KR20150122842A - 혈장 대사체를 이용한 혈관경직도 예측 또는 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 대상체(subject)로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 얻는 단계; 및 (b) 상기 시료에 있는 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드, 포스파티딜콜린(18:2/18:2) 및 라이소-포스파티딜콜린(18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 심혈관 합병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 심혈관 합병증 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 과체중 대상의 혈장에서 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도는 혈관경직도와 양의 상관관계를 가지고, 라이소-포스파티딜콜린(18:2)은 혈관경직도와 음의 상관관계를 가져 상기 양의 상관관계를 가지는 혈장 대사체의 농도가 높거나, 음의 상관관계를 가지는 혈장 대사체의 농도가 낮으면 혈관경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높다. 따라서 본 발명의 방법은 과체중 대상의 다양한 혈장 대사체의 농도 및 파라미터의 수치를 분석함으로써 혈관경직도를 판단하여 심혈관 합병증에 대한 진단에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.

Description

혈장 대사체를 이용한 혈관경직도 예측 또는 진단 방법{Methods for Predicting or Determining Arterial Stiffness Using plasma metabolites}

본 발명은 혈관경직도와 상관관계를 갖는 혈장 대사체를 이용하여 혈관경직도를 예측하고 심혈관 합병증의 예측 또는 진단하는 방법 및 심혈관 합병증의 진단 키트에 관한 것이다.

체질량지수(BMI) 범주 및 전-원인의 사망률 간의 관계를 조사한 연구들의 최근의 체계적인 검토에 의하여 과체중이 정상 체중에 비해 낮은 사망 위험과 연관되어 있는 반면, 비만은 높은 사망 위험과 연관된 것으로 나타났다(1). 그러나, Borrell 등은 전-원인 또는 심혈관 질환(CVD:cardiovascular disease)-특이적 사망 위험과 관련하여 과체중 성인에 대한 예방 효과를 찾을 수 없었다(2). 또한, McDonough 등은 과체중인 사람들이 정상 체중을 가진 사람들에 비하여 건강 관련된 삶의 질이 낮을 가능성이 20% 이상임을 보였다(3). 이러한 과체중인 사람들에 대한 모순되는 결과는 이전의 연구에서 다루어진 넓은 인종군 또는 연령 범위의 차이가 원인일 수 있다.

성인에서 높은 혈관 경직도가 CVD 위험 증가와 연관되어 있음은 이미 잘 확립되어 있다(4). 중앙 맥파 속도(PWV: pulse wave velocity)로 측정되는 혈관경직도는 CVD와 가장 강력하게 연관되어 있고(5), 성인에서의 심혈관 사망률 및 전-원인의 사망률 모두를 예견한다(6). PWV는 심지어 고혈압이 없는 경우에도 대사성 질환과 연관됨이 보고되었다(7). 또한, 건강한 사람에 대한 여러 연구에서도 BMI 증가에 따른 중앙 및 상완 수축기 혈압과 혈관경직도의 평행적 증가가 보고되었다(8-10). 더불어, 중년 대상에 대한 최근의 후발 연구는 증가된 BMI 및 허리둘레를 가지면서 대사성 질환 존재 시 혈관경직도에서의 연령 관계된 증가가 더 큼을 밝혔다(11). 그러나 과체중 중년에서 대사이상 및 혈관경직도에서 연령 관계된 주요 인자가 무엇인지는 아직 밝혀진바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 중년(40-55세)에서 일정기간 과체중을 유지하는 과체중군의 대사체 프로파일링을 수행하여, 동일한 기간 내 정상 체중을 유지하는 대조군의 대사체 프로파일과 비교하여 혈관경직도와 상관관계를 갖는 혈장 대사체 및 파라미터를 규명하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 과체중군의 경우 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)이 대조군보다 현저히 증가되고, 혈관경직도의 지표인 상완-발목 맥파속도(ba-PWV: brachial-ankle pulse wave velocity)와 양의 상관관계를 가지고; 라이소-포스파티딜콜린(18:2)은 대조군보다 현저하게 감소하고, 락토실세라마이드와 음의 상관관계를 가져 심혈관 합병증의 위험이 높다는 것을 확인하였다. 또한, 과체중군은 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 허리둘레, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA), 글루코오스, 인슐린, 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)의 수치가 대조군보다 현저하게 증가되고, BMI 및 SBP는 상완-발목 맥파속도와 양의 상관관계를 가져 혈관경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높아짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 심혈관 합병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 심혈관 합병증 진단 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 대상체(subject)로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 얻는 단계; 및 (b) 상기 시료에 있는 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드, 포스파티딜콜린(18:2/18:2) 및 라이소-포스파티딜콜린(18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 단계로서, 상기 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도가 대조군 시료의 것보다 증가하거나, 상기 라이소-포스파티딜콜린(18:2)의 농도가 대조군 시료의 것보다 감소하는 경우 혈관 경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높은 것으로 판단하는 심혈관 합병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 중년(40-55세)에서 일정기간 과체중을 유지하는 과체중군의 대사체 프로파일링을 수행하여, 동일한 기간 내 정상 체중을 유지하는 대조군의 대사체 프로파일과 비교하여 혈관경직도와 상관관계를 갖는 혈장 대사체 및 파라미터를 규명하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 과체중군의 경우 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)이 대조군보다 현저히 증가되고, 혈관경직도의 지표인 상완-발목 맥파속도(ba-PWV: brachial-ankle pulse wave velocity)와 양의 상관관계를 가지고; 라이소-포스파티딜콜린(18:2)은 대조군보다 현저하게 감소하고, 락토실세라마이드와 음의 상관관계를 가져 심혈관 합병증의 위험이 높다는 것을 확인하였다. 또한, 과체중군은 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 허리둘레, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA), 글루코오스, 인슐린, 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)의 수치가 대조군보다 현저하게 증가되고, BMI 및 SBP는 상완-발목 맥파속도와 양의 상관관계를 가져 혈관경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높아짐을 확인하였다.

