WO2010035757A1 - アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 - Google Patents

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affinity chromatography
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田守　功二
哲夫 福田
宮路　正昭
勇 王
毅由 安陪
友亮 岡野
昌輝 籾山
孝広 河合
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Jsr株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a packing material for affinity chromatography.
  • the present invention relates to a packing material for affinity chromatography to which a specific ligand useful for antibody purification is bound.
  • Affinity chromatography is chromatography that uses a column packed with a ligand-immobilized carrier obtained by immobilizing a substance (ligand) that specifically binds to the substance intended for separation and purification on an insoluble carrier, For example, it is used for the separation and purification of biological materials such as proteins and nucleic acids (Japanese Patent Laid-Open No. 6-281638).
  • POROS trade name
  • This filler uses mother particles mainly composed of a hydrophobic styrene-divinylbenzene copolymer. In this filler, non-specific adsorption, which is considered to be mainly caused by the mother particles, may occur, and when used at a high flow rate, the binding capacity is reduced.
  • An object of the present invention is to provide a packing material for affinity chromatography that can maintain a high ligand binding capacity even when separation / purification is performed at a high flow rate that has never been achieved.
  • the packing material for affinity chromatography comprises: A porous mother particle containing a copolymer of a monomer mixture containing a crosslinkable vinyl monomer and an epoxy group-containing vinyl monomer, A ligand is bound to the porous mother particle, The porous mother particle has a ring-opened epoxy group obtained by ring-opening an epoxy group contained in the porous mother particle.
  • the ring-opening epoxy group can contain a substituted or unsubstituted 2,3-dihydroxypropyl group.
  • the ligand may be a protein containing an immunoglobulin binding domain of protein A.
  • the immunoglobulin binding domain of protein A may be at least one selected from the A domain, B domain, C domain, D domain, E domain, and Z domain.
  • the ligand may be an immunoglobulin binding protein represented by the following general formula (1).
  • RR 2 (1) (Wherein R represents an amino acid sequence consisting of 4 to 300 amino acids including a continuous site of 4 to 20 histidines, and R 2 represents 50 to 500 including at least one immunoglobulin binding domain of protein A) (Wherein the terminal where R 2 binds to R is the terminal of the immunoglobulin binding domain).
  • R- can be a group represented by the following general formula (2).
  • R 1 represents an amino acid sequence consisting of 4 to 100 amino acids including a site in which 4 to 20 histidines are continuous (wherein, in R 1 , the end of the site in which the histidines are continuous is r and And r represents an arbitrary amino acid sequence consisting of 7 to 200 amino acids including the TEV domain.)
  • the ligand is one type in which at least one of the amino acid sequence represented by R and the amino acid sequence represented by R 2 in the general formula (1) is selected from lysine, arginine, and cysteine. And a domain t consisting of 1 to 50 amino acids including
  • the ligand may be an immunoglobulin binding protein represented by the following general formula (3).
  • R 2 -R (3) (Wherein R represents an amino acid sequence consisting of 4 to 300 amino acids including a continuous site of 4 to 20 histidines, and R 2 represents 50 to 500 including at least one immunoglobulin binding domain of protein A) (Wherein the terminal where R 2 binds to R is the terminal of the immunoglobulin binding domain).
  • —R can be a group represented by the following general formula (4).
  • R 1 represents an amino acid sequence consisting of 4 to 100 amino acids including a site in which 4 to 20 histidines are continuous (wherein, in R 1 , the end of the site in which the histidines are continuous is r and And r represents an arbitrary amino acid sequence consisting of 7 to 200 amino acids including the TEV domain.)
  • the ligand is one type in which at least one of the amino acid sequence represented by R and the amino acid sequence represented by R 2 in the general formula (3) is selected from lysine, arginine, and cysteine. And a domain t consisting of 1 to 50 amino acids including
  • protein refers to any molecule having a peptide structural unit, for example, a concept including a partial fragment of a natural protein or a variant obtained by artificially modifying the amino acid sequence of a natural protein.
  • the “immunoglobulin binding domain” represents a functional unit of a polypeptide having immunoglobulin binding activity alone, and the “immunoglobulin binding protein” has a specific affinity for immunoglobulin, and Represents a protein comprising an “immunoglobulin binding domain”.
  • TEV domain refers to a site cleaved by TEV (Tobacco Etch Virus) protease.
  • porous mother particles containing a copolymer of a monomer mixture containing a crosslinkable vinyl monomer and an epoxy group-containing vinyl monomer
  • a ligand is bonded to the particle, and the porous mother particle has a ring-opened epoxy group obtained by ring-opening an epoxy group contained in the porous mother particle.
  • High ligand binding capacity can be maintained even during separation and purification at high flow rates.
  • FIG. 1 is a view showing the amino acid sequences of immunoglobulin binding proteins (SPAK, SPAC, SPAKK, SPATK) prepared in Synthesis Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a view showing amino acid sequences of immunoglobulin binding proteins (SPA2K, SPA3K, SPA-His-C, SPA-His-N) prepared in Synthesis Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the structure of a DNA fragment encoding the immunoglobulin binding protein according to Synthesis Example 1 of the present invention, which is inserted into each of three types of expression vectors (pETM-11, pETM-10 and pET29). is there.
  • a filler for affinity chromatography is a porous mother particle containing a copolymer of a monomer mixture containing a crosslinkable vinyl monomer and an epoxy group-containing vinyl monomer.
  • the ligand is bonded to the porous mother particle, and the porous mother particle has a ring-opened epoxy group obtained by ring-opening an epoxy group contained in the porous mother particle.
  • the filler for affinity chromatography (porous mother particles) according to this embodiment is mainly composed of a copolymer of a monomer mixture containing a crosslinkable vinyl monomer and an epoxy group-containing vinyl monomer. Is preferred.
  • cross-linkable vinyl monomer an aromatic polyvinyl monomer and an aliphatic polyvinyl monomer are suitable.
  • aromatic polyvinyl monomer divinylbenzene is used. Is preferably a polyvalent (meth) acrylate compound.
  • the above-mentioned epoxy group-containing vinyl monomer is a vinyl monomer containing an epoxy group in the molecule.
  • (meth) such as glycidyl (meth) acrylate and ⁇ - (meth) acryl- ⁇ -glycidyl polyethylene glycol Acrylic acid esters; aromatic vinyl compounds such as vinylbenzyl glycidyl ether and the like, and glycidyl methacrylate and vinylbenzyl glycidyl ether are particularly preferable.
  • the filler for affinity chromatography is preferably a porous material containing a copolymer of 20 to 50% by weight of a crosslinkable vinyl monomer and 50 to 80% by weight of an epoxy group-containing vinyl monomer. It is preferable to use porous organic polymer particles.
  • the crosslinkable vinyl monomer is less than 20% by weight of the total amount of the monomer, the strength of the filler is inferior, so the filler may be destroyed at a high flow rate, and the column pressure may increase.
  • the crosslinkable vinyl monomer exceeds 50% by weight of the total amount of the monomers, it is difficult to control the pore diameter and the binding capacity may be reduced.
  • the filler for affinity chromatography according to this embodiment may contain another vinyl monomer as a copolymer component, and the content of the other vinyl monomer is preferably 0 to 30% by weight. It is.
  • the filler for affinity chromatography preferably has a particle diameter (volume average particle diameter) of 20 to 80 ⁇ m, more preferably 30 to 60 ⁇ m.
  • the “particle diameter” in the present invention is a volume average particle diameter obtained by a laser diffraction / scattering particle size distribution measuring apparatus.
  • the packing material for affinity chromatography preferably has a specific surface area of 50 to 150 m 2 / g, more preferably 80 to 120 m 2 / g.
  • the specific surface area is less than 50 m 2 / g, the binding capacity may be inferior.
  • the specific surface area exceeds 150 m 2 / g, the strength of the filler is inferior and the filler is destroyed at a high flow rate. Column pressure may increase.
  • the “specific surface area” in the present invention is a value obtained by dividing the surface area of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter by the dry weight of the particles.
  • the filler for affinity chromatography preferably has a volume average pore diameter of 100 to 400 nm, more preferably 200 to 300 nm.
  • the “volume average pore diameter” in the present invention is a volume average pore diameter of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm obtained by a mercury porosimeter.
  • the balance between the gaps between the particles to be the flow path of the solution to be purified and the relatively large pore size in the particle and the binding surface area of the molecule to be purified is optimal. And the binding capacity under high flow rate is maintained at a high level.
  • porous mother particles used as the affinity chromatography filler according to this embodiment include, for example, 20 to 50% by weight of a crosslinkable vinyl monomer and 50 to 80% by weight of an epoxy group.
  • the infiltration volume (pore volume) of pores having a pore diameter of 10 to 5000 nm when the affinity chromatography filler according to this embodiment is measured with a mercury porosimeter is preferably 1.3 to 2.5 mL / g.
  • the porous mother particles used as a filler for affinity chromatography according to the present embodiment can be produced, for example, by known seed polymerization, suspension polymerization, or the like.
  • seed polymerization method a two-stage swelling polymerization method described in JP-B-57-24369 is also preferably used.
  • water and porogen are essential components, and a polymerization initiator, a polymer dispersant, a surfactant, a salt, seed particles, and the like are used as necessary.
  • porogens include organic solvents such as aliphatic or aromatic hydrocarbons, esters, ketones, ethers, and alcohols.
  • organic solvents include toluene, ethylbenzene, cumene, n-propylbenzene, n-butylbenzene, t-butylbenzene, sec-butylbenzene, iso-butylbenzene, xylene, ethyltoluene, cymene, t- Butyl toluene, diisopropylbenzene, mesitylene, cyclohexane, octane, isooctane, butyl acetate, dimethyl phthalate, methyl ethyl ketone, 2-octanone, 3-octanone, 4-octanone, diisobutyl ketone, 2-nonanone, 3-nonanone, 4-nonanone,
  • polymerization initiator examples include peroxide initiators such as benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, tertiary butyl peroxy 2-ethyl hexanate, 3,5,5-trimethyl hexanoyl peroxide, azobisisobutyronitrile, azobis An azo initiator such as isovaleronitrile is preferred.
