WO2012133342A1 - 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド - Google Patents

免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド Download PDF

Info

Publication number
WO2012133342A1
WO2012133342A1 PCT/JP2012/057799 JP2012057799W WO2012133342A1 WO 2012133342 A1 WO2012133342 A1 WO 2012133342A1 JP 2012057799 W JP2012057799 W JP 2012057799W WO 2012133342 A1 WO2012133342 A1 WO 2012133342A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
protein
seq
immunoglobulin
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/057799
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
吉田　慎一
大 村田
俊一 平良
Original Assignee
株式会社カネカ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
Priority to JP2013507569A priority Critical patent/JP5933526B2/ja
Priority to AU2012233980A priority patent/AU2012233980B2/en
Priority to CA2830990A priority patent/CA2830990A1/en
Priority to KR1020137022283A priority patent/KR20140007394A/ko
Priority to EP12765583.5A priority patent/EP2690108B1/en
Priority to SG2013072194A priority patent/SG193950A1/en
Priority to US14/007,211 priority patent/US9284354B2/en
Priority to CN201280015181.4A priority patent/CN103443120B/zh
Publication of WO2012133342A1 publication Critical patent/WO2012133342A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a novel polypeptide that exhibits binding properties to immunoglobulin and is excellent in chemical stability.
  • the antibody has a function of specifically binding to a substance called an antigen, and a function of detoxifying and removing a factor having the antigen in cooperation with other biomolecules and cells.
  • the name “antibody” is a name that emphasizes the function of binding to such an antigen, and the substance is called “immunoglobulin”.
  • Substances (ligands) that specifically bind in the constant region (other than the antigen binding site) in the antibody can be used for antibody purification and detection, and the range of application is expanded by binding to the constant region. Therefore, industrial value is also sufficient.
  • Representative examples of ligands that specifically bind to a constant region in an antibody include protein A and protein G.
  • Techniques for improving the alkali resistance of ligands that bind to antibodies include techniques for imparting alkali resistance by mutating Gly at position 29 of protein A (Patent Documents 1 and 2), by substituting Asn with other amino acids. Examples include technologies that impart alkali resistance (Patent Documents 3 and 4), and technologies that use the C domain of protein A or a variant thereof (Patent Documents 5 and 6).
  • An object of the present invention is to provide a novel polypeptide that exhibits binding properties to immunoglobulins and is excellent in alkali stability.
  • the present inventors have made full use of computational chemistry techniques and protein engineering techniques, and have different sequences from the polypeptides obtained by the technological development so far, and more excellent alkalis. It came to invent the novel polypeptide which shows tolerance.
  • Said polypeptide has the following amino acid sequence: ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPVSVSREILEAEARRLNDAQAPG (SEQ ID NO: 1), or ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDVSVSREILEARRNLDAQAPR (SEQ ID NO: 2) Is preferably 90% or more.
  • the polypeptide of the present invention is particularly characterized by excellent stability to alkali. Even when exposed to extremely harsh alkaline conditions, for example, 0.1-1.0 M sodium hydroxide (NaOH) at room temperature for several hours, binding to immunoglobulin is hardly lost.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the present invention provides a novel peptide that exhibits alkali resistance significantly exceeding them.
  • a protein that has been exposed to alkaline conditions for a long time is generally severely cleaved and modified to show the state of the band (darkness) before alkali treatment. , Position, and number) are difficult to maintain.
  • the novel peptide obtained in the present invention can maintain the state of the band before treatment even after being exposed to severe alkaline conditions, and the tolerable conditions are more severe than the known alkali-resistant protein A mutants. Is possible.
  • FIG. 14 is an SDS-PAGE of the polypeptides of SEQ ID NOs: 13-15 after alkali treatment (0, 4, 8, and 24 hours).
  • FIG. 4 is an SDS-PAGE figure of the polypeptides of SEQ ID NOs: 38-46 after alkaline treatment (0, 4, and 24 hours).
  • polypeptide includes any molecule having a polypeptide structure. Since the polypeptide of the present invention consists of about 50 amino acids, it is generally called “protein” or “(protein) domain”, and is basically not distinguished from “polypeptide”. Absent.
  • Protein comprising an Fc region of an immunoglobulin is an expression including immunoglobulin molecules, immunoglobulin fragments, and immunoglobulin derivatives.
  • Immunoglobulin G derivative means, for example, a chimeric immunoglobulin G in which a part of a domain of human immunoglobulin G is replaced with a domain of immunoglobulin G of another species and a CDR of human immunoglobulin G ( Complementarity Determining Regions) is replaced with the CDR part of another species antibody and fused with humanized immunoglobulin G, Fc region sugar chain modified immunoglobulin G, human immunoglobulin G Fv region and Fc It is a generic name for modified artificial proteins such as artificial immunoglobulin G fused with a region.
  • the “protein containing the Fc region of an immunoglobulin” in the present invention is not limited to an immunoglobulin molecule or a derivative thereof that contains all of the region generally called an Fc region without a deficiency.
  • the novel polypeptide of the present invention comprises the following amino acid sequence and is characterized by binding to a protein containing an immunoglobulin Fc region.
  • X 1 D, E, N, or Q
  • the polypeptide comprises the following amino acid sequence and binds to a protein containing the Fc region of an immunoglobulin.
  • X 1 D, E, N, or Q
  • X 5 D, E, H , I, L, Q, R, S, T, or
  • the polypeptide has a sequence identity of 90% or more with the following amino acid sequence and binds to a protein containing an Fc region of an immunoglobulin.
  • ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPVSVSREILEAEARRLNDAQAPG SEQ ID NO: 1
  • ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDVSVSREILEARRNLDAQAPR SEQ ID NO: 2
  • sequence identity is more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more. Moreover, even if the polypeptide is shorter than the polypeptide of the present invention, a polypeptide (80%) or more, preferably 90% or more of the sequence (range) in the polypeptide of the present invention is included in the present invention.
  • the polypeptide may be a polypeptide in which two or more of the above amino acid sequences are linked.
  • the lower limit of the number to be connected is 2 or more, preferably 3 or more, more preferably 4 or more, still more preferably 5 or more, and the upper limit is 20 or less, preferably 10 or less, more preferably 8 Or less, more preferably 6 or less.
  • These multimers may be homopolymers such as homodimers and homotrimers, which are ligations of immunoglobulin-binding polypeptides (domains) having the same amino acid sequence. Further, it may be a heteropolymer such as a heterodimer or a heterotrimer which is a linking body of a plurality of types of immunoglobulin-binding polypeptides having different sequences.
  • Examples of how to link polypeptides include a method of linking without intervening amino acid residues serving as a linker, or a method of linking with one or more amino acid residues serving as a linker, but are not limited to these methods. It is not something. There is no restriction
  • polypeptide of the present invention is a fusion obtained by fusing an immunoglobulin-binding polypeptide or a polypeptide in which two or more of them are linked with other proteins having different functions as one component. Protein is also included. Examples of fusion proteins include, but are not limited to, proteins in which albumin or GST (glutathione S-transferase) is fused. Moreover, nucleic acids such as DNA aptamers, drugs such as antibiotics, and polymers such as PEG (polyethylene glycol) may be fused.
  • the polypeptide of the present invention is characterized by excellent chemical stability under alkaline conditions.
  • Alkaline conditions refers to the degree of alkalinity that can achieve the purpose of washing or sterilization. More specifically, an aqueous sodium hydroxide solution of about 0.05 to 1.0 N is applicable, but is not limited thereto.
  • Chemical stability refers to the property that a polypeptide retains its function against chemical modifications such as chemical changes of amino acid residues and chemical modifications such as amide bond transfer and cleavage. In the present invention, retention of the function of a polypeptide means that the binding activity to the Fc region of an immunoglobulin (the ratio of the polypeptide that retains affinity without undergoing chemical modification) is retained.
  • alkali resistance is also synonymous with “chemical stability under alkaline conditions”.
  • the affinity of an immunoglobulin for a protein containing the Fc region can be tested by a biosensor such as a Biacore system (manufactured by GE Healthcare Japan, Inc.) using the surface plasmon resonance principle, but is not limited thereto. is not.
  • a biosensor such as a Biacore system (manufactured by GE Healthcare Japan, Inc.) using the surface plasmon resonance principle, but is not limited thereto. is not.
  • the measurement conditions it is only necessary to detect a binding signal when the polypeptide of the present invention binds to the Fc region of an immunoglobulin.
  • the measurement is performed at a temperature of 20 to 40 ° C. (constant temperature) and at a pH of 6 to 8. You can easily evaluate it.
  • an affinity constant (K A ) or dissociation constant (K D ) can be used as the binding parameter (K A ) or dissociation constant (K D ) (Nagata et al., “Real-time analysis experiment method of biological substance interaction”, Springer Fairlark Tokyo, 1998. 41).
  • the affinity constant of the polypeptide of the present invention for the Fc region of an immunoglobulin is determined by immobilizing human IgG on a sensor chip using the Biacore system, and subjecting each domain mutation under the conditions of a temperature of 25 ° C. and a pH of 7.4. It can be obtained by an experimental system in which a body is added to a flow path.
  • the affinity constant to human IgG is 1 ⁇ 10 5 (M -1) or more, more preferably 1 ⁇ 10 6 (M -1) or more, more preferably 1 ⁇ 10 7
  • a protein that is (M ⁇ 1 ) can be preferably used.
  • K A and the K D are inappropriate. This is because the binding ability of one protein molecule to immunoglobulin does not change by chemical treatment.
  • a method for determining the residual binding activity of the protein after alkali treatment for example, the magnitude of the binding signal when the protein is immobilized on a sensor chip and the same concentration of immunoglobulin is added before and after chemical treatment of the protein.
  • a method using a binding parameter of theoretical maximum binding capacity (Rmax) is preferable, but the method is not limited to this method.
  • Rmax theoretical maximum binding capacity
  • an experimental system in which immunoglobulin is immobilized and proteins before and after chemical treatment are added is also possible.
  • the chemical stability under alkaline conditions can be determined not only by the binding activity to immunoglobulin, but also by the stability of the polypeptide itself as a substance. For example, it is possible to evaluate chemical stability under alkaline conditions by comparing electrophoresis bands of polypeptides before and after alkali treatment by electrophoresis. Specifically, chemical stability can be compared by performing very general SDS-PAGE and analyzing band intensity by densitometry. Based on the band intensity analyzed by densitometry, the polypeptide of the present invention was allowed to stand in a 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution at 25 ° C. for 24 hours, and then compared to before treatment.