따라서 본 발명은 혈장 대사체의 농도 또는 생화학적 파라미터를 측정함으로써 혈관경직도를 예측하여 심혈관 합병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 심혈관 합병증 진단키트에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 고-LDL-콜레스테롤 질환의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 심혈관 합병증은 고트리글리세라이드혈증, 울혈성 심부전, 심비대증, 부정맥, 관상동맥질환(coronary artery disease, CAD) 또는 심혈관질환을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 관상동맥질환은 심근경색, 안정협심증, 이형(프린즈메탈)협심증, 다른 만성 관상동맥질환, 아테롬성동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군[예컨대, 불안정협심증, NSTEMI(non-ST-elevation myocardial infarction) 또는 STEMI(ST-elevation myocardial infarction)), PAOD(peripheral arterial occlusive disease] 또는 뇌혈관 발작을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 심혈관질환은 울혈성 심부전, 고혈압, 폐동맥고혈압, 심근 및 뇌경색, 아테롬성동맥경화증, 죽종형성, 혈전증, 허혈성 심장질환, 혈관 재협착(post-angioplasty restenosis), 신부전, 심장부종, 신장기능부전(renal insufficiency), 신부종, 간부종, 폐부종, 발작, 일관성 허혈발작, 뇌혈관 장애, 재협착, 고혈압에서 혈압 조절, 혈소판 부착, 혈소판응집, 평활근 세포증식, 의료장치의 이용과 관련된 혈관합병증, 의료장치의 이용에 따른 상처, 폐혈전색전증, 뇌혈전색전증, 혈전정맥염, 저혈소판증 또는 출혈장애를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 대상체(subject)로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 얻는 단계

본 발명에 따르면, 우선 대상체로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 얻는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 대상체는 체질량지수(BMI)가 25 kg/m² 이상인 대상체이다. 하기 실시예에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 대상체는 BMI가 25 kg/m² 이상으로 과체중으로 분류되는 대상체이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 대상체는 체질량지수(BMI)가 25-50 kg/m², 25-40 kg/m², 25-35 kg/m², 25-30 kg/m² 또는 25kg/m² 이상 30 kg/m² 미만이다. 본 발명의 대상체는 포유류에 해당하는 동물을 모두 포함하며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 대상체는 인간이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 대상체의 연령은 35-60세, 38-58세 또는 40-55세이다.

단계 (b): 단계 (a)의 시료에 있는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 단계

단계 (a) 실시 이후, 단계 (a)의 시료에 있는 혈장 대사체의 농도를 측정한다.

본 명세서에서 용어 혈장 대사체는 혈액 기원의 액상 시료로부터 수득한 대사물질을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 혈액 기원은 전혈이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 혈장이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혈장 대사체를 검출하기 위해 전혈을 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 분리, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 대조군은 체질량지수(BMI)가 25 kg/m² 미만인 대상체이다. 하기 실시예에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 대상체는 BMI가 25 kg/m² 미만으로 정상 체중으로 분류되는 대상체이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 대상체는 체질량지수(BMI)가 10 kg/m² 이상 25 kg/m² 미만, 15 kg/m² 이상 25 kg/m² 미만, 18 kg/m² 이상 25 kg/m² 미만 또는 18.5 kg/m² 이상 25 kg/m² 미만이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 대조군의 연령은 35-60세, 38-58세 또는 40-55세이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (b) 이후 체질량지수(BMI), 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 허리둘레, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA), 글루코오스, 인슐린, 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)로 구성되는 군으로부터 선택되는 파라미터를 측정하는 단계 (c)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로, 상기 파라미터의 수치가 대조군에 비하여 증가되는 경우 혈관 경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높은 것으로 판단한다.

본 발명에 따르면, 본 발명자들에 의하여 새롭게 규명된 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드, 포스파티딜콜린(18:2/18:2) 또는 라이소-포스파티딜콜린(18:2) 이외에도 상기 파라미터에 대한 수치가 대조군보다 증가됨을 확인함으로서 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 혈관경직도가 높음에 따른 심혈관 합병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보의 제공이 가능하다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 측정은 기준시점 및 기준시점으로부터 1-10년의 시간 경과 후 측정한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 측정은 기준시점 및 기준시점으로부터 1-7년, 1-5년, 2-5년, 2-4년 또는 3년의 시간 경과 후 측정한다.

본 명세서에서 용어기준시점이란 혈장 대사체 프로파일링(즉, 혈장 대사체 농도의 측정) 또는 상기 파라미터 수치의 측정을 개시하는 특정 시점을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 본 발명의 L-류신, L-옥타노일카르니틴 및 데카노일카르니틴으로 구성된 군으로부터 선택된 혈장 대사체의 농도가 기준시점에서 측정한 농도보다 시간 경과 후 측정한 농도가 증가하는 경우 혈관 경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높은 것으로 판단한다. 하기 실시예에서 증명한 바와 같이, 대조군의 경우 L-류신, L-옥타노일카르니틴 또는 데카노일카르니틴의 농도에 있어 기준시점에서 측정한 농도보다 3년의 시간 경과 후 측정한 농도가 감소함을 알 수 있다(표 2).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 본 발명의 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA), 글루코오스, 인슐린, 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)로 구성되는 군으로부터 선택된 파라미터의 수치가 기준시점에서 측정한 수치보다 시간 경과 후 측정한 수치가 증가하는 경우 혈관 경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높은 것으로 판단한다. 하기 실시예에서 증명한 바와 같이, 대조군의 경우 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA), 글루코오스, 인슐린, 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)의 수치에 있어 기준시점에서 측정한 수치보다 3년의 시간 경과 후 측정한 수치가 감소함을 알 수 있다(표 1).

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (b) 이후 L-발린, L-페닐알라닌, 라이소-포스파티딜콜린(14:0), 라이소-포스파티딜콜린(16:0), 라이소-포스파티딜콜린(18:0), 라이소-포스파티딜콜린(20:3), 라이소-포스파티딜콜린(22:6) 및 포스파티딜콜린(18:0/20:4)로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 L-옥타노일카르니틴의 변화는 L-류신, L-페닐알라닌 또는 데카노일카르니틴의 변화와 양의 상관관계가 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 락토실세라마이드의 변화는 데카노일카르니틴의 변화와 양의 상관관계가 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 락토실세라마이드의 변화는 L-발린, 라이소-포스파티딜콜린(14:0, 16:0, 18:0, 18:2, 20:3 또는 22:6) 또는 포스파티딜콜린(18:0/20:4)의 변화와 음의 상관관계가 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 L-발린의 변화는 HOMA-IR의 변화와 양의 상관관계가 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 L-류신의 변화는 HOMA-IR의 변화와 양의 상관관계가 있다.