  • peroxide initiators such as benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, tertiary butyl peroxy 2-ethyl hexanate, 3,5,5-trimethyl hexanoyl peroxide, azobisisobutyronitrile, azobis An azo initiator such as isovaleronitrile is preferred.
  • water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol and polyvinyl pyrrolidone having a saponification degree of 80 to 95% can be used.
  • surfactants anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate, sodium dodecyl benzene sulfonate, polyoxyethylene dodecyl ether sulfate ester salts, nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether, etc. should be used.
  • the salt sodium chloride, sodium sulfate and the like can be preferably used.
  • polystyrene particles having a molecular weight of about 1,000 to 100,000, polyalkyl (meth) acrylate particles, and the like can be used.
  • the particle size required for the filler of the present invention can be obtained by adjusting the size and amount of seed particles, the amount of monomer, and the amount of porogen.
  • the particle size required for the filler of the present invention is obtained by adjusting the type and amount of the polymer dispersant and the surfactant, the stirring speed, the shape and size of the stirring blade and the polymerization vessel. Can do.
  • Examples of the ligand binding method include (1) a method in which an epoxy group contained in a porous mother particle is directly used as a ligand binding site (for example, a method described in JP-T-2006-511935), and (2) porosity.
  • the alcoholic hydroxyl group generated by ring opening of the epoxy group contained in the mother particle is activated with a tosyl group or the like to bind the ligand, or the alcoholic hydroxyl group is oxidatively opened using an oxidizing agent and then the ligand.
  • a method for example, a method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-211076 or Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the epoxy group on the surface is substantially ring-opened before being used as a packing material for affinity chromatography. That is, the filler for affinity chromatography according to the present embodiment has a ring-opened epoxy group.
  • the ring-opened epoxy group is obtained by opening the epoxy group contained in the porous mother particle before or after bonding the ligand to the porous mother particle.
  • the “ring-opening epoxy group” refers to a group in which an epoxy group is opened, and more specifically, for example, a nucleophilic group having a hydroxide ion, a chloride ion, a mercapto group, an amino group, or the like. A group in which an epoxy group is opened by reacting a compound or the like with an epoxy group.
  • the alcoholic hydroxyl group produced by the ring opening of the epoxy group makes the copolymer surface hydrophilic, prevents non-specific adsorption of proteins, etc., improves the toughness of the particles in water, and destroys particles at high flow rates. Play a role to prevent.
  • Examples of the ring-opening method of the epoxy in the porous mother particles include a method of heating or stirring at room temperature with an acid or alkali in an aqueous solvent.
  • the epoxy group may be ring-opened with a blocking agent having a mercapto group such as mercaptoethanol or a blocking agent having an amino group such as monoethanolamine.
  • the ring-opened epoxy group includes, for example, a group formed by opening an epoxy group, a group in which a ligand is bonded to the group formed by opening the ring, and It may be any group in which a ligand is bonded to the group generated by the ring opening via a linker, and is preferably at least one of these groups.
  • the porous mother particle is substituted or unsubstituted 2,3-dihydroxy as a ring-opened epoxy group in that the surface of the copolymer can be hydrophilized and nonspecific adsorption of proteins and the like can be more effectively prevented. It preferably contains a propyl group.
  • An unsubstituted 2,3-dihydroxypropyl group can be obtained, for example, by opening a glycidyl group by hydrolysis.
  • the substituted 2,3-dihydroxypropyl group can be obtained, for example, by opening the glycidyl group with a blocking agent having a mercapto group such as mercaptoethanol or a blocking agent having an amino group such as monoethanolamine.
  • Ligand The type of ligand is not particularly limited as long as it has affinity for the target.
  • proteins such as protein A, protein G, and avidin; peptides such as insulin; antibodies such as monoclonal antibodies Enzyme; hormone; DNA; RNA; carbohydrate such as heparin, Lewis X, ganglioside; iminodiacetic acid, synthetic dye, 2-aminophenylboronic acid, 4-aminobenzamidine, glutathione, biotin and derivatives thereof Compounds can be used.
  • the ligand illustrated above may use the whole, the fragment obtained by a recombinant, an enzyme treatment, etc. may be used. Further, it may be an artificially synthesized peptide or peptide derivative.
  • Preferred ligands for antibody purification are protein A and protein G, more preferably protein A immunoglobulin binding domain, most preferably 4 or more consecutive at the end of protein A immunoglobulin binding domain.
  • a protein containing a peptide containing a histidine unit examples include an immunoglobulin-binding protein represented by the following general formula (1) or (3).
  • Immunoglobulin binding protein (hereinafter also referred to as “protein 1”), which is an example of a preferred ligand, is represented by the following general formula (1).
  • RR 2 (1) (Wherein R represents an amino acid sequence consisting of 4 to 300 amino acids including a continuous site of 4 to 20 histidines, and R 2 represents 50 to 500 including at least one immunoglobulin binding domain of protein A) (Wherein the terminal where R 2 binds to R is the terminal of the immunoglobulin binding domain).
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R is preferably 8 to 100, and the number of histidines at sites where histidines contained in R are continuous is 4 to 8 It is preferable that In the general formula (1), the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R 2 is preferably 120 to 480.
  • R- is preferably a group represented by the following general formula (2).
  • R 1 represents an amino acid sequence consisting of 4 to 100 amino acids including a site in which 4 to 20 histidines are continuous (wherein, in R 1 , the end of the site in which the histidines are continuous is r and And r represents an arbitrary amino acid sequence consisting of 7 to 200 amino acids including the TEV domain.)
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R 1 is 4 to 25, the number of histidine site histidine continuous contained in R 1 is 4- The number is preferably 8.
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by r is preferably 10-50.
  • protein 2 An immunoglobulin-binding protein (hereinafter also referred to as “protein 2”), which is another example of a preferable ligand, is represented by the following general formula (3).
  • R 2 -R (3) (Wherein R represents an amino acid sequence consisting of 4 to 300 amino acids including a continuous site of 4 to 20 histidines, and R 2 represents 50 to 500 including at least one immunoglobulin binding domain of protein A) (Wherein the terminal where R 2 binds to R is the terminal of the immunoglobulin binding domain).
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R is preferably 8 to 100, and the number of histidines at sites where histidines contained in R are continuous is 4 to 8 It is preferable that In the general formula (1), the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R 2 is preferably 120 to 480.
  • -R is preferably a group represented by the following general formula (4).
  • R 1 represents an amino acid sequence consisting of 4 to 100 amino acids including 4 to 20 consecutive histidines (wherein, in R 1 , the end of the site where the histidine continues is bound to r) And r represents an arbitrary amino acid sequence consisting of 7 to 200 amino acids including the TEV domain.
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by R 1 is preferably 4 to 25, and the number of histidines at sites where histidines contained in r are continuous is 4 to 8
  • the number of amino acids contained in the amino acid sequence represented by r is preferably 10 to 50.
  • one amino acid at least one of the amino acid sequence represented by amino acid sequence and R 2 is represented by R is, selected lysine, arginine, and cysteine It preferably contains a domain t consisting of 1 to 50 amino acids including In this case, the same or different domain t may be contained in the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence represented by r may contain a TEV domain. Since the TEV domain is contained in the amino acid sequence represented by r, it is possible to separate R and R 2 by cleavage with TEV protease, and the TEV domain has the effect of the present invention (immobilization on a carrier). This is a preferable sequence for realizing a large amount and increasing the ability of the carrier to retain immunoglobulin). Further, in the amino acid sequence represented by r, a TEV domain mutant (mutant) (regardless of whether or not it can be cleaved by the TEV protease, the amino acid sequence of the TEV domain is 70% or more, preferably 90% or more of homology. May be included).
  • the total number of amino acids constituting the protein 1 or 2 of the present invention is usually 70 to 1000, and preferably 80 to 600 when used for binding to particles.
  • the immunoglobulin binding domain of protein A is preferably at least one selected from the A domain, B domain, C domain, D domain, E domain, and Z domain.
  • the amino acid sequences of the domains of A domain, B domain, C domain, D domain, and E domain are, for example, Moks T, Abrahms L, et al., Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637-643, described in Fig. 1.
  • the document is included in the disclosure by this reference.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more (preferably 90% or more) homology with the amino acid sequence of each domain described in the above document should also be used as an immunoglobulin binding domain of protein A in the present invention. Can do.
  • the immunoglobulin binding protein according to this embodiment may have a plurality of the same or different types of immunoglobulin binding domains.
  • the immunoglobulin binding domain of protein A is (D domain-A domain) n (where n is an integer of 1 or more (preferably 1 to 6), and any number between D domain and A domain)
  • the amino acid sequence of A domain and D domain may be included.
  • the immunoglobulin A binding domain of protein A may be a natural immunoglobulin binding domain or a recombinant immunoglobulin binding domain.
  • the recombinant immunoglobulin binding domain can be treated as equivalent to the immunoglobulin binding domain before modification in immunoglobulin binding activity.
  • the amino acid of the immunoglobulin binding domain of natural protein A It is preferable to maintain a homology of 70% or more (preferably 90% or more) with the sequence.
  • Specific examples include the Z domain described in Nilson B et al., Protein Engineering, 1987, Vol. 1, No. 2, pages 107-113, USA by Hober S et al. Examples include Z domain mutants having alkali resistance described in Patent Application 2006 / 0194955A1.
  • a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more (preferably 90% or more) homology with the amino acid sequence of each domain described in the above document should also be used as an immunoglobulin binding domain of protein A in the present invention. Can do.
  • the protein 1 or 2 of the present invention can be obtained in large quantities and economically.
  • any known vector capable of replicating in bacteria can be used.