  • the polypeptide of the present invention is preferably 50% or more, more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more.
  • the polypeptide of the present invention was allowed to stand in a 0.5 M aqueous sodium hydroxide solution at 25 ° C. for 30 hours, and then compared with before the treatment. Therefore, it is preferably 30% or more, more preferably 40% or more, and further preferably 50% or more.
  • the protein of the present invention can be produced by inserting a DNA encoding the amino acid sequence of the protein into a vector and culturing a transformant containing the vector.
  • the amino acid sequence obtained by translating the base sequence may be any DNA as long as it constitutes the protein.
  • DNA can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as PCR) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • the base sequence constituting the DNA may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be replaced with a degenerate codon and the same protein is encoded when translated.
  • Introduction of site-specific mutations for modifying the DNA base sequence can be carried out using recombinant DNA techniques, PCR methods and the like. That is, the introduction of mutations by recombinant DNA technology can be performed when, for example, appropriate restriction enzyme recognition sequences exist on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the protein of the present invention.
  • the enzyme recognition sequence portion is cleaved with the restriction enzyme, and after removing the region including the site where mutation is desired, the cassette mutation method is performed in which a DNA fragment mutated only to the target site is inserted by chemical synthesis or the like. it can.
  • site-specific mutation by PCR is, for example, a double double-stranded plasmid in which PCR is performed using a double-stranded plasmid encoding a protein as a template and two kinds of synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + and ⁇ strands. This can be done by the primer method.
  • a DNA encoding a multimeric protein can be prepared by linking a desired number of DNAs encoding the monomer protein (one domain) in series.
  • an appropriate restriction enzyme site is introduced into a DNA sequence, and double-stranded DNA fragmented with a restriction enzyme can be ligated with DNA ligase.
  • DNA encoding a multimeric protein if the base sequence encoding each monomer protein is the same, there is a possibility of inducing homologous recombination of the DNA in the host cell upon transformation.
  • sequence identity between the nucleotide sequences of DNAs encoding linked monomeric proteins is preferably 90% or less, and more preferably 85% or less.
  • the vector includes a base sequence that encodes the aforementioned protein or a partial amino acid sequence thereof, and a promoter that can function in a host operably linked to the base sequence. Usually, it can be obtained by linking or inserting a gene encoding the above-described protein into an appropriate vector.
  • the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can replicate autonomously in the host, and plasmid DNA or phage DNA can be used as the vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Japan) may be used. .
  • plasmid vectors useful for expression of genes of the genus Brevibacillus include pUB110, which is known as a Bacillus subtilis vector, or pHY500 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-31682), pNY700 (Japanese Patent Laid-Open No. 4-278091). , PNU211R2L5 (Japanese Patent Laid-Open No. 7-170984), pHT210 (Japanese Patent Laid-Open No. 6-133782), or pNCMO2 (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-238569) which is a shuttle vector between Escherichia coli and Brevibacillus bacteria. It is done.
  • the protein of the present invention can be obtained as a fusion protein with a known protein having an effect of assisting protein expression or an effect of facilitating purification.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • a fusion protein can be produced using a vector containing a DNA encoding the amino acid sequence of the protein of the present invention and a DNA encoding MBP or GST in a linked state.
  • a transformant can be obtained by introducing a vector into a host cell.
  • the method for introducing a vector into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, or a polyethylene glycol method.
  • the present invention is not limited to this.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the protein of the present invention is produced by culturing the above-described transformed cells in a medium, and producing and accumulating the protein of the present invention in the cultured cells (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cells). And the desired protein can be collected from the culture.
  • the protein of the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cell in a medium, and in the cultured cell (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cell). It is also possible to produce and accumulate a fusion protein containing, collect the fusion protein from the culture, cleave the fusion protein with an appropriate protease, and collect the desired protein.
  • the transformed cells are cultured according to the usual method used for host culture.
  • the medium used for the culture is not particularly limited as long as the protein can be produced with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol and neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2-aminoethyl) ) -Benzenesulfonyl fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediamine etidium, and other inhibitors .
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, Hsp104 / ClpB may be used (for example, co-expression or fusion proteinization). And coexisting with the protein of the present invention).
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium, and culturing at a low temperature. is not.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%
  • 2xYT medium tryptone 1.6%, yeast extract 1 0.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • TM medium peptone 1%, meat extract 0.5%, yeast extract 0.2%, glucose 1%, pH 7.0
  • 2SL medium peptone 4%, yeast extract 0.5%, glucose 2%, pH 7.2
  • the culture temperature is 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the protein of the present invention is cultured in the cultured cells (periplasm region) by aerobically culturing for several hours to several days under aeration and stirring conditions. And the cells are accumulated in a culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cells and the supernatant containing the secreted protein by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture.
  • the replacement protein can be recovered.
  • the cells when accumulated in cultured cells (including in the periplasm region), for example, the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the protein accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • the protein of the present invention can be purified by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in appropriate combination.
  • Confirmation that the obtained purified substance is the target protein can be performed by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the protein of the present invention can also be produced using a cell-free protein synthesis system using the DNA.
  • cell-free protein synthesis systems include those derived from prokaryotic cells, plant cells, and higher animal cells.
  • the protein of the present invention can be used as an affinity ligand characterized by having affinity for immunoglobulin.
  • the ligand can be immobilized on a carrier comprising a water-insoluble substrate to obtain an affinity separation matrix.
  • the “affinity ligand” is a substance that selectively collects (binds) a target molecule from a set of molecules based on the affinity between specific molecules represented by the binding of an antigen and an antibody. It is a term indicating (functional group), and in the present invention, it refers to a protein that specifically binds to immunoglobulin. In the present specification, the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • an inorganic carrier such as glass beads and silica gel, a synthetic polymer such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene
  • examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as crystalline cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, and crosslinked dextran, and organic-organic and organic-inorganic composite carriers obtained by combining these.
  • GCL2000 which is a porous cellulose gel
  • Sephacryl S-1000 in which allyl dextran and methylene bisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl which is a methacrylate-based carrier
  • Sepharose CL4B which is an agarose-based crosslinked carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier preferably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the method for immobilizing the ligand for example, it can be bound to the carrier by a conventional coupling method using an amino group, a carboxyl group, or a thiol group present in the ligand.
  • the support is activated by reacting the support with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, sodium periodate, or the like (or on the support surface).
  • introducing a reactive functional group a method of immobilizing by coupling reaction with a compound to be immobilized as a ligand, a condensation reagent such as carbodiimide in a system in which a compound to be immobilized as a carrier and a ligand exists, or
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier.
  • the protein of the present invention may be chemically modified for immobilization, or an amino acid residue useful for immobilization may be added.
  • amino acids useful for immobilization include amino acids having functional groups useful for immobilization chemical reactions in the side chain, such as Lys containing an amino group in the side chain, and thiol groups in the side chain. Cys containing is mentioned.
  • the modification / modification method for immobilization is not particularly limited.
  • a method of covalently binding to a carrier by a conventional coupling method through a Lys ⁇ -amino group present in a ligand is preferable.
  • the protein of the present invention may not contain Lys, in that case, as described above, it is preferable to add a sequence imparted with Lys useful for immobilization to the polypeptide, and the sequence imparted with Lys is It is preferable that it is provided at the end of the polypeptide.
  • the “sequence to which Lys is added” in the present invention is a sequence containing at least one Lys, and the number of Lys is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1. ⁇ 3.
  • the number of amino acid residues in the sequence with Lys at the end is not particularly limited, and may be a sequence composed of 1 Lys.
  • the number of amino acid residues in the sequence to which Lys is added is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • “Applied to the terminal” basically means the application to the N-terminal or C-terminal of the amino acid sequence. Therefore, Lys may be imparted by substitution mutation at the end of the polypeptide of the present invention.
  • the “protein containing the Fc region of an immunoglobulin” refers to a protein containing a site on the Fc region side to which the protein of the present invention binds, and need not be a protein containing the Fc region completely.
