TWI682936B - 親和性層析用擔體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種抑制了雜質之非特異吸附、且抑制了因長期保存造成之動態結合容量下降之保存安定性優異之親和性層析用擔體。
本發明之親和性層析用擔體之特徵係包含固相擔體、使環氧基開環所得之開環環氧基、及結合於前述固相擔體之配位子之親和性層析用擔體，該固相擔體含有包含(M-1)及(M-2)之構造單位之共聚物：(M-1)源自含有環氧基之單乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位含超過20質量份且99.5質量份以下，及(M-2)源自聚乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位含0.5~80質量份，於將前述親和性層析用擔體填充於任意之管柱容器中，以含有2M NaCl之pH7.5之20mM磷酸鈉緩衝液置換管柱，且在40℃靜置7天時之管柱內之pH上升幅度為2以下。

Description

親和性層析用擔體
本發明係關於親和性層析用擔體。尤其關於可使用於抗體等之蛋白質純化之親和性層析用擔體。
親和性層析用擔體在包含單株抗體之蛋白質之研究、開發及製造中扮演重要角色。親合性層析用擔體一般包含具有與標的物質選擇性結合之配位子之固相擔體。親和性層析用擔體由於固相擔體上之配位子對標的物質具有高的選擇性，故相較於離子層析、凝膠過濾層析、逆相液體層析等其他層析，可以較優異之收率且高速地經濟上純化。
一般，蛋白質純化用之親合性層析所要求之性能列舉為(1)不會非特異吸附標的蛋白質以外之雜質，(2)不因長時間保管而使結合容量降低，保存安定性優異，及(3)管柱操作上具有充分之機械強度等。
其中，作為親合性層析用擔體之固相擔體，已提案有瓊脂糖(agarose)粒子(專利文獻1、2)、由苯乙烯-二乙烯基苯之共聚物所成之多孔質粒子(專利文獻3、 4)、由甲基丙烯酸酯系乙烯基單體之聚合物所成之多孔質粒子(專利文獻5、6)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2008-523140號公報
[專利文獻2]日本特表2009-522580號公報
[專利文獻3]日本特開平08-278299號公報
[專利文獻4]日本特表平10-501173號公報
[專利文獻5]國際公開第2011/125674號公報
[專利文獻6]日本特開2012-141212號公報
然而，瓊脂糖粒子一般由於彈性率低，而有於介質以高速流動時管柱之壓力變高之缺點。且，瓊脂糖粒子由於一般係由天然海草經過冗長複雜之步驟而製造，故難以獲得一定品質者。
且，由如苯乙烯-二乙烯基苯之芳香族乙烯基單體之共聚物所成之多孔質粒子一般雖耐鹼性優異，但親水性低，故配位子之活性較低，而有對標的物質之動態結合容量較低之缺點。
再者，由甲基丙烯酸酯系乙烯基單體之聚合物所成之多孔質粒子雖具有高的親水性與機械強度，但關於雜質之 去除能期望進一步改善。
本發明所解決之課題係提供一種抑制了雜質 之非特異性吸附，且抑制了因長期保存造成之動態結合容量下降之保存安定性優異之親和性層析用擔體。
本發明人積極檢討之結果，發現具有含有各以特定量含有源自含環氧基之單乙烯基單體之構造單位與源自聚乙烯基單體之構造單位之共聚物之固相擔體、與前述固相擔體結合之配位子、及開環環氧基之特定親合性層析用擔體與標的物質之動態結合容量高，且雜質之去除能及保存安定性優異，因而完成本發明。
亦即，本發明提供<1>一種親和性層析用擔體，其特徵係包含固相擔體、使環氧基開環所得之開環環氧基、及結合於前述固相擔體之配位子之親和性層析用擔體，該固相擔體含有包含(M-1)及(M-2)之構造單位之共聚物：(M-1)源自含有環氧基之單乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位含超過20質量份且99.5質量份以下，及(M-2)源自聚乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位含0.5~80質量份，於將前述親和性層析用擔體填充於任意之管柱容器中，以包含2M NaCl之pH7.5之20mM磷酸鈉緩衝液置換 管柱，且在40℃靜置7天時之管柱內之pH上升幅度為2以下。
此外，本發明提供<2>一種親和性層析管柱，其係將上述<1>之親和性層析用擔體填充於管柱容器中而成。
另外，本發明提供<3>一種標的物質之純化方法，其特徵係使用上述<1>之親和性層析用擔體。
本發明之親和性層析用擔體之表面上的環氧基殘留量被減低，且具備因開環環氧基所致之高的親水性。
因此，依據本發明之親和性層析用擔體，可改善非特異性吸附之雜質，例如宿主細胞蛋白質(HCP=Host Cell Protein)或DNA之去除能。
此外，由於可高度保有配位子之活性，故例如在免疫球蛋白(immunoglobulin)之純化中使用本發明之親和性層析用擔體後，即使更長時間重複使用，免疫球蛋白等之動態結合容量仍不易下降，而可低成本地進行免疫球蛋白之純化。
以下，針對本發明之親和性層析用擔體詳細說明。
[親和性層析用擔體] <固相擔體之構成>
構成本發明之親和性層析用擔體之固相擔體含有包含(M-1)及(M-2)之共聚物：(M-1)源自含有環氧基之單乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位含超過20質量份且99.5質量份以下，及(M-2)源自聚乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位含0.5~80質量份
且，包含使環氧基開環而得之開環環氧基者。固相擔體之形態可為單塊體(monolith)、膜、中空纖維、粒子、匣、粒片等之任一種，但以粒子較佳。此外，基於表面積提高之觀點，固相擔體較好為多孔質粒子等之經多孔質化者。且，多孔質粒子較好為多孔質聚合物粒子。又，固相擔體除上述共聚物外，亦包含天然高分子或合成高分子等。
((M-1)源自含有環氧基之單乙烯基單體之構造單位)
含有環氧基之單乙烯基單體為1分子中具有1個聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵之基)、與1個以上環氧基之單體。含有環氧基之乙烯基單體可利用於用以將適當量之環氧基導入固相擔體中，獲得適當之配位子結合量、或開環環氧基量。
含有環氧基之單乙烯基單體列舉為例如(甲基) 丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚、(甲基)丙烯酸3,4-環氧基環己基甲酯、α-(甲基)丙烯基-ω-縮水甘油基聚乙二醇等非含羥基之(甲基)丙烯酸酯類；丙三醇單(甲基)丙烯酸酯縮水甘油醚等含羥基之(甲基)丙烯酸酯類；乙烯基苄基縮水甘油醚等等芳香族單乙烯基化合物，此外列舉為烯丙基縮水甘油醚、3,4-環氧基-1-丁烯、3,4-環氧基-3-甲基-1-丁烯等。可單獨使用該等中之1種，亦可組合2種以上使用。