심장은 동맥을 수축시켜서 혈액이 순환할 수 있는 펄스 또는 에너지를 발생시키며, 노화 및 아테롬성동맥경화증으로 인해 동맥은 경직된다. 사망의 주된 원인들 중 심근경색 및 뇌졸중(stroke)은 모두 아테롬성동맥경화증의 직접적인 결과이다. 증가된 혈관경직도는 심혈관질환의 증가된 위험도와 관련되어 있다. 이러한 혈관경직도를 측정하는 방법은 크게 3가지로 분류할 수 있다: (a)유순도(compliance), 혈관 한 부위의 경직도 측정; (b) 맥파속도(pulse wave velocity, PWV), 혈관 한 부분의 경직도 측정(예컨대, 대동맥, 상지 또는 하지); 및 (c) 맥파 파형분석(pulse wave analysis, PWA), 전신 혈관경직도를 측정.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혈관경직도는 상완-발목 맥파속도(brachial-ankle pulse wave velocity)에 의해 측정된다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 측정된 상완-발목 맥파속도에 의해 측정된 혈관경직도는 심혈관 합병증의 위험인자이다.

본 명세서의 용어 “맥파속도(pulse wave velocity, PWV)”는 혈관을 따라 이동하는 맥파의 전달 속도를 의미하며, 혈관 부분(segment) 간의 경직도를 나타낸다. 일반적으로 인간 대동맥의 맥파속도는 약 5 m/s에서 >15 m/s이다. 대동맥 PWV의 측정을 통해 혈관경직도를 예측 또는 진단할 수 있다. 증가된 대동맥 PWV 는 심혈관질환[예를 들어, 신부전(Blacher et al., Circulation. 1999; 99: 24342439), 고혈압(Laurent et al., Hypertension. 2001; 37: 12361241), 당뇨병(Cruickshank et al., Circulation . 2002; 106: 20852090)등]의 높은 위험도를 나타냈다. 최근의 연구 결과에 따르면, 상완-발목 맥파속도는 대동맥 PWV와 연관성을 보였다(Yamashina A et al., Hypertens Res, 25: 359-364. 2002). 따라서, 본 발명에서는 상완-발목 맥파속도(branchial-ankle pulse wave velocity, baPWV)를 측정하였다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c) 이후 허리 엉덩이 둘레 비율을 측정하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 상완-발목 맥파속도의 변화는 허리둘레, 허리 엉덩이 둘레 비율, 수축기 혈압, 체질량지수, 트리글리세리드 또는 혈청 고민감성 C-반응 단백질 수치의 변화와 양의 상관관계가 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 L-옥타노일카르니틴의 변화는 허리 엉덩이 둘레 비율, 총콜레스테롤 또는 유리 지방산 수치의 변화와 양의 상관관계가 있다.

본 명세서에서 용어(혈장 대사체 농도 또는 파라미터 수치의) 증가는 정상 체중을 가지는 대조군의 혈장 대사체 농도, 파라미터 수치 또는 이들의 기준시점 및 시간 경과 후 농도 또는 수치 사이의 변화에 비하여 측정 가능할 정도로 유의하게 농도, 수치 또는 변화 정도가 증가된 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 대조군의 파라미터 수치에 대하여 5%, 7%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 100% 이상 증가된 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 대조군의 혈장 대사체 농도에 대하여 5%, 6%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40% 또는 50% 이상 증가된 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 대상체의 기준시점 및 시간 경화 후의 혈장 대사체 농도 또는 파라미터 수치가 대조군의 기준시점 및 시간 경과 후의 혈장 대사체 농도 또는 파라미터 수치의 음으로의 변화에 대하여 양으로 변화한 경우, 또는 변화도가 1%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% 또는 40% 이상 증가된 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어(혈장 대사체 농도 또는 파라미터 수치의) 감소는 정상 체중을 가지는 대조군의 혈장 대사체 농도, 파라미터 수치 또는 이들의 기준시점 및 시간 경과 후 농도 또는 수치 사이의 변화에 비하여 측정 가능할 정도로 유의하게 농도, 수치 또는 변화 정도가 감소된 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 대조군의 혈장 대사체 농도에 대하여 5% 또는 10% 이상 감소된 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 대상체의 기준시점 및 시간 경화 후의 혈장 대사체 농도 변화도가 10%, 15% 또는 20% 이상 감소된 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)은 3년 후의 VIP(variable importance in the projection) 수치가 1 이상인 혈장 대사체로 대조군과의 차이가 큼을 나타낸다.

또한, 본 발명에 따르면 상완-발목 맥파 속도 변화의 가장 강력한 독립적 예측인자는 기준시점의 체질량지수, 수축기 혈압, L-옥타노일카르니틴 또는 락토실세라미드인바, 혈관경직도의 증가에 따른 심혈관 합병증의 위험의 강장 강력한 혈장 대사체 또는 파라미터는 상기 체질량지수, 수축기 혈압, L-옥타노일카르니틴 또는 락토실세라미드이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드, 포스파티딜콜린(18:2/18:2) 및 라이소-포스파티딜콜린(18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 심혈관 합병증 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 체질량지수(BMI), 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 허리둘레, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA), 글루코오스, 인슐린, 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)로 구성되는 군으로부터 선택되는 파라미터에 대한 정량장치를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도가 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 심혈관 합병증의 위험도를 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 L-발린, 라이소-포스파티딜콜린(18:2)의 농도가 대조군에 비하여 감소되는 경우, 증가된 심혈관 합병증의 위험도를 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혈장 대사체에 대한 정량장치는 크로마토그래피/질량분석기이다.

본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피(ultra performance liquid chromatography, UPLC)이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 질량분석기는 푸리에변환 질량 분석기(FTMS: Fourier Transform Mass Spectrometer)이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, LTQ-오비트랩 MS이다.

본 발명의 혈당 대사체는 다른 이동성에 따라 UPLC에서 각 성분들이 분리되며, 질량분석기를 거쳐 얻어진 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 이용하여 구성 성분을 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 파라미터의 수치가 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 심혈관 합병증의 위험도를 나타낸다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 혈관경직도와 관련된 혈장 대사체를 측정하여 심혈관 합병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 진단 키트를 제공한다.

(b) 본 발명에 따르면, 과체중 대상의 혈장에서 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도는 혈관경직도와 양의 상관관계를 가지고, 라이소-포스파티딜콜린(18:2)은 혈관경직도와 음의 상관관계를 가져 상기 양의 상관관계를 가지는 혈장 대사체의 농도가 높거나, 음의 상관관계를 가지는 혈장 대사체의 농도가 낮으면 혈관경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높다.