  • the purification method of the protein containing the Fc region of these immunoglobulins can be achieved by a procedure according to an affinity column chromatography purification method using a column already existing as a commercial product. That is, after adjusting a buffer containing a protein containing an immunoglobulin Fc region to be neutral, the solution is passed through an affinity column filled with an affinity separation matrix, and a protein containing an immunoglobulin Fc region is obtained. Adsorb. Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed. At this point, the protein containing the Fc region of the desired immunoglobulin is adsorbed to the affinity separation matrix of the present invention in the column.
  • Affinity separation matrix is a pure buffer solution (suitable denaturant or organic solvent) suitable to the extent that the ligand compound or carrier substrate does not completely impair the function. In some cases, it can be reused by washing it through.
  • Example 1 Preparation of Novel Polypeptide An oligonucleotide having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 3 and 4 was mixed, Blend Taq (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was used as the polymerase, and an overlap PCR reaction was performed according to the attached protocol. Went. Double-stranded DNA as a PCR reaction product was extracted and purified by agarose electrophoresis, and cleaved with restriction enzymes BamHI and HindIII (both manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the target double-stranded DNA was obtained by PCR reaction from the oligonucleotide having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 5 and 6, and cleaved with restriction enzymes HindIII and EcoRI (manufactured by Takara Bio Inc.). .
  • the above two types of double-stranded DNAs were subcloned into the BamHI / EcoRI site in the multicloning site of the plasmid vector pGEX-2T (manufactured by GE Healthcare Japan).
  • the ligation reaction was performed by mixing the vector pGEX-2T that had been cleaved with restriction enzymes BamHI and EcoRI and dephosphorylated with Alkaline Phosphatase (Takara Bio Inc.) and the above-mentioned two restriction enzyme-treated double-stranded DNAs. Then, using Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), it was performed according to the attached protocol.
  • the DNAs of SEQ ID NOs: 3, 4, 5, and 6 are designed to encode SEQ ID NO: 1 when the above two types of double-stranded DNAs are combined at the HindIII cleavage site and subcloned into pGEX-2T. did. Escherichia coli HB101 cells (manufactured by Takara Bio Inc.) were transformed with pGEX-2T (ligation reaction solution) containing DNA encoding SEQ ID NO: 1, and plasmid DNA was amplified and extracted by a conventional method.
  • PCR was performed using the oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 7 and 8, and the PCR reaction purified product was treated with restriction enzymes PstI and cfr13I (manufactured by Takara Bio Inc.), Double-stranded DNA was prepared. Also, using the same template, (2) PCR was performed using the oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 9 and 10, and the PCR reaction purified product was treated with restriction enzymes cfr13I and EcoRI to prepare double-stranded DNA for insert. .
  • oligonucleotide primers (1) uses SEQ ID NOs: 7 and 11, (2) uses SEQ ID NOs: 9 and 12, and for restriction enzymes, (1) uses PstI and XhoI ( In (2) manufactured by Takara Bio Inc., an expression plasmid having a DNA encoding a polypeptide having an amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 was linked was constructed by using XhoI and EcoRI. For the convenience of gene manipulation, the amino acid residue at the C-terminus (the end of the second repeat) is substituted with Lys, but the evaluation result does not change depending on the presence or absence of substitution because it is a C-terminus.
  • Brevibacillus choshinensis FY-1 strain was used to transform Brevibacillus choshinensis FY-1 strain. Transformation was carried out by an electrophoretic method according to a known method (“Biosci. Biotech. Biochem.”, 1997, 61, 202-203).
  • the Brevibacillus choshinensis FY-1 strain is a Phe ⁇ Tyr auxotrophic strain obtained by mutation treatment of the Brevibacillus choshinensis HPD31-OK strain (Japanese Patent Laid-Open No. 6-296485).
  • Brevibacillus choshinensis FY-1 recombinant bacteria 5 mL of 3YC medium containing 60 ⁇ g / mL neomycin (polypeptone 3%, yeast extract 0.2%, glucose 3%, magnesium sulfate 0.01%, iron sulfate 0 (.001%, manganese chloride 0.001%, zinc chloride 0.0001%) was subjected to shaking culture at 30 ° C. for 3 days.
  • the culture is centrifuged to separate the cells, and the desired polypeptide is obtained from the obtained culture supernatant by cation exchange chromatography using an SP Fast Flow column (manufactured by GE Healthcare Japan).
  • SP Fast Flow column manufactured by GE Healthcare Japan
  • anion exchange buffer A After washing with anion exchange buffer A, in the middle of a salt concentration gradient using anion exchange buffer A and anion exchange buffer B (50 mM Tris-HCl, 0.3 M NaCl, pH 8.0)
  • anion exchange buffer B 50 mM Tris-HCl, 0.3 M NaCl, pH 8.0
  • the target polypeptide to be eluted was collected.
  • the separated polypeptide solution of interest was dialyzed again against ultrapure water, and an aqueous solution containing only the polypeptide of interest was used as the final purified sample.
  • all the protein purification by the chromatography using the above column was implemented using the AKTAprime plus system (made by GE Healthcare Japan Co., Ltd.).
  • amino acid sequences of two kinds of polypeptides prepared through the above steps and used in the following examples are shown in SEQ ID NO: 13 (2 linked type of SEQ ID NO: 1) and SEQ ID NO: 14 (2 linked type of SEQ ID NO: 2). ).
  • Example 2 Analysis of Affinity of Various Polypeptides with Human IgG Various polypeptides obtained in Example 1 using a biosensor Biacore 3000 (manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.) using surface plasmon resonance was analyzed for the affinity with immunoglobulin.
  • human immunoglobulin G preparation (hereinafter referred to as human IgG) fractionated from human plasma was immobilized on a sensor chip, and various proteins were allowed to flow on the chip to detect their interaction.
  • Immobilization of human IgG on the sensor chip CM5 is performed by an amine coupling method using N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbohydrate hydride (EDC). Ethanolamine was used (sensor chips and immobilization reagents were all manufactured by GE Healthcare Japan Ltd.).
  • polypeptides produced by the method described in Example 1 were prepared using a running buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, 0.005% P-20, pH 7.4). Each of the polypeptide solutions was added to the sensor chip for 30 seconds at a flow rate of 20 ⁇ L / min. At a measurement temperature of 25 ° C., a binding reaction curve at the time of addition (binding phase, 90 seconds) and after completion of the addition (dissociation phase, 90 seconds) was observed in order. After each observation, 40 mM NaOH (15 seconds) was added to regenerate the sensor chip.
  • binding reaction curve binding reaction curve obtained by subtracting the binding reaction curve of the reference cell
  • the affinity constant (K A ) of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 to the antibody is 2.1 ⁇ 10 8 (M ⁇ 1 ) for the polypeptide of SEQ ID NO: 13 and 2.6 ⁇ for the polypeptide of SEQ ID NO: 14 10 8 (M ⁇ 1 ). It was a measurement result that can be said to have sufficient affinity for human immunoglobulin.
  • Example 3 Stability evaluation of novel polypeptide against alkali by SDS-PAGE analysis
  • the various polypeptides obtained in Example 1 were subjected to a treatment for incubation for a certain period of time under alkaline conditions. It evaluated by comparing the state of a band.
  • the alkali treatment was performed by the following method. To 200 ⁇ M of various polypeptides, add NaOH so that the final concentration is 0.5 M, and incubate at 25 ° C. for 4, 8 and 24 hours. The sample was neutralized by adding a certain volume confirmed to return to the polypeptide solution, and used as a sample for SDS-PAGE.
  • the sample for SDS-PAGE before alkali treatment (0 hour after treatment) is prepared by adding NaOH solution added during alkali treatment and HCl solution added during neutralization treatment in advance so that the polypeptide concentration and solution composition are the same. Prepared by adding mixed solution.
  • FIG. 1 shows an electronic image of SDS-PAGE.
  • the known high alkali resistance polypeptide (Comparative Example 1, SEQ ID NO: 15, 2-linked type) is 55.0. %, Whereas the polypeptide of SEQ ID NO: 13 was 60.9% and the polypeptide of SEQ ID NO: 14 was 91.6%.
  • polypeptide obtained in the present invention exhibits excellent stability even under severe alkaline conditions.
  • polypeptide of SEQ ID NO: 14 (based on SEQ ID NO: 2) has almost no change in band intensity (99.8%) even after incubation at 0.5 M NaOH at 25 ° C. for 4 hours. It can be said that this is a very practical polypeptide.
  • Example 4 Preparation of novel polypeptide Using pGEX-2T containing DNA encoding SEQ ID NO: 1 obtained in Example 1 as a template DNA, a quick change method was performed using two kinds of primers, and a new polypeptide was prepared. An expression plasmid containing the mutation was obtained. The quick change method was carried out using the DNA polymerase Pfu Turbo and the methylated DNA (template DNA) cleaving enzyme DpnI (both manufactured by Stratagene) according to the Stratagene protocol.
  • ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLRDDPVSREILEAEAQRLNDAQAPR SEQ ID NO: 30
  • ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLIDDPVSREILEAEAQRLNDAQAPR SEQ ID NO: 31
  • ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLIDDPVSREILEAEARRLNDAQAPR SEQ ID NO: 32
  • ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQSLHDDPSVSREILAEARRLNDAQAPR SEQ ID NO: 33
  • ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQELRDDPVSVSREILAEARRLNDAQAPR SEQ ID NO: 34
  • ADNRFNREQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAFIQLLRDDPVSVSREILEAEARRLNDAQAPR SEQ ID NO: 35
  • each polypeptide is shown in SEQ ID NOs: 38-45.
  • the amino acid residue at the C-terminus is substituted with Lys, but the evaluation result does not change depending on the presence or absence of substitution because it is a C-terminus.
  • polypeptides were expressed and purified in the same manner as in Example 1.
  • Example 5 Evaluation of Stability of Novel Polypeptides against Alkaline by SDS-PAGE Analysis
  • Various polypeptides obtained in Example 4 were treated for a certain period of time under alkaline conditions in the same manner as in Example 3. The evaluation was performed by comparing the state of the band on SDS-PAGE after the test.
  • the polypeptides of SEQ ID NOs: 38 to 41 were evaluated for stability after incubation for 4 hours and 24 hours.
  • the polypeptides of SEQ ID NOs: 42 to 45 were evaluated for stability after 30 hours of incubation. For reference, the same operation was performed for the polypeptide of SEQ ID NO: 14.
  • FIG. 2 shows an electronic image of SDS-PAGE.
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 38 was 73.4%
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 39 was 79.0%
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 40 was 85.6. %
  • the polypeptide of SEQ ID NO: 41 was 82.8%.
  • the known alkali-resistant polypeptide (Comparative Example 2, SEQ ID NO: 46, 2-linked type) was 23.1%, The polypeptide of SEQ ID NO: 14 is 45.1%, the polypeptide of SEQ ID NO: 42 is 45.8%, the polypeptide of SEQ ID NO: 43 is 43.8%, the polypeptide of SEQ ID NO: 44 is 49.6%, SEQ ID NO: 45 polypeptides were 65.0%. Therefore, it was found that these polypeptides also show excellent stability even under severe alkaline conditions.
  • a polypeptide obtained by introducing the mutation S33E into C-G29A is a known polypeptide exhibiting alkali resistance equivalent to that of C-G29A (International Publication No. 2011/118699).
  • the polypeptide (SEQ ID NO: 46) in which this sequence was linked in tandem was expressed and purified in the same manner as in Example 1, and alkali resistance was evaluated in the same manner as in Example 3.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

