 ELISA 킷트(Immunology Consultants Lab, Cat # E-80PX, Newberg, OR, USA)를 사용하여 측정한 결과, 심근경색 환자와 협심증에서 모두 두배 이상 높게 검출되어 관상동맥질환의 발생과 진행에 MPO의 역할이 크다는 것을 알 수 있었지만 심근경색 마커로서의 특이적 증가는 보이지 않았다.

급성 염증지표 중의 하나인 혈청 내 SAA(serum amyloid A)의 농도를 ELISA 킷트(Biosource cat #KNA0012, Camarillo, CA, USA)로 측정한 결과 심근경색 환자와 협심증 환자 모두 50 ~ 60 mg/L 범위의 값을 보여 정상수치(6 ~ 15 mg/dL) 보다 수배 높은 값을 보여주었다. 이는 SAA도 관상동맥질환의 특이적인 지표가 될 수 있으나, 심근경색의 특이적 지표는 될 수 없음을 보여준다.

실시예 1: 인터루킨( IL )-6의 양 검출

상기 실험예 2에서와 다른 염증지표인 인터루킨(IL)-6의 양을 ELISA 킷트(R&D systems, human quantikine IL-6, cat# D6050)로 검출하였다.

IL-6 항체(1차 항체)가 바닥에 코팅된 96 웰 플레이트를 사용하여 혈청 시료 0.1 mL을 반응 시약 0.1 mL 과 혼합하여 넣은 후 2시간 동안 반응시키고, 세척시약을 사용하여 항체에 결합하지 않은 혈청시료의 단백질을 모두 세척하였다. 1차 항체에 특이적인 결합을 하는 2차 항체(발색효소가 결합된 항체)를 0.2 mL 넣어 결합하도록 2시간동안 반응시켰으며, 반응 후 세척시약으로 결합하지 않은 2차 항체를 모두 세척하였다. 세척 후에 발색효소의 기질용액을 첨가하여 20분간 발색을 유도하고, 450 nm의 빛에 대한 흡광도를 표준물질의 흡광도와 비교 분석하여 IL-6의 양을 정량하였다. 그 결과, 협심증 환자의 값(6.6 ± 5.4 pg/mL) 보다 심근경색 환자의 값(15.6 ± 4.1 pg/mL)이 현저히 높아, IL-6 농도 증가가 심근경색에 특이적임을 알 수 있었다. 이는 정상인의 IL-6 농도가 3 pg/mL 보다 낮은 것에 비교한다면, 관상동맥질환자의 염증 반응이 심근경색 환자군에서 더욱 증가하는 것으로 사료된다.

실험예 3: 혈청 요산의 정량

환자들의 요산을 Caraway의 방법[Caraway WT. Determination of uric acid in serum by a carbonate method. Am JClin Pathol 1955;25:840-845.]에 따라 실시하여 비교한 결과, 심근경색 환자와 협심증 환자 간의 유의적인 차이는 없었으며, 심근경색과 협심증 환자군 모두 정상범위의 요산 농도(2 ~ 7 mg/dL)를 보여주었다.

[표 2]

실시예 2: 지단백질의 리피드 -단백질 조성 변화

본 발명자의 선행논문에 개시된 방법[Eur . J. Clin . Invest. 2007;37:249-256]에 따라 모든 환자의 혈청을 염화나트륨(NaCl)으로 혹은 포타슘 브로마이드(KBr)로 밀도를 조정한 후 각각 초원심분리(100,000 g, Hitachi Co, Himac CP90a, Tokyo, Japan)를 24시간 동안 실시하였다. VLDL(very low density lipoprotein)을 분리하기 위해 혈청의 밀도를 d <1.019 g/mL로 조정하여 초원심분리하고 남은 분획에 대해 밀도(g/mL)를 1.019 < d < 1.063으로 조정하여 LDL을 분리하였고, 남은 분획의 밀도(g/mL)를 1.063 < d < 1.125로 조정하여 HDL₂ 분획을 분리하였고, 다시 남은 분획에 대하여 밀도(g/mL)를 1.125 < d < 1.225 조정하여 HDL₃분획을 분리하였다.

각각 분리된 지단백질들을 PBS 버퍼를 사용하여 24시간 동안 투석하여 염을 제거하고, 콜레스테롤, 중성지방, 단백질을 정량하였다. 그 결과는 다음 표 3과 같이 VLDL 분획에서는 콜레스테롤 중성지방, 단백질의 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, LDL 분획에서는 심근경색 환자군에서 현저히 증가된 콜레스테롤, 중성지방, 단백질의 조성을 보였다. HDL₂ 분획에서는 심근경색 환자군의 경우 콜레스테롤의 농도가 오히려 감소하였고, TG 농도는 증가하였다. HDL₃ 분획에서도 심근경색 환자군의 콜레스테롤의 농도가 감소하였고, 중성지방의 농도는 유의적 차이가 없었다.