(c) 따라서 본 발명의 방법은 과체중 대상의 다양한 혈장 대사체의 농도 및 파라미터의 수치를 분석함으로써 혈관경직도를 판단하여 심혈관 합병증에 대한 진단에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 3년 후 현저하게 변화된 혈장 대사체에 대한 동정을 나타낸다. 도 1a는 기준시점 및 3년 후 정상 체중 대상(n=59)에 대한 PLS-DA 모델로부터의 스코어 플롯을 나타낸다. 도 1b는 기준시점 및 3년 후 과체중 대상(n=59)에 대한 PLS-DA 모델로부터의 스코어 플롯을 나타낸다. 도 1c는 3년 후 정상 체중 및 과체중 대상에 대한 PLS-DA 모델로부터의 스코어 플롯을 나타낸다. 도 1d-1f는 PLS-DA 모델로부터의 공변인[p] 및 신뢰도 관계[p(corr)]에 대한 S-플롯을 나타낸다.
도 2a-2d는 중년 대상에서의 기준시점과 3년 후 사이의 ba-PWV 변화 및 L-옥타노일카르니틴 변화(도 2a), ba-PWV 변화 및 락토실세라미드 변화(도 2b), L-옥타노일카르니틴 변화 및 허리 엉덩이 비율(WHR) 변화(도 2c), L-옥타노일카르니틴 변화 및 및 유리 지방산 변화(도 2d) 간의 상관관계를 나타낸다. 피어슨 상관관계에 의하여 시험하였다. r₀: 전체 인구의 상관계수, r₁: 대조군의 상관계수, r₂: 과체중군의 상관계수.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

실험대상

본 발명은 대한민국 일산의 국민건강보험공단 일산 병원(National Health Insurance Corporation Ilsan Hospital)에서 2009년 1월부터 2012년 2월까지의 기간 동안 3년 간격의 의료 평가를 시행한 118명의 대상(40-55세)을 포함하였다. 본 발명자들은 3년의 기간에 걸쳐 반복 측정 시 과체중(25≤BMI<30 kg/m²) 범위 내를 유지하는 59명의 대상군을 선별하였다. 상기 과체중군을 나이 및 성별을 일치시킨 59명의 정상 체중을 가진 대조군(18.5≤BMI<25 kg/m²)과 비교하였다. 이들이 본 발명에 참여하기 전 모든 참가자들에게 본 연구의 목적에 대하여 상세히 설명한 뒤 동의를 얻었다. NHIC가 지원하는 일산 병원과 연세대학교의 생명윤리심의위원회(Institutional Review Board)가 본 발명의 프로토콜의 윤리적 승인을 하였으며, 이는 헬싱키 선언에 따라 수행되었다.

인체측정학 파라미터, 혈압, 혈액 채취 및 식이섭취 평가

체질량지수(BMI:body mass index, kg/m²) 측정을 위하여 대상의 체중 및 신장을 아침에 의복 및 신발을 미착용한 채로 측정하였다. 서 있는 상태의 대상의 배꼽 레벨에서 정상 호기 후 허리둘레를 측정하였다. 20분의 휴식 후 자동혈압 모니터(TM-2654, A&D, 일본)를 이용하여 앉은 채로 환자의 왼팔에서 혈압을 측정하였다. 12시간의 공복 후, EDTA-처리 튜브 또는 일반 튜브에 정맥혈 표본을 채집하고, 혈장 또는 혈청을 수득하기 위하여 원심분리한 후, 이를 분석 전까지 -70℃에 보관하였다. 반정량적 음식빈도 설문(semi-quantitative food frequency questionnaire) 및 24시간 회상방법을 이용하여 연구 대상자들의 일반적인 식이섭취를 평가하였다. 컴퓨터 지원 영약 분석 프로그램(Computer-Aided Nutritional Analysis Program, CAN-pro 3.0.; 한국영양학회, 대한민국)을 이용하여 3일 동안의 식품 기록을 기반으로 영양분 섭취를 평가 및 계산하였다.

공복혈당, 인슐린 및 인슐린 저항성의 항상성-모델 평가

공복혈당 레벨은 Hitachi 7600 자동분석기(Hitachi Ltd., 일본)를 이용하여 헥소키나아제 방법에 의하여 분석하였다. 인슐린 레벨은 Immuno Nucleo Corporation(Stillwater, 미국)의 시판 키트를 이용하여 방사 면역 측정법(radioimmunoassay)을 이용하여 측정하였다. 인슐린 저항성(IR: Insulin resistance)은 하기 방정식을 이용하여 항상성 모델 평가(HOMA: homeostasis-model assessment)에 의하여 계산하였다: HOMAIR=[공복 인슐린(μIU/mL)×공복혈당(mmol/L)]/22.5.

혈청 지질 및 유리 지방산

효소 분석에 의하여 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드의 공복 레벨을 분석하고, Hitachi 7600 자동분석기를 이용하여 측정하였다. 덱스트란-황산 마그네슘으로 ApoB-함유 리포단백질을 침전시키고, 상등액에서 HDL-콜레스테롤 농도를 효소적으로 측정 하였다. 혈청 트리글리세리드 레벨<400 ㎎/dL인 대상에 대하여, LDL-콜레스테롤 농도를 Friedwald 공식을 이용하여 간접적으로 추정하였다: LDL-콜레스테롤=총 콜레스테롤-[HDL-콜레스테롤+(트리글리세리드/5)]. 혈청 트리글리세리드≥400 ㎎/dL인 대상에 대하여, LDL-콜레스테롤 농도를 직접적으로 측정하였다. 유리 지방산(FFA)는 Hitachi 7600 자동분석기로 효소적 분석[acylCoA 합성효소(acylCoA synthetase)-acylCoA 옥시다아제(ACS-ACOD) 방법]에 의하여 분석하였다.

혈청 고민감성 C-반응 단백질 및 상완-발목 맥파속도(baPWV: brachial-ankle pulse wave velocity) 평가

시판 고민감성 CRP-라텍스(II) X2 키트((Seiken Laboratories Ltd., 일본)를 이용하여 익스프레스 플러스 TM 자동-분석기(Chiron Diagnostics Co., Walpole, 미국)로 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 농도를 측정하였다. baPWV를 이전 공지된 방법(13)에 따라 자동 파형 분석기(model VP-1000; Nippon Colin Ltd., 일본)를 이용하여 측정하였다. 분석을 위하여 왼쪽 및 오른쪽 측면으로부터의 평균 baPWVs을 이용하였다.