免疫グロブリンに結合性を示し、かつ、アルカリに対する安定性に優れた新規ポリペプチドを提供する。本発明は、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。

Description

免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド
本発明は、免疫グロブリンに結合性を示し、かつ、化学的安定性に優れた、新規ポリペプチドに関する。
抗体は、抗原と呼ばれる物質に特異的に結合する機能、および、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。抗体という名は、このような抗原に結合するという機能を重視した名前であり、物質としては「免疫グロブリン」と呼ばれる。
抗体中の定常領域（抗原結合部位以外）で特異的に結合する物質（リガンド）は、抗体の精製や検出のために利用することが可能であり、定常領域に結合することで適応範囲も広がるため、産業的な価値も十分にある。抗体中の定常領域に特異的に結合するリガンドの代表的なものとして、プロテインＡやプロテインＧが挙げられる。
抗体医薬や検査診断などの抗体関連産業の発達に伴い、これらのリガンドに化学的な安定性が要求されることが増えてきた。特に、ウイルス等の失活、または、リガンドを固定化した担体（ビーズやチップなど）の洗浄のためにアルカリが使用されるので、アルカリに対して高い安定性を有するリガンドに対するニーズは非常に多い。ポリペプチド型のリガンドは、一般的にアルカリに対して弱いので、極めて優れた結合特異性を生かしつつ、アルカリに対する耐性を向上させる技術に対する研究が盛んになされている（非特許文献１、２）。
抗体に結合するリガンドのアルカリ耐性を向上させる技術としてはプロテインＡの２９位のＧｌｙを変異することでアルカリ耐性を付与する技術（特許文献１、２）、Ａｓｎを他のアミノ酸に置換することでアルカリ耐性を付与する技術（特許文献３、４）、プロテインＡのＣドメインまたはその変異体を利用する技術（特許文献５、６）が挙げられる。
特開昭６２－１９００８７号公報 国際公開第２０１０／１１０２８８号パンフレット 特表２００２－５２７１０７号公報 特表２００５－５３８６９３号公報 特開２００６－３０４６３３号公報 特表２０１０－５０４７５４号公報
Ｌｉｎｈｕｌｔ　Ｍ．他　著、「ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ」２００４年、５５巻、４０７－４１６頁 Ｐａｌｍｅｒ　Ｂ．他　著、「Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、２００８年、１３４巻、２２２－２３０頁
本発明の課題は、免疫グロブリンに結合性を示し、かつ、アルカリに対する安定性に優れた、新規ポリペプチドを提供することである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、計算化学的手法およびタンパク質工学的手法を駆使し、これまでの技術開発によって得られたポリペプチドとは配列が異なり、かつ、より優れたアルカリ耐性を示す新規ポリペプチドを発明するに至った。
すなわち、本発明は、以下のアミノ酸配列：
ＲＦＸ１Ｘ２ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＸ３ＰＮＬＴＥＥＱＲＮＸ４ＦＩＱＸ５ＬＸ６Ｘ７Ｘ８ＰＳＶＳＲＥＸ９ＬＡＥＡＸ１０Ｘ１１ＬＮＤＡＱＡＰＸ１２
（前記アミノ酸配列中、
       Ｘ１　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｎ，又は　Ｑ
       Ｘ２　＝　Ｅ，又は　Ｒ
       Ｘ３　＝　Ｌ，　Ｍ，又は　Ｉ
       Ｘ４　＝　Ａ，　Ｅ，　Ｆ，　Ｒ，　Ｙ，又は　Ｗ
       Ｘ５　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，又は　Ｖ
       Ｘ６　＝　Ｈ，　Ｉ，又は　Ｒ
       Ｘ７　＝　Ｄ，　Ｉ，又は　Ｒ
       Ｘ８　＝　Ｄ，又は　Ｅ
       Ｘ９　＝　Ｉ，　Ｌ，又は　Ｖ
       Ｘ１０　＝　Ｒ，又は　Ｑ
       Ｘ１１　＝　Ｈ，又は　Ｒ
       Ｘ１２　＝　Ｒ，　Ｇ，又は　Ｋ
である）
を含み、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。
また、本発明は、以下のアミノ酸配列：
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＲＦＸ１Ｘ２ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＸ３ＰＮＬＴＥＥＱＲＮＸ４ＦＩＱＸ５ＬＸ６Ｘ７Ｘ８ＰＳＶＳＲＥＸ９ＬＡＥＡＸ１０Ｘ１１ＬＮＤＡＱＡＰＸ１２
（前記アミノ酸配列中、
       Ｘ１　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｎ，又は　Ｑ
       Ｘ２　＝　Ｅ，又は　Ｒ
       Ｘ３　＝　Ｌ，　Ｍ，又は　Ｉ
       Ｘ４　＝　Ａ，　Ｅ，　Ｆ，　Ｒ，　Ｙ，又は　Ｗ
       Ｘ５　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，又は　Ｖ
       Ｘ６　＝　Ｈ，　Ｉ，又は　Ｒ
       Ｘ７　＝　Ｄ，　Ｉ，又は　Ｒ
       Ｘ８　＝　Ｄ，又は　Ｅ
       Ｘ９　＝　Ｉ，　Ｌ，又は　Ｖ
       Ｘ１０　＝　Ｒ，又は　Ｑ
       Ｘ１１　＝　Ｈ，又は　Ｒ
       Ｘ１２　＝　Ｒ，　Ｇ，又は　Ｋ
       Ｚ１～Ｚ３　＝　Ａ，　Ｄ，　Ｅ，　Ｇ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｎ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，　Ｖ，又は　Ｙ
である）
を含み、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とするポリペプチドに関する。
前記ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列：
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＧ（配列番号１）、又は
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号２）
との配列同一性が９０％以上であることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、特にアルカリに対する安定性に優れるという特徴を有する。極めて過酷なアルカリ性条件下、例えば、０．１～１．０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）に、室温下で数時間暴露しても、免疫グロブリンへの結合性はほとんど失われない。
免疫グロブリンに結合性を残し、アルカリ耐性に優れるプロテインＡ変異体は多く知られるが、本発明は、それらを有意に上回るアルカリ耐性を示す新規ペプチドを提供する。
例えば、タンパク質の確認のために利用されるＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて、アルカリ条件下に長時間暴露されたタンパク質は、一般的に、切断や修飾を激しく受けて、アルカリ処理前のバンドの状態（濃さ、位置、および、本数）を維持することが難しい。しかし、本発明で得られた新規ペプチドは、厳しいアルカリ性条件下に暴露された後も、処理前のバンドの状態を維持でき、その耐え得る条件は、公知のアルカリ耐性プロテインＡ変異体よりも厳しくすることが可能である。
実施例３及び比較例１の結果を示す。アルカリ処理（０、４、８、および、２４時間）後の、配列番号１３～１５のポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥの図である。 実施例５及び比較例２の結果を示す。アルカリ処理（０、４、および、２４時間）後の、配列番号３８～４６のポリペプチドのＳＤＳ－ＰＡＧＥの図である。
本明細書において、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含む。本発明のポリペプチドは約５０アミノ酸からなるため、一般的には、「タンパク質」、または、「（タンパク質の）ドメイン」と呼ばれることもあり、基本的に「ポリペプチド」と区別されるものではない。
「免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質」とは、免疫グロブリン分子、免疫グロブリン断片、および免疫グロブリン誘導体を含む表現である。「免疫グロブリンＧ誘導体」とは、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどの、改変型人工タンパク質を総称する名称である。また、Ｆｃ領域の立体構造を保持した上で、さらなる改変（断片化など）を施すことは可能である。よって、本発明における「免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質」は、一般的にＦｃ領域と呼ばれる領域を、不足なく全て含有する免疫グロブリン分子、および、その誘導体に限定されるものではない。
本発明の新規ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含み、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とする。
ＲＦＸ１Ｘ２ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＸ３ＰＮＬＴＥＥＱＲＮＸ４ＦＩＱＸ５ＬＸ６Ｘ７Ｘ８ＰＳＶＳＲＥＸ９ＬＡＥＡＸ１０Ｘ１１ＬＮＤＡＱＡＰＸ１２
       Ｘ１　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｎ，又は　Ｑ
       Ｘ２　＝　Ｅ，又は　Ｒ
       Ｘ３　＝　Ｌ，　Ｍ，又は　Ｉ
       Ｘ４　＝　Ａ，　Ｅ，　Ｆ，　Ｒ，　Ｙ，又は　Ｗ
       Ｘ５　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，又は　Ｖ
       Ｘ６　＝　Ｈ，　Ｉ，又は　Ｒ
       Ｘ７　＝　Ｄ，　Ｉ，又は　Ｒ
       Ｘ８　＝　Ｄ，又は　Ｅ
       Ｘ９　＝　Ｉ，　Ｌ，又は　Ｖ
       Ｘ１０　＝　Ｒ，又は　Ｑ
       Ｘ１１　＝　Ｈ，又は　Ｒ
       Ｘ１２　＝　Ｒ，　Ｇ，又は　Ｋ
好ましくは、以下のアミノ酸配列を含み、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とするポリペプチドである。
Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＲＦＸ１Ｘ２ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＸ３ＰＮＬＴＥＥＱＲＮＸ４ＦＩＱＸ５ＬＸ６Ｘ７Ｘ８ＰＳＶＳＲＥＸ９ＬＡＥＡＸ１０Ｘ１１ＬＮＤＡＱＡＰＸ１２
       Ｘ１　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｎ，又は　Ｑ
       Ｘ２　＝　Ｅ，又は　Ｒ
       Ｘ３　＝　Ｌ，　Ｍ，又は　Ｉ
       Ｘ４　＝　Ａ，　Ｅ，　Ｆ，　Ｒ，　Ｙ，又は　Ｗ
       Ｘ５　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，又は　Ｖ
       Ｘ６　＝　Ｈ，　Ｉ，又は　Ｒ
       Ｘ７　＝　Ｄ，　Ｉ，又は　Ｒ
       Ｘ８　＝　Ｄ，又は　Ｅ
       Ｘ９　＝　Ｉ，　Ｌ，又は　Ｖ
       Ｘ１０　＝　Ｒ，又は　Ｑ
       Ｘ１１　＝　Ｈ，又は　Ｒ
       Ｘ１２　＝　Ｒ，　Ｇ，又は　Ｋ
       Ｚ１～Ｚ３　＝　Ａ，　Ｄ，　Ｅ，　Ｇ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｎ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，　Ｖ，　又は　Ｙ
より好ましくは、以下のアミノ酸配列との配列同一性が９０％以上であり、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とするポリペプチドである。
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＧ（配列番号１）、又は
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号２）
上記配列同一性は、９５％以上であることが更に好ましく、９８％以上であることが特に好ましい。また、本発明のポリペプチドより短いポリペプチドであっても、本発明のポリペプチド中の８０％以上、好ましくは９０％以上の配列（範囲）を含む場合は、本発明に含まれる。
ポリペプチドは、上記のアミノ酸配列が２個以上連結されたものであってもよい。連結する個数の下限は、２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、更に好ましくは５個以上であり、上限は、２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは８個以下、更に好ましくは６個以下である。これらの多量体は、同一のアミノ酸配列からなる免疫グロブリン結合性ポリペプチド（ドメイン）同士の連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよい。また、配列が異なる複数種類の免疫グロブリン結合性ポリペプチド同士の連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
ポリペプチドの連結のされ方としては、リンカーとなるアミノ酸残基を介さず連結する方法、または、リンカーとなる１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。リンカーとなるアミノ酸残基の数に特に制限はなく、ポリペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが良い。
また、本発明のポリペプチドには、免疫グロブリン結合性ポリペプチド、または、それが２個以上連結されたポリペプチドが、１つの構成成分として、機能の異なる他のタンパク質と融合されて得られる融合タンパク質も含まれる。融合タンパク質の例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ）が融合したタンパク質を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されていてもよい。
本発明のポリペプチドはアルカリ性条件下での化学的安定性に優れるという特徴を有する。「アルカリ性条件下」とは、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を指す。より具体的には、約０．０５～１．０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。「化学的安定性」とは、アミノ酸残基の化学変化などの化学修飾、および、アミド結合の転移や切断などの化学変性に対して、ポリペプチドがその機能を保持する性質を指す。本発明においてポリペプチドの機能保持とは、免疫グロブリンのＦｃ領域への結合活性（化学変性を受けずに親和性を保持しているポリペプチドの割合）が保持されることを指す。「化学的安定性」が高い程、アルカリ性溶液への浸漬処理の後も、免疫グロブリンのＦｃ領域への結合活性が低下する度合いが小さい。なお、本明細書中における「アルカリ耐性」という用語も、「アルカリ性条件下における化学的安定性」と同義である。
免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に対する親和性は、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、本発明のポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ領域に結合した時の結合シグナルが検出できれば良く、温度２０～４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６～８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫＡ）や解離定数（ＫＤ）を用いることができる（永田他　著、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１９９８年、４１頁）。本発明のポリペプチドの、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＩｇＧへの親和定数（ＫＡ）が１×１０５（Ｍ－１）以上、より好ましくは１×１０６（Ｍ－１）以上、更に好ましくは１×１０７（Ｍ－１）であるタンパク質を好適に用いることができる。
