CN104640983A - 亲和分离基质用蛋白质配体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于开发构建新型基因工程蛋白质配体的技术，所述新型基因工程蛋白质配体将蛋白质配体固定在亲和分离基质上时的对目标分子的结合容量和结合效率最大化。本发明提供一种能够以图1中的(4)～(15)的示意图所示的形式固定于载体上的蛋白质配体(突变体)、以及将该蛋白质配体固定在非水溶性载体上的抗体亲和分离基质。该亲和分离基质显示出对目标分子的优异结合容量和结合效率的特征。

Description

亲和分离基质用蛋白质配体
技术领域
本发明涉及一种与目标物质特异性结合的蛋白质、将该蛋白质固定于载体而成的配体亲和分离基质及使用了该基质的分离纯化方法。
背景技术
作为蛋白质的重要的功能之一，可以举出与特定的分子特异性结合的功能。该功能在活体内的免疫反应及信号传导中起到重要的作用。另一方面，将该功能用于有用物质的分离纯化的技术开发也很盛行。作为实际工业利用的一个例子，可以举出：用于以较高的纯度一次性从动物细胞培养物中纯化(捕捉)抗体医药的蛋白质A亲和分离基质。
作为抗体医药所开发的基本上为单克隆抗体，使用重组培养细胞技术等大量地生产。所谓“单克隆抗体”，是指由来源于单一的抗体产生细胞的克隆得到的抗体。现在上市的抗体医药在分子结构上几乎为免疫球蛋白G(IgG)亚型。蛋白质A为通过革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产的细胞壁蛋白质的1种，由信号序列S、5个免疫球蛋白结合性区域(E区域、D区域、A区域、B区域、C区域)、及细胞壁结合区域即XM区域构成(非专利文献1)。在抗体医药制造工序中的初期纯化工序(捕获工序)中通常利用以蛋白质A为配体并固定于非水溶性载体而得到的亲和层析用柱(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3)。
为了改善蛋白质A柱的性能，进行了各种的技术开发，也进行了从配体方面考虑的技术开发。最初利用天然型的蛋白质A作为配体，但是以在蛋白质工程上进行修饰而成的重组蛋白质A为配体对柱的性能进行改良的技术也很多见。特别是，开发了一种意识到蛋白质A配体相对于非水溶性载体的固定方法的蛋白质A修饰技术。
含有蛋白质A的蛋白质性的配体利用蛋白质中存在的Lys(赖氨酸残基)、Cys(半胱氨酸残基)(在蛋白质A中不存在)的侧链的反应性官能团以图1(1)所示的方式通过共价键以多点固定在载体上(非专利文献4)。需要说明的是，改变了蛋白质A的抗体结合面和非结合面的Lys(赖氨酸残基)数量的比例的重组蛋白质A(专利文献1)为与图1(1)所示的方式基本上相同的固定形式，同时，为有效利用配体的抗体结合区域的技术。
在蛋白质A中突变导入1个Cys(半胱氨酸残基)的重组蛋白质A(专利文献2、非专利文献5)通过Cys位置特异性地固定在载体上。另外，还有将氨基序列中的Lys及Cys完全去除的重组蛋白质A(专利文献3、专利文献4)通过N末端(α氨基)、C末端(特殊标记)将蛋白质在固定在载体上的技术。这些技术如图1(2)或(3)所示的方式，是通过蛋白质配体的末端固定在载体上的技术，如这些文献中所记载，从可控制配体的取向，且可有效利用载体的表面积的方面考虑是有利的。
如上所述，在将蛋白质配体固定在亲和分离基质上方面的技术进展具有较高的工业利用价值，因此，以与要求较高性能的蛋白质A柱相关的技术为中心发展起来了。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-252368号公报
专利文献2：国际公开第1997/017361号小册子
专利文献3：日本特开2008-115151号公报
专利文献4：日本特开2008-266219号公报
非专利文献
非专利文献1：Hober S.等著、“J.Chromatogr.B”2007年、848卷、40-47页
非专利文献2：Low D.等著、“J.Chromatogr.B”、2007年、848卷、48-63页
非专利文献3：Roque A.C.A.等著、“J.Chromatogr.A”、2007年、1160卷、44-55页
非专利文献4：Wong L.S.等著、“Chem.Rev.”、2009年、109卷、4025-4053页
非专利文献5：Ljungquist C.等著、“Eur.J.Biochem.”、1989年、186卷、557-561页
发明内容
发明所需解决的课题
可以认为，在将含有蛋白质A的蛋白质性配体固定在载体上时，从可控制取向、可有效利用载体的表面积的方面考虑，通过一点(仅末端区域)固定是有利的，相反，若与通过多点固定相比，则无法忽视配体易于从载体上泄露的情形。因此，本发明所需解决的课题在于为了使将蛋白质性配体固定在载体上而得到的亲和分离基质相对于目标分子的结合容量/结合效率最大化，因此开发了一种构建新型基因工程蛋白质性配体的技术。
用于解决课题的技术方案
本发明人等为了解决上述的课题，对于蛋白质A，分子设计了多种重组蛋白质A突变体，使用蛋白质工程的方法及基因工程的方法获得该突变体，对获得的该突变体的物性及将该突变体固定在非水溶性载体上而成的抗体亲和分离基质的性能进行了比较研究。其结果发现，以图1中的(4)～(15)的示意图所示的方式将蛋白质配体固定在载体上制造了亲和分离基质，由此可使亲和分离基质相对于目标分子的结合容量/结合效率最大化。
即，本发明涉及一种蛋白质，其特征在于，包含来源于选自蛋白质A的E、D、A、B及C区域中的任一区域、且在全部Lys(赖氨酸残基)上导入了氨基酸取代突变的2个以上氨基酸序列，所述氨基酸序列彼此通过接头连接，且至少1个接头含有Lys(赖氨酸残基)或Cys(半胱氨酸残基)。
优选至少1个接头含有Lys。
优选导入取代突变前的氨基酸序列为SEQ ID NO(序列号):1～5中的任一氨基酸序列或在SEQ ID NO:1～5中的任一氨基酸序列中导入了下述(1)～(4)中的至少1个突变而成的氨基酸序列：
(1)与各区域中C区域的29位对应的氨基酸残基为Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser、Asp、Glu、Arg、His或Met中的任一者，
(2)与各区域中C区域的33位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、His或Met中的任一者，
(3)与各区域中C区域的36位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His或Met中的任一者，
(4)与各区域中C区域的37位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His或Met中的任一者。
优选全部Lys中所导入的氨基酸取代突变的半数以上为对Arg的取代突变。
优选全部Lys中所导入的氨基酸取代突变全部为对Arg的取代突变。
优选在以下所示的氨基酸残基中，保持有90％以上，且与导入突变前的氨基酸序列相比的序列同源性(同一性)为80％以上：
Gln-9、Gln-10、Phe-13、Tyr-14、Leu-17、Pro-20、Asn-21、Leu-22、Gln-26、Arg-27、Phe-30、Ile-31、Leu-34、Pro-38、Ser-39、Leu-45、Leu-51、Asn-52、Gln-55及Pro-57(残基号对应于C区域)。
优选在至少一个末端具有Lys或Cys。
优选在至少一个末端具有Lys。
另外，本发明涉及一种DNA，其编码所述蛋白质。
另外，本发明涉及一种载体，其含有所述DNA。
另外，本发明涉及一种转化体，其是通过载体对宿主细胞进行转化而得到的。
另外，本发明涉及一种所述蛋白质的制造方法，该方法包括：采用使用了所述DNA或者所述载体的无细胞蛋白质合成体系、或者所述转化体。
另外，本发明涉及一种亲和分离基质，其是以所述蛋白质为亲和配体，且固定于由非水溶性基材制成的载体而得到的。
所述亲和分离基质优选与含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合。
优选含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质为免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物。
另外，本发明涉及一种所述亲和分离基质的制造方法，该方法包括：以所述蛋白质为亲和配体并固定在由非水溶性基材制成的载体上。
另外，本发明涉及一种含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的纯化方法，该方法包括：使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质吸附在所述亲和分离基质上。
另外，本发明涉及一种亲和分离基质的制造方法，该方法包括：将相对于同一靶向分子的2个以上的结合区域通过接头连接而得到的亲和配体固定在载体上，其中，该亲和分离基质的制造方法通过至少1个接头中所含的至少1个氨基酸残基将亲和配体固定在载体上，而不是通过结合区域的核心区域将亲和配体固定在载体上。
优选该方法还包括：将亲和配体通过N末端区域和/或C末端区域固定在载体上。
发明效果
将通过本发明得到的新型基因工程蛋白质配体固定在非水溶性载体上而得到的亲和分离基质以较少的配体固定化量(固定的量)显示出对于目标分子的结合容量较高的特征。本技术有使制造上需要极大成本的蛋白质最大限度地发挥功能的一面，另一方面，也有可增加每次含抗体的培养上清液的处理量的一面，因此，在生产和利用亲和分离基质的方面，工业利用上的优点均较大。
将通过本发明得到的新型基因工程蛋白质配体按图1中的(4)～(15)的示意图所示的方式进行设计，使其固定在载体上，所谓上述现有技术中得到的配体，其固定化方式有较大不同。需要说明的是，图1示出了以3区域体的情况作为例子，4区域体的情况也同样，即使区域数增加也能起到本发明的效果。
特别是，从通过在各个区域间的至少1个以上接头区域进行固定的方面考虑，本发明与现有技术的方式不同，由此，期待固定在载体时(固相)与未固定在载体时(液相)的多区域型配体的(全局的)立体结构及动态行为有较大的不同。另外，各区域的核心区域的氨基酸残基未用于在载体上的固定化，因此，期待各个区域自身的立体结构及动态行为在固定在载体时和未固定时不变。