전반적(비표적화) 혈장 대사체 프로파일링

시료 준비 및 분석

분석 전, 100 μL 혈장에 80% 아세토니트릴 800 μL를 첨가하고, 혼합한 후 4℃에서 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 N₂로 건조시킨 후 10% 메탄올에 용해시키고, 혼합한 후 4℃에서 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 이후, 상층액을 새로운 바이알로 옮겨 담았다.

고성능 액체 크로마토그래피(UPLC: Ultra performance liquid chromatography)

혈장 추출 시료(7 μL)를 UPLC-LTQ-Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientific, 미국)이 결합된(coupled in-line) Acquity UPLC-BEH-C18 컬럼(2.1 x 50 mm, 1.7 μm; Waters, 미국)에 주입하였다. 상기 주입된 샘플은 0.1% 포름산을 포함한 물로 평형화시켰다. 0.1% 포름산을 포함한 농도구배 아세토니트릴로 0.35 mL/분의 속도로 20분간 시료를 용출시켰다. UPLC(Waters, 미국)를 이용하여 대사체들을 분리한 후, LTQ-Orbitrap-XL(Thermo Fisher Scientific, 미국)으로 분석하였다. 질량 분석기는 ESI-양성 모드로 운영하였다. 스프레이 전압은 5 kV였다. 질소(nitrogen sheath) 가스 및 보조 가스의 유속은 각각 50 및 5(arbitrary units) 였다. 모세관 전압, 튜브-렌즈 전압 및 모세관 온도는 각각 35 V, 80 V 및 370℃로 유지하였다. 오비트랩(Orbitrap) 데이터는 m/z 50-1,000 범위에서 수집하였다. 데이터 품질 대조를 위하여, 4가지 표준 화합물(아세트아미노펜, 설파디메톡신, 테르페나딘 및 레서핀)의 혼합물을 10개의 샘플에 각각 주입하였다. 55-65 eV에서의 충돌-에너지 램프에 의하여 대사체의 MS/MS 스펙트럼을 얻었고, 엑스칼리버 2.1 및 MS 프론티어 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 분석하였다.

데이터 처리 및 대사체 동정

유지시간, m/z 및 이온 강도를 포함하는 모든 MS 데이터는 기기에 통합되어 있는 SIEVE 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 이용하여 추출하고, 출력된 MS 데이터 결과를 매트릭스로 모았다. SIEVE 파라미터는 다음과 같다: m/z 범위 50-1,000; m/z 폭 0.02; 유지 시간 폭(retention time width) 2.5; 및 m/z 저항 0.005. 대사체는 다음의 데이터베이스를 이용하여 검색하였다: ChemSpider (www.chemspider.com), Human Metabolome(www.hmdb.ca), Lipid MAPS(www.lipidmaps.org), KEGG(www.genome.jp/kegg) 및 MassBank(www.massbank.jp). 유지 시간 및 질량 스펙트럼 모두에 기초하여 선택된 대사체들을 표준 샘플과 비교 확인하였다.

통계적 분석

통계적 분석은 SPSS v. 21.0(IBM SPSS statistics 21, 미국)을 이용하여 수행하였다. 통계적 분석을 위하여 왜곡된 변수들을 대수적으로(logarithmically) 변형하였다. 기술적(descriptive) 목적을 위하여, 평균값은 변환되지 않은 값으로 제시하였다. 결과는 평균±표준 오차(S.E.)로 표현하였다. 양측 P-검정값(two-tailed P-value)<0.05을 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 기준시점 및 3년 후 대조군 및 과체중군 간의 임상적 가변성에서의 차이를 Student's 독립 t-테스트를 이용하여 측정하였다. 기준시점 값에 대한 조절에 의하여 두 군간의 변수 차이를 비교하기 위하여 일반적인 선형 모델(General linear model, GLM) 시험을 적용하였다. 각 군에서의 기준시점 및 3년 후 차이를 계산하기 위하여 대응표본 t-테스트(Paired t-test)를 이용하였다. 시간에 따른 변수 간의 관계를 평가하기 위하여 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient) 및 편상관계수(partial correlation coefficient)를 이용하였다. 혈압과 연관된 주요 혈장 대사체를 동정하기 위하여 다중 회귀분석(Multiple regression analysis)을 수행하였다. R 패키지 'fdrtool'을 이용하여 오류 발견률(FDR: false discovery rate) 수정된 q-값을 계산하였다.

SIMCA-P+ 소프트웨어 버전 12.0(Umetrics, 스웨덴)을 이용하여 다변수 통계 분석(Multivariate statistical analysis)을 수행하였다. 첫번째 및 두번째 PLS 요소를 사용하는 스코어 플롯 또는 S-플롯을 가시화함으로써 정상 체중 및 과체중 대상 사이의 차이점을 모델링하기 위한 분류법으로 부분 최소 자승 판별 분석(PLS-DA: Partial least-squares discriminant analysis)을 사용하였다. 모델을 확인하기 위하여, PLS-DA 모델에 7-폴드 확인(7-fold validation)을 적용한 후, 순열 검정(permutation test)(n=200)에 의하여 모델의 신뢰도를 추가적으로 엄격히 확인하였다. R ² Y로 적합도(goodness of the fit)를 정량하고, Q ² Y로 예측능력(predictive ability)을 정량화하였다. 일반적으로, R ² Y는 트레이닝 세트에서 데이터가 수학적으로 얼마나 잘 생성되었는지를 보여주고, 0-1 사이에서 변화한다(1은 모델이 완벽하게 합치합을 의미한다). Q ² Y≥0.5인 모델을 우수한 예측능력을 가지는 것으로 간주하였다.

