JPH06296485A - 変異バチルス・ブレビス菌 - Google Patents
変異バチルス・ブレビス菌Info
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- JPH06296485A JPH06296485A JP2435694A JP2435694A JPH06296485A JP H06296485 A JPH06296485 A JP H06296485A JP 2435694 A JP2435694 A JP 2435694A JP 2435694 A JP2435694 A JP 2435694A JP H06296485 A JPH06296485 A JP H06296485A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 プロテアーゼ活性を実質的に示さない変異バ
チルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）
を提供する。 【効果】 この変異菌は、遺伝子組換え用の宿主菌とし
て使用した場合に、異種蛋白質を菌体外に分泌すると共
に、その蛋白質の維持に悪影響を及ぼさない。
チルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）
を提供する。 【効果】 この変異菌は、遺伝子組換え用の宿主菌とし
て使用した場合に、異種蛋白質を菌体外に分泌すると共
に、その蛋白質の維持に悪影響を及ぼさない。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な変異バチルス・
ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に関す
る。より具体的には、本発明はプロテアーゼ活性を実質
的に示さない変異バチルス・ブレビスに関する。したが
って、本発明の変異菌は、特に遺伝子組換え用の宿主と
して有用である。
ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）に関す
る。より具体的には、本発明はプロテアーゼ活性を実質
的に示さない変異バチルス・ブレビスに関する。したが
って、本発明の変異菌は、特に遺伝子組換え用の宿主と
して有用である。
【０００２】
【従来の技術】一般に、遺伝子組換え技術を利用した異
種蛋白質の生産は、大腸菌を宿主として利用している。
しかし、大腸菌は生産した異種蛋白質を菌体内に蓄積す
るため、生産量が制限され、異種蛋白質の回収、精製操
作が煩雑になる等の問題点がある。また、異種蛋白質を
菌体外に分泌することを特徴とする枯草菌を利用した異
種蛋白質生産系も確立されたが、分泌された異種蛋白質
が枯草菌由来のプロテアーゼの作用により分解され、そ
の蓄積量は著しく少ないという問題点に直面している。
種蛋白質の生産は、大腸菌を宿主として利用している。
しかし、大腸菌は生産した異種蛋白質を菌体内に蓄積す
るため、生産量が制限され、異種蛋白質の回収、精製操
作が煩雑になる等の問題点がある。また、異種蛋白質を
菌体外に分泌することを特徴とする枯草菌を利用した異
種蛋白質生産系も確立されたが、分泌された異種蛋白質
が枯草菌由来のプロテアーゼの作用により分解され、そ
の蓄積量は著しく少ないという問題点に直面している。
【０００３】一方、鵜▲高▼らは、バチルス属細菌バチ
ルス・ブレビス４７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ
４７）（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）を宿主とする異種蛋
白質生産系を確立し、提案した（例えば、特開昭６０−
５８０７４号、同６２−２０１５８３号公報参照）。バ
チルス・ブレビス４７は菌体外に多量の蛋白質を生産
し、菌体外プロテアーゼ活性が弱い特徴をもち、遺伝子
組換え技術を利用した異種蛋白質の生産に於いて、大腸
菌、枯草菌の欠点を克服した優れた宿主として注目され
ている。
ルス・ブレビス４７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ
４７）（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）を宿主とする異種蛋
白質生産系を確立し、提案した（例えば、特開昭６０−
５８０７４号、同６２−２０１５８３号公報参照）。バ
チルス・ブレビス４７は菌体外に多量の蛋白質を生産
し、菌体外プロテアーゼ活性が弱い特徴をもち、遺伝子
組換え技術を利用した異種蛋白質の生産に於いて、大腸
菌、枯草菌の欠点を克服した優れた宿主として注目され
ている。
【０００４】鵜▲高▼らは、バチルス・ブレビス４７を
用いてα−アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公
報、H.Yamagata et.al.,J.Bacteriol 169,1239（1987）
参照）やブタペプシノーゲン（鵜▲高▼重三、日本農芸
化学会昭６２年度大会講演要旨集ｐ８３７−８３７、塚
越規弘、日本農芸化学会誌６１，６８（１９８７）参
照）等の分泌生産に成功している。さらに鵜▲高▼ら
は、バチルス・ブレビス４７に比べ菌体外プロテアーゼ
活性が著しく低い新規バチルス・ブレビスＨＰＤ３１
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１）（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１０８７、Ｈ１０２株と同一菌株である）
（特開昭６３−５６２７７号公報参照）を分離し、異種
蛋白質生産の宿主として利用している。
用いてα−アミラーゼ（特開昭６２−２０１５８３号公
報、H.Yamagata et.al.,J.Bacteriol 169,1239（1987）
参照）やブタペプシノーゲン（鵜▲高▼重三、日本農芸
化学会昭６２年度大会講演要旨集ｐ８３７−８３７、塚
越規弘、日本農芸化学会誌６１，６８（１９８７）参
照）等の分泌生産に成功している。さらに鵜▲高▼ら
は、バチルス・ブレビス４７に比べ菌体外プロテアーゼ
活性が著しく低い新規バチルス・ブレビスＨＰＤ３１
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓＨＰＤ３１）（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１０８７、Ｈ１０２株と同一菌株である）
（特開昭６３−５６２７７号公報参照）を分離し、異種
蛋白質生産の宿主として利用している。
【０００５】かかる生産系をヒト上皮細胞増殖因子（ｈ
