JP5294941B2 - ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンA1c及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法 - Google Patents
ヘモグロビン類分離用カラム充填剤、ヘモグロビンA1c及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法 Download PDFInfo
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Description
しかしながらこのようなイオン交換基の導入法により得られたカラム充填剤は、イオン交換基が存在しない表面部分の疎水性が残り、この部分への非特異吸着は抑制できない。
カラム充填剤の耐圧性等の強度を低下させずに親水性化する手段として、親水性高分子で充填剤表面を被覆した二層構造のカラム充填剤を用いることが公知である。例えば特許文献2には、親水性高分子であるポリビニルアルコールで充填剤表面を被覆することによりイオン交換基が導入された充填剤が開示されている。しかしながらこのような被覆層の調製方法は、高分子鎖の疎水性に依存した物理的な吸着によるものであるため、多数の試料を測定する場合には被覆層が剥離し、測定精度が低下する可能性が大きい。
以下に本発明を詳述する。
なお、本明細書において「アクリル系」とは、アクリル基又はメタクリル基を有することを意味する。また、本明細書において「(メタ)アクリル酸」とは、「アクリル酸又はメタクリル酸」であることを示す。
上記ポリエチレングリコールジ(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ(メタ)アクリレート、ジエチレングリコールジ(メタ)アクリレート、トリエチレングリコールジ(メタ)アクリレート、テトラエチレングリコールジ(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールジ(メタ)アクリレート等が挙げられる
上記ポリプロピレングリコールジ(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、プロピレングリコールジ(メタ)アクリレート、ジプロピレングリコールジ(メタ)アクリレート、トリプロピレングリコールジ(メタ)アクリレート、テトラプロピレングリコールジ(メタ)アクリレート、ポリプロピレングリコールジ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールジ(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、ポリテトラメチレングリコールジ(メタ)アクリレート、ポリ(プロピレングリコール−テトラメチレングリコール)−ジ(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールポリエチレングリコール−ジ(メタ)アクリレート、1,3−ブチレングリコールジ(メタ)アクリレート、1,4−ブチレングリコールジ(メタ)アクリレート、1,6−ヘキサグリコールジ(メタ)アクリレート、1,9−ノナンジオールジ(メタ)アクリレート、ネオペンチルグリコールジ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記ヒドロキシアルキルジ(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、2−ヒドロキシ−1,3−ジ(メタ)アクリロキシプロパン、2−ヒドロキシ−1−(メタ)アクリロキシ−3−(メタ)アクリロキシプロパン、2−ヒドロキシ−3−(メタ)アクリロイルオキシプロピル(メタ)アクリレート、グリセロールジ(メタ)アクリレート、グリセロールアクリレートメタクリレート、ウレタン(メタ)ジアクリレート、イソシアヌル酸ジ(メタ)アクリレート、イソシアヌル酸トリ(メタ)アクリレート、1,10−ジ(メタ)アクリロキシ−4,7−ジオキサデカン−2,9−ジオール、1,10−ジ(メタ)アクリロキシ−5−メチル−4,7−ジオキサデカン−2,9−ジオール、1,11−ジ(メタ)アクリロキシ−4,8−ジオキサウンデガン−2,6,10−トリオール等が挙げられる。
上記分子内に少なくとも2個の(メタ)アクリル基を有するアルキロールアルカン(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、トリメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート、テトラメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ(メタ)アクリレート、テトラメチロールメタントリ(メタ)アクリレート、テトラメチロールメタンテトラ(メタ)アクリレート、トリメチロールエタントリ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
これらの架橋性アクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、2種以上を併用して用いてもよい。
また、上記架橋性アクリル系単量体は、イオン交換基を有さない構造であることが好ましい。
上記(メタ)アクリル酸アルキル類は特に限定されず、例えば、(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチル、(メタ)アクリル酸プロピル、(メタ)アクリル酸ブチル、(メタ)アクリル酸2−エチルヘキシル等が挙げられる。
