KR20170115535A - 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질, 및 그것을 사용한 친화성 분리제, 액체 크로마토그래피용 칼럼 - Google Patents

면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질, 및 그것을 사용한 친화성 분리제, 액체 크로마토그래피용 칼럼 Download PDF

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사토루 미사와
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Abstract

본 발명의 과제는, 세린 프로테아제 또는 서모리신에 내성을 갖고, 면역 글로불린 결합 활성을 갖는, 친화성 리간드로서 적합하게 사용할 수 있는 단백질을 제공하는 데 있다. 본 발명의 일 실시 형태는, 단백질 A의 E, D 및 A 도메인의 아미노산 서열 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 해당 도메인 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질, 또는 단백질 A의 B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 해당 도메인 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, 4위치의 리신 및 C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질이다.

Description

면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질, 및 그것을 사용한 친화성 분리제, 액체 크로마토그래피용 칼럼
본 발명은, 면역 글로불린에 특이적으로 결합하는 단백질, 및 해당 단백질을 면역 글로불린 결합성 친화성 리간드로 하는 친화성 분리제, 나아가 액체 크로마토그래피용 칼럼에 관한 것이다.
항체는, 항원이라고 불리는 물질에 특이적으로 결합하는 기능, 및 다른 생체 분자나 세포와 협동하여 항원성을 갖는 인자를 무독화ㆍ제거하는 기능을 갖는다. 항체라고 하는 이름은, 이러한 항원에 결합한다는 기능을 중시한 이름이며, 물질로서는 「면역 글로불린」이라고 불린다.
근년, 유전자 공학, 단백질 공학 및 세포 공학의 발전에 따라서, 항체 의약이라고 불리는, 항체가 갖는 기능을 이용한 의약품의 개발이 활발히 행해지고 있다. 항체 의약은, 종래의 의약과 비교하여, 표적 분자에 대하여 보다 특이적으로 작용하기 때문에, 부작용을 보다 경감시키며, 또한 높은 치료 효과가 얻어질 것이 기대되고 있으며, 실제로 다양한 병태의 개선에 기여하고 있다.
한편, 항체 의약은, 생체에 대량으로 투여되는 점에서, 다른 재조합 단백질 의약품과 비교한 경우에, 그 순도가 품질에 끼치는 영향은 크다고 여겨지고 있다. 따라서, 순도가 높은 항체를 제조하기 위해서, 항체에 대하여 특이적으로 결합하는 분자를 리간드로 하는 흡착 재료를 이용하는, 친화성 크로마토그래피 등의 방법이 일반적으로 사용되고 있다.
항체 의약으로서 개발되고 있는 것은, 기본적으로 모노클로날 IgG 항체이며, 재조합 배양 세포 기술 등을 사용하여 대량으로 생산되고, IgG 항체에 친화성을 갖는 단백질을 이용하여 정제되고 있다.
IgG 항체에 친화성을 갖는 면역 글로불린 결합성 단백질로서, 단백질 A가 잘 알려져 있다. 단백질 A는, 그람 양성 세균 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의해 생산되는 세포벽 단백질의 1종이며, 시그널 서열 S, 5개의 면역 글로불린 결합성 도메인(E 도메인, D 도메인, A 도메인, B 도메인, C 도메인), 및 세포벽 결합 도메인인 XM 영역으로 구성되어 있다(비특허문헌 1). 항체 의약 제조 공정에 있어서의 초기 정제 공정(캡처 공정)에는, 단백질 A가 리간드로서 수불용성 담체에 고정화된, 친화성 크로마토그래피용 칼럼이 일반적으로 이용되고 있다.
이 친화성 크로마토그래피용 칼럼의 성능을 개량하기 위해서, 근년, 리간드인 단백질 A에 관한 다양한 개발이 이루어지고, 단백질 공학적으로 개변을 가한 재조합 단백질 A를 사용하는 것이 시도되고 있다.
예를 들어, 재조합 단백질 A로서는, 면역 글로불린 결합 활성이 없는 XM 영역을 제거한 단백질 A(r단백질 A 세파로오스(rProtein A Sepharose)(등록 상표), GE 헬스케어 재팬사제)나, 특허문헌 1에 개시되는 B 도메인에 변이를 도입한 개변 도메인인 Z 도메인을 갖는 단백질 A 등이 알려져 있다.
Z 도메인은, B 도메인에 대하여 29위치의 글리신을 알라닌으로 치환하는 변이를 도입한 개변 도메인이며, B 도메인보다도 알칼리 내성이 높은 것이 알려져 있다. 이렇게 리간드 기능 향상을 위해, 알칼리 내성을 높인 재조합 단백질 A나 항체의 약산성 용출을 가능하게 하는 재조합 단백질 A가 개발되어 있다.
특허문헌 2에는, 알칼리 내성을 높이기 위해서, 단백질 A의 C, B, Z 도메인의 N 말단 3 내지 5개의 연속된 아미노산 결실을 포함하는 친화성 크로마토그래피 리간드가 개시되어 있다.
특허문헌 3에는, 알칼리 안정성을 높이기 위해서, 단백질 A의 도메인 C 유닛의 3위치 내지 6위치의 Asn-Lys-Phe-Asn이 결실된 서열을 갖는 친화성 크로마토그래피 리간드가 개시되어 있다.
특허문헌 4에는, 알칼리 내성을 높이기 위해서, 단백질 A의 B, Z 도메인의 3위치와 6위치의 아스파라긴을 다른 아미노산으로 치환한 면역 글로불린 결합 단백질이 개시되어 있다.
특허문헌 5에는, 약산성에서 항체의 이탈을 가능하게 하기 위해서, 단백질 A의 E, D, A, B, C 도메인에 있어서 리신 및 시스테인 잔기를 포함하지 않는 서열로 한 항체 인식 결합 단백질이 개시되어 있다.
미국 특허 제5143844호 명세서 일본 특허 공개 제2012-254981호 공보 일본 특허 공표 제2010-504754호 공보 일본 특허 공표 제2005-538693호 공보 일본 특허 공개 제2013-256484호 공보
Hober S. et. al, J. Chromatogr. B., 2007, Vol.848, p.40-47
본 발명자들의 검토에 의해, 재조합 단백질 A를 제조할 때에 사용하는 숙주 미생물이 생산하는 프로테아제나, 재조합 배양 세포에서 생산된 IgG 항체를 정제할 경우의 배양 세포가 생산하는 프로테아제의 작용에 의해, 리간드인 단백질 A가 절단되어 면역 글로불린 결합 활성이 대폭으로 저하된다는 문제가 있음을 처음으로 알아내었다.
특히, 재조합 단백질 A를 배양액으로부터 정제하는 공정에 있어서 pH를 높게 하여 이온 교환 수지에 흡착 또는 통액시킬 때, 또한 정제 전 또는 정제 후에 농축이나 탈염 등의 공정을 행할 때, 또한 재조합 단백질 A를 고정화한 분리제에 의해 면역 글로불린을 포함하는 배양액으로부터 면역 글로불린을 정제하는 공정을 행할 때, 프로테아제에 의한 절단이 현저하게 문제가 되는 것이 밝혀졌다.
상기 프로테아제 중 하나로 세린 프로테아제가 있다. 특허문헌 1 내지 4에 개시되는 재조합 단백질 A에서는, 세린 프로테아제 내성이 없어, 친화성 크로마토그래피용 칼럼의 리간드로서 사용하는 것에 문제가 있다.
또한, 본 발명자들의 검토에 따르면, 특허문헌 5에 개시되는 리신 및 시스테인을 포함하지 않는 재조합 단백질 A는, 면역 글로불린 결합 활성이 충분하지 않고, 특히 다량체화했을 때에는 야생형에 비해 면역 글로불린 결합 활성이 낮아, 애당초 친화성 크로마토그래피용 칼럼의 리간드로서의 기능을 충분히 수행할 수 없다는 과제가 있음을 새롭게 알아내었다.
또한, 상기 문제를 발생시키는 다른 프로테아제로서는 서모리신이 있다. 서모리신은, 바실루스속 세균 유래의 금속 프로테아제이며, 비교적 온도가 높은 환경이나 pH가 높은 환경에서 활성이 높아진다. 특허문헌 1, 3 내지 5에 개시되는 재조합 단백질 A에서는, 서모리신 내성이 없기 때문에 무손상 형태로 단백질을 회수할 수 없어, 친화성 크로마토그래피용 칼럼의 리간드로서 사용하는 것에 문제가 있다.
또한, 본 발명자들의 검토에 따르면, 특허문헌 2에 개시되는 재조합 단백질 A는, 서모리신 내성이 있는 것을 포함하지만, 면역 글로불린 결합 활성이 저하되어 버려, 애당초 친화성 크로마토그래피용 칼럼의 리간드로서의 기능을 충분히 수행할 수 없다는 과제가 있음을 새롭게 알아내었다.
따라서, 본 발명의 과제는, 프로테아제에 내성을 갖고, 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖는, 친화성 리간드로서 적합하게 사용할 수 있는 단백질을 제공하는 데 있다.
특히, 본 발명의 제1 과제는, 프로테아제 중에서도, 특히 세린 프로테아제에 내성을 갖고, 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖는, 친화성 리간드로서 적합하게 사용할 수 있는 단백질을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 제2 과제는, 프로테아제 중에서도, 특히 서모리신에 내성을 갖고, 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖는, 친화성 리간드로서 적합하게 사용할 수 있는 단백질을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은, 상기 제1 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 행한 결과, 단백질 A의 특정 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 도메인과 도메인을 연결하는 영역에 리신을 포함하지 않는 경우에 세린 프로테아제 내성이 향상되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
또한, 본 발명자들은, 상기 제2 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 행한 결과, 단백질 A의 특정 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 도메인과 도메인을 연결하는 영역에 소수성 아미노산을 포함하지 않는 경우에 서모리신 내성이 향상되는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 상기 과제는 이하의 구성에 의해 달성된다.
[1] 서열 번호 1 내지 3에 기재된 단백질 A의 E, D 및 A 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 해당 도메인 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
[2]-(1) 서열 번호 4 내지 6에 기재된 단백질 A의 B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 해당 도메인 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, 4위치의 리신 및 C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
[2]-(2) 서열 번호 4 내지 6에 기재된 단백질 A의 B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 해당 도메인 중 적어도 1개의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이라 한 경우, 적어도 1개의 해당 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)의 C 말단의 리신 및 4위치의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
[3] 상기 결실 또는 치환되어 있는 4위치의 리신 및 C 말단의 리신 중, 해당 4위치의 리신 및/또는 해당 C 말단의 리신이 결실되어 있는, [1] 또는 [2]에 기재된 단백질.
[4] 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이라 한 경우, 적어도 1개의 해당 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은 1 이상의 아미노산을 포함하는, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[5] 상기 결실 또는 치환되어 있는 4위치의 리신 및 C 말단의 리신 중, 해당 4위치의 리신 및/또는 해당 C 말단의 리신을 친수성 아미노산으로 치환한 것인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[6] 도메인을 3개 이상 갖는, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[7] 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이라 한 경우, 모든 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 있어서, 리신이 결실 또는 치환되어 있는, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[8] 상기 단백질에 포함되는 도메인 모두가, 서열 번호 1 내지 6에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열 중 어느 1종류에서 유래하는, [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[9] 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이라 한 경우, 해당 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은 리신을 포함하지 않는 것인, [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[10] 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이라 한 경우, 해당 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은 아르기닌을 포함하지 않는 것인, [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[11] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 단백질을 친화성 리간드로서, 수불용성 기재를 포함하는 담체에 고정화한 것을 특징으로 하는 친화성 분리제.
[12] [11]에 기재된 친화성 분리제를 포함하고, 적어도 하나의 용기를 구비하는 것을 특징으로 하는 액체 크로마토그래피용 칼럼.
[13] 서열 번호 3 내지 6에 기재된 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)라 한 경우, 적어도 1개의 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)는, 1 이상의 아미노산을 포함하며, 또한 소수성 아미노산 이외의 아미노산에 의해 구성되는 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인 것을 특징으로 하는, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
[14] 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가, A, B 또는 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 1위치의 알라닌 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 결실한 것인, [13]에 기재된 단백질.
[15] 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가, Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 1위치의 발린 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 결실한 것인, [13]에 기재된 단백질.
[16] 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가, A, B 또는 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 1위치의 알라닌 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 것인, [13] 또는 [14]에 기재된 단백질.
[17] 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가, Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 1위치의 발린 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 것인, [13] 또는 [15]에 기재된 단백질.
[18] 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)에서 치환하는 소수성 아미노산 이외의 아미노산이, 친수성 아미노산인, [16] 또는 [17]에 기재된 단백질.
[19] 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가 2 이상의 아미노산을 포함하는, [13] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[20] 도메인을 3개 이상 갖는, [13] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[21] 모든 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인, [13] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[22] 상기 단백질에 포함되는 도메인 모두가, 서열 번호 3 내지 6에 기재된 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열 중 어느 1종류에서 유래하는, [13] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[23] 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단의 리신을 결실 또는 치환한 것인, [13] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[24] C 말단측에 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)를 결합하는 도메인에 있어서, 해당 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단의 리신을 결실 또는 치환한 것인, [23]에 기재된 단백질.
[25] 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는 리신을 포함하지 않는 것인, [13] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[26] 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는 아르기닌을 포함하지 않는 것인, [13] 내지 [25] 중 어느 하나에 기재된 단백질.
[27] [13] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 사용하여, 브레비바실루스속 세균을 형질 전환하고, 배양을 행함으로써 단백질을 제조하는, [13] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 단백질의 제조 방법.
[28] [13] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 단백질을 친화성 리간드로서, 수불용성 기재를 포함하는 담체에 고정화한 것을 특징으로 하는, 친화성 분리제.
[29] [28]에 기재된 친화성 분리제를 포함하고, 적어도 하나의 해당 친화성 분리제가 충전되는 용기를 구비하는 것을 특징으로 하는, 액체 크로마토그래피용 칼럼.
본 발명의 실시 형태에 의해, 특정 프로테아제에 내성을 갖고, 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 단백질을 제공할 수 있다. 이러한 본 발명의 단백질을 사용함으로써, 면역 글로불린 결합 활성이 우수한 친화성 리간드나 내구성이 우수한 친화성 분리제를 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 제1 실시 형태에 의해, 프로테아제, 특히 세린 프로테아제에 내성을 갖고, 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 단백질을 제공할 수 있다. 이러한 본 발명의 단백질을 사용함으로써, 면역 글로불린 결합 활성이 우수한 친화성 리간드나 내구성이 우수한 친화성 분리제를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 제2 실시 형태에 의해, 프로테아제, 특히 서모리신에 내성을 갖고, 면역 글로불린과의 결합 능력을 갖는 단백질을 제공할 수 있다. 이러한 본 발명의 단백질을 사용함으로써, 면역 글로불린과의 결합 능력이 우수한 친화성 리간드나 내구성이 우수한 친화성 분리제를 제조할 수 있다.
도 1은, 스타필로코커스(Staphylococcus)의 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열 비교표이다. 또한, 「-(하이픈)」은 C 도메인의 아미노산 잔기와 동일한 것을 나타내고, 「/(사선)」은 아미노산 결실을 나타낸다.
도 2는, 4량체의 단백질을 리간드로서 담체에 고정화한 경우이며, 비고정화 도메인은 형성되지 않은 경우의 모식도이다.
도 3의 (A) 내지 (C)는, 4량체의 단백질을 리간드로서 담체에 고정화한 경우이며, 비고정화 도메인이 1개 이상 존재하는 경우의 모식도이다.
도 4의 (A), 도 4의 (B)는, 4량체의 단백질을 리간드로서 담체에 고정화한 경우이며, 비고정화 도메인이 1개 이상 존재하는 경우의 모식도이다.
도 5의 (A), 도 5의 (B)는, 4량체의 단백질을 리간드로서 담체에 고정화한 경우이며, 고정화용 태그를 도입하여 담체와의 결합을 형성하고 있고, 모든 도메인이 비고정화 도메인이 되는 경우의 모식도이다.
이하, 본 발명의 실시 형태에 대하여 상세하게 설명한다.
또한, 본 발명의 실시 형태는, 특정 프로테아제에 내성을 갖고, 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 제1 실시 형태는, 프로테아제, 특히 세린 프로테아제에 내성을 갖고, 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖는 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 제2 실시 형태는, 프로테아제, 특히 서모리신에 내성을 갖고, 면역 글로불린과의 결합 능력을 갖는 단백질에 관한 것이다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「단백질」이라는 용어는, 폴리펩티드 구조를 갖는 모든 분자를 포함하는 것이며, 단편화된, 또는 펩티드 결합에 의해 연결된 폴리펩티드쇄도, 「단백질」이라는 용어에 포함된다.
또한, 「도메인」이란, 단백질의 고차 구조상의 단위이며, 수십 내지 수백의 아미노산 잔기 서열로 구성되고, 어떤 물리 화학적 또는 생물 화학적인 기능을 발현하기에 충분한 단백질의 단위를 말한다.
[본 발명의 제1 실시 형태]
<단백질>
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제1 형태의 단백질은, 서열 번호 1 내지 3에 기재된 단백질 A의 E, D 및 A 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖고, 해당 도메인 중 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제2 형태의 단백질은, 서열 번호 4 내지 6에 기재된 단백질 A의 B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖고, 해당 도메인 중 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, 4위치의 리신 및 C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제3 형태의 단백질은, 서열 번호 4 내지 6에 기재된 단백질 A의 B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖고, 해당 도메인 중 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 리신을 포함하고, 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이라 한 경우, 적어도 1개의 해당 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)의 C 말단의 리신 및 4위치의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 명세서에 있어서는, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제1 형태, 제2 형태 및 제3 형태의 단백질을 총칭하여, 본 발명의 제1 실시 형태의 단백질이라 한다.