실험결과

기준시점 및 3년 후의 임상적 특징, 동맥 경직도 및 식이섭취

성별(두 군 모두 남성 29명 및 여성 30명) 및 연령(대조군, 46.3±0.71세; 과체중군, 46.3±0.73세)를 포함하는 기준시점의 특성은 대조군 및 과체중군 간에서 큰 차이를 보이지 않았다. 기준시점에서, 과체중군은 대조군보다 높은 BMI, 허리둘레, 트리글리세리드, FFA, 글루코오스, 인슐린, HOMA-IR 및 hs-CRP를 보였고, 낮은 HDL-콜레스테롤을 보였다(표 1). 유사하게, 3년 후 과체중군은 대조군보다 높은 BMI, 허리둘레, 수축기 및 이완기 혈압(SBP 및 DBP), 트리글리세리드, FFA, 글루코오스, 인슐린, HOMA-IR 및 ba-PWV를 보였고, 낮은 HDL-콜레스테롤을 보였다. 또한, 3년 후 과체중군은 기준시점 값과 비교하여 허리둘레, SBP, DBP, 트리글리세리드, FFA, 글루코오스, 인슐린, HOMA-IR, hs-CRP 및 ba-PWV가 증가함을 보였고, 과체중군에서 상기 허리둘레, SBP, DBP, 트리글리세리드, FFA, 글루코오스, 인슐린, HOMA-IR, hs-CRP 및 ba-PWV의 변화가 기준시점 값에 대하여 조절한 후의 정상 체중군에서의 이들의 변화와 비교하여 현저한 차이를 보였다(표 1). 대조군 및 과체중군의 추정 총 섭취열량은 기준시점에 각각 2,119±41 kcal/d 및 2,272±39 kcal/d였고(p=0.008), 3년 후에는 각각 2,125±38 kcal/d 및 2,283±37 kcal/d이었다(p=0.003). 기준시점 치 3년 후 간의 다량 영양소로부터 획득한 총 열량 섭취의 백분율에는 통계학적으로 현저한 차이가 없었고; 특히 기준시점(대조군, 1/0.85/0.71; 과체중군, 1/0.87/0.77)에서의 다불포화/단일불포화/포화(P/M/S)은 3년 후(대조군, 1/0.82/0.59; 과체중군, 1/0.89/0.60)와 현저한 차이가 없었다. 총 에너지 소비량 또는 흡연 및/또는 음주 환자의 비율도 기준시점과 3년 후 데이터 간에 큰 차이가 없었다(데이터 미기재).

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다. ^∮는 로그 변환 수치에 의하여 시험하였다; P ^a-값은 기준(baseline)시점에서 독립 t-테스트(independent t-test)로부터 도출하였다; P ^b-값은 3년 후 독립 t-테스트로부터 도출하였다; P ^c-값:변화된 값에서 독립 t-테스트로부터 도출하였다; P ^d-값: 기준시점 조정 후 변화된 값에서 독립 t-테스트로부터 도출하였다; ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001은 대응표본 t-테스트(paired t-test)로부터 도출하였다.

UPLC - LTQ - Orbitrap 질량 분석기를 이용한 혈장 대사체 프로파일링

비타겟 대사체 패턴 분석

기준시점 및 3년 후에 수득한 혈장 대사체의 질량 스펙트로미터(MS) 데이터를 PLS-DA 스코어 플롯으로 분석하였다. PLS-DA 스코어 플롯은 다음의 세 군의 조합으로 나타내었다: (1) 기준시점의 정상 체중 및 3년 후의 정상체중(도 1a); (2) 기준시점의 과체중 및 3년 후의 과체중(도 1b); 그리고 (3) 3년 후의 정상체중 및 과체중(도 1c). 혈장 대사체의 두 개-요소 PLS-DA 산점도(scatter plot)는 기준시점에서의 정상체중 및 3년 후 정상체중을 가진 대상을 구분하여 클러스터링하고 분명히 구분됨을 보여준다[R ² X(cum)=0.155, R ² Y(cum)=0.695, Q ² Y(cum)=0.502](도 1a). 순열검정을 사용하여 PLS-DA 모델을 확인하였고, R ² Y 절편은 0.0762이고, Q ² Y 절편은 -0.158로 나타났다. 유사하게, 혈장 대사체의 두 개-요소 PLS-DA 산점도는 기준시점에서의 과체중 및 3년 후 과체중을 가진 대상을 구분하여 보여주었고[R ² X(cum)=0.203, R ² Y(cum)=0.653, Q ² Y(cum)=0.537](도 1b), 순열검정은 0.0642의 R ² Y 절편 및 -0.176의 Q ² Y 절편을 나타냈다. 더불어, 혈장 대사체의 두 개-요소 PLS-DA 산점도는 3년 후 정상체중 및 3년 후 과체중을 가진 대상을 명확히 구분하여 보여주었고[R ² X(cum)=0.197, R ² Y(cum)=0.744, Q ² Y(cum)=0.644](도 1c), 순열검정은 0.0884의 R ² Y 절편 및 -0.152의 Q ² Y 절편을 나타냈다. 기준시점 및 3년 후의 데이터에서 차이를 보이는 대사체를 동정하기 위하여, 도심 스케일링(centroid scaling)을 이용하여 공변인 p(1) 및 신뢰도 관계 p(corr)(1)의 S-플롯을 생성하였다(1d, 1e 및 1f). S-플롯은 두 군을 구분하는 연관자로서 높거나 낮은 p(corr) 값을 나타내는 대사체가 두 군의 구분에 더 관련됨 나타낸다.

혈장 대사체 동정

764개의 혈장 대사체 중, 각 군의 구분에 중요한 역할을 하는 대사체(변수)를 변수중요도척도(VIP: Variable Important in the Projection) 파라미터에 따라 선별하였고, VIP 값>1.0는 샘플군 간의 차이에 높은 연관성을 나타낸다. VIP>1.0를 기준으로 76개의 대사체를 선별하였는데, 이 중 23개는 이미 동정된 것이고, 53개는 알려지지 않은 것이었다. 대조군 및 과체중군 간의 기준시점 대사체에서는 큰 차이가 없었다. 3년 후, 대조군은 다음과 같은 12개의 대사체에서 현저한 감소를 보였다: C14:0, C16:1, C16:0, C17:0, C18:1, C18:0, C20:4, C20:3 및 C22:6를 포함하는 라이소포스파티딜콜린(lysoPCs)(데이터 미기재), PC(16:0/18:1), PC(18:0/18:2) 및 PC(18:0/20:4)(표 2). 과체중군은 11개의 대사체에서 현저한 감소를 보였고: C14:0, C16:1, C16:0, C17:0, C18:2, C18:1, C18:0, C20:4, C20:3 및 C22:6를 포함하는 라이소포스파티딜콜린(lysoPCs)(데이터 미기재) 및 PC(18:0/20:4)(표 2), 6개의 대사체에서 현저한 증가를 보였다: L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, PC(18:2/18:2) 및 락토실세라미드(표 2). 라이소-포스파티딜콜린의 경우 라이소-포스파티딜콜린(18:2)이 대조군과 달리 과체중군에서 3년 후 유의하게 감소함을 볼 수 있었다: 5040139±211025(기준시점의 대조군의 피크 강도), 4601299±153221(3년 후의 대조군의 피크 강도); 5096388±176350(기준시점의 과체중군의 피크 강도), 4115088±106848(3년 후 과체중군의 피크 강도)(q<0.001).