上記ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、エチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ジエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、トリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、テトラエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、メトキシトリ(ポリ)エチレングリコールモノ(メタ)アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記ポリプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、プロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ジプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート、トリプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート、テトラプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート、ポリプロピレングリコールモノ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記アルキレングリコールモノ(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、ポリ(エチレングリコール・プロピレングリコール)モノ(メタ)アクリレート、ポリ(エチレングリコール・テトラメチレングリコール)モノ(メタ)アクリレート、ポリ(プロピレングリコール・テトラメチレングリコール)モノ(メタ)アクリレート、オクトキシポリエチレングリコールポリプロピレングリコール−モノ(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記水酸基又はグリシジル基を有する(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、グリシジル(メタ)アクリレート、グリセリンモノ(メタ)アクリレート、2−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、2−ヒドロキシプロピル(メタ)アクリレート、2,3−ジヒドロキシルエチル(メタ)アクリレート、2,3−ジヒドロキシルプロピル(メタ)アクリレート等が挙げられる。
これらの非架橋性アクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、2種以上を併用して用いてもよい。
また、上記非架橋性アクリル系単量体は、イオン交換基を有さない構造であることが好ましい。
上記架橋重合体粒子の粒子径は特に限定されないが、好ましい下限は0.1μm、好ましい上限は50μmである。上記架橋重合体粒子の粒子径が0.1μm未満であると、カラム圧力が増大し、HPLCに耐圧性付与のための特殊な部品等が必要となり、好ましくない。上記架橋重合体粒子の粒子径が50μmを超えると、カラム内の空隙率が増大し、試料の拡散が起き易くなり、ピークのブロード化等により測定精度が低下することがある。上記架橋重合体粒子の粒子径のより好ましい下限は0.5μm、より好ましい上限は30μmである。
上記イオン交換性重合体の有する「カチオン交換基」とは、公知のカチオン交換性を有する官能基を指し、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等のカチオン交換基等が挙げられる。また上記イオン交換性重合体の有する「アニオン交換基」とは、公知のアニオン交換性を有する官能基を指し、例えば、3級アミノ基、4級アンモニウム基等のアニオン交換基等が挙げられる。上記イオン性重合体におけるカチオン交換基としては特にスルホン酸基が好ましく、またアニオン交換基としては3級アミノ基が好ましい。
なお、本発明でいうカチオン交換基又はアニオン交換基(以下、両者を合わせて単にイオン交換基ともいう)には、これらのイオン交換基に付随する構造は問わないため、上記イオン交換基を末端に有する全ての官能基を含む。例えば、本発明でいう「カルボキシル基」とは、カルボキシルエチル基、カルボキシルプロピル基等、カルボキシル基が結合する官能基類全てを含む。
また、各イオン交換基は、複数種のイオン交換基、例えば、カチオン交換基としてカルボキシル基及びスルホン酸基を、アニオン交換基として3級アミノ基及び4級アンモニウム基を有していてもよい。
上記3級アミノ基を有する(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート、ジエチルアミノエチル(メタ)アクリレート、ジエチルアミノプロピル(メタ)アクリレート、2−ヒドロキシ−3− ジメチルアミノプロピル(メタ)アクリレート、N,N−ジメチル(メタ)アクリルアミド等が挙げられる。
上記4級アンモニウム基を有する(メタ)アクリル酸誘導体類は特に限定されず、例えば、ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート4級化物、2−(メタ)アクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド、2−(メタ)アクリロイルオキシエチルトリエチルアンモニウムクロライド、2−ヒドロキシ−3−(メタ)アクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等が挙げられる。