而且，令人惊讶的是，本发明的亲和分离基质与图1中的(1)或(2)的方式相比，抗体的结合容量显著提高。
即，对于本发明中配体在载体上的固定形式而言，在载体上的固定点较多，因此，可以享有不仅提高了目标分子的结合容量，而且配体难以从载体泄露等的优点。
附图说明
图1是示意地示出本发明的蛋白质配体在载体上的固定方式的图。
图2是蛋白质A的E、D、A、B、C及Z区域的序列比较的表。
图3是对于具有同一配体且其固定方式不同的亲和分离基质而言，描绘其配体固定化量与抗体结合容量的关系的图。
具体实施方式
关于取代氨基酸的突变的记载，在取代位置的编号前，附加野生型或非突变型的氨基酸，在取代位置的编号后，附加突变的氨基酸而记载。例如，将29位的Gly取代为Ala的突变记载为G29A。
“蛋白质”这一术语为含有具有多肽结构的所有的分子的物质，片段化或通过肽键连接的多肽链也包含在“蛋白质”这一术语中。另外，所谓“区域”，为蛋白质的高级结构上的单元，由数十至数百个氨基酸残基序列构成，是指足够表达任何物理化学或生物化学的功能的蛋白质的单元。
所谓“亲和配体”，是指由抗原和抗体的结合所代表的，基于特异性分子间亲和力，从某一分子的集合中选择性地捕捉(结合)靶向(目标)分子的物质的术语，在仅记载为“配体”的情况下也与“亲和配体”含义相同。
本发明中的亲和配体为将靶向分子结合区域(单体蛋白质、单区域)连接而成的多聚体蛋白质(多区域型蛋白质)，所述靶向分子结合区域为2个以上，优选为2～10个，更优选为2～8个，进一步优选为2～6个，最优选为3～6个。这些多聚体蛋白质可以是作为同一靶向分子结合区域的连接体的同源二聚体、同源三聚体等均聚物，若靶向分子相同，则也可以是作为多种靶向分子结合区域的连接体的异源二聚物、异源三聚物等杂聚物。
本发明中的靶向分子结合区域通过接头连接。通过接头的连接优选为使单体蛋白质的三维立体结构稳定的方法。
另外，作为实施方式之一，可以以本发明的蛋白质为1个构成成分，使其与功能不同的其它蛋白质融合。作为融合蛋白质的例子，可以举出白蛋白、GST(谷胱甘肽S-转移酶)融合而成的蛋白质作为例子，但并不限定于此。另外，在融合有DNA适体等核酸、抗生素等药物、PEG(聚乙二醇)等高分子的情况下，只要是利用本发明中得到的蛋白质的有用性的蛋白质也包含在本发明中。
将蛋白质固定在载体时所利用的蛋白质中的活性基团为N末端氨基酸的氨基、赖氨酸(Lys)侧链的氨基、半胱氨酸(Cys)侧链的巯基、C末端氨基酸的羧基或谷氨酸(Glu)侧链及天冬氨酸(Asp)侧链的羧基等(非专利文献4)，但并不限定于这些基团。
因此，所谓“固定在载体上的反应所利用的氨基酸残基”，例如，在以氨基为固定反应所涉及的官能团而用于反应的情况下，N末端氨基酸及赖氨酸为该氨基酸残基。需要说明的是，利用官能团的pKa的不同，例如在仅赖氨酸的ε氨基为固定反应所涉及的官能团的情况下，仅赖氨酸为该氨基酸残基。即，通过本发明得到的蛋白质以用于固定在载体上而利用为前提，从该观点考虑，“用于固定在载体上的反应的氨基酸残基”是由固定在载体上的反应的种类所唯一确定的。从反应性的观点考虑，用于固定的氨基酸优选为赖氨酸或半胱氨酸。官能团优选为赖氨酸的氨基或半胱氨酸的巯基。含有半胱氨酸的蛋白质易于形成二聚物，因此，从作为蛋白质且容易操作这一观点考虑，更优选“用于固定在载体上的反应的氨基酸残基”为赖氨酸。
所谓“区域间接头区域”，是指连接的靶向结合区域的连接部，即N末端侧的区域序列的C末端区域与C末端侧的区域序列的N末端区域连接形成的区域，在N个区域串联而成的蛋白质中，存在N-1个接头区域。也就是说，在本说明书中，将由连接的N末端侧的区域的C末端氨基酸与C末端侧的区域的N末端氨基酸的至少2个以上氨基酸残基构成的区域定义为“区域间接头区域”。
如上所述，在接头区域可以含有1或多个区域序列以外的氨基酸残基。接头区域中所含的氨基酸残基数优选为16个残基以内，更优选为8个残基以内，进一步优选为4个残基以内。接头优选含有赖氨酸或半胱氨酸，更优选含有赖氨酸。
本说明书中的“N末端区域”及“C末端区域”优选为8个残基以内，更优选为4个残基以内，进一步优选为2个残基以内，进而更优选为1个残基以内(所谓的N末端或C末端)。本发明的蛋白质可以在至少一个末端具有赖氨酸或半胱氨酸。
所谓本说明书中的“核心区域”，指在连接的各区域序列中，除N末端区域及区域的C末端区域以外的全部的区域。另外，在本发明中连接2个以上区域，因此，“核心区域”指除各个区域间接头区域、蛋白质的N末端区域(位于最N末端侧的区域的N末端区域)、及蛋白质的C末端区域(位于最C末端侧的区域的C末端区域)以外的全部的区域。
若从其它的观点定义本发明书中的区域的N末端区域/C末端区域，则也可定义为位于区域的两末端且未形成特定的二级结构的区域。即，N末端/C末端区域与形成特定的二级结构的区域相比，移动性(灵活性)较高。在此所说的二级结构，可以举出α-螺旋结构及β-链(strand)(折叠)结构及转角结构，但不限定于这些结构。
靶向结合区域的二级结构可基于相同或相似氨基酸序列的立体结构信息来确定。氨基酸序列的立体结构信息可从例如RCSB蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)获得，或也能够用DSSP(http://swift.cmbi.ru.nl/gv/dssp/)这样的二级结构归属用程序进行推测，或者可以通过分光学的方法(X射线、NMR等)实验性地获得。
需要说明的是，即使在难以获得这些信息的情况下，区域(蛋白质)的N末端/C末端的氨基酸的较高可变性也是明确的。因此，本发明的蛋白质一定具有由至少1个氨基酸残基构成的“N末端区域”及“C末端区域”，而且具有由2以上的氨基酸残基(一个区域的C末端氨基酸和另一个区域的N末端氨基酸)构成的“接头区域”。
将配体固定在载体时所用的氨基酸残基即使在其区域内偏离几个残基左右的位置，也能起到本发明的效果。
另外，本发明涉及一种将亲和配体固定在载体上制成的亲和分离基质的制造方法，所述亲和配体通过接头将相对于同一靶向分子的2个以上结合区域连接而得到，其中，该亲和分离基质的制造方法通过至少1个接头中所含的至少1个氨基酸残基将亲和配体固定在载体上，而不是通过结合区域的核心区域将亲和配体固定在载体上。而且，优选该方法含有将亲和配体通过N末端区域和/或C末端区域固定在载体上。该亲和配体为如下蛋白质，其中，用于固定在载体上的反应的氨基酸残基(A)至少有1个以上存在于蛋白质的各区域间接头区域的至少1个区域中，且(B)也可以存在于蛋白质的N末端区域和/或C末端区域，且(C)不存在于蛋白质的各区域的核心区域中。关于该蛋白质，举出连接3个靶向分子结合区域而成的蛋白质为例子补充。
需要说明的是，为了简化，将“连接3个靶向分子结合区域而成的蛋白质”和“用于固定在载体上的反应的氨基酸残基”分别记载为“3区域体”和“固定用残基”。若按照本说明书的定义，则3区域体具有2个接头区域。
也就是说，本发明中得到的蛋白质为了满足(A)的条件，在接头区域具有至少1个以上的固定用残基，即，固定用残基的方式为下述的任一方式：(a)仅存在于N末端侧的接头区域中、(b)仅存在于C末端侧的接头区域中、或(c)存在于两者的接头区域中。固定用残基优选存在于两者的接头区域中。
关于(B)的条件，可以考虑下面的(d)～(g)的4种方式。固定用残基为3区域体的以下4种方式：(d)仅存在于N末端区域中、(e)仅存在于C末端区域中、(f)存在于N末端区域及C末端区域的两者中、或(g)不存在于N末端区域及C末端区域的任一者中。
而且，为了满足(C)的条件，固定用残基除上述所示的方式以外，不存在于蛋白质中。若使用图1进行说明，则在蛋白质为3区域体、且固定用残基在各接头/末端区域中各为1个的情况下，为图1的(4)～(15)中的任一方式。
各接头区域(N/C末端区域)的固定残基的数量优选为1～8个，更优选为1～4个，进一步优选为1～2个，进而更优选为1个。
另外，从抑制配体泄露的观点考虑，优选蛋白质(多区域体1分子中)的固定残基的数量较多的一方。若将蛋白质中的区域数设为N，则优选为N-2个以上，更优选为N-1个以上，进一步优选为N个以上。
本发明中的以亲和配体为靶向的分子为能结合靶向分子结合区域的全部分子，例如可以举出含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质，具体而言，可以举出免疫球蛋白G(IgG)及免疫球蛋白G衍生物。
在此，所谓“免疫球蛋白G衍生物”，是对以下基因工程人工蛋白质总称的名称，例如：将人免疫球蛋白G的一部分区域取代为其它生物种的免疫球蛋白G的区域且使其融合而成的嵌合型免疫球蛋白G、将人免疫球蛋白G的CDR(Complementarity Determinig Regions)部分取代为其它生物种抗体的CDR部分且使其融合而成的人源化免疫球蛋白G、在Fc区域的糖链上施加分子修饰而成的免疫球蛋白G、使人免疫球蛋白G的Fv区域和Fc区域融合而成的人工免疫球蛋白G等。
以免疫球蛋白G及免疫球蛋白G衍生物为靶向的靶向分子结合区域包含在各种免疫球蛋白结合性蛋白质中。作为其免疫球蛋白结合性蛋白质的种类，可以举出源自金黄色葡萄球菌的蛋白质A、源自C/G群链球菌的蛋白质G、源自大消化链球菌的蛋白质L、源自A群链球菌的蛋白质H、源自流感嗜血杆菌的蛋白质D、源自链球菌AP4的蛋白质Arp、源自人的FcγR等为例，但并不限定于这些。
在本发明中，作为免疫球蛋白G结合区域，可以举出蛋白质A的E、D、A、B、以及C区域。这些区域为可以与免疫球蛋白的互补性决定区域(CDR)以外的区域结合的免疫球蛋白结合性蛋白质，其与以下各区域结合：免疫球蛋白的Fc区域、Fab区域、以及特别是Fab区域中的Fv区域。通常，与Fab(Fv)区域相比，各区域与Fc区域更牢地结合(非专利文献3)。
在本发明中，在用于固定在载体上的反应的氨基酸残基为赖氨酸残基的情况下，需要将下述氨基酸序列作为连接的对象，所述氨基酸序列由将蛋白质A的免疫球蛋白结合区域的氨基酸序列中的除末端以外的全部Lys以Lys以外的氨基酸取代突变而成。
需要说明的是，在含有末端且全部Lys残基以Lys以外的氨基酸取代突变而成的氨基酸序列形成后，可以利用将区域序列的末端区域的1个以上氨基酸取代突变为Lys后的氨基酸序列，也可以作为区域序列以外的氨基酸将1个以上的Lys残基赋予接头区域、末端区域。
另外，在用于固定在载体上的反应的氨基酸残基为半胱氨酸的情况下，由于在蛋白质A的免疫球蛋白结合区域的氨基酸序列中不含Cys，因此，作为将区域序列的末端区域的1个以上氨基酸取代突变为Cys的氨基酸序列、或作为区域序列以外的氨基酸，只要将1个以上的Cys残基赋予接头区域、末端区域即可。
