KR102410991B1 - 친화성 크로마토그래피용 담체 - Google Patents

친화성 크로마토그래피용 담체 Download PDF

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Abstract

불순물의 비특이 흡착이 억제되고, 또한 장기 보관에 의한 동적 결합 용량의 저하가 억제된 보존 안정성이 우수한 친화성 크로마토그래피용 담체를 제공하는 것. (M-1) 에폭시기 함유 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 20질량부를 초과하고, 99.5질량부 이하, 및 (M-2) 폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 0.5 내지 80질량부를 포함하는 공중합체를 함유하는 고상 담체와, 에폭시기를 개환시켜서 얻어지는 개환 에폭시기와, 상기 고상 담체에 결합한 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 담체이며, 상기 친화성 크로마토그래피용 담체를 임의의 칼럼 용기에 충전하고, 칼럼을 2M의 NaCl을 포함하는 pH 7.5의 20mM 인산나트륨 완충액으로 치환하고, 40℃에서 7일간 정치했을 때의 칼럼 내의 pH 상승 폭이 2 이하인 것을 특징으로 하는 친화성 크로마토그래피용 담체.

Description

친화성 크로마토그래피용 담체{CARRIER FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 친화성 크로마토그래피용 담체에 관한 것이다. 특히, 항체 등의 단백질의 정제에 유용한 친화성 크로마토그래피용 담체에 관한 것이다.
친화성 크로마토그래피는 모노클로날 항체를 포함한 단백질의 연구, 개발 및 제조에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다. 친화성 크로마토그래피용 담체는 일반적으로, 표적 물질과 선택적으로 결합하는 리간드를 갖는 고상 담체를 포함한다. 친화성 크로마토그래피는, 고상 담체 상의 리간드가 표적 물질에 대하여 높은 선택성을 갖기 때문에, 이온 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 액체 크로마토그래피 등의 다른 크로마토그래피에 비하여, 우수한 수율로 또한 고속으로 경제적인 정제가 가능하게 된다.
일반적으로, 단백 정제용의 친화성 크로마토그래피에 요구되는 성능으로서는, (1) 표적 단백질 이외의 불순물을 비특이 흡착하지 않는 것, (2) 장기간의 보관에 의해 결합 용량이 저하되지 않고, 보존 안정성이 우수한 것, (3) 칼럼 조작하는 데에 있어서 충분한 기계적 강도가 있는 것 등을 들 수 있다.
이러한 가운데, 친화성 크로마토그래피용 담체의 고상 담체로서, 아가로오스 입자(특허문헌 1, 2), 스티렌-디비닐벤젠의 공중합체를 포함하는 다공질 입자(특허문헌 3, 4), 메타크릴레이트계 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자(특허문헌 5, 6)가 제안되어 있다.
일본 특허 공표 제2008-523140호 공보 일본 특허 공표 제2009-522580호 공보 일본 특허 공개 평08-278299호 공보 일본 특허 공표 평10-501173호 공보 국제 공개 제2011/125674호 공보 일본 특허 공개 제2012-141212호 공보
그러나, 아가로오스 입자는 일반적으로 탄성률이 낮기 때문에, 고속으로 매체를 흘렸을 때에 칼럼의 압력이 높아진다는 결점을 갖고 있다. 또한, 아가로오스 입자는 일반적으로 천연의 해초로부터 오래 복잡한 공정을 거쳐서 제조되기 때문에, 일정한 품질의 것이 얻어지기 어렵다.
또한, 스티렌-디비닐벤젠과 같은 방향족 비닐 단량체의 공중합체를 포함하는 다공질 입자는 일반적으로 내알칼리성이 우수하지만, 친수성이 낮기 때문에, 리간드의 활성이 낮아, 표적 물질에 대한 동적 결합 용량이 낮다는 결점을 갖는다.
또한, 메타크릴레이트계 비닐 단량체의 중합체를 포함하는 다공질 입자는 높은 친수성과 기계적 강도를 갖고 있지만, 불순물의 제거능에 대해서는 추가적인 개선이 요망되고 있었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 불순물의 비특이 흡착이 억제되고, 또한 장기 보관에 의한 동적 결합 용량의 저하가 억제된 보존 안정성이 우수한 친화성 크로마토그래피용 담체를 제공하는 데 있다.
따라서, 본 발명자는 예의 검토한 결과, 에폭시기 함유 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위와 폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위를 각각 특정량 포함하는 공중합체를 함유하는 고상 담체와, 상기 고상 담체에 결합하는 리간드와, 개환 에폭시기를 갖는 특정한 친화성 크로마토그래피용 담체가 표적 물질의 동적 결합 용량이 높고, 게다가 불순물의 제거능 및 보존 안정성이 우수한 것을 발견하여, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 <1> (M-1) 에폭시기 함유 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 20질량부를 초과하고, 99.5질량부 이하, 및
(M-2) 폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 0.5 내지 80질량부를 포함하는 공중합체를 함유하는 고상 담체와,
에폭시기를 개환시켜서 얻어지는 개환 에폭시기와,
상기 고상 담체에 결합한 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 담체이며,
상기 친화성 크로마토그래피용 담체를 임의의 칼럼 용기에 충전하고, 칼럼을 2M의 NaCl을 포함하는 pH 7.5의 20mM 인산나트륨 완충액으로 치환하고, 40℃에서 7일간 정치했을 때의 칼럼 내의 pH 상승 폭이 2 이하인 것을 특징으로 하는
친화성 크로마토그래피용 담체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 <2> 상기 <1>의 친화성 크로마토그래피용 담체가 칼럼 용기에 충전된, 친화성 크로마토그래피 칼럼을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 <3> 상기 <1>의 친화성 크로마토그래피용 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 정제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체는 표면 상의 에폭시기 잔존량이 저감되어 있고, 게다가 개환 에폭시기에 의해 높은 친수성을 구비한다.
따라서, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체에 의하면, 비특이적으로 흡착하는 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질(HCP=Host Cell Protein)이나 DNA의 제거능을 개선하는 것이 가능하게 된다.
또한, 리간드의 활성을 높게 유지할 수 있기 때문에, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체를, 예를 들어 이뮤노글로불린의 정제에 사용한 후에, 또한 장기간 반복 사용해도 이뮤노글로불린 등의 동적 결합 용량이 저하되기 어려워, 저비용으로 이뮤노글로불린 정제가 가능하게 된다.
이하, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체에 대해서 상세하게 설명한다.
〔친화성 크로마토그래피용 담체〕
<고상 담체의 구성>
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체를 구성하는 고상 담체는
(M-1) 에폭시기 함유 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 20질량부를 초과하고, 99.5질량부 이하, 및
(M-2) 폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 0.5 내지 80질량부를 포함하는 공중합체를 함유하고,
또한, 에폭시기를 개환시켜서 얻어지는 개환 에폭시기를 포함하는 것이다. 고상 담체의 형태는 모노리스, 막, 중공 섬유, 입자, 카세트, 칩 등의 어느 것이어도 되지만, 입자가 바람직하다. 또한, 고상 담체는 표면적 향상의 관점에서, 다공질 입자 등의 다공질화된 것이 바람직하다. 또한, 다공질 입자로서는, 다공질 중합체 입자가 바람직하다. 또한, 고상 담체는 상기 공중합체 이외에, 천연 고분자나 합성 고분자 등을 포함하고 있어도 된다.
((M-1) 에폭시기 함유 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위)
에폭시기 함유 모노비닐 단량체는 1분자 중에, 1개의 중합성 비닐기(에틸렌성 불포화 결합을 갖는 기)와, 1개 이상의 에폭시기를 갖는 단량체이다. 에폭시기 함유 비닐 단량체는 고상 담체에 적절한 양의 에폭시기를 도입하여, 적절한 리간드 결합량이나, 개환 에폭시기량을 얻기 위하여 이용 가능하다.
에폭시기 함유 모노비닐 단량체로서는, 예를 들어 글리시딜(메트)아크릴레이트, 4-히드록시부틸(메트)아크릴레이트글리시딜에테르, 3,4-에폭시시클로헥실메틸(메트)아크릴레이트, α-(메트)아크릴-ω-글리시딜폴리에틸렌글리콜 등의 히드록시기 비함유 (메트)아크릴산에스테르류; 글리세린모노(메트)아크릴레이트글리시딜에테르 등의 히드록시기 함유 (메트)아크릴산에스테르류; 비닐벤질글리시딜에테르 등의 방향족 모노비닐 화합물 외에, 알릴글리시딜에테르, 3,4-에폭시-1-부텐, 3,4-에폭시-3-메틸-1-부텐 등을 들 수 있다. 이들 중 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 사용해도 된다.
이들 중에서도, 에폭시기 함유 모노비닐 단량체로서는, 방오성이나 보존 안정성 등의 관점에서, 에폭시기 함유 (메트)아크릴산에스테르류, 에폭시기 함유 방향족 모노비닐 화합물이 바람직하고, 에폭시기 함유 (메트)아크릴산에스테르류가 보다 바람직하고, 글리시딜(메트)아크릴레이트, 4-히드록시부틸(메트)아크릴레이트글리시딜에테르가 더욱 바람직하고, 글리시딜(메트)아크릴레이트가 특히 바람직하다. 또한, 고상 담체를 순상 현탁 중합에 의해 입자상으로 하는 경우에는, 에폭시기 함유 모노비닐 단량체로서는, 개환 에폭시기량의 컨트롤이 용이하게 되는 점에서 수 불용성의 것이 바람직하다. 여기서 수 불용성이란 물 100mL에 대하여 실온(25℃)에서 10g 이상은 용해되지 않는 것을 말한다. 또한, 에폭시기 함유 모노비닐 단량체는 시판품을 사용해도 되고, 공지된 방법에 따라 합성하여 사용해도 된다.