ここでいう反応性官能基とは、非イオン交換性であり、かつ、後述するイオン交換基を有する化合物と反応することができる官能基であれば特に限定されず、例えば、水酸基、グリコール基、エポキシ基、グリシジル基、1級アミノ基、2級アミノ基、シアノ基、アルデヒド基等が挙げられ、好ましくは水酸基、エポキシ基、グリシジル基、1級アミノ基、2級アミノ基であり、より好ましくは、水酸基、エポキシ基、グリシジル基である。
上記エポキシ化(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、グリシジル(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記ヒドロキシル化(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、グリセリンモノ(メタ)アクリレート、2−ヒドロキシエチル(メタ)アクリレート、2−ヒドロキシプロピル(メタ)アクリレート、2,3−ジヒドロキシルエチル(メタ)アクリレート、2,3−ジヒドロキシルプロピル(メタ)アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ化(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、2−アミノエチル(メタ)アクリレート、2,3−ジアミノエチル(メタ)アクリレート、2−アミノプロピル(メタ)アクリレート、2,3−ジアミノプロピル(メタ)アクリレート、(メタ)アクリルアミド等が挙げられる。
上記アルデヒド化(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、(メタ)アクロレイン等が挙げられる。
上記シアノ化(メタ)アクリレート類は特に限定されず、例えば、シアノ(メタ)アクリレート、エチル−2−シアノアクリレート等が挙げられる。
これらの反応性官能基を有するアクリル系単量体は、単独で用いてもよいし、2種以上を併用して用いてもよい。
また、イオン交換基を有するアルデヒド化合物を、酸触媒下にてアセタール反応により水酸基と反応させることにより、同様にイオン交換基を導入することができる。
更に、例えば、トリカルバニル酸、ブタンテトラカルボン酸等の多官能カルボン化合物と水酸基の脱水反応によるエステル化により、カルボキシル基を導入することができる。
加えて、1,3−プロパンスルトン、1,4−ブタンスルトン等を水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中で反応させることによってもスルホン酸基を導入することができる。
同様に水酸化アルカリ水溶液中又は水酸化アルカリの有機溶媒溶液中に塩酸2−クロロトリエチルアミン水溶液を添加することにより、3級アミノ基を導入することができる。
反応性官能基がエポキシ基やグリシジル基の場合には、そのまま上記処理に供してもよい。
上記過硫酸塩は特に限定されず、例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等が挙げられる。
上記有機過酸化物は特に限定されず、例えば、クメンハイドロパーオキサイド、ベンゾイルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、オクタノイルパーオキサイド、o−クロロベンゾイルパーオキサイド、アセチルパーオキサイド、t−ブチルハイドロパーオキサイド、t−ブチルパーオキシアセテート、t−ブチルパーオキシイソブチレート、3,5,5−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、t−ブチルパーオキシ−2−エチルヘキサノエート、ジ−t−ブチルパーオキサイド等が挙げられる。
上記アゾ化合物は特に限定されず、例えば、2,2−アゾビスイソブヒロニトリル、2,2−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニトリル)、4,4−アゾビス(4−シアノペンタン酸)、2,2−アゾビス(2−メチルブチロニトリル)、2,2−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニトリル)、アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル等が挙げられる。
なお、上記重合開始剤は、上記単量体混合物に溶解させて用いることが好ましい。
上記添加剤は特に限定されず、例えば、重合体にマクロポアを形成するための多孔質化剤、重合反応を制御するための各種連鎖移動剤、懸濁粒子を安定化されるための分散剤等が挙げられる。
上記芳香族炭化水素類は特に限定されず、例えば、トルエン、キシレン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等が挙げられる。
上記飽和炭化水素類は特に限定されず、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカン等が挙げられる。
上記アルコール類は特に限定されず、例えば、イソアミルアルコール、オクチルアルコール等のアルコール等が挙げられる。
上記単量体混合物100重量部に対する上記多孔質化剤の配合量の好ましい上限は100重量部である。