如上所述，在本发明中，在除连接的靶向分子结合区域的末端区域以外的氨基酸序列中存在可固定于载体上的氨基酸残基的情况下，需要对这些氨基酸残基进行取代突变。同时，通过导入本发明的突变而不失去靶向分子结合区域对于其靶向分子的结合力是很重要的。
作为本发明中的具体的实施方式之一，基于SEQ ID NO:1～5所示的野生型的蛋白质A的E、D、A、B及C区域中的任一区域的序列进行例示。各区域可以按如图2所示的形式进行调整。
为了简化，在此例示C区域(SEQ ID NO:5)作为标准。例如，关于残基号，对应于C区域的31位的残基在A、B区域中为相同的31位，在E区域中相当于29位，在D区域中相当于34位。“全部Lys(赖氨酸残基)”指蛋白质A的E、D、A、B区域中，对应于C区域的4、7、35、49、50及58位的6个Lys。各区域可以互相调整使序列同一性提高。例如可以用氨基酸序列多重调整用程序即Clustal(http://www.clustal.org/omega/)来确定。
仅在蛋白质A的C区域的情况下，指4、7、35、42、49、50及58位的7个Lys残基。但是，在导入突变前的氨基酸序列为接受了缺失突变而成的序列的情况下，例如在1～4位为缺失了的序列的情况下，不限定于上述的数量。而且，所谓“除末端以外的全部赖氨酸残基”，在蛋白质A的各区域的情况下，相当于除C区域的58位Lys以外的全部赖氨酸残基。
在本发明中，该C区域的C末端的赖氨酸残基在连接时一定存在于区域间的接头区域、或连接后的蛋白质(多区域体)的C末端区域。因此，在将赖氨酸残基用于固定时，仅该赖氨酸残基可以不进行取代突变。
关于“对于Lys残基的氨基酸取代突变”，通过取代所导入的氨基酸的种类包括非构成蛋白质氨基酸及非天然氨基酸，没有特别限定，但从基因工程的生产的观点考虑，可以优选使用天然型氨基酸。
而且，优选氨基酸取代突变的半数以上为对精氨酸(Arg)的取代突变，更优选除2个以外全部为对Arg的取代突变，进一步优选除1个以外全部为对Arg的取代突变，进而更优选全部为对Arg的取代突变。这是因为Arg是与Lys物性相似的碱性氨基酸，对蛋白质整体的物性造成的影响较小。
作为本发明中的具体的实施方式之一，导入本发明的突变前的序列可以为野生型的蛋白质A的E、D、A、B及C区域的突变体。例如SEQ ID NO:6所示，在B区域导入了A1V和G29A这样的突变而成的称为Z区域的氨基酸序列也是来源于B区域的序列，在Z区域导入本发明的突变当然也包含在本发明的范围中。
需要说明的是，关于该Z区域，通过NMR分光法以较高的准确性解析立体结构，且加上过去公知的B区域、E区域的立体结构信息，定义了蛋白质A的免疫球蛋白G结合区域的α螺旋区域(Tashiro M.等著、“J.Mol.Biol.”、1997年、272卷、573-590页，以及RCSB蛋白质数据库的PDB code：2SPZ)。
在图2的调整中示出了Z区域的序列、以及所定义的α螺旋结构的归属。“*”为α螺旋，“n”为在各区域中所保存的螺旋的N帽，“c”为在各区域中所保存的螺旋的C帽。
如上所述，在将未形成特定的二级结构的N末端侧/C末端侧的序列考虑为区域的N末端区域/C末端区域的情况下，蛋白质A的免疫球蛋白G结合区域的N末端区域优选为对应于C区域的1位～6位的氨基酸残基(E、D区域的长度不同)，更优选为对应于C区域的1位～5位的氨基酸残基。
同样地，蛋白质A的免疫球蛋白G结合区域的C末端区域优选为对应于C区域的55位～58位的氨基酸残基，更优选为对应于57位～58位的氨基酸残基。
若从其它的观点考虑示出本发明中的实施方式，则本发明的蛋白质在区域连接而成的蛋白质(多区域体)中，本发明的蛋白质在各区域的除N末端区域/C末端区域以外的区域内部的区域中不含成为在载体上的固定点的氨基酸残基。本发明的蛋白质在除蛋白质中的区域的内部区域以外的区域中，含有至少1个成为在载体上的固定点的氨基酸残基。
导入本发明的突变前的区域的氨基酸序列优选为SEQ ID NO:1～5中的任一氨基酸序列、或对SEQ ID NO:1～5中的任一氨基酸序列中导入了以下(1)～(4)中的至少1个突变而成的氨基酸序列。
(1)与各区域中C区域的29位对应的氨基酸残基为Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser、Asp、Glu、Arg、His或Met中的任一者、
(2)与各区域中C区域的33位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、His或Met中的任一者、
(3)与各区域中C区域的36位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His或Met中的任一者、
(4)与各区域中C区域的37位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His或Met中的任一者。
而且，更优选为导入了符合以下(5)～(8)中至少1个条件的氨基酸残基取代而成的氨基酸序列。
(5)与各区域中C区域的29位对应的氨基酸残基为Ala、Glu或Arg中的任一者、
(6)与各区域中C区域的33位对应的氨基酸残基为Leu、Thr或Glu中的任一者、
(7)与各区域中C区域的36位对应的氨基酸残基为Ile或Arg中的任一者、
(8)与各区域中C区域的37位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Glu、Arg或His中的任一者。
在本发明的蛋白质中，优选保持了90％以上，更优选保持了95％以上的如下所示的20个氨基酸残基。
例如在Gln-9、Gln-10、Phe-13、Tyr-14、Leu-17、Pro-20、Asn-21、Leu-22、Gln-26、Arg-27、Phe-30、Ile-31、Leu-34、Pro-38、Ser-39、Leu-45、Leu-51、Asn-52、Gln-55、Pro-57(残基号对应于C区域)中，优选保持了90％以上。同时，作为整体的序列同一性优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上，进而更优选为95％以上。
本发明利用上述的蛋白质作为亲和配体，也包含将该配体固定在由非水溶性基材制成的载体上而得到的亲和分离基质作为实施方式之一。
作为用于本发明的由非水溶性基材制成的载体，可以举出：玻璃珠、硅胶等无机载体；交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子，结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等由多糖类构成的有机载体；以及通过这些的组合而得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等。作为市售品，可以例示：作为多孔纤维素凝胶的GCL2000、将烯丙基葡聚糖和亚甲基双丙烯酰胺以共价键交联而成的Sephacryl S-1000、作为丙烯酸酯类载体的Toyopearl、作为琼脂糖类交联载体的Sepharose CL4B、以及作为纤维素类交联载体的Cellufine等。但是，本发明中的非水溶性载体并不仅限定于例示的这些载体。另外，从本亲和分离基质的使用目的及方法考虑，优选用于本发明的非水溶性载体表面积较大，优选为具有多个适当大小的小孔的多孔性。作为载体的形态，可以是珠状、整体柱状、纤维状、膜状(包括中空纤维)等的任意一种，可以选择任意的形态。
在将亲和配体固定在载体上的反应中所用的氨基酸残基为赖氨酸的情况下，配体的固定化方法只要为通过配体中存在的赖氨酸的ε氨基用现有的偶联法与载体共价键合的方法，就没有特别限定。
另外，其结果是，即使一部分的配体通过N末端的α氨基固定在载体上，其也可通过蛋白质的N末端而固定，因此，在本发明的范围内。
作为偶联法，可以举出：使载体与溴化氰、环氧氯丙烷、二缩水甘油醚、对甲苯磺酰氯、三氟乙磺酰氯、肼及高碘酸钠等反应而活化载体(或者在载体表面导入反应性官能团)，与固定为配体的化合物进行偶联反应而固定的方法；以及，在存在载体和固定为配体的化合物的体系中加入碳二亚胺这样的缩合试剂、或如戊二醛的这样在分子中具有多个官能团的试剂进行缩合、交联的固定方法。
在固定在载体上的反应中所用的氨基酸残基为半胱氨酸的情况下，配体的固定方法只要为通过配体中存在的半胱氨酸的巯基用现有的偶联法与载体共价键合的方法，就没有特别限定。
作为偶联法，同样可以举出：使载体与环氧氯丙烷等反应而活化载体，与固定为配体的化合物进行偶联反应的方法等。另外，可以在配体和载体之间导入由多个原子构成的间隔分子，也可以在载体上直接固定配体。
使用了亲和分离基质的靶向分子的纯化法可以依据通常的亲和柱层析纯化法的步骤来实现。例如，在以免疫球蛋白G为靶向分子的情况下，可以依据使用了已经作为市售品存在的蛋白质A柱的亲和柱层析纯化法的步骤来实现(非专利文献3)。
即，制备含有具有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的缓冲液，并使其为中性后，使该溶液通过填充了本发明的亲和分离基质的亲和柱，吸附具有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质。
接着，使适量的纯缓冲液通过亲和柱，清洗柱内部。此时，期望的具有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质吸附在柱内的本发明的亲和分离基质上。
然后，将制备为适当的pH的酸性缓冲液通入柱中，溶出期望的具有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质，由此可实现高纯度的纯化。在靶向分子的溶出中，只要是含有促进靶向分子从该基质上离解的物质的溶液，就不特别限定于酸性缓冲液。
通过将完全不损害配体化合物及载体基材的功能的程度的适当的强酸性或强碱性纯缓冲液(也有适当的修饰剂或含有有机溶剂的溶液的情况)通过本发明的亲和分离基质并进行清洗，可以进行再利用。
本发明另外涉及一种具有编码上述蛋白质的碱基序列的DNA。只要该编码蛋白质的碱基序列满足其碱基序列翻译成的氨基酸序列是构成该蛋白质的序列即可。具有这样的碱基序列的DNA可利用通常所使用的公知的方法，例如聚合酶链式反应(以下简称为PCR)法来获得。