ただし、アルカリ処理後の残存結合活性を求める場合には、結合パラメータとして、ＫＡやＫＤは不適切である。化学処理によって、タンパク質１分子の免疫グロブリンに対する結合能は変化しないからである。アルカリ処理後のタンパク質の残存結合活性を求める方法として、例えば、タンパク質をセンサーチップに固定化し、タンパク質を化学処理する前と後で、同一濃度の免疫グロブリンを添加したときの、結合シグナルの大きさ、または、理論的最大結合容量（Ｒｍａｘ）という結合パラメータを用いる方法が好ましいが、この方法に限定されない。例えば、免疫グロブリンを固定化し、化学処理前後のタンパク質を添加する実験系でも可能である。
アルカリ性条件下における化学的安定性は、免疫グロブリンに対する結合活性だけでなく、ポリペプチド自体の物質としての安定性を指標として決定することもできる。例えば、電気泳動法によって、アルカリ処理前後のポリペプチドの泳動バンドを比較することで、アルカリ性条件下における化学的安定性を評価することが可能である。具体的には、ごく一般的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、デンシトメトリーによるバンド強度を解析することによって化学的安定性を比較可能である。デンシトメトリーによって分析したバンド強度を基準にすると、本発明のポリペプチドは、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で、２５℃で２４時間静置した後、当該処理をする前と比較して、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。また、デンシトメトリーによって分析したバンド強度を基準にすると、本発明のポリペプチドは、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で、２５℃で３０時間静置した後、当該処理をする前と比較して、３０％以上であることが好ましく、４０％以上であることがより好ましく、５０％以上であることが更に好ましい。
本発明のタンパク質は、タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをベクターに挿入し、該ベクターを含む形質転換体を培養することによって生産することができる。
前記ＤＮＡは、その塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列が、該タンパク質を構成するものであればいずれでも良い。そのようなＤＮＡは、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該ＤＮＡを構成する塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、翻訳されたときに同一のタンパク質をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。
ＤＮＡの塩基配列を改変するための部位特異的な変異の導入は、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。すなわち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、タンパク質をコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。
また、本発明の単量体タンパク質（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体タンパク質をコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体タンパク質をコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。
また、多量体タンパク質をコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体タンパク質をコードする塩基配列が同一の場合には、形質転換した際に宿主細胞内でＤＮＡの相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下であることが好ましく、８５％以下であることがより好ましい。
前記ベクターは、前述したタンパク質、または、その部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したタンパク質をコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとしては、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）などが挙げられる。
本発明のタンパク質は、タンパク質発現を補助する作用、または、精製を容易にする作用がある公知の蛋白質との融合タンパク質として取得することができる。該タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。本発明のタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、ＭＢＰ或いはＧＳＴ等をコードするＤＮＡとを連結した状態で含むベクターを使用して、融合タンパク質を生産することができる。
形質転換体は、宿主となる細胞へベクターを導入することにより得ることができる。宿主へのベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。
宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。
また、本発明のタンパク質は、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明のタンパク質を含む融合タンパク質を生成蓄積させ、該培養物から該融合タンパク質を採取し、該融合タンパク質を適切なプロテアーゼによって切断し、所望のタンパク質を採取することによっても製造することができる。
形質転換細胞の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。培養に用いる培地は、該タンパク質を高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわちＰｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。
さらに、本発明のタンパク質を正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用しても良い（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のタンパク質と共存させる）。なお、本発明のタンパク質の正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン　１％、酵母エキス　０．５％、ＮａＣｌ　１％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％）等が挙げられる。
ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＴＭ培地（ペプトン　１％、肉エキス　０．５％、酵母エキス　０．２％、グルコース　１％、ｐＨ　７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン　４％、酵母エキス　０．５％　、グルコース　２％、ｐＨ　７．２）等が挙げられる。
また、培養温度は、１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより、本発明のタンパク質を、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
組換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組換えタンパク質を回収することができる。
また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたタンパク質を回収することができる。
本発明のタンパク質の精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。
得られた精製物質が目的のタンパク質であることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
本発明のタンパク質は、前記ＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系を用いて製造することもできる。このような無細胞タンパク質合成系の例として、原核細胞由来、植物細胞由来、高等動物細胞由来の合成系が挙げられる。
本発明のタンパク質は、免疫グロブリンに対して親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することができる。該リガンドを水不溶性の基材からなる担体に固定化して、アフィニティー分離マトリックスを得ることができる。
ここで、「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
アフィニティーリガンドを固定化するための、水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、メタクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
また、水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基、または、チオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合させることができる。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入しても良いし、担体にリガンドを直接固定化しても良い。この場合、固定化のために、本発明のタンパク質に対して、化学修飾しても良いし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えても良い。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明のタンパク質をリガンドとして固定化したマトリックスが本発明のタンパク質の効果を奏する限り、固定化のための修飾・改変方法は特に限定されない。
具体的な固定化方法として、リガンドに存在するＬｙｓのεアミノ基を介して、従来のカップリング法で担体に共有結合される方法が好ましい。本発明のタンパク質は、Ｌｙｓを含まない場合があるので、その場合には、上述のように、固定化に有用なＬｙｓを付与した配列をポリペプチドに加えることが好ましく、Ｌｙｓを付与した配列はポリペプチドの末端に付与されることが好ましい。本発明における「Ｌｙｓを付与した配列」とは、少なくとも１個以上のＬｙｓを含有する配列であり、Ｌｙｓの数は、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、更に好ましくは１～３個である。また、Ｌｙｓが複数ある場合には各々のＬｙｓが連続（隣接）している必要はない。また、末端にＬｙｓを付与した配列のアミノ酸残基数についても、特に制限は無く、Ｌｙｓ１個からなる配列であっても構わない。Ｌｙｓを付与した配列のアミノ酸残基数は、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、更に好ましくは１～５個である。「末端に付与」とは、基本的には、アミノ酸配列のＮ末端、または、Ｃ末端への付与を意味する。よって、本発明のポリペプチドの末端を置換変異することで、Ｌｙｓを付与しても構わない。
「免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質」とは、本発明のタンパク質が結合するＦｃ領域側の部位を含むタンパク質のことであり、Ｆｃ領域を完全に含むタンパク質である必要はない。
これらの免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質の精製法は、すでに市販品として存在するカラムを用いたアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法に準じる手順により達成することができる。すなわち、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液をアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液（該マトリックスからの解離を促進する物質を含む場合もある）をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。アフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
（実施例１）新規ポリペプチドの調製
配列番号３および４に記載のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを混合し、ポリメラーゼにＢｌｅｎｄ　Ｔａｑ（東洋紡績株式会社製）を用い、添付のプロトコルに従ってオーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物である二本鎖ＤＮＡをアガロース電気泳動で抽出・精製し、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（いずれもタカラバイオ株式会社製）により切断した。同様の手法で、配列番号５および６に記載のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドから、ＰＣＲ反応にて目的の二本鎖ＤＮＡを得て、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（タカラバイオ株式会社製）により切断した。
プラスミドベクターｐＧＥＸ－２Ｔ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに、上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。ライゲーション反応は、制限酵素ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩによる切断反応とＡｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）による脱リン酸化反応を行ったベクターｐＧＥＸ－２Ｔと、上記２種の制限酵素処理済み二本鎖ＤＮＡを混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡績株式会社製）を用い、添付のプロトコルに従って行った。なお、上記２種の二本鎖ＤＮＡが、ＨｉｎｄＩＩＩ切断サイトで結合し、ｐＧＥＸ－２Ｔにサブクローニングしたときに、配列番号１をコードするように、配列番号３、４、５、６のＤＮＡを設計した。この配列番号１をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ－２Ｔ（ライゲーション反応液）を用いて、大腸菌ＨＢ１０１細胞（タカラバイオ株式会社製）の形質転換を行い、定法によって、プラスミドＤＮＡを増幅・抽出した。
この発現プラスミドを鋳型として、（１）配列番号７および８のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ＰｓｔＩとｃｆｒ１３Ｉ（タカラバイオ株式会社製）で処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。また、同じ鋳型を用いて、（２）配列番号９および１０のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応精製産物を制限酵素ｃｆｒ１３ＩとＥｃｏＲＩで処理し、インサート用二本鎖ＤＮＡを調製した。これら２種のインサート用二本鎖ＤＮＡを、（３）制限酵素（ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ）処理と脱リン酸化処理を施したブレビバチルス用発現ベクターｐＮＫ３２６０’（国際公開第２００６／００４０６７号パンフレット）と混合し、ライゲーション反応によって、配列番号１のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを持つ発現プラスミドを構築した。
