JP2001149082A

JP2001149082A - Ｃｄ３６変異遺伝子並びに脂質代謝異常により引き起こされる疾患の判定法および診断キット

Info

Publication number: JP2001149082A
Application number: JP2000001448A
Authority: JP
Inventors: Takanori Oka; 孝紀岡; Akio Yamane; 根明男山; Kosei Tanaka; 中孝生田
Original assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakunaga Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-01-08
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2001-06-05

Abstract

(57)【要約】【課題】ＣＤ３６変異遺伝子並びに脂質代謝異常によ
り引き起こされる疾患の判定法および診断キットの提
供。【解決手段】配列番号１〜８のヌクレオチド配列を含
んでなるＣＤ３６変異遺伝子。ＣＤ３６遺伝子における
変異を検出することにより脂質代謝異常により引き起こ
される疾患の判定法。ＣＤ３６遺伝子における変異の検
出用試薬を含んでなる上記疾患の診断キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、ＣＤ３６変異遺伝子およびその用途に関し、
更に詳細には、ＣＤ３６変異遺伝子を用いた脂質代謝異
常により引き起こされる疾患の判定法およびその疾患の
診断キットに関する。

【０００２】背景技術近年、心臓核医学的検索の進歩により、心筋脂肪代謝の
臨床的評価が可能となり、心疾患における心筋脂肪代謝
異常が検討されるようになった。特に肥大型心筋症症例
で心筋への脂肪酸集積異常が数多く報告されているが、
機序は不明であった。

【０００３】体内における血液循環の駆動装置である心
臓は、平常状態においても莫大なエネルギーを必要と
し、運動時・ストレス負荷時には更にその必要量が増加
する。心筋におけるエネルギーの供給源の主たるものは
長鎖脂肪酸であり、７０〜８０％の心筋エネルギーが長
鎖脂肪酸に由来するとされている。従って、心筋におけ
る長鎖脂肪酸代謝障害は、重篤な結果をもたらすものと
考えられる。事実、長鎖脂肪酸代謝の最終段階、即ちミ
トコンドリアへの長鎖脂肪酸取り込み機構 (carnitine
shuttle) 障害、あるいはβ酸化系に属する酵素異常に
より突然死を含む心疾患が生じることが知られている。

【０００４】長鎖脂肪酸の細胞内取り込み機構に関して
は、諸説があり確定されていなかった。最近我々は心筋
長鎖脂肪酸取り込み機構に関与する遺伝子を同定し、従
来血小板の膜に発現する糖蛋白ＣＤ３６であることを報
告した（BIO Clinica,12(14),86-90(1997)）。

【０００５】これまで報告されているＣＤ３６変異遺伝
子としては、Ｃ４７８Ｔ置換：ＣＤ３６遺伝子の４７８
番目（エキソン４）のシトシンがチミンに置換したもの
（F.K.Schattauer Verlagsgesellschaft mbH(Stuttgar
t)69(5)481-484(1993)）、５３９ＡＣ欠失：ＣＤ３６遺
伝子の５３９、５４０番目（エキソン５）のアデニンと
チミンが欠失したもの（Blood,83(12),3545-3552(199
4））、１１５９Ａ挿入：ＣＤ３６遺伝子の１１５９番
目（エキソン１０）にアデニンが挿入されたもの（Arte
riosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology，16
(8)，1026-1032）等がある。

【０００６】しかし、これらのＣＤ３６変異遺伝子と脂
質代謝異常により引き起こされる疾患との関係およびこ
れら以外のＣＤ３６変異遺伝子の存在は確認されていな
い。

【０００７】

【発明の概要】本発明者らは、心臓に病歴のある人およ
び疑いのある人のうち、脂肪酸の取り込みが欠落してい
た４１検体について、フローサイトメトリー（flow cyt
ometry）で血小板、および単球におけるＣＤ３６タンパ
クの発現を調べた。その結果、すべての例で血小板およ
び単球ともＣＤ３６タンパクを発現していないことを見
出した。

【０００８】本発明者らは、更にこれら４１検体につき
染色体ＤＮＡを調製し、そのエキソン全領域に関して遺
伝子変異の解析を行った。また、重症心不全に陥った２
７名の心筋症患者に対してバチスタ手術（収縮しなくな
った心筋を一部切り取る手術）によって切除した組織か
ら染色体ＤＮＡを精製し、ＣＤ３６遺伝子変異の検出を
試みた。その結果、従来知られているエキソン４、エキ
ソン５、およびエキソン１０における変異のほかに、エ
キソン６、エキソン９、エキソン１２、およびエキソン
１３に新たな変異が存在することを見出した。また、本
発明者らは、エキソン６、エキソン９、およびエキソン
１３に存在する変異のみならず、エキソン５に存在する
新たな変異をも特定した。

【０００９】本発明は、ＣＤ３６変異遺伝子並びに脂質
代謝異常により引き起こされる疾患の判定法および診断
キットの提供をその目的とする。本発明はまた、脂質代
謝異常の検出法の提供をその目的とする。

【００１０】本発明によれば、配列番号１〜８から選択
されるヌクレオチド配列を含んでなるＣＤ３６変異遺伝
子が提供される。

【００１１】本発明によれば、また、配列番号１〜８か
ら選択されるヌクレオチド配列またはその変異部分を含
んでなるヌクレオチド断片が提供される。

【００１２】本発明によれば、ＣＤ３６遺伝子における
変異を検出することを含んでなる脂質代謝異常により引
き起こされる疾患の判定法が提供される。

【００１３】本発明によれば、ＣＤ３６遺伝子における
変異の検出用試薬を含んでなる脂質代謝異常により引き
起こされる疾患の診断キットが提供される。

【００１４】本発明によれば、ＣＤ３６遺伝子における
変異を検出することを含んでなる脂質代謝異常の検出法
が提供される。

【００１５】

【発明の具体的説明】本明細書において「変異」とは、
欠失、置換、および挿入を意味する。

【００１６】本明細書において「遺伝子変異」とは、片
方のアレルに変異が存在する場合のみならず、両アレル
に変異が存在する場合も含む。

【００１７】本明細書において「塩基番号Ｘにおける挿
入」とは、塩基番号Ｘ−１番と塩基番号Ｘ番との間に塩
基が挿入されることを意味する。

【００１８】本明細書において「ＣＤ３６遺伝子の塩基
番号」というときは、ＣＤ３６のｃＤＮＡ配列、すなわ
ち、配列番号９のヌクレオチド配列、の塩基番号に従う
ものとする。

【００１９】本発明によるＣＤ３６変異遺伝子は配列番
号１〜８に記載されるヌクレオチド断片を含んでなる。

【００２０】本発明によるＣＤ３６変異遺伝子は、具体
的には、ＣＤ３６遺伝子配列において配列番号３８のヌ
クレオチド配列部分（エキソン１３をコードする配列お
よびそれに隣接するイントロン部分を含む）が配列番号
１、２、または３のヌクレオチド配列であるＣＤ３６遺
伝子配列、ＣＤ３６遺伝子配列において配列番号３９の
ヌクレオチド配列部分（エキソン１２をコードする配列
およびそれに隣接するイントロン部分を含む）が配列番
号４のヌクレオチド配列であるＣＤ３６遺伝子配列、Ｃ
Ｄ３６遺伝子配列において配列番号４１のヌクレオチド
配列部分（エキソン９をコードする配列およびそれに隣
接するイントロン部分を含む）が配列番号５のヌクレオ
チド配列であるＣＤ３６遺伝子配列、ＣＤ３６遺伝子配
列において配列番号４２のヌクレオチド配列部分（エキ
ソン６をコードする配列およびそれに隣接するイントロ
ン部分を含む）が配列番号６または７のヌクレオチド配
列であるＣＤ３６遺伝子配列およびＣＤ３６遺伝子配列
において配列番号４３のヌクレオチド配列部分（エキソ
ン５をコードする配列およびそれに隣接するイントロン
部分を含む）が配列番号８のヌクレオチド配列であるＣ
Ｄ３６遺伝子配列であることができる。

【００２１】本明細書において配列番号１〜８および１
０〜１２のヌクレオチド配列の変異部分とは、置換、欠
失、または挿入を有する部分を含む連続した少なくとも
１２ヌクレオチド（例えば、１２〜４０ヌクレオチ
ド）、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド（例え
ば、２０〜４０ヌクレオチド）、からなる。

【００２２】「ＣＤ３６遺伝子」とはJ. Biol. Chem.,
Vol.269, No.29, 18985-18991(1994)に開示されるＣＤ
３６遺伝子を意味する。「ＣＤ３６変異遺伝子」とは変
異を有するＣＤ３６遺伝子をいう。

【００２３】ＣＤ３６遺伝子のｃＤＮＡ配列は配列番号
９に記載される。配列番号９のヌクレオチド配列におけ
るエキソンの存在位置は次の通りである。エキソン１：
１〜２７、エキソン２：２８〜１２１、エキソン３：１
２２〜３３０、エキソン４：３３１〜４９１、エキソン
５：４９２〜６３９、エキソン６：６４０〜８１９、エ
キソン７：８２０〜９１１、エキソン８：９１２〜９５
８、エキソン９：９５９〜１０２８、エキソン１０：１
０２９〜１２１６、エキソン１１：１２１７〜１３３
５、エキソン１２：１３３６〜１４０９、エキソン１
３：１４１０〜１４６４、エキソン１４：１４６５〜終
始コドンを含む領域まで。

【００２４】背景技術において言及した従来から知られ
るＣＤ３６変異遺伝子の変異部分は、配列番号１０〜１
２に記載される。

【００２５】正常なＣＤ３６遺伝子のエキソン１３、エ
キソン１２、エキソン１０、エキソン９、エキソン６、
エキソン５、およびエキソン４をコードする配列をそれ
ぞれ含むヌクレオチド配列は、配列番号３８、３９、４
０、４１、４２、４３、および４４に記載される。

【００２６】ＣＤ３６変異遺伝子およびその変異部分は
後述するように、ＣＤ３６遺伝子の変異の検出、脂質代
謝異常の検出、更には、脂質代謝異常により引き起こさ
れた疾患の診断および判定、に有用である。

【００２７】本明細書において「ＣＤ３６遺伝子におけ
る変異」は、エキソン４、エキソン５、エキソン６、エ
キソン９、エキソン１０、エキソン１２、およびエキソ
ン１３を含む領域における変異であることができる。
「ＣＤ３６遺伝子における変異」は、これらのエキソン
内における欠失、置換、および挿入や、エキソンからイ
ントロンあるいはイントロンからエキソンにかけての欠
失および置換のみならず、イントロン内部の５'コント
ロール領域や３'コントロール領域における欠失、置換
および挿入も意味する。「ＣＤ３６遺伝子における変
異」は、フレームシフトを生じさせる変異や、アミノ酸
の欠失、置換または挿入を生じさせる変異であることが
できる。

【００２８】エキソン５の変異の例としては、（１）Ｃ
Ｄ３６遺伝子の塩基番号６２０における塩基の置換、欠
失または挿入が挙げられる。好ましくは、ＣＤ３６遺伝
子の塩基番号６２０における塩基（チミン）のシトシン
への置換（下記参照）であることができる。ＣＤ３６遺
伝子正常配列（配列番号４３）：ex05、変異遺伝子配列
（配列番号８）：t620c。下線はエキソン５を示す。