  • plasmids described in US Pat. No. 5,151,350, Molecular edited by Sambrook et al. Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3 rd edition, 2001) include plasmids such as those described in.
  • Any method known in the art may be used to transform a bacterium by introducing a nucleic acid into the bacterium, for example, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, edited by Sambrook et al. 3 rd edition, 2001) can be utilized known methods described in the like. Methods for cultivating transformed bacteria and recovering the expressed protein are well known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid according to another embodiment of the present invention encodes an immunoglobulin binding protein (protein 1 or 2) or an equivalent functional variant thereof.
  • “functional variant” of an immunoglobulin-binding protein is an immunoglobulin-binding protein that has been altered by partial amino acid addition, deletion, substitution, chemical modification of amino acid residues, or the like. And having at least 70%, preferably 90% or more homology with the amino acid sequence of the immunoglobulin binding protein before modification, and having the same immunoglobulin binding activity as that of the immunoglobulin binding protein before modification. It means something that can be handled.
  • one immunoglobulin binding domain of protein A is a small protein consisting of about 60 amino acids
  • DNA encoding a desired amino acid sequence is divided into synthetic oligonucleotides consisting of several tens of bases. Then, they are ligated by a ligation reaction with DNA ligase and inserted into a plasmid, whereby a target expression vector can be obtained.
  • a target expression vector can be obtained.
  • it is a method generally performed by those skilled in the art to employ a nucleic acid sequence using an optimal codon of Escherichia coli.
  • the protein 1 or 2 of the present invention may be a protein containing one or more immunoglobulin binding domains (preferably 2 to 12, more preferably 2 to 5).
  • a cDNA encoding such a protein can be easily prepared by linking a predetermined number of cDNAs (complementary DNAs) encoding one immunoglobulin binding domain in series. By inserting the cDNA thus prepared into an appropriate expression plasmid and using it, a protein containing one or more immunoglobulin binding domains can be easily produced.
  • a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 8 shown in Examples described later, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NOs: 1 to 8, and A protein having immunoglobulin binding activity can be suitably used as the immunoglobulin binding protein of the present invention.
  • the packing material using the protein 1 or 2 of the present invention as a ligand has a larger amount of immunoglobulin-binding protein in affinity chromatography than the conventional packing material, and has an excellent ability to retain the protein. ing. Thereby, since the capture amount of the target protein can be increased, the binding capacity of the target protein (antibody) can be increased. As a result, a high-purity target protein can be purified efficiently, at low cost and in large quantities.
  • the binding capacity of the human IgG antibody at a linear flow rate of 300 cm / hr was measured using a column with an inner diameter of 0.5 cm and a height of 5 cm, using AKTAprime plus manufactured by GE Healthcare Bioscience.
  • a human IgG antibody manufactured by Lampire Biological Laboratories
  • diluted to 1 mg / mL with 25 mM citrate buffer (pH 6.0) was used, and the elution tip concentration was 10 w / v% with an absorbance monitor.
  • the binding capacity was determined from the amount of human IgG antibody adsorbed and the filler volume during breakthrough.
  • R and R 2 correspond to R and R 2 in the general formula (1) or the general formula (2) (R 1, R 2 and r are the general formula (2) or corresponds to R 1, R 2 and r in the general formula (4).), underlined in r indicates a TEV domain (TEV protease (peptide bond hydrolysis synthase) cleavage site), in R 2 The underlined portion indicates an interdomain linker or C-terminal linker (domain t), see Table 2.
  • TEV domain TEV protease (peptide bond hydrolysis synthase) cleavage site
  • DNA fragments encoding SPAK, SPAC, SPA2K, SPA3K, SPAKK, and SPATK were digested with restriction enzymes NcoI and HindIII (New-England Bio Bio Lab) to produce vector pETM-11. (See FIG. 3, obtained from kind giftof D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, yGermany).
  • the DNA fragment encoding SPA-His-N was digested with restriction enzymes NcoI and HindIII, and vector pETM-10 (see FIG. 3, kindkingift of D. Shibly, EMBL Heidelberg , Obtained from Heidelberg, Germany).
  • SPA-His-C which is an immunoglobulin binding protein having a histag (a peptide consisting of 6 histidine residues) at the C-terminus
  • the vector pET29 (see FIG. 3, see Novagen). Used).
  • the restriction enzymes used in this vector pET29 were NdeI (New-England Bio Bio Lab) and Xho I (New-England Bio Bio Lab).
  • All three types of expression vectors shown in FIG. 3 contain a kanamycin resistance gene as a selection marker.
  • Tev represents a TEV protease recognition site (amino acid sequence: ENLYFQG). TEV protease recognizes the amino acid sequence ENLYFQG and cleaves between Q and G.
  • the restriction enzyme was introduced by designing a pair of primers based on the SPAK insertion sequence. PCR amplification was performed using primers (SEQ ID NOs: 9 to 17) shown in Table 2.
  • the SPA-His-N DNA fragment can also be obtained directly by digesting a plasmid containing SPAK with a restriction enzyme (Table 1).
  • the DNA fragment of SPA-His-N was directly obtained by digesting a plasmid containing SPAK with a restriction enzyme (Table 1).
  • PCR amplification solution containing 0.5 ⁇ l of Straphylococcus aureus genomic DNA template (500 ng / ⁇ l), 5 pl of each primer, 5 ⁇ l of 10 ⁇ Pfu buffer (manufactured by Fermentas), and 1 ⁇ l of Pfu polymerase (manufactured by Fermentas) (5 units / ⁇ l) Sterile water was added to bring the final volume to 50 ⁇ l.
  • the conditions for PCR amplification are as follows: 94 ° C for 1 minute, then 94 ° C for 30 seconds, 56 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute 30 cycles, and finally 72 ° C for 10 minutes.
  • This PCR reaction was carried out with a PX2 Thermal Cycler PCR device (manufactured by Thermo-Electron Corporation).
  • Recombinant immunoglobulin binding protein is obtained from E. coli.
  • E. coli BL21 strain cells (manufactured by STRATAGENE)
  • 1 mM IPTG manufactured by Sigma-Aldrich
  • the cells were incubated at 37 ° C. until the absorbance (OD600) reached approximately 0.6.
  • the cells were collected and disrupted in Tris buffer at pH 8.0.
  • the obtained recombinant immunoglobulin binding protein was purified by Ni affinity chromatography (Ni-NTA (nitrilotriacetic acid) particles, manufactured by Qiagen).
  • Ni-NTA nitrilotriacetic acid
  • the purified immunoglobulin binding protein was further purified in an HEPES buffer at pH 7.5 by anion exchange chromatography (Q-Sepharose FF, manufactured by GE Bioscience).
  • PB Porous particles
  • SPAK glycidyl methacrylate / trimethylolpropane trimethacrylate copolymer
  • the average particle size of PB was 33 ⁇ m and the specific surface area was 83 m 2 / g.
  • SPAK digested with TEV protease was passed through a Ni-NAT column (volume: 4 mL) in 50 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, and 1 mM DTT buffer (pH 8.0) to cleave the his tag site of SPAK. Crude SPAKwoHis was recovered. This crude SPAKwoHis was dialyzed for 12 hours in 10 mM HEPES buffer (pH 7.5) to prepare SPAKwoHis for particle binding experiments.
  • the amino acid sequence of SPAKwoHis is as follows.
  • SPAKwohis total amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) GAMAKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEGSK
  • SPAKwoHis-bound porous particles SPAKwoHis-PB
  • SPAKwoHis-PB SPAKwoHis-bound porous particles
  • Immobilization example 3 380 mg of SPATK-bound porous particles (SPATK-PB) were obtained in the same manner as in Immobilization Example 1 except that SPATK was used instead of SPAK in Immobilization Example 1. The amount of SPATK bound to the particles was 36 mg / g particles.
  • Test example (measurement of binding amount of immunoglobulin G (IgG)) 2.2.3.1. Measurement example 1 Using SPAK-PB, 2.1.3.1. When the binding capacity of the human IgG antibody of SPAK-PB was determined by the method described in the column of measurement method 1, it was 30 mg / mL.
  • the obtained aqueous solution was put into a 7 L separable flask, a thermometer, a stirring blade, and a cooling tube were attached, set in a hot water bath, and stirring was started at 825 rpm in a nitrogen atmosphere. Subsequently, the separable flask was heated with a hot water bath, and when the temperature of the aqueous solution reached 85 ° C., the organic monomer solution was added to the aqueous solution using a dropping funnel, and the mixture was stirred for 5 hours.
  • the reaction solution was transferred to a 5 L polypropylene bottle and allowed to stand until the particles floated, and excess water was sucked out from below and discarded. Further, acetone was added to the reaction solution to precipitate the particles. Next, the reaction solution was allowed to stand for 3 minutes, and acetone was removed by decantation. After repeating this operation twice, water was added to settle the particles. Furthermore, it was left still for 3 minutes and decanted. This operation was repeated twice to wash the particles. Further, the particle dispersion was replaced with acetone again and air-dried overnight, followed by drying in a vacuum drier to obtain porous mother particles 1 (86 g).
  • Ligand 1 Preparation of Ligand SPAK prepared in Synthesis Example 1 is hereinafter referred to as Ligand 1.
  • the particle diameter of the packing material 1 for affinity chromatography is 43 ⁇ m, the specific surface area is 64 m 2 / g, the volume average pore diameter is 235 nm, the pore diameter mode is 130 nm, and the volume average pore diameter / pore diameter mode value.
  • the binding capacity (calculated by the method described in the column of 2.1.3.2. Measurement method 2) was 26 mg / mL at a linear flow rate of 150 cm / hr, 23 mg / mL at 500 cm / hr, and 22 mg / mL at 1000 cm / hr. mL.
  • Synthesis example 4 In Synthesis Example 3, the same procedure as in Synthesis Example 3 was conducted except that 115 g of diisobutyl ketone and 45 g of acetophenone were used instead of 173 g of diisobutyl ketone and 67 g of acetophenone, and the reaction vessel was changed to a separable flask with a baffle instead of a separable flask. Thus, porous mother particles were synthesized, and a ligand was bound thereto to obtain a packing material 2 for affinity chromatography.