本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いてHPLCによりヘモグロビンA1c等のヘモグロビン類の測定を行なう場合には、溶離液送液用のポンプ、サンプラ、検出器等を備えた公知のHPLCシステムに、本発明のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を充填したカラムを接続し、血液試料中のヘモグロビン類の測定を行なうことができる。
上記有機酸は特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
上記無機酸は特に限定されず、例えば、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等が挙げられる。
上記アミノ酸類は特に限定されず、例えば、グリシン、タウリン、アルギニン等が挙げられる。
また、上記緩衝液には、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。
ヘモグロビンA1cの測定を行う際の上記緩衝液の塩濃度の好ましい下限は10mmol/L、好ましい上限は1000mmol/Lである。上記緩衝液の塩濃度が10mmol/L未満であると、イオン交換反応が行なわれず、ヘモグロビンを分離することができなくなることがある。上記緩衝液の塩濃度が1000mmol/Lを超えると、塩が析出しシステムに悪影響を及ぼすことがある。
このような測定方法もまた、本発明の一つである。
本発明の測定方法により測定できる異常ヘモグロビン類としては、例えば、ヘモグロビンS、ヘモグロビンC等が挙げられる。また、ヘモグロビンF(胎児性ヘモグロビン)やヘモグロビンA2を測定することもできる。
つまり、本発明によれば、ヘモグロビン類の非特異吸着を低減し、測定精度及びカラム寿命を向上させることのできるヘモグロビン類分離用カラム充填剤を提供することができる。また、本発明によれば、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いた液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンA1c及び異常ヘモグロビン類の測定方法、並びに、該ヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法を提供することができる。
架橋性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)400g及びテトラメチロールメタントリアクリレート(新中村化学工業社製)100gの混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル(ナカライテスク社製)1.0gを溶解した。得られた単量体混合物を、4重量%のポリビニルアルコール(日本合成化学社製、「ゴーセノールGH−20」)水溶液5Lに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で80℃に加温し、1時間重合反応を行なった。温度を30℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として2−メタクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(東亞合成社製)195g、及び、アニオン交換基を有するアクリル系単量体としてジエチルアミノエチルメタクリレート(和光純薬工業社製)5gを反応系に添加し、再び80℃に加温して1時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基及び3級アミノ基が導入された架橋重合体粒子(ヘモグロビン類分離用カラム充填剤)を得た。
得られたヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径3mm、長さ30mmのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン類分離カラムを調製した。
架橋性アクリル系単量体としてテトラエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)400g、及び、非架橋性アクリル系単量体として2−ヒドロキシエチルメタクリレート(新中村化学工業社製)100gの混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル(ナカライテスク社製)1.0gを溶解した。得られた単量体混合物を、4重量%のポリビニルアルコール(日本合成化学社製、「ゴーセノールGH−20」)水溶液5Lに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で80℃に加温し、1時間重合反応を行なった。温度を30℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として3−スルホプロピルメタクリル酸(和光純薬工業社製)170g、及び、アニオン交換基を有するアクリル系単量体として2、3−ジアミノプロピルメタクリレート(新中村化学工業社製)30gを反応系に添加し、再び80℃に加温して1時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基及び3級アミノ基が導入された架橋重合体粒子(ヘモグロビン類分離用カラム充填剤)を得た。
得られたヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径3mm、長さ30mmのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン類分離カラムを調製した。