단백질 A는, 면역 글로불린 결합성 도메인이 5개 연결된 형태로 구성되는 단백질이다. 복수의 미생물이 단백질 A를 발현하지만, 단백질 A를 발현하는 미생물로서, 예를 들어 스타필로코커스(Staphylococcus)를 들 수 있다.
서열 번호 1 내지 6에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인은, 면역 글로불린의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 영역에 결합할 수 있는 면역 글로불린 결합성 단백질이며, 어느 도메인도, 면역 글로불린의 Fc 영역, Fab 영역 및 Fab 영역 중의 특히 Fv 영역의, 각각의 영역에 대하여 결합한다.
도 1의 서열 비교표에 도시한 바와 같이, 단백질 A 유래의, E, D, A, B, C 및 Z 도메인은, 서로 상동성이 높은 아미노산 서열을 갖고 있으며, 60％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖고 있다. 또한, 하이픈(-)은 C 도메인의 아미노산 잔기와 동일한 것을 나타낸다.
「단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인」이란, 야생형의 각 도메인의 아미노산 서열에서 유래하는 아미노산 서열을 갖는 도메인을 가리키고, Fc 영역으로의 결합능을 갖고 있는 단백질을 코딩하는 한, 야생형의 각 도메인의 아미노산 서열에 후술하는 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트) 이외의 변이가 들어 있어도 된다.
즉, 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인의 어느 아미노산 서열은, 변이를 도입하기 전의 아미노산 서열(야생형 아미노산 서열)이며, 「단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인」의 아미노산 서열은 E, D, A, B, C 및 Z 도메인의 야생형 아미노산 서열 그 자체, 또는 야생형 아미노산 서열에 후술하는 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)을 포함하고/포함하거나, 부분적인 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 및 화학 수식에 의해 개변된 것을 가리킨다.
여기서, 단백질 A의 Z 도메인은, B 도메인에 A1V와 G29A라는 변이를 도입하여 얻어진 것이며, 천연 단백질 A에는 존재하지 않는 도메인인데, 본 명세서에 있어서는, 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 Z 도메인의 야생형 아미노산 서열이라고 칭한다.
본 명세서에서는, 아미노산 서열 중의 특정 아미노산의 위치는, 야생형 아미노산 서열의 N 말단을 1위치로 하여 순차로 번호를 붙여 특정한다. 통상, 각 도메인의 아미노산 서열의 N 말단을 1위치라 한다. 단백질 A의 B, C 및 Z 도메인의 N 말단으로부터 4번째의 아미노산인 4위치는 리신이다. 여기서, 도 1에 도시한 대로 E 도메인은, 다른 도메인과 상동성이 높은 영역을 기준으로 하여, 1위치 및 2위치의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 것으로서 취급한다. 또한, 도 1에 도시한 대로 D 도메인은, 다른 도메인과 상동성이 높은 영역을 기준으로 하여, N 말단으로부터 3번째 내지 5번째의 아미노산 잔기가 삽입되어 있는 것으로서 취급한다.
본 명세서 중에서는, 아미노산에 대해서, 그 정식 명칭으로 기재하지 않을 때는, 관용적인 1문자 약호로 나타낸다. 또한, 아미노산을 치환하는 변이의 표기에 대해서, 치환 위치의 번호 앞에, 야생형 또는 비변이형의 아미노산을 붙이고, 치환 위치의 번호 뒤에, 변이된 아미노산을 붙여 표기한다. 예를 들어, 29위치의 글리신(Gly)을 알라닌(Ala)으로 치환하는 변이는, G29A라고 기재한다.
본 발명의 제1 실시 형태의 단백질은, 상술한 「단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인」을 단일 도메인으로서 2개 이상 갖는 다량체 단백질(복 도메인형 단백질)이다. 바람직하게는 3개 이상이며, 보다 바람직하게는 4개 이상이며, 바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 8개 이하, 더욱 바람직하게는 6개 이하이다.
이들 다량체 단백질은, 단일의 면역 글로불린 결합성 도메인의 연결체인 호모다이머, 호모트리머 등의 호모폴리머여도 되고, 종류가 다른 면역 글로불린 결합성 도메인의 연결체인 헤테로다이머, 헤테로트리머 등의 헤테로폴리머여도 된다. 바람직하게는, 본 발명의 제1 실시 형태의 단백질에 포함되는 도메인 모두가, 서열 번호 1 내지 6에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 1종류에서 유래하는 호모폴리머이다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질은, 2개 이상의 도메인의 C 말단과 N 말단이 연결되어, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)을 구성하고 있다. 여기서, 본 명세서에 있어서 「연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)」이란, 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단의 리신 및 그것에 연결되는 N 말단의 1위치에서 5위치까지의 서열을 가리킨다.
즉, 2개의 도메인이 연결되는 개소의, C 말단측의 1 아미노산 잔기와 N 말단측의 5 아미노산 잔기의 총 6 아미노산 잔기의 서열이 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이 된다. 여기서, N 말단측의 아미노산 서열은 B, C, Z에서 보존되어 있는 아미노산 서열을 기준으로 하고, 당해 서열의 5 아미노산 잔기를 가리키는 것으로 한다.
따라서, 도 1에 도시한 대로, E 도메인은 기준이 되는 N 말단측의 서열 중, N 말단으로부터 2 아미노산 잔기가 결실된 서열을 하고 있는 점에서, E 도메인을 포함하는 경우에는, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은, C 말단측의 1 아미노산 잔기와 N 말단측의 3 아미노산 잔기의 총 4 아미노산 잔기의 서열을 가리키는 것으로 한다.
또한, 도 1에 도시한 대로, D 도메인은 기준이 되는 N 말단측의 서열에 ( )로 표시된 3 아미노산 잔기를 삽입한 서열을 하고 있는 점에서, 본 단백질이 D 도메인을 포함하는 경우에는, 도메인간의 연결 부분에 C 말단측의 1 아미노산 잔기와 N 말단측의 8 아미노산 잔기의 총 9 아미노산 잔기를 포함하는 것이 된다. 단, D 도메인의 N 말단측에 삽입되어 있는, 「AQQ」의 3 아미노산 잔기는 본 발명의 효과에 특별히 영향을 미치지 않는다고 생각되기 때문에, 본 명세서에 있어서는 B, C, Z에서 보존되어 있는 아미노산 서열을 기준으로 하여, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 포함되는 D 도메인의 N 말단의 1위치에서 5위치의 아미노산 서열은, 하기에 나타낸 5 아미노산 잔기를 가리키는 것으로 한다.
n량체 단백질에 있어서는 n-1개의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이 존재한다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에 대해서도, C 말단은 리신(K)이다. 따라서, 상술한 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은, 반드시 리신(K)을 포함하게 된다.
또한, 이하에 나타낸 서열이, 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열이다. E 도메인은 1 및 2위치의 아미노산 잔기가 존재하지 않고 3개의 아미노산을 포함하며, 리신(K)을 포함하지 않는다. D, A, B, C 및 Z 도메인의 어느 서열도 5개의 아미노산을 포함하고, D, A 도메인은 리신(K)을 포함하지 않으며, B, C 및 Z 도메인은 4위치에 리신(K)을 포함하고 있다.
도메인 E A Q H
도메인 D A D N N F
도메인 A A D N N F
도메인 B A D N K F
도메인 C A D N K F
도메인 Z V D N K F
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제1 및 제3 형태의 단백질에 있어서는, 적어도 하나의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은, 부분적인 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 및 화학 수식에 의해 개변된 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)이며, 야생형 아미노산 서열에 존재하는 리신을 포함하지 않는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하고 있다. 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)은, 리신(K)을 포함하지 않는 것이 바람직하고, 리신(K) 및 아르기닌(R) 이외의 아미노산에 의해 구성되는 서열인 것이 보다 바람직하며, 1 이상의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제2 형태의 단백질에 있어서는, 적어도 1개의 B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 4위치의 리신 및 C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하고 있다. 따라서, 해당 도메인이 복수 연결되어 있음으로써, 제3 형태의 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)을 구성하게 된다. 덧붙여, 단백질의 가장 N 말단측 또는 C 말단측에 위치하는 도메인이 해당 도메인인 경우에는, 말단 부분은 변이 연결 개소 서열을 형성하지 않지만, 후술하는 친화성 리간드가 담체에 고정화되어 얻어지는 친화성 분리제에 있어서, 단백질의 해당 도메인의 N 말단측 또는 C 말단측을 담체에 고정화함으로써, 단백질과 담체의 결합, 및 고정화된 도메인과 기타 도메인의 결합을 안정적으로 유지할 수 있다.
여기서, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서 「변이」란, 야생형 아미노산 서열에 대하여 행해지는 부분적인 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 및 화학 수식에 의한 개변을 의미하고, 「변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)」이란, 야생형 아미노산 서열의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에, 특정 「변이」가 삽입된 서열을 말한다. 또한, 「변이 도메인」이란, 각 도메인의 야생형 아미노산 서열에, 특정 「변이」가 삽입된 도메인을 말한다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제1 및 제3 형태의 단백질에 포함되는 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트) 중 적어도 1개가 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)이면 되지만, 3량체 이상의 단백질인 경우에는, 2개 이상이 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)인 것이 바람직하고, n량체 단백질인 경우에는, n-1개가 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)인 것, 즉 모든 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)인 것이 보다 바람직하다.
따라서, 본 발명의 제1 실시 형태의 단백질에서는, 모든 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 있어서, 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것이 바람직하다.
후술하는 친화성 분리제에 있어서, 담체에 고정화된 리간드가 프로테아제에 의한 절단을 받지 않기 위해서는, 본 발명의 제1 실시 형태의 단백질에 있어서의, 가장 N 말단측의 도메인에 4위치의 리신, 또는 가장 C 말단측의 C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제2 형태의 단백질에 포함되는 도메인 중, 적어도 1개가 4위치의 리신 및 C 말단의 리신이 결실 또는 치환된 도메인(변이 도메인)이면 되지만, 단백질의 가장 N 말단측의 도메인 또는 가장 C 말단측의 도메인이 변이 도메인인 것이 바람직하고, 후술하는 고정화 도메인이 변이 도메인인 것이 바람직하다. 또한, 3량체 이상의 단백질인 경우에는, 고정화 도메인 및 그것에 연결되는 2개 이상이 변이 도메인인 것이 바람직하고, n량체 단백질인 경우에는, 고정화 도메인 및 그것에 연결되는 n-2개 이상의 도메인이 변이 도메인인 것이 바람직하며, 모든 도메인이 변이 도메인인 것이 가장 바람직하다.
연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단의 1 아미노산 잔기 및 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하지만, 이 서열에 대하여 치환, 삽입, 결실, 및 화학 수식에 의해 개변을 행하고, 바람직하게는 1 이상의 아미노산을 포함하고, 바람직하게는 리신(K) 및 아르기닌(R) 이외의 아미노산에 의해 구성되는 서열이다.
본 발명자들의 검토에 의해, 트립신이나 플라스민 등의 세린 프로테아제에 의해 절단을 받기 쉬운 개소가, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트) 중의 야생형 아미노산 서열에서 존재하는 특정 위치의 리신(K)의 C 말단측인 것이 밝혀졌다. 이로부터, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 존재하는 특정 리신(K)을 포함하지 않는 아미노산으로 구성되는 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하면, 세린 프로테아제에 의한 단백질의 절단을 현저하게 억제 가능한 것을 알아내었다.
구체적으로는, 야생형 아미노산 서열의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 있어서의 K를, 결실 및/또는 치환함으로써 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 할 수 있다. 바람직하게는 K 이외의 아미노산에 의해 구성되는 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하는 것이며, 보다 바람직하게는 K 및 R 이외의 아미노산에 의해 구성되는 변이 연결 엘리먼트로 하는 것이다.
덧붙여, 본 발명자들의 검토에 의하면, 야생형 아미노산 서열의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트) 이외에 존재하는 K 및 R은 세린 프로테아제에 의한 절단을 받기 어렵기 때문에 본 발명의 제1 실시 형태의 단백질의 각 도메인에 존재하고 있어도 될 뿐만 아니라, 본 발명의 제1 실시 형태의 단백질이 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖기 위해서는, 적어도 1개의 도메인에 있어서 1 이상의 리신을 포함할 필요가 있음을 알아내었다.
연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트) 이외에 존재하는 리신은, 야생형 아미노산 서열에 있어서의 리신이 보존되어 있는 것이 바람직하고, 바람직하게는 2개 이상이 보존되어 있는 것이며, 보다 바람직하게는 3개 이상이 보존되어 있는 것이고, 가장 바람직하게는 4개의 리신이 야생형 아미노산 서열과 동일한 위치에 포함되는 것이 바람직하다. 보존되는 K로서는, 35위치의 리신이 보존되어 있는 것이 가장 바람직하다.
연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트) 이외에 존재하는 리신이 충분한 면역 글로불린 결합 활성을 갖기 위해서 필요한 이유는 밝혀져 있지 않지만, 야생형 단백질 A의 항체 인식 부위 근방의 리신은 항체와 정전적인 상호 작용을 한다고 생각되고 있다. 이로부터, 야생형 단백질 A의 항체 인식 부위의 작용을 손상시키지 않는 범위에서, 치환, 삽입 등의 변이에 의해 야생형 아미노산 서열에 존재하지 않는 리신을 포함하고 있어도 상관없지만, 야생형 아미노산 서열에 존재하지 않는 리신을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
이하에, 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)의 구체적인 예에 대하여 설명한다.
연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)의 아미노산의 일부를 결실시켜 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)은 1 이상의 아미노산을 포함하는 것을 필수로 한다. 본 발명자들의 검토에 따르면, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 포함되는 6개의 모든 아미노산을 결실시킨 경우에는, 목적으로 하는 면역 글로불린으로의 결합 능력이 현저하게 저하되어, 당해 단백질을 친화성 리간드로서 사용하면 면역 글로불린과의 결합 능력이 불충분한 것이 밝혀졌다.
일반적으로 면역 글로불린은 각 도메인보다도 크고, 결합된 면역 글로불린끼리의 입체 장애에 의해 각 도메인과 결합 가능한 수는 한정되어 있다. 그 때문에, 각 도메인과 면역 글로불린이 결합했을 때에, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이 존재하지 않고 인접하는 도메인이 너무 가까우면, 면역 글로불린이 결합 가능한 공간이 부족하여, 1 도메인당 면역 글로불린 결합수가 저하되기 때문이라고 추정된다. 변이 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은 바람직하게는 1 이상, 보다 바람직하게는 2 이상의 아미노산을 포함하면, 목적으로 하는 면역 글로불린으로의 결합 능력이 보다 높아지는 경향이 있어 바람직하다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제1 형태의 단백질에서는, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이 단백질 A의 어느 도메인의 C 말단의 리신(K)과 E, D 및 A 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고 있다. 그 때문에, 야생형 아미노산 서열의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에는, K가 1개 포함되어 있다. 따라서, 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)은, 연결되는 도메인의 C 말단의 리신(K)을 결실시킨 것이 바람직하다.
예를 들어, 단백질 A의 A 도메인이 2개 연결되어 생기는 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)을 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, C 말단의 리신(K)을 결실시킨 알라닌(A), 아스파라긴산(D), 아스파라긴(N), 아스파라긴(N), 페닐알라닌(F)의 5개의 아미노산을 포함하는 서열이나, C 말단의 K에 더하여 1위치의 A 및 5위치의 F를 결실시키고, D, N, N의 3개의 아미노산을 포함하는 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제2, 제3 형태의 단백질에서는, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이 단백질 A의 어느 도메인의 C 말단의 리신(K)과 B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고 있다. 그 때문에, 야생형 아미노산 서열의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에는, C 말단과 4위치의 2개의 K가 포함되어 있다. 따라서, 변이 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)은, 연결되는 도메인의 C 말단의 리신(K) 및 4위치의 리신(K)을 결실시킨 것이 바람직하다.
예를 들어, 단백질 A의 B 도메인이 2개 연결되어 생기는 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)을 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, C 말단의 리신(K) 및 4위치의 리신(K)의 2개의 아미노산을 결실시킨 알라닌(A), 아스파라긴산(D), 아스파라긴(N), 페닐알라닌(F)의 4개의 아미노산을 포함하는 서열이나, C 말단의 K 및 4위치의 K에 더하여 1위치의 V 및 5위치의 F를 결실시키고, D, N의 2개의 아미노산을 포함하는 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 포함되는 K 중 어느 한쪽을 후술하는 방법으로 치환하는 경우에는, C 말단의 K만을 결실시키거나, 4위치의 K만을 결실시켜도 된다.
아미노산의 치환은, 원래의 아미노산을 삭제하고, 동일한 위치에 다른 아미노산을 추가하는 변이를 의미한다. 추가되는 다른 아미노산은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 천연 단백질 구성 아미노산, 단백질 비구성 아미노산, 비천연 아미노산을 들 수 있다. 이 중에서도, 유전자 공학적 생산의 관점에서, 천연형 아미노산을 적합하게 사용할 수 있다.
단, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)의 아미노산을 치환하여 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)에는 리신(K)을 포함하지 않도록 한 서열로 할 필요가 있다. 또한 아르기닌(R)도 포함하지 않도록 한 서열이면, 아르기닌을 인식하는 프로테아제에 대한 내성도 향상되어 바람직하다.
따라서, 치환에 의해 도입되는 아미노산으로서는, 리신(K) 및 아르기닌(R) 이외의 아미노산이면 특별히 한정되지 않지만, 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H) 등의 친수성 아미노산; 시스테인(C), 글리신(G), 메티오닌(M), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y) 등의 중성 아미노산 중 어느 것이 바람직하다. 이 중에서도, 친수성 아미노산 중 어느 것이 보다 바람직하다.
