JPWO2016125811A1 - 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質、およびそれを用いたアフィニティ分離剤、液体クロマトグラフィー用カラム - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献5には、弱酸性で抗体の脱離を可能にするために、プロテインAのE、D、A、B、Cドメインにおいてリジンおよびシステイン残基を含まない配列とした抗体認識結合タンパク質が開示されている。
[1]配列番号1〜3に記載のプロテインAのE、DおよびAドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのアミノ酸配列において、1以上のリジンを含み、C末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
[2]−(1)配列番号4〜6に記載のプロテインAのB、CおよびZドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのアミノ酸配列において、1以上のリジンを含み、4位のリジンおよびC末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
[2]−(2)配列番号4〜6に記載のプロテインAのB、CおよびZドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのアミノ酸配列において、1以上のリジンを含み、各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列(第1連結エレメント)とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列(第1連結エレメント)のC末端のリジンおよび4位のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
[3]前記欠失または置換されている4位のリジンおよびC末端のリジンのうち、該4位のリジンおよび/または該C末端のリジンが欠失している、[1]または[2]に記載のタンパク質。
[4]各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列(第1連結エレメント)とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列(第1連結エレメント)は1以上のアミノ酸からなる、[1]〜[3]のいずれかに記載のタンパク質。
[5]前記欠失または置換されている4位のリジンおよびC末端のリジンのうち、該4位のリジンおよび/または該C末端のリジンを親水性アミノ酸で置換したものである、[1]〜[4]のいずれかに記載のタンパク質。
[6]ドメインを3つ以上有する、[1]〜[5]のいずれかに記載のタンパク質。
[7]各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列(第1連結エレメント)とした場合、すべての連結箇所配列(第1連結エレメント)において、リジンが欠失または置換されている、[1]〜[6]のいずれかに記載のタンパク質。
[8]前記タンパク質に含まれるドメインのすべてが、配列番号1〜6に記載のプロテインAのE、D、A、B、CおよびZドメインのアミノ酸配列のいずれか1種類に由来する、[1]〜[7]のいずれかに記載のタンパク質。
[9]各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列(第1連結エレメント)とした場合、該連結箇所配列(第1連結エレメント)はリジンを含まないものである、[1]〜[8]のいずれかに記載のタンパク質。
[10]各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列(第1連結エレメント)とした場合、該連結箇所配列(第1連結エレメント)はアルギニンを含まないものである、[1]〜[9]のいずれかに記載のタンパク質。
[11][1]〜[10]のいずれかに記載のタンパク質をアフィニティリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティ分離剤。
[12][11]に記載のアフィニティ分離剤を含み、少なくとも一つの容器を備えることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用カラム。
[14]前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)が、A、B、またはCドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列からなり、1位のアラニンおよび/または5位のフェニルアラニンを欠失したものである[13]に記載のタンパク質。
[15]前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)が、Zドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列からなり、1位のバリンおよび/または5位のフェニルアラニンを欠失したものである[13]に記載のタンパク質。
[16]前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)が、A、B、またはCドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列からなり、1位のアラニンおよび/または5位のフェニルアラニンを疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものである[13]または[14]に記載のタンパク質。