另外，上述DNA也能够用公知的化学合成法合成，而且，也可以由DNA文库得到。该碱基序列的密码子可以由简并密码子取代，只要在翻译时编码同一氨基酸，就不需要与原本的碱基序列相同。可以使用具有1个或1个以上该碱基序列的重组DNA、或者该重组DNA为质粒或噬菌体的重组DNA、以及通过具有该DNA的载体转化而成的转化微生物/细胞、或者导入了该DNA的基因修饰生物、或者以该DNA为转录模板DNA的无细胞蛋白质合成体系来得到。
另外，可以获得本发明的蛋白质与公知的蛋白质的融合蛋白质，所述公知的蛋白质使辅助蛋白质表达的作用或纯化变得容易。即，可以得到含有至少一个编码含有本发明的蛋白质的融合蛋白质的重组DNA的微生物或细胞。作为该蛋白质的例子，可以举出：麦芽糖结合蛋白质(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等，但并不限定于这些蛋白质。
用于修饰编码本发明蛋白质的DNA的位点特异性突变的导入可以如下使用重组DNA技术、PCR法等进行。
即，利用重组DNA技术的突变的导入可以通过如下方法进行，例如，在编码本发明的蛋白质的基因中，希望导入突变的目标部位的两侧存在适当的限制酶识别序列的情况下，将这些限制酶识别序列部分用上述限制酶切断，除去含有希望导入突变的部位的区域后，通过化学合成等仅在目标部位插入导入突变的DNA片段的盒式突变法。
另外，利用PCR的位点特异性突变的导入可以通过如下方法进行，例如以编码蛋白质的双链质粒为模板，使用在+及－链中含有互补性突变的2种合成寡聚引物进行PCR的双引物法。
另外，也可以通过仅将想要的数量的编码本发明的单体蛋白质(1个区域)的DNA串联来制备编码多聚体蛋白质的DNA。例如编码多聚体蛋白质的DNA的连接方法如下：可以在DNA序列中导入适当的限制酶位点，将用限制酶片段化了的双链DNA用DNA连接酶进行连接。限制酶位点可以为1种，也可以导入多个不同种类的限制酶位点。
制备编码多聚体蛋白质的DNA的方法不限于这些连接的方法。例如，也可以通过在编码蛋白质A的DNA(例如，国际公开第WO06/004067号公报)中应用上述的导入突变法来制备。另外，在编码多聚体蛋白质的DNA中，在编码各单体蛋白质的碱基序列相同的情况下，由于可在宿主中诱发同源重组，因此，所连接的编码单体蛋白质的DNA的碱基序列间的序列同一性优选为90％以下，更优选为85％以下。
本发明的“表达载体”含有编码上述蛋白质或其部分氨基酸序列的碱基序列、以及可以在与其碱基序列可动连接的宿主中起作用的启动子。通常可以通过将编码上述的蛋白质的基因与适当的载体连接或者插入适当的载体来得到，用于插入基因的载体只要为能在宿主中自主复制的载体就没有特别限定，可以将质粒DNA、噬菌体DNA用作载体。
例如在将大肠杆菌用作宿主的情况下，可以举出：pQE系载体(Qiagen公司制)、pET系载体(Merck公司制)及pGEX系载体(GE Healthcare Bioscience公司制)等载体。
作为对短芽孢杆菌属细菌的基因的表达有用的质粒载体，例如可以举出：作为枯草杆菌载体公知的pUB110或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)、或作为大肠杆菌和短芽孢杆菌属细菌的穿梭载体的pNCMO2(日本特开2002-238569号公报)等。
本发明的转化体可以通过向作为宿主的细胞导入本发明的重组载体来得到。作为向宿主导入重组体DNA的方法，例如可以举出：使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法、土壤杆菌感染法、基因枪法或聚乙二醇法等，但并不限定于此。
另外，作为在宿主中表达得到的基因的功能的方法，也可以举出将本发明中得到的基因插入基因组(染色体)的方法等。
成为宿主的细胞并没有特别限定，从廉价地大量生产的方面考虑，可优选使用大肠杆菌、枯草杆菌、短芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)等细菌(真细菌)。作为短芽孢杆菌属细菌，可以举出桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)。
本发明的蛋白质可以通过在培养基中培养上述的转化体，使本发明的蛋白质在培养菌体中(菌体周质区域中也含有)或培养液中(菌体外)生成累积，从该培养物中采集期望的蛋白质来制造。
另外，本发明的蛋白质可以通过在培养基中培养上述的转化体，使含有本发明的蛋白质的融合蛋白质在培养菌体中(菌体周质区域中也含有)或培养液中(菌体外)生成累积，从该培养物中采集该融合蛋白质，并由适当的蛋白酶切断该融合蛋白质，采集期望的蛋白质来制造。
在培养基中培养本发明的转化体的方法可按照宿主的培养中所使用的通常的方法进行。用于培养得到的转化体的培养基只要是能够以高效率、高产量生产该蛋白质的，就没有特别限制。具体而言，可以使用葡萄糖、蔗糖、甘油、聚胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白氨基酸等碳源、氮源。
此外，可根据需要添加钾盐、钠盐、磷酸盐、镁盐、锰盐、锌盐、铁盐等无机盐类。在使用营养缺陷性的宿主细胞的情况下，只要添加繁殖所需求的营养物质即可。另外，如果需要，可以添加青霉素、红霉素、氯霉素、新霉素等抗生素。
而且，为了抑制由于来源于菌体内外存在的宿主的蛋白酶导致的该目标蛋白质的分解、低分子化，可以以适当的浓度添加公知的各种蛋白酶抑制剂，即苯甲基磺酰氟(PMSF)、苯甲脒、4-(2-氨乙基)-苯磺酰氟(AEBSF)、抗蛋白酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽、抑胃酶肽A、膦酰二肽、抑酶肽、乙二胺四乙酸(EDTA)、和/或其它市售的蛋白酶抑制剂。
另外，为了使本发明的蛋白质正确地折叠，例如可以利用GroEL/ES、Hsp70/DnaK、Hsp90、Hsp104/ClpB等分子伴侣(例如用共表达或融合蛋白质化等方法使其与本发明的蛋白质共存)。需要说明的是，在以本发明的蛋白质的正确的折叠为目的的情况下，也有在培养基中添加促进正确折叠的添加剂、以及在低温下培养等方法，但并不限定于这些方法。
作为培养以大肠杆菌为宿主得到的转化体的培养基，可以举出：LB培养基(胰化蛋白胨1％、酵母提取物0.5％、NaCl 1％)或2xYT培养基(胰化蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％)等。
作为培养以短芽孢杆菌属细菌为宿主得到的转化体的培养基，可以举出：TM培养基(蛋白胨1％、肉提取物0.5％、酵母提取物0.2％、葡萄糖1％、pH 7.0)或2SL培养基(蛋白胨4％、酵母提取物0.5％、葡萄糖2％、pH 7.2)等。
另外，在培养温度为15～42℃、优选为20～37℃下，在通气搅拌条件下有氧培养数小时～数天，由此使本发明的蛋白质在培养细胞内(包括周质区域内)或培养溶液(细胞外)中累积而回收。可以根据情况停止通气进行厌氧培养。
在分泌生产有重组蛋白质的情况下，培养结束后，可以通过用离心分离、过滤等通常的分离方法分离培养细胞与含有所分泌生产的蛋白质的上清液来回收所生产的重组蛋白质。
另外，在累积在培养细胞内(包括周质区域内)的情况下，也可以通过例如利用离心分离、过滤等方法从培养液中采集菌体，然后，将该菌体利用超声波破碎法、弗氏细胞压碎器法等破碎，和/或添加表面活性剂等进行增溶来回收细胞内所累积生产的蛋白质。
本发明的蛋白质的纯化可以通过亲和层析、阳离子或阴离子交换层析、凝胶过滤层析等单独进行，或将其适当组合来进行。
对得到的纯化物质是否为目标蛋白质的确认可以通过通常的方法来进行，例如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、N末端氨基酸序列分析、蛋白质印迹法等。
实施例
下面，基于实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例中获得的各种蛋白质以“表示区域的字母-导入的突变(在野生型中为Wild)”的形式记载。
例如，蛋白质A的野生型C区域以“C-wild”这样的形式记载，导入了突变G29E的C区域突变体以“C-G29E”这样的形式记载。同时导入了2种突变的突变体使用斜线表示。
例如，导入了突变G29E及突变S13L的C区域突变体以“C-G29E/S13L”这样的形式记载。另外，对连接多个单区域而成的蛋白质而言，加上句点，在连接的数量处加上“d”来表示。
例如，将5个导入了突变G29E及突变S13L的C区域突变体连接而成的蛋白质记载为“C-G29E/S13L.5d”。
[实施例1]
配体表达质粒的制备
以将除C末端的Lys-58以外的Lys残基取代为其它的氨基酸而成的蛋白质A的C区域突变体(C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.1d、SEQ ID NO:7)为基础，设计亲和配体。在本实施例中，将连接5个该区域而成的C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.5d(SEQ ID NO:8)、连接4个而成的C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.4d(SEQ ID NO:9)、以及仅将位于连接而成的4个C末端侧的区域的Lys-58取代为Arg而成的SEQ ID NO:9的单残基突变体C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R(C末K58R).4d(SEQ ID NO:10)用作亲和配体，按以下的步骤制备该表达质粒。
将编码C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.5d，且在5’末端赋予NcoI识别位点、在3’末端赋予XbaI识别位点的DNA(SEQ ID NO:11)通过外包来进行全合成(Eurogentec公司)。将其亚克隆到表达质粒(pUC57)中，然后用限制酶(NcoI及XbaI：均为Takarabio公司制)消化而获得编码C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.5d的DNA，并将其与短芽孢杆菌表达用载体pNK3260’连接，从而制备了含插入到短芽孢杆菌表达用载体pNK3260’中的编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的DNA的表达质粒。