나아가, 알칼리성 조건 하에서의 안정성이 향상되는 관점에서, 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H)이 바람직하다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제1 형태의 단백질에서는, 야생형 아미노산 서열의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에는, K가 1개 포함되어 있고, 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)은, 연결되는 도메인의 C 말단의 리신(K)을 치환한 것이 바람직하다.
예를 들어, 단백질 A의 A 도메인이 2개 연결되어 생기는 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)을 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, C 말단의 리신(K)을, 리신(K) 및 아르기닌(R) 이외의 아미노산으로 치환한 것이 바람직하다.
구체적으로는, C 말단의 리신(K)을 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D)이나 히스티딘(H)으로 치환한 서열이나, C 말단의 K에 더하여 1위치의 A 및 5위치의 F를, 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D)이나 히스티딘(H)으로 치환한 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제2 형태의 단백질에서는, 야생형 아미노산 서열의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에는, C 말단과 4위치의 2개의 K가 포함되어 있고, 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)은, 연결되는 도메인의 C 말단의 리신(K) 및 4위치의 리신(K)을 치환한 것이 바람직하다.
예를 들어, 단백질 A의 B 도메인이 2개 연결되어 생기는 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)을 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, C 말단의 리신(K) 및 4위치의 리신(K)을 리신(K) 및 아르기닌(R) 이외의 아미노산으로 치환한 것이 바람직하다. 구체적으로는, C 말단의 리신(K) 및 4위치의 리신(K)을 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D)이나 히스티딘(H)으로 치환한 서열이나, C 말단의 K 및 4위치의 K에 더하여 1위치의 V 및 5위치의 F를, 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D)이나 히스티딘(H)으로 치환한 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다.
또한, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 포함되는 어느 한쪽의 K를 상술한 방법으로 결실시키는 경우에는, C 말단의 K만을 치환하거나, 4위치의 K만을 치환해도 된다.
변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)에는, 야생형 아미노산 서열에 포함되는 5개의 아미노산에 더하여, 추가의 아미노산 서열이 삽입되어 있어도 된다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질에 있어서는, C 말단의 리신(K) 및/또는 4위치의 리신(K)을 결실 또는 치환하여 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하면, 세린 프로테아제에 대한 내성을 높일 수 있다. 또한 본 발명의 제1 실시 형태의 단백질에서는, 말단의 K 및/또는 4위치의 K가 결실되어, 4개의 아미노산을 포함하는 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하면, 트립신이나 플라스민 등의 세린 프로테아제 내성을 더욱 높일 수 있어 바람직하다.
또한, 이유는 분명하지 않지만, 야생형 아미노산 서열의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트) 중의 K에 더하여 다른 몇 개의 아미노산을 결실시켜, 바람직하게는 3개, 보다 바람직하게는 2개의 아미노산을 포함하는 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)로 하면, 세린 프로테아제 내성이 더욱 높아지는 경향이 있기 때문에 바람직하다. 이것은, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이 짧아짐으로써, 프로테아제와의 물리적인 접촉이 억제되기 때문이라고 추정된다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질은 세린 프로테아제에 대한 내성에 더하여, 다른 프로테아제에 대한 내성을 갖고 있어도 된다. 예를 들어, 변이 연결 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트)이, 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 구성되는 경우에는, 서모리신에 대한 내성을 갖기 때문에 바람직하다.
변이 결합 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트) 이외에 도입되는 아미노산 서열의 개변은, 특별히 한정되는 것은 아니고, 야생형 아미노산 서열을 갖는 단백질에 비해, 동등 또는 그 이상으로, 면역 글로불린의 Fab 영역에 대한 친화성이 저하되며, 또한 면역 글로불린에 친화성을 갖고 있으면 된다.
변이 결합 개소 서열(변이 제1 연결 엘리먼트) 이외의 부분의 아미노산 서열은, 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인의 어느 야생형 아미노산 서열과, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 동일성을 갖고, 그 결과, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질이 Fc 영역으로의 결합능을 갖고 있으면 된다.
변이를 도입하여 얻어지는 단백질의 각 도메인은, 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인의 어느 야생형 아미노산 서열과, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 아미노산의 서열 동일성을 나타낸다.
상술한 단백질의 구체예로서, 서열 번호 48 내지 57에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질은 프로테아제, 특히 세린 프로테아제에 내성을 갖는 것을 특징으로 한다. 세린 프로테아제이란, 트립신, 플라스민 등을 예로서 들 수 있고, 통상, 대장균 등의 미생물이나 CHO 세포 등의 배양 세포에서 생성, 축적되는 프로테아제이다.
예를 들어, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질을 제작하는 경우에는, 통상, 후술하는 바와 같이, 대장균 등의 미생물을 숙주로 하는 형질 전환체를 이용하여, 형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외에 단백질을 축적시켜 회수한다. 목적으로 하는 단백질을 축적ㆍ회수할 때에는, 숙주가 되는 미생물이 생산하는 프로테아제의 영향을 받는 경우가 있다.
또한, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질을 면역 글로불린 결합성 친화성 리간드로 하여 친화성 분리제를 제작하고, 면역 글로불린을 정제하기 위해 사용하는 경우에는, 해당 친화성 분리제에 통과시키는 면역 글로불린 생산한 CHO 세포 등의 배양 상청 중에 포함되는 프로테아제의 영향을 받는 경우가 있다.
본 발명자들의 검토에 따르면, 야생형 아미노산 서열을 갖는 다량체 단백질에서는, 해당 다량체 단백질을 축적ㆍ회수한 경우에, 배양 도중 및 회수 후의 정제ㆍ농축 등의 공정에서 프로테아제의 영향에 의해 절단을 받아, 목적으로 하는 다량체 단백질을 얻지 못함을 알았다.
또한, 야생형 아미노산 서열을 갖는 다량체 단백질을 리간드로 하여 친화성 분리제를 제작한 경우, 면역 글로불린 정제용으로 사용할 때에 리간드인 다량체 단백질이 프로테아제의 영향에 의해 절단을 받아, 면역 글로불린 결합성을 충분히 발휘하지 못하는 것이 밝혀졌다. 이것은, 프로테아제 중에서도 대장균 등의 미생물이나 CHO 세포 등의 배양 세포 등이 생산하는 세린 프로테아제의 영향에 의한 것이며, 각 도메인의 아미노산 서열 중에서도 특정 부분에서 절단을 받고 있는 것이, 처음으로 밝혀졌다.
이들 검토 결과를 고려하여, 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)에 특정 개변을 가한 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질은, 배양 도중 및 회수 후의 정제ㆍ농축 등의 공정에 있어서 세린 프로테아제에 의한 절단을 받는 일 없이, 축적ㆍ회수를 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 다량체 단백질을 리간드로 하여 친화성 분리제를 제작한 경우, 세린 프로테아제의 영향을 받는 일 없이, 충분한 면역 글로불린 결합성을 발휘하여, 목적으로 하는 면역 글로불린을 정제하는 것이 가능하다.
면역 글로불린의 정제 공정 등에서 사용한 경우에 프로테아제의 영향을 받지 않고 리간드가 안정적으로 기능할 수 있다는 효과를 현저하게 발휘하는 점에서, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질은, 담체에 결합하지 않는 비고정화 도메인을 1개 이상 포함하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2개 이상, n량체의 단백질인 경우에는 n-1개 이상이 비고정화 도메인인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 n개 모두가 비고정화 도메인이다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질이, 이후에 상세하게 설명하는 비고정화 도메인을 포함하기 위해서는, 적어도 1개 이상의 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 아미노산의 치환이나 삽입 등에 의해 고정화에 유용한 아미노산 잔기를 도입하거나, 고정화에 유용한 아미노산을 결실시키거나, 고정화용 태그를 도입하거나 함으로써, 제작할 수 있다.
본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질이 비고정화 도메인을 포함함으로써, 배향성을 조정하여 담체에 고정화시킬 수 있고, 보다 높은 면역 글로불린 결합성을 발휘할 수 있기 때문에 바람직하다.
또한, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 친화성 분리제는, 반복해서 사용한 경우라고 해도, 리간드의 면역 글로불린 결합성이 저하되는 일 없이, 효율적으로 면역 글로불린을 정제하는 것이 가능하다.
그 때문에, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 단백질은 면역 글로불린의 Fc 영역으로의 결합 활성이 충분히 높아서 친화성 리간드로서 적합하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 리간드로서 안정되게 반복 사용하는 것이 가능하여, 공업적으로 유리하다.
여기서, 본 명세서에 있어서 세린 프로테아제 내성이 있는지는, 다음 방법으로 확인한다. 2mg/mL의 리간드 용액 10μL에 1 내지 10mg/mL의 세린 프로테아제 용액을 2μL 첨가한 용액을, 37℃, 15시간 가열했을 때에, 절단되지 않은 리간드가 많을수록 바람직하다. 세린 프로테아제 용액의 농도는, 프로테아제의 종류에 따라서 적절히 설정하면 되고, 예를 들어 트립신은 1mg/mL로 하는 것이 바람직하고, 플라스민은 10mg/mL로 하는 것이 바람직하다.
세린 프로테아제 내성이 있는 것으로서는, 절단되지 않은 리간드를 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상 유지하고 있는 것이다. 또한, 절단되었는지의 여부는, 일반적으로 사용되는 전기 영동법(SDS-PAGE)에 의해 확인한다.
[본 발명의 제2 실시 형태]
<단백질>
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은, 서열 번호 3 내지 6에 기재된 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖고, 각 도메인을 연결하는 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 중 적어도 하나는, 1 이상의 아미노산을 포함하며, 또한 소수성 아미노산 이외의 아미노산에 의해 구성되는 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인 것을 특징으로 한다.
단백질 A는, 면역 글로불린 결합성 도메인이 5개 연결된 형태로 구성되는 단백질이다. 복수의 미생물이 단백질 A를 발현하지만, 단백질 A를 발현하는 미생물로서, 예를 들어 스타필로코커스(Staphylococcus)를 들 수 있다.
서열 번호 3 내지 6에 기재된 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인은, 면역 글로불린의 상보성 결정 영역(CDR) 이외의 영역에 결합할 수 있는 면역 글로불린 결합성 단백질이며, 어느 도메인도, 면역 글로불린의 Fc 영역, Fab 영역 및 Fab 영역 중의 특히 Fv 영역의, 각각의 영역에 대하여 결합한다.
도 1의 서열 비교표에 도시한 바와 같이, 단백질 A 유래의, A, B, C 및 Z 도메인은, 서로 상동성이 높은 아미노산 서열을 갖고 있으며, 80％ 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖고 있다. 또한, 하이픈(-)은 C 도메인의 아미노산 잔기와 동일한 것을 나타낸다.
「단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인」이란, 야생형의 각 도메인의 아미노산 서열에서 유래하는 아미노산 서열을 갖는 도메인을 가리키고, Fc 영역으로의 결합능을 갖고 있는 단백질을 코딩하는 한, 야생형의 각 도메인의 아미노산 서열에 후술하는 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트) 이외의 변이가 들어 있어도 된다.
즉, 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인의 어느 아미노산 서열은, 변이를 도입하기 전의 아미노산 서열(야생형 아미노산 서열)이며, 「단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인」의 아미노산 서열은, A, B, C 및 Z 도메인의 야생형 아미노산 서열 그 자체, 또는 야생형 아미노산 서열에 후술하는 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)를 포함하고/포함하거나, 부분적인 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 및 화학 수식에 의해 개변된 것을 가리킨다.
여기서, 단백질 A의 Z 도메인은, B 도메인에 A1V와 G29A라는 변이를 도입하여 얻어진 것이며, 천연 단백질 A에는 존재하지 않는 도메인인데, 본 명세서에 있어서는, 서열 번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 Z 도메인의 야생형 아미노산 서열이라고 칭한다.
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은, 상술한 「단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인」을 단일 도메인으로서 2개 이상 갖는 다량체 단백질(복 도메인형 단백질)이다. 바람직하게는 3개 이상이며, 보다 바람직하게는 4개 이상이며, 바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 8개 이하, 더욱 바람직하게는 6개 이하이다.
이들 다량체 단백질은, 단일의 면역 글로불린 결합성 도메인의 연결체인 호모다이머, 호모트리머 등의 호모폴리머여도 되고, 종류가 다른 면역 글로불린 결합성 도메인의 연결체인 헤테로다이머, 헤테로트리머 등의 헤테로폴리머여도 된다. 바람직하게는, 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질에 포함되는 도메인 모두가, 서열 번호 3 내지 6에 기재된 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열 중 어느 1종류에서 유래하는 호모폴리머이다.
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은, 2개 이상의 도메인의 C 말단과 N 말단이 연결되어, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)를 구성한다. 여기서, 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서 「연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)」란, 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 가리킨다.
즉, N 말단측에 다른 도메인을 연결하는 도메인에 있어서는, 당해 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열이 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 된다. 따라서, n량체 단백질에 있어서는 n-1개의 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 존재한다.
이하에 나타낸 서열이, 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열이다. 어느 서열도 5개의 아미노산을 포함하고, 소수성 아미노산인 알라닌(A) 및/또는 페닐알라닌(F)을 포함하고 있다.
도메인 A A D N N F
도메인 B A D N K F
도메인 C A D N K F
도메인 Z V D N K F
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질에 있어서는, 적어도 1개의 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)는, 부분적인 아미노산의 치환, 삽입, 결실, 및 화학 수식에 의해 개변된 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인 것을 특징으로 하고 있다. 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)란, 1 이상의 아미노산을 포함하며, 또한 소수성 아미노산 이외의 아미노산에 의해 구성되는 서열이다.
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질에 포함되는 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 중 적어도 1개가 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)이면 되지만, 3량체 이상의 단백질인 경우에는, 2개 이상이 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인 것이 바람직하고, n량체 단백질인 경우에는, n-1개가 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인 것, 즉 모든 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인 것이 보다 바람직하다.
연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)는 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하지만, 이 서열에 대하여 치환, 삽입, 결실, 및 화학 수식에 의해 개변을 행하고, 1 이상의 아미노산을 포함하며, 또한 소수성 아미노산 이외의 아미노산에 의해 구성되는 서열이 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)이다.
본 발명자들의 검토에 의해, 서모리신에 의해 절단을 받기 쉬운 개소가, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 중의 소수성 아미노산의 N 말단측인 것이 밝혀졌다. 이로부터, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)를 소수성 아미노산 이외의 아미노산에 의해 구성되는 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)로 하면, 서모리신에 의한 단백질의 절단을 현저하게 억제 가능한 것을 알아내었다.
구체적으로는, 야생형 아미노산 서열의 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 있어서의 A 및 F를, 결실 및/또는 치환함으로써, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)로 하는 것이 바람직하다.
여기서, 본 명세서에 있어서의 「소수성 아미노산」이란, 알라닌(A), 이소류신(I), 류신(L), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 트립토판(W), 발린(V)을 가리키고, 「소수성 아미노산 이외의 아미노산」이란, 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 리신(K) 등의 친수성 아미노산; 시스테인(C), 글리신(G), 메티오닌(M), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y) 등의 천연형의 중성적인 아미노산이나; 아세틸리신, 아지드-Z-리신, 글루탐산 5-메틸, 아스파라긴산 5-메틸 등의 비천연형의 중성적인 아미노산을 가리킨다.
이하에, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)의 구체적인 예에 대하여 설명한다.
연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)의 아미노산의 일부를 결실시켜 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는 1 이상의 아미노산을 포함하는 것을 필수로 한다. 본 발명자들의 검토에 따르면, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 5개의 모든 아미노산을 결실시킨 경우에는, 목적으로 하는 면역 글로불린으로의 결합 능력이 현저하게 저하되고, 당해 단백질을 친화성 리간드로서 사용하면 면역 글로불린과의 결합 능력이 불충분한 것이 밝혀졌다. 특히, 친화성 분리제로서 사용하는 정제 조건에 따라서 그 차이가 현저하게 나타난다.
일반적으로 면역 글로불린은 각 도메인보다도 크고, 결합한 면역 글로불린끼리의 입체 장애에 의해 각 도메인과 결합 가능한 수는 한정되어 있다. 그 때문에, 각 도메인과 면역 글로불린이 결합했을 때에, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 존재하지 않고 인접하는 도메인이 너무 가까우면, 면역 글로불린이 결합 가능한 공간이 부족하여, 1 도메인당 면역 글로불린 결합수가 저하되기 때문이라고 추정된다. 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는 다양한 정제 조건에 있어서 면역 글로불린과의 결합 능력이 우수하다는 이유에서, 1 이상의 아미노산을 포함하는 것을 필수로 하고, 2 이상의 아미노산을 포함하면, 목적으로 하는 면역 글로불린으로의 결합 능력이 보다 높아지는 경향이 있어 바람직하다.
변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가 단백질 A의 A, B 및 C 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인에 포함되는 경우에는, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는, A, B 또는 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 1위치의 알라닌 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 결실시킨 것이 바람직하다.
예를 들어, 1위치의 알라닌(A) 및 5위치의 페닐알라닌(F)의 2개의 아미노산을 결실시킨 아스파라긴산(D), 아스파라긴(N), 리신(K)의 3개의 아미노산을 포함하는 서열이나, 1위치의 A 및 5위치의 F에 더하여 4위치의 K를 결실시키고, D, N의 2개의 아미노산을 포함하는 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 소수성 아미노산을 후술하는 방법으로 치환하는 경우에는, 1위치의 A만을 결실시키거나, 5위치의 F만을 결실시켜도 된다.
변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가 단백질 A의 Z 도메인에서 유래하는 도메인에 포함되는 경우에는, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는, Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 1위치의 발린 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 결실한 것이 바람직하다.
예를 들어, 1위치의 발린(V) 및 5위치의 페닐알라닌(F)의 2개의 아미노산을 결실시킨 아스파라긴산(D), 아스파라긴(N), 리신(K)의 3개의 아미노산을 포함하는 서열이나, 1위치의 V 및 5위치의 F에 더하여 4위치의 K를 결실시키고, D, N의 2개의 아미노산을 포함하는 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 소수성 아미노산의 일부를 후술하는 방법으로 치환하는 경우에는, 1위치의 V만을 결실시키거나, 5위치의 F만을 결실시켜도 된다.