該等中，作為含環氧基之單乙烯基單體，基於防污性或保存安定性等之觀點，較好為含環氧基之(甲基)丙烯酸酯類、含環氧基之芳香族單乙烯基化合物，更好為含環氧基之(甲基)丙烯酸酯類，又更好為(甲基)丙烯酸縮水甘油酯、(甲基)丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚，最好為(甲基)丙烯酸縮水甘油酯。又，藉由順相懸浮聚合使固相擔體成為粒子狀時，作為含環氧基之單乙烯基單體，基於開環環氧基量之控制容易而言較好為水不溶性者。此處所謂水不溶性係指相對於水100mL在室溫(25℃)下無法溶解10g以上。又，含環氧基之單乙烯基單體可使用市售品，亦可根據習知方法合成而使用。
源自含環氧基之單乙烯基單體之構造單位之 含量相對於全部構造單位為超過20質量份且99.5質量份以下。該含量為20質量份以下時，會使開環環氧基之量減少，使配位子結合後之親和性層析用擔體之親水性降 低，使雜質之去除能降低。另一方面，超過99.5質量份時，會使機械強度降低，無法耐受作為親和性層析用擔體之作業。
源自含環氧基之單乙烯基單體之構造單位之含量，基於防污性或保存安定性之觀點，相對於全部構造單位較好為25質量份以上，更好為30質量份以上，又更好為40質量份以上，最好為50質量份以上，且，基於防污性或保存安定性等之觀點，相對於全部構造單位較好為95質量份以下，更好為90質量份以下，又更好為85質量份以下，最好為80質量份以下。
((M-2)源自聚乙烯基單體之構造單位)
聚乙烯基單體為1分子中具有2個以上之聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵之基)之乙烯基單體。以下，將該聚乙烯基單體分成非含羥基之聚乙烯基單體與含羥基之聚乙烯基單體加以說明。又，聚乙烯基單體可單獨使用1種或組合2種以上使用。
非含羥基之聚乙烯基單體列舉為例如乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四乙二醇二(甲基)丙烯酸酯、丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、二丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、三丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、四丙二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,4-丁二醇二(甲基)丙烯酸酯、1,6-己二醇二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯 酸酯之(甲基)丙烯酸酯類；二乙烯基苯、三乙烯基苯等之芳香族聚乙烯基化合物；丁二烯、異氰尿酸二烯丙酯、異氰尿酸三烯丙酯等烯丙基化合物等，可單獨使用1種或組合2種以上使用。該等中，非含羥基之聚乙烯基單體較好為(甲基)丙烯酸酯類、芳香族聚乙烯基化合物。
且，上述非含羥基之聚乙烯基單體所含聚合性乙烯基之個數於1分子中較好為2~5個，更好為2或3個。
作為含羥基之聚乙烯基單體較好為多元醇之(甲基)丙烯酸酯類、各種糖類之2取代以上之(甲基)丙烯酸酯類、多元醇之(甲基)丙烯醯胺類。
多元醇之(甲基)丙烯酸酯類列舉為丙三醇二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷二(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷二(甲基)丙烯酸酯、丁烷三醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇二(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇三(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、肌醇(inositol)二(甲基)丙烯酸酯、肌醇三(甲基)丙烯酸酯、肌醇四(甲基)丙烯酸酯等。
各種糖類之2取代以上之(甲基)丙烯酸酯類列舉為例如葡萄糖二(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖三(甲基)丙烯酸酯、葡萄糖四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇二(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇三(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇四(甲基)丙烯酸酯、甘露糖醇五(甲基)丙烯酸酯等。
此外，含羥基之聚乙烯基單體除上述例示者以外，亦 可列舉為二胺基丙醇、三羥基甲基胺基甲烷、葡萄糖胺等之胺基醇與(甲基)丙烯酸之脫水縮合反應物等。
又，上述含羥基之聚乙烯基單體中所含之聚合性乙烯基之個數為1分子中較好為2~5個，更好為2或3個。
該等中，作為聚乙烯基單體，基於較少量使 用即可獲得良好的多孔性與機械強度，對於含環氧基之單乙烯基單體之使用量之限制較少等之觀點，較好為非含羥基之聚乙烯基單體。非含羥基之聚乙烯基單體中，基於防污性或保存安定性等之觀點，最好為聚合性乙烯基之個數為3個之(甲基)丙烯酸酯類、聚合性乙烯基之個數為2或3個之芳香族聚乙烯基化合物。最適合之具體例列舉為三羥甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯、三乙烯基苯。
源自聚乙烯基單體之構造單位之含量相對於 全部構造單為0.5~80質量份。源自聚乙烯基單體之構造單位之含量未達0.5質量份時，固相擔體之機械強度低，無法耐受作為親和性層析用擔體之作業。又，超過80質量份時，親水性低，無法獲得HCP之減低效果，且配位子之活性降低。
源自聚乙烯基單體之構造單位之含量基於防污性或保存安定性等之觀點，相對於全部構造單位較好為5質量份以上，更好為10質量份以上，又更好為15質量份以上，再更好為20質量份以上，最好為25質量份以上，且，基於防污性或保存安定性等之觀點，相對於全部構造單位較 好為70質量份以下，更好為65質量份以下，又更好為60質量份以下，再更好為50質量份以下，最好為40質量份以下。
((M-3)源自不含環氧基之單乙烯基單體之構造單位)
本發明中使用之固相擔體所含之共聚物除上述構造單位(M-1)及構造單位(M-2)以外，較好進一步含有(M-3)源自不含環氧基之單乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位為40質量份以下者。