另外，以含编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的DNA的载体pNK3260’为模板，通过使用了SEQ ID NO:12和13的寡核苷酸引物(通过外包合成，Sigma-Aldrich Japan株式会社)的PCR，合成编码C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.4d的DNA(SEQ ID NO:14、含有NcoI/XbaI位点)，用限制酶(NcoI及XbaI)消化后，与pNK3260’连接。
同样地，以含编码SEQ ID NO:8的氨基酸序列的DNA的载体pNK3260’为模板，通过使用了SEQ ID NO:12及15的寡核苷酸引物的PCR，合成编码C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R(C末K58R).4d的DNA(SEQ ID NO:16、含有NcoI/XbaI位点)，用限制酶(NcoI及XbaI)消化后，与pNK3260’连接。
按照TOYOBO公司的实验方案实施了使用DNA聚合酶的Blend Taq(TOYOBO公司制)的PCR、以及使用了Ligation high ver.2(TOYOBO公司制)的连接反应。利用限制酶的消化反应按照Takarabio公司的实验方案实施。
最终，分别制备了将编码SEQ ID NO:8～10的氨基酸序列的DNA插入到短芽孢杆菌表达用载体pNK3260’中的表达质粒。
NK3260’是对公知的短芽孢杆菌表达载体(国际公开第06/004067号小册子)进行了突变处理而成的载体，使得想表达的蛋白质编码DNA能在NcoI/XbaI位点插入。
另外，以含与上述突变的种类的一部分不同的蛋白质A的C区域突变体(C-K04R/K07R/G29A/S33L/K35R/K42R/K49R/K50R.1d、SEQ ID NO:17)为基础，用同样的方法制备了其中连接了3个这样的区域的C-K04R/K07R/G29A/S33L/K35R/K42R/K49R/K50R.3d(SEQ ID NO:18)的表达质粒。编码SEQID NO:18的氨基酸序列的DNA与上述同样地通过外包进行全合成(Eurogentec公司)，含有NcoI/XbaI位点的编码部分的DNA序列如SEQ ID NO:19所示。
[实施例2]
配体的表达和纯化
利用实施例1中得到的表达质粒转化桥石短芽孢杆菌FY-1株。转化以利用公知的电穿孔法实施(“Biosci.Biotech.Biochem.”，1997年，61号，202-203页)。需要说明的是，桥石短芽孢杆菌FY-1株为对桥石短芽孢杆菌HPD31-OK株(日本特开平6-296485号公报)进行突变处理而得到的Phe和Tyr营养缺陷型菌株。
将桥石短芽孢杆菌FY-1重组菌用含有60μg/mL新霉素的5mL的3YC培养基(聚胨3％、酵母提取物0.2％、葡萄糖3％、硫酸镁0.01％、硫酸铁0.001％、氯化锰0.001％、氯化锌0.0001％)在30℃下震荡培养，持续3天。
对培养物进行离心处理，分离菌体，通过使用了SP Fast Flow柱(GE Healthcare·Japan公司制)的阳离子交换层析从得到的培养上清液中纯化(粗纯化)目标蛋白质。具体而言，添加醋酸钠使其最终浓度为50mM，再将用盐酸调整为pH4.0的培养上清液添加到用阳离子交换用缓冲液A(50mM CH3COOH-CH3COONa，pH4.0)平衡化了的SP Fast Flow柱中。用阳离子交换用缓冲液A洗涤后，洗脱目标蛋白质并利用阳离子交换缓冲液A和阳离子交换缓冲液B(50mM CH3COOH-CH3COONa，1M NaCl，pH4.0)的盐浓度梯度洗脱程序分离。
然后，通过使用了HiTrap Q柱(GE Healthcare Bioscience公司制)的阴离子交换层析纯化目标蛋白质。具体而言，利用超纯水将分离的目标蛋白质溶液透析，添加到用阴离子交换用缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH8.0)平衡化了的HiTrap Q柱中，用阴离子交换用缓冲液A洗涤后，洗脱目标蛋白质并利用阴离子交换缓冲液A和阴离子交换缓冲液B(50mM Tris-HCl，1M NaCl，pH8.0)的盐浓度梯度洗脱程序分离。
利用超纯水透析分离的目标蛋白质溶液，将透析后的水溶液用作最终纯化样品。需要说明的是，通过使用了柱的层析法进行的蛋白质纯化，全部使用AKTAprime plus系统(GE Healthcare Bioscience公司制)来实施。
[实施例3]
配体对人免疫球蛋白的亲和性的分析
使用利用了表面等离子体共振的生物传感器Biacore 3000(GE HealthcareBioscience公司制)来分析实施例2中获得的配体与免疫球蛋白的亲和性。将从人血浆中分级分离的人免疫球蛋白G制剂(以下，记为人IgG)固定在传感器芯片上，使实施例2中获得的配体流到芯片上，检测两者的相互作用。
人IgG在传感器芯片CM5上的固定以使用了N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)的胺偶联法进行，在封闭中使用乙醇胺(传感器芯片及固定用试剂全部为GE Healthcare Bioscience公司制)。
用固定用缓冲液(10mM CH3COOH-CH3COONa、pH4.5)稀释作为人IgG市售的Gammagard(Baxter公司)，使配体的最终浓度为50μg/mL左右，按照Biacore 3000附带的实验方案将人IgG固定在传感器芯片上。另外，对芯片上的其它流动池进行在利用EDC/NHS活化后固定乙醇胺的处理，由此也准备了成为阴性对照的参考池。
配体溶液使用由运行缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4、150mM NaCl、0.005％P-20、pH7.4)将其稀释至16、32、64和128nM的溶液。将各配体溶液以流速40μL/min经2.5分钟注射到传感器芯片中。在测定温度25℃下，依次对注射过程中(结合相、2.5分钟)及注射后(离解相、2.5分钟)的结合反应曲线进行观测。在各观测结束后，依次添加0.1M Gly(pH2.5)及20mM NaOH各0.5分钟，对传感器芯片进行再生。
该操作的目的在于除去残留在传感器芯片上的注射蛋白质，确认固定的人IgG的结合活性基本完全恢复。对得到的传感图(减去了参考池的结合反应曲线的传感图)，通过使用了系统附带软件BIA evaluation的1:1的结合模型进行拟合分析，算出配体对人IgG的亲和常数(KA＝kon/koff)。
如表1所示，各种多区域型C区域突变体对人IgG的亲和常数KA(M-1)为109。这与例如公知的5区域型配体C-G29A/S33E.5d(比较例1)为同等程度。本发明是提高固定时的靶向分子的结合“容量”的技术，重要的是对靶向分子在分子水平的结合“力”大致相同，因此本结果可以认为是显示本发明的有效性的数据。
[表1]
*1为比较例1中获得的蛋白质。
[实施例4]
具有固定在载体上的配体的亲和分离基质的试制
利用偶联目标官能团为氨基的市售的配体固定化用偶联柱，制作固定了实施例2中得到的配体的亲和分离基质。
使用市售的预填充柱“Hitrap NHS activated HP”1mL(GE Healthcare Bioscience公司制)作为非水溶性基材。该柱以交联琼脂糖为基础，导入了偶联目标官能团为氨基的蛋白性配体固定化用的活性基团，因此按照产品手册固定配体。以流速1mL/min流入2mL的在冰浴中冷却了的1mM HCl，重复3次该操作以除去柱中的异丙醇。
然后，立刻以相同的流速添加用偶联缓冲液(0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3)稀释配体而成的溶液1mL，密封柱的顶部和底部，在25℃下静置30分钟，由此将获得的配体固定在柱上。
然后，打开柱，以相同的流速流入3mL的偶联缓冲液，回收未反应的配体。然后，流入2mL的封闭缓冲液(0.5M乙醇胺、0.5M NaCl、pH8.3)，实施3次该操作，再流入2mL的洗涤用缓冲液(0.1M Acetate、0.5M NaCl、pH4.0)，实施3次该操作。
流入封闭用缓冲液和洗涤用缓冲液的一系列的操作各交替进行3次。最后，流入2mL的标准缓冲液(20mM NaH2PO4-Na2HPO4、150mM NaCl、pH7.4)而完成亲和分离柱的制作。
固定反应中被取代的NHS在280nm处具有吸收。使用脱盐柱HiTrap Desalting 5mL(GE Healthcare Bioscience公司制)除去NHS，仅对未反应配体在280nm处的吸光度(Abs280)进行测定，算出固定化收率。可以通过利用HiTrapDesalting分离分子量为5,000以上的成分(在此为配体)和分子量为1,000以下的成分(被取代的NHS)。
将500μL未反应的配体通过HiTrap Desalting 5mL柱，添加1mL的偶联缓冲液后，再添加1.5mL的偶联缓冲液，回收此时的洗脱液1.5mL，测定280nm处的吸光度。使用通过在HPLC及双缩脲法的研究中事先推导出的算式(在Abs280＝0.484时为1mg/mL)算出浓度。
将配体稀释溶液的浓度(装入量)、配体固定化量及固定化收率示于表2。
例如，在C-K04R/K07R/G29A/S33L/K35R/K42R/K49R/K50R.3d(SEQ IDNO:18)的情况下，将在配体中的2个区域间接头区域及C末端的各1个赖氨酸残基的侧链的氨基用于固定，以基本如图1的(4)所示的方式固定到基质上。需要说明的是，无法否定通过配体的N末端的氨基酸的氨基进行固定的可能性，但从反应性的观点考虑，该可能性较低。在以微小的比例通过N末端的氨基酸固定的情况下，也如图1的(6)所示的方式固定，因此推测在本发明中得到的效果上没有不同。另外，虽然区域的数目不同，但是5区域型的C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.5d(SEQ ID NO:8)、以及4区域型的C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R.4d(SEQ ID NO:9)也以同样的方式、即图1的(4)的方式固定。另外，从SEQ ID NO:9中仅去掉C末的Lys而成的C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R(C末K58R).4d(SEQ ID NO:10)以图1的(7)的方式固定。