ＥＧＦ）に適用すると、バチルス・ブレビス４７（１５
mg／Ｌ）に対して約１５倍の高効率でｈＥＧＦの生産す
ることが見い出されている（特開平２−３１６８２号公
報参照）。また、発現ベクターの最適化によりその生産
量は、最高１．２ｇ／Ｌにも達している（Ｓ．Ｅｂｉｓ
ｕら、Biosci.Biotech.Biochem.,56(5),812-813,1992参
照）。
ＥＧＦ）に適用すると、バチルス・ブレビス４７（１５
mg／Ｌ）に対して約１５倍の高効率でｈＥＧＦの生産す
ることが見い出されている（特開平２−３１６８２号公
報参照）。また、発現ベクターの最適化によりその生産
量は、最高１．２ｇ／Ｌにも達している（Ｓ．Ｅｂｉｓ
ｕら、Biosci.Biotech.Biochem.,56(5),812-813,1992参
照）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前記のように、バチル
ス・ブレビスを宿主として用いる異種蛋白質の分泌生産
系は大腸菌、枯草菌と比べ非常に効率のよい系であるこ
とが認識されている。しかしながら、バチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１を始めとする従来既知のバチルス属細菌を
宿主として用いた異種蛋白質生産系であっても、ヒト成
長ホルモン（以下、「ｈＧＨ」と略記する場合もあ
る）、インターロイキン２（以下、「ＩＬ２」と略記す
る場合もある）等の特定の異種蛋白質の生産に適用する
と菌体外に分泌されたそれらの蛋白質が宿主自体のプロ
テアーゼ活性により分解を受け、その蓄積量が著しく低
下するとの問題が生じており、産業上、より安定に異種
蛋白質を蓄積する宿主が求められている。
ス・ブレビスを宿主として用いる異種蛋白質の分泌生産
系は大腸菌、枯草菌と比べ非常に効率のよい系であるこ
とが認識されている。しかしながら、バチルス・ブレビ
スＨＰＤ３１を始めとする従来既知のバチルス属細菌を
宿主として用いた異種蛋白質生産系であっても、ヒト成
長ホルモン（以下、「ｈＧＨ」と略記する場合もあ
る）、インターロイキン２（以下、「ＩＬ２」と略記す
る場合もある）等の特定の異種蛋白質の生産に適用する
と菌体外に分泌されたそれらの蛋白質が宿主自体のプロ
テアーゼ活性により分解を受け、その蓄積量が著しく低
下するとの問題が生じており、産業上、より安定に異種
蛋白質を蓄積する宿主が求められている。
【０００７】したがって、本発明の目的は、従来既知の
バチルス・ブレビスに比べて菌体外プロテアーゼ活性が
有意に低い変異バチルス・ブレビスを提供することであ
る。この変異バチルス・ブレビスは、代表的な例とし
て、ｈＧＨ及びＩＬ２の生産に適する菌株である。
バチルス・ブレビスに比べて菌体外プロテアーゼ活性が
有意に低い変異バチルス・ブレビスを提供することであ
る。この変異バチルス・ブレビスは、代表的な例とし
て、ｈＧＨ及びＩＬ２の生産に適する菌株である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
る、プロテアーゼ活性を実質的に示さない変異バチルス
・ブレビスの提供により解決できる。また、本発明はか
かる変異バチルス・ブレビスの宿主菌としての用途も提
供する。
る、プロテアーゼ活性を実質的に示さない変異バチルス
・ブレビスの提供により解決できる。また、本発明はか
かる変異バチルス・ブレビスの宿主菌としての用途も提
供する。
【０００９】本発明の変異バチルス・ブレビスを宿主菌
として使用すれば、特定の異種蛋白質、特にｈＧＨ及び
ＩＬ２の生産効率を高めることができる。すなわち、本
発明の菌株を異種蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
ベクターと組み合わせて使用すると、そのＤＮＡの発現
により産生され、そして菌体外に分泌された異種蛋白質
を安定に維持、蓄積することが可能である。
として使用すれば、特定の異種蛋白質、特にｈＧＨ及び
ＩＬ２の生産効率を高めることができる。すなわち、本
発明の菌株を異種蛋白質をコードするＤＮＡを含有する
ベクターと組み合わせて使用すると、そのＤＮＡの発現
により産生され、そして菌体外に分泌された異種蛋白質
を安定に維持、蓄積することが可能である。
【００１０】このような作用及び効果を奏するには、バ
チルス・ブレビスに、菌体外プロテアーゼ活性を有意に
低下させるような変異を誘発することが必要である。本
発明にいう「プロテアーゼ活性を実質的に示さない」と
は、ｈＧＨやＩＬ２その他の蛋白質に対して本発明の変
異菌自体がそれらの生産に悪影響を及ぼす程度に作用し
ないことを意味する。したがって、本発明の変異菌は、
少なくともｈＧＨ及びＩＬ２を完全に失活または分解す
るようなプロテアーゼの産生能を有さないことが好まし
いが、これらの異種蛋白質の生産系、例えば培養物中で
の異種蛋白質の生産に許容できる範囲で失活または分解
するものであってもよい。
チルス・ブレビスに、菌体外プロテアーゼ活性を有意に
低下させるような変異を誘発することが必要である。本
発明にいう「プロテアーゼ活性を実質的に示さない」と
は、ｈＧＨやＩＬ２その他の蛋白質に対して本発明の変
異菌自体がそれらの生産に悪影響を及ぼす程度に作用し
ないことを意味する。したがって、本発明の変異菌は、
少なくともｈＧＨ及びＩＬ２を完全に失活または分解す
るようなプロテアーゼの産生能を有さないことが好まし
いが、これらの異種蛋白質の生産系、例えば培養物中で
の異種蛋白質の生産に許容できる範囲で失活または分解
するものであってもよい。
【００１１】また、当然のことに、本発明の変異菌には
ｈＧＨ及びＩＬ２に加え、他の有用な異種蛋白質に対し
てもプロテアーゼ活性を実質的に示さないものも包含さ
れる。本発明の変異菌の親菌としては、後述する変異誘
発法によって目的の変異菌を創製できるものであれば、
バチルス・ブレビスのいずれの種または株に属するもの
でも使用できる。これらのうち、具体的に好ましいもの
としては、本発明者の一人が異種蛋白質の生産用宿主と
して提案した、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ
−７２２４）（特開昭６２−２０１５８３号公報参
照）、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１０８７）（特開昭６３−５６２７７号公報参照）を
挙げることができる。
ｈＧＨ及びＩＬ２に加え、他の有用な異種蛋白質に対し
てもプロテアーゼ活性を実質的に示さないものも包含さ
れる。本発明の変異菌の親菌としては、後述する変異誘
発法によって目的の変異菌を創製できるものであれば、
バチルス・ブレビスのいずれの種または株に属するもの