不含環氧基之單乙烯基單體為1分子中具有1個聚合性乙烯基(具有乙烯性不飽和鍵之基)，且不含環氧基之乙烯基單體。以下，將不含環氧基之單乙烯基單體分成不含環氧基之非含羥基之單乙烯基單體、不含環氧基之含羥基之單乙烯基單體加以說明。
作為不含環氧基之非含羥基之單乙烯基單體，基於防止純化時之雜質之非特異性吸附之觀點，較好為非離子性單體。該非離子性單體列舉為例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸環己酯、(甲基)丙烯酸甲氧基乙酯等(甲基)丙烯酸酯類；(甲基)丙烯醯胺、二甲基(甲基)丙烯醯胺、(甲基)丙烯醯基嗎啉、二丙酮(甲基)丙烯醯胺等(甲基)丙烯醯胺類，可單獨使用1種或組合2種以上使用。又，作為分離子性單體，亦可使用如(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯之疏水性(甲基)丙烯酸酯類；如苯乙烯、α- 甲基苯乙烯、乙基乙烯基苯之芳香族乙烯基化合物，但基於抑制純化時之雜質之非特異性吸附之觀點，較好不為該等單體，而為上述例示之單體中，具有碳數5以下之烷基或烷氧基烷基之(甲基)丙烯酸烷酯類或上述之(甲基)丙烯醯胺類。
不含環氧基之含羥基之單乙烯基單體列舉為 例如丙三醇單(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基乙烷單(甲基)丙烯酸酯、三羥甲基丙烷單(甲基)丙烯酸酯、丁三醇單(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇單(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇單(甲基)丙烯酸酯、肌醇單(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙酯、(甲基)丙烯酸羥基丙酯、聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等(甲基)丙烯酸酯類；羥基乙基(甲基)丙烯醯胺等(甲基)丙烯醯胺類等，可單獨使用1種或組合2種以上使用。
此外，不含環氧基之含羥基之單乙烯基單體中所含羥基之個數為1分子中較好1~5個，更好1~3個。
該等中，作為不含環氧基之單乙烯基單體，基於防污性等之觀點，較好為不含環氧基之含羥基之單乙烯基單體，更好為丙三醇單(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸羥基乙酯、(甲基)丙烯酸羥基丙酯、羥基乙基(甲基)丙烯醯胺，又更好為丙三醇單(甲基)丙烯酸酯、羥基乙基(甲基)丙烯醯胺，最好為羥基乙基(甲基)丙烯醯胺。
源自不含環氧基之單乙烯基單體之構造單位之含量相對於全部構造單位較好為40質量份以下。藉由 使該含量為40質量份以下，於含羥基之單乙烯基單體之情況，能提高多孔質粒子之親水性，抑制凝聚，提高配位子之活性且改善標的物質之動態結合量。且，亦改善機械強度。上述構造單位之含量相對於全部構造單位，更好為35質量份以下，又更好為30質量份以下，再更好為25質量份以下，最好為20質量份以下。且，源自不含環氧基之單乙烯基單體之構造單位之含量亦可為0質量份。含有該構造單為時，相對於全部構造單位較好為5質量份以上。
上述構造單位(M-1)~(M-3)之含量之較佳組合 為構造單位(M-1)：相對於全部構造單位為40~90質量份，構造單位(M-2)：相對於全部構造單位為10~60質量份，構造單位(M-3)：相對於全部構造單位為0~25質量份，更好之組合為構造單位(M-1)：相對於全部構造單位為40~80質量份，構造單位(M-2)：相對於全部構造單位為15~60質量份，構造單位(M-3)：相對於全部構造單位為0~25質量份，最好之組合為構造單位(M-1)：相對於全部構造單位為40~80質量份，構造單位(M-2)：相對於全部構造單位為20~60質量份，構造單位(M-3)：相對於全部構造單位為0~20質量份。
(環氧基含量)
配位子結合前之固相擔體中所含環氧基為用以結合配位子之官能基，且再經開環後成為親和性層析用擔體之提 高親水性根源的官能基。配位子結合前之固相擔體之環氧基含量較好為1~6mmol/g，更好為2~5mmol/g，最好為2.5~4mmol/g。配位子結合前之固相擔體之環氧基含量為1mmol/g以上時，配位子結合後獲得之開環環氧基之量成為適當量，而提高標的物質以外之雜質之去除能。配位子結合前之固相擔體之環氧基含量為6mmol/g以下時，配位子結合後之環氧基之殘留量減少，抑制了作為親和性層析用擔體保存時之配位子之活性降低，且亦抑制了重複使用時之標的物質之動態結合容量之降低。
配位子結合前之固相擔體之環氧基含量可藉由含環氧基之單乙烯基單體之量、聚合溫度、聚合時間、聚合液之pH、以及聚合後之開環處理等加以調整。
<固相擔體之製造>
固相單體之製造法舉例固相擔體為多孔質粒子之情況為例加以說明。
多孔質粒子可藉由習知之晶種聚合、懸浮聚合等製造。晶種聚合法列舉為日本特公昭57-24369號公報記載之二段膨脹聚合法。聚合時，除上述單體外，可視需要使用聚合起始劑、多孔化劑、水系介質、分散安定劑、界面活性劑、聚合調整劑、聚合抑制劑、晶種粒子等。
多孔質粒子之製造中之較佳聚合法為以單體混合物、多孔化劑為必要成分之水系混合物之懸浮聚合法。
又，懸浮聚合之具體方法列舉為例如使聚合 起始劑溶解於包含單體混合物及多孔化劑之混合溶液(單體溶液)中，且懸浮於水系介質中加熱至特定溫度進行聚合之方法，或使聚合起始劑溶解於包含單體混合物及多孔化劑之混合溶液(單體溶液)中，且添加於加熱至特定溫度之水系介質中進行聚合之方法，使包含單體混合物及多孔化劑之混合溶液(單體溶液)懸浮於水系介質中且加熱至特定溫度，並添加聚合起始劑進行聚合之方法等。
聚合起始劑較好為自由基聚合起始劑。自由 基聚合起始劑列舉為例如偶氮系起始劑、過氧化物系起始劑、氧化還原系起始劑等，具體而言列舉為偶氮雙異丁腈、偶氮雙異丁酸甲酯、偶氮雙-2,4-二甲基戊腈、過氧化苯甲醯、過氧化二第三丁基、過氧化苯甲醯基-二甲基苯胺等。聚合起始劑之合計使用量相對於單體總量100質量份通常為0.01~10質量份左右。
上述多孔化劑係為了製造多孔質粒子而使 用，在油滴內聚合中，與單體一起存在，作為非聚合成分具有形成孔之角色。多孔化劑只要為於多孔質表面可容易去除者即無特別限制，列舉為例如可溶於各種有機溶劑或單體混合物中之線狀聚合物等，亦可併用該等。