【００２９】 ex05 TTTGAATTTTGTTTACTGCTGTTTCTTTAGAGTTCGTTTTCTAGCCAAGGAAAATGTAAC 60 t620c TTTGAATTTTGTTTACTGCTGTTTCTTTAGAGTTCGTTTTCTAGCCAAGGAAAATGTAAC 60 ************************************************************ ex05 CCAGGACGCTGAGGACAACACAGTCTCTTTCCTGCAGCCCAATGGTGCCATCTTCGAACC 120 t620c CCAGGACGCTGAGGACAACACAGTCTCTTTCCTGCAGCCCAATGGTGCCATCTTCGAACC 120 ************************************************************ ex05 TTCACTATCAGTTGGAACAGAGGCTGACAACTTCACAGTTCTCAATCTGGCTGTGGCAGT 180 t620c TTCACTATCAGTTGGAACAGAGGCTGACAACTTCACAGCTCTCAATCTGGCTGTGGCAGT 180 ************************************** ********************* ex05 GAGTAGACAAACAACAAAGTTATCTATT 208 t620c GAGTAGACAAACAACAAAGTTATCTATT 208 ****************************

【００３０】エキソン６の変異の例としては、（２）Ｃ
Ｄ３６遺伝子の塩基番号７１６における塩基の置換、欠
失または挿入、および（３）ＣＤ３６遺伝子の塩基番号
７７０における塩基の置換、欠失または挿入が挙げられ
る。

【００３１】変異（２）は、好ましくは、ＣＤ３６遺伝
子の塩基番号７１６におけるチミンからグアニンへの置
換（下記参照）であることができる。ＣＤ３６遺伝子正
常配列（配列番号４２）：ex06、変異遺伝子配列（配列
番号７）：t716g。下線はエキソン６を示す。

【００３２】 ex06 TTGTCTTAAACAGTGACTTTGTTTTTGTAGGCTGCATCCCATATCTATCAAAATCAATTT 60 t716g TTGTCTTAAACAGTGACTTTGTTTTTGTAGGCTGCATCCCATATCTATCAAAATCAATTT 60 ************************************************************ ex06 GTTCAAATGATCCTCAATTCACTTATTAACAAGTCAAAATCTTCTATGTTCCAAGTCAGA 120 t716g GTTCAAATGATCCTCAATTCACTTATTAACAAGTCAAAATCTTCTAGGTTCCAAGTCAGA 120 ********************************************** ************* ex06 ACTTTGAGAGAACTGTTATGGGGCTATAGGGATCCATTTTTGAGTTTGGTTCCGTACCCT 180 t716g ACTTTGAGAGAACTGTTATGGGGCTATAGGGATCCATTTTTGAGTTTGGTTCCGTACCCT 180 ************************************************************ ex06 GTTACTACCACAGTTGGTCTGTTTTATCCTGTAAGTACCAAATATGAATGGCAATATTAT 240 t716g GTTACTACCACAGTTGGTCTGTTTTATCCTGTAAGTACCAAATATGAATGGCAATATTAT 240 ************************************************************

【００３３】変異（３）は、好ましくは、ＣＤ３６遺伝
子の塩基番号７７０へのフレームシフトを生じさせる塩
基の挿入、更に好ましくは、ＣＤ３６遺伝子の塩基番号
７７０へのチミンの挿入（下記参照）、であることがで
きる。ＣＤ３６遺伝子正常配列（配列番号４２）：ex0
6、変異遺伝子配列（配列番号６）：770ins。下線はエ
キソン６を示す。

【００３４】 ex06 TTGTCTTAAACAGTGACTTTGTTTTTGTAGGCTGCATCCCATATCTATCAAAATCAATTT 60 770ins TTGTCTTAAACAGTGACTTTGTTTTTGTAGGCTGCATCCCATATCTATCAAAATCAATTT 60 ************************************************************ ex06 GTTCAAATGATCCTCAATTCACTTATTAACAAGTCAAAATCTTCTATGTTCCAAGTCAGA 120 770ins GTTCAAATGATCCTCAATTCACTTATTAACAAGTCAAAATCTTCTATGTTCCAAGTCAGA 120 ************************************************************ ex06 ACTTTGAGAGAACTGTTATGGGGCTATAGGGATCCATTTTT-GAGTTTGGTTCCGTACCC 179 770ins ACTTTGAGAGAACTGTTATGGGGCTATAGGGATCCATTTTTTGAGTTTGGTTCCGTACCC 180 ***************************************** ****************** ex06 TGTTACTACCACAGTTGGTCTGTTTTATCCTGTAAGTACCAAATATGAATGGCAATATTA 239 770ins TGTTACTACCACAGTTGGTCTGTTTTATCCTGTAAGTACCAAATATGAATGGCAATATTA 240 ************************************************************ ex06 T 240 770ins T 241 *

【００３５】エキソン９の変異の例としては、（４）Ｃ
Ｄ３６遺伝子の塩基番号９７０における塩基の置換、欠
失または挿入が挙げられる。好ましくは、ＣＤ３６遺伝
子の塩基番号９７０におけるチミンのシトシンへの置換
（下記参照）であることができる。ＣＤ３６遺伝子正常
配列（配列番号４１）：ex09、変異遺伝子配列（配列番
号５）：t970c。下線はエキソン９を示す。

【００３６】 ex09 CTAATCATTTGCCACTCGATTTTTAAACAGATGCAGCCTCATTTCCACCTTTTGTTGAGA 60 t970c CTAATCATTTGCCACTCGATTTTTAAACAGATGCAGCCTCACTTCCACCTTTTGTTGAGA 60 ***************************************** ****************** ex09 AAAGCCAGGTATTGCAGTTCTTTTCTTCTGATATTTGCAGGTAAGACAGATACTGAAGTA 120 t970c AAAGCCAGGTATTGCAGTTCTTTTCTTCTGATATTTGCAGGTAAGACAGATACTGAAGTA 120 ************************************************************ ex09 TAAGTATGCT 130 t970c TAAGTATGCT 130 **********

【００３７】エキソン１２の変異の例としては、（５）
ＣＤ３６遺伝子のエキソン１２の５’側上流第５番目の
塩基（イントロン部分に存在）からエキソン１２の第２
番目の塩基までの塩基部分（TTTAGAT）またはその塩基
部分の一部の欠失であって、スプライシングの正常な進
行を妨げるような欠失、すなわち発現タンパク質からエ
キソン１２が完全に欠落するような欠失、であることが
できる。ＣＤ３６遺伝子のエキソン１２の５’側上流第
５番目の塩基（イントロン内部に存在）からエキソン１
２の第２番目の塩基までの塩基部分（TTTAGAT）の欠失
は下記の通りである。ＣＤ３６遺伝子正常配列（配列番
号３９）：ex12、変異遺伝子配列（配列番号４）：ex12
skip。下線はエキソン１２を示す。

【００３８】 ex12 TTGGTAATTATTTAGTTGTTCTCTTTTTAGATAACTGGATTCACTTTACAATTTGCAAAA 60 ex12skipTTGGTAATTATTTAGTTGTTCTCTT-------AACTGGATTCACTTTACAATTTGCAAAA 53 ************************* **************************** ex12 CGGCTGCAGGTCAACCTATTGGTCAAGCCATCAGAAAAAATTCAGTGAGTCTCTTGAAAA 120 ex12skipCGGCTGCAGGTCAACCTATTGGTCAAGCCATCAGAAAAAATTCAGTGAGTCTCTTGAAAA 113 ************************************************************ ex12 TGGTTATTTTGATA 134 ex12skipTGGTTATTTTGATA 127 **************

【００３９】エキソン１３の変異の例としては、（６）
ＣＤ３６遺伝子の塩基番号１４３８〜１４４９の塩基を
含む塩基部分または塩基番号１４３８〜１４４９の一部
の欠失、（７）ＣＤ３６遺伝子の塩基番号１４５７にお
ける塩基の置換、欠失または挿入、（８）ＣＤ３６遺伝
子のエキソン１３の５'側上流第８番目の塩基（イント
ロン部分に存在）からエキソン１３の第２番目の塩基ま
での塩基部分またはその塩基部分の一部の欠失が挙げら
れる。

【００４０】変異（６）は、ＣＤ３６遺伝子の塩基番号
１４３８〜１４４９からなる塩基部分（attgtgcctatt）
またはその一部の欠失であることができる。

【００４１】ＣＤ３６遺伝子の塩基番号１４３８〜１４
４９からなる塩基部分（attgtgcctatt）の欠失は以下の
通りである。ＣＤ３６遺伝子正常配列（配列番号３
８）：ex13、変異遺伝子配列（配列番号１）：del12。
下線はエキソン１３を示す。

【００４２】 ex13 AGTTTATATGTTCATAATTATTTTCAACGTATATTACAGAGTATTAAAGAATCTGAAGAG 60 del12 AGTTTATATGTTCATAATTATTTTCAACGTATATTACAGAGTATTAAAGAATCTGAAGAG 60 ************************************************************ ex13 GAACTATATTGTGCCTATTCTTTGGCTTAATGAGGTTTGTATTTGCAGCTGTTAGTCATT 120 del12 GAACTAT------------CTTTGGCTTAATGAGGTTTGTATTTGCAGCTGTTAGTCATT 108 ******* ***************************************** ex13 AAAA 124 del12 AAAA 112 ****

【００４３】変異（７）は、好ましくは、ＣＤ３６遺伝
子の塩基番号１４５７へのフレームシフトを生じさせる
塩基の挿入、更に好ましくは、塩基番号１４５７へのtt
aaagaatctgaagaggaactatattgtgcctattctttggcの挿入
（すなわち、塩基番号１４１４〜１４５６の塩基部分の
重複）、であることができる。

【００４４】ＣＤ３６遺伝子の塩基番号１４１４〜１４
５６の塩基部分の重複は下記の通りである。ＣＤ３６遺
伝子正常配列（配列番号３８）：ex13、変異遺伝子配列
（配列番号２）：dup43。下線はエキソン１３を示す。

【００４５】 ex13 AGTTTATATGTTCATAATTATTTTCAACGTATATTACAGAGTATTAAAGAATCTGAAGAG 60 dup43 AGTTTATATGTTCATAATTATTTTCAACGTATATTACAGAGTATTAAAGAATCTGAAGAG 60 ************************************************************ ex13 GAACTATATTGTGCCTATTCTTTGGC---------------------------------- 90 dup43 GAACTATATTGTGCCTATTCTTTGGCTTAAAGAATCTGAAGAGGAACTATATTGTGCCTA 120 ************************** ex13 ---------TTAATGAGGTTTGTATTTGCAGCTGTTAGTCATTAAAA 124 dup43 TTCTTTGGCTTAATGAGGTTTGTATTTGCAGCTGTTAGTCATTAAAA 167 **************************************

【００４６】変異（８）は、ＣＤ３６遺伝子のエキソン
１３の５'側上流第８番目の塩基（イントロン部分に存
在）からエキソン１３の第２番目の塩基までの塩基部分
（tattacagag）の欠失またはその塩基部分の一部の欠失
であって、スプライシングの正常な進行を妨げるような
欠失、すなわち、発現タンパク質からエキソン１３が完
全に欠落するような欠失、であることができる。

【００４７】ＣＤ３６遺伝子のエキソン１３の５'側上
流第８番目の塩基（イントロン部分に存在）からエキソ
ン１３の第２番目の塩基までの塩基部分（tattacagag）
の欠失は記の通りである。ＣＤ３６遺伝子正常配列（配
列番号３８）：ex13、変異遺伝子配列：del10（配列番
号３）。下線はエキソン１３を示す。