でも使用できる。これらのうち、具体的に好ましいもの
としては、本発明者の一人が異種蛋白質の生産用宿主と
して提案した、バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ
−７２２４）（特開昭６２−２０１５８３号公報参
照）、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１０８７）（特開昭６３−５６２７７号公報参照）を
挙げることができる。
【００１２】これらの親菌から本発明の変異菌へと変異
する方法としては、微生物に変異を誘発させる方法であ
ればどのような手段を用いてもよいが、たとえば紫外線
照射、ガンマー線照射またはニトロソグアニジンのよう
な薬剤処理などが挙げられる。得られる各種変異菌から
目的の菌株を選択する方法としては、予めｈＧＨまたは
ＩＬ２をコードするＤＮＡを含むプラスミドで親菌を形
質転換しておき、これらの形質転換体に前記変異処理を
行った後、変異菌のｈＧＨまたはＩＬ２の産生能を調べ
ることにより、目的の変異菌株を選ぶのが都合よい。
する方法としては、微生物に変異を誘発させる方法であ
ればどのような手段を用いてもよいが、たとえば紫外線
照射、ガンマー線照射またはニトロソグアニジンのよう
な薬剤処理などが挙げられる。得られる各種変異菌から
目的の菌株を選択する方法としては、予めｈＧＨまたは
ＩＬ２をコードするＤＮＡを含むプラスミドで親菌を形
質転換しておき、これらの形質転換体に前記変異処理を
行った後、変異菌のｈＧＨまたはＩＬ２の産生能を調べ
ることにより、目的の変異菌株を選ぶのが都合よい。
【００１３】こうして得られた本発明の変異菌の具体的
なものの一つは、平成４年１１月１１日付で微生物工業
技術研究所の特許微生物寄託センターに微工研菌寄第１
３２７４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２７４）として寄託さ
れ、平成６年２月１７日にＦＥＲＭ ＢＰ−４５７６と
してブダペスト条約に基く国際寄託に移管されたバチル
ス・ブレビスＯＫ（本明細書におけるバチルス・ブレビ
ス３１−ＯＫと同一菌株）と命名された菌株を挙げるこ
とができる。
なものの一つは、平成４年１１月１１日付で微生物工業
技術研究所の特許微生物寄託センターに微工研菌寄第１
３２７４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３２７４）として寄託さ
れ、平成６年２月１７日にＦＥＲＭ ＢＰ−４５７６と
してブダペスト条約に基く国際寄託に移管されたバチル
ス・ブレビスＯＫ（本明細書におけるバチルス・ブレビ
ス３１−ＯＫと同一菌株）と命名された菌株を挙げるこ
とができる。
【００１４】前述のように本発明の変異菌株は、遺伝子
組換え用の宿主菌として有利に使用することができる。
したがって、その有用性は以下の使用例によって確認で
きるであろう。まず、本発明の宿主菌を形質転換するの
に使用するｈＧＨまたはＩＬ２をコードするＤＮＡを含
有する発現プラスミドを調製する。発現プラスミドは、
バチルス・ブレビスで機能するプロモーターを含有して
いるものが好ましい。
組換え用の宿主菌として有利に使用することができる。
したがって、その有用性は以下の使用例によって確認で
きるであろう。まず、本発明の宿主菌を形質転換するの
に使用するｈＧＨまたはＩＬ２をコードするＤＮＡを含
有する発現プラスミドを調製する。発現プラスミドは、
バチルス・ブレビスで機能するプロモーターを含有して
いるものが好ましい。
【００１５】プロモーターの具体的なものとしては、例
えば前記バチルス・ブレビス４７及び同ＨＰＤ３１のプ
ロモーター領域を含有するＤＮＡを挙げることができ
る。プロモーター領域を含有するＤＮＡは、上記プロモ
ーター以外に、ＳＤ配列、翻訳開始コドンなどを有して
いることが必要であり、さらに主要菌体外蛋白質遺伝子
の一部を含んでいてもよい。
えば前記バチルス・ブレビス４７及び同ＨＰＤ３１のプ
ロモーター領域を含有するＤＮＡを挙げることができ
る。プロモーター領域を含有するＤＮＡは、上記プロモ
ーター以外に、ＳＤ配列、翻訳開始コドンなどを有して
いることが必要であり、さらに主要菌体外蛋白質遺伝子
の一部を含んでいてもよい。
【００１６】例えば、ｈＧＨはバチルス・ブレビスの菌
体内、菌体外のいずれに蓄積されても良いが、菌体外に
これらの蛋白質を蓄積する場合、プロモーター領域を含
有するＤＮＡの３′末端側にシグナルペプチドをコード
する領域が含まれている必要がある。シグナルペプチド
としては、例えば、バチルス・ブレビス４７または同Ｈ
ＰＤ３１の主要菌体外蛋白質のシグナルペプチドなどが
挙げられる。特に、前者ＭＷＰ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｗａｌ
ｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドはその一例で
ある。
体内、菌体外のいずれに蓄積されても良いが、菌体外に
これらの蛋白質を蓄積する場合、プロモーター領域を含
有するＤＮＡの３′末端側にシグナルペプチドをコード
する領域が含まれている必要がある。シグナルペプチド
としては、例えば、バチルス・ブレビス４７または同Ｈ
ＰＤ３１の主要菌体外蛋白質のシグナルペプチドなどが
挙げられる。特に、前者ＭＷＰ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｗａｌ
ｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナルペプチドはその一例で
ある。
【００１７】遺伝子の発現に用いる発現ベクターとして
は、例えば、ｐＨＹ５００，ｐＮＵ２００（特開平２−
３１６８２号公報、鵜▲高▼重三、日本農芸化学会誌、
６１，６６９（１９８７）参照）などが挙げられる。上
記のＤＮＡを用いて作成したｈＧＨ発現プラスミドはｐ
ＮＵ２００−ＧＨなどが挙げられる。
は、例えば、ｐＨＹ５００，ｐＮＵ２００（特開平２−
３１６８２号公報、鵜▲高▼重三、日本農芸化学会誌、
６１，６６９（１９８７）参照）などが挙げられる。上
記のＤＮＡを用いて作成したｈＧＨ発現プラスミドはｐ
ＮＵ２００−ＧＨなどが挙げられる。
【００１８】これらのプラスミドを構築する方法として
は、例えばMolecular Cloning 2nd.Ed.,A Laboratory M
anual(Cold Spring Harbor Laboratory (1990)参照）に
記載の方法などが挙げられる。プラスミドの構築に用い
る宿主としては、大腸菌、枯草菌、バチルス・ブレビス
に属する微生物であればいずれでもよく、例えば大腸菌
ＨＢ１０１、大腸菌ＪＭ１０９、枯草菌ＲＭ１４１（J.