実施例1と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図1と同様のクロマトグラムを得た。
架橋性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)450g及びテトラメチロールメタントリアクリレート(新中村化学工業社製)50gの混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル(ナカライテスク社製)1.0gを溶解した。得られた単量体混合物を、4重量%のポリビニルアルコール(日本合成化学社製、「ゴーセノールGH−20」)水溶液5Lに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で80℃に加温し、1時間重合反応を行なった。温度を30℃に冷却した後、アニオン交換基を有するアクリル系単量体としてジエチルアミノエチルメタクリレート(和光純薬工業社製)30g、及び、カチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体としてグリセリンメタクリレート(日油社製)100gを反応系に添加し、再び80℃に加温して1時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、カチオン交換基に変換可能な水酸基、及び、アニオン交換基が導入された架橋重合体粒子を得た。
得られた架橋重合体粒子50gを、10重量%の水酸化ナトリウム水溶液100mLに分散させ、室温で40gのエピクロルヒドリンを添加し、5時間反応させた。得られたエポキシ化重合体粒子40gを20重量%の硫酸ナトリウム水溶液に分散させ、80℃で20時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、アニオン交換基に加えてスルホン酸基が導入された架橋重合体粒子(ヘモグロビン類分離用カラム充填剤)を得た。
得られたヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径3mm、長さ30mmのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン類分離カラムを調製した。
実施例1と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図1と同様のクロマトグラムを得た。
架橋性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)450g及びテトラメチロールメタントリアクリレート(新中村化学工業社製)50gの混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル(ナカライテスク社製)1.0gを溶解した。得られた単量体混合物を、4重量%のポリビニルアルコール(日本合成化学社製、「ゴーセノールGH−20」)水溶液5Lに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で80℃に加温し、1時間重合反応を行なった。温度を30℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として2−メタクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(東亞合成社製)170g、及び、アニオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体としてグリシジルメタクリレート(日油社製)30gを反応系に添加し、再び80℃に加温して1時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、アニオン交換基に変換可能なグリシジル基、及び、カチオン交換基が導入された架橋重合体粒子を得た。
得られた架橋重合体粒子50gを、10重量%の水酸化ナトリウム水溶液100mLに分散させ、5重量%の塩酸2−クロロトリメチルアミン水溶液50mLを添加して、80℃で20時間反応させた。得られた反応物をイオン交換水で洗浄し、カチオン交換基に加えて3級アミノ基が導入された架橋重合体粒子(ヘモグロビン類分離用カラム充填剤)を得た。
得られたヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径3mm、長さ30mmのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン類分離カラムを調製した。
実施例1と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図1と同様のクロマトグラムを得た。
本比較例では、実施例1におけるアニオン交換基を有するアクリル系単量体を用いずにカラム充填剤(カチオン交換基のみを有する充填剤)を調製した例を示す。
実施例1におけるアニオン交換基を有するアクリル系単量体(ジエチルアミノエチルメタクリレート)を用いなかったこと以外は、実施例1と同様にして重合反応を行い、スルホン酸基のみが導入された架橋重合体粒子(ヘモグロビン類分離用カラム充填剤)及びヘモグロビン類分離カラムを得た。
実施例1と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図2のクロマトグラムを得た。図2中、ピーク1がヘモグロビンA1c、ピーク2がヘモグロビンA0である。実施例1のカラム充填剤により得られたクロマトグラム(図1)よりも測定時間を延長したにも関わらず、ヘモグロビンA1cの分離が不良であった。
本比較例では、実施例2におけるカチオン交換基を有するアクリル系単量体を用いずにカラム充填剤(アニオン交換基のみを有する充填剤)を調製した例を示す。