上述多孔化劑列舉為例如己烷、庚烷、辛 烷、壬烷、癸烷、十一碳烷等脂肪族烴類；環己烷、環戊烷等脂環式烴類；苯、甲苯、二甲苯、萘、乙基苯等芳香族烴類、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、四氯乙烷、氯苯等鹵 化烴類；丁醇、戊醇、己醇、庚醇、己醇、4-甲基-2-戊醇、2-乙基-1-己醇等脂肪族醇類；環己醇等脂環式醇類；2-苯基乙基醇、苄基醇等芳香族醇類；二乙基酮、甲基異丁基酮、二異丁基酮、苯乙酮、2-辛酮、環己酮等酮類；二丁基醚、二異丁基醚、苯甲醚、乙氧基苯等醚類；乙酸異戊酯、乙酸丁酯、乙酸-3-甲氧基丁酯、丙二酸二乙酯等酯類，以及非交聯性乙烯基單體之均聚物等線狀聚合物。多孔化劑可單獨使用或混合2種以上使用。
上述多孔化劑之合計使用量通常相對於單體總量100質量份為40~400質量份左右。
上述水系介質列舉為例如水溶性高分子水溶 液等，水溶性高分子列舉為例如羥基乙基纖維素、聚乙烯醇、羧基甲基纖維素、聚乙烯基吡咯啶酮、澱粉、明膠等。水系介質之合計使用量相對於單體總量100質量份，通常為200~7000質量份左右。
且，使用水作為水系介質之分散介質時，亦 可使用例如氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣等分散安定劑。
又，亦可使用以烷基硫酸酯鹽、烷基芳基硫 酸酯鹽、烷基磷酸酯鹽、脂肪酸鹽等之陰離子性界面活性劑為代表之各種界面活性劑。
另外，亦可使用亞硝酸鈉等亞硝酸鹽、碘化鉀等碘化物鹽、第三丁基兒茶酚、苯醌、苦味酸(picric acid)、氫醌、氯化銅、氯化鐵等聚合抑制劑。
且，亦可使用十二烷基硫醇等聚合調整劑。
另外，聚合溫度只要依聚聚合起始劑決定即可，例如使用偶氮雙異丁腈作為聚合起始劑時，較好為50~100℃，更好為60~90℃。
又，聚合時間通常為5分鐘~48小時，較好為10分鐘~24小時。
聚合完成後，較好使用水及/或熱水洗淨以去除附著於所得多孔質粒子上之水溶性高分子等。
且，使用晶種粒子及/或多孔化劑之良溶劑進行洗淨，就使後述之配位子之結合容易之觀點係較佳。作為洗淨溶劑可較好地使用丙酮、乙醇、異丙醇等。且，亦可視需要在洗淨前後，使用超音波分散機等分散多孔質粒子。再者，利用傾析、過濾、篩分級等方法，去除小粒子或粗大粒子，就壓力特性之提高或標的物質等之動態結合容量之提高方面而言係較佳。
<親和性層析用擔體之上述以外之構成> (開環環氧基)
本發明之親和性層析用擔體具有使環氧基開環而得之開環環氧基。該開環環氧基可在使配位子結合於含有上述共聚物之固相擔體後，使該共聚物中所含之環氧基，亦即與配位子結合之環氧基以外之剩餘環氧基開環而獲得。環氧基除上述共聚物中所含者以外，亦包含利用表氯醇或二縮水甘油醚化合物等隨後導入之環氧基，在本發明之親和 性層析用擔體之製造中之哪一階段導入均可。
接著，本發明之親和性層析用擔體係使固相 擔體表面之大部分環氧基開環，使親和性層析用擔體與高濃度之氯化物離子接觸，使剩餘之環氧基開環時釋出之氫氧化物離子之量顯著減少。
因此，本發明之親和性層析用擔體係將親和性層析用擔體填充於任意之管柱容器中，以含有2M NaCl之pH7.5之20mM磷酸鈉緩衝液置換管柱，且在40℃靜置7天時之管柱內之pH上升幅度為2以下者。藉由該構成，而成為雜質之去除能與保存安定性優異者。上述pH之上升幅度較好為1.9以下，於進一步改善雜質之去除能時，更好為1.7以下。且，pH上升幅度之下限值並無特別限制，例如為0.01。
上述pH上升幅度具體而言為可自以下之式求 出者，更詳言之，可藉實施例所記載之方法測定。又，本發明中，pH上升幅度之測定係對新的親和性層析用擔體進行。新的親和性層析用擔體意指於之未使用過之狀態之擔體，例如若使用於抗體純化中，則係指使用於抗體純化之前之狀態。
(pH上升幅度)=(負荷pH)-(初期pH)
上述式中「初期pH」係使含2M NaCl之pH7.5之20mM磷酸鈉緩衝液通液於管柱中，於管柱內之pH達到平衡時之pH之值。
上述式中「負荷pH」意指測定初期pH後在40℃之 恆溫器內靜置7天後，使含2M NaCl之pH7.5之20mM磷酸鈉緩衝液再度通液於管柱中，在pH為最高時之pH之值。
又，作為使環氧基開環生成之開環環氧基， 基於防止雜質之非特異吸附，同時防止保存中之配位子之活性降低之觀點，較好為以下述式(1)表示之基。
Figure 104120750-A0202-12-0018-2
 [式(1)中，R1表示碳數1~6之2價有機基，R2表示氫原子或碳數1~10之1價有機基，X表示硫基(>S)、亞磺醯基(>S=O)、磺醯基(>S(=O)2)、亞胺基(>NH)、或氧基(>O)，*表示鍵結位置]。
R1表示碳數1~6之2價有機基。該有機基之碳數較好為1~4，更好為1或2。
且，上述2價有機基可為直鏈狀亦可為分支鏈狀。又，該2價有機基列舉為2價烴基、於2價烴基之碳-碳原子間具有選自醚鍵、亞胺基及酯鍵之1種以上之基，較好為2價烴基。
上述2價烴基較好為2價脂肪族烴基，更好為烷二 基。
烷二基之具體例列舉烷甲烷-1,1-二基、乙烷-1,1-二基、乙烷-1,2-二基、丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基、丁烷-1,4-二基、戊烷-1,5-二基、己烷-1,6-二基等。
R2表示氫原子或碳數1~10之1價有機基，較 好為碳數1~10之1價有機基。作為該有機基，基於結合配位子時之動態結合容量、防污性之觀點，較好為以下述式(2)或(3)表示之有機基，更好為以式(2)表示之有機基。
Figure 104120750-A0202-12-0019-3
 [式(2)中，R3表示碳數1~10之2價或3價有機基，n表示1或2，**表示與式(1)中X之結合位置]。
Figure 104120750-A0202-12-0019-4
 [式(3)中， R4表示碳數1~10之2價或3價有機基，Y表示酸性基或胺基，m表示1或2，**表示與式(1)中X之結合位置]。
式(2)中之R3、式(3)中之R4所表示之2價或3價有機基之碳數，基於結合配位子時之動態結合容量等之觀點，較好為1~8，更好為1~6，又更好為2~4。
此外，上述2價有機基列舉為2價烴基，可為直鏈狀亦可為分支鏈狀。上述2價烴基較好為2價之脂肪族烴基，更好為烷二基。該烷二基之碳數，基於結合配位子時之動態結合容量等之觀點，較好為1~8，更好為1~6，又更好為2~4。
上述烷二基之具體例列舉為甲烷-1,1-二基、乙烷-1,1-二基、乙烷-1,2-二基、丙烷-1,1-二基、丙烷-1,2-二基、丙烷-1,3-二基、丙烷-2,2-二基等。
且，上述3價有機基列舉為3價烴基，可為直鏈狀亦可為分支鏈狀。上述3價烴基較好為3價之脂肪族烴基，更好為烷三基。該烷三基之碳數，基於結合配位子時之動態結合容量、防污性之觀點，較好為1~8，更好為1~6，又更好為2~4。
上述烷三基之具體例列舉為甲烷-1,1,1-三基、乙烷-1,1,2-三基、丙烷-1,2,3-三基、丙烷-1,2,2-三基等。
式(2)中，n表示1或2，較好為2。