Bacteriol ., 158,1054(1984) 参照）、バチルス・ブレ
ビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）などが挙げられ
る。
は、例えばMolecular Cloning 2nd.Ed.,A Laboratory M
anual(Cold Spring Harbor Laboratory (1990)参照）に
記載の方法などが挙げられる。プラスミドの構築に用い
る宿主としては、大腸菌、枯草菌、バチルス・ブレビス
に属する微生物であればいずれでもよく、例えば大腸菌
ＨＢ１０１、大腸菌ＪＭ１０９、枯草菌ＲＭ１４１（J.
Bacteriol ., 158,1054(1984) 参照）、バチルス・ブレ
ビス４７（ＦＥＲＭ Ｐ−７２２４）などが挙げられ
る。
【００１９】バチルス・ブレビスを形質転換する方法と
しては、例えば、Takahashi らの方法（J.Bacteriol .,
156, 1130(1983)参照）あるいはエレクトロポレーショ
ンによる方法（H.Takagiら、Agric.Bio.Chem.,53, 3099
-3100(1989))などが挙げられる。培養に用いる培地に
は、炭素源、窒素源の他、無機塩類が必要に応じて含ま
れる。また、糖と無機塩類を主とする合成培地を用いて
培養してもよい。栄養要求性を示す菌株を用いる場合に
は、その成育に必要な栄養物質を培地に添加する。さら
に必要であれば、培地に抗生物質や消泡剤などを加えて
もよい。培地の初発pHは５．０〜９．０であり、好まし
くは６．５〜７．５である。
しては、例えば、Takahashi らの方法（J.Bacteriol .,
156, 1130(1983)参照）あるいはエレクトロポレーショ
ンによる方法（H.Takagiら、Agric.Bio.Chem.,53, 3099
-3100(1989))などが挙げられる。培養に用いる培地に
は、炭素源、窒素源の他、無機塩類が必要に応じて含ま
れる。また、糖と無機塩類を主とする合成培地を用いて
培養してもよい。栄養要求性を示す菌株を用いる場合に
は、その成育に必要な栄養物質を培地に添加する。さら
に必要であれば、培地に抗生物質や消泡剤などを加えて
もよい。培地の初発pHは５．０〜９．０であり、好まし
くは６．５〜７．５である。
【００２０】培養温度は、通常１５℃〜４２℃、好まし
くは２４〜３７℃であり、培養時間は通常１６〜３６０
時間、好ましくは２４〜１４４時間である。培養終了
後、例えば遠心分離、ろ過などで菌体と上清を分離す
る。菌体内に産生されたｈＧＨは、当該技術分野におけ
る通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法
などにより菌体を破砕し、さらに必要ならば界面活性剤
を加えることにより抽出される。このようにして得られ
た培養上清あるいは菌体抽出液中に含まれるｈＧＨは、
常用の蛋白質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲルろ
過、イオン交換、逆層クロマトグラフィーなどの各種ク
ロマトグラフィーなどにより精製され、こうして目的と
する異種蛋白質を得ることができる。
くは２４〜３７℃であり、培養時間は通常１６〜３６０
時間、好ましくは２４〜１４４時間である。培養終了
後、例えば遠心分離、ろ過などで菌体と上清を分離す
る。菌体内に産生されたｈＧＨは、当該技術分野におけ
る通常の方法、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法
などにより菌体を破砕し、さらに必要ならば界面活性剤
を加えることにより抽出される。このようにして得られ
た培養上清あるいは菌体抽出液中に含まれるｈＧＨは、
常用の蛋白質精製法、例えば塩析、等電点沈澱、ゲルろ
過、イオン交換、逆層クロマトグラフィーなどの各種ク
ロマトグラフィーなどにより精製され、こうして目的と
する異種蛋白質を得ることができる。
【００２１】以上により、有用性が確認されるように、
本発明における新規な変異菌は、前述のとおり組換えＤ
ＮＡ技術により産生された異種蛋白質を効率よく菌体外
に分泌蓄積し、安定に維持可能であることから、遺伝子
組換えにおける宿主菌として極めて優れた物である。
本発明における新規な変異菌は、前述のとおり組換えＤ
ＮＡ技術により産生された異種蛋白質を効率よく菌体外
に分泌蓄積し、安定に維持可能であることから、遺伝子
組換えにおける宿主菌として極めて優れた物である。
【００２２】
【実施例】以下、本発明を参考例及び実施例によりさら
に具体的に説明するが、本発明をこれらのいずれかに限
定することを意図するものでない。例１（参考例） ：ヒト成長ホルモン遺伝子を含むプラス
ミドｐＮＵ２００−ＧＨの構築 池原ら（Ikehara ら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,595
6-5960 (1984) 参照）により公表されたヒト成長ホルモ
ンをコードするＤＮＡ（ＨｉｎｆＩ−ＳａｌＩ断片）を
プラスミドｐＧＨ−Ｌ９（Ikehara ら.,同上）より単離
した。
に具体的に説明するが、本発明をこれらのいずれかに限
定することを意図するものでない。例１（参考例） ：ヒト成長ホルモン遺伝子を含むプラス
ミドｐＮＵ２００−ＧＨの構築 池原ら（Ikehara ら.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,81,595
6-5960 (1984) 参照）により公表されたヒト成長ホルモ
ンをコードするＤＮＡ（ＨｉｎｆＩ−ＳａｌＩ断片）を
プラスミドｐＧＨ−Ｌ９（Ikehara ら.,同上）より単離
した。
【００２３】その断片にＭＷＰのシグナルペプチドとｈ
ＧＨをインフレームで結合するための合成リンカーをＴ
４ＤＮＡリガーゼで連結した後、制限酵素ＮｃｏＩとＳ
ａｌＩで処理し、５９６ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片
を得た。バチルス・ブレビス４７の主要膜蛋白質の一つ
ＭＷＰ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｗａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の
Ｃ末端領域を含むプラスミドｐＢＲ−ＡＮ２（特開平２
−２５７８７６号公報）から２７ｂｐ ＮｃｏＩ−Ｓａ
ｌＩ断片を除去し、これに前記の５９６ｂｐＮｃｏＩ−
ＳａｌＩ断片を挿入してプラスミドｐＢＲ−ＡＮ２−Ｇ
Ｈを得た。
ＧＨをインフレームで結合するための合成リンカーをＴ
４ＤＮＡリガーゼで連結した後、制限酵素ＮｃｏＩとＳ
ａｌＩで処理し、５９６ｂｐのＮｃｏＩ−ＳａｌＩ断片
を得た。バチルス・ブレビス４７の主要膜蛋白質の一つ
ＭＷＰ（Ｍｉｄｄｌｅ Ｗａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ）の
Ｃ末端領域を含むプラスミドｐＢＲ−ＡＮ２（特開平２
−２５７８７６号公報）から２７ｂｐ ＮｃｏＩ−Ｓａ
ｌＩ断片を除去し、これに前記の５９６ｂｐＮｃｏＩ−
ＳａｌＩ断片を挿入してプラスミドｐＢＲ−ＡＮ２−Ｇ
Ｈを得た。
【００２４】プラスミドｐＢＲ−ＡＮ２−ＧＨを制限酵