実施例2におけるカチオン交換基を有するアクリル系単量体(3−スルホプロピルメタクリル酸)を用いなかったこと以外は、実施例2と同様に重合反応を行い、3級アミノ基のみが導入された架橋重合体粒子(ヘモグロビン類分離用カラム充填剤)及びヘモグロビン類分離カラムを得た。
実施例1と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、ヘモグロビン類は全く分離されず、全ての成分が一つのピークとなって溶出された。これは、カラム充填剤表面のプラスに荷電したアニオン交換基と、プラスに荷電したヘモグロビン類とが反発し合い、イオン交換反応が行われなかったためであると考えられる。
本比較例では、実施例1における架橋重合体粒子がアクリル系以外の単量体に由来する成分を含む場合の例を示す。
架橋性アクリル系単量体としてトリエチレングリコールジメタクリレート(新中村化学工業社製)450g、及び、その他の架橋性単量体としてジビニルベンゼン(キシダ化学社製)50gの混合物に、重合開始剤として過酸化ベンゾイル(ナカライテスク社製)1.0gを溶解した。得られた単量体混合物を、4重量%のポリビニルアルコール(日本合成化学社製、「ゴーセノールGH−20」)水溶液5Lに分散させ、攪拌しながら窒素雰囲気下で80℃に加温し、1時間重合反応を行なった。温度を30℃に冷却した後、カチオン交換基を有するアクリル系単量体として2−メタクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸(東亞合成社製)195g、及び、アニオン交換基を有するアクリル系単量体としてジエチルアミノエチルメタクリレート(和光純薬工業社製)5gを反応系に添加し、再び80℃に加温して1時間重合反応を行なった。得られた架橋重合体粒子をイオン交換水及びアセトンで洗浄することにより、スルホン酸基及び3級アミノ基が導入された架橋重合体粒子(ヘモグロビン類分離用カラム充填剤)を得た。
得られたヘモグロビン類分離用カラム充填剤を、内径3mm、長さ30mmのステンレス製カラムに充填し、ヘモグロビン類分離カラムを調製した。
実施例1と同様の方法により、ヒト健常人血液を用いて測定したところ、図2と同様のクロマトグラムが得られ、ヘモグロビンA1cの分離が不良であった。
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて、回収率試験を実施した。回収率は、カラムの代わりに内径0.25mm、長さ1000mmのPEEK製配管をHPLCに取り付け、実施例及び比較例で用いた試料を測定したときのピーク総面積に対する調製したヘモグロビン類分離カラムを取り付けて測定したときのピーク総面積の比率(%)により求めた。結果を表1に示す。
一方、比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムでは回収率が80%以下と低かった。これは、測定対象であるヘモグロビンがカラム充填剤に非特異的に吸着して溶出してこなかったためであると考えられる。
実施例に用いたヒト健常人血液の代わりに、修飾ヘモグロビン類を含む試料を人為的に調製して測定し、そのヘモグロビンA1cピークとの分離性能を評価した。
修飾ヘモグロビン類を含む試料としては、レイバイルヘモグロビンA1c含有試料(試料L)、アセチル化ヘモグロビン含有試料(試料A)、カルバミル化ヘモグロビン含有試料(試料C)の3種類を、公知の方法により調製した。
すなわち、試料Lは、ヒト健常人血液に、グルコースを2500mg/dLとなるように添加し、37℃で3時間加温することにより調製した。試料Aは、ヒト健常人血液に、アセトアルデヒドを60mg/dLとなるように添加し、37℃で2時間加温することにより調製した。試料Cは、ヒト健常人血液に、シアン酸ナトリウムを60mg/dLとなるように添加し、37℃で2時間加温することにより調製した。
得られた修飾ヘモグロビン類を含む試料(試料L、試料A、試料C)と、修飾ヘモグロビン類を含む試料の調製に用いたヒト健常人血液(非修飾品)とを、実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて測定し、ヘモグロビンA1cの測定値を比較した。分離性能は、修飾ヘモグロビン類を含む試料のヘモグロビンA1c値から非修飾品のヘモグロビンA1c値を差し引いた値(Δ値)を算出して比較することにより評価した。結果を表2に示す。
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて、異常ヘモグロビンとしてヘモグロビンS及びヘモグロビンCを含む試料(ヘレナ研究所社製、「AFSCヘモコントロール」)の測定を行った。
実施例1のヘモグロビン類分離カラムを用いて測定した結果、得られたクロマトグラムを図3に示す。図3中、ピーク1はヘモグロビンA1c、ピーク2はヘモグロビンA0、ピーク3はヘモグロビンF(胎児性Hb)、ピーク4はヘモグロビンS、ピーク5はヘモグロビンCを示す。実施例1のヘモグロビン類分離カラムにおいては、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンS及びヘモグロビンCを良好に分離することができた。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のヘモグロビン類分離カラムを用いて測定した場合、異常ヘモグロビン類であるヘモグロビンS及びヘモグロビンCを分離することはできなかった。
実施例及び比較例で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて、ヘモグロビンA2を含む試料として、A2コントロール(レベル2)(バイオラッド社製)を測定した。