에폭시기 함유 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위의 함유량은, 전체 구조 단위에 대하여 20질량부를 초과하고, 99.5질량부 이하이다. 당해 함유량이 20질량부 이하이면, 개환 에폭시기의 양이 줄어들어 리간드 결합 후의 친화성 크로마토그래피용 담체의 친수성이 낮아져, 불순물의 제거능이 낮아진다. 한편, 99.5질량부를 초과하면, 기계적 강도가 낮아져, 친화성 크로마토그래피용 담체로서의 취급에 견딜 수 없게 된다.
에폭시기 함유 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위의 함유량은, 방오성이나 보존 안정성 등의 관점에서, 전체 구조 단위에 대하여 바람직하게는 25질량부 이상, 보다 바람직하게는 30질량부 이상, 더욱 바람직하게는 40질량부 이상, 특히 바람직하게는 50질량부 이상이고, 또한 방오성이나 보존 안정성 등의 관점에서, 전체 구조 단위에 대하여, 바람직하게는 95질량부 이하, 보다 바람직하게는 90질량부 이하, 더욱 바람직하게는 85질량부 이하, 특히 바람직하게는 80질량부 이하이다.
((M-2) 폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위)
폴리비닐 단량체는 1분자 중에, 2개 이상의 중합성 비닐기(에틸렌성 불포화 결합을 갖는 기)를 갖는 비닐 단량체이다. 이하, 당해 폴리비닐 단량체를, 히드록시기 비함유 폴리비닐 단량체와, 히드록시기 함유 폴리비닐 단량체로 나누어서 설명한다. 또한, 폴리비닐 단량체는 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
히드록시기 비함유 폴리비닐 단량체로서는, 예를 들어 에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 디에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 트리에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 테트라에틸렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 디프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 트리프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 테트라프로필렌글리콜디(메트)아크릴레이트, 1,4-부탄디올디(메트) 아크릴레이트, 1,6-헥산디올디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판트리(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨테트라(메트)아크릴레이트 등의 (메트)아크릴산에스테르류; 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠 등의 방향족 폴리비닐 화합물; 부타디엔, 이소시아누르산디알릴, 이소시아누르산트리알릴 등의 알릴 화합물 등을 들 수 있고, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이들 중에서도, 히드록시기 비함유 폴리비닐 단량체로서는, (메트)아크릴산에스테르류, 방향족 폴리비닐 화합물이 바람직하다.
또한, 상기 히드록시기 비함유 폴리비닐 단량체에 포함되는 중합성 비닐기의 개수로서는 1분자 중에, 2 내지 5개가 바람직하고, 2 또는 3개가 보다 바람직하다.
히드록시기 함유 폴리비닐 단량체로서는, 다가 알코올의 (메트)아크릴산에스테르류, 각종 당류의 2치환 이상의 (메트)아크릴산에스테르류, 다가 알코올의 (메트)아크릴아미드류가 바람직하다.
다가 알코올의 (메트)아크릴산에스테르류로서는, 글리세린디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올에탄디(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판디(메트)아크릴레이트, 부탄트리올디(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨디(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨트리(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨디(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨트리(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨테트라(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨펜타(메트)아크릴레이트, 이노시톨디(메트)아크릴레이트, 이노시톨트리(메트)아크릴레이트, 이노시톨테트라(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
각종 당류의 2치환 이상의 (메트)아크릴산에스테르류로서는, 예를 들어 글루코오스디(메트)아크릴레이트, 글루코오스트리(메트)아크릴레이트, 글루코오스테트라(메트)아크릴레이트, 만니톨디(메트)아크릴레이트, 만니톨트리(메트)아크릴레이트, 만니톨테트라(메트)아크릴레이트, 만니톨펜타(메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다.
또한, 히드록시기 함유 폴리비닐 단량체로서는, 상기 예시한 것 이외에, 디아미노프로판올, 트리스히드록시메틸아미노메탄, 글루코사민 등의 아미노알코올과 (메트)아크릴산과의 탈수 축합 반응물 등도 들 수 있다.
또한, 상기 히드록시기 함유 폴리비닐 단량체에 포함되는 중합성 비닐기의 개수로서는 1분자 중에, 2 내지 5개가 바람직하고, 2 또는 3개가 보다 바람직하다.
이들 중에서도, 폴리비닐 단량체로서는, 비교적 소량의 사용으로 양호한 다공성과 기계적 강도가 얻어지고, 에폭시기 함유 모노비닐 단량체의 사용량을 제한하는 것이 적은 등의 관점에서, 히드록시기 비함유 폴리비닐 단량체가 바람직하다. 히드록시기 비함유 폴리비닐 단량체 중에서도, 방오성이나 보존 안정성 등의 관점에서, 중합성 비닐기의 개수가 3개인 (메트)아크릴산에스테르류, 중합성 비닐기의 개수가 2 또는 3개인 방향족 폴리비닐 화합물이 특히 바람직하다. 특히 적합한 구체예로서는 트리메틸올프로판트리(메트)아크릴레이트, 디비닐벤젠, 트리비닐벤젠을 들 수 있다.
폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위의 함유량은, 전체 구조 단위에 대하여 0.5 내지 80질량부이다. 폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위의 함유량이 0.5질량부 미만이면, 고상 담체의 기계적 강도가 낮아져, 친화성 크로마토그래피용 담체로서의 취급에 견딜 수 없게 된다. 또한, 80질량부를 초과하면, 친수성이 저하되어, HCP의 저감 효과가 얻어지지 않고, 또한 리간드의 활성이 저하된다.
폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위의 함유량은, 방오성이나 보존 안정성 등의 관점에서, 전체 구조 단위에 대하여, 바람직하게는 5질량부 이상, 보다 바람직하게는 10질량부 이상, 더욱 바람직하게는 15질량부 이상, 더욱 바람직하게는 20질량부 이상, 특히 바람직하게는 25질량부 이상이고, 또한 방오성이나 보존 안정성 등의 관점에서, 전체 구조 단위에 대하여, 바람직하게는 70질량부 이하, 보다 바람직하게는 65질량부 이하, 더욱 바람직하게는 60질량부 이하, 더욱 바람직하게는 50질량부 이하, 특히 바람직하게는 40질량부 이하이다.
((M-3) 에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위)
본 발명에서 사용하는 고상 담체에 포함되는 공중합체로서는, 상기 구조 단위 (M-1) 및 구조 단위 (M-2) 외에, (M-3) 에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 40질량부 이하를 더 포함하는 것이 바람직하다.
에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체는 1분자 중에, 1개의 중합성 비닐기(에틸렌성 불포화 결합을 갖는 기)를 갖고, 에폭시기를 함유하지 않는 비닐 단량체이다. 이하, 에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체를, 에폭시기를 함유하지 않는 히드록시기 비함유 모노비닐 단량체와, 에폭시기를 함유하지 않는 히드록시기 함유 모노비닐 단량체로 나누어서 설명한다.
에폭시기를 함유하지 않는 히드록시기 비함유 모노비닐 단량체로서는, 정제시의 불순물의 비특이 흡착을 방지하는 점에서, 비이온성 단량체가 바람직하다. 이러한 비이온성 단량체로서는, 예를 들어 메틸(메트)아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, 부틸(메트)아크릴레이트, 시클로헥실(메트)아크릴레이트, 메톡시에틸(메트)아크릴레이트 등의 (메트)아크릴산에스테르류; (메트)아크릴아미드, 디메틸(메트)아크릴아미드, (메트)아크릴로일모르폴린, 다이아세톤(메트)아크릴아미드 등의 (메트)아크릴아미드류를 들 수 있고, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 비이온성 단량체로서, 2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, 스테아릴(메트)아크릴레이트와 같은 소수성 (메트)아크릴레이트류; 스티렌, α-메틸스티렌, 에틸비닐벤젠과 같은 방향족 비닐 화합물을 사용해도 되지만, 정제시의 불순물의 비특이 흡착을 억제하는 관점에서, 이러한 단량체가 아니라, 상기에서 예시한 단량체 중, 탄소수 5 이하의 알킬기 또는 알콕시알킬기를 갖는 (메트)아크릴산알킬에스테르류나, 상기의 (메트)아크릴아미드류가 바람직하다.
에폭시기를 함유하지 않는 히드록시기 함유 모노비닐 단량체로서는, 예를 들어 글리세롤모노(메트)아크릴레이트, 트리메틸올에탄모노(메트)아크릴레이트, 트리메틸올프로판모노(메트)아크릴레이트, 부탄트리올모노(메트)아크릴레이트, 펜타에리트리톨모노(메트)아크릴레이트, 디펜타에리트리톨모노(메트)아크릴레이트, 이노시톨모노(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시프로필(메트)아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트 등의 (메트)아크릴산에스테르류; 히드록시에틸(메트)아크릴아미드 등의 (메트)아크릴아미드류 등을 들 수 있고, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 에폭시기를 함유하지 않는 히드록시기 함유 모노비닐 단량체에 포함되는 히드록시기의 개수로서는 1분자 중에, 1 내지 5개가 바람직하고, 1 내지 3개가 보다 바람직하다.