아미노산의 치환은, 원래의 아미노산을 삭제하고, 동일한 위치에 다른 아미노산을 추가하는 변이를 의미한다. 추가되는 다른 아미노산은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 천연 단백질 구성 아미노산, 단백질 비구성 아미노산, 비천연 아미노산을 들 수 있다. 이 중에서도, 유전자 공학적 생산의 관점에서, 천연형 아미노산을 적합하게 사용할 수 있다.
단, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)의 아미노산을 치환하여 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)에는 소수성 아미노산을 포함하지 않도록 한 서열로 할 필요가 있다. 따라서, 치환에 의해 도입되는 아미노산으로서는, 소수성 아미노산 이외의 아미노산이라면 특별히 한정되지 않지만, 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 리신(K) 등의 친수성 아미노산; 시스테인(C), 글리신(G), 메티오닌(M), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y) 등의 중성적인 아미노산 중 어느 것이 바람직하다. 이 중에서도, 친수성 아미노산 중 어느 것이 보다 바람직하다.
나아가, 알칼리성 조건 하에서의 안정성이 향상되는 관점에서, 아르기닌(R), 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 리신(K)이 바람직하다.
또한, 그 밖의 프로테아제, 예를 들어 후술하는 세린 프로테아제에 대한 내성이 향상되는 관점에서, 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H)이 바람직하다.
변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가 단백질 A의 A, B 및 C 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인에 포함되는 경우에는, 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는, A, B, 또는 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 1위치의 알라닌 및/또는 5위치의 페닐알라닌을, 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 것이 바람직하다.
예를 들어, 1위치의 알라닌(A) 및 5위치의 페닐알라닌(F)의 2개의 아미노산을 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 서열이나, 1위치의 A 및 5위치의 F에 더하여 4위치의 K를, K를 제외한 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 소수성 아미노산의 일부를 상술한 방법으로 결실시킬 경우에는, 1위치의 A만을 치환하거나, 5위치의 F만을 치환해도 된다.
변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)가 단백질 A의 Z 도메인에서 유래하는 도메인에 포함되는 경우에는, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는, Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 1위치의 발린 및/또는 5위치의 페닐알라닌을, 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 것이 바람직하다.
예를 들어, 1위치의 발린(V) 및 5위치의 페닐알라닌(F)의 2개의 아미노산을 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 서열이나, 1위치의 V 및 5위치의 F에 더하여 4위치의 K를, K를 제외한 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 소수성 아미노산의 일부를 상술한 방법으로 결실시키는 경우에는, 1위치의 V만을 치환하거나, 5위치의 F만을 치환해도 된다.
변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)에는, 야생형 아미노산 서열에 포함되는 5개의 아미노산에 더하여, 추가의 아미노산 서열이 삽입되어 있어도 된다. 예를 들어, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 소수성 아미노산의 일부를 상술한 방법으로 치환한 서열에, 추가로 소수성 아미노산 이외의 아미노산을 삽입하여, 6 이상의 아미노산을 포함하는 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)로 할 수도 있다.
또한, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 소수성 아미노산의 일부를 상술한 방법으로 결실시킨 서열로부터, 추가로 일부 또는 전부의 아미노산을 결실시키고, 소수성 아미노산 이외의 아미노산을 포함하는 임의의 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)를 삽입할 수도 있다. 또한, 리신 잔기의 아세틸화나 프롤린 잔기의 히드록실화 등의 화학 수식 등도, 항체와의 결합성 등에 영향이 없는 범위에서 가능하다.
단, 얻어지는 단백질의 입체 구조가 크게 변화되면, 목적으로 하는 면역 글로불린으로의 친화성 및 결합능에 변화를 줄 가능성이 있기 때문에, 야생형 아미노산 서열의 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 추가의 아미노산 서열을 더 삽입하지 않는 것이 바람직하다.
치환, 삽입 등에 의해 변이가 도입된 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)를 구성하는 아미노산으로서는, 소수성 아미노산 이외의 아미노산이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 아르기닌(R), 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H), 리신(K) 등의 친수성 아미노산이며, 보다 바람직하게는 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D), 히스티딘(H)이다.
변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트) 이외에 도입되는 아미노산 서열의 개변은, 특별히 한정되는 것은 아니고, 야생형 아미노산 서열을 갖는 단백질에 비해, 동등 또는 그 이상으로 면역 글로불린에 친화성 및 결합능을 갖고 있으면 된다.
변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트) 이외의 부분의 아미노산 서열은, 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인의 어느 야생형 아미노산 서열과, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 동일성을 갖고, 그 결과, 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질이 Fc 영역으로의 결합능을 갖고 있으면 된다.
변이를 도입하여 얻어지는 단백질의 각 도메인은, 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인의 어느 야생형 아미노산 서열과, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 아미노산의 서열 동일성을 나타낸다.
면역 글로불린으로의 친화성 및 결합능 이외에 유용한 리간드의 특성 지표로서, 내알칼리성이나 약산성 용출성을 들 수 있다. 이들을 개량하기 위해서, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트) 이외의 아미노산 서열의 개변을 하는 것은, 본 발명에 있어서는 양립 가능하고, 바람직한 형태라고 할 수 있다.
내알칼리성이란, 0.1N NaOH나 0.5N NaOH 등의 알칼리 용액에 침지시켰을 때에, 면역 글로불린과의 친화성 및 결합능을 높게 유지하는 것을 말한다. 이에 의해, 내알칼리성을 갖는 단백질을 친화성 리간드로서 사용하여 분리제로 했을 때에, 알칼리 용액에 의한 세정을 반복해도 높은 분리 정제능을 유지할 수 있다. 또한, C 도메인 및 Z 도메인은 원래 높은 내알칼리성을 갖는 것이 알려져 있어, 내알칼리성에 있어서는 바람직한 서열이다.
또한 약산성 용출성이란, 친화성 리간드를 고정화한 분리제로 면역 글로불린을 흡착 정제할 때에, 통상, 산성에서 용출되는 면역 글로불린을, 더 높은 pH의 마일드한 조건에서 용출 가능한 것을 말한다. 이에 의해, 용출될 때에 단백질의 응집과 같은 변성을 억제하는 것이 가능하다. 특허문헌 5나 국제 공개 제2010/118699호 등에 기재되어 있는 약산성 용출성을 부여하는 변이는, 본 발명에 있어서는 양립 가능하며 바람직한 형태라고 할 수 있다.
상술한 단백질의 구체예로서, 서열 번호 105 내지 115에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은 프로테아제, 특히 서모리신에 내성을 갖는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질을 제작하는 경우에, 통상, 후술하는 바와 같이, 미생물을 숙주로 하는 형질 전환체를 이용하여, 형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외에 단백질을 축적시켜 회수한다. 목적으로 하는 단백질을 축적ㆍ회수할 때에는, 숙주가 되는 미생물이 생산하는 프로테아제의 영향을 받는 경우가 있다.
본 발명자들의 검토에 따르면, 야생형 아미노산 서열을 갖는 다량체 단백질을 상기 방법에 의해 축적ㆍ회수한 경우에, 배양 도중 및 회수 후의 정제ㆍ농축 등의 공정에서 프로테아제의 영향에 의해 절단을 받아, 목적으로 하는 다량체 단백질을 얻지 못함을 알았다. 이것은, 프로테아제 중에서도 바실루스속 세균 등이 생산하는 서모리신의 영향에 의한 것이며, 각 도메인의 아미노산 서열 중에서도 특정 부분에서 절단을 받고 있는 것이, 처음으로 밝혀졌다.
이들 검토 결과를 고려하여, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 특정 개변을 가한 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은, 배양 도중 및 회수 후의 정제ㆍ농축 등의 공정에 있어서 서모리신에 의한 절단을 받는 일 없이, 축적ㆍ회수를 행할 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은 면역 글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 활성이 충분히 높고 친화성 리간드로서 적합하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 고효율로 생산 가능하여, 공업적으로 유리하다.
여기서, 본 명세서에 있어서 서모리신 내성이 있는지는, 다음 방법으로 확인한다. 2mg/mL의 리간드 용액 10μL에 1mg/mL의 서모리신 용액을 2μL 첨가한 용액을, 37℃, 15분간 가열했을 때에, 절단되지 않은 리간드가 많을수록 바람직하다. 예를 들어 절단되지 않은 리간드를 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상 유지하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 절단되었는지의 여부는, 일반적으로 사용되는 전기 영동법(SDS-PAGE)에 의해 확인한다.
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)를 가짐으로써 서모리신에 대한 내성을 갖지만, 추가로 다른 프로테아제에 대한 내성을 갖는 아미노산 서열인 것이 바람직하다. 다른 프로테아제로서는, 예를 들어 트립신이나 플라스민 등의 세린 프로테아제를 들 수 있다.
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질을 리간드로서 사용한 친화성 분리제를 사용하여 재조합 배양 세포에서 생산된 IgG 항체를 정제하는 경우에 있어서는, 해당 배양 세포가 생산하는 세린 프로테아제에 의해 리간드가 절단되어, 충분한 면역 글로불린 결합성을 발휘할 수 없을 가능성이 있다. 따라서, 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질이, 추가로 세린 프로테아제에 대한 내성을 갖는 아미노산 서열인 것이 바람직하다.
상기 이유에 의해, 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단의 리신을 결실 또는 치환한 것이 바람직하다. 본 발명자들의 검토에 의해, 트립신이나 플라스민 등의 세린 프로테아제에 의해 절단을 받기 쉬운 개소가, 각 도메인의 야생형 아미노산 서열에서 존재하는 C 말단 리신(K)의 C 말단측인 것이 밝혀졌다. 이로부터, 각 도메인의 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 결합하는 C 말단 리신(K)을 결실 또는 치환에 의해 포함하지 않도록 한 아미노산 서열로 구성되게 하면, 세린 프로테아제에 의한 단백질의 절단을 현저하게 억제 가능한 것을 알아내었다.
보다 바람직하게는, C 말단측에 상기 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)를 결합하는 도메인에 있어서, 해당 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단의 리신을 결실 또는 치환한 것이다.
더욱 바람직하게는, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)에도 리신을 포함하지 않는 것이다. 앞서 나타낸 바와 같이, B, C, Z 도메인의 야생형 아미노산 서열에서는, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 중의 4위치에 리신을 포함하고 있다.
본 발명자들의 검토에 의해, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 중의 리신에 대해서도 비교적 세린 프로테아제에 의한 절단을 받기 쉬운 것이 밝혀졌으므로, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)에 있어서는, 리신(K)을 결실 또는 치환함으로써 포함하지 않도록 한 아미노산 서열로 하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)는 아르기닌(R)을 포함하지 않는 것이다.
이하에, 세린 프로테아제 내성을 갖는 변이 연결 엘리먼트의 구체적인 예에 대하여 설명한다.
각 도메인의 C 말단 리신(K) 및/또는 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)의 아미노산의 일부를 결실시키는 경우를 들 수 있다. 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 A 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고 있는 경우에는, 각 도메인의 C 말단의 K만을 결실시키면 된다.
한편으로, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고 있는 경우에는, C 말단과 4위치의 2개의 K가 포함되어 있고, 적어도 C 말단의 K를 결실시키는 것이 바람직하고, 추가로 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 중의 K도 결실시키는 것이 보다 바람직하다.
예를 들어, 단백질 A의 B 도메인이 2개 연결되어 생기는 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 소수성 아미노산의 결실에 의해 제작된 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인 경우, 추가로 C 말단의 리신(K)을 결실시킨 아스파라긴산(D), 아스파라긴(N), 리신(K)의 3개의 아미노산을 포함하는 서열이나, 추가로 C 말단의 리신(K) 및 4위치의 리신(K)의 2개의 아미노산을 결실시킨 아스파라긴산(D), 아스파라긴(N)의 2개의 아미노산을 포함하는 서열을, 바람직한 예로서 들 수 있다.
또한, C 말단의 K 및 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 K 중 어느 한쪽을 후술하는 방법으로 치환하는 경우에는, C 말단의 K만을 결실시키거나, 4위치의 K만을 결실시켜도 된다.
각 도메인의 C 말단 리신(K) 및/또는 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)의 아미노산의 일부를 치환하는 경우에는, 원래의 아미노산을 삭제하고, 동일한 위치에 다른 아미노산을 추가하는 것을 들 수 있다. 추가되는 다른 아미노산은 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 천연 단백질 구성 아미노산, 단백질 비구성 아미노산, 비천연 아미노산을 들 수 있다. 이 중에서도, 유전자 공학적 생산의 관점에서, 천연형 아미노산을 적합하게 사용할 수 있다.
단, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)의 아미노산을 치환하여 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)로 하는 경우에는, 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 구성되는 것이 필요하고, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)에는 리신(K)을 포함하지 않도록 한 서열로 하는 것이 바람직하다. 또한 아르기닌(R)도 포함하지 않도록 한 서열이면, 아르기닌을 인식하는 프로테아제에 대한 내성도 향상되어 바람직하다.
따라서, 치환에 의해 도입되는 아미노산으로서는, 소수성 아미노산, 리신(K) 및 아르기닌(R) 이외의 아미노산이면 특별히 한정되지 않지만, 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H) 등의 친수성 아미노산; 시스테인(C), 글리신(G), 메티오닌(M), 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y) 등의 중성 아미노산 중 어느 것이 바람직하다. 이 중에서도, 상기 친수성 아미노산 중 어느 것이 보다 바람직하다. 나아가, 알칼리성 조건 하에서의 안정성이 향상되는 관점에서, 아스파라긴산(D), 글루타민(Q), 글루탐산(E), 히스티딘(H)이 바람직하다.
연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 A 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함한 경우에는, 각 도메인의 C 말단의 K만을 치환하면 된다. 한편으로, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함한 경우에는, C 말단과 4위치의 2개의 K가 포함되어 있고, 적어도 C 말단의 K를 치환하는 것이 바람직하고, 추가로 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 중의 K도 치환하는 것이 보다 바람직하다.
예를 들어, 단백질 A의 B 도메인이 2개 연결되어 생기는 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)가 소수성 아미노산의 치환에 의해 제작된 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)인 경우, 추가로 C 말단의 리신(K)을 소수성 아미노산, 리신(K) 및 아르기닌(R) 이외의 아미노산으로 치환한 것이 바람직하고, 추가로 C 말단의 리신(K) 및 4위치의 리신(K)의 2개의 아미노산을 소수성 아미노산, 리신(K) 및 아르기닌(R) 이외의 아미노산으로 치환한 것이 보다 바람직하다. 구체적으로는, 1위치의 V 및 5위치의 F에 더하여 C 말단의 K 및 4위치의 K를, 아스파라긴(N), 아스파라긴산(D)이나 히스티딘(H)으로 치환한 서열 등을 바람직한 예로서 들 수 있다.
또한, C 말단의 K 및 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)에 포함되는 어느 한쪽의 K를 상술한 방법으로 결실시키는 경우에는, C 말단의 K만을 치환하거나, 4위치의 K만을 치환해도 된다.
상기 변이를 가입함으로써, 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은 세린 프로테아제에 내성을 갖는 것이 가능해진다. 세린 프로테아제란, 트립신, 플라스민 등을 예로서 들 수 있고, 통상, 대장균 등의 미생물이나 CHO 세포 등의 배양 세포에서 생성, 축적되는 프로테아제이다.
본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질을 면역 글로불린 결합성 친화성 리간드로 하여 친화성 분리제를 제작하고, 면역 글로불린을 정제하기 위해 사용하는 경우에는, 해당 친화성 분리제에 통과시키는 항체 생산한 CHO 세포 등의 배양 상청 중에 포함되는 프로테아제의 영향을 받는 경우가 있다.
본 발명자들의 검토에 따르면, 세린 프로테아제의 영향에 의해, 각 도메인의 아미노산 서열 중에서도 특정 부분에서 절단을 받고 있는 것이, 처음으로 밝혀졌다. 이러한 검토 결과를 고려하여, 세린 프로테아제에 내성을 갖는 아미노산 서열에 개변된 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질을 리간드로 하여 친화성 분리제를 제작한 경우, 세린 프로테아제의 영향을 받는 일 없이, 충분한 면역 글로불린 결합성을 발휘하여, 목적으로 하는 면역 글로불린을 정제하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 친화성 분리제는, 반복 사용한 경우에도, 리간드의 면역 글로불린 결합성이 저하되는 일 없이, 효율적으로 면역 글로불린을 정제하는 것이 가능하다.
그 때문에, 본 발명의 제2 실시 형태에 있어서의 단백질은 면역 글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 활성이 충분히 높아 친화성 리간드로서 적합하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 리간드로서 안정되게 반복 사용하는 것이 가능하여, 공업적으로 유리하다.
여기서, 본 명세서에 있어서 세린 프로테아제 내성이 있는지는, 다음 방법으로 확인한다. 2mg/mL의 리간드 용액 10μL에 1 내지 10mg/mL의 세린 프로테아제 용액을 2μL 첨가한 용액을, 37℃, 15시간 가열했을 때에, 절단되지 않은 리간드가 많을수록 바람직하다. 세린 프로테아제 용액의 농도는, 프로테아제의 종류에 따라서 적절히 설정하면 되고, 예를 들어 트립신은 1mg/mL로 하는 것이 바람직하고, 플라스민은 10mg/mL로 하는 것이 바람직하다.
세린 프로테아제 내성이 있는 것으로서는, 절단되지 않은 리간드를 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상 유지하고 있는 것이 바람직하다. 또한, 절단되었는지의 여부는, 일반적으로 사용되는 전기 영동법(SDS-PAGE)에 의해 확인한다.