[17]前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)が、Zドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列からなり、1位のバリンおよび/または5位のフェニルアラニンを疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものである[13]または[15]に記載のタンパク質。
[18]前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)で置換する疎水性アミノ酸以外のアミノ酸が、親水性アミノ酸である[16]または[17]に記載のタンパク質。
[19]前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)が2以上のアミノ酸からなる[13]〜[18]のいずれかに記載のタンパク質。
[20]ドメインを3つ以上有する[13]〜[19]のいずれか1項に記載のタンパク質。
[21]すべての連結エレメント(第2連結エレメント)が変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)である[13]〜[20]のいずれかに記載のタンパク質。
[22]前記タンパク質に含まれるドメインのすべてが、配列番号3〜6に記載のプロテインAのA、B、CおよびZドメインのアミノ酸配列のいずれか1種類に由来する[13]〜[21]のいずれかに記載のタンパク質。
[23]少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列におけるC末端のリジンを欠失または置換したものである[13]〜[22]のいずれかに記載のタンパク質。
[24]C末端側に前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)を結合するドメインにおいて、該ドメインのアミノ酸配列におけるC末端のリジンを欠失または置換したものである[23]に記載のタンパク質。
[25]前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)はリジンを含まないものである[13]〜[24]のいずれかに記載のタンパク質。
[26]前記変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)はアルギニンを含まないものである[13]〜[25]のいずれかに記載のタンパク質。
[27][13]〜[26]のいずれかに記載のタンパク質をコードするDNAを含むベクターを用いて、ブレビバチルス属細菌を形質転換し、培養を行うことによってタンパク質を製造する、[13]〜[26]のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
[28][13]〜[26]のいずれかに記載のタンパク質をアフィニティリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティ分離剤。
[29][28]に記載のアフィニティ分離剤を含み、少なくとも1つの該アフィニティ分離剤が充填される容器を備えることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用カラム。
なお、本発明の実施形態は、特定のプロテアーゼに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質に関するものである。
本発明の第1の実施形態は、プロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼに耐性を有し、十分な免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質に関するものである。
また、本発明の第2の実施形態は、プロテアーゼ、特にサーモリシンに耐性を有し、免疫グロブリンとの結合能力を有するタンパク質に関するものである。
<タンパク質>
本発明の第1の実施形態における第1の態様のタンパク質は、配列番号1〜3に記載のプロテインAのE、D、およびAドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有し、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において、1以上のリジンを含み、C末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする。
図1に示した通り、プロテインAのE、D、A、B、CおよびZドメインのいずれについても、C末端はリジン(K)である。よって、上述の連結箇所配列(第1連結エレメント)には、必ずリジン(K)を含むこととなる。
ドメインD A D N N F
ドメインA A D N N F
ドメインB A D N K F
ドメインC A D N K F
ドメインZ V D N K F
よって、本発明の第1の実施形態のタンパク質では、すべての連結箇所配列(第1連結エレメント)において、リジンが欠失または置換されていることが好ましい。
以下に、変異連結箇所配列(変異第1連結エレメント)の具体的な例について説明する。
本発明の第1の実施形態におけるタンパク質が非固定化ドメインを含むことにより、配向性を調整して担体に固定化することができ、より高い免疫グロブリン結合性を発揮することができるため好ましい。