[表2]
[实施例5]
试制亲和分离基质的人IgG结合容量的评价
为了对试制亲和分离基质的人IgG结合容量进行评价，进行了利用亲和层析实验的抗体dBC测定。
将丙种球蛋白(Nichiyaku公司制)以标准缓冲液(100mM NaH2PO4-Na2HPO4、138mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)稀释到150倍并调整成1mg/mL的浓度而成的溶液用作人IgG。
另外，通过层析系统AKTAexplorer 100(GE Healthcare Bioscience公司制)的测定池预先测定该溶液100％通过时的Abs280(100％Abs280)。需要说明的是，HiTrap NHS Activated HP(1mL)为(0.96mL)，因此，在一系列的操作中将1mL视为1CV。
在层析系统AKTAexplorer 100上连接试制亲和分离基质，以流速1.0mL/min流入5CV的标准缓冲液(100mM NaH2PO4-Na2HPO4、138mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)进行平衡化。接着，以流速0.2mL/min(31cm/h)流入人IgG溶液，持续至监测吸光度超过100％Abs280的5％为止。然后，以流速1.0mL/min流入5CV的标准缓冲液，接着，流入3CV的溶出缓冲液(35mM Acetate、pH3.5)，溶出人IgG。将至监测吸光度超过100％Abs280的5％为止时流入的人IgG的总量作为抗体dBC(抗体5％dBC)。
将试制的5区域型的亲和分离基质的评价结果示于表3。
[表3]
另外，将表3的结果以横轴为固定化量、纵轴为抗体dBC描绘出的图表示于图3。
确认到相对于比较例1中得到的亲和分离基质，通过本发明得到的亲和分离基质在基本同等的配体固定化量中显示出明显较高的抗体dBC。从将不同的2种配体的抗体dBC在3个不同的固定化量点进行比较的图3的曲线的倾向考虑，可以说在载体固定化时，按图1(4)所示的方式固定配体的本发明的亲和分离基质与如图1(1)所示的方式固定的情况相比，明显地显示出抗体dBC较高的倾向。
将试制的4区域型的亲和分离基质的评价结果示于表4。
[表4]
可知，通过本发明得到的例如按图1(7)的形式固定了配体的亲和分离基质显示出与按图1(4)的形式固定了配体的亲和分离基质同等程度的抗体dBC。
也就是说，在图1(4)～(7)的任一形式中均可期待前面所示出的提高抗体dBC的效果，理论上在(4)～(15)的任一形式中均可期待同样的效果。另外也可知，即使区域数改变也可看到相同的效果。
将试制的3区域型的亲和分离基质的评价结果示于表5。
[表5]
相对于比较例2中得到的亲和分离基质，通过本发明得到的亲和分离基质在基本同等的配体固定化量中明显显示出较高的抗体dBC。本数据可以说是如下情况的一个例子，即，本发明中得到的亲和分离基质与按图1(2)的形式固定了配体的亲和分离基质相比，明显显示出较高的抗体dBC。
另外可知，即使区域数及序列改变，只要具有区域的抗体结合功能就可表现出相同的效果。
[比较例1]
C-G29A/S33E.5d
在固定到载体上时，获得按图1(1)的形式固定的5区域型的配体作为参照用配体，制备固定了该配体的亲和分离基质。
C-G29A/S33E.5d(SEQ ID NO:20)的表达质粒的制备方法依据公开专利文献(国际公开第2010/110288号公报)的记载。编码DNA的序列如SEQ IDNO:21所示，例如通过全合成本序列的DNA，插入到市售的短芽孢杆菌表达用质粒(例如pNCMO2、Takarabio公司制)中也可容易地制备表达质粒。
配体的表达和纯化按实施例2中记载的方法实施。按实施例3中记载的方法，同样地测定获得的配体对人IgG的亲和性，结果记载于表1。按实施例4中记载的方法制备固定了获得的配体的亲和分离基质，按实施例5中记载的方法测定抗体dBC，将结果记载于表3及图3。
[比较例2]
C-K04R/K07R/G29A/S33L/K35R/K42R/K49R/K50R/(C末以外K58R).3d
在固定到载体上时，获得按图1(2)的形式固定的3区域型的配体作为参照用配体，制备固定了该配体的亲和分离基质。
将编码C-K04R/K07R/G29A/S33L/K35R/K42R/K49R/K50R/(C末以外K58R).3d(SEQ ID NO:22)，在5’末端赋予NcoI识别位点、在3’末端赋予XbaI识别位点而成的DNA(SEQ ID NO:23)通过外包进行全合成(Eurogentec公司)。
本配体仅通过第3个区域的Lys-58(配体序列的C末端)固定于载体。利用其DNA的表达质粒按实施例1中记载的方法制备，按实施例2中记载的方法对配体进行表达/纯化。按实施例3中记载的方法测定获得的配体对人IgG的亲和性，将其亲和常数(KA)示于表5。另外，按实施例4中记载的方法将获得的配体固定于载体而制备亲和分离基质，将按实施例5中记载的方法求出抗体dBC的结果记载于表5。
[实施例6]
基质用纤维素珠的制作
(1)纤维素分散液B的制作
将旭化成株式会社制的纤维素PH-F20JP(中值粒径：21μm)76g与蒸馏水800g混合，一边搅拌一边调整为4℃。然后，一边保持设定温度和搅拌，一边投入调整为4℃的碱性水溶液A400g，搅拌30分钟。
(2)多孔纤维素珠的制作
将调整为4℃的纤维素分散液B1276g、调整为4℃的邻二氯苯7801g、调整为4℃的山梨糖醇单油酸酯(相当于span80的产品)78g混合，在安装了2个圆盘式涡轮(Rushton turbine)叶片的不锈钢容器内，以460rpm(Pv值：5.0kW/m3)在4℃下搅拌15分钟，制作乳液。一边保持设定温度和搅拌，一边加入调整为4℃的甲醇592g作为凝固溶剂。另外，凝固溶剂的添加所需时间为5秒钟。然后，一边保持搅拌数和设定温度，一边搅拌30分钟。进行加压过滤后，使用甲醇3000g作为洗涤液进行洗涤，接着，用3000g的水进行洗涤，得到多孔纤维素珠。得到多孔纤维素珠。得到的多孔纤维素珠使用38μm和90μm的筛子进行湿法分级。
(3)交联
在上述多孔纤维素珠20体积份中加入蒸馏水至30体积份，移至反应容器。在其中投入含有甘油聚缩水甘油醚的Denacol EX-314(Nagase ChemteX公司制)2.3重量份作为交联剂，一边调整为40℃一边继续搅拌。调整为40℃后，搅拌30分钟。接着，准备2N NaOH水溶液7.1体积份，每1小时加入1/4。其间，将温度保持在40℃，并继续搅拌。添加最后的1/4量后，在同一温度下搅拌1小时。反应结束后，一边进行抽滤，一边用珠的20倍体积量以上的蒸馏水洗涤，得到1次交联珠。
将得到的1次交联珠移入容器，加入蒸馏水，将总量设为交联多孔纤维素珠的10倍体积量，使用高压反应釜，在120℃下加热1小时。放冷至室温后，用珠的5倍体积量以上的RO水洗涤，得到环氧基变为甘油基的热压处理后的1次交联珠。
然后，在该热压处理后的1次交联珠20体积份中加入蒸馏水至30体积份，移入反应容器。在其中投入含有甘油聚缩水甘油醚的Denacol EX-314 2.3重量份作为交联剂，一边调整为40℃一边继续搅拌。调整为40℃后，搅拌30分钟。接着，准备2N NaOH水溶液7.1体积份，每1小时加入1/4。其间，将温度保持在40℃，并继续搅拌。添加最后的1/4量后，在同一温度下搅拌1小时。反应结束后，一边进行抽滤，一边用珠的20倍体积量以上的蒸馏水洗涤，得到2次交联珠。
将得到的2次交联珠移入容器，加入蒸馏水，将总量设为交联多孔纤维素珠的10倍体积量，使用高压反应釜，在120℃下加热60分钟。放冷至室温后，用珠的5倍体积量以上的蒸馏水洗涤，得到热压处理后的2次交联珠。
[实施例7]
将配体固定在纤维素珠上的亲和分离基质试制例
将实施例6中得到的交联多孔纤维素珠3.5mL放入离心管中，加入RO水，将总量设为6mL。将其在25℃下安装在混合旋转器MR-3(AS ONE公司制)上后进行搅拌。接着，加入将高碘酸钠(和光纯药工业株式会社制)溶解于RO水而成的11.16mg/mL的高碘酸钠水溶液2.0mL，在25℃下搅拌1小时。反应后，在玻璃过滤器(Sibata Scientific Technology公司制11GP100)上，以RO水洗涤至滤液的电导率为1μS/cm以下，得到含甲酰基的交联多孔纤维素珠。洗涤滤液的电导率用电导率仪ECTester10 Pure+(EUTECH INSTRUMENTS公司制)测定。
在玻璃过滤器(Sibata Scientific Technology公司制11GP100)上，将得到的含有甲酰基的交联多孔纤维素珠3.5mL用pH12的0.6M柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业株式会社制柠檬酸三钠二水合物、氢氧化钠、RO水制备)置换。将置换后的含甲酰基的交联多孔纤维素珠使用柠檬酸缓冲液移入离心管，并调整液量使总体积量为7.5mL。在其中加入实施例2中得到的配体溶液后，在6℃下一边使用混合旋转器MR-3搅拌一边反应23小时。
然后，回收反应液(反应液1)，用pH8的0.1M柠檬酸钠水溶液(使用和光纯药工业株式会社制柠檬酸三钠二水合物、RO水制备)置换，在6℃下使用混合旋转器MR-3搅拌4小时。接着，加入5.5重量％浓度的二甲胺硼烷水溶液(用和光纯药工业株式会社制二甲胺硼烷和RO水制备)1.93mL，在6℃下搅拌1小时后，将反应温度升至25℃，在25℃下，一边使用混合旋转器MR-3搅拌一边反应18小时。反应后，回收反应液(反应液2)。对反应液1及2在278nm附近的吸收极大的UV吸光度进行测定，通过从装入的配体量中减去，算出配体固定化量。配体的装入量、配体固定化量及固定化收率示于表6。
[表6]
在玻璃过滤器11GP100(Sibata Scientific Technology公司制)上，将反应后的珠用珠的3倍体积量的RO水洗涤。接着，加入3倍体积量的0.1N柠檬酸一水合物(用关东化学株式会社制柠檬酸一水合物和RO水制备)，在该珠中加入0.1N柠檬酸一水合物，使总量达到30mL以上，放入离心管，在25℃下，一边搅拌30分钟一边进行酸洗涤。酸洗涤后，在玻璃过滤器11GP100上，将珠用珠的3倍体积量的RO水洗涤，接着，加入3倍体积量的0.05M氢氧化钠+1M硫酸钠水溶液。接着，在该珠中加入0.05M氢氧化钠+1M硫酸钠水溶液，使总量达到30mL以上，放入离心管，在室温下，一边搅拌30分钟一边进行碱洗涤。