이들 중에서도, 에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체로서는, 방오성 등의 관점에서, 에폭시기를 함유하지 않는 히드록시기 함유 모노비닐 단량체가 바람직하고, 글리세롤모노(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸(메트)아크릴레이트, 히드록시프로필(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸(메트)아크릴아미드가 보다 바람직하고, 글리세롤모노(메트)아크릴레이트, 히드록시에틸(메트)아크릴아미드가 더욱 바람직하고, 히드록시에틸(메트)아크릴아미드가 특히 바람직하다.
에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위의 함유량으로서는, 전체 구조 단위에 대하여 40질량부 이하가 바람직하다. 당해 함유량을 40질량부 이하로 함으로써, 히드록시기 함유물 비닐 단량체의 경우에는 다공질 입자의 친수성이 향상되고, 응집이 억제되어, 리간드의 활성이 높아져 표적 물질의 동적 결합량이 개선된다. 또한, 기계적 강도도 개선된다. 상기 구조 단위의 함유량으로서는 전체 구조 단위에 대하여, 보다 바람직하게는 35질량부 이하, 더욱 바람직하게는 30질량부 이하, 더욱 바람직하게는 25질량부 이하, 특히 바람직하게는 20질량부 이하이다. 또한, 에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위의 함유량은 0질량부여도 된다. 당해 구조 단위를 함유하는 경우에는 전체 구조 단위에 대하여 5질량부 이상이 바람직하다.
상기 구조 단위 (M-1) 내지 (M-3)의 함유량의 바람직한 조합은, 구조 단위 (M-1): 전체 구조 단위에 대하여 40 내지 90질량부, 구조 단위 (M-2): 전체 구조 단위에 대하여 10 내지 60질량부, 구조 단위 (M-3): 전체 구조 단위에 대하여 0 내지 25질량부이고, 더욱 바람직한 조합은 구조 단위 (M-1): 전체 구조 단위에 대하여 40 내지 80질량부, 구조 단위 (M-2): 전체 구조 단위에 대하여 15 내지 60질량부, 구조 단위 (M-3): 전체 구조 단위에 대하여 0 내지 25질량부이고, 특히 바람직한 조합은 구조 단위 (M-1): 전체 구조 단위에 대하여 40 내지 80질량부, 구조 단위 (M-2): 전체 구조 단위에 대하여 20 내지 60질량부, 구조 단위 (M-3): 전체 구조 단위에 대하여 0 내지 20질량부이다.
(에폭시기 함유량)
리간드 결합 전의 고상 담체에 포함되는 에폭시기는 리간드를 결합하기 위한 관능기이고, 또한, 추가로 개환 후에 친화성 크로마토그래피용 담체로서의 친수성 향상의 근본이 되는 관능기이다. 리간드 결합 전의 고상 담체의 에폭시기 함유량은, 바람직하게는 1 내지 6mmol/g이고, 더욱 바람직하게는 2 내지 5mmol/g이고, 특히 바람직하게는 2.5 내지 4mmol/g이다. 리간드 결합 전의 고상 담체의 에폭시기 함유량이 1mmol/g 이상이면, 리간드 결합 후에 얻어지는 개환 에폭시기의 양이 적절한 양이 되어, 표적 물질 이외의 불순물의 제거능이 향상된다. 리간드 결합 전의 고상 담체의 에폭시기 함유량이 6mmol/g 이하이면, 리간드 결합 후의 에폭시기의 잔류량이 감소하여, 친화성 크로마토그래피용 담체로서 보존한 경우의 리간드 활성 저하가 억제되어, 반복 사용했을 때의 표적 물질의 동적 결합 용량의 저하도 억제된다.
리간드 결합 전의 고상 담체의 에폭시기 함유량은 에폭시기 함유 모노비닐 단량체의 양, 중합 온도, 중합 시간, 중합액의 pH, 나아가 중합 후의 개환 처리 등에 의해 조정할 수 있다.
<고상 담체의 제조>
고상 담체의 제조법을, 고상 담체가 다공질 입자인 경우를 예로 들어 설명한다.
다공질 입자는 공지된 시드 중합, 현탁 중합 등에 의해 제조할 수 있다. 시드 중합법으로서, 일본 특허 공고 소57-24369호 공보에 기재된 2단 팽윤 중합법을 들 수 있다. 중합 시에는 상기 단량체 외에, 중합 개시제, 다공화제, 수계 매체, 분산 안정제, 계면 활성제, 중합 조정제, 중합 금지제, 시드 입자 등을 필요에 따라서 사용한다.
다공질 입자의 제조에 있어서의 바람직한 중합법은 단량체 혼합물과, 다공화제를 필수 성분으로 하는 수계 혼합물의 현탁 중합법이다.
또한, 현탁 중합의 구체적인 방법으로서는, 예를 들어 단량체 혼합물 및 다공화제를 포함하는 혼합 용액(단량체 용액)에 중합 개시제를 용해하고, 수계 매체 중에 현탁시켜서 소정 온도까지 가열하여 중합시키는 방법이나, 단량체 혼합물 및 다공화제를 포함하는 혼합 용액(단량체 용액)에 중합 개시제를 용해하고, 소정 온도까지 가열한 수계 매체 중에 첨가하여 중합시키는 방법, 단량체 혼합물 및 다공화제를 포함하는 혼합 용액(단량체 용액)을 수계 매체 중에 현탁시켜서 소정 온도까지 가열하고, 중합 개시제를 첨가하여 중합시키는 방법 등을 들 수 있다.
중합 개시제로서는 라디칼 중합 개시제가 바람직하다. 라디칼 중합 개시제로서는, 예를 들어 아조계 개시제, 과산화물계 개시제, 산화 환원계 개시제 등을 들 수 있고, 구체적으로는 아조비스이소부티로니트릴, 아조비스이소부티르산메틸, 아조비스-2,4-디메틸발레로니트릴, 과산화벤조일, 과산화디-tert-부틸, 과산화벤조일-디메틸아닐린 등을 들 수 있다. 중합 개시제의 합계 사용량은, 통상 단량체 총량 100질량부에 대하여 0.01 내지 10질량부 정도이다.
상기 다공화제는 다공질 입자를 제조하기 위하여 사용되고, 유적 내의 중합에 있어서, 단량체와 함께 존재하고, 비중합 성분으로서 구멍을 형성하는 역할을 갖는다. 다공화제는, 다공질 표면에 있어서 용이하게 제거 가능한 것이라면 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 각종 유기 용제나 단량체 혼합물에 가용인 선상 중합물 등을 들 수 있고, 이들을 병용해도 된다.
상기 다공화제로서는, 예를 들어 헥산, 헵탄, 옥탄, 노난, 데칸, 운데칸 등의 지방족 탄화수소류; 시클로헥산, 시클로펜탄 등의 지환식 탄화수소류; 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 나프탈렌, 에틸벤젠 등의 방향족 탄화수소류; 사염화탄소, 1,2-디클로로에탄, 테트라클로로에탄, 클로로벤젠 등의 할로겐화 탄화수소류; 부탄올, 펜탄올, 헥산올, 헵탄올, 헥산올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-에틸-1-헥산올 등의 지방족 알코올류; 시클로헥산올 등의 지환식 알코올류; 2-페닐에틸알코올, 벤질알코올 등의 방향족 알코올류; 디에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 디이소부틸케톤, 아세토페논, 2-옥타논, 시클로헥사논 등의 케톤류; 디부틸에테르, 디이소부틸에테르, 아니솔, 에톡시벤젠 등의 에테르류; 아세트산이소펜틸, 아세트산부틸, 아세트산-3-메톡시부틸, 말론산디에틸 등의 에스테르류 외에, 비가교성 비닐 단량체의 단독 중합체 등의 선상 중합물을 들 수 있다. 다공화제는 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 다공화제의 합계 사용량은, 통상 단량체 총량 100질량부에 대하여 40 내지 400질량부 정도이다.
상기 수계 매체로서는, 예를 들어 수용성 고분자 수용액 등을 들 수 있고, 수용성 고분자로서는, 예를 들어 히드록시에틸셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 전분, 젤라틴 등을 들 수 있다. 수계 매체의 합계 사용량은, 단량체 총량 100질량부에 대하여, 통상 200 내지 7000질량부 정도이다.
또한, 수계 매체의 분산매로서 물을 사용하는 경우, 예를 들어 염화나트륨, 황산나트륨, 탄산나트륨, 탄산칼슘, 인산칼슘 등의 분산 안정제를 사용해도 된다.
또한, 알킬황산에스테르염, 알킬아릴황산에스테르염, 알킬인산에스테르염, 지방산염 등의 음이온성 계면 활성제를 비롯한 각종 계면 활성제를 사용해도 된다.
또한, 아질산나트륨 등의 아질산염, 요오드화칼륨 등의 요오드화물염, tert-부틸피로카테콜, 벤조퀴논, 피크르산, 히드로퀴논, 염화구리, 염화제2철 등의 중합 금지제를 사용할 수도 있다.
또한, 도데실머캅탄 등의 중합 조정제를 사용해도 된다.
또한, 중합 온도는 중합 개시제에 따라서 결정하면 되지만, 예를 들어 아조비스이소부티로니트릴을 중합 개시제로서 사용하는 경우에는, 50 내지 100℃가 바람직하고, 60 내지 90℃가 보다 바람직하다.