式(3)中，Y表示酸性基或胺基，但以酸性基較佳。酸性基列舉為羧基、磷酸基、磺基、該等之鹽等。又，鹽列舉為鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等鹼土類金屬鹽；銨鹽；有機銨鹽等。
式(3)中，m表示1或2，較好為1。
X係表示硫基(>S)、亞磺醯基(>S=O)、磺醯基(>S(=O)2)、亞胺基(>NH)、或氧基(>O)，但以硫基(>S)、亞磺醯基(>S=O)、氧基(>O)較佳，更好為硫基(>S)、亞磺醯基(>S=O)，最好為亞磺醯基(>S=O)。
固相擔體中之環氧基之開環方法可列舉為例如在水溶劑中，於酸或鹼存在下攪拌之方法。攪拌可加熱進行，亦可在室溫下進行。
且，亦可使用巰基乙醇、硫代丙三醇、巰基乙酸或其鹽、巰基琥珀酸或其鹽、巰基乙烷磺酸或其鹽、巰基丙烷磺酸或其鹽等具有親水基之硫醇化合物；單乙醇胺、葡萄糖胺等具有親水性基之胺化合物；二乙二醇、丙三醇等多元醇類作為使環氧基經開環之保護劑。又，此處所謂親水性基列舉為羥基；胺基；羧基、磷酸基、磺基、該等之鹽等酸性基等。鹽列舉為鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鎂鹽、鈣鹽等鹼土類金屬鹽；銨鹽；有機銨鹽等。
上述酸或鹼、保護劑之使用量相對於剩餘之環氧基1莫耳，通常為0.1~40莫耳當量。剩餘之環氧基由於與配位子多點結合，在保存中使配位子之活性降低，故以2~40莫耳當量之過量進行保護。
此外，開環反應之反應時間並無特別限制， 但通常為0.5~72小時左右，較好為1~48小時。又，反應溫度只要在溶劑之沸點以下適當選擇即可，但通常為2~100℃左右。
且，亦可視需要在鹼性觸媒存在下進行保護。該鹼性觸媒列舉為三乙胺、N,N-二甲基-4-胺基吡啶、二異丙基乙胺等，可單獨使用1種或組合2種以上使用。
較佳之開環環氧基為以巰基化合物及/或多元 醇類使固相擔體中所含之環氧基開環獲得之開環環氧基，由於非特異吸附比利用具有胺基之保護劑之開環基少，故具有動態結合量變高之優點。
此外，使用巰基化合物作為保護劑時，可使用氧化劑使硫基氧化成亞磺醯基，可進一步提高親水性。
上述氧化劑大致分成有機氧化劑與無機氧化 劑，有機氧化劑列舉為例如過乙酸、過苯甲酸、偏氯過苯甲酸等。另一方面，無機氧化劑列舉為例如過氧化氫、鉻酸、過錳酸鹽等。又，該等氧化劑可單獨使用1種或組合2種以上使用。
且，氧化劑之合計使用量相對於硫基1莫耳，通常為0.1~10莫耳當量左右，較好為0.5~3莫耳當量。
又，上述氧化反應較好在溶劑存在下進行。 該溶劑列舉為水；二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺等醯胺系溶劑；甲醇、乙醇等醇系溶劑等，該等溶劑可單獨使用1種或組合2種以上使用。
上述溶劑之合計使用量相對於原料之固相擔體，通常為1~50質量倍左右，較好為5~15質量倍左右。
且，上述氧化反應之反應時間並無特別限 制，通常為1~72小時左右，反應溫度只要在溶劑之沸點以下適當選擇即可，但通常為1~90℃左右。
(配位子)
本發明之親和性層析用擔體為包含結合於固相擔體上之配位子者。
配位子只要是對標的物質具有適度親和性者即可，其種類並無特別限制，但可使用例如蛋白質A、蛋白質G、蛋白質F、Fc結合之蛋白質、抗生物素蛋白(avidin)等蛋白質；胰島素等胜肽；單株抗體等之抗體；酵素；賀爾蒙；DNA；RNA；肝素(heparin)、路易斯X(Lewis X)、神經節糖苷(ganglioside)等之糖質；亞胺基二乙酸、合成色素、2-胺基苯基硼酸、4-胺基苯甲脒、穀胱甘肽(glutathione)、生物素(biotin)或其衍生物之低分子化合物。上述例示之配位子可使用其全體，亦可使用藉由重組、酵素處理等獲得之片段。此外，亦可為人工合成之胜肽或胜肽衍生物。
上述配位子中，免疫球蛋白之分離或純化中 較佳之配位子列舉為免疫球蛋白結合性蛋白質。
免疫球蛋白結合性蛋白質較好為由蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、Fc結合之蛋白質及該等之功能性變異體所 組成之群選出之至少1種以上。其中，較好為蛋白質A、蛋白質G、該等之功能性變異體，更好為蛋白質A、其功能性變異體。
又，本發明中，所謂「蛋白質」係指具有胜 肽構造單位之所有分子，為例如包含人為改變天然型蛋白質之部分片段或天然型蛋白質之胺基酸序列之變異體之概念。此外，所謂「免疫球蛋白結合區(domain)」表示單獨即具有免疫球蛋白結合活性之聚胜肽之功能單位，所謂「免疫球蛋白結合性蛋白質」表示免疫球蛋白上具有特殊之親和性，且包含「免疫球蛋白結合區」之蛋白質。所謂「免疫球蛋白結合」係表示免疫球蛋白分子之互補性決定區域(CDR)以外之區域，尤其是鍵結於Fc片段。本發明中，與親和性層析關連使用之用語「配位子」係表示與親和性層析之標的物質結合之分子。
上述配位子與固相擔體之結合方法於利用固 相擔體中所含環氧基作為直接與配位子之結合部位時作為製程較簡易而較佳。此外，以對甲苯磺醯基等使固相擔體中所含環氧基開環而生成之醇性羥基活性化後，結合配位子之方法，或亦可使固相擔體中所含環氧基或由該環氧基之開環生成之基進一步伸展連結基後，透過該連結基使配位子結合於固相擔體。連結基較好為二縮水甘油氧基烷、聚烷二醇二縮水甘油醚等二縮水甘油醚化合物。
配位子之結合條件隨配位子結合前之固相擔 體之環氧基含量、配位子之種類而不同，可採用本技藝者 習知之方法。配位子為蛋白質時，蛋白質之N末端之胺基、蛋白質所含之離胺酸、半胱胺酸成為與環氧基之反應點。結合蛋白質時，可使用例如蛋白質之等電點附近之緩衝類之水溶液，視需要添加氯化鈉或硫酸鈉等之鹽，邊混合蛋白質與固相擔體，邊在0~40℃反應1~48小時，可結合配位子的蛋白質。
配位子之結合量係依據配位子之種類、標的 物質之種類等適當調節，但以如蛋白質A之免疫球蛋白結合性蛋白質作為配位子而結合時，固相擔體每1g較好為10~200mg，更好為25~100mg。以如蛋白質A之免疫球蛋白結合性蛋白質作為配位子結合時，固相擔體每1g之配位子之結合量為10mg以上時成為動態結合容量優異者，為200mg以下時，用於結合之抗體之溶出而使用之溶出液之量成為特別適當之量。
(粒徑、比表面積)
構成本發明之親和性層析用擔體之固相擔體為多孔質粒子時，上述多孔質粒子之粒徑通常為35~100μm，較好為40~85μm。粒徑為35μm以上時，壓力特性優異。為100μm以下時，獲得動態結合容量高之填充劑。
多孔質粒子之粒徑可藉聚合時之條件進行調整。又，本發明中所謂「粒徑」意指以雷射繞射散亂式粒度分佈測定裝置(Beckman Coulter公司製之LS13 320)獲得之體積平均粒徑。