碱洗涤后，在玻璃过滤器(Sibata Scientific Technology公司制11GP100)上，将珠用珠的20倍体积量的RO水洗涤。接着，加入珠的3倍量的0.1N柠檬酸钠水溶液，确认滤液为中性后，使用RO水洗涤至洗涤滤液的电导率为1μS/cm以下，得到目标亲和分离基质。洗涤滤液的电导率用电导率仪ECTester10 Pure+测定。
[实施例8]
纤维素基的亲和分离基质的人IgG结合容量的评价
为了对实施例7中试制的亲和分离基质的人IgG结合容量进行评价，进行了利用亲和层析实验的抗体dBC测定。
使用AKTAexplorer 100(GE Healthcare Bioscience公司制)作为层析系统，在直径0.5cm、高度15cm的柱上安装22μm的网，分别放入试制亲和分离基质3mL，以线速度450cm/h通入20％乙醇水溶液1小时，得到试制亲和分离基质填充柱。下面与实施例5同样地实施了IgG的动态结合容量的测定。
将试制的纤维素基亲和分离基质的评价结果示于表7。
[表7]
确认了相对于比较例3中得到的亲和分离基质，通过本发明得到的纤维素基亲和分离基质在基本同等的配体固定化量中明显地显示出较高的抗体dBC。因此，可以说通过本发明得到的亲和分离基质不依赖于作为基质基础的基材的种类，显示同样的抗体dBC提高效果。
[实施例9]
配体的泄露量的测定
为了评价配体的泄露量，使用实施例4中得到的亲和分离基质对在该基质中添加人IgG并用酸性溶液溶出后的IgG溶出液中所含的配体的量进行测定。使用AKTAexplorer 100作为层析系统。在级分收集器上固定15ml的采集用管，关于溶出液的采集用管，预先放入了中和液。与实施例5同样地使IgG溶出，回收溶出液。
对溶出液中的IgG量和配体(蛋白质A)量进行测定，求出泄漏到纯化IgG中的配体浓度(泄露量)。关于泄露量，按照文献中记载的ELISA法进行定量(Steindl F.等著，“Journal of Immunological Methods”2000年、235卷、61-69页)。将配体的泄露的定量结果示于表8。
[表8]
确认了通过本发明得到的按图1(4)的形式固定了配体的亲和分离基质与比较例4中得到的按图1(2)中得到的形式固定了配体的亲和分离基质相比，可明显抑制配体的泄露。本发明可以说能够兼具较高的抗体dBC和较低的配体泄露。
[比较例3]
将C-G29A/S33E.5d固定在纤维素珠上而成的亲和分离基质
用以下的方法获得将比较例1中得到的C-G29A/S33E.5d固定在纤维素珠上而成的亲和分离基质。与实施例7同样地制作甲酰化载体，在玻璃过滤器(Sibata Scientific Technology公司制11GP100)上将得到的含甲酰基的交联多孔纤维素珠3.5mL用pH12的0.25M柠檬酸缓冲液(使用和光纯药工业株式会社制柠檬酸三钠二水合物、氢氧化钠、RO水制备)置换。将取代后的含甲酰基的交联多孔纤维素珠放入离心管中，使用pH12的0.25M柠檬酸缓冲液，调整液量使总体积量为7.5mL。在其中加入C-G29A/S33E.5d溶液(66.7mg/mL)0.63g后，在6℃下使用混合旋转器MR-3一边搅拌一边反应23小时。
然后，使用2.4M柠檬酸水(使用和光纯药工业株式会社制柠檬酸一水合物、RO水制备)将反应溶液pH调整为5.0，在6℃下使用混合旋转器MR-3搅拌4小时。然后，与实施例6同样地实施还原和洗涤操作。将配体稀释溶液的浓度(装入量)、配体固定化量及固定化收率记载于表6。用实施例8中记载的方法对亲和分离基质的人IgG结合容量进行测定。将其结果记载于表7。
[比较例4]
将C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R/(C末以外K58R). 5d固定在琼脂糖基载体上而成的亲和分离基质
在固定于载体时，获得按图1(2)的形式所固定的5区域型的配体作为参照用配体，制备固定了该配体而成的亲和分离基质。
用同样的方法制备以蛋白质A的C区域突变体(C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R/K58R.1d、SEQ ID NO:24)为基础，对5个该区域进行连接，且仅在位于C末端侧的区域未对Lys-58导入Arg突变的C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R/(C末以外K58R).5d(SEQ ID NO:25)的表达质粒。编码SEQ ID NO:25的氨基酸序列的DNA与实施例1同样地通过外包进行全合成(Eurogentec公司)，含有NcoI/XbaI位点的编码部分的DNA序列如SEQ ID NO:26所示。用与实施例2同样的方法对C-K04R/K07R/G29A/S33R/K35R/K42R/K49Q/K50R/K58R(C末以外K58R).5d(SEQ IDNO:25)进行表达/纯化，获得配体。用与实施例4同样的方法制作固定该配体而成的亲和分离基质。用配体稀释溶液的浓度(装入量)12.1mg/mL进行制备，其结果是，配体固定化量为9.4mg/mL-gel，固定化收率为77％。按实施例9中记载的方法对配体自亲和分离基质的泄露量进行测定。将其结果记载于表8。

Claims (19)

1.一种蛋白质，其含有2个以上的下述氨基酸序列：
来源于选自蛋白质A的E、D、A、B及C区域中的任一区域、且全部Lys(赖氨酸残基)上都导入了氨基酸取代突变的氨基酸序列，
所述氨基酸序列彼此通过接头连接，且，
至少1个接头含有Lys(赖氨酸残基)或Cys(半胱氨酸残基)。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其中，至少1个接头含有Lys。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其中，导入取代突变前的氨基酸序列为：
序列号1～5中的任一氨基酸序列；或
在序列号1～5中的任一氨基酸序列中导入了下述(1)～(4)中的至少1个突变的氨基酸序列，
(1)与各区域中C区域的29位对应的氨基酸残基为Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Ser、Asp、Glu、Arg、His或Met中的任一者、
(2)与各区域中C区域的33位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Thr、Asp、Glu、Asn、Gln、Arg、His或Met中的任一者、
(3)与各区域中C区域的36位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His或Met中的任一者、
(4)与各区域中C区域的37位对应的氨基酸残基为Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Glu、Arg、His或Met中的任一者。
4.如权利要求1～3中任一项所述的蛋白质，其中，全部Lys中所导入的氨基酸取代突变的半数以上是取代突变为Arg。
5.如权利要求1～4中任一项所述的蛋白质，其中，全部Lys中所导入的氨基酸取代突变全都是取代突变为Arg。
6.如权利要求1～5中任一项所述的蛋白质，其中，在以下所示的氨基酸残基中，90％以上被保持，且与导入突变前的氨基酸序列相比，序列同源性为80％以上：
Gln-9、Gln-10、Phe-13、Tyr-14、Leu-17、Pro-20、Asn-21、Leu-22、Gln-26、Arg-27、Phe-30、Ile-31、Leu-34、Pro-38、Ser-39、Leu-45、Leu-51、Asn-52、Gln-55及Pro-57(残基号对应于C区域)。
7.如权利要求1～6中任一项所述的蛋白质，其中，在至少一侧末端具有Lys或Cys。
8.如权利要求1～7中任一项所述的蛋白质，其中，在至少一侧末端具有Lys。
9.一种DNA，其编码权利要求1～8中任一项所述的蛋白质。
10.一种载体，其含有权利要求9所述的DNA。
11.一种转化体，其是利用权利要求10所述的载体对宿主细胞进行转化而得到的。
12.一种权利要求1～8中任一项所述的蛋白质的制造方法，该方法包括：采用使用了权利要求9所述的DNA或权利要求10所述的载体的无细胞蛋白质合成体系、或者权利要求11所述的转化体。
13.一种亲和分离基质，其通过下述方法得到：
以权利要求1～8中任一项所述的蛋白质为亲和配体，且固定于由非水溶性基材制成的载体上。
14.如权利要求13所述的亲和分离基质，其与含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质结合。
15.如权利要求14所述的亲和分离基质，其中，含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质为免疫球蛋白G或免疫球蛋白G衍生物。
16.权利要求13～15中任一项所述的亲和分离基质的制造方法，该方法包括：以权利要求1～8中任一项所述的蛋白质为亲和配体，且固定于由非水溶性基材制成的载体上。
17.一种含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质的纯化方法，该方法包括：使含有免疫球蛋白的Fc区域的蛋白质吸附在权利要求13～15中任一项所述的亲和分离基质上。
18.一种亲和分离基质的制造方法，该方法包括：将相对于同一靶向分子的2个以上结合区域通过接头连接而得到的亲和配体固定在载体上，
其中，该亲和分离基质的制造方法通过至少1个接头中所含的至少1个氨基酸残基将亲和配体固定在载体上，而不是通过结合区域的核心区域将亲和配体固定在载体上。
19.如权利要求18所述的亲和分离基质的制造方法，该方法还包括：将亲和配体通过N末端区域和/或C末端区域固定在载体上。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107849095A (zh) * 2015-07-22 2018-03-27 株式会社钟化 酸性pH范围内的抗体结合能力降低的抗体结合性蛋白质

