JPS6374485A - 分泌発現プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 技術分野 本発明は、新規な分泌発、現プラスミドに関する。

さらに詳細には、本発明は、シグナル配列を具備するプ
ラスミドであってそのプロモーター活性を抑制するとい
われる物質が存在しても該活性が抑制されないように変
異させた分泌発現プラスミドに関するものである。

先行技術 本発明者らの共同研究者らは、シグナル配列をコードす
る遺伝子に対応するＤＮＡ遺伝子（以下「シグナル遺伝
子」という。）と所望タンパクをコードする遺伝子に対
応するＤＮＡ遺伝子（以下「外来性遺伝子」という。）
とが直結可能なりＮＡ遺伝子を含むプラスミド（ｐＴＡ
５２９）を開発した（特開昭６０−３０６８７号公報参
照）。

そして、本発明者らは、このプラスミドまたはこれを改
良したプラスミド（例えばｐＴＡ１５２９等：特開昭６
１−３７０９９号公報参照）で形質転換された宿主菌（
形質転換体）の培養方法の検討を種々行ってきた（特願
昭５９−２７９５８６号、同５９−２７９５８７号、同
６〇−９５１８１号、同６０−１２１２４９号および同
６０−９５１８１号明細書参照。以下これらを「先願発
明」と総称する。）。これら先願発明に係る培養法は、
いずれも使用したプラスミドの特性を巧みに利用したも
のである。すなわち、プラスミドのプロモーター活性が
、このプラスミドを用いて形質転換された宿主（形質転
換体）を培養する培地中に含まれる少なくとも一つの成
分によって誘導されたり抑制されたりすることを利用す
るという培養法である。このようなプラスミドとしては
、前記ｐＴＡ５２９およびｐＴＡ１５２９がある。これ
らはいずれもアルカリ性ホスファターゼ由来のプロモー
ターを具備しているので、無機燐の存在量によりその活
性が誘導されたり抑制されたりする（Ｂｉｏｃｈｉｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、、３８．４６０（１９８０）　、Ｎａｔｕｒ
ｅ、旦３　、１５２９（１９５９）］。そして、これら
ププラストで形質転換された宿主菌を培養するに際して
は、プロモーター活性を誘導すべく無機燐欠乏条件下で
の培養に切り換える必要があった。そのため、培養法が
二段階となったり（特願昭５９−２７９５８６号および
同６０−１２１２４９号明細書参照）、一段階の培養で
あっても培地や培養条件に制限があった（特願昭５９−
２７９５８７号および同６０−９５１８１号明細書参照
）。また、上記プラスミドに限らず、他のプロモーター
（例えばトリプトファン由来のもの、ラクトースオペロ
ン由来のもの等）を具備するプラスミドを用いて、所望
タンパクを効率よく産生させようとするためには、上記
と同様プロモーター活性の誘導を行う必要がある。そし
て、そのような誘導を行うには、例えば、トリプトファ
ン由来のプロモーターの場合はインドールアクリル酸（
ＩＡＡ）やインドールプロピオン酸等のトリプトファン
アナログが必要である〔底置「遺伝子の分子生物学」　
（下）第３版ｐ４３３〜４５７　■化学同人刊〕。また
、プロモーターがラクトースオペロン由来の場合は、Ｉ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）等
の物質が必要である。

しかし、これらの物質は一般に高価であり、さらに宿主
菌の増殖阻害作用を有する場合もあることから、これら
を工業的生産に応用するに際してその生産コスト、生産
効率等に問題点を有していた。

〔発明の概要〕

要旨 本発明は、上記問題点に解決を与えることを目的とし、
突然変異誘起剤を用いて変異させたプラスミドであって
、たとえ変異させる前のプラスミドにおけるプロモータ
ー活性を抑制する物質（例えば無機燐）が存在する場合
であっても抑制を受けないものを取得し、このプラスミ
ドを提供することによって上記目的を達成しようとする
ものである。

従って、本発明による分泌発現プラスミドは、アルカリ
性ホスファターゼ由来のプロモーターに対応するＤＮＡ
遺伝子およびシグナル配列に対応するＤＮＡ遺伝子を具
備しかつ予定した宿主細胞内で増殖可能なプラスミドで
あって、このプラスミドのプロモーター活性を抑制する
量の無機燐が存在する条件下でもその活性に抑制がかか
らないように変異されたもの、である。

然−里 本発明のプラスミドは、上記問題点を全て解決するもの
である。すなわち、本発明によるプラスミドは、培地中
のプロモーター活性を抑制する物質（例えば無機燐）の
量によりそのプロモーター活性が影響を受けず、常に一
定のプロモーター活性を保持している。従って、培養の
開始後、菌体の増殖とともに、維持されているプロモー
ター活性によって所望タンパクないしペプチド（以下「
所望タンパク等」という）の産生も行なわれることから
、短時間で所望物質を得ることができる。