構成本發明之親和性層析用擔體之固相擔體 為多孔質粒子時，上述多孔質粒子之比表面積在測定相當於孔徑10~5000nm之範圍之孔洞時，以孔洞尺寸10nm~5000nm之比表面積計，較好為70m2/g以上，更好為90m2/g以上。比表面積在上述範圍內時，獲得標的物質之動態結合容量高之親和性層析用擔體。又，本發明中之「比表面積」係以水銀孔隙計(島津製作所股份有限公司製之Autopore IV9520)獲得之細孔徑10~5000nm之細孔所具有之表面積除以粒子之乾燥質量之值。
本發明之親和性層析用擔體之雜質去除能 高，且保存安定性優異，對於抗體等之蛋白質之純化特別有用。
[親和性層析管柱]
本發明之親和性層析管柱為將本發明之親和性層析用擔體填充於管柱容器中而成者。
[標的物質之純化方法]
本發明之標的物質之純化方法之特徵為使用本發明之親和性層析用擔體者。
純化係除了使用本發明之親和性層析用擔體以外，與常用方法相同，列舉為例如準備含標的物質之組成物之準備步驟，使前述組成物通液至本發明之層析管柱中之通液步驟，與使藉該通液步驟而吸附於擔體上之標的物質溶出 之溶出步驟之方法。
本發明之純化方法適於蛋白質之純化，尤其適於免疫球蛋白之純化。
[實施例]
以下，列舉實施例詳細說明本發明，但本發明並不受限於該等實施例。
(實施例1)
(1)將聚乙烯醇(KURARAY公司製，PVA-217)3.58g添加於360g純水中，加熱攪拌使聚乙烯醇溶解，冷卻後添加十二烷基硫酸鈉(和光純藥工業製)0.36g、硫酸鈉(和光純藥工業製)0.36g、亞硝酸鈉(和光純藥工業製)0.18g，經攪拌調製水溶液S。
另一方面，將由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱縲縈公司製)12.00g及二乙烯基苯(新日鐵化學公司製)1.33g所成之單體組成物溶解於二異丁基酮(三井化學公司製)24.43g中，調製單體溶液。
接著，將前述水溶液S全量投入500mL可分離燒瓶內，且安裝溫度計、攪拌翼及冷卻管，設定於溫水浴中，在氮氣氛圍下開始攪拌。將前述單體溶液全量投入可分離燒瓶內，以溫水浴加溫使內溫到達85℃後添加2,2’-偶氮異丁腈(和光純藥工業公司製)0.53g，使溫度維持在86℃。
(2)隨後，使溫度維持在86℃進行攪拌3小時。接著，使反應液冷卻後，過濾該反應液，以純水與乙醇洗淨。洗淨之粒子分散於純水中進行傾析3次，去除小粒子。接著，以使粒子之濃度成為10質量%之方式使粒子分散於純水中，獲得多孔質粒子分散液。
(3)將改質蛋白質A(Repligen製之rSPA)0.15g分散於1.2M硫酸鈉/0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)40mL中，獲得蛋白質A分散液，將實施例1之步驟(2)中獲得之多孔質粒子分散液(以粒子乾燥質量換算相當於1g)添加於該蛋白質A分散液中。使該分散液在25℃振盪5小時予以攪拌，使蛋白質A固定於粒子上。
(4)以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)洗淨生成之蛋白質A固定粒子後，分散於1.0M硫酸水溶液(和光純藥工業公司製)40mL中，在40℃振盪4小時予以攪拌，使未反應之環氧基開環。
隨後，以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)洗淨，獲得親和性層析用填充劑1。
(實施例2)
實施例1之步驟(1)中，除使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱縲縈公司製)9.20g、1-乙基-4-乙烯基苯(ChemSampCo公司製)0.58g及二乙烯基苯(新日鐵化學公司製)1.73g所成之單體組成物溶解於二異丁基酮(三井化 學公司製)19.59g及苯甲醚(和光純藥工業公司製)6.05g之混合液中，調製單體溶液以外，餘進行與實施例1之步驟(1)及(2)相同之操作，獲得多孔質粒子分散液。
隨後，以與實施例1之步驟(3)相同之操作固定蛋白質A，生成蛋白質A固定粒子。
接著，使生成之蛋白質A固定粒子分散於1.0M之2-巰基乙醇(和光純藥工業公司製)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃振盪17小時予以攪拌，使未反應之環氧基開環。進而，使所得未反應之環氧基開環而成之蛋白質A固定粒子以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)予以洗淨，獲得親和性層析用填充劑2。
(實施例3)
實施例1之步驟(1)中，除使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱縲縈公司製)8.18g、N-(2-羥基乙基)丙烯醯胺(東京化成工業公司製)1.36g及三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SATOMER公司製)4.09g所成之單體組成物溶解於4-甲基-2-戊醇(和光純藥工業製)21.97g及碳酸二乙酯(和光純藥工業製)2.95g之混合液中，調製單體溶液以外，餘進行與實施例1之步驟(1)及(2)相同之操作，獲得多孔質粒子分散液。
隨後，以與實施例1之步驟(3)相同之操作固定蛋白質A，生成蛋白質A固定粒子。
接著，使生成之蛋白質A固定粒子(PA-1)分散於1.0M之1-硫代丙三醇(旭化學工業公司製)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃振盪17小時予以攪拌，使未反應之環氧基開環。隨後，使所得未反應之環氧基開環而成之蛋白質A固定粒子(PA-2)以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)予以洗淨，獲得親和性層析用填充劑3。
(實施例4)
以使粒子之濃度成為10質量%之方式將與實施例3相同之操作獲得之使未反應之環氧基開環而成之蛋白質A固定粒子(PA-2)分散於純水中。於其中添加30%過氧化氫0.48g，在25℃振盪24小時予以攪拌。隨後，以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)洗淨，獲得親和性層析用填充劑4。
(實施例5)
使與實施例3相同之操作生成之蛋白質A固定粒子(PA-1)分散於1.0M之1-硫代丙三醇/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃振盪40小時予以攪拌，使未反應之環氧基開環。進而，使所得未反應之環氧基開環而成之蛋白質A固定粒子以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)予以洗淨，獲得親和性層析用填充劑5。
(實施例6)