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015190458A1 (ja) * 2014-06-09 2015-12-17 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法
US11566082B2 (en) * 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
JP6805831B2 (ja) * 2015-02-05 2020-12-23 三菱ケミカル株式会社 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質、およびそれを用いたアフィニティ分離剤、液体クロマトグラフィー用カラム
EP3253785B1 (en) 2015-02-06 2019-04-10 Navigo Proteins Gmbh Novel egfr binding proteins
CN115160438A (zh) * 2015-04-06 2022-10-11 苏伯多曼有限责任公司 含有从头结合结构域的多肽及其用途
EP3322721B1 (en) 2015-07-16 2021-12-08 Navigo Proteins Gmbh Novel immunoglobulin-binding proteins and their use in affinity purification
CA2991815A1 (en) 2015-07-20 2017-01-26 Navigo Proteins Gmbh Novel binding proteins based on di-ubiquitin muteins and methods for generation
JPWO2017022759A1 (ja) * 2015-08-04 2018-05-31 株式会社カネカ 免疫グロブリン結合性改変型タンパク質
CA3022751A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Navigo Proteins Gmbh Targeted compounds for the site-specific coupling of chemical moieties comprising a peptide linker
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CN109311949B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法
WO2017194593A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
CN109476712B (zh) 2016-08-11 2022-08-02 纳维格蛋白质有限公司 新型对碱稳定的免疫球蛋白结合蛋白
US11084846B2 (en) 2017-03-31 2021-08-10 Hamari Chemicals, Ltd. Method for producing peptide
GB201708277D0 (en) 2017-05-24 2017-07-05 Ge Healthcare A Recombinant protein
WO2019091918A1 (en) 2017-11-07 2019-05-16 Navigo Proteins Gmbh Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
CN112334491A (zh) * 2018-06-29 2021-02-05 国立大学法人京都工艺纤维大学 分离剂
EP3816188B1 (en) * 2018-06-29 2024-03-13 National University Corporation Kyoto Institute of Technology Separating agent
WO2020040307A1 (ja) * 2018-08-24 2020-02-27 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
WO2020129027A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 King Abdullah University Of Science And Technology Sliding clamp-based affinity purification systems, methods of making and use thereof

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0326046A3 (en) 1988-01-25 1990-06-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of human epidermal growth factor
JP3012026B2 (ja) 1991-03-05 2000-02-21 ヒゲタ醤油株式会社 高発現ベクター及び該高発現ベクター を保有する微生物並びに該微生物を 用いる有用物質の製造法
JP3433807B2 (ja) 1992-03-31 2003-08-04 鵜高 重三 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするｄｎａを保有する発現ベクターを組み込んだバチルス・ブレビスを用いる有用物質の製造法
JP2727391B2 (ja) 1992-07-23 1998-03-11 ヒゲタ醤油株式会社 高発現ベクター及び該高発現ベクターを保有する微生物並びに該微生物を用いる有用物質の製造法
JP3739101B2 (ja) 1993-02-22 2006-01-25 株式会社豊田中央研究所 変異バチルス・ブレビス菌
SE9503925D0 (sv) 1995-11-07 1995-11-07 Pharmacia Biotech Ab Separationsmedium för IgG
US6013763A (en) 1996-06-04 2000-01-11 Genentech, Inc. Peptide variants of protein A
JP3753945B2 (ja) 2001-02-14 2006-03-08 ヒゲタ醤油株式会社 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター
US8597908B2 (en) 2004-07-06 2013-12-03 Kaneka Corporation Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium
WO2006062685A2 (en) * 2004-11-11 2006-06-15 Affymax, Inc. Novel peptides that bind to the erythropoietin receptor
JP4179517B2 (ja) 2006-02-21 2008-11-12 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン親和性リガンド
EP1992692B1 (en) 2006-02-21 2013-01-09 Protenova Co., Ltd. Immunoglobulin affinity ligand
JP5004165B2 (ja) * 2006-10-10 2012-08-22 独立行政法人産業技術総合研究所 タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質
JP2008266219A (ja) 2007-04-20 2008-11-06 National Institute Of Advanced Industrial & Technology リジン及びシステイン残基を含まないタンパク質
US8287845B2 (en) * 2008-12-18 2012-10-16 E I Du Pont De Nemours And Company Hair-binding peptides
EP2412809B1 (en) 2009-03-24 2017-08-09 Kaneka Corporation Protein having affinity for immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
AU2011230313B2 (en) 2010-03-24 2015-01-22 Kaneka Corporation Protein capable of binding specifically to immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
US10065995B2 (en) * 2011-03-25 2018-09-04 Kaneka Corporation Protein for affinity-separation matrix
EP2690108B1 (en) * 2011-03-25 2018-07-25 Kaneka Corporation Novel immunoglobulin-binding polypeptide
JP2016217208A (ja) * 2015-05-18 2016-12-22 株式会社デンソー 駆動装置

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107849095A (zh) * 2015-07-22 2018-03-27 株式会社钟化 酸性pH范围内的抗体结合能力降低的抗体结合性蛋白质

Also Published As

Publication number Publication date
EP2899271B1 (en) 2018-07-25
WO2014046278A1 (ja) 2014-03-27
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