  • the particle size of the packing material 2 for affinity chromatography is 33 ⁇ m, the specific surface area is 83 m 2 / g, the volume average pore diameter is 146 nm, the pore diameter mode is 40 nm, and the volume average pore diameter / pore diameter mode is 3.7. Met.
  • the binding capacity (calculated by the method described in section 2.1.3.2. Measurement method 2) was 32 mg / mL at a linear flow rate of 150 cm / hr, 20 mg / mL at 500 cm / hr, and 14 mg / mL at 1000 cm / hr. mL.
  • Synthesis example 5 A filler 3 for affinity chromatography was obtained in the same manner as in Synthesis Example 3 except that (bonding of porous mother particles and ligand) in Synthesis Example 3 was changed to the following procedure.
  • the particle diameter of the packing material 3 for affinity chromatography is 43 ⁇ m, the specific surface area is 64 m 2 / g, the volume average pore diameter is 235 nm, the pore diameter mode is 130 nm, and the volume average pore diameter / pore diameter mode is Was 1.8.
  • the binding capacity (calculated by the method described in 2.1.3.2. Measurement method 2) was 25 mg / mL at a linear flow rate of 150 cm / hr, 21 mg / mL at 500 cm / hr, and 20 mg / mL at 1000 cm / hr. there were.
  • Synthesis Example 6 Porous mother particles were synthesized in the same manner as in Synthetic Example 3 except that cumene 140 g and acetophenone 20 g were used instead of 173 g of diisobutyl ketone and 67 g of acetophenone in Synthesis Example 3, and a ligand was bound to the porous mother particles. Thus, a filler 4 for affinity chromatography was obtained.
  • the particle size of the packing material 4 for affinity chromatography is 39 ⁇ m, the specific surface area is 91 m 2 / g, the volume average pore diameter is 128 nm, the pore diameter mode is 33 nm, and the volume average pore diameter / pore diameter mode is 3.9. Met.
  • the binding capacity (calculated by the method described in the column of 2.1.3.2. Measurement method 2) is 19 mg / mL at a linear flow rate of 150 cm / hr, 8 mg / mL at a linear flow rate of 500 cm / hr, and 1000 cm / hr. It was 6 mg / mL.
  • Synthesis example 7 Synthesis Example 3 except that 15 g of trimethylolpropane trimethacrylate and 25 g of ethylene glycol dimethacrylate were used instead of 40 g of trimethylolpropane trimethacrylate, and 115 g of diisobutylketone and 45 g of acetophenone were used instead of 173 g of diisobutylketone and 67 g of acetophenone.
  • porous mother particles were synthesized, and a ligand was bound to the porous mother particles to obtain a packing material 5 for affinity chromatography.
  • the particle size of the packing material 5 for affinity chromatography is 32 ⁇ m, the specific surface area is 38 m 2 / g, the volume average pore diameter is 329 nm, the pore diameter mode is 302 nm, and the volume average pore diameter / pore diameter mode is 1.1. Met.
  • the binding capacity (calculated by the method described in the column of 2.1.3.2. Measurement method 2) is 10 mg / mL at a linear flow rate of 150 cm / hr, 9 mg / mL at a linear flow rate of 500 cm / hr, and 1000 cm / hr. It was 8 mg / mL.
  • Synthesis example 8 A filler 6 for affinity chromatography was obtained in the same manner as in Synthesis Example 3 except that SPAKwoHis was used instead of Ligand 1 in Synthesis Example 3.
  • the particle size of the packing material 6 for affinity chromatography is 33 ⁇ m, the specific surface area is 83 m 2 / g, the volume average pore diameter is 146 nm, the pore diameter mode is 40 nm, and the volume average pore diameter / pore diameter mode is 3.7. Met.
  • the binding capacity (calculated by the method described in section 2.1.3.2. Measurement method 2) was 8 mg / mL at a linear flow rate of 150 cm / hr, 5 mg / mL at 500 cm / hr, and 4 mg / mL at 1000 cm / hr. mL.
  • Comparative Synthesis Example 1 A filler for affinity chromatography (trade name “MabSelect Xtra”, manufactured by GE Healthcare Biosciences) in which protein A was immobilized on crosslinked agarose not using vinyl monomer as a raw material was evaluated.
  • the binding capacity (calculated by the method described in the column of 2.1.3.2. Measurement method 2) was 25 mg / mL at a linear flow rate of 150 cm / hr and 12 mg / mL at 500 cm / hr. Although the linear flow rate was attempted to be 1000 cm / hr, the column pressure was high and the linear flow rate did not reach 1000 cm / hr.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made.
  • the present invention also includes configurations that are substantially the same as the configurations described in the embodiments (for example, configurations that have the same functions, methods, and results, or configurations that have the same purposes and results).
  • the invention includes a configuration in which a non-essential part of the configuration described in the embodiment is replaced.
  • the present invention includes a configuration that achieves the same effect as the configuration described in the embodiment or a configuration that can achieve the same object.
  • the invention includes a configuration in which a known technique is added to the configuration described in the embodiment.

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Abstract

アフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体を含有する多孔性母粒子であって、前記多孔性母粒子にリガンドが結合しており、前記多孔性母粒子は、該多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する。

Description

アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
　本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤に関する。特に、抗体精製に有用な特定のリガンドを結合したアフィニティークロマトグラフィー用充填剤に関する。
　アフィニティークロマトグラフィーとは、不溶性担体に、分離・精製を目的とする物質と特異的に結合する物質（リガンド）を固定化し、得られたリガンド固定化担体を充填したカラムを用いるクロマトグラフィーであり、例えばタンパク質、核酸などの生体関連物質の分離・精製に用いられている（特開平６－２８１６３８号公報）。
　アフィニティークロマトグラフィー用充填剤としては、アガロースゲルに代表される糖鎖の架橋粒子が広く使われているが、分離・精製対象分子を含む溶液を高速で流すと粒子が変形してカラム圧力が高くなり、分離・精製の時間効率に劣るという問題があった。
　一方、比較的高流速で使用できるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤としては、アプライドバイオシステムズ社製ＰＯＲＯＳ（商品名）がある。この充填剤は、疎水性のスチレン－ジビニルベンゼン共重合体を主成分とする母粒子を使用する。この充填剤では、主に母粒子に起因すると考えられる非特異吸着が生じる場合があり、また、高流速で使用すると結合容量が低下する問題があった。
　本発明は、これまでにない高流速下の分離・精製でも高いリガンド結合容量を維持できるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を提供することを目的とする。
　本発明の一態様に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、
　架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体を含有する多孔性母粒子であって、
　前記多孔性母粒子にリガンドが結合しており、
　前記多孔性母粒子は、該多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する。
　上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記開環エポキシ基として置換または非置換の２，３－ジヒドロキシプロピル基を含むことができる。
　上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記リガンドが、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質であることができる。
　この場合、前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＺドメインから選ばれる少なくとも１種であることができる。
　上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記リガンドが、下記一般式（１）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質であることができる。