<タンパク質>
本発明の第2の実施形態におけるタンパク質は、配列番号3〜6に記載のプロテインAのA、B、C、およびZドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有し、各ドメインを連結する連結エレメント(第2連結エレメント)のうち少なくとも一つは、1以上のアミノ酸からなり、かつ疎水性アミノ酸以外のアミノ酸により構成される変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)であることを特徴とする。
ドメインB A D N K F
ドメインC A D N K F
ドメインZ V D N K F
以下に、変異連結エレメント(変異第2連結エレメント)の具体的な例について説明する。
また、その他のプロテアーゼ、例えば後述するセリンプロテアーゼ、への耐性が向上する観点で、アスパラギン酸(D)、グルタミン(Q)、グルタミン酸(E)、ヒスチジン(H)が好ましい。
以下に、セリンプロテアーゼ耐性を有する変異連結エレメントの具体的な例について説明する。
本発明の第1の実施形態及び第2の実施形態のタンパク質(本発明のタンパク質)の製造方法について以下に説明する。
本発明のタンパク質は、上記のタンパク質をコードする塩基配列を有するDNAを作製し、該DNAを翻訳して製造することができる。具体的には、該DNAを含むベクターを用いて、宿主となる微生物を形質転換した形質転換体、または該DNAを用いた無細胞タンパク質合成系を利用して製造することができる。
本発明のタンパク質をアフィニティリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化することにより、本発明のアフィニティ分離剤を得ることができる。ここで、「アフィニティリガンド」とは、抗原と免疫グロブリンの結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集(結合)する物質(官能基)を指す用語であり、本明細書においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
(1)リガンド中のすべてのドメインが固定化ドメインである場合
(2)リガンド中のN末端および/またはC末端側のドメインが1つ以上固定化ドメインである場合
(3)リガンド中の両末端以外のドメインが1つ以上固定化ドメインである場合
(4)リガンドのN末端および/またはC末端に固定化用タグを導入し、固定化ドメインが存在しない場合
[作製例]
1)野生型プロテインA発現プラスミドの作製
5’側にcatatg(NdeI)、3’側にctcgag(XhoI)を付加した野生型Cドメイン2量体(WT)をコードするDNA配列(配列番号7)を化学合成した。得られたDNA断片を制限酵素NdeIおよびXhoI(ともにThermo Scientific社製)を用いて消化後、精製・回収を行った。
なお、配列番号7はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のDNA配列をもとに大腸菌発現用にコドン最適化を行って決定した。
制限酵素処理した配列番号7のDNA断片とpET22bベクターを、DNAリガーゼ(LigaFast Rapid DNA Ligation System、Promega社製)を用いて連結し、WT発現ベクターを構築した。
WT発現ベクターを用いて大腸菌JM109(TaKaRa社製)の形質転換を行い、定法によりプラスミドDNAを増幅および抽出した。
野生型Cドメイン2量体のアミノ酸配列の一部に欠失および/または置換の変異を有するタンパク質 Mut1〜Mut13をコードするDNA配列(配列番号34〜46)を含む発現ベクターの作製を行った。Mut1〜13発現ベクターは、表1に示す鋳型と合成オリゴヌクレオチドプライマーセット(配列番号8〜33)の組み合わせによりクイックチェンジ法(QuikChange Lightning Site−Directed Mutagenesis Kit、Agilent Technologies社製)を用いて作製した。クイックチェンジ法はAgilent Technologies社のプロトコルに従い実施した。
得られたMut1〜13発現ベクターのDNA配列の解析はDNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製)を用いて行った。発現ベクターのシークエンシングPCR反応はBig Dye Terminator v.1.1 Cycle Sequenceing Kit(Applied Biosystems社製)を用いて、付属プロトコルに従って行った。得られたシークエンシングPCR産物は定法により精製し、DNA配列解析に用いた。
本実施によって得られたMut1〜13発現ベクターのうち、発現タンパク質をコードするDNA配列は配列番号34〜46で示される通りであった。
Rosetta(DE3)(メルク社製)を、上記1)および2)で得られたWT、Mut1〜13発現ベクターで形質転換し、目的タンパク質であるWT、Mut1〜13をそれぞれ発現する形質転換体を得た。形質転換法はメルク社プロトコルに従った。
目的タンパク質を発現する形質転換体を50mg/Lカルベニシリンを含むLB培地に植菌し、30℃で終夜培養して前培養液を得た。得られた前培養液10mLを500mL LB培地(50mg/Lカルベニシリン含有)に植菌し、30℃、130rpmでOD600≒0.6〜0.8になるまで培養した。イソプロピル1−チオ−β−D−ガラクシド(IPTG)を終濃度0.1mMとなるように添加し、さらに培養を4時間継続した。培養終了後、遠心にて集菌した。