實施例1之步驟(1)中，除使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱縲縈公司製)5.26g、丙三醇單甲基丙烯酸酯(日油公司製)2.63g及二乙烯基苯(新日鐵化學公司製)2.63g所成之單體組成物溶解於2-辛酮(東洋合成公司製)25.00g中，調製單體溶液以外，餘進行與實施例1之步驟(1)及(2)相同之操作，獲得多孔質粒子分散液。
隨後，以與實施例1之步驟(3)相同之操作固定蛋白質A，生成蛋白質A固定粒子。
接著，使生成之蛋白質A固定粒子分散於1.0M之2-巰基丙烷磺酸鈉(東京化成工業公司製)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃振盪17小時予以攪拌，使未反應之環氧基開環。進而，使所得未反應之環氧基開環而成之蛋白質A固定粒子以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)予以洗淨，獲得親和性層析用填充劑6。
(實施例7)
實施例1之步驟(1)中，除使由丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚(日本化成公司製)4.77g及丙三醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學工業公司製)8.86g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製造所公司製)21.52g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.35g之混合液中，調製單體溶液以外，餘 進行與實施例1之步驟(1)及(2)相同之操作，獲得多孔質粒子分散液。
隨後，以與實施例3相同之操作，實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得親和性層析用填充劑7。
(實施例8)
實施例1之步驟(1)中，除使由乙烯基苯縮水甘油醚(TORAY精密化學公司製)3.43g、丙三醇單甲基丙烯酸酯(日油公司製)4.11g及乙二醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學工業公司製)6.17g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製造所公司製)21.52g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.35g之混合液中，調製單體溶液以外，餘進行與實施例1之步驟(1)及(2)相同之操作，獲得多孔質粒子分散液。
隨後，以與實施例3相同之操作，實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得親和性層析用填充劑8。
(比較例1)
實施例3中，除了在蛋白質A固定後未進行未反應之環氧基之開環以外，餘以與實施例3相同之操作，獲得親和性層析用填充劑9。
(比較例2)
實施例1之步驟(1)中，除使由甲基丙烯酸3,4-環氧基環己基甲酯(DAICEL公司製)1.41g、丙三醇單甲基丙烯酸酯(日油公司製)8.45g及三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(SATOMER公司製)4.23g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製造所公司製)21.50g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.34g之混合液中，調製單體溶液以外，餘進行與實施例1之步驟(1)及(2)相同之操作，獲得多孔質粒子分散液。
隨後，以與實施例1之步驟(3)相同之操作固定蛋白質A，生成蛋白質A固定粒子。
接著，使生成之蛋白質A固定粒子分散於1.0M之1-硫代丙三醇(旭化學工業公司製)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中，在25℃振盪4小時予以攪拌，使未反應之環氧基開環。進而，以0.1M磷酸鈉緩衝液(pH6.6)、0.1M氫氧化鈉水溶液、0.1M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)洗淨，獲得親和性層析用填充劑10。
(比較例3)
比較例2中，除將蛋白質A固定粒子分散於1.0M之1-硫代丙三醇(旭化學工業公司製)/0.1M硫酸鈉(pH8.3)40mL中後之振盪攪拌時間自4小時變更為17小時以外，餘以與比較例2相同之操作獲得親和性層析用填充劑11。
(比較例4)
實施例1之步驟(1)中，除使由甲基丙烯酸縮水甘油酯(三菱縲縈公司製)1.39g、丙三醇單甲基丙烯酸酯(日油公司製)2.79g及丙三醇二甲基丙烯酸酯(新中村化學工業公司製)9.76g所成之單體組成物溶解於苯乙酮(井上香料製造所公司製)21.50g及2-辛酮(東洋合成公司製)7.34g之混合液中，調製單體溶液以外，餘進行與實施例1之步驟(1)及(2)相同之操作，獲得多孔質粒子分散液。
隨後，以與實施例3相同之操作，實施蛋白質A之固定、未反應之環氧基之開環及洗淨，獲得親和性層析用填充劑12。
試驗例1(環氧基含量之定量)
定量實施例1~8及比較例1~4中獲得之配位子結合前之多孔質粒子之環氧基含量。
亦即，將鹽酸過量添加於懸浮於氯化鈣水溶液中之多孔質粒子中使鹽酸加成反應藉此使環氧基開環，剩餘之鹽酸以過量之氫氧化鈉水溶液中和後，添加酚酞溶液，以鹽酸反滴定剩餘之氫氧化鈉而定量。又，滴定終點為酚酞之紅色消失之時點。結果示於表1。
試驗例2(剩餘之環氧基量之評價(pH上升幅度之測定))
以充填高度約5cm將實施例1~8及比較例1~4所得之親和性層析用填充劑填充於GE Healthcare公司製之 Tricorn 5/50管柱中，將前述管柱連接於GE Healthcare公司製之AKTAprime plus上，邊監控pH邊以流速0.2mL/分鐘通液包含2M之NaCl之pH7.5之20mM磷酸鈉緩衝液，記錄管柱內之pH達到平衡時之pH值作為初期pH。 進而，自AKTAprime plus卸下經置換成前述緩衝液之前述管柱，在40℃之恆溫器內靜置7天。
隨後，再度將前述管柱連接於AKTAprime plus上且邊監控pH邊以流速0.2mL/分鐘通液前述緩衝液，記錄管柱內之pH最高時之pH值作為負荷pH。求出初期pH與負荷pH之差作為pH上升幅度。又，初期pH及負荷pH之測定係在23±1℃之恆溫室內實施。結果示於表1。
試驗例3(蛋白質A結合量之定量)