【００４８】 ex13 AGTTTATATGTTCATAATTATTTTCAACGTATATTACAGAGTATTAAAGAATCTGAAGAG 60 del10 AGTTTATATGTTCATAATTATTTTCAACGTA----------TATTAAAGAATCTGAAGAG 50 ******************************* ******************* ex13 GAACTATATTGTGCCTATTCTTTGGCTTAATGAGGTTTGTATTTGCAGCTGTTAGTCATT 120 del10 GAACTATATTGTGCCTATTCTTTGGCTTAATGAGGTTTGTATTTGCAGCTGTTAGTCATT 110 ************************************************************ ex13 AAAA 124 del10 AAAA 114 ****

【００４９】エキソン４における変異の例としては、
（９）ＣＤ３６遺伝子の塩基番号４７８における塩基の
置換、欠失または挿入、好ましくはＣのＡへの置換（下
記参照）、が挙げられる。

【００５０】ＣＤ３６遺伝子正常配列（配列番号４
４）：ex04、変異遺伝子配列：478CT（配列番号１
０）。下線はエキソン４を示す。

【００５１】 ex04 CATAACCCAAACTTATTTTCTTTTCCATAGCAAGTTGTCCTCGAAGAAGGTACAATTGCT 60 478CT CATAACCCAAACTTATTTTCTTTTCCATAGCAAGTTGTCCTCGAAGAAGGTACAATTGCT 60 ************************************************************ ex04 TTTAAAAATTGGGTTAAAACAGGCACAGAAGTTTACAGACAGTTTTGGATCTTTGATGTG 120 478CT TTTAAAAATTGGGTTAAAACAGGCACAGAAGTTTACAGACAGTTTTGGATCTTTGATGTG 120 ************************************************************ ex04 CAAAATCCACAGGAAGTGATGATGAACAGCAGCAACATTCAAGTTAAGCAAAGAGGTCCT 180 478CT CAAAATCCACAGGAAGTGATGATGAACAGCAGCAACATTCAAGTTAAGCAAAGAGGTTCT 180 ********************************************************* ** ex04 TATACGTACAGGTGAGTGAGTGCCCACAAATATGAGACACT 221 478CT TATACGTACAGGTGAGTGAGTGCCCACAAATATGAGACACT 221 *****************************************

【００５２】エキソン５における変異の例としては、更
に、（１０）ＣＤ３６遺伝子の塩基番号５３９および／
または５４０における塩基の置換、欠失または挿入、好
ましくは、５３９および５４０におけるＡＣの欠失（下
記参照）、が挙げられる。

【００５３】ＣＤ３６遺伝子正常配列（配列番号４
３）：ex05、変異遺伝子配列：539ACdel（配列番号１
１）。下線はエキソン５を示す。

【００５４】 ex05 TTTGAATTTTGTTTACTGCTGTTTCTTTAGAGTTCGTTTTCTAGCCAAGGAAAATGTAAC 60 539ACdelTTTGAATTTTGTTTACTGCTGTTTCTTTAGAGTTCGTTTTCTAGCCAAGGAAAATGTAAC 60 ************************************************************ ex05 CCAGGACGCTGAGGACAACACAGTCTCTTTCCTGCAGCCCAATGGTGCCATCTTCGAACC 120 539ACdelCCAGGACGCTGAGGACA--ACAGTCTCTTTCCTGCAGCCCAATGGTGCCATCTTCGAACC 118 ***************** ***************************************** ex05 TTCACTATCAGTTGGAACAGAGGCTGACAACTTCACAGTTCTCAATCTGGCTGTGGCAGT 180 539ACdelTTCACTATCAGTTGGAACAGAGGCTGACAACTTCACAGTTCTCAATCTGGCTGTGGCAGT 178 ************************************************************ ex05 GAGTAGACAAACAACAAAGTTATCTATT 208 539ACdelGAGTAGACAAACAACAAAGTTATCTATT 206 ****************************

【００５５】エキソン１０における変異の例としては、
（１１）ＣＤ３６遺伝子の塩基番号１１５９における塩
基の置換、欠失または挿入、好ましくは、Ａの挿入（下
記参照）、が挙げられる。

【００５６】ＣＤ３６遺伝子正常配列（配列番号４
０）：ex10、変異遺伝子配列：1159Ains（配列番号１
２）。下線はエキソン１０を示す。

【００５７】 ex10 TGGAATGCAGCTCTTTTTTCTCTGTATTTAGGTCAATCTATGCTGTATTTGAATCCGACG 60 1159AinsTGGAATGCAGCTCTTTTTTCTCTGTATTTAGGTCAATCTATGCTGTATTTGAATCCGACG 60 ************************************************************ ex10 TTAATCTGAAAGGAATCCCTGTGTATAGATTTGTTCTTCCATCCAAGGCCTTTGCCTCTC 120 1159AinsTTAATCTGAAAGGAATCCCTGTGTATAGATTTGTTCTTCCATCCAAGGCCTTTGCCTCTC 120 ************************************************************ ex10 CAGTTGAAAACCCAGACAACTATTGTTTCTGCACAGAAAAAATTATCTC-AAAAAATTGT 179 1159AinsCAGTTGAAAACCCAGACAACTATTGTTTCTGCACAGAAAAAATTATCTCAAAAAAATTGT 180 ************************************************* ********** ex10 ACATCATATGGTGTGCTAGACATCAGCAAATGCAAAGAAGGTGAGTAAATAACCTCAGTA 239 1159AinsACATCATATGGTGTGCTAGACATCAGCAAATGCAAAGAAGGTGAGTAAATAACCTCAGTA 240 ************************************************************ ex10 GCACAGTCCAT 250 1159AinsGCACAGTCCAT 251 ***********

【００５８】本明細書において「ＣＤ３６遺伝子におけ
る変異の検出用試薬」とは、ＣＤ３６遺伝子における特
定または不特定変異の検出に必要とされるプライマー、
プライマーペア、プローブ、制限酵素、マクサムギルバ
ート法やチェインターミネーター法のような塩基配列決
定法に用いられる試薬、並びにヌクレオチド断片の増幅
用鋳型としてのＣＤ３６遺伝子やＣＤ３６変異遺伝子を
いい、本発明による脂質代謝異常により引き起こされる
疾患またはその発症可能性の判定法に使用される。

【００５９】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出に用い
られるプライマーおよびプローブは、本発明によるＣＤ
３６変異遺伝子またはその相補鎖、好ましくは、配列番
号１〜８および１０〜１２から選択されるヌクレオチド
配列またはその相補鎖、の連続する少なくとも１２（例
えば、１２〜２０）、好ましくは少なくとも２０（例え
ば、２０〜４０）、の塩基からなるヌクレオチド断片、
であることができる。

【００６０】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出に用い
られるプライマーとしては、各エキソンの５'側上流部
分および３'側下流部分並びにそれらの相補鎖が挙げら
れるがこれらに限定されるものではない。好ましくは、
配列番号１３〜３７に記載されるヌクレオチド断片およ
びその相補鎖であることができる。

【００６１】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出に用い
られるプローブとしては、配列番号１〜８および１０〜
１２に記載されるヌクレオチド断片およびその相補鎖か
ら選ぶことができる。プローブは慣用技術に従って標識
されていてもよい。

【００６２】本発明によるプライマーペアはＣＤ３６遺
伝子における変異の検出に用いられる二つのプライマー
からなる。プライマーペアは、ＣＤ３６遺伝子あるいは
ＣＤ３６変異遺伝子の少なくとも１２（例えば、１２〜
２０）、好ましくは少なくとも２０（例えば、２０〜４
０）、のヌクレオチドからなるヌクレオチド断片と、Ｃ
Ｄ３６遺伝子あるいはＣＤ３６変異遺伝子の相補鎖の少
なくとも１２（例えば、１２〜４０）、好ましくは少な
くとも２０（例えば、２０〜４０）、のヌクレオチドか
らなるヌクレオチド断片とからなることができる。プラ
イマーペアの例としては、配列番号１３および１４のヌ
クレオチド配列、配列番号１５および１６のヌクレオチ
ド配列、配列番号１７および１８のヌクレオチド配列、
配列番号１９および２０のヌクレオチド配列、配列番号
２１および２２のヌクレオチド配列、配列番号２３およ
び２４のヌクレオチド配列、配列番号２５および２６の
ヌクレオチド配列、配列番号２７および２８のヌクレオ
チド配列、配列番号２９および３０のヌクレオチド配
列、配列番号３１または３２および配列番号３３のヌク
レオチド配列、配列番号３４および３５のヌクレオチド
配列、並びに配列番号３６および３７のヌクレオチド配
列が挙げられる。

【００６３】本発明においては、（１）〜（１１）から
選択される２以上の変異の検出を組み合わせて行うこと
により、本発明による判定法の精度を向上させることが
できる。

【００６４】従って、（１）〜（１１）から選択される
２以上の変異の検出を組み合わせて実施する態様は、本
発明による判定法および診断キットの範囲内であること
はいうまでもない。

【００６５】脂質代謝異常により引き起こされる疾患の
診断および判定並びに脂質代謝異常の検出は、ＣＤ３６
遺伝子における変異を検出することにより実施できる。

【００６６】ＣＤ３６遺伝子における変異の存在は脂質
代謝異常により引き起こされる疾患のかかり易さを示
す。

【００６７】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出は、配
列番号１〜８および１０〜１２から選択されるヌクレオ
チド配列またはその相補鎖あるいはそれらの変異部分を
含んでなるヌクレオチドプローブと、被験者から単離し
た核酸試料とをハイブリダイズさせ、次いでハイブリダ
イゼーション複合体の存在を検出することにより実施し
てもよい。ハイブリダイゼーション複合体の存在は変異
の存在を示す。ハイブリダイゼーション複合体は、固定
化されたプローブ上に目的核酸を捕獲し、標識核酸試料
の存在を検出することにより検出できる。ハイブリダイ
ゼーション複合体は、また、ＰＣＲ法等による増幅産物
の存在を検出することにより検出してもよい。具体的に
は、ヌクレオチドプローブと、もう一つの他のＣＤ３６
遺伝子のヌクレオチド断片とを準備し、これらをプライ
マーペアとして用いて試料核酸をＰＣＲ法等により増幅
する。増幅産物の存在は変異の存在を示す。

【００６８】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出は、ま
た、被験者から単離した核酸試料および標準核酸試料
を、ＣＤ３６変異遺伝子またはその相補鎖の連続する少
なくとも１２（例えば、１２〜２０）、好ましくは少な
くとも２０（例えば、２０〜４０）、のヌクレオチドか
らなるヌクレオチド断片を含んでなるＣＤ３６遺伝子に
おける変異の検出用プライマーペアを用いてＰＣＲ法等
により増幅し、得られた増幅産物を相補鎖置換が生じる
ように、熱変性させた後、冷却し、相補鎖置換の程度を
検出することにより実施してもよい。野生型由来の標準
核酸試料の相補鎖置換は野生型遺伝子の存在を示し、変
異型由来の標準核酸試料の相補鎖置換は変異型遺伝子の
存在を示す。疾患のより具体的な診断および判定は後述
する。

【００６９】脂質代謝異常により引き起こされる疾患の
診断および判定は、ＣＤ３６遺伝子における不特定変異
あるいは特定変異を検出することにより実施できる。

【００７０】不特定変異の検出は、ＣＤ３６遺伝子全体
にわたって変異遺伝子の解析が可能である。ＣＤ３６遺
伝子において変異が存在すると評価されたサンプルは、
脂質代謝異常により引き起こされる疾患の患者である
と、あるいはその発症可能性があると診断または判定す
ることができる。