上記3)で集菌した菌体を50mLの懸濁バッファー(50mM imidazole pH8.0、500mM NaCl)に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離して、上清画分と沈殿画分とに分画した。上清画分を懸濁バッファーで平衡化したHisTrap HP 5mLカラム(GEヘルスケア・ジャパン社製)に供し、平衡化バッファーで洗浄後、溶出バッファー(175mM imidazole pH8.0、500mM NaCl)を用いて目的タンパク質を溶出した。溶出された目的タンパク質を透析にて脱塩水に置換した。目的タンパク質はAmicon−Ultra 10K(メルクミリポア社製)を用いて約30〜40mg/mLの濃度まで遠心濃縮した。濃縮後の目的タンパク質はPBSバッファーを用いて2mg/mLに調製した。
WTの連結箇所配列(第1連結エレメント)近傍の配列、およびMut1〜13の変異連結エレメント近傍の配列を表2に示す。Cドメインの2量体のうち、D58で示される位置のアミノ酸が1つ目のドメインのC末端であり、D1’で示される位置のアミノ酸が2つ目のドメインのN末端である。また「/(斜線)」はアミノ酸の欠失を表す。
<トリプシン耐性評価>
1)プロテアーゼであるトリプシンへの耐性を以下の方法で評価した。
作製例で得られたMut1のタンパク質とトリプシンとを混合し、37℃で15分間加熱した。配合量は以下の通りである。
・作製例1のタンパク質(2mg/mL、リン酸バッファー) 10μL
・希釈用バッファー(500mM Tris−HCl pH8.0) 2μL
・純水 6μL
・トリプシン溶液(1mg/mL) 2μL
トリプシン処理前に比べてほとんど分解していないもの(染色度が90%以上維持)を◎、分解が少ないもの(染色度が70%以上90%未満を維持)を○、分解が多いもの(染色度が30%以上70%未満を維持)を△、ほとんど分解しているもの(染色度が30%未満)を×とした。
結果を表3に示した。
トリプシン溶液(1mg/mL)をプラスミン溶液(10mg/mL)に代えた以外は、トリプシン耐性への評価と同様にして評価した。結果を表3に示した。
作製例で得られたMut1のタンパク質を、エポキシ基で活性化された多孔質アクリルビーズ1mLに対し3mg固定化して分離剤とし、免疫グロブリンとの結合能を評価した。
常法に従い、分離剤との静的な吸着容量を評価した。結果を表3に示した。
Mut1のタンパク質の代わりに、作製例で得られたMut2〜10を実施例1−2〜1−10に、WTを比較例1−1に、Mut11〜13を比較例1−2〜1−4に用いたこと以外は実施例1−1と同様にして、プロテアーゼ耐性評価と免疫グロブリンの吸着能評価を実施した。
結果を表3に示した。
[作製例]
1)野生型プロテインA発現プラスミドの作製
5’側にcatatg(NdeI)、3’側にctcgag(XhoI)を付加した野生型Cドメイン2量体(WT)をコードするDNA配列(配列番号61)を化学合成した。得られたDNA断片を制限酵素NdeIおよびXhoI(ともにThermo Scientific社製)を用いて消化後、精製・回収を行った。
なお、配列番号61はスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)由来のDNA配列をもとに大腸菌発現用にコドン最適化を行って決定した。
WT発現ベクターを用いて大腸菌JM109(TaKaRa社製)の形質転換を行い、定法によりプラスミドDNAを増幅および抽出した。
野生型Cドメイン2量体のアミノ酸配列の一部に欠失および/または置換の変異を有するタンパク質 Mut1〜Mut14をコードするDNA配列(配列番号90〜103)を含む発現ベクターの作製を行った。Mut1〜14発現ベクターは、表4に示す鋳型と合成オリゴヌクレオチドプライマーセット(配列番号62〜89)の組み合わせによりクイックチェンジ法(QuikChange Lightning Site−Directed Mutagenesis Kit、Agilent Technologies社製)を用いて作製した。クイックチェンジ法はAgilent Technologies社のプロトコルに従い実施した。
得られたMut1〜14発現ベクターのDNA配列の解析はDNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems社製)を用いて行った。発現ベクターのシークエンシングPCR反応はBig Dye Terminator v.1.1 Cycle Sequenceing Kit (Applied Biosystems社製)を用いて、付属プロトコルに従って行った。得られたシークエンシングPCR産物は定法により精製し、DNA配列解析に用いた。
本実施によって得られたMut1〜14発現ベクターのうち、発現タンパク質をコードするDNA配列は配列番号90〜103で示される通りであった。
Rosetta(DE3)(メルク社製)を、上記1)および2)で得られたWT、Mut1〜14発現ベクターで形質転換し、目的タンパク質であるWT、Mut1〜14をそれぞれ発現する形質転換体を得た。形質転換法はメルク社プロトコルに従った。
目的タンパク質を発現する形質転換体を50mg/Lカルベニシリンを含むLB培地に植菌し、30℃で終夜培養して前培養液を得た。得られた前培養液10mLを500mL LB培地(50mg/Lカルベニシリン含有)に植菌し、30℃、130rpmでOD600≒0.6〜0.8になるまで培養した。イソプロピル1−チオ−β−D−ガラクシド(IPTG)を終濃度0.1mMとなるように添加し、さらに培養を4時間継続した。培養終了後、遠心にて集菌した。