<단백질의 제조 방법>
본 발명의 제1 실시 형태 및 제2 실시 형태의 단백질(본 발명의 단백질)의 제조 방법에 대하여 이하에 설명한다.
본 발명의 단백질은, 상기 단백질을 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA를 제작하고, 해당 DNA를 번역하여 제조할 수 있다. 구체적으로는, 해당 DNA를 포함하는 벡터를 사용하여, 숙주가 되는 미생물을 형질 전환시킨 형질 전환체 또는 해당 DNA를 사용한 무세포 단백질 합성계를 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명의 단백질을 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA는, 통상 사용되는 공지된 방법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(이하, PCR로 약칭함)법을 이용하여 취득할 수 있다. 또한, 공지된 화학 합성법으로 합성하는 것도 가능하고, 또한 게놈 DNA 라이브러리로부터 얻을 수도 있다. 당해 DNA를 구성하는 염기 서열은, 코돈이 축중 코돈으로 치환되어 있어도 되고, 번역되었을 때에 동일한 아미노산을 코딩하고 있는 한, 본래의 염기 서열과 동일할 필요성은 없다.
본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA에 부위 특이적으로 변이를 도입하는 방법으로서는, 이하와 같이, 유전자 재조합 기술, PCR법 등을 사용하여 행할 수 있다.
즉, 유전자 재조합 기술에 의한 변이의 도입은, 예를 들어 본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자 중에 있어서, 변이 도입을 희망하는 목적 부위의 양측에 적당한 제한효소 인식 서열이 존재하는 경우에, 그들 제한효소 인식 서열 부분을 상기 제한효소로 절단하여, 변이 도입을 희망하는 부위를 포함하는 영역을 제거한 후, 화학 합성 등에 의해 목적으로 하는 부위에만 변이 도입한 DNA 단편을 삽입하는 카세트 변이법에 의해 행할 수 있다.
또한, PCR에 의한 부위 특이적 변이의 도입은, 예를 들어 단백질을 코딩하는 이중쇄 플라스미드를 주형으로 하여, + 및 -쇄에 상보적인 변이를 포함하는 2종의 합성 올리고 프라이머를 사용하여 PCR을 행하는 더블 프라이머법에 의해 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 단량체 단백질(1개의 도메인)을 코딩하는 DNA를, 의도하는 수만큼 직렬로 연결함으로써, 다량체 단백질을 코딩하는 DNA를 제작할 수도 있다. 예를 들어, 다량체 단백질을 코딩하는 DNA의 연결 방법은, DNA 서열에 적당한 제한효소 부위를 도입하고, 제한효소로 단편화한 이중쇄 DNA를 DNA 리가아제로 연결할 수 있다. 제한효소 부위는 1종류여도 되지만, 복수의 상이한 종류의 제한효소 부위를 도입할 수도 있다.
다량체 단백질을 코딩하는 DNA를 제작하는 방법은, 이러한 연결하는 방법으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 단백질 A를 코딩하는 DNA(예를 들어, 국제 공개 제2006/004067호)에 상기 변이 도입법을 적용함으로써 제작하는 것도 가능하다.
또한, 다량체 단백질을 코딩하는 DNA에 있어서, 각각의 단량체 단백질을 코딩하는 염기 서열이 동일한 경우에는, 숙주에서 상동 재조합을 유발할 가능성이 있으므로, 바람직하게는 연결되어 있는 단량체 단백질을 코딩하는 DNA의 염기 서열간의 서열 동일성이 90％ 이하, 보다 바람직하게는 85％ 이하인 것이 바람직하다.
벡터는, 상술한 단백질, 또는 그의 부분 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 DNA, 및 그 염기 서열에 작동 가능하게 연결된 숙주에서 기능할 수 있는 프로모터를 포함한다. 통상적으로는, 상술한 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA를, 적당한 벡터에 연결 또는 삽입함으로써 얻을 수 있다.
유전자를 삽입하기 위한 벡터는, 숙주 내에서 자율 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고, 플라스미드 DNA나 파지 DNA를 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 대장균을 숙주로서 사용하는 경우에는, pQE계 벡터(퀴아젠사제), pET계 벡터(머크사제) 및 pGEX계 벡터(GE 헬스케어 재팬 가부시끼가이샤제)의 벡터 등을 들 수 있다.
벡터로서는, 형질 전환의 숙주로서 브레비바실루스속 세균을 사용하는 경우에는, 예를 들어 고초균 벡터로서 공지된 pUB110, 또는 pHY500(일본 특허 공개 평2-31682호 공보), pNY700(일본 특허 공개 평4-278091호 공보), pNU211R2L5(일본 특허 공개 평7-170984호 공보), pHT210(일본 특허 공개 평6-133782호 공보), 또는 대장균과 브레비바실루스속 세균의 셔틀 벡터인 pNCMO2(일본 특허 공개 2002-238569호 공보) 등을 들 수 있다.
숙주가 되는 세포에 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 도입함으로써 형질 전환체를 얻을 수 있다. 숙주로의 벡터의 형질 전환 방법으로서는, 예를 들어 칼슘 이온을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 아세트산리튬법, 아그로박테리아 감염법, 파티클 건법 또는 폴리에틸렌글리콜법 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 벡터를 숙주에서 유지하는 방법으로서는, 예를 들어, 세포 내에서 게놈(염색체)으로부터 독립하여 벡터의 자율 복제에 의해 유지하는 방법이나, 제작한 유전자를 게놈(염색체)에 조립하여, 게놈의 복제에 의존하여 유지하는 방법 등을 들 수 있다.
숙주가 되는 세포에 대해서는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 저렴하게 대량 생산하기 위해서는, 바람직하게는 대장균, 고초균, 브레비바실루스속, 스타필로코커스속, 스트렙토코커스속, 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 코리네박테리움속(Corynebacterium) 등의 박테리아(진정세균)를 적합하게 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, 고초균, 브레비바실루스속, 스타필로코커스속, 스트렙토코커스속, 스트렙토마이세스속(Streptomyces), 코리네박테리움속(Corynebacterium) 등의 그람 양성균이 좋다. 더욱 바람직하게는, 단백질 A의 대량 생산으로의 적응예(국제 공개 제2006/004067호)가 공지된 브레비바실루스속 세균이 좋다.
브레비바실루스속 세균으로서는, 한정되지 않지만, 브레비바실루스 아그리(Brevibacillus agri), 비. 보르스텔렌시스(B. borstelensis), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 센트로스포루스(B. centrosporus), 비. 초시넨시스(B. choshinensis), 비. 포르모수스(B. formosus), 비. 인보카투스(B. invocatus), 비. 라테로스포루스(B. laterosporus), 비. 림노필루스(B. limnophilus), 비. 파라브레비스(B. parabrevis), 비. 레우스제리(B. reuszeri), 비. 테르모루베르(B. thermoruber)가 예시된다.
바람직하게는, 브레비바실루스 브레비스 47주(JCM6285), 브레비바실루스 브레비스 47K주(FERM BP-2308), 브레비바실루스 브레비스 47-5Q주(JCM8970), 브레비바실루스 초시넨시스 HPD31주(FERM BP-1087) 및 브레비바실루스 초시넨시스 HPD31-OK주(FERM BP-4573)가 예시된다.
생산량의 향상 등의 목적에 따라서, 상기 브레비바실루스속 세균의 프로테아제 결손주, 고발현주, 또는 아포 형성능 결실주와 같은 변이주(또는 유도주)를 사용해도 된다. 구체적으로 열거하면, 브레비바실루스 초시넨시스 HPD31 유래의 프로테아제 변이주인 브레비바실루스 초시넨시스 HPD31-OK(일본 특허 공개 평6-296485호 공보)나, 아포 형성능을 갖지 않는 브레비바실루스 초시넨시스 HPD31-SP3(국제 공개 제2005/045005호 공보)을 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질은, 형질 전환체, 또는 상기 DNA를 사용한 무세포 단백질 합성계를 이용하여 제조할 수 있다.
형질 전환체를 사용하여 단백질을 제조하는 경우, 단백질은 형질 전환체의 세포 내(페리플라즘 영역 내를 포함함), 또는 배양 용액(세포 외)에 축적시켜 회수할 수 있다. 세포 내에 축적하면, 발현 단백질의 산화를 방지할 수 있고, 배지 성분과의 부반응도 없는 점에서 유리하고, 페리플라즘 영역 내에 축적하면, 세포 내 프로테아제에 의한 분해를 억제할 수 있는 점에서 유리하다.
한편, 형질 전환체의 세포 외로 단백질을 분비하면, 균체 파쇄나 추출의 공정이 불필요해지기 때문에, 제조 비용이 억제되는 점에서 유리하다. 한편으로, 프로테아제도 분비하는 숙주인 경우, 배양 도중에 목적으로 하는 단백질이 분해될 가능성이 있다.
구체적인 방법으로서, 단백질이 배양 세포 내(페리플라즘 영역 내를 포함함)에 축적될 경우에는, 예를 들어 배양액으로부터 원심 분리, 여과 등의 방법에 의해 균체를 채취하고, 계속해서, 이 균체를 초음파 파쇄법, 프렌치 프레스법 등에 의해 파쇄하고/파쇄하거나, 계면 활성제 등을 첨가하여 가용화함으로써, 세포 내에 축적 생산된 단백질을 회수할 수 있다. 이 때, 프로테아제도 용출되면, 목적으로 하는 단백질이 분해될 가능성이 있다.
재조합 단백질이 분비 생산될 경우에는, 배양 종료 후에, 원심 분리, 여과 등의 일반적인 분리 방법으로, 배양 세포와 분비 생산된 단백질을 포함하는 상청을 분리함으로써 생산된 재조합 단백질을 회수할 수 있다.
본 발명의 단백질을 무세포 단백질 합성계에 의해 제조하는 경우, 무세포 단백질 합성계로서는, 세포 추출액을 사용하여 인비트로(in vitro)에서 단백질을 합성하는 계라면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 원핵 세포 유래, 식물 세포 유래, 고등 동물 세포 유래의 합성계 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 단백질은, 상기한 형질 전환체를 배지에서 배양하고, 다른 단백질과의 융합 단백질의 형태로 발현시켜, 해당 배양물로부터 해당 융합 단백질을 채취하고, 해당 융합 단백질을 적절한 프로테아제에 의해 절단하여, 원하는 단백질을 채취함으로써 제조할 수도 있다.
상기한 형질 전환체를 배지에서 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법에 따라서 행해진다. 얻어진 형질 전환체의 배양에 사용하는 배지는, 해당 단백질을 고효율, 고수량으로 생산할 수 있는 것이면 특별히 제한은 없다.
구체적으로는, 글루코오스, 자당, 글리세롤, 폴리펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 카사미노산 등의 탄소원이나 질소원을 사용할 수 있다. 그 밖에, 칼륨염, 나트륨염, 인산염, 마그네슘염, 망간염, 아연염, 철염 등의 무기 염류가 필요에 따라서 첨가된다. 영양 요구성 숙주 세포를 사용하는 경우에는, 생육에 요구되는 영양 물질을 첨가하면 된다. 또한, 필요하다면 페니실린, 에리트로마이신, 클로람페니콜, 네오마이신, 카나마이신 등의 항생 물질이 첨가되어도 된다.
대장균을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 LB 배지(트립톤 1％, 효모 엑기스 0.5％, NaCl 1％), 또는 2xYT 배지(트립톤 1.6％, 효모 엑기스 1.0％, NaCl 0.5％) 등을 들 수 있다.
브레비바실루스속 세균을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 TM 배지(펩톤 1％, 고기 엑기스 0.5％, 효모 엑기스 0.2％, 글루코오스 1％; pH 7.0), 또는 2SL 배지(펩톤 4％, 효모 엑기스 0.5％, 글루코오스 2％; pH 7.2) 등을 들 수 있다.
또한, 균체 내외에 존재하는 숙주 유래의 프로테아제에 의한 당해 목적 단백질의 분해, 저분자화를 억제하기 위해서, 공지된 각종 프로테아제 저해제, 즉 페닐메탄 술포닐 플루오라이드(Phenylmethane sulfonyl fluoride; PMSF), 벤즈아미딘(Benzamidine), 4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐 플루오라이드(4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride; AEBSF), 안티페인(Antipain), 키모스타틴(Chymostatin), 류펩틴(Leupeptin), 펩스타틴(Pepstatin) A, 포스포르아미돈(Phosphoramidon), 아프로티닌(Aprotinin), 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetra acetic acid; EDTA) 및/또는 그 밖에 시판되고 있는 프로테아제 저해제를 적당한 농도로 첨가해도 된다.
또한, 본 발명의 단백질을 올바르게 폴딩시키기 위해서, 예를 들어 GroEL/ES, Hsp70/DnaK, Hsp90, Hsp104/ClpB 등의 분자 샤페론을 이용해도 된다. 분자 샤페론(chaperone)은, 예를 들어 공발현, 또는 융합 단백질화 등의 방법으로, 본 발명의 단백질과 공존시킬 수 있다. 단백질의 올바른 폴딩을 목적으로 하는 경우에는, 올바른 폴딩을 조장하는 첨가제를 배지 중에 첨가하는 것, 및 저온에서 배양하는 것 등의 방법도 가능하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
재조합 단백질은, 배양 온도는 15 내지 42℃, 바람직하게는 20 내지 37℃에서, 통기 교반 조건에서 호기적으로 수 시간 내지 수일 배양함으로써 제조할 수 있다. 경우에 따라서는, 통기를 차단하여 혐기적으로 배양해도 된다.
재조합 단백질의 정제는 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등을 단독으로 또는 적절히 조합함으로써 행할 수 있다.
얻어진 정제 물질이 목적 단백질인 것에 대한 확인은, 통상의 방법, 예를 들어 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, N 말단 아미노산 서열 분석, 웨스턴 블롯팅, 효소 면역 측정법(ELISA) 등에 의해 행할 수 있다.
<친화성 분리제>
본 발명의 단백질을 친화성 리간드로서, 수불용성 기재를 포함하는 담체에 고정화함으로써, 본 발명의 친화성 분리제를 얻을 수 있다. 여기서, 「친화성 리간드」란, 항원과 면역 글로불린의 결합으로 대표되는, 특이적인 분자간의 친화력에 기초하여, 어떤 분자의 집합으로부터 목적으로 하는 분자를 선택적으로 포집(결합)하는 물질(관능기)을 가리키는 용어이며, 본 명세서에 있어서는, 면역 글로불린에 대하여 특이적으로 결합하는 단백질을 가리킨다. 본 명세서에 있어서는, 간단히 「리간드」라고 표기한 경우에도, 「친화성 리간드」와 동의이다.
본 발명에 사용되는 수불용성 기재를 포함하는 담체로서는, 글래스 비즈, 실리카 겔 등의 무기 담체; 가교 폴리비닐알코올, 가교 폴리아크릴레이트, 가교 폴리아크릴아미드, 가교 폴리스티렌 등의 합성 고분자나; 결정성 셀룰로오스, 가교 셀룰로오스, 가교 아가로오스, 가교 덱스트란 등의 다당류를 포함하는 유기 담체; 나아가 이들의 조합에 의해 얻어지는 유기-유기, 유기-무기 등의 복합 담체 등을 들 수 있다.
시판품으로서는, 다공질 셀룰로오스 겔인 GCL2000(세이가가꾸 고교 가부시끼가이샤제), 알릴덱스트란과 메틸렌비스아크릴아미드를 공유 결합으로 가교한 세파크릴(Sephacryl)(등록 상표) S-1000(GE 헬스케어 재팬 가부시끼가이샤제), 아크릴레이트계 담체인 토요펄(Toyopearl)(등록 상표)(도소 가부시끼가이샤제), 아가로오스계 가교 담체인 세파로오스(Sepharose)(등록 상표) CL4B(GE 헬스케어 재팬 가부시끼가이샤제), 및 셀룰로오스계 가교 담체인 셀루핀(Cellufine)(등록 상표)(JNC 가부시끼가이샤제) 등을 예시할 수 있다. 단, 본 발명에 있어서의 수불용성 담체는, 예시된 이들 담체만으로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 사용되는 수불용성 담체는, 본 발명의 친화성 분리제의 사용 목적 및 방법에서 볼 때, 표면적이 큰 것이 바람직하고, 적당한 크기의 세공을 다수 갖는 다공질인 것이 바람직하다. 담체의 형태로서는, 비즈상, 모놀리스상, 섬유상, 막상(중공사를 포함함) 등 모두 가능하고, 임의의 형태를 선택할 수 있다.
리간드의 고정화 방법에 대해서는, 예를 들어 리간드에 존재하는 아미노기, 카르복실기, 히드록실기, 카르보아미드기, 폴리에틸렌옥시기 또는 티올기를 이용한, 종래의 커플링법으로 담체에 결합해도 된다.
커플링법으로서는, 담체를 브롬화시안, 에피클로로히드린, 디글리시딜에테르, 토실클로라이드, 트레실클로라이드, 히드라진 및 과요오드산나트륨 등과 반응시켜 담체를 활성화하여(또는 담체 표면에 반응성 관능기를 도입하여), 리간드로서 고정화하는 화합물과 커플링 반응을 행하여 고정화하는 방법, 또한 담체와 리간드로서 고정화하는 화합물이 존재하는 계에 카르보디이미드와 같은 축합 시약, 또는 글루타르알데히드와 같이 분자 중에 복수의 관능기를 갖는 시약을 첨가하여 축합, 가교하는 것에 의한 고정화 방법을 들 수 있다.
또한, 리간드와 담체의 사이에 복수의 원자를 포함하는 스페이서 분자를 도입해도 되고, 담체에 리간드를 직접 고정화해도 된다. 따라서, 고정화를 위해서, 본 발명의 단백질에 대하여 화학 수식해도 되고, 고정화에 유용한 아미노산 잔기를 첨가해도 된다.