　Ｒ－Ｒ２　・・・・・（１）
　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
　この場合、上記一般式（１）において、Ｒ－は下記一般式（２）で表される基であることができる。
　Ｒ１－ｒ－　・・・・・（２）
　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
　また、この場合、前記リガンドは、上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むものであることができる。
　また、上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤において、前記リガンドが、下記一般式（３）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質であることができる。
　Ｒ２－Ｒ　・・・・・（３）
　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
　この場合、上記一般式（３）において、－Ｒは下記一般式（４）で表される基であることができる。
　－ｒ－Ｒ１　・・・・・（４）
　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
　また、この場合、前記リガンドは、上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むものであることができる。
　本発明において、「タンパク質」とは、ペプチド構造単位を有するあらゆる分子をいい、例えば、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変した変異体を含む概念である。また、「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、単独でイムノグロブリン結合活性を有するポリペプチドの機能単位を表し、「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに特異的な親和性を有し、かつ、「イムノグロブリン結合ドメイン」を含むタンパク質を表す。
　また、本発明において、「ＴＥＶドメイン」とは、ＴＥＶ（Tobacco Etch Virus）プロテアーゼによる切断部位をいう。
　上記アフィニティークロマトグラフィー用充填剤によれば、架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体を含有する多孔性母粒子であって、前記多孔性母粒子にリガンドが結合しており、前記多孔性母粒子は、該多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有することにより、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、これまでにない高流速下の分離・精製でも高いリガンド結合容量を維持することができる。
図１は、本発明の合成例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＫ、ＳＰＡＣ、ＳＰＡＫＫ、ＳＰＡＴＫ）のアミノ酸配列を示す図である。 図２は、本発明の合成例１で調製されたイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡ２Ｋ、ＳＰＡ３Ｋ、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｃ、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｎ）のアミノ酸配列を示す図である。 図３は、３種類の発現ベクター（ｐＥＴＭ－１１、ｐＥＴＭ－１０およびｐＥＴ２９）にそれぞれ挿入された、本発明の合成例１に係るイムノグロブリン結合タンパク質をコードするＤＮＡフラグメントの構成を説明する図である。
　本発明の一実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体を含有する多孔性母粒子であって、多孔性母粒子にリガンドが結合しており、多孔性母粒子は、多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する。
　１．アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
　１．１．多孔性母粒子
　１．１．１．構成
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤（多孔性母粒子）は、架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体から主に構成されるのが好ましい。
　上記架橋性ビニル単量体としては、芳香族ポリビニル単量体、脂肪族ポリビニル単量体が好適であり、芳香族ポリビニル単量体としては、ジビニルベンゼンが、また、脂肪族ポリビニル単量体としては多価（メタ）アクリレート化合物が好ましい。多価（メタ）アクリレート化合物としては、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレートなどが挙げられ、トリメチロールプロパントリメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、エチレングリコールジアクリレートが特に好ましい。
　上記エポキシ基含有ビニル単量体は、分子中にエポキシ基を含有するビニル単量体であり、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、α－（メタ）アクリル－ω－グリシジルポリエチレングリコール等の（メタ）アクリル酸エステル類；ビニルベンジルグリシジルエーテル等の芳香族ビニル化合物等が挙げられ、グリシジルメタクリレート、ビニルベンジルグリシジルエーテルが特に好ましい。
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤として、好ましくは２０～５０重量％の架橋性ビニル単量体と５０～８０重量％のエポキシ基含有ビニル単量体との共重合体を含有する多孔質有機重合体粒子を用いることが好ましい。ここで、架橋性ビニル単量体が単量体総量の２０重量％未満であると、充填剤の強度が劣るために高流速下で充填剤が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合があり、一方、架橋性ビニル単量体が単量体総量の５０重量％を超えると、細孔径の制御が困難となり、結合容量が低下する場合がある。
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、その他のビニル単量体を共重合体成分として含有していても良く、その他のビニル単量体の含有量は、好ましくは０～３０重量％である。
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、好ましくは、２０～８０μｍ、より好ましくは、３０～６０μｍの粒径（体積平均粒子径）を有する。粒径が２０μｍ未満であると、高流速下でカラム圧力が高くなり、実用に耐えない。粒径が８０μｍを超えると、結合容量に劣る。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒径である。
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、好ましくは、５０～１５０ｍ２／ｇ、より好ましくは、８０～１２０ｍ２／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ２／ｇ未満であると、結合容量が劣る場合があり、一方、１５０ｍ２／ｇを超えると、充填剤の強度が劣るために高流速下で充填剤が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合がある。本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥重量で除した値である。
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、好ましくは、１００～４００ｎｍ、より好ましくは、２００～３００ｎｍの体積平均細孔径を有する。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ未満であると、高流速下の結合容量低下が顕著になる場合があり、一方、４００ｎｍを超えると、流速にかかわらず結合容量が低下する場合がある。本発明における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
　上記範囲の粒径、比表面積、および細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる粒子間の隙間および粒子内の比較的大きな細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤として使用される多孔性母粒子の一具体例としては、例えば、２０～５０重量％の架橋性ビニル単量体と５０～８０重量％のエポキシ基含有ビニル単量体との共重合体を含有し、粒径が２０～８０μｍであり、比表面積が５０～１５０ｍ２／ｇであり、体積平均細孔径が１００～４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
　なお、本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０～５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは、１．３～２．５ｍＬ／ｇである。
　１．１．２．製造
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤として使用される多孔性母粒子は、例えば公知のシード重合、懸濁重合などにより製造することができる。シード重合法として、特公昭５７－２４３６９号公報記載の二段膨潤重合法も好適に用いられる。重合に際しては、上記単量体の他、水、ポロジェンを必須成分とし、重合開始剤、高分子分散剤、界面活性剤、塩、シード粒子などを必要に応じて使用する。
　ポロジェンとしては、脂肪族あるいは芳香族炭化水素類、エステル類、ケトン類、エーテル類、アルコール類等の有機溶剤が挙げられる。このような有機溶剤としては、例えば、トルエン、エチルベンゼン、クメン、ｎ－プロピルベンゼン、ｎ－ブチルベンゼン、ｔ－ブチルベンゼン、ｓｅｃ－ブチルベンゼン、ｉｓｏ－ブチルベンゼン、キシレン、エチルトルエン、シメン、ｔ－ブチルトルエン、ジイソプロピルベンゼン、メシチレン、シクロヘキサン、オクタン、イソオクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジメチル、メチルエチルケトン、２－オクタノン、３－オクタノン、４－オクタノン、ジイソブチルケトン、２－ノナノン、３－ノナノン、４－ノナノン、５－ノナノン、２－デカノン、３－デカノン、４－デカノン、５－デカノン、２－ウンデカノン、３－ウンデカノン、４－ウンデカノン、５－ウンデカノン、６－ウンデカノン、ホロン、イソホロン、アセトフェノン、ジブチルエーテル、１－ヘキサノール、２－オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール等が挙げられ、好ましくは、炭素数２以上のアルキル基を有する芳香族炭化水素類を主成分とする溶剤、炭素数８以上のケトン類を主成分とする溶剤、最も好ましくは、クメンおよび／またはジイソブチルケトンを主成分とする溶剤である。単量体の組成に応じて、上記ポロジェンの量と種類を選定することにより、本実施形態に係る充填剤に必要な細孔径分布と比表面積を得ることができる。
　重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ２－エチルヘキサネート、３，５，５－トリメチルヘキサノイルペルオキシド等の過酸化物系開始剤、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソバレロニトリル等のアゾ系開始剤が好ましい。これら重合開始剤は、単量体混合物あるいはポロジェンに溶解して重合系に供される。
　高分子分散剤としては、ケン化度８０～９５％のポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマーを使用することができる。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンドデシルエーテル硫酸エステル塩などのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテルなどの非イオン性界面活性剤などを使用することができる。塩としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウムなどが好適に使用できる。シード粒子としては、分子量１，０００～１００，０００程度のポリスチレン粒子、ポリアルキル（メタ）アクリレート粒子などを使用することができる。シード重合では、シード粒子の大きさと量、単量体の量、ポロジェンの量を調整することにより、本発明の充填剤に必要な粒径を得ることができる。懸濁重合では、高分子分散剤および界面活性剤の種類と量、攪拌速度、攪拌翼および重合容器の形状と大きさを調整することにより、本発明の充填剤に必要な粒径を得ることができる。
　重合完結後、シード粒子および／またはポロジェンの良溶媒を用いて洗浄することにより、所望の細孔径分布の多孔性母粒子が得られる。
　１．１．３．リガンドとの結合
　本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤には、リガンドが結合している。
　リガンドの結合方法としては、例えば、（１）多孔性母粒子に含まれるエポキシ基をそのままリガンドの結合サイトとして利用する方法（例えば特表２００６－５１１９３５号に記載の方法）、（２）多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環して生成するアルコール性水酸基を、トシル基などで活性化してからリガンドを結合したり、酸化剤を用いて該アルコール性水酸基を酸化的開列してからリガンドを結合したり方法（例えば特開２００７－２１１０７６号、特開２００８－０３２４１１号に記載の方法）、（３）多孔性母粒子に含まれるエポキシ基または、当該エポキシ基の開環により生成する基からさらにリンカーを伸ばしてから、当該リンカーを介して多孔性母粒子にリガンドを結合する方法（例えば特開２００８－０３２４１１号、特開平１０－１９５０９９号、特開２００４－３３１９５３号に記載の方法）が挙げられる。
　いずれの結合法でも、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤として使用する前に、表面のエポキシ基は実質的に開環している。すなわち、本実施形態に係るアフィニティークロマトグラフィー用充填剤は、開環エポキシ基を有する。この開環エポキシ基は上述したように、多孔性母粒子にリガンドを結合する前または後に、多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環させて得られる。本発明において「開環エポキシ基」とは、エポキシ基を開環させた基をいい、より具体的には、例えば水酸化物イオン、塩化物イオン、メルカプト基またはアミノ基等を有する求核性化合物などをエポキシ基と反応させることにより、エポキシ基を開環させた基をいう。