【００７１】特定変異の検出は、いくつかの特定変異の
有無を解析するだけで十分な検出率を期待できる場合
や、ある特定変異と病状とに著しい相関がある場合など
においては、必要な種類の特定変異を検出することで十
分な診断または判定をすることができる。従って、変異
（１）〜（１１）が存在すると評価されたサンプルは、
脂質代謝異常により引き起こされる疾患患者であると、
あるいはその発症可能性があると診断または判定するこ
とができる。

【００７２】＜不特定変異の検出＞不特定変異を検出す
る方法としては、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ、ＰＣＲ−ＤＧＧ
Ｅ、ＲＮａｓｅによるミスマッチ切断法、ＰＣＲ−ＰＨ
ＦＡ法（Ｉ）等が挙げられる。本発明において用いたＰ
ＣＲ−ＰＨＦＡ法（Ｉ）による不特定変異検出法（米国
特許第５６８８６４３号）を以下説明する。

【００７３】ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法（Ｉ）では野生型の配
列を有する標的遺伝子を、その領域を特異的に増幅する
ことが可能な非標識プライマーでＰＣＲ増幅して非標識
標準ＤＮＡを得る。一方、検体の同じ領域を同じ配列の
標識プライマーで増幅することによって両末端に標識を
有する標識試料ＤＮＡを調製する。なお、この標識プラ
イマーの一方は固相に吸着可能な標識を有し、他方のプ
ライマーは検出可能な標識を有する。

【００７４】標識試料ＤＮＡに対して大過剰量（例えば
１０〜３０倍量）の非標識標準ＤＮＡを混和し、熱変性
が生じるに充分な高温（例えば９８℃）で１０分程度保
温した後、アニーリングが完結するのに充分な低温（例
えば７０℃）まで緩やかな温度勾配（例えば１℃／３〜
１０分）をかけて徐々に冷却する。この操作によって検
体が野生型のｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅの場合には標識試料
ＤＮＡと非標識標準ＤＮＡが完全に同じ配列をもつため
に、標識ＤＮＡと非標識ＤＮＡの間で相補鎖置換が生
じ、もとの両末端に標識をもつ分子は非標識ＤＮＡの過
剰度に応じて数学的な確率で再構成されるに過ぎない。
一方、検体が標的領域について、両方のアレルとも野生
型と異なる配列をもつ場合には、温度勾配の段階でわず
かな配列の差が認識され、もとの両末端に標識をもつ分
子が効率よく再構成される。また、検体が片方は野生型
のアレルをもち、他方は野生型と異なる配列を有する場
合には、野生型のアレルに由来する標識試料ＤＮＡはあ
まり再構成されず、野生型と異なる配列のアレルに由来
する標識ＤＮＡは効率よく再構成されるために、上述し
た２例の中間程度の効率で標識ＤＮＡが再構成される。

【００７５】ＤＮＡは固相に吸着可能なビオチンで標識
することができる。標識ＤＮＡはストレプトアビジンを
固定化したマイクロプレートにて捕捉できる。また、検
出可能な標識としてＤＮＰ（ジニトロフェニル基）を使
用し、アルカリ性フォスファターゼ標識抗ＤＮＰ抗体を
結合させ、ｐＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト）を発色基質として黄色の発色により検出することも
できる。この系においては、ストレプトアビジンを固定
化したマイクロプレートにアルカリ性フォスファターゼ
標識抗ＤＮＰ抗体を分注しておき、これに上述の条件で
標識試料ＤＮＡを非標識標準ＤＮＡを混和後アニーリン
グさせた溶液を加える。両末端標識ＤＮＡは一方の標識
でマイクロプレートに吸着し、他方の標識にアルカリ性
フォスファターゼ標識抗ＤＮＰ抗体が結合する。洗浄操
作の後、発色基質であるｐＮＰＰを加えることにより発
色させることができる。この発色の強さは固相上に存在
する両末端標識ＤＮＡの量、即ち、両末端標識ＤＮＡが
再構成された割合、に依存する。これによってもとの検
体が両方とも野生型のアレルをもつか、片方は野生型、
他方は野生型と異なる配列をもつか、或いは両方とも野
生型と異なる配列をもつかを判定できる。

【００７６】なお、野生型配列と野生型配列とは異なる
配列がアニーリング中に区別される程度は各エキソンの
鎖長、塩基配列によって異なるため、解析する領域ごと
に適切なカットオフ値をもうけることによって判定が可
能になる。

【００７７】＜特定変異の検出＞特定変異遺伝子の検出
をする方法としては、ＡＳＯ法、ＳＳＰ法、ＬＣＲ法、
ＰＨＦＡ法（２）が挙げられる。本発明において使用し
たＰＨＦＡ法（２）（ＷＯ９８／０２５７４号）につい
て以下説明する。エキソン４のＣ４７８Ｔ変異、エキソ
ン５の５３９ＡＣ欠失、エキソン１０の１１５９Ａ挿入
の遺伝子についての特定変異の検出方法について説明す
る。

【００７８】ＣＤ３６遺伝子（野生型）の配列を有する
染色体ＤＮＡをそのエキソン増幅用プライマーを用いて
ＰＣＲ増幅する。これをｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ−ｖｅｃｔ
ｏｒに導入後、塩基配列を確認し野生型の配列を有する
プラスミドを得る。一方、ＣＤ３６変異遺伝子を有する
染色体ＤＮＡを同じプライマーで増幅し、同ベクターに
導入後、塩基配列を確認し、変異遺伝子を有するプラス
ミドを得る。

【００７９】野生型および変異型のプラスミドを鋳型と
して、そのエキソン増幅用標識プライマー（配列はエキ
ソン増幅用非標識プライマーと同じ）を用いて増幅し、
野生型および変異型の標識標準ＤＮＡを得る。一方、試
料ＤＮＡをエキソン増幅用非標識プライマーで増幅し、
非標識試料ＤＮＡを調製する。

【００８０】標識標準ＤＮＡに対して大過剰量（例えば
１０〜３０倍量）の非標識試料ＤＮＡを加え、上述した
不特定変異の検出の項と同様の操作により熱変性、アニ
ーリングを行う。その結果、検体が標識標準ＤＮＡと同
じ配列を有する場合には、その標識ＤＮＡが再構成され
る確率は数学的なものとなり、非標識ＤＮＡの過剰度に
応じて低くなる。一方、検体が標識標準ＤＮＡと同じ配
列を有しない場合には、もとの標識標準ＤＮＡが効率よ
く再構成される。この違いは上述した発色系によって検
出され、それによって検体が特定変異遺伝子を有するか
否かを判定する。ここで、解析するエキソンによってそ
の鎖長、塩基配列が異なるために解析する領域ごとに適
切なカットオフ値を設定することで判定が可能になる。

【００８１】このようにして、不特定変異遺伝子の存在
が明らかになったもののうち、該当するエキソンに未だ
変異が報告されていないもの、および相当するエキソン
の報告されている変異遺伝子と配列の異なるもの等につ
いては、新規変異遺伝子として塩基配列の確認を行い、
新たな変異遺伝子として検出すべき特定変異遺伝子のグ
ループに加え、更なる診断および判定に使用することが
できる。

【００８２】本発明において、「脂質代謝異常により引
き起こされる疾患」には、動脈硬化症、高脂血症、狭心
症、心筋症、若年性突然死、外科的手術における事故が
含まれる。

【００８３】特発性心筋症は心筋症とも呼ばれ1980年、
世界保健機構/世界心臓病学会連合の心筋症委員会にお
いて「原因未知の心筋疾患」と定義されたが1995年には
「心機能不全を伴う心筋疾患」と再定義され、従来の肥
大型、拡張型、拘束型の他に不整脈原性右室心筋症を加
えた分類がなされた。ＣＤ３６完全欠損例では今まで原
因不明とされていた心筋症病態を呈する例が多く、本遺
伝子が心筋症（肥大型あるいは拡張型）の原因遺伝子の
一つと考えられる。心筋超音波断層を含む従来の検査法
では、幼若年期の心筋症の診断は困難なことが多いが、
本発明による判定法によれば出生前および出生直後の診
断が可能である。また、両親の遺伝子を検索することに
より、子供の遺伝子異常を推測することができる。特
に、心移植しか治療の手段の無い拡張型心筋症の進展や
予後の判定に、本発明の判定法は有効である。

【００８４】幼若年者の突然死は、一見健康と思われる
児童の運動中、運動直後に発生することが多い。本発明
者等の検討によれば、これまでに調査を行ったＣＤ３６
欠損症患者の家系には、乳児あるいは乳幼児期や小児期
に突然死をした者が少なからず存在していることが判明
した。

【００８５】ＣＤ３６欠損症患者が突然死に至る機序と
して、以下のように考えられる。心筋の主たるエネルギ
ー源である長鎖脂肪酸代謝障害が存在する条件では、代
替エネルギー源、例えばブドウ糖が使われる。従って、
長鎖脂肪酸取り込み障害が存在する条件下で、ブドウ糖
利用障害（例えば低血糖、空腹下での過激な運動、感染
症に起因する食指不振、下痢、嘔吐、発熱あるいは糖代
謝に必要なビタミンB１不足など）が加わると、重篤な
事態を引き起こし、致死的なポンプ機能不全・不整脈を
誘発しやすい状態になるものと推察される。出生後ある
いは就学前にＣＤ３６遺伝子を解析し、ＣＤ３６遺伝子
異常の存在を前もって知り、適切な指導を行うことがで
きれば、若年者の突然死を含むこれらの事態を予防する
ことができる。また、原因不明の心疾患の家族歴（遺伝
歴）を有する夫婦が子共を希望する際、両親の遺伝子の
解析は、ＣＤ３６遺伝子異常の推測が可能であり、夫婦
間での将来設計に有用と考えられる。

【００８６】外科技術の発達により、多くの心臓手術が
行われているが、長鎖脂肪酸取り込み障害が存在するよ
うな症例においては、正常例と同様の心筋保護あるいは
術後管理では不利なことが考えられる。事実、ＣＤ３６
欠損例で術後の予後が悪い症例が存在する。従って、Ｃ
Ｄ３６遺伝子の解析は、心臓手術のみならず大規模な手
術を必要とする場合の術中、術後の事故発生の予防に有
用と考えられる。

【００８７】

【実施例】本発明者らは６９７０人の心臓に病歴のある
人および疑いのある人について、長鎖脂肪酸の類似体で
ある放射標識したiodine-labeled 15-(p-iodophenyl)-3
-R,S-methylpentagecanoic acid (BMIPP)を用いた心筋
シンチトグラムをとったところ、０．４７％に相当する
３３名で心筋への脂肪酸の取り込みが完全に欠落してい
た（データ省略）。このうち、２８名については染色体
ＤＮＡを調製することが可能であった。これとは別に心
筋への脂肪酸の取り込みが見られない心臓疾患を有する
１３名から染色体ＤＮＡを調製した。これを合わせて合
計４１検体について、フローサイトメトリー（flow cyt
ometry）で血小板、および単球におけるＣＤ３６タンパ
クの発現を調べた結果、すべての例で血小板および単球
ともＣＤ３６タンパクを発現していないことが解った
（データ省略）。

【００８８】本発明者らはこれら４１検体につき染色体
ＤＮＡを調製し、そのエキソン全領域に関して遺伝子変
異の解析を行った。その結果、調べた４１検体すべてに
おいてエキソン４のＣ４７８Ｔ変異のｈｏｍｏｚｙｇｏ
ｔｅ、或いは２種類の変異遺伝子をもつことが明らかに
なった（データ省略）。