고정화에 유용한 아미노산 잔기를 부가한 경우, 부가한 아미노산 잔기를 고정화용 태그라고 칭한다. 고정화용 태그는 아미노산 잔기를 1 이상의 임의의 수만큼 부가할 수 있고, 부가하는 위치는 리간드의 N 말단측 및/또는 C 말단측을 들 수 있다. 고정화에 유용한 아미노산으로서는, 측쇄에 고정화의 화학 반응에 유용한 관능기를 갖고 있는 아미노산을 들 수 있고, 예를 들어 측쇄에 아미노기를 포함하는 리신(K)이나, 측쇄에 티올기를 포함하는 시스테인(C)을 들 수 있다.
한편, 담체에 리간드를 직접 고정화하는 방법으로서는, 리간드의 아미노산 서열의 임의의 개소에, 고정화에 유용한 아미노산을 치환ㆍ삽입하는 것을 들 수 있다.
본 발명의 본질은, 본 발명에 있어서 단백질에 부여한 효과가, 해당 단백질을 리간드로서 고정화한 분리제(매트릭스)에 있어서도 동일하게 부여되는 것에 있고, 고정화를 위해 어떻게 수식ㆍ개변해도, 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 친화성 분리제에 있어서의 리간드와 담체의 고정화 양식으로서는, 다점 고정과 단점 고정을 들 수 있다. 다점 고정이란, 리간드 본체 및/또는 고정화 태그가 2점 이상에서 담체와 화학 결합하여 고정화되어 있는 양식을 말하고, 단점 고정이란, 리간드 본체 또는 고정화 태그가 1점에서 담체와 화학 결합하여 고정화되어 있는 양식을 말한다.
리간드가 담체에 결합하여 고정화된 경우, 리간드에 포함되는 2 이상의 도메인은, 각각 고정화 도메인과 비고정화 도메인으로 구별된다. 여기에서 말하는 고정화 도메인이란, 담체와 다점 또는 단점에서 결합하고 있는 도메인이며, 비고정화 도메인이란, 담체와 결합하지 않은 도메인이다.
본 발명의 친화성 분리제에 있어서는, 항체의 정제 공정 등에서 사용한 경우에 프로테아제의 영향을 받지 않고 리간드가 안정적으로 기능할 수 있다는 효과를 현저하게 발휘하는 점에서, 리간드는 비고정화 도메인을 1개 이상 포함하는 것이 바람직하고, 바람직하게는 2개 이상, n량체의 리간드인 경우에는, n-1개 이상이 비고정화 도메인인 것이 바람직하고, 가장 바람직하게는 n개의 모두가 비고정화 도메인이다.
담체에 고정화된 리간드에 있어서의 고정화 도메인-비고정화 도메인의 패턴으로서는, 이하의 4개를 들 수 있다.
(1) 리간드 중의 모든 도메인이 고정화 도메인인 경우
(2) 리간드 중의 N 말단 및/또는 C 말단측의 도메인이 1개 이상 고정화 도메인인 경우
(3) 리간드 중의 양쪽 말단 이외의 도메인이 1개 이상 고정화 도메인인 경우
(4) 리간드의 N 말단 및/또는 C 말단에 고정화용 태그를 도입하고, 고정화 도메인이 존재하지 않는 경우
이하, 4량체의 단백질을 리간드로서 담체에 고정화한 경우의 모식도인 도 2 내지 5를 예로서 설명하지만, 2량체 이상의 단백질이면 동일하게 생각할 수 있다. 또한, 도 2 내지 5에 있어서, 4량체에 포함되는 4개의 도메인을, 각각 a 내지 d라고 나타내고, 제1 및 제2 연결 엘리먼트에 상당하는 아미노산 서열을, a 내지 d를 연결하는 실선으로 나타냈다. 또한, a 내지 d의 아미노산 서열은 동일해도, 상이해도 되고, a와 d는 각각 C 말단측 또는 N 말단측의 어느 경우에도 동일하게 생각할 수 있다.
상기 (1)의 경우에는, 비고정화 도메인은 형성되지 않는다. 예를 들어, 도 2에 모식적으로 도시된 경우이며, a 내지 d의 모든 도메인이 담체에 결합되어 있기 때문에, 친화성 분리제를 정제 공정에서 사용할 때에 프로테아제의 영향으로 연결 엘리먼트가 절단되어도, 리간드는 담체에 결합된 채로 기능할 수 있다.
상기 (2)의 경우에는, 비고정화 도메인이 1개 이상 존재하는 경우이며, 도 3의 (A) 내지 (C)에 모식적으로 도시된다. 도 3의 (A)에서는, 리간드의 N 말단 또는 C 말단으로부터 2개의 도메인(a, b)이 담체에 결합되는 고정화 도메인이며, 반대측 말단의 2개의 도메인(c, d)이 담체에 결합되지 않은 비고정화 도메인이다. 이 경우, a와 b의 연결 엘리먼트가 절단되어도 리간드는 기능할 수 있지만, b와 c 또는 c와 d의 연결 엘리먼트가 절단되면, c와 d는 담체로부터 이탈되어 리간드로서의 기능을 수행할 수 없기 때문에 바람직하지 않다.
도 3의 (B)에서는, 리간드의 N 말단 또는 C 말단의 도메인(a)이 담체에 결합되는 고정화 도메인이며, 여기에 연결되는 3개의 도메인(b, c, d)이 담체에 결합되지 않은 비고정화 도메인이다. 이 경우, a와 b, b와 c 또는 c와 d 중 어느 연결 엘리먼트가 절단되어도, b 내지 d는 담체로부터 이탈되어 리간드로서의 기능을 수행하지 못하기 때문에 바람직하지 않다. 그 중에서도, a와 b의 연결 엘리먼트와 같이 고정화 도메인과 비고정화 도메인의 연결 엘리먼트가 절단되면, 해당 비고정화 도메인에 연속해서 결합하는 도메인도 기능하지 못하게 되기 때문에 특히 문제가 된다.
도 3의 (C)에서는, 리간드의 N 말단 및 C 말단의 도메인(a, d)이 담체에 결합되는 고정화 도메인이며, 그 사이의 2개의 도메인(b, c)이 담체에 결합되지 않은 비고정화 도메인이다. 이 경우, a와 b, b와 c 또는 c와 d 중 어느 2개 이상의 연결 엘리먼트가 절단되면, b, c는 담체로부터 이탈되어 리간드로서의 기능을 수행하지 못하기 때문에 바람직하지 않다.
상기 (3)의 경우에는, 비고정화 도메인이 1개 이상 존재하는 경우이며, 도 4의 (A), 도 4의 (B)에 모식적으로 도시된다. 도 4의 (A)에서는, 리간드의 N 말단과 C 말단의 중간에 존재하는 1개의 도메인(c(b여도 동일함))이 담체에 결합되는 고정화 도메인이며, 양쪽 말단의 2개의 도메인(a, d)과 그것에 연결되는 1개의 도메인(b(c여도 동일함))이 담체에 결합되지 않은 비고정화 도메인이다. 이 경우, a와 b, b와 c 또는 c와 d 중 어느 연결 엘리먼트가 절단되어도, a, b, d는 담체로부터 이탈되어 리간드로서의 기능을 수행하지 못하기 때문에 바람직하지 않다. 그 중에서도, b와 c, c와 d의 연결 엘리먼트와 같이, 고정화 도메인과 비고정화 도메인의 연결 엘리먼트가 절단되는 것이 특히 문제가 된다.
도 4의 (B)에서는, 리간드의 N 말단과 C 말단의 중간에 존재하는 2개의 도메인(b, c)이 담체에 결합되는 고정화 도메인이며, 양쪽 말단의 2개의 도메인(a, d)이 담체에 결합되지 않은 비고정화 도메인이다. 이 경우, b와 c의 연결 엘리먼트가 절단되어도 리간드는 기능할 수 있지만, a와 b 또는 c와 d의 연결 엘리먼트가 절단되면, c와 d는 담체로부터 이탈되어 리간드로서의 기능을 수행하지 못하기 때문에 바람직하지 않다.
상기 (4)의 경우에는, 고정화용 태그를 도입하여 담체와의 결합을 형성하고 있고, 모든 도메인이 비고정화 도메인이 되는 경우이며, 도 5의 (A), 도 5의 (B)에 모식적으로 도시된다. 도 5의 (A)에서는, 리간드의 N 말단 또는 C 말단의 도메인(a)의 말단 서열에 고정화용 태그를 도입하여 담체에 결합시키고 있다. 이 경우, a와 b, b와 c 또는 c와 d 중 어느 연결 엘리먼트가 절단되어도 b 내지 d는 담체로부터 이탈되어 리간드로서의 기능을 수행하지 못하게 되어 바람직하지 않다. 고정화 태그를 갖는 a를 고정화 도메인으로서 생각하면, a와 b의 연결 엘리먼트의 절단이 상술한 도 3의 (B)와 동일하게 특히 문제가 된다. 덧붙여, a의 말단 서열이 프로테아제로 절단되면, 모든 도메인이 이탈되어 리간드로서 기능하지 못하게 되기 때문에 특히 문제가 된다. 이 때문에, a의 고정화용 태그를 연결하는 말단(C 말단 또는 N 말단) 서열에 있어서, 프로테아제 내성을 부여하기 위한 변이가 도입될 필요가 있다.
도 5의 (B)에서는, 리간드의 N 말단 및 C 말단의 도메인(a, d)의 말단 서열에 고정화용 태그를 도입하여 담체에 결합시키고 있다. 이 경우에도, 고정화 태그를 갖는 a, d를 고정화 도메인으로서 생각하면, 상술한 도 3의 (C)와 동일한 문제가 있다. 또한, a 및 d의 말단 서열이 프로테아제로 절단되면, 모든 도메인이 이탈되어 리간드로서 기능하지 못하게 되기 때문에 특히 문제가 된다. 이 때문에, a, d의 고정화용 태그를 연결하는 말단(C 말단 및 N 말단) 서열에 있어서, 프로테아제 내성을 부여하기 위한 변이가 도입될 필요가 있다.
상술한 바로부터, 본 발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제1, 제3 형태 및 제2 실시 형태의 단백질에 있어서의 변이 결합 엘리먼트 위치로서는, 바람직하게는 고정화 도메인과 비고정화 도메인의 사이나, 비고정화 도메인과 비고정화 도메인의 사이에 있는 것이다. 보다 바람직하게는 적어도 고정화 도메인과 비고정화 도메인의 사이에 있는 것이고, 더욱 바람직하게는 비고정화 도메인과 비고정화 도메인의 사이에도 있는 것이다.
또한, 리간드에 고정화용 태그를 도입한 경우에는, 고정화용 태그를 갖는 도메인을 고정화 도메인으로 하여, 상기 범위에서 바람직한 형태를 생각하면 된다.
발명의 제1 실시 형태에 있어서의 제2 형태의 단백질에 있어서의, 4위치의 리신 및 C 말단의 리신이 결실 또는 치환된 도메인(변이 도메인)의 위치로서는, 적어도 고정화 도메인이 변이 도메인인 것이 바람직하고, 그에 덧붙여 고정화 도메인에 직접 연결되는 비고정화 도메인도 변이 도메인인 것이 보다 바람직하며, 연속해서 연결되는 비고정화 도메인 중 고정화 도메인에 보다 가까운 것이 변이 도메인인 것이 더욱 바람직하다.
한편, 고정화 도메인으로부터 가장 떨어진 비고정화 도메인은 다른 도메인에 연결되지 않은 측의 말단은 프로테아제의 영향을 받아도 특별히 문제가 없으므로, 변이 도메인이 아니어도 된다. 단, 가장 떨어진 비고정화 도메인이 변이 도메인이면, 다른 도메인과의 연결 개소가 프로테아제에 의한 영향을 받는 일이 없으므로 바람직하다. 또한, 리간드에 고정화용 태그를 도입한 경우에는, 고정화용 태그를 갖는 도메인을 고정화 도메인으로 하여, 상기 범위에서 바람직한 형태를 생각하면 된다.
리간드 중의 담체와 결합을 형성하는 부위는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 리간드 서열의 말단이다. 말단에서 고정화함으로써 리간드의 자유도가 높아지고, 면역 글로불린과 결합 가능한 영역을 넓게 유지함으로써, 면역 글로불린과의 결합능을 높게 유지할 수 있다. 리간드의 말단이라면, N 말단이어도 C 말단이어도 어느 쪽이어도 된다.
본 발명의 친화성 분리제는, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질에 결합하는 것이 바람직하다. 친화성 분리제가 결합하는, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질로서는, 예를 들어 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 항체, 항체 유도체, 단편 항체 및 단편 항체 유도체를 들 수 있다. 이들 단백질을, 친화성 칼럼 크로마토그래피 정제법에 의해 분리 정제하는 것이 가능하게 된다.
또한, 이들 단백질은 일반적으로 차이니즈 햄스터 난소 유래 CHO 세포나 마우스 골수종 세포 Sp2/0 세포, NS0 세포, 메탄올 자화성 피키아 효모, 빵 효모, 누룩 곰팡이 등을 사용하여 제조되지만, 그들 배양액 내에 프로테아제가 존재하는 경우, 본 발명의 친화성 분리제는 그 프로테아제에 의한 열화를 최소한으로 억제할 수 있기 때문에 바람직하다.
여기서 「면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 항체」로서는, 예를 들어 IgG를 들 수 있다. 「항체 유도체」란, IgG 유도체를 가리키고, 예를 들어 인간 IgG의 일부 도메인을 타생물종의 IgG 항체의 도메인으로 치환하여 융합시킨 키메라 항체나, 인간 IgG의 CDR 부분을 타생물종 항체의 CDR 부분으로 치환하여 융합시킨 인간형화 항체를 들 수 있다.
「단편 항체」로서는, 예를 들어 인간 IgG의 Fab 영역만을 포함하는 단백질을 들 수 있다. 「단편 항체 유도체」로서는, 예를 들어 인간 IgG의 Fv 영역과 Fc 영역을 융합시킨 인공 항체를 들 수 있다. 또한, 이들 항체, 항체 유도체, 단편 항체 및 단편 항체 유도체를 총칭하는 명칭으로서 「항체 유사 분자」라는 표현을, 명세서 중에서 사용한다.
본 발명의 친화성 분리제를 사용하여, 면역 글로불린의 Fc 영역을 포함하는 단백질을 분리할 수 있다. 구체적으로는 본 발명의 친화성 분리제를 포함하고, 적어도 하나의 해당 친화성 분리제가 충전되는 용기를 구비하는 액체 크로마토그래피용 칼럼으로 할 수 있다.
Fc 영역을 포함하는 단백질(상술한 항체, 항체 유도체, 단편 항체 및 단편 항체 유도체)의 분리는, 이미 시판품으로서 존재하는 단백질 A 칼럼을 사용한 친화성 칼럼 크로마토그래피 정제법에 준하는 순서에 의해 달성할 수 있다(참고 문헌 1: Roque A. C. A. 외 저, 「J. Chromatogr. A」, 2007년, 1160권, 44-55페이지).
즉, 항체, 항체 유도체, 단편 항체 및 단편 항체 유도체를 함유하는 완충액을 중성이 되도록 조정한 후, 해당 용액을 본 발명의 액체 크로마토그래피용 칼럼에 통과시켜, 항체, 항체 유도체, 단편 항체 및 단편 항체 유도체를 흡착시킨다. 계속해서, 액체 크로마토그래피용 칼럼에 순수한 완충액을 적량 통과시켜, 칼럼 내부를 세정한다.
이 시점에서는 원하는 항체, 항체 유도체, 단편 항체 및 단편 항체 유도체는 칼럼 내의 본 발명의 친화성 분리제에 흡착된다. 계속해서, 적절한 pH로 조정한 산성 완충액(해당 매트릭스로부터의 해리를 촉진시키는 물질을 포함하는 경우도 있음)을 칼럼에 통액시켜, 원하는 항체, 항체 유도체, 단편 항체 및 단편 항체 유도체를 용출시킴으로써, 고순도의 정제가 달성된다.
본 발명의 친화성 분리제는, 리간드 화합물이나 담체의 기재가 완전히 기능이 손상되지 않을 정도의, 적당한 강산성 또는 강알칼리성의 순수한 완충액(적당한 변성제, 또는 유기 용제를 포함하는 용액의 경우도 있음)에 통과시켜 세정함으로써, 재이용이 가능하다.
일반적으로는, 단백질 A를 구성하는 각각의 도메인은, Fab 영역보다도 Fc 영역에 대하여 보다 강하게 결합한다(참고 문헌 1). 따라서, 본 발명의 단백질의 「면역 글로불린에 대한 친화성」은, 본질적으로는 Fc 영역에 대한 친화성을 가리키는 표현이며, Fab 영역에 대한 결합력만이 변화되어도, 면역 글로불린에 대한 친화성의 강도는 크게 변화되지 않는다. 본 발명의 단백질은, 단백질 A의 면역 글로불린 결합 도메인이 갖는, Fab 영역으로의 2차적인 친화성이 저하되어 있어, 면역 글로불린과의 상호 작용에 있어서의 2차적인 결합의 영향을 배제할 수 있다는 효과를 발휘한다.
한편으로, Fc 영역으로의 친화성은 유지되고 있으므로, 면역 글로불린 전체에 대한 친화성은 유지되고 있다. 본 발명의 단백질이 갖는 면역 글로불린에 대한 친화성은, 인간 면역 글로블린 G 제제에 대한 친화성을 후술하는 비아코어(Biacore) 시스템에 의해 측정했을 때에, 친화 상수(KA)가 106(M-1) 이상인 것이 바람직하고, 107(M-1) 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 단백질의, 면역 글로불린에 대한 친화성은, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 원리를 사용한 비아코어(Biacore)(등록 상표) 시스템(GE 헬스케어 재팬 가부시끼가이샤제) 등의 바이오센서에 의해 측정할 수 있지만, 측정 방법은 이것으로 한정되는 것은 아니다.