実施例1のカラム充填剤を用いて測定して得られたクロマトグラムを図4に示す。図4中、ピーク1はヘモグロビンA1c、ピーク2はヘモグロビンA0、ピーク3はヘモグロビンF(胎児性Hb)、ピーク6はヘモグロビンA2を示す。実施例1のヘモグロビン類分離カラムにおいて、ヘモグロビンA2を良好に分離することができた。他の実施例のカラム充填剤を用いた場合でも、ほぼ同様の分離性能を示した。
一方、比較例のカラム充填剤を用いて測定した場合、ヘモグロビンA2を分離することはできなかった。
実施例1、2及び比較例1、3で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いて、同一のヒト健常人血液試料を連続測定し、ヘモグロビンA1c値の推移を確認した。結果を図5に示す。
実施例1、2で調製したヘモグロビン類分離カラムでは、3000回測定においても測定値が変化しなかったが、比較例1、3で調製したヘモグロビン類分離カラムを用いた場合は、測定値が低下し、カラム寿命が短いことが確認された。
2 ヘモグロビンA0
3 ヘモグロビンF(胎児性Hb)
4 ヘモグロビンS
5 ヘモグロビンC
6 ヘモグロビンA2
Claims (9)
- 架橋性アクリル系単量体を含有し、かつ、アクリル系単量体のみからなる単量体混合物を重合して得られる架橋重合体粒子と、前記架橋重合体粒子の表面において重合されてなるアクリル系重合体層とからなり、
前記アクリル系重合体層は、カチオン交換基及びアニオン交換基を有する
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤。 - アクリル系重合体層は、架橋重合体粒子の表面において、カチオン交換基及び/又はアニオン交換基を有するアクリル系単量体を重合させて得られたものである
ことを特徴とする請求項1記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤。 - アクリル系重合体層は、架橋重合体粒子の表面において、カチオン交換基及び/又はアニオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体を重合させた後、前記カチオン交換基及び/又はアニオン交換基に変換可能な官能基をカチオン交換基及び/又はアニオン交換基に変換して得られたものである
ことを特徴とする請求項1記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤。 - カラム充填剤の乾燥重量1g当たりのアニオン交換基量が、0.01〜100μeqであることを特徴とする請求項1、2又は3記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤。
- 請求項1、2、3又は4記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンA1cの測定方法。
- 請求項1、2、3又は4記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンA1c及び異常ヘモグロビン類の測定方法。
- 請求項1、2、3又は4記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
架橋性アクリル系単量体を含有し、かつ、アクリル系単量体のみからなる単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程、及び、
前記架橋重合体粒子と、カチオン交換基を有するアクリル系単量体及びアニオン交換基を有するアクリル系単量体、又は、カチオン交換基とアニオン交換基の両方を有する単量体とを重合開始剤の存在下で重合し、前記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基及びアニオン交換基を有する重合体層を形成する工程を有する
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。 - 請求項1、2、3又は4記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤を製造する方法であって、
架橋性アクリル系単量体を含有し、かつ、アクリル系単量体のみからなる単量体混合物を重合して架橋重合体粒子を形成する工程、及び、
前記架橋重合体粒子と、カチオン交換基及び/又はアニオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体とを重合開始剤の存在下で重合し、前記架橋重合体粒子の表面にカチオン交換基及び/又はアニオン交換基に変換可能な官能基を有する重合体を形成させ、前記カチオン交換基及び/又はアニオン交換基に変換可能な官能基をカチオン交換基及び/又はアニオン交換基に変換する工程を有する
ことを特徴とするヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。 - アニオン交換基を有するアクリル系単量体又はアニオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体の配合量が0.5〜20重量%であり、かつ、カチオン交換基を有するアクリル系単量体又はカチオン交換基に変換可能な官能基を有するアクリル系単量体の配合量が80〜99.5重量%である
ことを特徴とする請求項7又は8記載のヘモグロビン類分離用カラム充填剤の製造方法。
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