【００８９】また、この遺伝子に関して変異遺伝子を一
方にしかもたないｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅの人におい
ても、部分的に長鎖脂肪酸の心筋への取り込みが見られ
ない領域があり (Tanaka et al., J. Mol. Cell Cardio
l., vol 29, . pp 121-127,(1997)) 、心臓へのエネル
ギー供給に何らかの異常が生じていると考えられる。

【００９０】下記実施例においては上記４１検体につい
て試験を実施した。また、重症心不全に陥った２７名の
心筋症患者に対してバチスタ手術によって切除した組織
から染色体ＤＮＡを精製し、ＣＤ３６遺伝子変異の検出
を試みた。

【００９１】実施例１：ＣＤ３６遺伝子内の不特定変異
検出ＣＤ３６遺伝子内の不特定変異を検出する方法を以下に
詳述する。以下の実施例ではエキソン部分に存在する変
異の検出の例について詳述するが、他の領域、即ちイン
トロン部分、遺伝子の上流のプロモーターを含む転写制
御に関する領域、遺伝子下流のノンコーディング領域も
同様な方法で解析することができる。また、以下にはＰ
ＣＲ−ＰＨＦＡ法（Ｉ）による不特定変異検出法につい
て記述するが、不特定変異遺伝子を検出することが可能
な他のいかなる方法、即ちＳＳＣＰ、ＤＧＧＥ、ミスマ
ッチ切断法等による解析を行うことができる。また、Ｐ
ＣＲに使用したプライマー配列は、特異的に標的遺伝子
領域を増幅できるものであれば、本実施例の配列に限定
されるものではない。

【００９２】（１）エキソン３の不特定変異の検出以下にエキソン３における不特定変異の検出法について
詳述する。

【００９３】（ｉ）野生型非標識標準ＤＮＡの調製ＣＤ３６遺伝子に関して野生型の配列を有する染色体Ｄ
ＮＡを、末梢血リンパ球を原料としてQIAamp blood kit
（QIAGEN社製）を使用して抽出した。

【００９４】CD36-3U: 5'-OH-TTCTGTTTTATGATCTCTTTCTA
AT（配列番号１３） CD36-3L: 5'-OH-AATGAGAGGATATTCTTTGACTAC（配列番号
１４）上記の配列を有するＣＤ３６エキソン３増幅用非標識プ
ライマー各１０ｐｍｏｌを用いて、抽出した染色体Ｄ
ＮＡ１００ｎｇを鋳型として、２００μＭｄＮＴＰｓ、
２．５ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５ｕｎｉｔＡｍｐ
ｌｉＴａｑＧｏｌｄ（Perkin Elmer - ABI社製）を加
え、Ampli Taq Gold用緩衝液を用いて１００μｌの反応
液を作製した。ＰＣＲ反応装置はGene Amp PCR system
9600（Perkin Elmer - ABI）を用い、９６℃、１２分の
前処理の後、熱変性９４℃、３０秒、アニーリング５０
℃、６０秒および伸長反応７２℃、６０秒を１サイクル
とし、４０サイクル行った。増幅液５０μｌを３％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、２６９ｂｐの鎖長を有す
る目的物のバンドからＤＮＡを抽出した。これをｐＴ７
ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏｒに導入し、大腸菌を形質転換
した。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、塩
基配列を確認し、ｐＥＸ０３Ｗと命名した。

【００９５】１０ｐｇのプラスミドｐＥＸ０４Ｗを鋳型
として、上記のエキソン３増幅用非標識プライマー各１
０ｐｍｏｌを用い、上記組成のＰＣＲ反応液を調製し、
上記サイクル条件でＰＣＲ増幅し、エキソン３野生型非
標識標準ＤＮＡを得た。

【００９６】（ii）標識試料ＤＮＡの調製 Bio-CD36-3U: 5'-biotin-TTCTGTTTTATGATCTCTTTCTAAT
（配列番号１３） DNP-CD36-3L: 5'-DNP-AATGAGAGGATATTCTTTGACTAC（配列
番号１４）患者の末梢血リンパ球からQIAamp blood kitを用いて抽
出した染色体ＤＮＡ３０ｎｇを鋳型として、上記のＣＤ
３６エキソン４増幅用標識プライマー、各３ｐｍｏｌ、
1 unit AmpliTaq Gold（Perkin Elmer - ABI社製）を含
む２００μＭｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２をを加
え、３０μｌのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ用緩衝液中
で、上記ＰＣＲ装置、ＰＣＲサイクル条件にて増幅を行
い、標識試料ＤＮＡを得た。

【００９７】（iii）温度勾配によるアニーリング反応１μｌの標識試料ＤＮＡと１５μｌの非標識標準ＤＮＡ
を含む、終濃度３．３ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣ：０．３
Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、０．３Ｍ塩化ナト
リウム）溶液３０μｌを調製し、Gene Amp PCR system
9600（PerkinElmer - ABI）を用いて熱変性後、温度勾
配によるアニーリングを行った。温度勾配は、９８℃、
１０分間加熱の後、９８℃から７０℃までを１℃／１０
分の速度で徐冷する条件で行った。

【００９８】このとき、非標識標準ＤＮＡの代わりに１
５μｌのAmpli Taq Gold用緩衝液を加えて同様に調製し
たものを同様の熱変性、温度勾配によるアニーリングを
行い、発色陽性コントロールとした。

【００９９】（iv）発色反応（iii）で調製したアニーリング溶液２０μｌをＥＤ−
ＰＣＲ（特許第２７８６８５７号）の系により発色操作
を行った。各検体の発色陽性コントロールの示した吸光
度と、非標識標準ＤＮＡを加えたものの吸光度との比を
求め、標識ＤＮＡが再構成された割合を％で示したもの
をＩｎｄｅｘとし、変異の有無を判定した。

【０１００】（２）エキソン４の不特定変異の検出エキソン４における不特定変異の検出は、使用したプラ
イマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ増
幅物の鎖長が２２１ｂｐであること、および得られた野
生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ０４Ｗであること以
外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検出
した。

【０１０１】CD36-4U: 5'-OH-CATAACCCAAACTTATTTTCTTT
TCC（配列番号１５） CD36-4L: 5'-OH-AGTGTCTCATATTTGTGGGCACTCA（配列番号
１６） Bio-CD36-4U: 5'-biotin-CATAACCCAAACTTATTTTCTTTTCC
（配列番号１５） DNP-CD36-4L: 5'-DNP-AGTGTCTCATATTTGTGGGCACTCA（配
列番号１６）エキソン４における不特定変異検出の結果を表１に示
す。

【０１０２】（３）エキソン５の不特定変異の検出エキソン５における不特定変異の検出は、使用したプラ
イマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ増
幅物の鎖長が２０８ｂｐであること、および得られた野
生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ０５Ｗであること以
外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検出
した。

【０１０３】CD36-5U: 5'-OH-TTTGAATTTTGTTTACTGCTGTT
TC（配列番号１７） CD36-5L: 5'-OH-AATAGATAACTTTGTTGTTTGTCTAC（配列番
号１８） Bio-CD36-5U: 5'-biotin-TTTGAATTTTGTTTACTGCTGTTTC
（配列番号１７） DNP-CD36-5L: 5'-DNP-AATAGATAACTTTGTTGTTTGTCTAC（配
列番号１８）エキソン５における不特定変異検出の結果を表１に示
す。

【０１０４】（４）エキソン６の不特定変異の検出エキソン６における不特定変異の検出は、使用したプラ
イマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ増
幅物の鎖長が２４０ｂｐであること、および得られた野
生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ０６Ｗであること以
外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検出
した。

【０１０５】CD36-6U: 5'-OH-TTGTCTTAAACAGTGACTTTGTT
TT（配列番号１９） CD36-6L: 5'-OH-ATAATATTGCCATTCATATTTGGTA（配列番号
２０） Bio-CD36-6U: 5'-biotin-TTGTCTTAAACAGTGACTTTGTTTT
（配列番号１９） DNP-CD36-6L: 5'-DNP-ATAATATTGCCATTCATATTTGGTA（配
列番号２０）

【０１０６】（５）エキソン７の不特定変異の検出エキソン７における不特定変異の検出は、使用したプラ
イマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ増
幅物の鎖長が１５２ｂｐであること、および得られた野
生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ０７Ｗであること以
外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検出
した。

【０１０７】CD36-7U: 5'-OH-AAGTAACATTTTCCCATACATAT
AT（配列番号２１） CD36-7L: 5'-OH-CATACATGCACATTTTACCAGAATA（配列番号
２２） Bio-CD36-7U: 5'-biotin-AAGTAACATTTTCCCATACATATAT
（配列番号２１） DNP-CD36-7L: 5'-DNP-CATACATGCACATTTTACCAGAATA（配
列番号２２）

【０１０８】（６）エキソン８の不特定変異の検出エキソン８における不特定変異の検出は、使用したプラ
イマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ増
幅物の鎖長が１０７ｂｐであること、および得られた野
生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ０８Ｗであること以
外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検出
した。

【０１０９】CD36-8U: 5'-OH-TGTTTATTCATTGTCTTTTTCTA
TT（配列番号２３） CD36-8L: 5'-OH-CTGTGATGACCACAAAACAAATATT（配列番号
２４） Bio-CD36-8U: 5'-biotin-TGTTTATTCATTGTCTTTTTCTATT
（配列番号２３） DNP-CD36-8L: 5'-DNP-CTGTGATGACCACAAAACAAATATT（配
列番号２４）

【０１１０】（７）エキソン９の不特定変異の検出エキソン９における不特定変異の検出は、使用したプラ
イマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ増
幅物の鎖長が１３０ｂｐであること、および得られた野
生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ０９Ｗであること以
外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検出
した。

【０１１１】CD36-9U: 5'-OH-CTAATCATTTGCCACTCGATTTT
TA（配列番号２５） CD36-9L: 5'-OH-AGCATACTTATACTTCAGTATCTGT（配列番号
２６） Bio-CD36-9U: 5'-bioitn-TAATCATTTGCCACTCGATTTTTA
（配列番号２５） DNP-CD36-9L: 5'-DNP-AGCATACTTATACTTCAGTATCTGT（配
列番号２６）

【０１１２】（８）エキソン１０の不特定変異の検出エキソン１０における不特定変異の検出は、使用したプ
ライマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ
増幅物の鎖長が２５０ｂｐであること、および得られた
野生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ１０Ｗであること
以外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検
出した。

【０１１３】CD36-10U: 5'-OH-TGGAATGCAGCTCTTTTTTCTC
TGT（配列番号２７） CD36-10L: 5'-OH-ATGGACTGTGCTACTGAGGTTATTT（配列番
号２８） Bio-CD36-10U:5'-biotin-TGGAATGCAGCTCTTTTTTCTCTGT
（配列番号２７） DNP-CD36-10L:5'-DNP-ATGGACTGTGCTACTGAGGTTATTT（配
列番号２８）エキソン１０における不特定変異検出の結果を表１に示
す。

【０１１４】（９）エキソン１１の不特定変異の検出エキソン１１における不特定変異の検出は、使用したプ
ライマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ
増幅物の鎖長が１７９ｂｐであること、および得られた
野生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ１１Ｗであること
以外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検
出した。

【０１１５】CD36-11U: 5'-OH-TTCCAATTGACTCTTAAAACTT
GTC（配列番号２９） CD36-11L: 5'-OH-CCAAATCAGATCAATAAGGTGTTTT（配列番
号３０） Bio-CD36-11U: 5'-biotin-TTCCAATTGACTCTTAAAACTTGTC
（配列番号２９） DNP-CD36-11L: 5'-DNP-CCAAATCAGATCAATAAGGTGTTTT（配
列番号３０）