측정 조건으로서는, 단백질 A가 면역 글로불린의 Fc 영역에 결합했을 때의 결합 시그널을 검출할 수 있으면 되고, 온도 20 내지 40℃(일정 온도)로 pH 6 내지 8의 중성 조건에서 측정함으로써 간단하게 평가할 수 있다.
본 발명의 단백질이 친화성을 나타내는 대상으로서는, 예를 들어 Fab 영역, 및 Fc 영역을 부족함 없이 함유하는 면역 글로불린 분자, 및 그의 유도체를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 단백질은, Fc 영역측의 일부분을 포함하는 단백질에 대해서도 친화성을 갖고, 결합 대상은, Fc 영역을 완전히 포함하는 단백질일 필요는 없다. 항체의 입체 구조는 이미 알려진 것이므로, 단백질 공학적으로 본 발명의 단백질이 결합하는 영역의 입체 구조를 유지할 뿐 아니라, Fab 영역이나 Fc 영역에 한층 더한 개변(단편화 등)을 실시하는 것은 가능하고, 본 발명의 단백질은 그들의 파생물에도 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질을 고정화한 친화성 분리제의 면역 글로불린에 대한 결합능은, 예를 들어 과잉의 면역 글로불린 용액 중에 침지시킨 분리제가 어느 정도의 면역 글로불린을 흡착 가능한지를 평가하는 정적 흡착 용량이나, 분리제를 충전시킨 칼럼에 면역 글로불린 용액을 통액시켰을 때에 파과(破過)되는 액량을 평가하는 동적 흡착 용량 등으로 비교 평가 가능하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<본 발명의 실시 형태 1의 실시예>
[제작예]
1) 야생형 단백질 A 발현 플라스미드의 제작
5'측에 catatg(NdeI), 3'측에 ctcgag(XhoI)를 부가한 야생형 C 도메인 2량체(WT)를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 7)을 화학 합성하였다. 얻어진 DNA 단편을 제한효소 NdeI 및 XhoI(모두 서모 사이언티픽(Thermo Scientific)사제)를 사용하여 소화 후, 정제ㆍ회수를 행하였다.
또한, 서열 번호 7은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 DNA 서열을 바탕으로 대장균 발현용으로 코돈 최적화를 행하여 결정하였다.
단백질 발현 벡터로서, T7 프로모터를 갖고, 멀티클로닝 사이트 하류에 6xHis 태그 및 종지 코돈을 갖는 벡터 pET22b(머크사제)를 선택하였다. pET22b를 제한효소 NdeI 및 XhoI(모두 서모 사이언티픽(Thermo Scientific)사제)를 사용하여 소화 후, 정제ㆍ회수를 행하였다.
제한효소 처리한 서열 번호 7의 DNA 단편과 pET22b 벡터를, DNA 리가아제(리가패스트 래피드 DNA 라이게이션 시스템(LigaFast Rapid DNA Ligation System), 프로메가(Promega)사제)를 사용하여 연결하여, WT 발현 벡터를 구축하였다.
WT 발현 벡터를 사용하여 대장균 JM109(다카라(TaKaRa)사제)의 형질 전환을 행하고, 정해진 방법에 의해 플라스미드 DNA를 증폭 및 추출하였다.
2) 단백질 A 변이체(Mut) 발현 플라스미드 제작
야생형 C 도메인 2량체의 아미노산 서열의 일부에 결실 및/또는 치환의 변이를 갖는 단백질 Mut1 내지 Mut13을 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 34 내지 46)을 포함하는 발현 벡터의 제작을 행하였다. Mut1 내지 13 발현 벡터는, 표 1에 나타낸 주형과 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(서열 번호 8 내지 33)의 조합에 의해 퀵 체인지법(퀵체인지 라이트닝 부위-지정 돌연변이유발 키트(QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit), 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)사제)을 사용하여 제작하였다. 퀵 체인지법은 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)사의 프로토콜에 따라서 실시하였다.
Figure pct00001
얻어진 Mut1 내지 13 발현 벡터는 JM109(다카라(TaKaRa)사제)를 형질 전환함으로써 정해진 방법에 의해 증폭 및 추출하였다.
얻어진 Mut1 내지 13 발현 벡터의 DNA 서열의 해석은 DNA 시퀀서 3130xl 유전자 분석기(Genetic Analyzer)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사제)를 사용하여 행하였다. 발현 벡터의 시퀀싱 PCR 반응은 빅 다이 터미네이터(Big Dye Terminator) v.1.1 사이클 시퀀싱 키트(Cycle Sequenceing Kit)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사제)를 사용하여, 부속 프로토콜에 따라서 행하였다. 얻어진 시퀀싱 PCR 산물은 정해진 방법에 의해 정제하여, DNA 서열 해석에 사용하였다.
본 실시에 의해 얻어진 Mut1 내지 13 발현 벡터 중, 발현 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 서열 번호 34 내지 46에 나타낸 바와 같았다.
3) 단백질의 발현
로제타(Rosetta)(DE3)(머크사제)를, 상기 1) 및 2)에서 얻어진 WT, Mut1 내지 13 발현 벡터로 형질 전환하여, 목적 단백질인 WT, Mut1 내지 13을 각각 발현하는 형질 전환체를 얻었다. 형질 전환법은 머크사 프로토콜에 따랐다.
목적 단백질을 발현하는 형질 전환체를 50mg/L 카르베니실린을 포함하는 LB 배지에 식균하고, 30℃에서 종야 배양하여 전배양액을 얻었다. 얻어진 전배양액 10mL를 500mL LB 배지(50mg/L 카르베니실린 함유)에 식균하고, 30℃, 130rpm으로 OD600≒0.6 내지 0.8이 될 때까지 배양하였다. 이소프로필 1-티오-β-D-갈락시드(IPTG)를 최종 농도 0.1mM이 되도록 첨가하고, 추가로 배양을 4시간 계속하였다. 배양 종료 후, 원심으로써 집균하였다.
4) 단백질의 회수
상기 3)에서 집균한 균체를 50mL의 현탁 버퍼(50mM 이미다졸(imidazole) pH 8.0, 500mM NaCl)에 현탁시키고, 초음파 파쇄하였다. 원심 분리하고, 상청 획분과 침전 획분으로 분획하였다. 상청 획분을 현탁 버퍼로 평형화시킨 HisTrap HP 5mL 칼럼(GE 헬스케어 재팬사제)에 제공하고, 평형화 버퍼로 세정 후, 용출 버퍼(175mM 이미다졸(imidazole) pH 8.0, 500mM NaCl)를 사용하여 목적 단백질을 용출하였다. 용출된 목적 단백질을 투석으로 탈염수로 치환하였다. 목적 단백질은 아미콘-울트라(Amicon-Ultra) 10K(머크밀리포어사제)를 사용하여 약 30 내지 40mg/mL의 농도까지 원심 농축시켰다. 농축 후의 목적 단백질은 PBS 버퍼를 사용해서 2mg/mL로 조제하였다.
정제 종료 후의 목적 단백질을 트리신(Tricine) SDS-PAGE(eㆍ파젤 R15S; ATTO사제)에 제공하고, 분자량 약 14000Da의 위치에서 싱글 밴드를 확인하였다. WT 발현 벡터를 사용하여 얻어진 목적 단백질은 서열 번호 47의 아미노산 서열을 갖는 단백질이며, Mut1 내지 13 발현 벡터를 사용하여 얻어진 목적 단백질은, 각각, 서열 번호 48 내지 60의 아미노산 서열을 갖는 단백질이었다.
WT의 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트) 근방의 서열, 및 Mut1 내지 13의 변이 연결 엘리먼트 근방의 서열을 표 2에 나타낸다. C 도메인의 2량체 중, D58로 표시되는 위치의 아미노산이 첫 번째 도메인의 C 말단이며, D1'로 표시되는 위치의 아미노산이 두 번째 도메인의 N 말단이다. 또한 「/(사선)」은 아미노산의 결실을 나타낸다.
Figure pct00002
[실시예 1-1]
<트립신 내성 평가>
1) 프로테아제인 트립신에 대한 내성을 이하의 방법으로 평가하였다.
제작예에서 얻어진 Mut1의 단백질과 트립신을 혼합하고, 37℃에서 15분간 가열하였다. 배합량은 이하와 같다.
ㆍ제작예 1의 단백질(2mg/mL, 인산 버퍼) 10μL
ㆍ희석용 버퍼(500mM 트리스(Tris)-HCl pH 8.0) 2μL
ㆍ순수 6μL
ㆍ트립신 용액(1mg/mL) 2μL
이어서, 전기 영동용 희석액(200mM 트리스(Tris)-HCl pH 6.8, 200mM DTT, 20％ 글리세롤, 4％ SDS, 0.012％ 브로모페놀 블루; 2x샘플 버퍼(Sample buffer))을 얻어진 혼합액에 20μL 첨가하였다. 그 중 10μL를 샘플로 하여, SDS 폴리아크릴아미드 겔로써 전기 영동을 실시하였다. 비교로서, 서모리신을 첨가하지 않은 혼합액의 동량을 동일한 겔 상에서 전기 영동을 실시하였다.
전기 영동 후의 겔을 염색하고, 트립신 처리 전후에서의 단백질의 분해 유무를 염색도에 의해 비교 평가하였다. 염색도란, 전기 영동에 의해 얻어진 염색 밴드의 위치 및 강도를 말한다.
트립신 처리 전에 비해 거의 분해되지 않은 것(염색도가 90％ 이상 유지)을 ◎, 분해가 적은 것(염색도가 70％ 이상 90％ 미만을 유지)을 ○, 분해가 많은 것(염색도가 30％ 이상 70％ 미만을 유지)을 △, 대부분 분해되어 있는 것(염색도가 30％ 미만)을 ×라고 하였다.
결과를 표 3에 나타냈다.
2) 프로테아제인 플라스민에 대한 내성을 이하의 방법으로 평가하였다.
트립신 용액(1mg/mL)을 플라스민 용액(10mg/mL)으로 바꾼 것 이외에는, 트립신 내성에 대한 평가와 동일하게 하여 평가하였다. 결과를 표 3에 나타냈다.
<면역 글로불린의 흡착능 평가(SBC)>
제작예에서 얻어진 Mut1의 단백질을, 에폭시기로 활성화된 다공질 아크릴 비즈 1mL에 대하여 3mg 고정화하여 분리제로 하고, 면역 글로불린과의 결합능을 평가하였다.
통상법에 따라서, 분리제와의 정적인 흡착 용량을 평가하였다. 결과를 표 3에 나타냈다.
[실시예 1-2 내지 1-10, 비교예 1-1 내지 1-4]
Mut1의 단백질 대신에, 제작예에서 얻어진 Mut2 내지 10을 실시예 1-2 내지 1-10에, WT를 비교예 1-1에, Mut11 내지 13을 비교예 1-2 내지 1-4에 사용한 것 이외에는 실시예 1-1과 동일하게 하여, 프로테아제 내성 평가와 면역 글로불린의 흡착능 평가를 실시하였다.
결과를 표 3에 나타냈다.
Figure pct00003
C 말단의 리신이 결실 또는 치환되지 않은 비교예 1-1 내지 1-4는 트립신 내성, 플라스민 내성이 모두 낮은 것에 반해, C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 실시예 1-1 내지 1-10은 트립신 내성, 플라스민 내성 중 어느 것이 적어도 높게 개변되었다. 실시예 1-2 및 1-3은 연결 개소 서열(제1 연결 엘리먼트)이 2 아미노산 잔기로 짧고, 트립신 내성이 더욱 향상되었다.
<본 발명의 실시 형태 2의 실시예>
[제작예]
1) 야생형 단백질 A 발현 플라스미드의 제작
5'측에 catatg(NdeI), 3'측에 ctcgag(XhoI)를 부가한 야생형 C 도메인 2량체(WT)를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 61)을 화학 합성하였다. 얻어진 DNA 단편을 제한효소 NdeI 및 XhoI(모두 서모 사이언티픽(Thermo Scientific)사제)를 사용하여 소화 후, 정제ㆍ회수를 행하였다.
또한, 서열 번호 61은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래의 DNA 서열을 바탕으로 대장균 발현용으로 코돈 최적화를 행하여 결정하였다.
단백질 발현 벡터로서, T7 프로모터를 갖고, 멀티클로닝 사이트 하류에 6xHis 태그 및 종지 코돈을 갖는 벡터 pET22b(머크사제)를 선택하였다. pET22b를 제한효소 NdeI 및 XhoI(모두 서모 사이언티픽(Thermo Scientific)사제)를 사용하여 소화 후, 정제ㆍ회수를 행하였다.
제한효소 처리한 서열 번호 61의 DNA 단편과 pET22b 벡터를, DNA 리가아제(리가패스트 래피드 DNA 라이게이션 시스템(LigaFast Rapid DNA Ligation System), 프로메가(Promega)사제)를 사용하여 연결하고, WT 발현 벡터를 구축하였다.
WT 발현 벡터를 사용하여 대장균 JM109(다카라(TaKaRa)사제)의 형질 전환을 행하고, 정해진 방법에 의해 플라스미드 DNA를 증폭 및 추출하였다.
2) 단백질 A 변이체(Mut) 발현 플라스미드 제작
야생형 C 도메인 2량체의 아미노산 서열의 일부에 결실 및/또는 치환의 변이를 갖는 단백질 Mut1 내지 Mut14를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 90 내지 103)을 포함하는 발현 벡터의 제작을 행하였다. Mut1 내지 14 발현 벡터는, 표 4에 나타낸 주형과 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트(서열 번호 62 내지 89)의 조합에 의해 퀵 체인지법(퀵체인지 라이트닝 부위-지정 돌연변이유발 키트(QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit), 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)사제)을 사용하여 제작하였다. 퀵 체인지법은 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)사의 프로토콜에 따라서 실시하였다.
Figure pct00004
얻어진 Mut1 내지 14 발현 벡터는 JM109(다카라(TaKaRa)사제)를 형질 전환함으로써 정해진 방법에 의해 증폭 및 추출하였다.
얻어진 Mut1 내지 14 발현 벡터의 DNA 서열의 해석은 DNA 시퀀서 3130xl 유전자 분석기(Genetic Analyzer)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사제)를 사용하여 행하였다. 발현 벡터의 시퀀싱 PCR 반응은 빅 다이 터미네이터(Big Dye Terminator) v.1.1 사이클 시퀀싱 키트(Cycle Sequenceing Kit)(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사제)를 사용하고, 부속 프로토콜에 따라서 행하였다. 얻어진 시퀀싱 PCR 산물은 정해진 방법에 의해 정제하여, DNA 서열 해석에 사용하였다.
본 실시에 의해 얻어진 Mut1 내지 14 발현 벡터 중, 발현 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 서열 번호 90 내지 103에 나타낸 바와 같았다.
3) 단백질의 발현
로제타(Rosetta)(DE3)(머크사제)를 상기 1) 및 2)에서 얻어진 WT, Mut1 내지 14 발현 벡터로 형질 전환하고, 목적 단백질인 WT, Mut1 내지 14를 각각 발현하는 형질 전환체를 얻었다. 형질 전환법은 머크사 프로토콜에 따랐다.
목적 단백질을 발현하는 형질 전환체를 50mg/L 카르베니실린을 포함하는 LB 배지에 식균하고, 30℃에서 종야 배양하여 전배양액을 얻었다. 얻어진 전배양액 10mL를 500mL LB 배지(50mg/L 카르베니실린 함유)에 식균하고, 30 ℃, 130rpm으로 OD600≒0.6 내지 0.8이 될 때까지 배양하였다. 이소프로필 1-티오-β-D-갈락시드(IPTG)를 최종 농도 0.1mM이 되도록 첨가하고, 추가로 배양을 4시간 계속하였다. 배양 종료 후, 원심으로써 집균하였다.
4) 단백질의 회수
상기 3)에서 집균한 균체를 50mL의 현탁 버퍼(50mM 이미다졸(imidazole) pH 8.0, 500mM NaCl)에 현탁시키고, 초음파 파쇄하였다. 원심 분리하고, 상청 획분과 침전 획분으로 분획하였다. 상청 획분을 현탁 버퍼로 평형화시킨 HisTrap HP 5mL 칼럼(GE 헬스케어 재팬사제)에 제공하고, 평형화 버퍼로 세정 후, 용출 버퍼(175mM 이미다졸(imidazole) pH 8.0, 500mM NaCl)를 사용하여 목적 단백질을 용출하였다. 용출된 목적 단백질을 투석으로 탈염수로 치환하였다. 목적 단백질은 아미콘-울트라(Amicon-Ultra) 10K(머크밀리포어사제)을 사용하여 약 30 내지 40mg/mL의 농도까지 원심 농축시켰다. 농축 후의 목적 단백질은 PBS 버퍼를 사용하여 2mg/mL로 조제하였다.
정제 종료 후의 목적 단백질을 트리신(Tricine) SDS-PAGE(eㆍ파젤 R15S; ATTO사제)에 제공하고, 분자량 약 14000Da의 위치에서 싱글 밴드를 확인하였다. WT 발현 벡터를 사용하여 얻어진 목적 단백질은 서열 번호 104의 아미노산 서열을 갖는 단백질이며, Mut1 내지 14 발현 벡터를 사용하여 얻어진 목적 단백질은, 각각, 서열 번호 105 내지 118의 아미노산 서열을 갖는 단백질이었다.
WT의 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 근방의 서열, 및 Mut1 내지 14의 변이 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트) 근방의 서열을 표 5에 나타낸다. C 도메인의 2량체 중, D58로 표시되는 위치의 아미노산이 첫 번째 도메인의 C 말단이며, D1'로 표시되는 위치의 아미노산이 두 번째 도메인의 N 말단이다. 또한 「/(사선)」은 아미노산의 결실을 나타낸다.