다음으로 본 발명자들은 대조군 및 과체중군 간의 대사체 변화(기준시점 및 3년 후)를 비교하였다. 과체중군은 대조군에 비하여 L-옥타노일카르니틴 및 데카노일카르니틴이 크게 증가함을 보였고, 대조군과 비교하여 3년 후에 L-류신, L-옥타노일카르니틴 및 데카노일카르니틴에서 높은 피크 강도를 보였다(표 2).

각 값들은 평균 정규화된 피크 강도±표준오차로 나타내었다; 대응표본 t-테스트로부터 도출한 ^* q<0.05, ^** q<0.01, ^*** q<0.001; 독립 t-테스트로부터 도출한 ^‡ q<0.05, ^‡‡ q<0.01, ^‡‡‡ q<0.001는 대조군 및 과체중군 간의 변화된 값으로부터 도출하였다. VIP: 변수중요도척도.

생화학적 파라미터 및 주요 혈장 대사체의 변화와 baPWV 변화의 상관관계

모든 개체(n=118)에서, ba-PWV 변화는 △ 허리둘레(r=0.294, P=0.001), △ 허리와 엉덩이 둘레 비율(WHR)(r=0.268, P=0.003), △ SBP(r=0.0.319, P<0.001), △ 트리글리세리드(r=0.214, P=0.020), △ hs-CRP(r=0.233, P=0.012), △ L-옥타노일카르니틴(r=0.528, P<0.001), △ 데카노일카르니틴(r=0.452, P<0.001) 및 △ 락토실세라미드(r=0.288, P=0.002)(도 2)와 양의 상관관계를 나타냈다. 이러한 결과를 기초로, 본 발명자들은 △ ba-PWV의 독립적 예측인자(independent predictors)를 결정하기 위하여 다중 회귀 분석을 수행하였다. 연령, 성별, 기준시점 BMI, △ 허리둘레, △ SBP, △ 트리글리세리드, △ HOMA-IR, △ 인슐린, △ hs-CRP, △ L-류신, △ L-옥타노일카르니틴, △ 데카노일카르니틴 및 △ 락토실세라미드를 시험하였다. 비록, 기준 시점의 BMI(표준화된 β=0.185, P=0.034) 및 △ SBP(표준화된 β=0.196, P=0.020) 역시 중요하였으나, L-옥타노일카르니틴(표준화된 β=0.428, P=0.003) 및 락토실세라미드(표준화된 β=0.201, P=0.012)의 변화가 △ ba-PWV의 가장 강력한 독립적 예측인자였다.

생화학적 파라미터 및 주요 혈장 대사체의 변화와 L- 옥타노일카르니틴 및 락토실세라미드 변화의 상관관계

L-옥타노일카르니틴의 변화는 △ WHR(도 2), △ 총 콜레스테롤, △ FFA(도 2), △ L-류신, △ L-페닐알라닌 및 △ 데카노일카르니틴(r=0.815, P<0.001)과 양의 상관관계를 나타냈다. 락토실세라미드의 변화는 △ 데카노일카르니틴과 양의 상관관계를 나타냈고, △ L-발린, △ lysoPCs(14:0, 16:0, 18:2, 18:0, 20:3 및 22:6) 및 △ PC(18:0/20:4)와 음의 상관 관계를 나타냈다(r=0.266, P=0.004). 또한, △ L-발린(r=0.411, P<0.001) 및 △ L-류신(r=0.479, P<0.001)은 △ HOMA-IR과 양의 상관관계를 나타냈다(r=0.479, P <0.001).

고 찰

본 발명은 중년의 과체중 대상은 추적관찰 기간 동안 정상 체중의 대조군에서 관찰된 것을 초과하는 죽상 혈관경직도의 지표로서(14, 15) 상당한 ba-PWV의 증가를 보임을 밝혔다. 또한, 옥타노일카르니틴의 생리학적 활성 형태인 L-옥타노일카르니틴 및 락토실세라미드의 변화가 기준점 BMI 및 SBP 변화와 마찬가지로 ba-PWV 변화의 독립적 예측인자로서 나타났다. 더불어, 혈관경직도의 마커인 ba-PWV 및 SBP 모두에서의 평균 변화는 L-옥타노일카르니틴 및 락토실세라미드의 변화와 양의 상관관계를 보였다. 이러한 발견은 과체중의 지속이 특히 중년에 있어 증가된 혈관경직도의 중요한 위험 요소이고, 이러한 혈관경직도의 증가가 혈장 L-옥타노일카르니틴 및 락토실세라미드의 연령 관계된 증가와 연관있을 수 있음을 제시한다.

정상 체중 대상에서 현저한 변화가 일어나지 않은 것과는 달리, 과체중 대상에서는 3년의 기간 동안 이러한 ba-PWV 증가와 함께, L-옥타노일카르니틴의 34% 증가 및 데카노일카르니틴의 27% 증가를 보였다. 아실카르니틴 생산 증가는 트리카복실산 사이클을 통하여 이산화탄소로 완전 산화를 초과하는 경우 발생할 수 있다(16). 따라서, 옥타노일카르니틴 및 데카노일카르니틴을 포함하는 중간 사슬 아실카르니틴은 중간 지방산 β-산화의 부산물(17) 및 불완전 지방산 산화의 마커(18)로 알려져 있다. 실제로, 높은 체지방은 과부화된 지방산의 β-산화와 상관관계를 보였고, 이는 중간 사슬 아실카르니틴 양의 증가를 지배적으로 이끈다(18). 따라서 본 발명의 중년의 과체중 대상에서 옥타노일카르니틴 및 데카노일카르니틴의 증가는 상향조절된 지방산 β-산화와 관련되어 있을 수 있고, 이는 높은 FFA 부하 및 높은 복부 지방 축적 때문일 가능성이 있다(18, 19). 본 발명에서의 옥타노일카르니틴 및 데카노일카르니틴의 변화는 공복 FFA 및 허리와 엉덩이 둘레 비율의 변화와 밀접하게 관련있음을 보였다.