【０１１６】（１０）エキソン１２の不特定変異の検出エキソン１２における不特定変異の検出は、使用したプ
ライマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ
増幅物の鎖長が１３４ｂｐであること、および得られた
野生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ１２Ｗであること
以外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検
出した。

【０１１７】CD36-12U: 5'-OH-TTGGTAATTATTTAGTTGTTCT
CTT（配列番号３１）または CD36-12U2: 5'-OH-TTGGTAATTATTTAGTTGTTCTCTTTTTAG
（配列番号３２） CD36-12L2: 5'-OH-TATCAAAATAACCATTTTCAAGAGACTCAC
（配列番号３３） Bio-CD36-12U: 5'-biotin-TTGGTAATTATTTAGTTGTTCTCTT
（配列番号３１）または Bio-CD36-12U2: 5'-biotin-TTGGTAATTATTTAGTTGTTCTCTT
TTTAG（配列番号３２） DNP-CD36-12L2: 5'-DNP-TATCAAAATAACCATTTTCAAGAGACTC
AC（配列番号３３）

【０１１８】（１１）エキソン１３の不特定変異の検出エキソン１３における不特定変異の検出は、使用したプ
ライマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ
増幅物の鎖長が１２２ｂｐであること、および得られた
野生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ１３Ｗであること
以外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検
出した。

【０１１９】CD36-13U3: 5'-OH-AGTTTATATGTTCATAATTAT
TTTCAACGT（配列番号３４） CD36-13L2: 5'-OH-TTTTAATGACTAACAGCTGCAAATACAAAC
（配列番号３５） Bio- CD36-13U3: 5'-biotin-AGTTTATATGTTCATAATTATTTT
CAACGT（配列番号３４） DNP- CD36-13L2: 5'-DNP-TTTTAATGACTAACAGCTGCAAATACA
AAC（配列番号３５）

【０１２０】（１２）エキソン１４の不特定変異の検出エキソン１４における不特定変異の検出は、使用したプ
ライマー配列が以下のものであること、得られるＰＣＲ
増幅物の鎖長が２２５ｂｐであること、および得られた
野生型配列を持つプラスミドがｐＥＸ１４Ｗであること
以外はエキソン３と同様な操作を行って変異遺伝子を検
出した。このＰＣＲ増幅物にはエキソン１４に存在する
終止コドンの下流約３０塩基が含み、それよりも下流の
領域は含まない。

【０１２１】CD36-14U: 5'-OH-AAATAATGTTGATTATTAACTT
GAT（配列番号３６） CD36-14L: 5'-OH-TGAAGCAATATTTTTTGGTACATAC（配列番
号３７） Bio-CD36-14U: 5'-biotin-AAATAATGTTGATTATTAACTTGAT
（配列番号３６） DNP-CD36-14L: 5'-DNP-TGAAGCAATATTTTTTGGTACATAC（配
列番号３７）

【０１２２】表1：エキソン4、#5、#10の不特定変異検
出の結果

【表１】

【０１２３】Wild：野生型、Hetero：変異が片側のアレ
ルに存在する、Homo：変異が両側のアレルに存在する。

【０１２４】判定は以下のカットオフ値にしたがった。

【０１２５】エキソン4 Wild：Index < 10、hetero
zygote：10 ≦ Index < 30、homozygote（mutant）：30
≦ Index エキソン5 Wild：Index < 15、heterozygote：15
≦ Index < 40、homozygote（mutant）：40 ≦ Index エキソン10 Wild：Index < 10、heterozygote：10
≦ Index < 30、homozygote（mutant）：30 ≦ Index

【０１２６】実施例２：ＣＤ３６遺伝子内の特定変異検
出ＣＤ３６遺伝子内の特定変異を検出する方法を以下に詳
述する。以下の実施例ではエキソン部分に存在する変異
の検出の例について詳述するが、他の領域、即ちイント
ロン部分、遺伝子の上流のプロモーターを含む転写制御
に関する領域、遺伝子下流のノンコーディング領域も同
様な方法で解析することができる。また、以下にはＰＣ
Ｒ−ＰＨＦＡ法（ＩＩ）による特定変異検出法について
記述するが、特定変異遺伝子を検出することが可能な他
のいかなる方法、即ちＡＳＯ法、ＳＳＰ法、ｄｉｒｅｃ
ｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ等による解析を行うことがで
きる。また、ＰＣＲに使用したプライマー配列は、特異
的に標的遺伝子領域を増幅できるものであれば、本実施
例の配列に限定されるものではない。

【０１２７】本実験を開始する時点で本遺伝子には以下
にあげる３種類の変異遺伝子が報告されていた。

【０１２８】Ｃ４７８Ｔ変異：エキソン４の４７８番目
のシトシンがチミンに置換したもの。

【０１２９】５３９ＡＣ欠失：エキソン５の５３９、５
４０番目のアデニンとチミンが欠失したもの。

【０１３０】１１５９Ａ挿入：エキソン１０の１１５９
番目にアデニンが挿入されたもの。

【０１３１】上記変異遺伝子はＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によ
って同定することが可能で、本実験に用いた染色体ＤＮ
Ａはこの方法で同定したものである。

【０１３２】以下に本願で行った特定変異の検出法につ
いて述べる。

【０１３３】（１）エキソン４の特定変異検出（ｉ）標識標準ＤＮＡの調製エキソン４においては今までにＣ４７８Ｔの変異が同定
されている。この変異遺伝子は野生遺伝子に存在する制
限酵素Ｓａｕ９６Ｉの切断部位が消失することが知られ
ており、これによってこの変異遺伝子を同定することが
できる。このようにして同定したＣ４７８Ｔ変異遺伝子
を有する染色体ＤＮＡを、ＣＤ３６エキソン４増幅用非
標識プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、その増幅物をｐ
Ｔ７Ｂｌｕｅ−ＴＶｅｃｔｏｒに導入し、大腸菌を形
質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製
し、塩基配列を確認しｐＥＸ０４Ｍを得た。

【０１３４】エキソン４の不特定検出の項で作製したｐ
ＥＸ０４Ｗ、および上記操作で作製したｐＥＸ０４Ｍ各
１０ｐｇを鋳型としてＣＤ３６エキソン４増幅用標識プ
ライマー各１０ｎｍｏｌを用いて１００μｌの反応系で
ＰＣＲ増幅を行うことによって野生型、Ｃ４７８Ｔ変異
型の標識標準ＤＮＡを調製した。なお、反応条件等は既
述の通りである。

【０１３５】（ii）非標識試料ＤＮＡの調製患者の末梢リンパ球から既述のキットを用いて染色体Ｄ
ＮＡを調製した。染色体ＤＮＡ５０ｎｇを鋳型として、
ＣＤ３６エキソン４増幅用非標識プライマー各５ｐｍｏ
ｌ、AmpliTaq God 1.5 unitを用いて液量５０μｌでＰ
ＣＲ増幅を行った。

【０１３６】（iii）温度勾配によるアニーリング１μｌの標識標準ＤＮＡと１５μｌの非標識試料ＤＮＡ
を含む、終濃度３．３ｘＳＳＣ溶液３０μｌを調製し、
Gene Amp PCR system 96を用いて熱変性後、温度勾配に
よるアニーリングを行った。温度勾配は、９８℃、１０
分間加熱の後、９８℃から７０℃までを１℃／１０分の
速度で徐冷する条件で行った。

【０１３７】このとき、非標識試料ＤＮＡの代わりに１
５μｌのAmpli Taq Gold用緩衝液を加えて同様に調製し
たものを同様の熱変性、温度勾配によるアニーリングを
行い、発色陽性コントロールとした。

【０１３８】（iv）発色反応（iii）で調製したアニーリング溶液２０μｌをＥＤ−
ＰＣＲの系により発色操作を行った。各検体の発色陽性
コントロールの示した吸光度と、非標識試料ＤＮＡを加
えたものの吸光度との比を求め、標識ＤＮＡが再構成さ
れた割合を％で示したものをＩｎｄｅｘとし、変異の有
無を判定した。

【０１３９】（２）エキソン５の特定変異検出（ｉ）標識標準ＤＮＡの調製エキソン５においては今までに５３９ＡＣ欠失の変異が
同定されている。この変異遺伝子を有する染色体ＤＮＡ
を、ＣＤ３６エキソン５増幅用非標識プライマーを用い
てＰＣＲ増幅し、その増幅物をpT7Blue - T Vectorに導
入し、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換体から
プラスミドを調製し、塩基配列を確認しｐＥＸ０５Ｍを
得た。

【０１４０】（ｉｉ）非標識試料ＤＮＡの調製患者の末梢リンパ球から既述のキットを用いて染色体Ｄ
ＮＡを調製した。染色体ＤＮＡ５０ｎｇを鋳型として、
ＣＤ３６エキソン５増幅用非標識プライマー各５ｐｍｏ
ｌ、AmpliTaq God 1.5 unitを用いて液量５０μｌでＰ
ＣＲ増幅を行った。

【０１４１】（iii）温度勾配によるアニーリングエキソン４の特定変異検出と同様の操作を行った。

【０１４２】（iv）発色反応エキソン４の特定変異検出と同様の操作を行った。

【０１４３】（３）エキソン１０の特定変異検出（ｉ）標識標準ＤＮＡの調製エキソン１０においては今までに１１５９Ａ挿入変異が
同定されている。この変異遺伝子を有する染色体ＤＮＡ
を、ＣＤ３６エキソン１０増幅用非標識プライマーを用
いてＰＣＲ増幅し、その増幅物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ
Ｖｅｃｔｏｒに導入し、大腸菌を形質転換した。得られ
た形質転換体からプラスミドを調製し、塩基配列を確認
しｐＥＸ１０Ｍを得た。

【０１４４】（ii）非標識試料ＤＮＡの調製患者の末梢リンパ球から既述のキットを用いて染色体Ｄ
ＮＡを調製した。染色体ＤＮＡ５０ｎｇを鋳型とし
て、ＣＤ３６エキソン１０増幅用非標識プライマー各５
ｐｍｏｌ、AmpliTaq God 1.5 unitを用いて液量５０μ
ｌでＰＣＲ増幅を行った。

【０１４５】（iii）温度勾配によるアニーリングエキソン４の特定変異検出と同様の操作を行った。

【０１４６】（iv）発色反応エキソン４の特定変異検出と同様の操作を行った。

【０１４７】

【表２】

【０１４８】Wild：野生型、Hetero：変異が片側のアレ
ルに存在する、Homo：変異が両側のアレルに存在する。

【０１４９】変異遺伝子は以下のものを用いたエキソン4：C478T置換、エキソン5：539A挿入、エキソ
ン10：1159AC欠失いずれのエキソンともIndexが20以下のものを陽性と判
定した。

【０１５０】実施例３：ＣＤ３６遺伝子内の新規変異遺
伝子の同定すでに述べた方法によって患者のＣＤ３６遺伝子の解析
を行い、不特定変異の検出の項で変異が存在すると判定
されたもののうち、特定変異の検出の項で変異が検出さ
れなかったものについては今までに報告されていない変
異遺伝子を持つことが示唆される。

【０１５１】（１）変異遺伝子Ｅｘ１３ｄｅｌ１２
の同定検体＃０３はＣＤ３６遺伝子の特定、不特定変異の検出
によって、エキソン４のＣ４７８Ｔ変異のほかにエキソ
ン１３に何らかの変異を持つことが示唆された。この検
体のエキソン１３に存在する新たな変異遺伝子の同定法
について詳細する。