또한, 중합 시간은 통상 5분 내지 48시간, 바람직하게는 10분 내지 24시간이다.
중합 완결 후, 얻어진 다공질 입자에 부착된 수용성 고분자 등을 제거하기 위해서, 물 및/또는 열수를 사용하여 세정하는 것이 바람직하다.
또한, 시드 입자 및/또는 다공화제의 양용매를 사용하여 세정하는 것이, 후술하는 리간드의 결합이 용이하게 되는 점에서, 바람직하다. 세정 용매로서는 아세톤, 에탄올, 이소프로필알코올 등을 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 필요에 따라, 세정의 전후로, 초음파 분산기 등을 사용하여 다공질 입자를 분산해도 된다. 또한, 데칸테이션, 여과, 체 분급 등의 방법에 의해, 작은 입자나 조대(粗大) 입자를 제거하는 것이 압력 특성의 향상이나 표적 물질 등의 동적 결합 용량의 향상의 점에서 바람직하다.
<친화성 크로마토그래피용 담체의 상기 이외의 구성>
(개환 에폭시기)
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체는, 에폭시기를 개환시켜서 얻어지는 개환 에폭시기를 갖는다. 이 개환 에폭시기는, 상기 공중합체를 함유하는 고상 담체에 리간드를 결합한 후에, 해당 공중합체에 포함되는 에폭시기, 즉 리간드와 결합한 에폭시기 이외의 잔여 에폭시기를 개환시켜서 얻을 수 있다. 에폭시기에는 상기의 공중합체에 포함되는 것 외에, 에피클로로히드린이나 디글리시딜에테르 화합물 등에 의해, 나중에 도입한 에폭시기도 포함되고, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체의 제조에 있어서 어느 단계에서 도입되었는지는 묻지 않는다.
그리고, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체는, 고상 담체의 표면의 에폭시기가 대부분 개환되어 있어, 친화성 크로마토그래피용 담체를 고농도의 염화물 이온과 접촉시켜, 잔여 에폭시기를 개환시켰을 때에 방출되는 수산화물 이온의 양이 현저하게 적다.
그로 인해, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체는, 친화성 크로마토그래피용 담체를 임의의 칼럼 용기에 충전하고, 칼럼을 2M의 NaCl을 포함하는 pH 7.5의 20mM 인산나트륨 완충액으로 치환하고, 40℃에서 7일간 정치했을 때의 칼럼 내의 pH 상승 폭이 2 이하가 되는 것이다. 이러한 구성에 의해, 불순물의 제거능과 보존 안정성이 우수한 것이 된다. 상기 pH 상승 폭은, 바람직하게는 1.9 이하이고, 불순물의 제거능을 더욱 개선시키는 경우에는, 1.7 이하가 보다 바람직하다. 또한, pH 상승 폭의 하한값은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 0.01이다.
상기 pH 상승 폭은, 구체적으로는 이하의 식으로부터 구할 수 있는 것이고, 보다 상세하게는 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, pH 상승 폭의 측정은 새로운 친화성 크로마토그래피용 담체에 대하여 행한다. 새로운 친화성 크로마토그래피용 담체란, 이전에 사용되지 않았던 상태의 담체를 의미하고, 예를 들어 항체 정제에 사용하는 것이라면, 항체 정제에 사용하기 전의 상태의 것을 말한다.
(pH 상승 폭)=(부하 pH)-(초기 pH)
상기 식에 있어서 「초기 pH」는, 2M의 NaCl을 포함하는 pH 7.5의 20mM 인산나트륨 완충액을 칼럼에 통액하여, 칼럼 내의 pH가 평형에 도달했을 때의 pH의 값을 의미한다.
상기 식에 있어서 「부하 pH」는, 초기 pH를 측정하고 나서 40℃의 항온기 내에서 7일간 정치한 후, 2M의 NaCl을 포함하는 pH 7.5의 20mM 인산나트륨 완충액을 칼럼에 다시 통액하여, pH가 가장 높아졌을 때의 pH의 값을 의미한다.
또한, 에폭시기가 개환되어 생성되는 개환 에폭시기로서는, 불순물의 비특이 흡착을 방지함과 함께, 보존 중에 리간드의 활성이 저하되는 것을 방지하는 관점에서, 하기 식 (1)로 표시되는 기가 바람직하다.
Figure 112016126108739-pct00001
[식 (1) 중,
R1은 탄소수 1 내지 6의 2가의 유기기를 나타내고,
R2는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 10의 1가의 유기기를 나타내고,
X는 티오기(>S), 술피닐기(>S=O), 술포닐기(>S(=O)2), 이미노기(>NH) 또는 옥시기(>O)를 나타내고,
*는 결합 위치를 나타냄]
R1은 탄소수 1 내지 6의 2가의 유기기를 나타낸다. 당해 유기기의 탄소수로서는, 바람직하게는 1 내지 4이고, 보다 바람직하게는 1 또는 2이다.
또한, 상기 2가의 유기기는 직쇄상이거나 분지쇄상이어도 된다. 또한, 이러한 2가의 유기기로서는 2가의 탄화수소기, 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자 간에 에테르 결합, 이미노기 및 에스테르 결합으로부터 선택되는 1종 이상을 갖는 기를 들 수 있고, 2가의 탄화수소기가 바람직하다.
상기 2가의 탄화수소기는, 바람직하게는 2가의 지방족 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 알칸디일기이다.
알칸디일기의 구체예로서는 메탄-1,1-디일기, 에탄-1,1-디일기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,1-디일기, 프로판-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 프로판-2,2-디일기, 부탄-1,4-디일기, 펜탄-1,5-디일기, 헥산-1,6-디일기 등을 들 수 있다.
R2는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 10의 1가의 유기기를 나타내지만, 탄소수 1 내지 10의 1가의 유기기가 바람직하다. 이러한 유기기로서는, 리간드를 결합시켰을 경우의 동적 결합 용량, 방오성의 관점에서, 하기 식 (2) 또는 (3)으로 표시되는 유기기가 바람직하고, 식 (2)로 표시되는 유기기가 보다 바람직하다.
Figure 112016126108739-pct00002
[식 (2) 중,
R3은 탄소수 1 내지 10의 2가 또는 3가의 유기기를 나타내고,
n은 1 또는 2를 나타내고,
**는 식 (1) 중의 X와의 결합 위치를 나타냄]
Figure 112016126108739-pct00003
[식 (3) 중,
R4는 탄소수 1 내지 10의 2가 또는 3가의 유기기를 나타내고,
Y는 산성기 또는 아미노기를 나타내고,
m은 1 또는 2를 나타내고,
**는 식 (1) 중의 X와의 결합 위치를 나타냄]
식 (2) 중의 R3, 식 (3) 중의 R4로 표시되는 2가 또는 3가의 유기기의 탄소수로서는, 리간드를 결합시켰을 경우의 동적 결합 용량 등의 관점에서, 1 내지 8이 바람직하고, 1 내지 6이 보다 바람직하고, 2 내지 4가 더욱 바람직하다.
또한, 상기 2가의 유기기로서는 2가의 탄화수소기를 들 수 있고, 직쇄상이거나 분지쇄상이어도 된다. 상기 2가의 탄화수소기는, 바람직하게는 2가의 지방족 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 알칸디일기이다. 이러한 알칸디일기의 탄소수로서는, 리간드를 결합시켰을 경우의 동적 결합 용량 등의 관점에서, 1 내지 8이 바람직하고, 1 내지 6이 보다 바람직하고, 2 내지 4가 더욱 바람직하다.
상기 알칸디일기의 구체예로서는 메탄-1,1-디일기, 에탄-1,1-디일기, 에탄-1,2-디일기, 프로판-1,1-디일기, 프로판-1,2-디일기, 프로판-1,3-디일기, 프로판-2,2-디일기 등을 들 수 있다.
또한, 상기 3가의 유기기로서는 3가의 탄화수소기를 들 수 있고, 직쇄상이거나 분지쇄상이어도 된다. 상기 3가의 탄화수소기는, 바람직하게는 3가의 지방족 탄화수소기이고, 보다 바람직하게는 알칸트리일기이다. 이러한 알칸트리일기의 탄소수로서는, 리간드를 결합시켰을 경우의 동적 결합 용량, 방오성의 관점에서, 1 내지 8이 바람직하고, 1 내지 6이 보다 바람직하고, 2 내지 4가 더욱 바람직하다.
상기 알칸트리일기의 구체예로서는 메탄-1,1,1-트리일기, 에탄-1,1,2-트리일기, 프로판-1,2,3-트리일기, 프로판-1,2,2-트리일기 등을 들 수 있다.
식 (2) 중, n은 1 또는 2를 나타내지만, 2가 바람직하다.
식 (3) 중, Y는 산성기 또는 아미노기를 나타내지만, 산성기가 바람직하다. 산성기로서는 카르복시기, 인산기, 술포기, 이들의 염 등을 들 수 있다. 또한, 염으로서는 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토금속염; 암모늄염; 유기 암모늄염 등을 들 수 있다.
식 (3) 중, m은 1 또는 2를 나타내지만, 1이 바람직하다.
X는 티오기(>S), 술피닐기(>S=O), 술포닐기(>S(=O)2), 이미노기(>NH) 또는 옥시기(>O)를 나타내지만, 티오기(>S), 술피닐기(>S=O), 옥시기(>O)가 바람직하고, 티오기(>S), 술피닐기(>S=O)가 보다 바람직하고, 술피닐기(>S=O)가 특히 바람직하다.