また、上記と並行して、オリゴヌクレオチドプライマーについて、（１）では配列番号７および１１を、（２）では配列番号９および１２を使用し、制限酵素については、（１）ではＰｓｔＩとＸｈｏＩ（タカラバイオ株式会社製）、（２）では、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩを使用することで、配列番号２のアミノ酸配列が連結されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを持つ発現プラスミドを構築した。なお、遺伝子操作の都合から、Ｃ末端（２番目のリピートの最後）のアミノ酸残基はＬｙｓに置換されているが、Ｃ末端なので置換の有無によって評価結果は変わらない。
これらの発現プラスミドを用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１株の形質転換を行った。形質転換は、公知の方法による電気導入法にて実施した（「Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、１９９７年、６１号、２０２－２０３頁）。なお、ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１株は、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＯＫ株（特開平６－２９６４８５号公報）に変異処理をして得られたＰｈｅ・Ｔｙｒ要求性株である。
ブレビバチルス・チョウシネンシスＦＹ－１組換え菌を、６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む５ｍＬの３ＹＣ培地（ポリペプトン　３％、酵母エキス　０．２％、グルコース　３％、硫酸マグネシウム　０．０１％、硫酸鉄　０．００１％、塩化マンガン　０．００１％、塩化亜鉛　０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。
培養物を遠心処理して菌体を分離し、得られた培養上清から、ＳＰ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーにて、目的のポリペプチドを精製した。具体的には、酢酸ナトリウムを終濃度５０ｍＭになるように添加し、さらに塩酸でｐＨ４．０に調整した培養上清を、陽イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＨ－ＣＨ３ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．０）にて平衡化したＳＰ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラムに添加し、陽イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陽イオン交換緩衝液Ａと陽イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＨ－ＣＨ３ＣＯＯＮａ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的のポリペプチドを分取した。次に、ＤＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて、目的のポリペプチドを精製した。具体的には、分取した目的タンパク質溶液を、超純水に透析し、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）にて平衡化したＤＥＡＥ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Ａと陰イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．３Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出される目的のポリペプチドを分取した。分取した目的のポリペプチド溶液を、再び超純水に透析し、目的のポリペプチドのみを含む水溶液を最終精製サンプルとした。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を利用して実施した。
以上の工程を経て調製され、以後の実施例に用いた、２種類のポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１３（配列番号１の２連結型）、配列番号１４（配列番号２の２連結型）として示す。
（実施例２）各種ポリペプチドのヒトＩｇＧとの親和性の解析
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ　３０００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）を用いて、実施例１で取得した各種ポリペプチドの免疫グロブリンとの親和性を解析した。
ヒト血漿から分画したヒト免疫グロブリンＧ製剤（以後は、ヒトＩｇＧと記する）をセンサーチップに固定化し、各種タンパク質をチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ヒトＩｇＧのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、および、Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）。ヒトＩｇＧ溶液としてガンマガード（バクスター社製）を使用し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解して調製した。このヒトＩｇＧ溶液を、固定化用緩衝液（１０ｍＭ　ＣＨ３ＣＯＯＨ－ＣＨ３ＣＯＯＮａ、ｐＨ４．５）で１００倍に希釈した。ヒトＩｇＧは、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。
実施例１に記載の方法で製造した各種ポリペプチドは、ランニング緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４－Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．００５％　Ｐ－２０、ｐＨ７．４）を用いて、１０～１０００ｎＭの範囲で適宜調製し（各々について、異なるタンパク質濃度の溶液を３種類調製）、各々のポリペプチド溶液を、流速２０μＬ／ｍｉｎで３０秒間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、９０秒間）、および、添加終了後（解離相、９０秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、４０ｍＭ　ＮａＯＨ（１５秒間）を添加してセンサーチップを再生した。この操作は、センサーチップ上に残った添加タンパク質の除去が目的であり、固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧに対する親和定数（ＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を算出した。
配列番号１のポリペプチドの抗体への親和定数（ＫＡ）は、配列番号１３のポリペプチドが２．１×１０８（Ｍ－１）であり、配列番号１４のポリペプチドが２．６×１０８（Ｍ－１）であった。ヒト免疫グロブリンに対して十分な親和性を有すると言える測定結果であった。
（実施例３）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析による新規ポリペプチドのアルカリに対する安定性評価
実施例１で取得した各種ポリペプチドについて、アルカリ性条件下で一定時間インキュベートする処理を行った後の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のバンドの状態を比較することで評価した。
アルカリ処理は次の方法で行った。２００μＭの各種ポリペプチドに対して、最終濃度が０．５ＭとなるようにＮａＯＨを加えて、２５℃にて４、８、および、２４時間インキュベートし、０．５Ｍ　ＨＣｌ（あらかじめｐＨが中性に戻ることを確認した一定容量）をポリペプチド溶液に対して添加することで中和し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルとした。アルカリ処理前（処理後０時間）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルは、ポリペプチド濃度、溶液の組成が同じになるように、アルカリ処理時に加えるＮａＯＨ溶液、および、中和処理時に加えるＨＣｌ溶液を、あらかじめ混合させた溶液を加えることで調製した。電源搭載型ミニスラブ電気泳動槽パジェランに１５％ポリアクリルアミド・プレキャストゲル「ｅ・ＰＡＧＥＬ」（共にアトー株式会社製）を用いて、付属のマニュアル（定法）に従いＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。染色・脱色処理後の電気泳動ゲルを画像読取装置ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ（バイオラッドラボラトリーズ株式会社製）を用いて電子画像化し、バンドの解析（デンシトメトリー）は、付属のソフトＱｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅ（バイオラッドラボラトリーズ株式会社製）にて、マニュアルに従って行った。図１にＳＤＳ－ＰＡＧＥの電子画像を示す。
アルカリ処理から２４時間後のバンド強度比（アルカリ処理前を１００％としたときの残存率）について、公知の高アルカリ耐性ポリペプチド（比較例１、配列番号１５、２連結型）が５５．０％であったのに対し、配列番号１３のポリペプチドが６０．９％、配列番号１４のポリペプチドが９１．６％であった。
本発明で得られたポリペプチドは、厳しいアルカリ条件下でも優れた安定性を示すことが分かった。特に、配列番号１４（配列番号２がベース）のポリペプチドは、０．５Ｍ　ＮａＯＨ、２５℃で４時間インキュベートしても、バンド強度がほとんど変化しない（９９．８％）ことから、様々な局面で極めて実用性の高いポリペプチドであると言える。
（実施例４）新規ポリペプチドの調製
実施例１で取得した配列番号１をコードするＤＮＡを含むｐＧＥＸ－２Ｔを鋳型ＤＮＡとして、２種類のプライマーを用いて、クイックチェンジ法を実施し、新たな変異を含む発現プラスミドを取得した。クイックチェンジ法は、ＤＮＡポリメラーゼのＰｆｕ　Ｔｕｒｂｏ、および、メチル化ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）切断酵素ＤｐｎＩ（ともにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のプロトコルに従い実施した。配列番号１６と１７、または、配列番号１８と１９、または、配列番号２０と２１、または、配列番号２２と２３、配列番号２４と２５、配列番号２６と２７、配列番号２８と２９という、７通りのプライマーの組み合わせで、新たな変異を導入した発現プラスミドを調製した。さらに、配列番号１６と１７のプライマーを用いて調製した発現プラスミドを鋳型ＤＮＡとして、配列番号１８と１９のプライマーを用いて、もう一度変異を導入した発現プラスミドも調製した。したがって、新たに８種類の発現プラスミドを調製した。
これらの発現プラスミドを鋳型として、実施例１に記載の工程（１）～（３）の手法を用いて、以下に示す各々のアミノ酸配列（配列番号３０～３７）について、同じ配列のリピートとなるアミノ酸配列を有する４種類のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現プラスミドを取得した。
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＱＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号３０）
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＩＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＱＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号３１）
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＩＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号３２）
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＨＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号３３）
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＥＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号３４）
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＬＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号３５）
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＴＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号３６）
ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＩＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号３７）
各々のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３８～４５に示す。なお、実施例１と同様に、Ｃ末端（２番目のリピートの最後）のアミノ酸残基はＬｙｓに置換されているが、Ｃ末端なので置換の有無によって評価結果は変わらない。
これらの発現プラスミドを用いて、実施例１と同様の方法でポリペプチドを発現し、精製した。
（実施例５）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析による新規ポリペプチドのアルカリに対する安定性評価
実施例４で取得した各種ポリペプチドについて、実施例３と同様の手法にて、アルカリ性条件下で一定時間インキュベートする処理を行った後の、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のバンドの状態を比較することで評価した。配列番号３８～４１のポリペプチドについては、４時間及び２４時間インキュベートした後の安定性を評価した。配列番号４２～４５のポリペプチドについては、３０時間インキュベートした後の安定性を評価した。なお、参照として配列番号１４のポリペプチドについても同様の操作を行った。
図２にＳＤＳ－ＰＡＧＥの電子画像を示す。アルカリ処理を開始してから２４時間後のバンド強度比について、配列番号３８のポリペプチドが７３．４％、配列番号３９のポリペプチドが７９．０％、配列番号４０のポリペプチドが８５．６％、配列番号４１のポリペプチドが８２．８％であった。同様に、アルカリ処理を開始してから３０時間後のバンド強度比について、公知のアルカリ耐性ポリペプチド（比較例２、配列番号４６、２連結型）が２３．１％であったのに対し、配列番号１４のポリペプチドが４５．１％、配列番号４２のポリペプチドが４５．８％、配列番号４３のポリペプチドが４３．８％、配列番号４４のポリペプチドが４９．６％、配列番号４５のポリペプチドが６５．０％であった。したがって、これらのポリペプチドも、厳しいアルカリ条件下でも優れた安定性を示すことが分かった。
（比較例１）Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄの調製および評価
Ｃ－Ｇ２９Ａ．２ｄはプロテインＡのＣドメインに変異Ｇ２９Ａを導入した等機能変異体であり、アルカリ耐性が非常に高いことで公知（特許文献５）のポリペプチドである。この等機能変異体がタンデムに連結されたポリペプチド（配列番号１５）をコードするＤＮＡを、ＰｓｔＩ／ＥｃｏＲＩサイトで切断できるようにＰＣＲで増幅し、ベクターｐＮＫ３２６０’にサブクローニングした。実施例１と同様の方法で発現・精製を行い、実施例３と同様の方法でアルカリ耐性を評価した。
（比較例２）Ｃ－Ｇ２９Ａ／Ｓ３３Ｅ．２ｄの調製および評価
Ｃ－Ｇ２９Ａに変異Ｓ３３Ｅを導入したポリペプチドは、Ｃ－Ｇ２９Ａと同等のアルカリ耐性を示す公知のポリペプチドである（国際公開第２０１１／１１８６９９号公報）。この配列がタンデムに連結されたポリペプチド（配列番号４６）について、実施例１と同様の手法で発現・精製を行い、実施例３と同様の方法でアルカリ耐性を評価した。