본 발명에서 예시된 바(실시예 1, 표 1)와 같이, 혈청에서의 TG 증가는 심근경색 환자의 중요한 특징이었고, 이는 혈청 TG 증가는 관상동맥질환의 증가와 비례한다는 최근의 보고와 잘 일치하였다[J. Am. Med Assoc. 2007;298:336-338, J. Am. Med Assoc. 2007;298:299-308; J. Am. Med Assoc.2007;309-316]. 더욱이, 이 결과들은 2004년 circulation 지에 발표된 바와 같이 아시아-태평양지역의 심혈관 질환자들의 위험도와 혈청 중성지방의 증가는 비례한다는 보고[Circulation 2004; 110:2678-2686]와도 잘 일치하고 있다.

본 발명에서는 관상동맥질환자 중에서도 특히 심근경색 환자들에게서 중성지방의 농도가 더욱 증가하며, 심근경색 환자의 혈청 내에서도 특히 LDL과 HDL에 TG의 농도가 증가함을 보여주어, 이를 진단 킷트의 제작에 응용할 수 있다. 혈청 TG의 증가는 혈관 염증을 악화시킨다는 정비례한다는 최근의 보고들[Circ Res 2007;100:381-390, Circ Res 2007;100:299-301]과, 관상동맥질환은 동맥경화로부터 시작되며, 동맥경화는 고지혈증과 면역 염증 반응의 악화가 주요 원인으로 작용함은 잘 알려져 있다. 심근경색 면역 염증을 완화 혹은 억제하는 것으로 알려진 HDL의 긍정적 기능이 부정적으로 변화하는 것이 HDL의 콜레스테롤의 감소와 TG의 증가와 연관있다는 것을 제시하고 있다. 따라서, HDL-콜레스테롤의 감소 혹은 HDL-TG의 증가를 심근경색의 진단마커로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.

[표 3]

실험예 5: 혈청과 HDL ₂ , HDL ₃ 을 사용한 파라옥사나제 활성 분석( paraoxonase assay )

환자들의 혈청 10 ㎕, 혹은 HDL₂(1 mg/ml)와 HDL₃ 분획(2 mg/mL)을 사용하여 Eckerson 등의 방법(Eckerson HW, Wyte CM, La Du BN. The human serum paraoxonase/arylesterase polymorphism. Am J Hum Genet. 1983;35:1126-1138)과 본 발명자들의 선행논문[Cho KH, Park JE, Kim YO, Choi I, JJ Kim, JR Kim. (2008) The function, composition, and particle size of high-density lipoprotein were severely impaired in an oliguric phase of hemorrhagic fever with renal syndrome. Clin Biochem.2008;41:56-64]에 따라 파라옥사나제 분석을 실시하였다.

그 결과, 도 1과 같이 HDL₃을 사용하여 파라옥사나제의 활성을 측정하였을 경우 심근경색 환자와 협심증 환자 모두 현저한 활성 감소를 보여 HDL의 항산화 활성이 매우 감소하였음을 알 수 있었다. 그러나, 관상동맥질환자 군에서 모두 현저한 감소를 보여 심근경색의 특이적인 마커로 사용하기에는 한계가 있음을 알 수 있었다.

실험예 6: HDL ₃ 을 사용한 LCAT 의 활성 변화

환자들의 HDL₃을 효소원으로 하고 방사능 동위원소가 표지된 [¹⁴C]-콜레스테롤을 사용하여 본 발명자들의 선행논문[J. Lipid Res . 2005;46:589-596]에 따라, LCAT의 활성을 비교하였다.

그 결과는 도 2와 같이 모든 관상동맥질환자들에게서 LCAT의 활성이 대조군보다 낮아있음을 알 수 있었다. 이는 HDL의 TG 증가와 연관있는 것으로 해석되며, HDL의 항산화 기능을 담당하는 주요한 효소인 LCAT이 관상동맥 질환자들에게서는 결핍되었음을 보여준다. 따라서, LCAT 활성의 감소를 심근경색의 특이적인 마커로 사용하기에는 한계가 있는 것으로 보인다.

실시예 7: CETP 활성의 측정

본 발명자의 선행 논문[Biochim . Biophys . Acta 1391:133-144]에 따라 [³H]-콜레스테릴 올레이트(Cholesteryl oleate)를 포함하는 재조합 HDL([³H]-CE-reconstituted HDL)을 합성하여 CE-공여체로 사용하고, 혈청과 VLDL, LDL, HDL₂, HDL₃을 각각 CETP 단백질원으로 처리하고, 사람 LDL(2 mg/mL)을 CE-수용체로 사용하여 6시간 동안 반응시킨 후, 수용체 LDL을 분리하여 방사능량을 신틸레이션 계수(scintillation counting)로 측정하여, CE-공여체로부터 CE-수용체로 전달된 활성을 계산하였다.