Figure pct00005
[실시예 2-1]
<프로테아제 내성 평가>
1) 프로테아제인 서모리신에 대한 내성을 이하의 방법으로 평가하였다.
제작예에서 얻어진 Mut1의 단백질과 서모리신을 혼합하고, 37℃에서 15분간 가열하였다. 배합량은 이하와 같다.
ㆍ제작예 1의 단백질(2mg/mL, 인산 버퍼) 10μL
ㆍ희석용 버퍼(500mM 트리스(Tris)-HCl pH 8.0, 5mM CaCl2) 2μL
ㆍ순수 6μL
ㆍ서모리신 용액(1mg/mL) 2μL
이어서, 전기 영동용 희석액(200mM 트리스(Tris)-HCl pH 6.8, 200mM DTT, 20％ 글리세롤, 4％ SDS, 0.012％ 브로모페놀 블루; 2x샘플 버퍼(Sample buffer))을, 얻어진 혼합액에 20μL 첨가하였다. 그 중 10μL를 샘플로 하여, SDS 폴리아크릴아미드 겔로써 전기 영동을 실시하였다. 비교로서, 서모리신을 첨가하지 않은 혼합액의 동량을 동일한 겔 상에서 전기 영동을 실시하였다.
전기 영동 후의 겔을 염색하고, 서모리신 처리 전후에서의 단백질의 분해 유무를 염색도에 의해 비교 평가하였다. 염색도란, 전기 영동에 의해 얻어진 염색 밴드의 위치 및 강도를 말한다.
서모리신 처리 전에 비해 거의 분해되지 않은 것(염색도가 90％ 이상 유지)을 ◎, 분해가 적은 것(염색도가 70％ 이상 90％ 미만을 유지)을 ○, 분해가 많은 것(염색도가 30％ 이상 70％ 미만을 유지)을 △, 대부분 분해되어 있는 것(염색도가 30％ 미만)을 ×라고 하였다.
결과를 표 6에 나타냈다.
2) 프로테아제인 트립신에 대한 내성을 이하의 방법으로 평가하였다.
서모리신 용액(1mg/mL)을 트립신 용액(1mg/mL)으로 변경한 것 이외에는, 서모리신 내성에 대한 평가와 동일하게 하여 평가하였다. 결과를 표 6에 나타냈다.
3) 프로테아제인 플라스민에 대한 내성을 이하의 방법으로 평가하였다.
서모리신 용액(1mg/mL)을 플라스민 용액(10mg/mL)으로 변경한 것 이외에는, 서모리신 내성에 대한 평가와 동일하게 하여 평가하였다. 결과를 표 6에 나타냈다.
<면역 글로불린의 흡착능 평가(SBC)>
제작예에서 얻어진 Mut1의 단백질을, 에폭시기로 활성화된 다공질 아크릴 비즈 1mL에 대하여 3mg 고정화하여 친화성 분리제로 하고, 면역 글로불린과의 결합능을 평가하였다. 통상법에 따라서, 분리제와의 정적인 흡착 용량을 평가하였다.
결과를 표 6에 나타냈다.
[실시예 2-2 내지 2-11, 비교예 2-1 내지 2-4]
Mut1의 단백질 대신에, 제작예에서 얻어진 Mut2 내지 11을 실시예 2-2 내지 2-11에, WT를 비교예 2-1에, Mut12 내지 14를 비교예 2-2 내지 2-4에 사용한 것 이외에는 실시예 2-1과 동일하게 하여, 프로테아제 내성 평가와 면역 글로불린의 흡착능 평가를 실시하였다.
결과를 표 6에 나타냈다.
Figure pct00006
연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)를 변이시키지 않은 비교예 2-1은 서모리신 내성이 낮은 것에 반해, 변이 연결 엘리먼트(변이 제2 연결 엘리먼트)를 갖는 실시예 2-1 내지 2-11은 서모리신 내성이 높으며, 또한 결합능도 높게 유지되었다. 비교예 2-2 및 2-3은 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)의 1위치의 소수성 아미노산이 결실되어 있기는 하지만 5위치의 소수성 아미노산을 갖기 때문에 서모리신 내성이 낮다. 비교예 2-4는 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)의 1위치 및 5위치의 소수성 아미노산이 결실되어 있기 때문에 서모리신 내성이 높기는 하지만, 연결 엘리먼트(제2 연결 엘리먼트)의 아미노산수가 1보다 적기 때문에 결합능이 저하되었다.
본 발명을 특정 형태를 사용하여 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 의도와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경 및 변형이 가능한 것은, 당업자에 있어서 명확하다. 또한 본 출원은, 2015년 2월 5일자로 출원된 일본 특허 출원(특원 제2015-021577호) 및 2015년 2월 5일자로 출원된 일본 특허 출원(특원 제2015-021578호)에 기초하고 있으며, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.
본 발명에 따르면, 프로테아제, 특히 세린 프로테아제나 서모리신에 내성을 갖고, 면역 글로불린과의 결합 능력을 갖는 단백질을 제공할 수 있으므로, 면역 글로불린과의 결합 능력이 우수한 친화성 리간드나 내구성이 우수한 친화성 분리제를 제조할 때에 본 발명의 단백질을 사용할 수 있다.
1 도메인
2 제1 또는 제2 연결 엘리먼트
3 담체 표면
4 고정화용 태그
SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> PROTEIN HAVING AFFINITY FOR IMMUNOGLOBULIN, SEPARATING AGENT FOR AFFINITY AND COLUMN FOR LIQUID CHROMATOGRAPHY USING THE SAME <130> W519869 <150> JP2015/021577 <151> 2015-02-05 <150> JP2015/021578 <151> 2015-02-05 <160> 118 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 56 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn 1 5 10 15 Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu 20 25 30 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys 35 40 45 Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu 35 40 45 Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 3 <211> 58 <212> 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Staphylococcus aureus <400> 6 Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 7 <211> 360 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 7 catatggcgg acaacaagtt taacaaagaa caacagaacg ccttttacga aatcctgcac 60 ctgccgaacc tgacggaaga acaacgcaac ggttttattc agagcctgaa agatgacccg 120 agcgtgtcta aggaaatcct ggcggaagcc aaaaagctga acgatgcaca agctccgaaa 180 gcagacaaca agttcaacaa ggaacagcaa aatgccttct atgaaattct gcatctgccg 240 aacctgaccg aagaacagcg taatggcttc attcaaagcc tgaaggacga cccgagtgtt 300 tccaaagaaa ttctggccga agccaaaaag ctgaatgatg cacaggctcc gaaactcgag 360 <210> 8 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctgaacgat gcacaagctc cggcagacaa cttcaacaag gaacagcaaa atg 53 <210> 9 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 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Staphylococcus aureus <400> 35 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc ggacaacaac 180 aaggaacagc aaaatgcctt ctatgaaatt ctgcatctgc cgaacctgac cgaagaacag 240 cgtaatggct tcattcaaag cctgaaggac gacccgagtg tttccaaaga aattctggcc 300 gaagccaaaa agctgaatga tgcacaggct ccgaaactcg agcaccacca ccaccaccac 360 <210> 36 <211> 360 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 36 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc ggaccaccac 180 aaggaacagc aaaatgcctt ctatgaaatt ctgcatctgc cgaacctgac cgaagaacag 240 cgtaatggct tcattcaaag cctgaaggac gacccgagtg tttccaaaga aattctggcc 300 gaagccaaaa agctgaatga tgcacaggct ccgaaactcg agcaccacca ccaccaccac 360 <210> 37 <211> 372 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 37 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gaatgacaat 180 gataacgata acaaggaaca gcaaaatgcc ttctatgaaa ttctgcatct gccgaacctg 240 accgaagaac agcgtaatgg cttcattcaa agcctgaagg acgacccgag tgtttccaaa 300 gaaattctgg ccgaagccaa aaagctgaat gatgcacagg ctccgaaact cgagcaccac 360 caccaccacc ac 372 <210> 38 <211> 372 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 38 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gaacggagac 180 aacggggata acaaggaaca gcaaaatgcc ttctatgaaa ttctgcatct gccgaacctg 240 accgaagaac agcgtaatgg cttcattcaa agcctgaagg acgacccgag tgtttccaaa 300 gaaattctgg ccgaagccaa aaagctgaat gatgcacagg ctccgaaact cgagcaccac 360 caccaccacc ac 372 <210> 39 <211> 366 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 39 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gaatgacaac 180 gataacaagg aacagcaaaa tgccttctat gaaattctgc atctgccgaa cctgaccgaa 240 gaacagcgta atggcttcat tcaaagcctg aaggacgacc cgagtgtttc caaagaaatt 300 ctggccgaag ccaaaaagct gaatgatgca caggctccga aactcgagca ccaccaccac 360 caccac 366 <210> 40 <211> 366 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 40 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gggagacaac 180 gggaacaagg aacagcaaaa tgccttctat gaaattctgc atctgccgaa cctgaccgaa 240 gaacagcgta atggcttcat tcaaagcctg aaggacgacc cgagtgtttc caaagaaatt 300 ctggccgaag ccaaaaagct gaatgatgca caggctccga aactcgagca ccaccaccac 360 caccac 366 <210> 41 <211> 372 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 41 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gcatgaccat 180 gatcacgatc acaaggaaca gcaaaatgcc ttctatgaaa ttctgcatct gccgaacctg 240 accgaagaac agcgtaatgg cttcattcaa agcctgaagg acgacccgag tgtttccaaa 300 gaaattctgg ccgaagccaa aaagctgaat gatgcacagg ctccgaaact cgagcaccac 360 caccaccacc ac 372 <210> 42 <211> 366 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 42 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gcatgaccac 180 caccacaagg aacagcaaaa tgccttctat gaaattctgc atctgccgaa cctgaccgaa 240 gaacagcgta atggcttcat tcaaagcctg aaggacgacc cgagtgtttc caaagaaatt 300 ctggccgaag ccaaaaagct gaatgatgca caggctccga aactcgagca ccaccaccac 360 caccac 366 <210> 43 <211> 366 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 43 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gcatgaccac 180 gatcacaagg aacagcaaaa tgccttctat gaaattctgc atctgccgaa cctgaccgaa 240 gaacagcgta atggcttcat tcaaagcctg aaggacgacc cgagtgtttc caaagaaatt 300 ctggccgaag ccaaaaagct gaatgatgca caggctccga aactcgagca ccaccaccac 360 caccac 366 <210> 44 <211> 366 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 44 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gaaagacaac 180 aagaacaagg aacagcaaaa tgccttctat gaaattctgc atctgccgaa cctgaccgaa 240 gaacagcgta atggcttcat tcaaagcctg aaggacgacc cgagtgtttc caaagaaatt 300 ctggccgaag ccaaaaagct gaatgatgca caggctccga aactcgagca ccaccaccac 360 caccac 366 <210> 45 <211> 357 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 45 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc gaaaaacaag 180 gaacagcaaa atgccttcta tgaaattctg catctgccga acctgaccga agaacagcgt 240 aatggcttca ttcaaagcct gaaggacgac ccgagtgttt ccaaagaaat tctggccgaa 300 gccaaaaagc tgaatgatgc acaggctccg aaactcgagc accaccacca ccaccac 357 <210> 46 <211> 363 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 46 gcggacaaca agtttaacaa agaacaacag aacgcctttt acgaaatcct gcacctgccg 60 aacctgacgg aagaacaacg caacggtttt attcagagcc tgaaagatga cccgagcgtg 120 tctaaggaaa tcctggcgga agccaaaaag ctgaacgatg cacaagctcc ggacaacaag 180 aacaaggaac agcaaaatgc cttctatgaa attctgcatc tgccgaacct gaccgaagaa 240 cagcgtaatg gcttcattca aagcctgaag gacgacccga gtgtttccaa agaaattctg 300 gccgaagcca aaaagctgaa tgatgcacag gctccgaaac tcgagcacca ccaccaccac 360 cac 363 <210> 47 <211> 124 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 47 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Leu Glu His His His His His His 115 120 <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 48 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Ala Asp Asn Phe Asn Lys Glu 50 55 60 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 65 70 75 80 Glu Gln Arg Asn 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PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 55 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro His Asp His Asp His Asp His 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Leu Glu His His His His His His 115 120 <210> 56 <211> 122 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 56 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro His Asp His His His Lys Glu 50 55 60 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 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Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Leu Glu His His His His His His 115 120 <210> 115 <211> 124 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 115 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro His Asp His Asp His Asp His 50 55 60 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 85 90 95 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 100 105 110 Gln Ala Pro Lys Leu Glu His His His His His His 115 120 <210> 116 <211> 121 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 116 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Lys Phe Asn Lys Glu Gln 50 55 60 Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu 65 70 75 80 Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser 85 90 95 Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro 100 105 110 Lys Leu Glu His His His His His His 115 120 <210> 117 <211> 120 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 117 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln 50 55 60 Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln 65 70 75 80 Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys 85 90 95 Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 100 105 110 Leu Glu His His His His His His 115 120 <210> 118 <211> 119 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 118 Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Asn Lys Glu Gln Gln Asn 50 55 60 Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg 65 70 75 80 Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu 85 90 95 Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu 100 105 110 Glu His His His His His His 115

Claims (25)

  1. 서열 번호 1 내지 3에 기재된 단백질 A의 E, D 및 A 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 해당 도메인 중 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
  2. 서열 번호 4 내지 6에 기재된 단백질 A의 B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 해당 도메인 중 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, 4위치의 리신 및 C 말단의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
  3. 서열 번호 4 내지 6에 기재된 단백질 A의 B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 해당 도메인 중 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 리신을 포함하고, 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열이라 한 경우, 적어도 1개의 해당 연결 개소 서열의 C 말단의 리신 및 4위치의 리신이 결실 또는 치환되어 있는 것을 특징으로 하는, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결실 또는 치환되어 있는 4위치의 리신 및 C 말단의 리신 중, 해당 4위치의 리신 및/또는 해당 C 말단의 리신이 결실되어 있는, 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열이라 한 경우, 적어도 1개의 해당 연결 개소 서열은 1 이상의 아미노산을 포함하는, 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결실 또는 치환되어 있는 4위치의 리신 및 C 말단의 리신 중, 해당 4위치의 리신 및/또는 해당 C 말단의 리신을 친수성 아미노산으로 치환한 것인, 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열이라 한 경우, 모든 연결 개소 서열에 있어서, 리신이 결실 또는 치환되어 있는, 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열이라 한 경우, 적어도 1개의 해당 연결 개소 서열은 리신을 포함하지 않는 것인, 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 각 도메인의 C 말단의 리신 및 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 개소 서열이라 한 경우, 적어도 1개의 해당 연결 개소 서열은 아르기닌을 포함하지 않는 것인, 단백질.
  10. 서열 번호 3 내지 6에 기재된 단백질 A의 A, B, C 및 Z 도메인 중 어느 것에서 유래하는 도메인을 2개 이상 갖는 단백질이며, 각 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 연결 엘리먼트라 한 경우, 적어도 1개의 연결 엘리먼트는, 1 이상의 아미노산을 포함하며, 또한 소수성 아미노산 이외의 아미노산에 의해 구성되는 변이 연결 엘리먼트인 것을 특징으로 하는, 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 변이 연결 엘리먼트가, A, B 또는 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 적어도 1개의 변이 연결 엘리먼트의 아미노산 서열에 있어서의 1위치의 알라닌 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 결실한 것인, 단백질.
  12. 제10항에 있어서, 상기 변이 연결 엘리먼트가, Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 적어도 1개의 변이 연결 엘리먼트의 아미노산 서열에 있어서의 1위치의 발린 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 결실한 것인, 단백질.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 변이 연결 엘리먼트가, A, B 또는 C 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 적어도 1개의 변이 연결 엘리먼트의 아미노산 서열에 있어서의 1위치의 알라닌 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 것인, 단백질.
  14. 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 변이 연결 엘리먼트가, Z 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 1위치에서 5위치까지의 서열을 포함하고, 적어도 1개의 변이 연결 엘리먼트의 아미노산 서열에 있어서의 1위치의 발린 및/또는 5위치의 페닐알라닌을 소수성 아미노산 이외의 아미노산으로 치환한 것인, 단백질.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 변이 연결 엘리먼트에서 치환하는 소수성 아미노산 이외의 아미노산이, 친수성 아미노산인, 단백질.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단의 리신을 결실 또는 치환한 것인, 단백질.
  17. 제16항에 있어서, C 말단측에 상기 변이 연결 엘리먼트를 결합하는 도메인에 있어서, 해당 도메인의 아미노산 서열에 있어서의 C 말단의 리신을 결실 또는 치환한 것인, 단백질.
  18. 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 변이 연결 엘리먼트는 리신을 포함하지 않는 것인, 단백질.
  19. 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 변이 연결 엘리먼트는 아르기닌을 포함하지 않는 것인, 단백질.
  20. 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 1개의 변이 연결 엘리먼트가 2 이상의 아미노산을 포함하는, 단백질.
  21. 제10항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 모든 연결 엘리먼트가 변이 연결 엘리먼트인, 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 도메인을 3개 이상 갖는, 단백질.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질에 포함되는 도메인 모두가, 서열 번호 1 내지 6에 기재된 단백질 A의 E, D, A, B, C 및 Z 도메인의 아미노산 서열 중 어느 1종류에서 유래하는, 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 단백질을 친화성 리간드로서, 수불용성 기재를 포함하는 담체에 고정화한 것을 특징으로 하는, 친화성 분리제.
  25. 제24항에 기재된 친화성 분리제를 포함하고, 적어도 하나의 해당 친화성 분리제가 충전되는 용기를 구비하는 것을 특징으로 하는, 액체 크로마토그래피용 칼럼.
KR1020177021689A 2015-02-05 2016-02-02 면역 글로불린에 친화성을 갖는 단백질, 및 그것을 사용한 친화성 분리제, 액체 크로마토그래피용 칼럼 KR20170115535A (ko)

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