고상 담체 중의 에폭시기의 개환 방법으로서는, 예를 들어 수 용매 중, 산 또는 알칼리 존재하에서 교반하는 방법을 들 수 있다. 교반은 가열하여 행해도 되고, 실온에서 행해도 된다.
또한, 머캅토에탄올, 티오글리세롤, 머캅토아세트산이나 그의 염, 머캅토숙신산이나 그의 염, 머캅토에탄술폰산이나 그의 염, 머캅토프로판술폰산이나 그의 염 등의 친수성기를 갖는 머캅토 화합물; 모노에탄올아민, 글루코사민 등의 친수성기를 갖는 아민 화합물; 디에틸렌글리콜, 글리세린 등의 다가 알코올류를 에폭시기를 개환시키는 블로킹제로서 사용해도 된다. 또한, 여기에서 말하는 친수성기로서는 히드록시기; 아미노기; 카르복시기, 인산기, 술포기, 이들의 염 등의 산성기 등을 들 수 있다. 염으로서는 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 마그네슘염, 칼슘염 등의 알칼리 토금속염; 암모늄염; 유기 암모늄염 등을 들 수 있다.
상기 산이나 알칼리, 블로킹제의 사용량은 잔여 에폭시기 1몰에 대하여, 통상 0.1 내지 40몰 당량이다. 잔여 에폭시기는 리간드와 다점 결합하고, 보존 중에 리간드의 활성을 저하시키기 위해서, 2 내지 40몰 당량의 과잉량으로 블로킹하는 것이 바람직하다.
또한, 개환 반응의 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.5 내지 72시간 정도이고, 바람직하게는 1 내지 48시간이다. 또한, 반응 온도는 용매의 비점 이하에서 적절히 선택하면 되지만, 통상 2 내지 100℃ 정도이다.
또한, 필요에 따라 염기성 촉매 존재하에서 블로킹을 행해도 된다. 이러한 염기성 촉매로서는 트리에틸아민, N,N-디메틸-4-아미노피리딘, 디이소프로필에틸아민 등을 들 수 있고, 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
바람직한 개환 에폭시기는, 고상 담체에 포함되는 에폭시기를 머캅토 화합물 및/또는 다가 알코올류에 의해 개환시켜서 얻어지는 개환 에폭시기이고, 아미노기를 갖는 블로킹제에 의한 개환기보다도 비특이 흡착이 적어지는 데다, 동적 결합량이 높아진다고 하는 이점을 갖는다.
또한, 머캅토 화합물을 블로킹제로서 사용한 경우, 산화제를 사용하여 티오기를 술피닐기로 산화하여, 더욱 친수성을 향상시킬 수 있다.
상기 산화제는 유기 산화제와 무기 산화제로 크게 구별되고, 유기 산화제로서는, 예를 들어 과아세트산, 과벤조산, 메타클로로과벤조산 등을 들 수 있다. 한편, 무기 산화제로서는, 예를 들어 과산화수소, 크롬산, 과망간산염 등을 들 수 있다. 또한, 이들 산화제는 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 산화제의 합계 사용량은 티오기 1몰에 대하여, 통상 0.1 내지 10몰 당량 정도이지만, 바람직하게는 0.5 내지 3몰 당량이다.
또한, 상기 산화 반응은 용매 존재하에서 행하는 것이 바람직하다. 이러한 용매로서는 물; 디메틸포름아미드, 디메틸아세트아미드 등의 아미드계 용매; 메탄올, 에탄올 등의 알코올계 용매 등을 들 수 있고, 이들 용매는 1종을 단독으로 또는 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
상기 용매의 합계 사용량은, 원료가 되는 고상 담체에 대하여, 통상 1 내지 50질량배 정도인데, 바람직하게는 5 내지 15질량배이다.
또한, 상기 산화 반응의 반응 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 1 내지 72시간 정도이고, 반응 온도는 용매의 비점 이하에서 적절히 선택하면 되지만, 통상 1 내지 90℃ 정도이다.
(리간드)
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체는, 고상 담체에 결합한 리간드를 포함하는 것이다.
리간드는, 표적 물질에 대하여 적당한 친화성을 갖는 것이라면, 그의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, Fc 결합 단백, 아비딘 등의 단백질; 인슐린 등의 펩티드; 모노클로날 항체 등의 항체; 효소; 호르몬; DNA; RNA; 헤파린, 루이스 X, 강글리오시드 등의 당질; 이미노디아세트산, 합성 색소, 2-아미노페닐붕소산, 4-아미노벤즈아미딘, 글루타티온, 비오틴이나 그의 유도체와 같은 저분자 화합물을 사용할 수 있다. 상기에 예시한 리간드는 그 전체를 사용해도 되지만, 재조합, 효소 처리 등에 의해 얻어지는 그의 프래그먼트를 사용해도 된다. 또한, 인공적으로 합성된 펩티드나 펩티드 유도체여도 된다.
상기 리간드 중에서도, 이뮤노글로불린의 분리 또는 정제에 적합한 리간드로서는, 이뮤노글로불린 결합성 단백질을 들 수 있다.
이뮤노글로불린 결합성 단백질로서는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, Fc 결합 단백 및 그들의 기능성 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종 이상이 바람직하다. 그 중에서도, 바람직하게는 단백질 A, 단백질 G, 그들의 기능성 변이체이고, 보다 바람직하게는 단백질 A, 그의 기능성 변이체이다.
또한, 본 발명에 있어서, 「단백질」이란, 펩티드 구조 단위를 갖는 모든 분자를 말하고, 예를 들어 천연형 단백질의 부분적 단편이나 천연형 단백질의 아미노산 서열을 인위적으로 개변한 변이체를 포함하는 개념이다. 또한, 「이뮤노글로불린 결합 도메인」이란, 단독으로 이뮤노글로불린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 기능 단위를 나타내고, 「이뮤노글로불린 결합성 단백질」이란, 이뮤노글로불린에 특이적인 친화성을 갖고, 또한 「이뮤노글로불린 결합 도메인」을 포함하는 단백질을 나타낸다. 「이뮤노글로불린 결합」이란 이뮤노글로불린 분자의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 영역, 특히 Fc 프래그먼트에 결합하는 것을 나타낸다. 본 발명에 있어서, 친화성 크로마토그래피에 관련하여 사용되는 용어 「리간드」란, 친화성 크로마토그래피의 표적 물질과 결합하는 분자를 나타낸다.
상기 리간드와 고상 담체의 결합 방법으로서는, 고상 담체에 포함되는 에폭시기를 그대로 리간드와의 결합 부위로서 이용하는 것이 프로세스로서 간편하여, 바람직하다. 그 밖에, 고상 담체에 포함되는 에폭시기를 개환시켜 생성하는 알코올성 수산기를 토실기 등으로 활성화하고 나서, 리간드를 결합하는 방법이나, 고상 담체에 포함되는 에폭시기 또는, 당해 에폭시기의 개환에 의해 생성되는 기로부터 추가로 링커를 늘리고 나서, 당해 링커를 통해 고상 담체에 리간드를 결합해도 된다. 링커로서는 디글리시딜옥시알칸, 폴리알킬렌글리콜디글리시딜에테르 등의 디글리시딜에테르 화합물이 바람직하다.
리간드의 결합 조건은 리간드 결합 전의 고상 담체의 에폭시기 함유량, 리간드의 종류에 따라 상이하지만, 당업자에게 공지된 방법을 채용할 수 있다. 리간드가 단백질인 경우에는, 단백질의 N 말단의 아미노기, 단백질에 포함되는 리신, 시스테인이 에폭시와의 반응점이 될 수 있다. 단백질을 결합하는 경우, 예를 들어 단백질의 등전점에 가까운 버퍼류의 수용액을 사용하고, 필요에 따라 염화나트륨이나 황산나트륨 등의 염을 첨가하여, 단백질과 고상 담체를 혼합하면서, 0 내지 40℃에서 1 내지 48시간 반응시켜서, 리간드인 단백질을 결합할 수 있다.
리간드의 결합량은 리간드의 종류, 표적 물질의 종류 등에 따라 적절히 조절되지만, 단백질 A와 같은 이뮤노글로불린 결합성 단백질을 리간드로서 결합하는 경우, 고상 담체 1g당, 바람직하게는 10 내지 200mg, 보다 바람직하게는 25 내지 100mg이다. 단백질 A와 같은 이뮤노글로불린 결합성 단백질을 리간드로서 결합하는 경우, 고상 담체 1g당의 리간드의 결합량이 10mg 이상이면 동적 결합 용량이 우수한 것이 되고, 200mg 이하이면, 결합한 항체의 용출을 위해 사용되는 용출액의 양이 특히 적절한 양이 된다.
(입자 직경, 비표면적)
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체를 구성하는 고상 담체가 다공질 입자인 경우, 상기 다공질 입자의 입자 직경은, 통상 35 내지 100㎛이고, 바람직하게는 40 내지 85㎛이다. 입자 직경이 35㎛ 이상이면, 압력 특성이 우수하다. 100㎛ 이하이면, 동적 결합 용량이 높은 충전제가 얻어진다.