素ＡｐａＬＩ，ＨｉｎｄIII で処理して６５６ｂｐ Ａ
ｐａＬＩ−ＨｉｎｄIII 断片を単離した。一方、プラス
ミドｐＮＵ２００（鵜▲高▼重三、日本農芸化学会誌、
61、６６９−６７６（１９８７）参照）を制限酵素Ａｐ
ａＬＩ−ＨｉｎｄIII で切断し、その大きい断片と上記
６５６ｂｐ ＡｐａＬＩ，ＨｉｎｄIII 断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結させた反応液を用いてTakahashi らの
方法（J.Bacteriol., 156, 1130(1983) 参照）によって
バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４，
ＩＦＯ １４６９８）の形質転換を行った。得られたエ
リスロマイシン耐性の形質転換体からプラスミドを単離
し、これをｐＮＵ２００−ＧＨと命名した。
素ＡｐａＬＩ，ＨｉｎｄIII で処理して６５６ｂｐ Ａ
ｐａＬＩ−ＨｉｎｄIII 断片を単離した。一方、プラス
ミドｐＮＵ２００（鵜▲高▼重三、日本農芸化学会誌、
61、６６９−６７６（１９８７）参照）を制限酵素Ａｐ
ａＬＩ−ＨｉｎｄIII で切断し、その大きい断片と上記
６５６ｂｐ ＡｐａＬＩ，ＨｉｎｄIII 断片をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで連結させた反応液を用いてTakahashi らの
方法（J.Bacteriol., 156, 1130(1983) 参照）によって
バチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６６４，
ＩＦＯ １４６９８）の形質転換を行った。得られたエ
リスロマイシン耐性の形質転換体からプラスミドを単離
し、これをｐＮＵ２００−ＧＨと命名した。
【００２５】例２（実施例）．バチルス・ブレビス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）３１−ＯＫの創製 例１で得たプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨを、Takahash
i らの方法により親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１
（特開昭６３−５６２７７号公報、ＦＥＲＭ ＢＰ−１
０８７）に導入し、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐ
ＮＵ２００−ＧＨ）を得た。
ａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）３１−ＯＫの創製 例１で得たプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨを、Takahash
i らの方法により親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１
（特開昭６３−５６２７７号公報、ＦＥＲＭ ＢＰ−１
０８７）に導入し、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐ
ＮＵ２００−ＧＨ）を得た。
【００２６】その形質転換体をＴ２培地に希釈懸濁し、
Ｔ２プレートに塗抹した後、紫外線（２Ｊ／ｍ2 ）に暴
露した。３０℃で一晩培養し、得られたコロニーを５Ｙ
Ｃ培地に植菌し、３０℃で６日間培養した。３日目と６
日目の培養液を採取し、培養上清液中に含まれるｈＧＨ
量を酵素免疫測定法により測定した。この際に、３日目
から６日目にかけて培養上清中のｈＧＨ量が増加してい
る１株を選択分離した。
Ｔ２プレートに塗抹した後、紫外線（２Ｊ／ｍ2 ）に暴
露した。３０℃で一晩培養し、得られたコロニーを５Ｙ
Ｃ培地に植菌し、３０℃で６日間培養した。３日目と６
日目の培養液を採取し、培養上清液中に含まれるｈＧＨ
量を酵素免疫測定法により測定した。この際に、３日目
から６日目にかけて培養上清中のｈＧＨ量が増加してい
る１株を選択分離した。
【００２７】変異株と親株を比較すると、親株では培養
上清中のｈＧＨ量が３日目から６日目にかけて減少する
のに対して、得られた変異株は、３日目以降もｈＧＨ量
が増加するという顕著な違いを示した。変異株よりプラ
スミドを除去するために、変異株をエリスロマイシンを
含まないＴ２培地で繰り返し継代培養した後、エリスロ
マイシン感受性でかつｈＧＨを生産しない株が容易に得
られた。本菌株をバチルス・ブレビス３１−ＯＫと命名
した。
上清中のｈＧＨ量が３日目から６日目にかけて減少する
のに対して、得られた変異株は、３日目以降もｈＧＨ量
が増加するという顕著な違いを示した。変異株よりプラ
スミドを除去するために、変異株をエリスロマイシンを
含まないＴ２培地で繰り返し継代培養した後、エリスロ
マイシン感受性でかつｈＧＨを生産しない株が容易に得
られた。本菌株をバチルス・ブレビス３１−ＯＫと命名
した。
【００２８】バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５７３）の菌学的性質は、親菌株バチルス・
ブレビスＨＰＤ３１（特開昭６３−５６２７７７号公報
参照）と特定の異種蛋白質に対する作用が異なる点を除
きほぼ同様な性状を示した。以下に、その主要な性質を
示す。
ＢＰ−４５７３）の菌学的性質は、親菌株バチルス・
ブレビスＨＰＤ３１（特開昭６３−５６２７７７号公報
参照）と特定の異種蛋白質に対する作用が異なる点を除
きほぼ同様な性状を示した。以下に、その主要な性質を
示す。
【００２９】生理学的性質 硝酸塩の還元 − ＶＰテストアセトインの生成 − インドールの生成 − 硫化水素の生成 ＴＳＩ寒天培地 − 酢酸鉛寒天培地 ＋ クエン酸の利用 ＋ 無機窒素源の利用 硝酸塩 − アンモニウム塩 ＋
【００３０】 色素の生成（キング培地） − ウレアーゼ − オキシダーゼ ＋ アシルアミダーゼ − カタラーゼ ＋ Ｏ−Ｆテスト 分解せず ゼラチンの分解 − グルコースから酸の生成 − キシロース分解 − ラクトース分解 − マルトース分解 − アルギニン加水分解 − 生育できる ｐＨ ５．５〜８．５
【００３１】形態的性質 細胞の大きさ 液体培地；０．９〜１．２×
３．９〜５．８μｍ 寒天培地；０．９〜１．２×２．９〜４．２μｍ 細胞の形 桿菌 細胞の多形性の有無 無 運動性の有無 有
３．９〜５．８μｍ 寒天培地；０．９〜１．２×２．９〜４．２μｍ 細胞の形 桿菌 細胞の多形性の有無 無 運動性の有無 有
【００３２】例３（実施例）培養上清の蛋白質分解活性
の測定 変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫ、参考例としての
親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１及び比較例としての
枯草菌（ＩＦＯ３０４４株）をＴ2 培地中、３０℃、６
日間振盪培養した。培養液を１０，０００rpm 、１０分
間遠心分離し、得られた上清を活性測定用の試料とし
た。５ｇのアゾカゼイン（Sigma,Ａ２７６５）を、０．
１ＭのTris−ＨＣｌ（pH８．０）１リッターに溶かし、
基質溶液とした。