上記3)で集菌した菌体を50mLの懸濁バッファー(50mM imidazole pH8.0、500mM NaCl)に懸濁し、超音波破砕した。遠心分離して、上清画分と沈殿画分とに分画した。上清画分を懸濁バッファーで平衡化したHisTrap HP 5mLカラム(GEヘルスケア・ジャパン社製)に供し、平衡化バッファーで洗浄後、溶出バッファー(175mM imidazole pH8.0、500mM NaCl)を用いて目的タンパク質を溶出した。溶出された目的タンパク質を透析にて脱塩水に置換した。目的タンパク質はAmicon−Ultra 10K(メルクミリポア社製)を用いて約30〜40mg/mLの濃度まで遠心濃縮した。濃縮後の目的タンパク質はPBSバッファーを用いて2mg/mLに調製した。
精製終了後の目的タンパク質をTricine SDS−PAGE(e・パジェル R15S;ATTO社製)に供し、分子量約14000Daの位置にシングルバンドを確認した。WT発現ベクターを用いて得られた目的タンパク質は配列番号104のアミノ酸配列を有するタンパク質であり、Mut1〜14発現ベクターを用いて得られた目的タンパク質は、それぞれ、配列番号105〜118のアミノ酸配列を有するタンパク質であった。
WTの連結エレメント(第2連結エレメント)近傍の配列、およびMut1〜14の変異連結エレメント(第2連結エレメント)近傍の配列を表5に示す。Cドメインの2量体のうち、D58で示される位置のアミノ酸が1つ目のドメインのC末端であり、D1’で示される位置のアミノ酸が2つ目のドメインのN末端である。また「/(斜線)」はアミノ酸の欠失を表す。
<プロテアーゼ耐性評価>
1)プロテアーゼであるサーモリシンへの耐性を以下の方法で評価した。
作製例で得られたMut1のタンパク質とサーモリシンとを混合し、37℃で15分間加熱した。配合量は以下の通りである。
・作製例1のタンパク質(2mg/mL、リン酸バッファー) 10μL
・希釈用バッファー(500mM Tris−HCl pH8.0,5mM CaCl2) 2μL
・純水 6μL
・サーモリシン溶液(1mg/mL) 2μL
次に、電気泳動用の希釈液(200mM Tris−HCl pH6.8、200mM DTT、20%グリセロール、4%SDS、0.012%ブロモフェノールブルー;2xSample buffer)を、得られた混合液に20μL添加した。そのうち10μLをサンプルとして、SDSポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を実施した。比較として、サーモリシンを添加していない混合液の同量を同じゲル上にて電気泳動を実施した。
電気泳動後のゲルを染色し、サーモリシン処理前後でのタンパク質の分解の有無を染色度により比較評価した。染色度とは電気泳動により得られた染色バンドの位置および強度をいう。
サーモリシン処理前に比べてほとんど分解していないもの(染色度が90%以上維持)を◎、分解が少ないもの(染色度が70%以上90%未満を維持)を○、分解が多いもの(染色度が30%以上70%未満を維持)を△、ほとんど分解しているもの(染色度が30%未満)を×とした。
結果を表6に示した。
サーモリシン溶液(1mg/mL)をトリプシン溶液(1mg/mL)に変更した以外は、サーモリシン耐性への評価と同様にして評価した。結果を表6に示した。
サーモリシン溶液(1mg/mL)をプラスミン溶液(10mg/mL)に変更した以外は、サーモリシン耐性への評価と同様にして評価した。結果を表6に示した。
作製例で得られたMut1のタンパク質を、エポキシ基で活性化された多孔質アクリルビーズ1mLに対し3mg固定化してアフィニティ分離剤とし、免疫グロブリンとの結合能を評価した。常法に従い、分離剤との静的な吸着容量を評価した。
結果を表6に示した。
Mut1のタンパク質の代わりに、作製例で得られたMut2〜11を実施例2−2〜2−11に、WTを比較例2−1に、Mut12〜14を比較例2−2〜2−4に用いたこと以外は実施例2−1と同様にして、プロテアーゼ耐性評価と免疫グロブリンの吸着能評価を実施した。
結果を表6に示した。
2 第1または第2連結エレメント
3 担体表面
4 固定化用タグ
Claims (25)
- 配列番号1〜3に記載のプロテインAのE、DおよびAドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において、1以上のリジンを含み、C末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
- 配列番号4〜6に記載のプロテインAのB、CおよびZドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において、1以上のリジンを含み、4位のリジンおよびC末端のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
- 配列番号4〜6に記載のプロテインAのB、CおよびZドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有するタンパク質であって、該ドメインの少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列において、1以上のリジンを含み、各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列のC末端のリジンおよび4位のリジンが欠失または置換されていることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