다공질 입자의 입자 직경은, 중합할 때의 조건으로 조정할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서의 「입자 직경」이란, 레이저 회절 산란식 입도 분포 측정 장치(베크만·콜터사제 LS13320)에 의해 얻어지는 부피 평균 입자 직경을 의미한다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체를 구성하는 고상 담체가 다공질 입자인 경우, 상기 다공질 입자의 비표면적은 구멍 직경 10 내지 5000nm의 범위에 상당하는 포어를 측정했을 때에, 포어 사이즈 10nm 내지 5000nm에 있어서의 비표면적으로, 바람직하게는 70㎡/g 이상이고, 보다 바람직하게는 90㎡/g 이상이다. 비표면적이 상기의 범위 내이면, 표적 물질의 동적 결합 용량이 높은 친화성 크로마토그래피용 담체가 얻어진다. 또한, 본 발명에 있어서의 「비표면적」이란, 수은 포로시미터(가부시키가이샤 시마즈 세이사꾸쇼제 오토포어 IV9520)에 의해 얻어지는 세공 직경 10 내지 5000nm의 세공이 갖는 표면적을 입자의 건조 질량으로 나눈 값이다.
본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체는 불순물 제거능이 높고, 게다가 보존 안정성이 우수하여, 항체 등의 단백질의 정제에 특히 유용하다.
〔친화성 크로마토그래피 칼럼〕
본 발명의 친화성 크로마토그래피 칼럼은 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체가 칼럼 용기에 충전된 것이다.
〔표적 물질의 정제 방법〕
본 발명의 표적 물질의 정제 방법은 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는 것이다.
정제는, 본 발명의 친화성 크로마토그래피용 담체를 사용하는 것 이외에는 통상의 방법과 마찬가지인데, 예를 들어 표적 물질을 포함하는 조성물을 준비하는 준비 공정과, 본 발명의 크로마토그래피 칼럼에 상기 조성물을 통액하는 통액 공정과, 해당 통액 공정에 의해 담체에 흡착된 표적 물질을 용출시키는 용출 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 정제 방법은 단백질의 정제에 적합하고, 이뮤노글로불린의 정제에 특히 적합하다.
실시예
이하, 실시예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
(1) 360g의 순수에 폴리비닐알코올(구라레사제 PVA-217) 3.58g을 첨가하고, 가열 교반하여 폴리비닐알코올을 용해시켜, 냉각한 후, 도데실황산나트륨(와코 쥰야꾸 고교제) 0.36g, 황산나트륨(와코 쥰야꾸 고교제) 0.36g, 아질산나트륨(와코 쥰야꾸 고교제) 0.18g을 첨가하고, 교반하여 수용액 S를 제조하였다.
한편, 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사제) 12.00g 및 디비닐벤젠(신닛테츠 가가쿠사제) 1.33g을 포함하는 단량체 조성물을, 디이소부틸케톤(미쓰이 가가쿠사제) 24.43g에 용해시켜, 단량체 용액을 제조하였다.
계속해서, 상기 수용액 S를 500mL 세퍼러블 플라스크 내에 전량 투입하고, 온도계, 교반 날개 및 냉각관을 장착하여, 온수 배스에 세팅하고, 질소 분위기하에서 교반을 개시하였다. 세퍼러블 플라스크 내에 상기 단량체 용액을 전량 투입하여, 온수 배스에 의해 가온하고 내온이 85℃에 도달했을 때 2,2'-아조이소부티로니트릴(와코 쥰야꾸 고교사제) 0.53g을 첨가하고, 86℃로 온도를 유지하였다.
(2) 그 후, 86℃로 온도를 유지하고, 3시간 교반을 행하였다. 계속해서, 반응액을 냉각한 후, 이러한 반응액을 여과하여, 순수와 에탄올로 세정하였다. 세정한 입자를 순수에 분산시켜서 데칸테이션을 3회 행하고, 작은 입자를 제거하였다. 계속해서, 입자의 농도가 10질량％가 되도록 입자를 순수에 분산시켜, 다공질 입자 분산액을 얻었다.
(3) 개변 단백질 A(Repligen제 rSPA) 0.15g을, 1.2M 황산나트륨/0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6) 40mL에 분산시켜 단백질 A 분산액을 얻고, 이 단백질 A 분산액에 실시예 1의 공정 (2)에서 얻어진 다공질 입자 분산액(입자 건조 질량 환산으로 1g 상당)을 첨가하였다. 이 분산액을 25℃에서 5시간 진탕 교반하여, 단백질 A를 입자에 고정하였다.
(4) 생성한 단백질 A 고정 입자를, 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6)로 세정한 후, 1.0M 황산 수용액(와코 쥰야꾸 고교사제) 40mL에 분산시켜, 40℃에서 4시간 진탕 교반함으로써, 미반응된 에폭시기를 개환시켰다.
그 후, 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6), 0.1M 수산화나트륨 수용액, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH 3.2)로 세정하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 1을 얻었다.
(실시예 2)
실시예 1의 공정 (1)에 있어서, 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사제) 9.20g, 1-에틸-4-비닐벤젠(ChemSampCo사제) 0.58g 및 디비닐벤젠(신닛테츠 가가꾸사제) 1.73g을 포함하는 단량체 조성물을, 디이소부틸케톤(미쓰이 가가쿠사제) 19.59g 및 아니솔(와코 쥰야꾸 고교사제) 6.05g의 혼합액에 용해시켜, 단량체 용액을 제조한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 및 (2)와 동일한 조작을 행하여, 다공질 입자 분산액을 얻었다.
그 후, 실시예 1의 공정 (3)과 동일한 조작으로 단백질 A를 고정하여, 단백질 A 고정 입자를 생성시켰다.
계속해서, 생성한 단백질 A 고정 입자를, 1.0M 2-머캅토에탄올(와코 쥰야꾸 고교사제)/0.1M 황산나트륨(pH 8.3) 40mL에 분산시키고, 25℃에서 17시간 진탕 교반함으로써, 미반응된 에폭시기를 개환시켰다. 또한, 얻어진 미반응된 에폭시기가 개환한 단백질 A 고정 입자를, 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6), 0.1M 수산화나트륨 수용액, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH 3.2)로 세정하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 2를 얻었다.
(실시예 3)
실시예 1의 공정 (1)에 있어서, 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사제) 8.18g, N-(2-히드록시에틸)아크릴아미드(도꾜 가세이 고교사제) 1.36g 및 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트(사토마사제) 4.09g을 포함하는 단량체 조성물을, 4-메틸-2-펜탄올(와코 쥰야꾸 고교제) 21.97g 및 탄산디에틸(와코 쥰야꾸 고교제) 2.95g의 혼합액에 용해시켜, 단량체 용액을 제조한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 및 (2)와 동일한 조작을 행하여, 다공질 입자 분산액을 얻었다.
그 후, 실시예 1의 공정 (3)과 동일한 조작으로 단백질 A를 고정하여, 단백질 A 고정 입자를 생성시켰다.
계속해서, 생성한 단백질 A 고정 입자 (PA-1)을 1.0M 1-티오글리세롤(아사히 가가꾸 고교사제)/0.1M 황산나트륨(pH 8.3) 40mL에 분산시키고, 25℃에서 17시간 진탕 교반함으로써, 미반응된 에폭시기를 개환시켰다. 또한, 얻어진 미반응된 에폭시기가 개환한 단백질 A 고정 입자 (PA-2)를 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6), 0.1M 수산화나트륨 수용액, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH 3.2)로 세정하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 3을 얻었다.
(실시예 4)
실시예 3과 동일한 조작으로 얻은, 미반응된 에폭시기가 개환한 단백질 A 고정 입자 (PA-2)를 입자의 농도가 10질량％가 되도록 순수에 분산시켰다. 이것에, 30％ 과산화수소수 0.48g을 첨가하고, 25℃에서 24시간 진탕 교반하였다. 또한, 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6), 0.1M 수산화나트륨 수용액, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH 3.2)로 세정하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 4를 얻었다.
(실시예 5)
실시예 3과 동일한 조작으로 생성시킨 단백질 A 고정 입자 (PA-1)을 1.0M 1-티오글리세롤/0.1M 황산나트륨(pH 8.3) 40mL에 분산시키고, 25℃에서 40시간 진탕 교반함으로써, 미반응된 에폭시기를 개환시켰다. 또한, 얻어진 미반응된 에폭시기가 개환한 단백질 A 고정 입자를, 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6), 0.1M 수산화나트륨 수용액, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH 3.2)로 세정하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 5를 얻었다.
(실시예 6)
실시예 1의 공정 (1)에 있어서, 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사제) 5.26g, 글리세롤모노메타크릴레이트(니찌유사제) 2.63g 및 디비닐벤젠(신닛테츠 가가꾸사제) 2.63g을 포함하는 단량체 조성물을, 2-옥타논(도요 고세이사제) 25.00g에 용해시켜, 단량체 용액을 제조한 것 이외에는 실시예 1의 공정 (1) 및 (2)과 동일한 조작을 행하여, 다공질 입자 분산액을 얻었다.
그 후, 실시예 1의 공정 (3)과 동일한 조작으로 단백질 A를 고정하여, 단백질 A 고정 입자를 생성시켰다.
계속해서, 생성한 단백질 A 고정 입자를, 1.0M 2-머캅토프로판술폰산나트륨(도꾜 가세이 고교사제)/0.1M 황산나트륨(pH 8.3) 40mL에 분산시키고, 25℃에서 17시간 진탕 교반함으로써, 미반응된 에폭시기를 개환시켰다. 또한, 얻어진 미반응된 에폭시기가 개환한 단백질 A 고정 입자를, 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6), 0.1M 수산화나트륨 수용액, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH 3.2)로 세정하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 6을 얻었다.