の測定 変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫ、参考例としての
親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１及び比較例としての
枯草菌（ＩＦＯ３０４４株）をＴ2 培地中、３０℃、６
日間振盪培養した。培養液を１０，０００rpm 、１０分
間遠心分離し、得られた上清を活性測定用の試料とし
た。５ｇのアゾカゼイン（Sigma,Ａ２７６５）を、０．
１ＭのTris−ＨＣｌ（pH８．０）１リッターに溶かし、
基質溶液とした。
【００３３】０．１mlの上記基質溶液にこれと等量の試
料を加え、３７℃で５時間反応させた後、０．２mlの１
０％トリクロロ酢酸溶液を加えて反応を止めた。そして
室温に２０分間静置した後、１５，０００rpm で１０分
間遠心分離して上清画分をとり、０．４mlの０．５Ｎ
ＮａＯＨを加え、４４０nmで吸光度を測定した。その結
果を表１に示す。
料を加え、３７℃で５時間反応させた後、０．２mlの１
０％トリクロロ酢酸溶液を加えて反応を止めた。そして
室温に２０分間静置した後、１５，０００rpm で１０分
間遠心分離して上清画分をとり、０．４mlの０．５Ｎ
ＮａＯＨを加え、４４０nmで吸光度を測定した。その結
果を表１に示す。
【００３４】
【表１】 表１において、分解活性は５時間の吸光度変化で表し
た。この際、５時間で吸光度を１０変化させる酵素活性
を１ユニットと定義した。
た。この際、５時間で吸光度を１０変化させる酵素活性
を１ユニットと定義した。
【００３５】例４（実施例）培養上清中の蛋白質分解酵
素の解析 例３において変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫ及び
親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１より得た前記培養上
清にゲルローディングバッファー〔５％ＳＤＳ、２０％
グリセロール、４０mM Tris−ＨＣｌ（pH６．７）〕を
等量加え、室温に３０分放置し、ゼラチン−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゼラチン−ＰＡＧＥ）に供し
た。
素の解析 例３において変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫ及び
親株バチルス・ブレビスＨＰＤ３１より得た前記培養上
清にゲルローディングバッファー〔５％ＳＤＳ、２０％
グリセロール、４０mM Tris−ＨＣｌ（pH６．７）〕を
等量加え、室温に３０分放置し、ゼラチン−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゼラチン−ＰＡＧＥ）に供し
た。
【００３６】ゼラチン−ＰＡＧＥは０．５％ゼラチン、
７．５％アクリルアミドの濃度で、E.Strydom らの方法
（Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 214-217 (198
6)) に従って行った。蛋白質分解酵素はゼラチンの分解
により生ずるクリアバンドにより検出した。その結果を
示す図１より、変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫで
は、培養上清に存在する主要な蛋白質分解酵素が欠失し
ていた。
７．５％アクリルアミドの濃度で、E.Strydom らの方法
（Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 214-217 (198
6)) に従って行った。蛋白質分解酵素はゼラチンの分解
により生ずるクリアバンドにより検出した。その結果を
示す図１より、変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫで
は、培養上清に存在する主要な蛋白質分解酵素が欠失し
ていた。
【００３７】例５（実施例） バチルス・ブレビス３１
−ＯＫによるヒト成長ホルモンの分泌生産 例１で得られたプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨをTakaha
shi の方法によりバチルス・ブレビス３１−ＯＫに導入
し、バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００−Ｇ
Ｈ）を得た。
−ＯＫによるヒト成長ホルモンの分泌生産 例１で得られたプラスミドｐＮＵ２００−ＧＨをTakaha
shi の方法によりバチルス・ブレビス３１−ＯＫに導入
し、バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００−Ｇ
Ｈ）を得た。
【００３８】ポリペプトン３％、酵母エキス０．２％、
グルコース３％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ 2 Ｏ ０．０１％，
ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０１％，ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ
2 Ｏ０．００１％，ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００１
％，ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．０００１％およびエリス
ロマイシン１０mg／Ｌ（pH７．２）よりなる培地に、バ
チルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）及
び対照としてバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐＮＵ２
００−ＧＨ）を３０℃で振盪培養し、培養上清中のｈＧ
Ｈを抗ヒト成長ホルモン抗体を用いた酵素免疫測定法に
より定量した。
グルコース３％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ 2 Ｏ ０．０１％，
ＣａＣｌ2 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０１％，ＭｎＳＯ4 ・４Ｈ
2 Ｏ０．００１％，ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．００１
％，ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ０．０００１％およびエリス
ロマイシン１０mg／Ｌ（pH７．２）よりなる培地に、バ
チルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）及
び対照としてバチルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐＮＵ２
００−ＧＨ）を３０℃で振盪培養し、培養上清中のｈＧ
Ｈを抗ヒト成長ホルモン抗体を用いた酵素免疫測定法に
より定量した。
【００３９】変異株バチルス・ブレビス３１−ＯＫ（ｐ
ＮＵ２００−ＧＨ）は、培養６日目には１６．５mg／Ｌ