【０１５２】検体＃０３の染色体ＤＮＡ１００ｎｇを鋳
型としてＣＤ３６エキソン１３増幅用非標識プライマー
（配列は既述）各１００ｐｍｏｌ、２．５ｕｎｉｔのAm
pliTaq Goldを用い、既述の組成を持つＰＣＲ反応液を
調製した。これを既述の条件でＰＣＲ増幅を行い、増幅
物を得た。３％アガロースゲル電気泳動を行い、目的の
フラグメントを抽出し、ｐＴ７ＢｌｕｅＴ−Ｖｅｃｔｏ
ｒに導入後、大腸菌を形質転換した。得られた形質転換
体からプラスミドＤＮＡを抽出し、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ
３７７を用いて塩基配列の決定を行った。その結果、こ
の検体はエキソン１３の内部に１２塩基の欠失があるこ
とが明らかになった。この変異によって生成するタンパ
クはＩｌｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅの４アミノ酸が欠
失したものとなる。

【０１５３】なお、検体＃１０７、＃２０１、＃３２６
も同じ変異遺伝子を持つことが解った。

【０１５４】（２）変異遺伝子Ｅｘ１３ｄｕｐ４３
の同定検体＃０７はＣＤ３６遺伝子の特定、不特定変異の検出
によって、エキソン５の５３９ＡＣ欠失以外にエキソン
１３に変異を持つことが示唆された。この検体をＣＤ３
６エキソン１３増幅用非標識プライマー（配列は既述）
によってＰＣＲ増幅後、上述の方法により塩基配列を確
認した。その結果、この検体はエキソン１３内に４３ｂ
ｐの配列が重複していることが明らかになった。この結
果、途中に終止コドンが出現し、生成するタンパクは未
成熟な状態で翻訳が停止する。

【０１５５】（３）変異遺伝子Ｅｘ１３ｓｋｉｐの同
定検体＃２０６はＣＤ３６遺伝子の特定、不特定変異の検
出によって、エキソン１０の１１５９Ａ挿入以外にエキ
ソン１３に変異を持つことが示唆された。この検体をＣ
Ｄ３６エキソン１３増幅用非標識プライマー（配列は既
述）によってＰＣＲ増幅後、上述の方法により塩基配列
を確認した。その結果、この検体はエキソン１３の直前
のイントロン部分からエキソン部分にかけて１０塩基の
欠失が見られた。これによってイントロンの３'−ｓｐ
ｌｉｃｅａｃｃｅｐｔｏｒ部位の配列が変化し、スプ
ライシング異常が生じることが予想される。

【０１５６】ｃＤＮＡの配列決定の結果、この検体はエ
キソン１２からエキソン１４につながっており、エキソ
ン１３が完全に欠落（ｓｋｉｐ）していることが確認さ
れた。

【０１５７】なお、この解析によって、J. Biol. Chem.
(1994), vol 22, pp 18985-18991に示されているCD36
の野生型遺伝子のエキソン13上流のイントロン配列が5'
-gttcataattattttcaacgtattacg-エキソン13ではなく5'-
gttcataattattttcaacgtatattacg-エキソン13であること
が明らかになった。

【０１５８】（４）変異遺伝子Ｔ９７０Ｃの同定検体＃１０４はＣＤ３６遺伝子の特定、不特定変異の検
出によって、エキソン４のＣ４７８Ｔ変異のほかにエキ
ソン９に変異をもつことが示唆された。この検体をＣＤ
３６エキソン９増幅用非標識プライマー（配列は既述）
によってＰＣＲ増幅後、上述の方法により塩基配列を確
認した。その結果、エキソン９の９７０番目のチミンが
シトシンに置換していることが確認された。これによ
り、この遺伝子から発現されるタンパクはＰｈｅからＶ
ａｌに置換したものとなる。

【０１５９】（５）変異遺伝子７７０Ａ挿入の同定検体＃８０５はＣＤ３６遺伝子の特定、不特定変異の検
出によって、エキソン４のＣ４７８Ｔ変異のほかにエキ
ソン６に変異をもつことが示唆された。この検体をＣＤ
３６エキソン６増幅用非標識プライマー（配列は既述）
によってＰＣＲ増幅後、上述の方法により塩基配列を確
認した。その結果、エキソン６の７７０番目にチミンが
１塩基挿入していることが確認された。これにより、リ
ーディングフレームがずれ、終止コドンが出現し、この
遺伝子から発現されるタンパクは未成熟なタンパクとな
る。

【０１６０】（６）変異遺伝子Ｔ６２０Ｃの同定検体＃４１３はＣＤ３６遺伝子の特定、不特定変異の検
出によって、エキソン５に既に報告されている変異、５
３９ＡＣ欠失以外の変異遺伝子をもつことが示唆され
た。この検体をＣＤ３６エキソン５増幅用非標識プライ
マー（配列は既述）によってＰＣＲ増幅後、上述の方法
により塩基配列を確認した。その結果、エキソン５の６
２０番目のチミンがシトシンに置換していることが確認
された。これにより、この遺伝子から発現されるタンパ
クはＶａｌからＡｌａに置換したものとなる。

【０１６１】以下に検体#413を解析した結果を示す。表
3には不特定変異の検出の結果を、表４にはエキソン5で
知られていた539ACdelの特定変異の検出の結果を示す。

【０１６２】

【表３】

【０１６３】

【表４】

【０１６４】カットオフ値２０以下のものを陽性と判定
した。その結果、#413の検体は表３の結果からエキソン
5に何らかの変異を有するが、既に報告されている539AC
delの変異遺伝子は有しないと言う結論になる。このこ
とからこの検体が新規変異遺伝子を有することが強く示
唆された。

【０１６５】（７）変異遺伝子Ｔ７１６Ｇの同定検体＃８７２はＣＤ３６遺伝子の特定、不特定変異の検
出によって、エキソン６に、本発明によって明らかとな
った７７０Ａ挿入（770insA）以外の変異を持つことが
示唆された。この検体をエキソン６増幅用プライマー
（配列は既述）によってＰＣＲ増幅後、上述の方法によ
り塩基配列を確認した。その結果、エキソン６の７１６
番目のチミンがグアニンに置換していることが確認され
た。これにより、この遺伝子からは１６９番目のアミノ
酸が本体のメチオニン（ATG）からアルギニン（ACG）に
変異したタンパク質を生成する。

【０１６６】（８）変異遺伝子Ex12 Skipの同定検体#811はＣＤ３６変異遺伝子の特定、不特定変異の検
出によって、エキソン４のC478T変異以外にエキソン１
２に変異を有することが示唆された。この検体をエキソ
ン１２増幅用プライマー（配列は既述）によって、ＰＣ
Ｒ増幅後、上述の方法により塩基配列を確認した。その
結果、エキソン１２の上流に存在するイントロン部分に
７塩基の欠失が存在することが明らかとなった。これに
よってイントロンの３’−splice acceptor部位の配列
が変化し、スプライシング異常が生じることが予想され
る。ｃＤＮＡの配列決定の結果、この検体はエキソン１
１からエキソン１３につながっており、エキソン１２が
完全に欠落（skip）していることが確認された。