- 前記欠失または置換されている4位のリジンおよびC末端のリジンのうち、該4位のリジンおよび/または該C末端のリジンが欠失している、請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列は1以上のアミノ酸からなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記欠失または置換されている4位のリジンおよびC末端のリジンのうち、該4位のリジンおよび/または該C末端のリジンを親水性アミノ酸で置換したものである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列とした場合、すべての連結箇所配列において、リジンが欠失または置換されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列はリジンを含まないものである、請求項1〜7のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 各ドメインのC末端のリジンおよび各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結箇所配列とした場合、少なくとも一つの該連結箇所配列はアルギニンを含まないものである、請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 配列番号3〜6に記載のプロテインAのA、B、CおよびZドメインのいずれかに由来するドメインを2つ以上有するタンパク質であって、各ドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列を連結エレメントとした場合、少なくとも一つの連結エレメントは、1以上のアミノ酸からなり、かつ、疎水性アミノ酸以外のアミノ酸により構成される変異連結エレメントであることを特徴とする、免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質。
- 前記変異連結エレメントが、A、B、またはCドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列からなり、少なくとも一つの変異連結エレメントのアミノ酸配列における1位のアラニンおよび/または5位のフェニルアラニンを欠失したものである、請求項10に記載のタンパク質。
- 前記変異連結エレメントが、Zドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列からなり、少なくとも一つの変異連結エレメントのアミノ酸配列における1位のバリンおよび/または5位のフェニルアラニンを欠失したものである、請求項10に記載のタンパク質。
- 前記変異連結エレメントが、A、B、またはCドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列からなり、少なくとも一つの変異連結エレメントのアミノ酸配列における1位のアラニンおよび/または5位のフェニルアラニンを疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものである、請求項10または11に記載のタンパク質。
- 前記変異連結エレメントが、Zドメインのアミノ酸配列における1位から5位までの配列からなり、少なくとも一つの変異連結エレメントのアミノ酸配列における1位のバリンおよび/または5位のフェニルアラニンを疎水性アミノ酸以外のアミノ酸で置換したものである、請求項10または12に記載のタンパク質。
- 前記変異連結エレメントで置換する疎水性アミノ酸以外のアミノ酸が、親水性アミノ酸である、請求項13または14に記載のタンパク質。
- 少なくとも一つのドメインのアミノ酸配列におけるC末端のリジンを欠失または置換したものである、請求項10〜15のいずれか1項に記載のタンパク質。
- C末端側に前記変異連結エレメントを結合するドメインにおいて、該ドメインのアミノ酸配列におけるC末端のリジンを欠失または置換したものである、請求項16に記載のタンパク質。
- 少なくとも一つの変異連結エレメントはリジンを含まないものである、請求項10〜17のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 少なくとも一つの変異連結エレメントはアルギニンを含まないものである、請求項10〜18のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 少なくとも一つの変異連結エレメントが2以上のアミノ酸からなる、請求項10〜19のいずれか1項に記載のタンパク質。
- すべての連結エレメントが変異連結エレメントである、請求項10〜20のいずれか1項に記載のタンパク質。
- ドメインを3つ以上有する、請求項1〜21のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質に含まれるドメインのすべてが、配列番号1〜6に記載のプロテインAのE、D、A、B、CおよびZドメインのアミノ酸配列のいずれか1種類に由来する、請求項1〜22のいずれか1項に記載のタンパク質。
- 請求項1〜23のいずれか1項に記載のタンパク質をアフィニティリガンドとして、水不溶性の基材からなる担体に固定化したことを特徴とする、アフィニティ分離剤。
- 請求項24に記載のアフィニティ分離剤を含み、少なくとも1つの該アフィニティ分離剤が充填される容器を備えることを特徴とする、液体クロマトグラフィー用カラム。
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