のｈＧＨを培養上清中に生産していた。一方、親株バチ
ルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐＮＵ２００−ＧＨ）のｈ
ＧＨ量は０．７mg／Ｌであり、変異株は親株の約２５倍
のｈＧＨを生産した。
ＮＵ２００−ＧＨ）は、培養６日目には１６．５mg／Ｌ
のｈＧＨを培養上清中に生産していた。一方、親株バチ
ルス・ブレビスＨＰＤ３１（ｐＮＵ２００−ＧＨ）のｈ
ＧＨ量は０．７mg／Ｌであり、変異株は親株の約２５倍
のｈＧＨを生産した。
【００４０】例６（実施例）．バチルス・ブレビス３１
−ＯＫにより生産されたｈＧＨの性質 例５で得られた培養上清を、Laemmli の方法（Nature,
227,680(1970)参照）に準じてＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけた後、Ｂｕｒｎｅｔｔｅの方法
（Anal.Biochem., 112,195(1981)参照）に準じて抗ヒト
成長ホルモン抗体（生化学工業（株）製）を用いてウェ
スタンブロティングを行った。バチルス・ブレビス３１
−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）の生産するｈＧＨはヒト
脳下垂体より抽出精製した標準品（生化学工業（株）
製）と同じ分子量を示したが、親株の生産したｈＧＨ
は、分解を受け、低分子量化していた。
−ＯＫにより生産されたｈＧＨの性質 例５で得られた培養上清を、Laemmli の方法（Nature,
227,680(1970)参照）に準じてＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にかけた後、Ｂｕｒｎｅｔｔｅの方法
（Anal.Biochem., 112,195(1981)参照）に準じて抗ヒト
成長ホルモン抗体（生化学工業（株）製）を用いてウェ
スタンブロティングを行った。バチルス・ブレビス３１
−ＯＫ（ｐＮＵ２００−ＧＨ）の生産するｈＧＨはヒト
脳下垂体より抽出精製した標準品（生化学工業（株）
製）と同じ分子量を示したが、親株の生産したｈＧＨ
は、分解を受け、低分子量化していた。
【００４１】例７（実施例） バチルス・ブレビス３１
−ＯＫによるヒトインターロイキン２（ｈＩＬ２）の分
泌生産 ヒト インターロイキン２（ｈＩＬ２）遺伝子を有する
プラスミドｐＩＬ−５０Ａ（T.Taniguchi ら, Nature
302, 305-310 (1983)参照）を、制限酵素ＨｇｉＡＩと
ＤｒａＩで消化し、ｈＩＬ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を
得た。
−ＯＫによるヒトインターロイキン２（ｈＩＬ２）の分
泌生産 ヒト インターロイキン２（ｈＩＬ２）遺伝子を有する
プラスミドｐＩＬ−５０Ａ（T.Taniguchi ら, Nature
302, 305-310 (1983)参照）を、制限酵素ＨｇｉＡＩと
ＤｒａＩで消化し、ｈＩＬ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を
得た。
【００４２】一方、ＭＷＰシグナル配列の疎水領域にＬ
ｅｕ３個、正電荷領域にＡｒｇ２個を付加した改変シグ
ナル配列を有するプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮを制限
酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で消化した後、ＨｉｎｄII
I 切断部位を埋めて平滑化し、ｈＩＬ２遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とリガーゼで結合してｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ｈ
ＩＬ２を得た。
ｅｕ３個、正電荷領域にＡｒｇ２個を付加した改変シグ
ナル配列を有するプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮを制限
酵素ＰｓｔＩとＨｉｎｄIII で消化した後、ＨｉｎｄII
I 切断部位を埋めて平滑化し、ｈＩＬ２遺伝子を含むＤ
ＮＡ断片とリガーゼで結合してｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ｈ
ＩＬ２を得た。
【００４３】このプラスミドｐＮＵＲ２Ｌ４ＭＮ−ｈＩ
Ｌ２をバチルス・ブレビスＨＰＤ３１及びバチルス・ブ
レビス３１−ＯＫに導入して得られたそれぞれの形質転
換菌をＰＹ培地で３０℃にて３日間培養した。培養上清
のｈＩＬ２量は、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１の形質
転換菌では約２０mg／Ｌであったのに対し、バチルス・
ブレビス３１−ＯＫの形質転換菌では約８０mg／Ｌに生
産量が向上していた。
Ｌ２をバチルス・ブレビスＨＰＤ３１及びバチルス・ブ
レビス３１−ＯＫに導入して得られたそれぞれの形質転
換菌をＰＹ培地で３０℃にて３日間培養した。培養上清
のｈＩＬ２量は、バチルス・ブレビスＨＰＤ３１の形質
転換菌では約２０mg／Ｌであったのに対し、バチルス・
ブレビス３１−ＯＫの形質転換菌では約８０mg／Ｌに生
産量が向上していた。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、異種蛋白質の生産用変
異菌を用いて遺伝子組換えに有利に使用できる宿主菌が
提供される。本発明の変異菌は、特に、ヒト成長ホルモ
ンまたはインターロイキン２の生産に適する。例えば、
ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを含有する適当な
プラスミドで形質転換して得られる形質転換体は、異種
蛋白質の生産に優れていることが知られている宿主菌を
使用した場合に比し、有意に高い生産、蓄積性を示す。
異菌を用いて遺伝子組換えに有利に使用できる宿主菌が
提供される。本発明の変異菌は、特に、ヒト成長ホルモ
ンまたはインターロイキン２の生産に適する。例えば、
ヒト成長ホルモンをコードするＤＮＡを含有する適当な
プラスミドで形質転換して得られる形質転換体は、異種
蛋白質の生産に優れていることが知られている宿主菌を
使用した場合に比し、有意に高い生産、蓄積性を示す。
【図１】例４（実施例）で得られた培養上清中の蛋白質
分解酵素をゼラチン−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により解析した結果を示す図面である。
分解酵素をゼラチン−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により解析した結果を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:08） (72)発明者 太田 陽子 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 平井 正名 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 山田 幸生 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 鵜▲高▼ 重三 愛知県名古屋市名東区植園町１丁目24番地 の３