使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)(BCA)試藥定量結合於實施例1~8及比較例1~4所得之親和性層析用填充劑之配位子的蛋白質A之結合量。具體而言，將以固體成分換算為1mg之填充劑取樣於試管中，使之以ThermoFisher Scientific公司之BCA蛋白質分析套組定量。反應係在37℃下以倒轉混合30分鐘進行。校正線係使用與結合於擔體上之蛋白質A相同者製作。結果示於表1。
試驗例4(DBC之測定及保存安定性之評價)
使用GE Healthcare公司製之AKTAprime plus，在線 流速300cm/hr下測定各實施例及比較例之各填充劑對蛋白質(人類IgG抗體，Equitech Bio公司製HGG-1000)之DBC。管柱係使用容量4mL(5mm
Figure 104120750-A0202-12-0036-9
×200mm長)者，蛋白質係使用在20mM磷酸鈉/150mM氯化鈉水溶液(pH7.5)中溶解5mg/mL之蛋白質而成者，且自溶出前端10%穿透時之蛋白質捕捉量與管柱填充體積求出DBC。結果示於表1。
進而，與試驗例2同樣以含2M之NaCl之 pH7.5之20mM磷酸鈉緩衝液置換DBC測定後之管柱，直接在40℃靜置7天。隨後，再以與上述相同之條件實施DBC測定，求出負荷DBC。以負荷DBC/初期DBC×100作為DBC維持率，評價親和性層析用填充劑之保存安定性。又，初期DBC及負荷DBC之測定係在23±1℃之恆溫室內實施。結果示於表1。
試驗例5(HCP之定量)
以充填高度約5cm將實施例及比較例之各填充劑填充於管柱容器(GE Healthcare公司製之Tricorn 10/50管柱)中，製作管柱。所得管柱分別連接於GE Healthcare公司製之AKTAprime plus上，以流速1mL/分鐘通液5管柱容量(管柱容積之5倍)之20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)，予以平衡化。
接著，以約23mg抗體/mL擔體之負荷量以流速1mL/分鐘使含有單株抗體曲妥單抗(Trastuzumab)之CHO細胞 培養上澄液通液至管柱。
接著，以流速1mL/分鐘依序通液各5管柱容量之20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)、20mM磷酸鈉/1M氯化鈉緩衝液(pH7.5)、及20mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)。
隨後，以流速1mL/分鐘使50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH3.2)通液於管柱，使管柱內捕捉之單株抗體溶出，回收Abs.280>100mAu之溶出部分。
接著，使用分光光度計，測定回收之部分中所含有之抗體濃度(mg.mL)。且，使用Cygnus Technologies公司製之CHO HCP ELISA套組，使用3G，測定回收之部分中所含宿主細胞蛋白質(HCP)之濃度(ng/mL)。進而將HCP之濃度除以抗體濃度，藉此算出每單位抗體量之HCP量。結果示於表1。
Figure 104120750-A0202-12-0038-5
表1中之各符號係如下所示。
(M-1)GMA：甲基丙烯酸縮水甘油酯，HBAGE：甲基 丙烯酸4-羥基丁酯縮水甘油醚，VBGE：(4-乙烯基苄基)縮水甘油醚，METHB：甲基丙烯酸3,4-環氧基環己基甲酯
(M-2)DVB：二乙烯基苯，TMP：三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，GLDM：丙三醇二甲基丙烯酸酯，EDMA：乙二醇二甲基丙烯酸酯
(M-3)EVB：1-乙基-4-乙烯基苯，HEAA：N-(2-羥基乙基)甲基丙烯醯胺，GLM：丙三醇單甲基丙烯酸酯
(開環所使用之化合物)ME：2-巰基乙醇、TG：1-硫代丙三醇，MPSA：2-巰基丙烷磺酸鈉

Claims (12)

  1. 一種親和性層析用擔體，其特徵係包含固相擔體、使環氧基開環所得之開環環氧基、及結合於前述固相擔體之配位子之親和性層析用擔體，該固相擔體含有包含(M-1)及(M-2)之構造單位之共聚物：(M-1)源自含有環氧基之單乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位含超過20質量份且99.5質量份以下，及(M-2)源自聚乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位含0.5~80質量份，於將前述親和性層析用擔體填充於任意之管柱容器中，以包含2M NaCl之pH7.5之20mM磷酸鈉緩衝液置換管柱，且在40℃靜置7天時之管柱內之pH上升幅度為2以下。
  2. 如請求項1之親和性層析用擔體，其中前述共聚物進而包含(M-3)源自不含有環氧基之單乙烯基單體之構造單位：相對於全部構造單位為40質量份以下。
  3. 如請求項1之親和性層析用擔體，其中前述開環環氧基係以下述式(1)表示之基，
    Figure 104120750-A0202-13-0001-7
     [式(1)中，R1表示碳數1~6之2價有機基， R2表示氫原子或碳數1~10之1價有機基，X表示硫基(>S)、亞硫醯基(>S=O)、磺醯基(>S(=O)2)、亞胺基(>NH)、或氧基(>O)，*表示鍵結位置]。
  4. 如請求項3之親和性層析用擔體，其中R2為以下述式(2)表示者，
    Figure 104120750-A0202-13-0002-8
     [式(2)中，R3表示碳數1~10之2價或3價有機基，n表示1或2，**表示與式(1)中之X之鍵結位置]。
  5. 如請求項3之親和性層析用擔體，其中X為硫基(>S)、亞硫醯基(>S=O)、或氧基(>O)。
  6. 如請求項1之親和性層析用擔體，其中前述配位子為免疫球蛋白(immunoglobulin)結合性蛋白質。
  7. 如請求項6之親和性層析用擔體，其中前述免疫球蛋白結合性蛋白質係由蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L、Fc結合之蛋白質及該等之功能性變異體所組成之群選出之至少1種以上。
  8. 如請求項1之親和性層析用擔體，其中前述固相擔體為多孔質粒子。
  9. 如請求項8之親和性層析用擔體，其中前述多孔 質粒子之粒徑為35~100μm。
  10. 一種親和性層析管柱，其係將如請求項1~9中任一項之親和性層析用擔體填充於管柱容器中而成。
  11. 一種標的物質之純化方法，其特徵係使用如請求項1~9中任一項之親和性層析用擔體。
  12. 如請求項11之純化方法，其中前述標的物質為標的蛋白質。
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