(실시예 7)
실시예 1의 공정 (1)에 있어서, 4-히드록시부틸아크릴레이트글리시딜에테르(닛본 가세이사제) 4.77g 및 글리세린디메타크릴레이트(신나까무라 가가꾸 고교사제) 8.86g을 포함하는 단량체 조성물을, 아세토페논(이노우에 코료 세이조쇼사제) 21.52g 및 2-옥타논(도요 고세이사제) 7.35g의 혼합액에 용해시켜, 단량체 용액을 제조한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 및 (2)와 동일한 조작을 행하여, 다공질 입자 분산액을 얻었다.
그 후, 실시예 3과 동일한 조작으로 단백질 A의 고정, 미반응된 에폭시기의 개환 및 세정을 실시하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 7을 얻었다.
(실시예 8)
실시예 1의 공정 (1)에 있어서, 비닐벤질글리시딜에테르(도레이·파인 케미컬사제) 3.43g, 글리세롤모노메타크릴레이트(니찌유사제) 4.11g 및 에틸렌글리콜디메타크릴레이트(신나까무라 가가꾸 고교사제) 6.17g을 포함하는 단량체 조성물을, 아세토페논(이노우에 코료 세이조쇼사제) 21.52g 및 2-옥타논(도요 고세이사제) 7.35g의 혼합액에 용해시켜, 단량체 용액을 제조한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 및 (2)와 동일한 조작을 행하여, 다공질 입자 분산액을 얻었다.
그 후, 실시예 3과 동일한 조작으로 단백질 A의 고정, 미반응된 에폭시기 개환 및 세정을 실시하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 8을 얻었다.
(비교예 1)
실시예 3에 있어서, 단백질 A 고정 후에 미반응된 에폭시기 개환을 행하지 않는 것 이외에는, 실시예 3과 동일한 조작으로 친화성 크로마토그래피용 충전제 9를 얻었다.
(비교예 2)
실시예 1의 공정 (1)에 있어서, 3,4-에폭시시클로헥실메틸메타크릴레이트(다이셀사제) 1.41g, 글리세롤모노메타크릴레이트(니찌유사제) 8.45g 및 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트(사토마사제) 4.23g을 포함하는 단량체 조성물을, 아세토페논(이노우에 코료 세이조쇼사제) 21.50g 및 2-옥타논(도요 고세이사제) 7.34g의 혼합액에 용해시켜, 단량체 용액을 제조한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 및 (2)와 동일한 조작을 행하여, 다공질 입자 분산액을 얻었다.
그 후, 실시예 1의 공정 (3)과 동일한 조작으로 단백질 A를 고정하여, 단백질 A 고정 입자를 생성시켰다.
계속해서, 생성한 단백질 A 고정 입자를, 1.0M 1-티오글리세롤(아사히 가가꾸 고교사제)/0.1M 황산나트륨(pH 8.3) 40mL에 분산시키고, 25℃에서 4시간 진탕 교반함으로써, 미반응된 에폭시기를 개환시켰다. 또한, 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 6.6), 0.1M 수산화나트륨 수용액, 0.1M 시트르산나트륨 버퍼(pH 3.2)로 세정하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 10을 얻었다.
(비교예 3)
비교예 2에 있어서, 1.0M 1-티오글리세롤(아사히 가가꾸 고교사제)/0.1M 황산나트륨(pH 8.3) 40mL에 단백질 A 고정 입자를 분산시킨 후의 진탕 교반 시간을, 4시간에서 17시간으로 변경한 것 이외에는, 비교예 2와 동일한 조작으로 친화성 크로마토그래피용 충전제 11을 얻었다.
(비교예 4)
실시예 1의 공정 (1)에 있어서, 글리시딜메타크릴레이트(미쯔비시 레이온사제) 1.39g, 글리세롤 모노메타크릴레이트(니찌유사제) 2.79g 및 글리세린디메타크릴레이트(신나까무라 가가꾸 고교사제) 9.76g을 포함하는 단량체 조성물을, 아세토페논(이노우에 코료 세이조쇼사제) 21.50g 및 2-옥타논(도요 고세이사제) 7.34g의 혼합액에 용해시켜, 단량체 용액을 제조한 것 이외에는, 실시예 1의 공정 (1) 및 (2)과 동일한 조작을 행하여, 다공질 입자 분산액을 얻었다.
그 후, 실시예 3과 동일한 조작으로 단백질 A의 고정, 미반응된 에폭시기 개환 및 세정을 실시하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제 12를 얻었다.
시험예 1(에폭시기 함유량의 정량)
실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 4에서 얻어진 리간드 결합 전의 다공질 입자의 에폭시기 함유량을 정량하였다.
즉, 염화칼슘 수용액에 현탁한 다공질 입자에 염산을 과잉으로 첨가하여 염산을 부가 반응시킴으로써 에폭시기를 개환하고, 잔여의 염산을 과잉량의 수산화나트륨 수용액으로 중화한 후, 페놀프탈레인 용액을 첨가하고, 잔여의 수산화나트륨을 염산으로 역적정함으로써 정량하였다. 또한, 적정의 종점은 페놀프탈레인의 적색이 사라진 시점으로 하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
시험예 2(잔여 에폭시기량의 평가(pH 상승 폭의 측정))
실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 4에서 얻어진 친화성 크로마토그래피용 충전제를 GE 헬스케어사제 Tricorn 5/50 칼럼에 충전 높이 약 5cm로 충전하고, 상기 칼럼을 GE 헬스케어사제 AKTAprime plus에 접속하여 pH를 모니터링하면서 2M의 NaCl을 포함하는 pH 7.5의 20mM 인산나트륨 완충액을 유속 0.2mL/분으로 통액하여, 칼럼 내의 pH가 평형에 도달했을 때의 pH의 값을 초기 pH로서 기록하였다. 또한, 상기 완충액으로 치환한 상기 칼럼을 AKTAprime plus로부터 떼어내고, 40℃의 항온기 내에서 7일간 정치하였다.
그 후, 상기 칼럼을 다시 AKTAprime plus에 접속하여 pH를 모니터링하면서 상기 완충액을 유속 0.2mL/분으로 통액하여, pH가 가장 높아졌을 때의 pH의 값을 부하 pH로서 기록하였다. 초기 pH와 부하 pH와의 차를 pH 상승 폭으로서 구하였다. 또한, 초기 pH 및 부하 pH의 측정은 23±1℃의 항온실 내에서 실시하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
시험예 3(단백질 A 결합량의 정량)
실시예 1 내지 8 및 비교예 1 내지 4에서 얻어진 친화성 크로마토그래피용 충전제에 결합한 리간드인 단백질 A의 결합량을, 비신코닌산(BCA) 시약을 사용하여 정량하였다. 구체적으로는, 고형분 환산으로 1mg의 충전제를 테스트 튜브에 채취하고, 이것을 ThermoFisher Scientific사의 BCA 단백질 검정 키트(Protein Assay Kit)로 정량하였다. 반응은 37℃에서 30분간, 전도 혼화함으로써 행하였다. 검량선은 담체에 결합시킨 단백질 A와 동일한 것을 사용하여 작성하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
시험예 4(DBC의 측정 및 보존 안정성의 평가)
GE 헬스케어사제 AKTAprime plus를 사용하여, 선 유속 300cm/hr에 있어서의 단백질(인간 IgG 항체, Equitech Bio사제 HGG-1000)에 대한 실시예 및 비교예의 각 충전제의 DBC를 측정하였다. 칼럼은 용량 4mL(5mmφ×200mm 길이)의 것을, 단백질은 20mM 인산나트륨/150mM 염화나트륨 수용액(pH 7.5)에서 5mg/mL로 단백질을 용해한 것을 각각 사용하고, 용출 선단 10％ 브레이크 스루(breakthrough)일 때의 단백질 포착량과 칼럼 충전 부피로부터 DBC를 구하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
또한, DBC 측정 후의 칼럼을 시험예 2와 동일하게 2M의 NaCl을 포함하는 pH 7.5의 20mM 인산나트륨 완충액으로 치환하고, 그대로 40℃에서 7일간 정치하였다. 그 후, 다시 상기와 동일한 조건으로 DBC의 측정을 실시하고, 부하 DBC를 구하였다. 부하 DBC/초기 DBC×100을 DBC 유지율로 하여, 친화성 크로마토그래피용 충전제의 보존 안정성을 평가하였다. 또한, 초기 DBC 및 부하 DBC의 측정은 23±1℃의 항온실 내에서 실시하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
시험예 5(HCP의 정량)
칼럼 용기(GE 헬스케어사제 Tricorn10/50 column)에, 실시예 및 비교예의 각 충전제를, 충전 높이 약 5cm로 충전하여 칼럼을 제작하였다. 얻어진 칼럼을 GE 헬스케어사제 AKTA Prime Plus에 각각 접속하고, 20mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.5)를 5칼럼 용량(칼럼 용적의 5배), 유속 1mL/분으로 통액하고, 평형화시켰다.
계속해서, 모노클로날 항체 트라스투주맙(Trastuzumab)을 함유하는 CHO 세포 배양 상청을, 약 23mg 항체/mL 담체의 부하량으로, 유속 1mL/분으로 칼럼에 통액하였다.