　エポキシ基が開環して生成するアルコール性水酸基は、共重合体表面を親水化し、タンパクなどの非特異吸着を防止すると共に、水中で粒子の靱性を向上させ、高流速下の粒子の破壊を防止する役割を果たす。多孔性母粒子中のエポキシの開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸またはアルカリにより、加熱または室温で攪拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノールなどのメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミンなどのアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させても良い。
　上記（１）～（３）で説明したように、開環エポキシ基は、例えば、エポキシ基を開環して生成した基、当該開環して生成した基にリガンドを結合させた基、および当該開環して生成した基にリンカーを介してリガンドを結合させた基のいずれかであってもよく、これらの少なくとも１種であることが好ましい。この場合、共重合体表面を親水化し、タンパクなどの非特異吸着をより効果的に防止することができる点で、多孔性母粒子が開環エポキシ基として置換または非置換の２，３－ジヒドロキシプロピル基を含むことが好ましい。非置換の２，３－ジヒドロキシプロピル基は例えば、グリシジル基を加水分解によって開環することにより得ることができる。置換の２，３－ジヒドロキシプロピル基は例えば、グリシジル基をメルカプトエタノールなどのメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミンなどのアミノ基を有するブロッキング剤によって開環することにより得ることができる。
　１．２．リガンド
　リガンドとしては、標的物に対してアフィニティーを有するものであれば、その種類は特に限定されないが、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；モノクロナール抗体等の抗体；酵素；ホルモン；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖質；イミノジ酢酸、合成色素、２－アミノフェニル硼素酸、４－アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、リコンビナント、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体であってもよい。
　抗体精製に好適なリガンドとしては、プロテインＡおよびプロテインＧであり、さらに好ましくはプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインであり、最も好ましくは、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインの末端に、４個以上の連続するヒスチジン単位を含むペプチドを付加したタンパクであり、このようなタンパクとしては、例えば、後述する一般式（１）または（３）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質が挙げられる。
　１．２．１．イムノグロブリン結合タンパク質
　好ましいリガンドの一例であるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質１」ともいう。）は、下記一般式（１）で表される。
　Ｒ－Ｒ２　・・・・・（１）
　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
　上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は８～１００個であることが好ましく、Ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４～８個であることが好ましい。また、上記一般式（１）において、Ｒ２で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１２０～４８０個であることが好ましい。
　また、上記一般式（１）において、Ｒ－は下記一般式（２）で表される基であることが好ましい。
　Ｒ１－ｒ－　・・・・・（２）
　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
　上記一般式（２）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は４～２５個であることが好ましく、Ｒ１に含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４～８個であることが好ましく、ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１０～５０個であることが好ましい。
　好ましいリガンドの他の一例であるイムノグロブリン結合タンパク質（以下、「タンパク質２」ともいう。）は、下記一般式（３）で表される。
　Ｒ２－Ｒ　・・・・・（３）
　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
　上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は８～１００個であることが好ましく、Ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４～８個であることが好ましい。また、上記一般式（１）において、Ｒ２で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１２０～４８０個であることが好ましい。
　上記一般式（３）において、－Ｒは下記一般式（４）で表される基であることが好ましい。
　－ｒ－Ｒ１　・・・・・（４）
　（式中、Ｒ１は４～２０個の連続したヒスチジンを含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
　上記一般式（４）において、Ｒ１で表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は４～２５個であることが好ましく、ｒに含まれるヒスチジンが連続した部位のヒスチジンの数は４～８個であることが好ましく、ｒで表されるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸の数は１０～５０個であることが好ましい。
　上記一般式（１）および上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むことが好ましい。この場合、上記アミノ酸配列中に同一または異なるドメインｔが複数含まれていてもよい。
　また、上記一般式（２）および上記一般式（４）に示されるように、ｒで表されるアミノ酸配列中にＴＥＶドメインが含まれていてもよい。ｒで表されるアミノ酸配列中にＴＥＶドメインが含まれていることにより、ＴＥＶプロテアーゼによる切断によってＲとＲ２との分離が可能になるうえ、ＴＥＶドメインは、本発明の効果（担体への固定化量が多く、かつ、当該担体のイムノグロブリン保持能力を高めること）を実現するために好ましい配列である。また、ｒで表されるアミノ酸配列中に、ＴＥＶドメインの変異体（Mutant）（該ＴＥＶプロテアーゼで切断できるか否かと関係なく、ＴＥＶドメインのアミノ配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する。）が含まれていてもよい。
　本発明のタンパク質１または２を構成するアミノ酸の総個数は通常７０～１０００であり、粒子に結合させる用途に使用する場合、８０～６００であるのが好ましい。
　１．２．１．１．イムノグロブリン結合ドメイン
　プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメイン、およびＺドメインから選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、およびＥドメインのドメインのアミノ酸配列は例えば、Moks T, Abrahms L, et al.,Staphylococcal protein A consists of five IgG-binding domains, Eur J Biochem. 1986, 156, 637-643のFig.1に記載されている。該文献はこの参照により開示に含まれる。また、上記文献に記載された各ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明におけるプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとして使用することができる。
　本実施形態に係るイムノグロブリン結合タンパク質は、複数の同一または異なる種類のイムノグロブリン結合ドメインを有していてもよい。例えば、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、（Ｄドメイン－Ａドメイン）ｎ（ここで、ｎは１以上の整数（好ましくは１～６）を示し、ＤドメインとＡドメインとの間には任意のアミノ酸配列が存在していてもよい。）、すなわち、ＡドメインおよびＤドメインを含む繰り返し単位を含むものであってもよい。
　また、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインは、天然型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよいし、または、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインであってもよい。ここで、組換え型のイムノグロブリン結合ドメインは、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合ドメインと同等のものとして扱うことができ、例えば、天然型のプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を保持することが好ましい。具体例としては、ニルソン・ビー（Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｂ．）他、プロテイン・エンジニアリング(Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ)、１９８７年、第１巻、２号、１０７－１１３頁に記載されているＺドメイン、Hober Sらによる米国特許出願２００６／０１９４９５５Ａ１に記載されているアルカリ耐性を有するＺドメインの変異体(mutant)が挙げられる。上記文献はこの参照により開示に含まれる。また、上記文献に記載された各ドメインのアミノ酸配列と７０％以上（好ましくは９０％以上）の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も、本発明におけるプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインとして使用することができる。
　１．２．１．２．タンパク質１または２の製造
　本発明のタンパク質１または２を製造するための標準技術としては、例えば、Frederick M. AusbelらによるCur rent Protocols In Molecular BiologyやSambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。例えば、本発明のタンパク質１または２は、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されている遺伝子組換え技術を用いて製造することができる。すなわち、目的の改変タンパク質（タンパク質１または２）をコードする核酸配列を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、当該細胞を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、本発明のタンパク質１または２を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、細菌内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、細菌中に核酸を導入することにより細菌を形質転換させるためには、当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition, 2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した細菌を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。
　すなわち、本発明の他の一実施形態にかかる核酸は、イムノグロブリン結合タンパク質（タンパク質１または２）あるいはその等機能変異体をコードする。本発明において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（functional variant）」とは、部分的なアミノ酸の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を保持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
　具体的には、プロテインＡの１個のイムノグロブリン結合ドメインは約６０個のアミノ酸からなる小さなタンパク質であるため、例えば、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを数十塩基からなる合成オリゴヌクレオチドに分割して合成し、それらをＤＮＡリガーゼによるライゲーション反応によって繋げてプラスミドに挿入することにより、目的の発現ベクターを取得することができる。その際に、当該タンパク質を大腸菌で効率良く発現させる目的で、大腸菌の至適コドンを用いた核酸配列を採用することは、当業者によって一般的に行われる方法である。また、後述する本発明の実施例に示されるようにStraphylococcus aureusのゲノムＤＮＡからＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）技術を用いて所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を構築することが可能である。
　また、上述したように、本発明のタンパク質１または２は、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上（好ましくは２～１２個、より好ましくは２～５個）を含むタンパク質であってもよい。この様なタンパク質をコードするｃＤＮＡは、１個のイムノグロブリン結合ドメインをコードするｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）を所定の個数、直列に連結することにより、容易に作成することができる。こうして作成したｃＤＮＡを適切な発現プラスミドに挿入して利用することにより、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上含むタンパク質を容易に製造することができる。