Claims (3)

  1. 以下のアミノ酸配列：
    ＲＦＸ１Ｘ２ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＸ３ＰＮＬＴＥＥＱＲＮＸ４ＦＩＱＸ５ＬＸ６Ｘ７Ｘ８ＰＳＶＳＲＥＸ９ＬＡＥＡＸ１０Ｘ１１ＬＮＤＡＱＡＰＸ１２
    （前記アミノ酸配列中、
           Ｘ１　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｎ，又は　Ｑ
           Ｘ２　＝　Ｅ，又は　Ｒ
           Ｘ３　＝　Ｌ，　Ｍ，又は　Ｉ
           Ｘ４　＝　Ａ，　Ｅ，　Ｆ，　Ｒ，　Ｙ，又は　Ｗ
           Ｘ５　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，又は　Ｖ
           Ｘ６　＝　Ｈ，　Ｉ，又は　Ｒ
           Ｘ７　＝　Ｄ，　Ｉ，又は　Ｒ
           Ｘ８　＝　Ｄ，又は　Ｅ
           Ｘ９　＝　Ｉ，　Ｌ，又は　Ｖ
           Ｘ１０　＝　Ｒ，又は　Ｑ
           Ｘ１１　＝　Ｈ，又は　Ｒ
           Ｘ１２　＝　Ｒ，　Ｇ，又は　Ｋ
    である）
    を含み、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とするポリペプチド。
  2. 以下のアミノ酸配列：
    Ｚ１Ｚ２Ｚ３ＲＦＸ１Ｘ２ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＸ３ＰＮＬＴＥＥＱＲＮＸ４ＦＩＱＸ５ＬＸ６Ｘ７Ｘ８ＰＳＶＳＲＥＸ９ＬＡＥＡＸ１０Ｘ１１ＬＮＤＡＱＡＰＸ１２
    （前記アミノ酸配列中、
           Ｘ１　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｎ，又は　Ｑ
           Ｘ２　＝　Ｅ，又は　Ｒ
           Ｘ３　＝　Ｌ，　Ｍ，又は　Ｉ
           Ｘ４　＝　Ａ，　Ｅ，　Ｆ，　Ｒ，　Ｙ，又は　Ｗ
           Ｘ５　＝　Ｄ，　Ｅ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，又は　Ｖ
           Ｘ６　＝　Ｈ，　Ｉ，又は　Ｒ
           Ｘ７　＝　Ｄ，　Ｉ，又は　Ｒ
           Ｘ８　＝　Ｄ，又は　Ｅ
           Ｘ９　＝　Ｉ，　Ｌ，又は　Ｖ
           Ｘ１０　＝　Ｒ，又は　Ｑ
           Ｘ１１　＝　Ｈ，又は　Ｒ
           Ｘ１２　＝　Ｒ，　Ｇ，又は　Ｋ
           Ｚ１～Ｚ３　＝　Ａ，　Ｄ，　Ｅ，　Ｇ，　Ｈ，　Ｉ，　Ｌ，　Ｎ，　Ｑ，　Ｒ，　Ｓ，　Ｔ，　Ｖ，又は　Ｙ
    である）
    を含み、免疫グロブリンのＦｃ領域を含むタンパク質に結合することを特徴とするポリペプチド。
  3. 以下のアミノ酸配列：
    ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＧ（配列番号１）、又は
    ＡＤＮＲＦＮＲＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＲＤＤＰＳＶＳＲＥＩＬＡＥＡＲＲＬＮＤＡＱＡＰＲ（配列番号２）
    との配列同一性が９０％以上である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
PCT/JP2012/057799 2011-03-25 2012-03-26 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド WO2012133342A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013507569A JP5933526B2 (ja) 2011-03-25 2012-03-26 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド
AU2012233980A AU2012233980B2 (en) 2011-03-25 2012-03-26 Novel immunoglobulin-binding polypeptide
CA2830990A CA2830990A1 (en) 2011-03-25 2012-03-26 Novel immunoglobulin-binding polypeptide
KR1020137022283A KR20140007394A (ko) 2011-03-25 2012-03-26 면역 글로불린 결합성 신규 폴리펩티드
EP12765583.5A EP2690108B1 (en) 2011-03-25 2012-03-26 Novel immunoglobulin-binding polypeptide
SG2013072194A SG193950A1 (en) 2011-03-25 2012-03-26 Novel immunoglobulin-binding polypeptide
US14/007,211 US9284354B2 (en) 2011-03-25 2012-03-26 Immunoglobulin-binding polypeptide
CN201280015181.4A CN103443120B (zh) 2011-03-25 2012-03-26 免疫球蛋白结合性新型多肽

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-068497 2011-03-25
JP2011068497 2011-03-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012133342A1 true WO2012133342A1 (ja) 2012-10-04

Family

ID=46931059

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/057799 WO2012133342A1 (ja) 2011-03-25 2012-03-26 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9284354B2 (ja)
EP (1) EP2690108B1 (ja)
JP (1) JP5933526B2 (ja)
KR (1) KR20140007394A (ja)
CN (1) CN103443120B (ja)
AU (1) AU2012233980B2 (ja)
CA (1) CA2830990A1 (ja)
SG (1) SG193950A1 (ja)
WO (1) WO2012133342A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015034056A1 (ja) * 2013-09-06 2015-03-12 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド
WO2016052073A1 (ja) * 2014-09-29 2016-04-07 富士フイルム株式会社 抗体結合性ポリペプチド、抗体結合性融合ポリペプチドおよび吸着材料
JP2016079149A (ja) * 2014-10-21 2016-05-16 株式会社プロテイン・エクスプレス プロテインｌ変異体
WO2016152946A1 (ja) * 2015-03-26 2016-09-29 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質およびそれを用いたアフィニティー担体
WO2018043629A1 (ja) * 2016-09-01 2018-03-08 国立研究開発法人産業技術総合研究所 非天然型立体構造を形成した抗体に親和性を示すポリペプチド
WO2019187603A1 (ja) * 2018-03-29 2019-10-03 株式会社カネカ 免疫グロブリンｇ結合性ペプチド
WO2020040307A1 (ja) * 2018-08-24 2020-02-27 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
WO2023046886A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Cytiva Bioprocess R&D Ab Fc binding polypeptides

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10065995B2 (en) 2011-03-25 2018-09-04 Kaneka Corporation Protein for affinity-separation matrix
CN104640983A (zh) * 2012-09-21 2015-05-20 株式会社钟化 亲和分离基质用蛋白质配体
CN104945488B (zh) * 2014-03-27 2020-02-18 迈格生物医药（上海）有限公司 一种具有免疫球蛋白结合能力的多肽
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10513537B2 (en) 2016-05-11 2019-12-24 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation matrix
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
WO2017194592A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method of storing a separation matrix
EP3455241B1 (en) 2016-05-11 2022-02-23 Cytiva BioProcess R&D AB Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
CN115850408A (zh) * 2022-09-01 2023-03-28 西安蓝晓科技新材料股份有限公司 一种多肽、融合型多聚体蛋白质及其用途