【０１６７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> WAKUNAGA PHARMACEUTICAL CO.,LTD. <120> CD36 MUTANT GENE AND METHODS FOR DETERMINING DISEASES CAUSED BY AB NORMAL LIPID METABOLISM AND DIAGNOSTIC KITS THEREFOR <130> 123052US <150> JP3446/1999 <151> 1999-01-08 <150> JP264052/1999 <151> 1999-09-17 <160> 44 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 112 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtttatatg ttcataatta ttttcaacgt atattacaga gtattaaaga atctgaagag 60 gaactatctt tggcttaatg aggtttgtat ttgcagctgt tagtcattaa aa 112 <210> 2 <211> 167 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 agtttatatg ttcataatta ttttcaacgt atattacaga gtattaaaga atctgaagag 60 gaactatatt gtgcctattc tttggcttaa agaatctgaa gaggaactat attgtgccta 120 ttctttggct taatgaggtt tgtatttgca gctgttagtc attaaaa 167 <210> 3 <211> 114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agtttatatg ttcataatta ttttcaacgt atattaaaga atctgaagag gaactatatt 60 gtgcctattc tttggcttaa tgaggtttgt atttgcagct gttagtcatt aaaa 114 <210> 4 <211> 127 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ttggtaatta tttagttgtt ctcttaactg gattcacttt acaatttgca aaacggctgc 60 aggtcaacct attggtcaag ccatcagaaa aaattcagtg agtctcttga aaatggttat 120 tttgata 127 <210> 5 <211> 130 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ctaatcattt gccactcgat ttttaaacag atgcagcctc acttccacct tttgttgaga 60 aaagccaggt attgcagttc ttttcttctg atatttgcag gtaagacaga tactgaagta 120 taagtatgct 130 <210> 6 <211> 241 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ttgtcttaaa cagtgacttt gtttttgtag gctgcatccc atatctatca aaatcaattt 60 gttcaaatga tcctcaattc acttattaac aagtcaaaat cttctatgtt ccaagtcaga 120 actttgagag aactgttatg gggctatagg gatccatttt ttgagtttgg ttccgtaccc 180 tgttactacc acagttggtc tgttttatcc tgtaagtacc aaatatgaat ggcaatatta 240 t 241 <210> 7 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ttgtcttaaa cagtgacttt gtttttgtag gctgcatccc atatctatca aaatcaattt 60 gttcaaatga tcctcaattc acttattaac aagtcaaaat cttctaggtt ccaagtcaga 120 actttgagag aactgttatg gggctatagg gatccatttt tgagtttggt tccgtaccct 180 gttactacca cagttggtct gttttatcct gtaagtacca aatatgaatg gcaatattat 240 <210> 8 <211> 207 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tttgaatttt gtttactgct gtttctttag agttcgtttt ctagccaagg aaaatgtaac 60 ccaggacgct gaggacaaca cagtctcttt cctgcagccc aatggtgcca tcttcgaacc 120 ttcactatca gttggaacag aggctgcaac ttcacagctc tcaatctggc tgtggcagtg 180 agtagacaaa caacaaagtt atctatt 207 <210> 9 <211> 1870 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaaaaatcct tcttagccat tttaaagata gctttccaat gattagacga attgattctt 60 tctgtgactc atcagttcct ttcctgtaaa attcatgtct tgctgttgat ttgtgaataa 120 gaaccagagc ttgtagaaac cactttaatc atatccagga gtttgcaaga aacaggtgct 180 taacactaat tcacctcctg aacaagaaaa atgggctgtg accggaactg tgggctcatc 240 gctggggctg tcattggtgc tgtcctggct gtgtttggag gtattctaat gccagttgga 300 gacctgctta tccagaagac aattaaaaag caagttgtcc tcgaagaagg tacaattgct 360 tttaaaaatt gggttaaaac aggcacagaa gtttacagac agttttggat ctttgatgtg 420 caaaatccac aggaagtgat gatgaacagc agcaacattc aagttaagca aagaggtcct 480 tatacgtaca gagttcgttt tctagccaag gaaaatgtaa cccaggacgc tgaggacaac 540 acagtctctt tcctgcagcc caatggtgcc atcttcgaac cttcactatc agttggaaca 600 gaggctgaca acttcacagt tctcaatctg gctgtggcag ctgcatccca tatctatcaa 660 aatcaatttg ttcaaatgat cctcaattca cttattaaca agtcaaaatc ttctatgttc 720 caagtcagaa ctttgagaga actgttatgg ggctataggg atccattttt gagtttggtt 780 ccgtaccctg ttactaccac agttggtctg ttttatcctt acaacaatac tgcagatgga 840 gtttataaag ttttcaatgg aaaagataac ataagtaaag ttgccataat cgacacatat 900 aaaggtaaaa ggaatctgtc ctattgggaa agtcactgcg acatgattaa tggtacagat 960 gcagcctcat ttccaccttt tgttgagaaa agccaggtat tgcagttctt ttcttctgat 1020 atttgcaggt caatctatgc tgtatttgaa tccgacgtta atctgaaagg aatccctgtg 1080 tatagatttg ttcttccatc caaggccttt gcctctccag ttgaaaaccc agacaactat 1140 tgtttctgca cagaaaaaat tatctcaaaa aattgtacat catatggtgt gctagacatc 1200 agcaaatgca aagaagggag acctgtgtac atttcacttc ctcattttct gtatgcaagt 1260 cctgatgttt cagaacctat tgatggatta aacccaaatg aagaagaaca taggacatac 1320 ttggatattg aacctataac tggattcact ttacaatttg caaaacggct gcaggtcaac 1380 ctattggtca agccatcaga aaaaattcaa gtattaaaga atctgaagag gaactatatt 1440 gtgcctattc tttggcttaa tgagactggg accattggtg atgagaaggc aaacatgttc 1500 agaagtcaag taactggaaa aataaacctc cttggcctga tagaaatgat cttactcagt 1560 gttggtgtgg tgatgtttgt tgcttttatg atttcatatt gtgcatgcag atcgaaaaca 1620 ataaaataag tatgtaccaa aaaatattgc ttcaataata ttagcttata tattacttgt 1680 tttcacttta tcaaagagaa gttacatatt aggccatata tatttctaga catgtctagc 1740 cactgatcat ttttaaatat aggtaaataa acctataaat attatcacgc agatcactaa 1800 agtatatctt taattctggg agaaatgaga taaaagatgt acttgtgacc attgtaacaa 1860 tagcacaaat 1870 <210> 10 <211> 221 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 cataacccaa acttattttc ttttccatag caagttgtcc tcgaagaagg tacaattgct 60 tttaaaaatt gggttaaaac aggcacagaa gtttacagac agttttggat ctttgatgtg 120 caaaatccac aggaagtgat gatgaacagc agcaacattc aagttaagca aagaggttct 180 tatacgtaca ggtgagtgag tgcccacaaa tatgagacac t 221 <210> 11 <211> 206 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tttgaatttt gtttactgct gtttctttag agttcgtttt ctagccaagg aaaatgtaac 60 ccaggacgct gaggacaaca gtctctttcc tgcagcccaa tggtgccatc ttcgaacctt 120 cactatcagt tggaacagag gctgacaact tcacagttct caatctggct gtggcagtga 180 gtagacaaac aacaaagtta tctatt 206 <210> 12 <211> 251 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 tggaatgcag ctcttttttc tctgtattta ggtcaatcta tgctgtattt gaatccgacg 60 ttaatctgaa aggaatccct gtgtatagat ttgttcttcc atccaaggcc tttgcctctc 120 cagttgaaaa cccagacaac tattgtttct gcacagaaaa aattatctca aaaaaattgt 180 acatcatatg gtgtgctaga catcagcaaa tgcaaagaag gtgagtaaat aacctcagta 240 gcacagtcca t 251 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 ttctgtttta tgatctcttt ctaat 25 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 aatgagagga tattctttga ctac 24 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 cataacccaa acttattttc ttttcc 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 agtgtctcat atttgtgggc actca 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tttgaatttt gtttactgct gtttc 25 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 aatagataac tttgttgttt gtctac 26 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 ttgtcttaaa cagtgacttt gtttt 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 ataatattgc cattcatatt tggta 25 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 aagtaacatt ttcccataca tatat 25 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 catacatgca cattttacca gaata 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tgtttattca ttgtcttttt ctatt 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 ctgtgatgac cacaaaacaa atatt 25 <210> 25 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ctaatcattt gccactcgat tttta 25 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 agcatactta tacttcagta tctgt 25 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 tggaatgcag ctcttttttc tctgt 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 atggactgtg ctactgaggt tattt 25 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 ttccaattga ctcttaaaac ttgtc 25 <210> 30 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 ccaaatcaga tcaataaggt gtttt 25 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 ttggtaatta tttagttgtt ctctt 25 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 ttggtaatta tttagttgtt ctctttttag 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 tatcaaaata accattttca agagactcac 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 agtttatatg ttcataatta ttttcaacgt 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 ttttaatgac taacagctgc aaatacaaac 30 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 aaataatgtt gattattaac ttgat 25 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tgaagcaata ttttttggta catac 25 <210> 38 <211> 124 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 agtttatatg ttcataatta ttttcaacgt atattacaga gtattaaaga atctgaagag 60 gaactatatt gtgcctattc tttggcttaa tgaggtttgt atttgcagct gttagtcatt 120 aaaa 124 <210> 39 <211> 134 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 ttggtaatta tttagttgtt ctctttttag ataactggat tcactttaca atttgcaaaa 60 cggctgcagg tcaacctatt ggtcaagcca tcagaaaaaa ttcagtgagt ctcttgaaaa 120 tggttatttt gata 134 <210> 40 <211> 250 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 tggaatgcag ctcttttttc tctgtattta ggtcaatcta tgctgtattt gaatccgacg 60 ttaatctgaa aggaatccct gtgtatagat ttgttcttcc atccaaggcc tttgcctctc 120 cagttgaaaa cccagacaac tattgtttct gcacagaaaa aattatctca aaaaattgta 180 catcatatgg tgtgctagac atcagcaaat gcaaagaagg tgagtaaata acctcagtag 240 cacagtccat 250 <210> 41 <211> 130 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ctaatcattt gccactcgat ttttaaacag atgcagcctc atttccacct tttgttgaga 60 aaagccaggt attgcagttc ttttcttctg atatttgcag gtaagacaga tactgaagta 120 taagtatgct 130 <210> 42 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ttgtcttaaa cagtgacttt gtttttgtag gctgcatccc atatctatca aaatcaattt 60 gttcaaatga tcctcaattc acttattaac aagtcaaaat cttctatgtt ccaagtcaga 120 actttgagag aactgttatg gggctatagg gatccatttt tgagtttggt tccgtaccct 180 gttactacca cagttggtct gttttatcct gtaagtacca aatatgaatg gcaatattat 240 <210> 43 <211> 208 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 tttgaatttt gtttactgct gtttctttag agttcgtttt ctagccaagg aaaatgtaac 60 ccaggacgct gaggacaaca cagtctcttt cctgcagccc aatggtgcca tcttcgaacc 120 ttcactatca gttggaacag aggctgacaa cttcacagtt ctcaatctgg ctgtggcagt 180 gagtagacaa acaacaaagt tatctatt 208 <210> 44 <211> 221 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 cataacccaa acttattttc ttttccatag caagttgtcc tcgaagaagg tacaattgct 60 tttaaaaatt gggttaaaac aggcacagaa gtttacagac agttttggat ctttgatgtg 120 caaaatccac aggaagtgat gatgaacagc agcaacattc aagttaagca aagaggtcct 180 tatacgtaca ggtgagtgag tgcccacaaa tatgagacac t 221

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2G045 AA25 AA35 DA12 DA13 FB01 FB02 FB03 FB04 FB07 FB08 GC10 4B024 AA11 CA03 CA09 DA06 GA25 HA12 4B063 QA01 QA07 QA08 QA13 QA17 QA19 QQ12 QQ43 QR38 QR56 QR62 QS25 QS34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１〜８から選択されるヌクレオチ
ド配列を含んでなるＣＤ３６変異遺伝子。
【請求項２】下記からなる群から選択される配列からな
る、請求項１に記載のＣＤ３６変異遺伝子：ＣＤ３６遺
伝子配列において配列番号３８のヌクレオチド配列部分
が配列番号１、２、または３のヌクレオチド配列である
ＣＤ３６遺伝子配列、ＣＤ３６遺伝子配列において配列
番号３９のヌクレオチド配列部分が配列番号４のヌクレ
オチド配列であるＣＤ３６遺伝子配列、ＣＤ３６遺伝子
配列において配列番号４１のヌクレオチド配列部分が配
列番号５のヌクレオチド配列であるＣＤ３６遺伝子配
列、ＣＤ３６遺伝子配列において配列番号４２のヌクレ
オチド配列部分が配列番号６または７のヌクレオチド配
列であるＣＤ３６遺伝子配列およびＣＤ３６遺伝子配列
において配列番号４３のヌクレオチド配列部分が配列番
号８のヌクレオチド配列であるＣＤ３６遺伝子配列。
【請求項３】配列番号１〜８から選択されるヌクレオチ
ド配列またはその相補鎖あるいはそれらの変異部分を含
んでなるヌクレオチド断片。
【請求項４】変異部分が、変異を有する配列番号１〜８
から選択されるヌクレオチド配列の連続する少なくとも
１２ヌクレオチドからなるヌクレオチド断片である、請
求項３に記載のヌクレオチド断片。
【請求項５】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出用プロ
ーブである、請求項３または４に記載のヌクレオチド断
片。
【請求項６】請求項１に記載のＣＤ３６変異遺伝子また
はその相補鎖の連続する少なくとも１２ヌクレオチドか
らなるヌクレオチド断片を含んでなるＣＤ３６遺伝子に
おける変異の検出用プライマー。
【請求項７】請求項６に記載の二つのプライマーからな
るプライマーペア。
【請求項８】請求項７に記載のプライマーペアによりＣ
Ｄ３６遺伝子またはＣＤ３６変異遺伝子を増幅すること
により得られたヌクレオチド断片。
【請求項９】ＣＤ３６遺伝子における変異を検出するこ
とを含んでなる、脂質代謝異常により引き起こされる疾
患の判定法。
【請求項１０】ＣＤ３６遺伝子における変異が、エキソ
ン４、エキソン５、エキソン６、エキソン９、エキソン
１０、エキソン１２、またはエキソン１３における変異
である、請求項９に記載の判定法。
【請求項１１】ＣＤ３６遺伝子における変異が、配列番
号１〜８および１０〜１１のいずれかに記載の配列によ
り特定される変異である、請求項９に記載の判定法。
【請求項１２】脂質代謝異常により引き起こされる疾患
が、心筋症、若年性突然死、および外科的手術における
事故からなる群から選択される、請求項９に記載の判定
法。
【請求項１３】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出が、
請求項３に記載のヌクレオチド断片と被験者から単離し
た核酸試料とをハイブリダイズさせ、次いでハイブリダ
イゼーション複合体の存在を検出する工程を含んでなる
ことを特徴とする、請求項９に記載の判定法。
【請求項１４】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出が、
請求項７に記載のプライマーペアを用いて被験者から単
離した核酸試料および標準核酸試料を増幅し、得られた
増幅産物を相補鎖置換反応に付し、相補鎖置換の程度を
検出する工程を含んでなることを特徴とする、請求項９
に記載の判定法。
【請求項１５】ＣＤ３６遺伝子における変異の検出用試
薬を含んでなる、脂質代謝異常により引き起こされる疾
患の診断キット。
【請求項１６】変異の検出用試薬が、請求項１に記載の
ＣＤ３６変異遺伝子またはその相補鎖の連続する少なく
とも１２ヌクレオチドからなるヌクレオチド断片を含ん
でなるものである、請求項１５に記載の診断キット。