　例えば、後述する実施例において示される配列番号１～８のアミノ酸配列を有するタンパク質や、配列番号１～８において１個または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合活性を有するタンパク質は、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質として好適に使用することができる。
　１．２．１．３．作用効果
　本発明のタンパク質１または２をリガンドとして用いた充填剤は、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、従来の充填剤と比較してイムノグロブリン結合タンパク質の保持量が多く、かつ、当該タンパク質の保持能に優れている。これにより、目的タンパク質の捕捉量を高めることができるため、目的タンパク質（抗体）の結合容量を増大させることができる。その結果、純度の高い目的タンパク質を効率良く、低コストでかつ大量に精製することができる。
　２．実施例
　以下、本実施形態にかかるアフィニティークロマトグラフィー用充填剤を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。
　２．１．評価方法
　２．１．１．粒径
　レーザ回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製　ＬＳ１３３２０）により、粒子の体積平均粒径を測定した。
　２．１．２．比表面積、体積平均細孔径、細孔径最頻値
　後述する合成例４～８および比較合成例１でそれぞれ調製された、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤を４０℃で２４時間真空乾燥させて乾燥粒子を得、水銀ポロシメーター（島津製作所社製　オートポアＩＶ９５２０）にて乾燥粒子の比表面積、体積平均細孔径、および細孔径最頻値を求めた。測定範囲は細孔径範囲で１０～５０００ｎｍとした。
　２．１．３．結合容量
　２．１．３．１．測定法１
　ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを用いて、線流速１５０ｃｍ／ｈｒおよび５００ｃｍ／ｈｒ、１０００ｃｍ／ｈｒにおけるヒトＩｇＧ抗体の結合容量を測定した。カラム容量は１ｍＬ、ヒトＩｇＧ抗体（ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ（Ｌａｍｐｉｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）は２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、吸光度モニターで溶出先端濃度５ｗ／ｖ％ブレークスルー（破過）のときのヒトＩｇＧ抗体吸着量と充填剤体積から結合容量を求めた。
　２．１．３．２．測定法２
　内径０．５ｃｍ、高さ５ｃｍのカラムにて、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるヒトＩｇＧ抗体の結合容量を測定した。ヒトＩｇＧ抗体（ランパイアバイオロジカルラボラトリーズ（Ｌａｍｐｉｒｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）は２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、吸光度モニターで溶出先端濃度１０ｗ／ｖ％ブレークスルーのときのヒトＩｇＧ抗体吸着量と充填剤体積から結合容量を求めた。
　２．２．実験例
　２．２．１．合成例１（イムノグロブリン結合タンパク質の調製）
　後述する調製例１～４により、図１および図２に示されるアミノ酸配列を有するイムノグロブリン結合タンパク質（ＳＰＡＫ（配列番号１）、ＳＰＡＣ（配列番号２）、ＳＰＡＫＫ（配列番号３）、ＳＰＡＴＫ（配列番号４）、ＳＰＡ２Ｋ（配列番号５）、ＳＰＡ３Ｋ（配列番号６）、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｃ（配列番号７）、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｎ（配列番号８））を調製した。
　なお、図１および図２において、ＲおよびＲ２は上記一般式（１）または上記一般式（２）におけるＲおよびＲ２に対応し（Ｒ１、Ｒ２およびｒは上記一般式（２）または上記一般式（４）におけるＲ１、Ｒ２およびｒに対応する。）、ｒ中の下線部はＴＥＶドメイン（ＴＥＶプロテアーゼ（ペプチド結合加水分解合成酵素）切断部位）を示し、Ｒ２中の下線部はインタードメインリンカーまたはＣ末端リンカー（ドメインｔ）、表２参照）を示す。
　これらのタンパク質は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦマススペクトル分析により、それぞれアミノ酸配列が一致したことにより、図１および図２に示すアミノ酸配列を有することが確認された。
　２．２．１．１．調製例１（ＰＣＲ増幅および制限酵素の消化）
　Straphylococcus aureus（ＡＴＣＣ，　１０８３２）由来のプロテインＡ（Ｄドメイン＋Ａドメイン）のｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。プライマー（表２参照）は、後述するサブクローニングを補助するために対応する制限酵素部位を有するように設計された。
　表１に示されるように、ＳＰＡＫ、ＳＰＡＣ、ＳＰＡ２Ｋ、ＳＰＡ３Ｋ、ＳＰＡＫＫ、およびＳＰＡＴＫをそれぞれコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（New-England Bio Lab製）によって消化されて、ベクターｐＥＴＭ－１１（図３参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
　また、表１に示されるように、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－ＮをコードするＤＮＡフラグメントは、制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化されて、ベクターｐＥＴＭ－１０（図３参照、kind gift of D. Shibly, EMBL Heidelberg, Heidelberg, Germanyから入手）に挿入された。
　さらに、表１に示されるように、Ｃ末端にヒスタグ（ヒスチジン６残基からなるペプチド）を有するイムノグロブリン結合タンパク質であるＳＰＡ－Ｈｉｓ－Ｃを形成するために、ベクターｐＥＴ２９（図３参照、Novagen社製）が用いられた。このベクターｐＥＴ２９に用いられる制限酵素はＮｄｅＩ（New-England Bio Lab製）およびＸｈｏＩ（New-England Bio Lab製）であった。
　なお、図３に示される３種類の発現ベクターはすべて、選択マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を含む。
　また、図３に示されるイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列において、「Ｔｅｖ」はＴＥＶプロテアーゼ認識部位（アミノ酸配列：ＥＮＬＹＦＱＧ）を示す。ＴＥＶプロテアーゼはアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＧを認識し、ＱとＧの間を切断する。
　上記制限酵素は、ＳＰＡＫの挿入配列に基づく１対のプライマーを設計することにより導入された。また、ＰＣＲ増幅は、表２に示されるプライマー（配列番号９～１７）を用いて行われた。
　なお、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－ＮのＤＮＡフラグメントは、ＳＰＡＫを含むプラスミドを制限酵素（表１）で消化することにより直接得ることもできる。本合成例では、ＳＰＡ－Ｈｉｓ－ＮのＤＮＡフラグメントは、ＳＰＡＫを含むプラスミドを制限酵素（表１）で消化することにより直接得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Straphylococcus aureusのgenomic ＤＮＡテンプレート（５００ｎｇ／μｌ）０．５μｌ、各プライマー５ｐｌ、１０×Ｐｆｕ緩衝液（Fermentas製）５μｌ、およびＰｆｕポリメラーゼ（Fermentas製）（５ユニット／μｌ）１μｌを含むＰＣＲ増幅溶液に滅菌水を加えて、最終的な液の体積を５０μｌとした。ＰＣＲ増幅の条件は以下の通りである：９４℃で１分、次に９４℃で３０秒、５６℃で１分、７２℃で１分の３０サイクル、最後に７２℃で１０分。このＰＣＲ反応をＰＸ２　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　ＰＣＲ装置（Thermo Electron Corporation製）にて行った。
　２．２．１．２．調製例２（ライゲーションおよび形質転換）
　制限酵素で消化されたＤＮＡフラグメントのライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolab製）１００－２００ユニット／ｍｌおよび５×リガーゼ緩衝液（ニューイングランドバイオラボ（New England Biolab）社製）を用いて１２℃で１２－１６時間行われた。プラスミドの形質転換のために、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５－α株細胞（New England Biolab製）を使用した。
　２．２．１．３．調製例３（プラスミドＤＮＡの調製および配列解析）
　陽性コロニーを選択し、ミニプレップキット（Mini Prep Kit）（キアゲン（Qiagen）社製）によってプラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡについて、挿入されたＤＮＡフラグメントが正しい配列であるかどうかを確認するために、3730 NDA Sequencer（Applied Biosystems製）で配列解析を行った。
　２．２．１．４．調製例４（イムノグロブリン結合タンパク質の発現および精製）
　組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１株）細胞（STRATAGENE製）内にて１８℃で１ｍＭのＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、１５時間発現させた。誘導に先立って、吸光度（ＯＤ６００）が約０．６に到達するまで上記細胞を３７℃でインキュベートした。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ８．０のトリス緩衝液中で破砕した。
　得られた組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質は、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィー（Ｎｉ－ＮＴＡ（ニトリロトリ酢酸）粒子、キアゲン社製）によって精製された。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質は陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ－セファロースＦＦ、ＧＥバイオサイエンス社製）によって、ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ緩衝液中でさらに精製された。
　２．２．２．合成例２（イムノグロブリン結合タンパク質の粒子への固定化）
　２．２．２．１．固定化例１
　グリシジルメタクリレート・トリメチロールプロパントリメタクリレート共重合体からなる多孔質粒子（以下、ＰＢと記す。）を懸濁重合により作製した。ＰＢの平均粒径は３３μｍ、比表面積は８３ｍ２／ｇであった。４００ｍｇのＰＢ、３６ｍｇのＳＰＡＫが１６ｍＬのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に分散した混合液を調製し、４℃で２４時間転倒混和し、ＳＰＡＫをＰＢに結合させた。次いで、１０％メルカプトエタノール水溶液０．８ｍＬを添加して４℃で６時間転倒混和し、残余のエポキシ基を開環、ブロッキングし、２０％エタノール水溶液で洗浄して、３８０ｍｇのＳＰＡＫ結合多孔質粒子（ＳＰＡＫ－ＰＢ）を得た。Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔで定量測定を行ったところ、前記粒子に結合したＳＰＡＫの量は２９ｍｇ／ｇ粒子であった。
　２．２．２．２．固定化例２
　５０ｍＭ トリス塩酸、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴのバーファー（ｐＨ８．０）中、ＴＥＶプロテアーゼで消化されたＳＰＡＫをＮｉ－ＮＡＴカラム（容量：４ｍＬ）に通過させて、ＳＰＡＫのヒスタグ部位が切断された粗ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを回収した。この粗ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバーファー（ｐＨ７．５）中で１２時間透析して、粒子への結合実験用ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを調製した。ＳＰＡＫｗｏＨｉｓのアミノ酸配列は以下の通りである。
ＳＰＡＫｗｏｈｉｓ（全アミノ酸配列）（配列番号１８）
GAMAKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEGSK
　次に、上記固定化例１で、ＳＰＡＫの代わりにＳＰＡＫｗｏＨｉｓを使用した以外は、上記固定化例１と同様にして、３８０ｍｇのＳＰＡＫｗｏＨｉｓ結合多孔質粒子（ＳＰＡＫｗｏＨｉｓ－ＰＢ）を得た。前記粒子に結合したＳＰＡＫｗｏＨｉｓの量は６ｍｇ／ｇ粒子であった。
　２．２．２．３．固定化例３
　上記固定化例１で、ＳＰＡＫの代わりにＳＰＡＴＫを使用した以外は、上記固定化例１と同様にして、３８０ｍｇのＳＰＡＴＫ結合多孔質粒子（ＳＰＡＴＫ－ＰＢ）を得た。前記粒子に結合したＳＰＡＴＫの量は３６ｍｇ／ｇ粒子であった。
　２．２．３．試験例（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）結合量の測定）
　２．２．３．１．測定例１
　ＳＰＡＫ－ＰＢを用いて、２．１．３．１．測定法１の欄に記載された方法にて、ＳＰＡＫ－ＰＢのヒトＩｇＧ抗体の結合容量を求めたところ、３０ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．３．２．測定例２
　上記測定法１で、ＳＰＡＫ－ＰＢの代わりにＳＰＡＴＫ－ＰＢを使用した以外は、上記測定法１と同様にして、ＳＰＡＴＫ－ＰＢのヒトＩｇＧ抗体の結合容量（２．１．３．１．測定法１の欄に記載された方法で算出）を求めたところ、３５ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．３．３．測定例３