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62190087A (ja) 1985-12-13 1987-08-20 カビ　ファルマシア　アクチェボラーグ 蛋白質工学を用いるダウンストリ−ムプロセツシングを促進するためのＩｇＧ結合性蛋白質の構成
JPH0231682A (ja) 1988-01-25 1990-02-01 Juzo Udaka ヒトｅｇｆの製造法
JPH06133782A (ja) 1992-07-23 1994-05-17 Higeta Shoyu Co Ltd 高発現ベクタ−及び該高発現ベクタ−を 保有する微生物並びに該微生物を用いる 有用物質の製造法
JPH06296485A (ja) 1993-02-22 1994-10-25 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 変異バチルス・ブレビス菌
JPH07170984A (ja) 1992-03-31 1995-07-11 Juzo Udaka 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコード するｄｎａを保有する発現ベクターを 組み込んだバチルス・ブレビスを用いる 有用物質の製造法
JP2002527107A (ja) 1998-10-21 2002-08-27 アフィボディ・テクノロジー・スウェーデン・アーベー アフィニティ分離の方法及びそれに用いるリガンド
JP2002238569A (ja) 2001-02-14 2002-08-27 Higeta Shoyu Co Ltd 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター
JP2005538693A (ja) 2002-03-25 2005-12-22 アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ 変異免疫グロブリン結合タンパク質
WO2006004067A1 (ja) 2004-07-06 2006-01-12 Kaneka Corporation ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法
JP2006304633A (ja) 2005-04-26 2006-11-09 Apro Life Science Institute Inc イムノグロブリン結合タンパク質
JP2010504754A (ja) 2006-09-29 2010-02-18 ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー 抗体単離のためのスタフィロコッカスアウレウス由来のドメインｃを含むクロマトグラフィーリガンド
WO2010110288A1 (ja) 2009-03-24 2010-09-30 株式会社カネカ 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
WO2011077395A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Institut Pasteur IMMUNOGLOBULIN-BINDING PROTEINS DERIVED FROM Sac7d AND USES THEREOF
WO2011118699A1 (ja) 2010-03-24 2011-09-29 株式会社カネカ 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8674073B2 (en) * 2006-02-21 2014-03-18 Protenova Co., Ltd. Immunoglobulin affinity ligand
JP5004165B2 (ja) 2006-10-10 2012-08-22 独立行政法人産業技術総合研究所 タンパク質の配向制御固定化に適したタンパク質
US9040661B2 (en) 2010-12-21 2015-05-26 Jsr Corporation Support for affinity chromatography and method for isolating immunoglobulin

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS62190087A (ja) 1985-12-13 1987-08-20 カビ　ファルマシア　アクチェボラーグ 蛋白質工学を用いるダウンストリ−ムプロセツシングを促進するためのＩｇＧ結合性蛋白質の構成
JPH0231682A (ja) 1988-01-25 1990-02-01 Juzo Udaka ヒトｅｇｆの製造法
JPH07170984A (ja) 1992-03-31 1995-07-11 Juzo Udaka 新規アミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコード するｄｎａを保有する発現ベクターを 組み込んだバチルス・ブレビスを用いる 有用物質の製造法
JPH06133782A (ja) 1992-07-23 1994-05-17 Higeta Shoyu Co Ltd 高発現ベクタ−及び該高発現ベクタ−を 保有する微生物並びに該微生物を用いる 有用物質の製造法
JPH06296485A (ja) 1993-02-22 1994-10-25 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 変異バチルス・ブレビス菌
JP2002527107A (ja) 1998-10-21 2002-08-27 アフィボディ・テクノロジー・スウェーデン・アーベー アフィニティ分離の方法及びそれに用いるリガンド
JP2002238569A (ja) 2001-02-14 2002-08-27 Higeta Shoyu Co Ltd 大腸菌とブレビバチルス属細菌間のプラスミドシャトルベクター
JP2005538693A (ja) 2002-03-25 2005-12-22 アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ 変異免疫グロブリン結合タンパク質
WO2006004067A1 (ja) 2004-07-06 2006-01-12 Kaneka Corporation ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法
JP2006304633A (ja) 2005-04-26 2006-11-09 Apro Life Science Institute Inc イムノグロブリン結合タンパク質
JP2010504754A (ja) 2006-09-29 2010-02-18 ジーイー・ヘルスケア・バイオ−サイエンシズ・アーベー 抗体単離のためのスタフィロコッカスアウレウス由来のドメインｃを含むクロマトグラフィーリガンド
WO2010110288A1 (ja) 2009-03-24 2010-09-30 株式会社カネカ 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
WO2011077395A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Institut Pasteur IMMUNOGLOBULIN-BINDING PROTEINS DERIVED FROM Sac7d AND USES THEREOF
WO2011118699A1 (ja) 2010-03-24 2011-09-29 株式会社カネカ 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOSCI. BIOTECH. BIOCHEM., vol. 61, 1997, pages 202 - 203
LINHULT M. ET AL., PROTEINS: STRUCTURE, FUNCTION, AND BIOINFORMATICS, vol. 55, 2004, pages 407 - 416
LINHULT MARTIN ET AL.: "Improving the tolerance of a protein a analogue to repeated alkaline exposures using a bypass mutagenesis approach.", PROTEINS, vol. 55, no. 2, 2004, pages 407 - 416, XP002488610 *
NAGATA ET AL.: "Real-time analysis of biomolecular interactions", 1998, SPRINGER-VERLAG TOKYO, pages: 41
PALMER B. ET AL., JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 134, 2008, pages 222 - 230
YOSHIDA S. ET AL.: "Rational design and engineering of protein A to obtain the controlled elution profile in monoclonal antibody purification.", CHEM-BIO INFORMATICS JOURNAL, vol. 12, 2012, pages 1 - 13, XP055073094 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015034056A1 (ja) * 2013-09-06 2015-03-12 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド
US10450344B2 (en) 2014-09-29 2019-10-22 Fujifilm Corporation Antibody-binding polypeptide, antibody-binding fusion polypeptide, and adsorption material
WO2016052073A1 (ja) * 2014-09-29 2016-04-07 富士フイルム株式会社 抗体結合性ポリペプチド、抗体結合性融合ポリペプチドおよび吸着材料
JPWO2016052073A1 (ja) * 2014-09-29 2017-06-01 富士フイルム株式会社 抗体結合性ポリペプチド、抗体結合性融合ポリペプチドおよび吸着材料
JP2016079149A (ja) * 2014-10-21 2016-05-16 株式会社プロテイン・エクスプレス プロテインｌ変異体
WO2016152946A1 (ja) * 2015-03-26 2016-09-29 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質およびそれを用いたアフィニティー担体
JPWO2016152946A1 (ja) * 2015-03-26 2018-01-18 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質およびそれを用いたアフィニティー担体
US10723769B2 (en) 2015-03-26 2020-07-28 Jsr Corporation Immunoglobulin-binding protein and affinity carrier using same
US11008365B2 (en) 2016-09-01 2021-05-18 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Polypeptide exhibiting affinity to antibodies forming non-native three-dimensional structure
JPWO2018043629A1 (ja) * 2016-09-01 2019-06-24 国立研究開発法人産業技術総合研究所 非天然型立体構造を形成した抗体に親和性を示すポリペプチド
WO2018043629A1 (ja) * 2016-09-01 2018-03-08 国立研究開発法人産業技術総合研究所 非天然型立体構造を形成した抗体に親和性を示すポリペプチド
WO2019187603A1 (ja) * 2018-03-29 2019-10-03 株式会社カネカ 免疫グロブリンｇ結合性ペプチド
WO2020040307A1 (ja) * 2018-08-24 2020-02-27 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
JPWO2020040307A1 (ja) * 2018-08-24 2021-08-26 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
JP7335881B2 (ja) 2018-08-24 2023-08-30 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
WO2023046886A1 (en) 2021-09-24 2023-03-30 Cytiva Bioprocess R&D Ab Fc binding polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
AU2012233980A1 (en) 2013-10-17
SG193950A1 (en) 2013-11-29
JP5933526B2 (ja) 2016-06-08
US20140100356A1 (en) 2014-04-10
EP2690108A1 (en) 2014-01-29
CA2830990A1 (en) 2012-10-04
KR20140007394A (ko) 2014-01-17
CN103443120B (zh) 2016-08-31
JPWO2012133342A1 (ja) 2014-07-28
EP2690108B1 (en) 2018-07-25
EP2690108A4 (en) 2014-12-31
US9284354B2 (en) 2016-03-15
CN103443120A (zh) 2013-12-11
AU2012233980B2 (en) 2016-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5933526B2 (ja) 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド
JP6184463B2 (ja) 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
JP6196343B2 (ja) 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
US10065995B2 (en) Protein for affinity-separation matrix
JP6276694B2 (ja) アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド
JP6805831B2 (ja) 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質、およびそれを用いたアフィニティ分離剤、液体クロマトグラフィー用カラム
JP6464089B2 (ja) アフィニティー分離マトリックス用分離能強化リガンド
JP6596005B2 (ja) Ｆａｂ領域含有ペプチド用アフィニティー分離マトリックス
WO2019187602A1 (ja) 改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド
WO2016031926A1 (ja) Ｆａｂ領域結合性ペプチド
JPWO2017022759A1 (ja) 免疫グロブリン結合性改変型タンパク質
WO2019187603A1 (ja) 免疫グロブリンｇ結合性ペプチド
WO2018180205A1 (ja) 免疫グロブリン精製用アフィニティー分離マトリックス
WO2018180204A1 (ja) 安定性改良型免疫グロブリン結合性ペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12765583

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013507569

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137022283

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2830990

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012233980

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20120326

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012765583

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14007211

Country of ref document: US