Claims (3)
- 【請求項１】 プロテアーゼ活性を実質的に示さない変
異バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉ
ｓ）。 - 【請求項２】 少なくともヒト成長ホルモン及びインタ
ーロイキン２に対してプロテアーゼ活性を実質的に示さ
ない請求項１に記載の変異バチルス・ブレビス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の変異バチルス
・ブレビスからなる遺伝子組換え用の宿主菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2435694A JP3739101B2 (ja) | 1993-02-22 | 1994-02-22 | 変異バチルス・ブレビス菌 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3208393 | 1993-02-22 | ||
| JP5-32083 | 1993-02-22 | ||
| JP2435694A JP3739101B2 (ja) | 1993-02-22 | 1994-02-22 | 変異バチルス・ブレビス菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06296485A true JPH06296485A (ja) | 1994-10-25 |
| JP3739101B2 JP3739101B2 (ja) | 2006-01-25 |
Family
ID=26361857
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2435694A Expired - Lifetime JP3739101B2 (ja) | 1993-02-22 | 1994-02-22 | 変異バチルス・ブレビス菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3739101B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005045005A1 (ja) | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 |
| WO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Kaneka Corporation | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| WO2010110288A1 (ja) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
| WO2011118699A1 (ja) | 2010-03-24 | 2011-09-29 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
| WO2012133349A1 (ja) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用タンパク質 |
| WO2012133342A1 (ja) | 2011-03-25 | 2012-10-04 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド |
| WO2014046278A1 (ja) | 2012-09-21 | 2014-03-27 | 株式会社カネカ | アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド |
-
1994
- 1994-02-22 JP JP2435694A patent/JP3739101B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7655452B1 (en) | 2003-11-11 | 2010-02-02 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | Brevibacillus choshinensis and process for prodcuing protein wtih use of the microbe as host |
| WO2005045005A1 (ja) | 2003-11-11 | 2005-05-19 | Higeta Shoyu Co., Ltd. | 新規ブレビバチルス・チョウシネンシス及び該微生物を宿主とするタンパク質の製造方法 |
| EP2251425A1 (en) | 2004-07-06 | 2010-11-17 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| JPWO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2008-04-24 | 株式会社カネカ | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| JP2010246569A (ja) * | 2004-07-06 | 2010-11-04 | Kaneka Corp | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| WO2006004067A1 (ja) * | 2004-07-06 | 2006-01-12 | Kaneka Corporation | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| US8597908B2 (en) | 2004-07-06 | 2013-12-03 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| JP2014064589A (ja) * | 2004-07-06 | 2014-04-17 | Kaneka Corp | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| US8889389B2 (en) | 2004-07-06 | 2014-11-18 | Kaneka Corporation | Process for producing protein A-like protein with use of Brevibacillus genus bacterium |
| JP2016063844A (ja) * | 2004-07-06 | 2016-04-28 | 株式会社カネカ | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 |
| WO2010110288A1 (ja) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド |
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