백색 지방 조직은 가지쇄 아미노산(BCAAs: Branched-chain amino acids)의 전신 대사에 있어 주요한 역할자로 평가되고 있다(20-22). 체중을 일치시킨 건강한 비만 대상과 비교하여 BCAA 이화효소의 풍부한 mRNA는 대사 증후군을 가진 비만 대상의 대망의(그러나 피하에서는 아님) 백색 지방 조직에서 현저하게 감소하고, 내장지방이 대사적으로 약화된 개인의 BCAA 대사적 표현형에 기여할 가능성을 높임이 보고되었다(20). 본 발명에서 3년 후의 정상 체중 대상과 비교하여 과체중 대상은 3년의 시간 경과 후 허리 둘레 3.42 cm의 현저한 증가 및 높은 혈장 류신/이소류신 레벨을 보였다. 이는 본질적 비만증 신호가 백색 지방 조직의 BCAA 효소 발현을 하향 조절 하고 침투성(systemic) BCAAs의 증가는 인슐린 저항성 정도를 추적하고, 혈당 조절을 악화시킴을 제시하였다(20). 사실, 본 발명의 발린, 류신 및 HOMA-IR 간의 강한 양의 상관관계는 이전의 연구 결과와 일치한다(23). 따라서, 정상 체중 대상에 비해 과체중군에서 수축기 및 이완기 혈압, 트리글리세리드 및 HOMA-IR 지수의 높은 증가는 침투성 BCAAs 및 인슐린 저항성 표현형 간에 밀접한 연관이 있다는 기존의 보고를 뒷받침할 수 있다(24).

본 발명에서, 정상 체중군 및 과체중군 모두에서 연령 관계된 lysoPCs의 감소를 발견하였다. 이러한 결과는 이전의 동물 연구와 일치하며, 이는 연령이 증가할 수록 lysoPCs가 감소함을 보여준다(25). 또한, 과체중 대상에서 혈장 팔미틱 아미드 및 락토실세라미드의 연령-관계된 증가를 관찰하였다. 보편적인 글리코스핀고리피드인 락토실세라미드는 혈관 내피 성장인자 처리 후 혈관내피세포에서 생성되고, 이는 혈관 병증에 관련된다(26). 락토실세라미드는 세포간 결합분자(intracellular adhesion molecule) 발현의 상향 조절에 중요한 역할을 하고(27), 이는 ba-PWV와 양의 상관관계가 있다. 마찬가지로, 락토실세라미드의 변화는 본 발명에서 ba-PWV 변화의 독립적 예측인자 중 하나였다. 또한, 본 발명의 락토실세라미드 및 PC(18:0/20:4) 간의 음성 상관관계는 락토실세라미드가 세포질의 Ca^{2 +}-의존 PLA₂의 활성을 촉진한다는 이전의 연구를 뒷받침하고(29), 그 중 선호되는 기질은 sn-2 위치에 아라키돈산(20:4 ω6)을 포함하는 인지질이다(30).

비록, 본 발명에서 많은 수의 대사체 마커가 UPLC-LTQ-Orbitrap MS에서 검출되었으나, 대부분의 대사체는 현재 동정되지 않았다. 내인성 생체분자의 많은 데이터베이스는 대사체학 연구를 위한 LC-MS-기반 기술에의 사용이 아직 정립되지 않았다(31). 이러한 제한에도 불구하고, UPLC-LTQ-Orbitrap MS 기반된 대사체 분석 및 다변량 데이터 분석을 사용한 본 발명의 접근방식은 대조군에 비해 과체중군에서 L-옥타노일카르니틴 및 데카노일카르니틴에서 더 큰 증가를 보였다. 또한, 기준시점의 BMI 및 SBP 변화에서와 같이 과체중군은 3 년 기간에 걸쳐 L-류신, 락토실세라미드 및 ba-PWV의 증가를 보였다. 이러한 발견은 과체중 지속이 특히 중년에서 혈관경직도의 중요한 악화 인자가 되고, 이러한 증가된 혈관경직도는 혈장 L-옥타노일카르니틴 및 락토실세라미드의 연령-관계된 증과와 연관있을 수 있음을 제시한다.

요컨대, 본 발명은 증가된 혈관경직도 및 대사성 장애가 중년의 과체중 대상에서 발생하는 복부 지방 축적과 연관됨을 제시한다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

1. 심혈관 합병증의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법:
   (a) 대상체(subject)로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 얻는 단계; 및
   (b) 상기 시료에 있는 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드, 포스파티딜콜린(18:2/18:2) 및 라이소-포스파티딜콜린(18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 단계로서, 상기 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도가 대조군 시료의 것보다 증가하거나, 상기 라이소-포스파티딜콜린(18:2)의 농도가 대조군 시료의 것보다 감소하는 경우 혈관 경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높은 것으로 판단한다.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 대상체는 체질량지수(BMI)가 25 kg/m² 이상인 대상체인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 대조군은 체질량지수(BMI)가 25 kg/m² 미만인 대상체인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b) 이후 체질량지수(BMI), 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 허리둘레, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA), 글루코오스, 인슐린, 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)로 구성되는 군으로부터 선택되는 파라미터를 측정하는 단계 (c)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법으로, 상기 파라미터의 수치가 대조군에 비하여 증가되는 경우 혈관 경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높은 것으로 판단한다.
   
5. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 측정은 기준시점 및 기준시점으로부터 1-10년의 시간 경과 후 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 방법은 상기 L-류신, L-옥타노일카르니틴 및 데카노일카르니틴으로 구성된 군으로부터 선택된 혈장 대사체의 농도가 기준시점에서 측정한 농도보다 시간 경과 후 측정한 농도가 증가하는 경우 혈관 경직도가 높아 심혈관 합병증의 위험이 높은 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 혈관경직도는 상완-발목 맥파속도(brachial-ankle pulse wave velocity)에 의해 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드, 포스파티딜콜린(18:2/18:2) 및 라이소-포스파티딜콜린(18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 심혈관 합병증 진단 키트.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 진단 키트는 체질량지수(BMI), 수축기 혈압(SBP), 이완기 혈압(DBP), 허리둘레, 트리글리세리드, 총 콜레스테롤, 유리 지방산(FFA), 글루코오스, 인슐린, 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 및 인슐린 저항성의 항상성 모델 평가(HOMA-IR)로 구성되는 군으로부터 선택되는 파라미터에 대한 정량장치를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
   
10. 제 8 항에 있어서, 상기 L-류신, 팔미틱 아미드, L-옥타노일카르니틴, 데카노일카르니틴, 락토실세라미드 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도가 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 심혈관 합병증의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
    
11. 제 8 항에 있어서, 상기 라이소-포스파티딜콜린(18:2)의 농도가 대조군에 비하여 감소되는 경우, 증가된 심혈관 합병증의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
    
12. 제 9 항에 있어서, 상기 파라미터의 수치가 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 심혈관 합병증의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.

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