계속해서, 20mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.5), 20mM 인산나트륨/1M 염화나트륨 버퍼(pH 7.5) 및 20mM 인산나트륨 버퍼(pH 7.5)를 각각 5칼럼 용량, 유속 1mL/분으로 칼럼에 순차 통액하였다.
그 후, 50mM 시트르산나트륨 버퍼(pH 3.2)를 유속 1mL/분으로 칼럼에 통액하고, 칼럼 내에 포착되어 있었던 모노클로날 항체를 용출시켜, Abs. 280>100mAu의 용출 프랙션을 회수하였다.
그리고, 분광 광도계를 사용하여, 회수한 프랙션 중에 함유되는 항체 농도(mg/mL)를 측정하였다. 또한, Cygnus Technologies사제 CHO HCP ELISA kit, 3G를 사용하여, 회수한 프랙션 중에 함유되는 Host Cell Protein(HCP)의 농도(ng/mL)를 측정하였다. 또한 HCP의 농도를 항체 농도로 나눔으로써, 단위 항체량당의 HCP량을 산출하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
Figure 112016126108739-pct00004
표 1 중의 각 기호는 이하에 나타내는 대로이다.
(M-1) GMA: 글리시딜메타크릴레이트, HBAGE: 4-히드록시부틸아크릴레이트글리시딜에테르, VBGE: (4-비닐벤질)글리시딜에테르, METHB: 3,4-에폭시시클로헥실메틸메타크릴레이트
(M-2) DVB: 디비닐벤젠, TMP: 트리메틸올프로판트리메타크릴레이트, GLDM: 글리세린디메타크릴레이트, EDMA: 에틸렌글리콜디메타크릴레이트
(M-3) EVB: 1-에틸-4-비닐벤젠, HEAA: N-(2-히드록시에틸)메타크릴아미드, GLM: 글리세롤모노메타크릴레이트
(개환에 사용한 화합물) ME: 2-머캅토에탄올, TG: 1-티오글리세롤, MPSA: 2-머캅토프로판술폰산나트륨

Claims (12)

  1. (M-1) 에폭시기 함유 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 50 내지 95질량부, 및
    (M-2) 폴리비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 0.5 내지 40질량부를 포함하며, 추가로 (M-3) 에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체에서 유래되는 구조 단위: 전체 구조 단위에 대하여 40질량부 이하를 더 포함하는 공중합체를 함유하는 고상 담체와,
    에폭시기를 개환시켜서 얻어지는 개환 에폭시기와,
    상기 고상 담체에 결합한 리간드를 포함하는 친화성 크로마토그래피용 담체이며,
    여기서, 에폭시기를 함유하지 않는 모노비닐 단량체는 에틸비닐벤젠, 글리세롤모노(메트)아크릴레이트 및 히드록시에틸(메트)아크릴아미드로 이루어지는 군에서 선택되는 것이고,
    상기 친화성 크로마토그래피용 담체를 임의의 칼럼 용기에 충전하고, 칼럼을 2M의 NaCl을 포함하는 pH 7.5의 20mM 인산나트륨 완충액으로 치환하고, 40℃에서 7일간 정치했을 때의 칼럼 내의 pH 상승 폭이 2 이하인 것을 특징으로 하는
    친화성 크로마토그래피용 담체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 개환 에폭시기가 하기 식 (1)로 표시되는 기인, 친화성 크로마토그래피용 담체.
    Figure 112022014872561-pct00007

    [식 (1) 중,
    R1은 탄소수 1 내지 6의 2가의 탄화수소기, 또는 2가의 탄화수소기의 탄소-탄소 원자 간에 에테르 결합, 이미노기 및 에스테르 결합으로부터 선택되는 1종 이상을 갖는 기를 나타내고,
    R2는 수소 원자 또는 탄소수 1 내지 10의 1가의 유기기를 나타내고, 1가의 유기기는 하기 식 (2) 또는 (3)으로 표시되는 기이며,
    X는 티오기(>S), 술피닐기(>S=O), 술포닐기(>S(=O)2), 이미노기(>NH) 또는 옥시기(>O)를 나타내고,
    *는 결합 위치를 나타냄]
    Figure 112022014872561-pct00008

    [식 (2) 중,
    R3은 탄소수 1 내지 10의 2가 또는 3가의 탄화수소기를 나타내고,
    n은 1 또는 2를 나타내고,
    **는 식 (1) 중의 X와의 결합 위치를 나타냄]
    Figure 112022014872561-pct00009

    [식 (3) 중,
    R4는 탄소수 1 내지 10의 2가 또는 3가의 탄화수소기를 나타내고,
    Y는 산성기 또는 아미노기를 나타내고,
    m은 1 또는 2를 나타내고,
    **는 식 (1) 중의 X와의 결합 위치를 나타냄]
  3. 제2항에 있어서, X가 티오기(>S), 술피닐기(>S=O) 또는 옥시기(>O)인, 친화성 크로마토그래피용 담체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 리간드가 이뮤노글로불린 결합성 단백질인, 친화성 크로마토그래피용 담체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 이뮤노글로불린 결합성 단백질이 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, Fc 결합 단백 및 그들의 기능성 변이체로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종 이상인, 친화성 크로마토그래피용 담체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 고상 담체가 다공질 입자인, 친화성 크로마토그래피용 담체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 다공질 입자의 입자 직경이 35 내지 100㎛인, 친화성 크로마토그래피용 담체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 크로마토그래피용 담체가 칼럼 용기에 충전된, 친화성 크로마토그래피 칼럼.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 친화성 크로마토그래피용 담체를 사용하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 정제 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적 물질이 표적 단백질인, 정제 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3076170B1 (en) * 2013-11-27 2023-09-06 JSR Corporation Solid-phase carrier and production method for filler for affinity chromatography
JP6634202B2 (ja) * 2014-08-22 2020-01-22 Jsr株式会社 担体、担体の製造方法、及び標的物の精製方法
JP2019070528A (ja) * 2016-02-26 2019-05-09 Jsr株式会社 多孔質担体、アフィニティクロマトグラフィー用多孔質担体、標的物の精製方法、及び抗体
EP3586958B1 (en) 2017-02-27 2022-04-06 Showa Denko K.K. Packing material for size exclusion chromatography and method for producing the same
WO2019004440A1 (ja) * 2017-06-30 2019-01-03 昭和電工株式会社 液体クロマトグラフィー用充填剤及び液体クロマトグラフィー用カラム
EP3770191A4 (en) * 2018-04-27 2021-11-10 Canon Kabushiki Kaisha PARTICLES, METHOD FOR MANUFACTURING PARTICLES, AFFINITY PARTICLES, REAGENTS AND KIT THEREFORE AS WELL AS METHOD FOR DETECTING A TARGET SUBSTANCE
EP3816177A4 (en) 2018-06-29 2021-12-01 Mitsubishi Chemical Corporation POLYPEPTIDE ISOLATION PROCESS, POLYPEPTIDE PRODUCTION PROCESS AND POLYPEPTIDE PURIFICATION APPARATUS
JP2021181405A (ja) * 2018-08-29 2021-11-25 Jsr株式会社 ポリペプチドの精製方法
EP3897972A1 (en) * 2018-12-17 2021-10-27 CHRETO ApS Ligand linker substrate
CN110577878B (zh) * 2019-08-30 2022-11-04 安徽省金裕皖酒业有限公司 一种利用副产物黄水提高白酒抗氧化活性的方法
CN115463647A (zh) * 2021-06-11 2022-12-13 苏州瑞恒嘉航医疗科技有限公司 一种蛋白分离专用固定相及其制备与应用
WO2023058409A1 (ja) 2021-10-05 2023-04-13 Jsr株式会社 クロマトグラフィー担体をカラムに充填する方法、スラリーの保存方法、及びスラリー

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1088861B (it) * 1976-10-28 1985-06-10 Asahi Chemical Ind Materiale assorbente per proteine
JP2540667B2 (ja) 1989-07-06 1996-10-09 パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレイテッド パ―ヒュ―シブクロマトグラフィ―
US5583162A (en) 1994-06-06 1996-12-10 Biopore Corporation Polymeric microbeads and method of preparation
US6841580B2 (en) * 2001-12-21 2005-01-11 Organo Corporation Organic porous material, process for manufacturing the same, and organic porous ion exchanger
WO2006065208A1 (en) 2004-12-14 2006-06-22 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of immunoglobulins
EP1974215B1 (en) 2006-01-06 2017-12-27 EMD Millipore Corporation Affinity chromatography matrices and methods of making and using the same
JP5083934B2 (ja) * 2006-06-08 2012-11-28 株式会社リバース・プロテオミクス研究所 アフィニティ担体及びその製造方法
JP5626526B2 (ja) * 2008-09-25 2014-11-19 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
SG10201502260XA (en) * 2010-03-24 2015-05-28 Jsr Corp Filler for affinity chromatography and method for isolating immunoglobulin
JP5998050B2 (ja) * 2010-03-31 2016-09-28 Jsr株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
JP5354094B2 (ja) * 2010-03-31 2013-11-27 Ｊｓｒ株式会社 アフィニティークロマトグラフィー用充填剤
CN103270044B (zh) * 2010-12-21 2016-03-09 Jsr株式会社 亲和色谱用载体和分离免疫球蛋白的方法
JP2012141212A (ja) 2010-12-28 2012-07-26 Tosoh Corp 多孔質担体及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106459141B (zh) 2019-09-13
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KR20170020372A (ko) 2017-02-22

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