그 결과, 다음 표 4와 같이 관상동맥질환자군이 대조군 보다 높은 혈청 CETP 활성을 보여주었다. 그러나, 협심증과 심근경색환자 군 간에는 유의적인 활성 차이가 없었다. 흥미로운 점은 관상동맥질환자 군에서 LDL-CETP 활성이 대조군보다 두 배 이상 높으나 HDL₃-CETP의 활성은 오히려 낮은 활성을 보여주었다. 이는 심근경색 환자군에서 HDL-TG의 증가와 연관하여 HDL의 기능이 감소하는 것과 상관성이 있는 것으로 사료된다.

[표 4]

실시예 3: CETP 단백질의 발현 분석

환자들의 지단백질(lipoprotein) 분획들을 동일 농도(단백질 기준: 2 mg/mL)로 희석하여 10% SDS-PAGE로 전기영동하고, 겔속의 모든 단백질을 Towbin 등의 방법[J Immunol Methods 1984;72:313-340]에 따라 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 옮기고, PVDF 막에 부착된 단백질들 중 CETP의 상대적 발현량을 비교하기 위해 1차 항체인 CETP-다중클론 항체(Abcam cat# ab19012)를 1:1000의 부피비율로 사용하고 1차 항체에 특이적인 HRP(horse radish peroxidase)로 컨쥬게이트된 2차 항체(Santa Cruz, SC2004)를 1:2000의 부피비율로 처리하여 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로 분석한 결과, 도 3에서와 같이 LDL 분획과 HDL₃ 분획에서 CETP의 발현량이 상대적으로 증가함을 알 수 있었다.

이 결과는 CETP의 상대적 발현량이 심근경색 환자에서 매우 특이적으로 증가하고 있음을 보여주는 증거이며, 심근경색의 진단 및 예측에 활용될 수 있다.

실시예 4: 혈청 apoC -Ⅲ 단백질의 발현 분석

환자들의 지단백질 분획들을 동일농도(단백질 기준: 2 mg/mL)로 희석하여 15% SDS-PAGE로 전기영동한 후, 겔 속의 모든 단백질을 Towbin 등의 방법[J Immunol Methods 1984;72:313-340]에 따라 PVDF 막으로 옮기고, PVDF 막에 부착된 단백질들 중 CETP의 상대적 발현량을 비교하기 위해 1차 항체인 apoC-Ⅲ-다중클론 항체(Chemicon AB821)를 1:1000의 부피비율로 사용하고 1차 항체에 특이적인 HRP(horse radish peroxidase)로 컨쥬게이트된 2차 항체(Santa Cruz, SC2020)를 1:2000의 부피비율로 처리하여 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 분석 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 apoC-Ⅲ 단백질이 심근경색 환자의 LDL 분획과 HDL₂ 분획에서 특이적으로 발현되는 것을 관찰할 수 있었다.

실시예 5: LDL 의 산화정도 비교

각각 환자들의 LDL이 얼마나 산화되었는지를 측정하기 위해, 같은 농도(2 mg/mL 단백질 기준)의 LDL을 대상으로 산화생성물인 MDA(Malondialdehyde)의 양을 Blois의 방법[Blois MS. Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 1958; 181:1199-1200]에 따라 정량하였다.

그 결과, 도 5에서와 같이 심근경색과 협심증 환자가 대조군 보다 월등한 산화정도를 보였고, 그 중에서도 심근경색 환자가 가장 현저한 증가를(대조군에 비해 92%) 보여주었다.

이들의 LDL 분획을 같은 농도(2 mg/mL)로 희석하여 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동을 실시하여 이동성을 비교한 결과, 도 6과 같이 심근경색 환자군이 협심증 환자군 보다 더 빠른 이동성을 보여주었다. 이 결과는 LDL의 산화가 진행될수록 전하가 증가하여, 겔 상에서 이동성이 빨라진다는 기존의 학설과 잘 일치하며, 심근경색 환자의 염증 지표 효소(GOT) 혹은 싸이토카인(IL-6) 상승과도 잘 일치하였다.

Claims (6)

1. 검체 혈청의 고밀도지단백질2(HDL₂) 분획에서 중성지방 농도를 혈청자동분석기 혹은 중성지방 농도 측정킷트로 측정하여 62 ~ 80 mg/dL(단백질 1 mg 당 0.39 ± 0.05 mg) 범위에 있는지 확인하는 단계를 포함하는 급성 심근경색 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서，상기　고밀도지단백질2(HDL₂) 분획은　혈청　내　지단백질을　분획시　밀도가 1.063 g/mL　보다　크고 1.125 g/mL　보다　작은　것을 특징으로 하는 급성 심근경색 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
   
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