　上記測定法１で、ＳＰＡＫ－ＰＢの代わりにＳＰＡＫｗｏＨｉｓ－ＰＢを使用した以外は、上記測定法１と同様にして、ＳＰＡＫｗｏＨｉｓ－ＰＢのヒトＩｇＧ抗体の結合容量（２．１．３．１．測定法１の欄に記載された方法で算出）を求めたところ、６ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．４．合成例３（アフィニティークロマトグラフィー用充填剤の調製）
　（ｉ）多孔性母粒子の合成　グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）６０ｇおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）４０ｇをジイソブチルケトン（三井化学社製）１７３ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）６７ｇに溶解させ、２、２’－アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１ｇを添加し、有機モノマー溶液を調製した。
　次に、３０００ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製　ＰＶＡ－２１７）１２ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製　エマール１０Ｇ）１ｇおよび塩化ナトリウム３１ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液を調製した。
　次いで、得られた水溶液を７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、８２５ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、水溶液の温度が８５℃になったところで、この水溶液に滴下ロートを用いて上記有機モノマー溶液を添加し、５時間攪拌を行った。
　次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液を５Ｌのポリプロピレン製ビンに移し、粒子が浮遊するまで静置し、下方から余分な水を吸い出して廃棄した。さらに、この反応液にアセトンを加えて粒子を沈降させた。次に、反応液を３分間静置して、デカンテーションによりアセトンを除去した。この操作を２回繰り返したのち水を加えて、粒子を沈降させた。さらに、３分間静置してデカンテーションを行った。この操作を２回繰り返して粒子を洗浄した。さらに、粒子の分散液をアセトンで再び置換して、一晩風乾したのち、真空乾燥機にて乾燥を行い、多孔性母粒子１（８６ｇ）を得た。
　（ｉｉ）リガンドの作製
　上記合成例１で調製されたＳＰＡＫを、以下リガンド１とする。
　（ｉｉｉ）多孔性母粒子とリガンドとの結合
　３５０ｍｇの多孔性母粒子１と、３２ｍｇのリガンド１とが１８ｍＬのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に分散した混合液を調製し、４℃で２０時間転倒混和し、リガンド１を多孔性母粒子１に結合させた。次いで、０．５ｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノールと０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなる水溶液２０ｍＬで２回洗浄した後、０．５ｍｏｌ／Ｌメルカプトエタノールと０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムとからなるｐＨ８．５の緩衝液２０ｍＬ中、室温で４時間転倒混和し、残余のエポキシ基を開環、ブロッキングした。２０％エタノール水溶液で洗浄して、３２０ｍｇのアフィニティークロマトグラフィー用充填剤１を得た。
　（ｉｖ）評価
　アフィニティークロマトグラフィー用充填剤１の粒径は４３μｍ、比表面積は６４ｍ2／ｇ、体積平均細孔径は２３５ｎｍ、細孔径最頻値は１３０ｎｍ、体積平均細孔径／細孔径最頻値は１．８であった。結合容量（２．１．３．２．測定法２の欄に記載された方法で算出）は、線流速１５０ｃｍ／ｈｒにおいて２６ｍｇ／ｍＬ、５００ｃｍ／ｈｒにおいて２３ｍｇ／ｍＬ、１０００ｃｍ／ｈｒにおいて２２ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．５．合成例４
　合成例３で、ジイソブチルケトン１７３ｇおよびアセトフェノン６７ｇの代わりにジイソブチルケトン１１５ｇおよびアセトフェノン４５ｇを使用し、反応容器をセパラブルフラスコの代わりにバッフル付きセパラブルフラスコに変更した以外は、合成例３と同様にして、多孔性母粒子を合成、リガンドを結合して、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤２を得た。
　アフィニティークロマトグラフィー用充填剤２の粒径は３３μｍ、比表面積は８３ｍ2／ｇ、体積平均細孔径は１４６ｎｍ、細孔径最頻値は４０ｎｍ、体積平均細孔径／細孔径最頻値は３．７であった。結合容量（２．１．３．２．測定法２の欄に記載された方法で算出）は、線流速１５０ｃｍ／ｈｒにおいて３２ｍｇ／ｍＬ、５００ｃｍ／ｈｒにおいて２０ｍｇ／ｍＬ、１０００ｃｍ／ｈｒにおいて１４ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．６．合成例５
　合成例３における（多孔性母粒子とリガンドとの結合）を以下の手順に変更した以外は、合成例３と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤３を得た。
　（ｉ）多孔性母粒子とリガンドとの結合
　１０ｇの多孔性母粒子１を２５０ｍＬポリ瓶にいれて、純水８０ｇに分散させ、０．１Ｍ硫酸を１０ｇ添加した。この液を６０℃で５時間転倒混和することにより、多孔性母粒子１のエポキシ基を開環した。次いで、桐山ロートでろ過した後、純水とアセトニトリルで洗浄し、アセトニトリル２００ｇに分散した。これに１．３ｇのトシルクロライド、１．３ｇのトリプロピルアミン、０．８ｇのトリメチルアミン塩酸塩を加え、室温で５時間攪拌することにより、水酸基をトシル化した。次いで、これをろ過した後、アセトニトリルと水で洗浄し、ｐＨ９．５のホウ酸緩衝液９０ｇに分散し、１０ｇのトシル化多孔性母粒子１の分散液を得た。４００ｍｇのトシル化多孔性母粒子１と、３６ｍｇのリガンド１とが１６ｍＬのホウ酸緩衝液に分散した混合液を調製し、３７℃で２０時間転倒混和し、リガンド１をトシル化多孔性母粒子１に結合させた。次いで、１０％モノエタノールアミン水溶液０．８ｍＬを添加して３７℃で６時間転倒混和し、残余のトシル基をブロッキングし、２０％エタノール水溶液で洗浄して、３８０ｍｇのアフィニティークロマトグラフィー用充填剤３を得た。
　（ｉｉ）評価
　アフィニティークロマトグラフィー用充填剤３の粒径は４３μｍ、比表面積は６４ｍ2／ｇ、体積平均細孔径は２３５ｎｍ、細孔径最頻値は１３０ｎｍ、体積平均細孔径／細孔径最頻値は１．８であった。結合容量（２．１．３．２．測定法２に記載された方法で算出）は、線流速１５０ｃｍ／ｈｒにおいて２５ｍｇ／ｍＬ、５００ｃｍ／ｈｒにおいて２１ｍｇ／ｍＬ、１０００ｃｍ／ｈｒにおいて２０ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．７．合成例６
　合成例３で、ジイソブチルケトン１７３ｇおよびアセトフェノン６７ｇの代わりにクメン１４０ｇおよびアセトフェノン２０ｇを使用した以外は、合成例３と同様にして、多孔性母粒子を合成し、該多孔性母粒子にリガンドを結合して、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤４を得た。
　アフィニティークロマトグラフィー用充填剤４の粒径は３９μｍ、比表面積は９１ｍ2／ｇ、体積平均細孔径は１２８ｎｍ、細孔径最頻値は３３ｎｍ、体積平均細孔径／細孔径最頻値は３．９であった。結合容量（２．１．３．２．測定法２の欄に記載された方法で算出）は、線流速１５０ｃｍ／ｈｒにおいて１９ｍｇ／ｍＬ、線流速５００ｃｍ／ｈｒにおいて８ｍｇ／ｍＬ、１０００ｃｍ／ｈｒにおいて６ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．８．合成例７
　合成例３で、トリメチロールプロパントリメタクリレート４０ｇの代わりにトリメチロールプロパントリメタクリレート１５ｇおよびエチレングリコールジメタクリレート２５ｇを、ジイソブチルケトン１７３ｇおよびアセトフェノン６７ｇの代わりにジイソブチルケトン１１５ｇおよびアセトフェノン４５ｇを使用した以外は、合成例３と同様にして、多孔性母粒子を合成し、該多孔性母粒子にリガンドを結合して、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤５を得た。
　アフィニティークロマトグラフィー用充填剤５の粒径は３２μｍ、比表面積は３８ｍ2／ｇ、体積平均細孔径は３２９ｎｍ、細孔径最頻値は３０２ｎｍ、体積平均細孔径／細孔径最頻値は１．１であった。結合容量（２．１．３．２．測定法２の欄に記載された方法で算出）は、線流速１５０ｃｍ／ｈｒにおいて１０ｍｇ／ｍＬ、線流速５００ｃｍ／ｈｒにおいて９ｍｇ／ｍＬ、１０００ｃｍ／ｈｒにおいて８ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．９．合成例８
　合成例３で、リガンド１の代わりに、ＳＰＡＫｗｏＨｉｓを用いた以外は、合成例３と同様にしてアフィニティークロマトグラフィー用充填剤６を得た。
　アフィニティークロマトグラフィー用充填剤６の粒径は３３μｍ、比表面積は８３ｍ2／ｇ、体積平均細孔径は１４６ｎｍ、細孔径最頻値は４０ｎｍ、体積平均細孔径／細孔径最頻値は３．７であった。結合容量（２．１．３．２．測定法２の欄に記載された方法で算出）は、線流速１５０ｃｍ／ｈｒにおいて８ｍｇ／ｍＬ、５００ｃｍ／ｈｒにおいて５ｍｇ／ｍＬ、１０００ｃｍ／ｈｒにおいて４ｍｇ／ｍＬであった。
　２．２．１０．比較合成例１
　ビニル単量体を原料としない架橋アガロースにプロテインＡを固定したアフィニティークロマトグラフィー用充填剤（商品名「MabSelect Xtra」、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を評価した。結合容量（２．１．３．２．測定法２の欄に記載された方法で算出）は、線流速１５０ｃｍ／ｈｒにおいて２５ｍｇ／ｍＬ、５００ｃｍ／ｈｒにおいて１２ｍｇ／ｍＬであった。なお、線流速を１０００ｃｍ／ｈｒにしようとしたが、カラム圧力が高く、線流速は１０００ｃｍ／ｈｒに達しなかった。
　本実施形態に係る説明は以上である。本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらなる種々の変形が可能である。また本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および結果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

Claims (10)

  1. 　架橋性ビニル単量体およびエポキシ基含有ビニル単量体を含む単量体混合物の共重合体を含有する多孔性母粒子であって、
    　前記多孔性母粒子にリガンドが結合しており、
    　前記多孔性母粒子は、該多孔性母粒子に含まれるエポキシ基を開環させて得られる開環エポキシ基を有する、アフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  2. 　前記開環エポキシ基として置換または非置換の２，３－ジヒドロキシプロピル基を含む、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  3. 　前記リガンドが、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質である、請求項１または２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  4. 　前記プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインが、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＺドメインから選ばれる少なくとも１種である、請求項３に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  5. 　前記リガンドが、下記一般式（１）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
    　Ｒ－Ｒ２　・・・・・（１）
    　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
  6. 　上記一般式（１）において、Ｒ－は下記一般式（２）で表される基である、請求項５に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
    　Ｒ１－ｒ－　・・・・・（２）
    　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
  7. 　前記リガンドは、上記一般式（１）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むものである、請求項５または６に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
  8. 　前記リガンドが、下記一般式（３）で表されるイムノグロブリン結合タンパク質である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
    　Ｒ２－Ｒ　・・・・・（３）
    　（式中、Ｒは４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～３００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、Ｒ２はプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１個含む５０～５００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す（ここで、Ｒ２がＲに結合する末端はイムノグロブリン結合ドメインの末端である。）。）
  9. 　上記一般式（３）において、－Ｒは下記一般式（４）で表される基である、請求項８に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
    　－ｒ－Ｒ１　・・・・・（４）
    　（式中、Ｒ１は４～２０個のヒスチジンが連続した部位を含む４～１００個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し（ここで、Ｒ１において、前記ヒスチジンが連続した部位の末端がｒと結合する。）、ｒはＴＥＶドメインを含む７～２００個のアミノ酸からなる任意のアミノ酸配列を示す。）
  10. 　前記リガンドは、上記一般式（３）において、Ｒで表されるアミノ酸配列およびＲ２で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも一方が、リジン、アルギニン、およびシステインから選ばれる１種のアミノ酸を含む１～５０個のアミノ酸からなるドメインｔを含むものである、請求項８または９に記載のアフィニティークロマトグラフィー用充填剤。
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