また、培地中に無機燐を含有する培地をも使用すること
ができるので、培地への適用範囲も広い。

本発明によるプラスミドはプロモーターのＤＮＡ遺伝子
を持つと共に所与の宿主菌中で増殖しうるものであると
ころから、そこへ外来性遺伝子を組み込んでなるキメラ
プスミドはそれを適当な宿主に導入すれば外来性遺伝子
由来のタンパク等を産生させることができるのであるが
、このプラスミドはまたシグナル配列をも組み込んでな
るものであるところから、産生タンパク等はこのシグナ
ル配列のおかげで宿主細胞外に分泌されることになって
、下記の利点が得られる。

（イ）　産生物質の精製が簡単である。従来は、宿主菌
の生育を行って、適当な時期に宿主全体をつぶして菌が
本来持つ雑多な物質の中から目的とする有用物質を抽出
精製していたため、多大な労力が必要であるうえ、物質
によっては精製困難なことがあった。これに対して本発
明のプラスミドを用いれば、産生されるタンパク等は菌
体外に分泌され、菌の生育培地はその構成成分が判って
いるのであるから、培地からの目的物質分泌の確認、回
収が容易とするであろう。

（ロ）　産生物質がペプチダーゼによる分解から保護さ
れる。すなわち、菌体内には多くのペプチダーゼ（プロ
テアーゼ）が存在するので不必要な蛋白は速やかに水解
されてゆくが、本発明によって目的の有用タンパク等を
菌体内に留めることなく直ちに菌体外へ分泌させれば、
この目的タンパク等は上記の氷解酵素から保護されるこ
とになるであろう。

（ハ）　如何なる外来性タンパク等でも発現可能である
。すなわち、従来の雑種タンパク法では、目的とするタ
ンパク等を純粋に得るためにたとえばメチオニンに特異
的な臭化シアン処理（Ｓｃｉｅｎｃｅ　％　　１９８．
１０５１３（１９７７）’］によって余分なタンパクを
明断したり、リジンやアルギニンに特異的なトリプシン
消化（Ｎａｔｕｒｅ、　　２８５．４５Ｂ（＋９８０）
］を行う場合には、目的とするタンパクのアミノ酸組成
中にこれらのアミノ酸が含まれているときはそこでも切
断が生じるため完全な形で所望のタンパク等を得ること
ができず、一方、直接発現法［Ｎａｔｕｒｅ、　　２８
１．５４４（１９７９）　：ｌによってタンパク等を産
生させる場合には、遺伝子Ｎ末端には開始コドン（メチ
オニン）が必要であって産生タンパク等もＮ末端にメチ
オニンが付いたものとして得られるものもあり（特開昭
５６−６８３９９号公報参照）、このような末端のメチ
オニンは臭化シアン処理により分解除去することが技術
的に難しいので、結局産生させたタンパク等は天然のも
のとは異質のものとなる。これに対して、本発明による
プラスミドに所望タンパク等をコードする遺伝子を組込
んで組換ＤＮＡとし、これを用いて宿主の形質転換を行
って形質転換体を得てこれを培養すると、いったんシグ
ナル・ペプチドとの融合タンパクとして産生されたタン
パク等は宿主菌内のシグナル−ペプチダーゼによって特
異的にシグナル・ペプチド部分が切断されて、所望組成
の成熟タンパクとなって宿主菌細胞外へ分泌されること
になる。

【発明の詳細な説明〕

プラスミド 本発明によるプラスミドは、先ず、アルカリ性ホスファ
ターゼ由来のプロモーターに対応するＤＮＡ遺伝子およ
びシグナル配列に対応するＤＮＡ遺伝子を具備しかつ予
定した宿主細胞内で増殖可能なプラスミド、である。

そして、本発明によるプラスミドは、上記のようなプラ
スミド、すなわち分泌発現用プラスミド、であって、無
機燐存在ドであってもプロモーター活性が抑制されない
ように変異させたものである。

本発明によるプラスミドは分泌発現プラスミドであって
、外来遺伝子を組み込んでそれ（すなわちキメラプラス
ミド）を適当な宿主細胞（たとえば大腸菌または酵母）
に導入して該外来遺伝子由来のタンパク等を産生させる
訳であるが、このような利用の仕方からいって、本発明
の分泌発現プラスミドの好ましい一実施態様は、シグナ
ル遺伝子と外来性遺伝子とが直結しうるように仕込まれ
たものである。

本発明による分泌発現プラスミドは、前記または上記の
属性を持つプラスミド、すなわちアルカリ性ホスファタ
ーゼ由来のプロモーターに対応するＤＮＡ遺伝子および
シグナル配列に対応するＤＮＡ遺伝子を具備しかつ予定
した宿主細胞で増殖可能であるもの（好ましくはシグナ
ル配列に対応するＤＮＡ遺伝子と所望の外来性タンパク
ないしペプチドをコードするＤＮＡ遺伝子とが直結しう
るように仕込まれたもの）（以下、原プラスミドという
）、を変異原処理に付すことによって得ることが典型的
であるところ（詳細後記）、このような処理によって生
じる上記の変異がプラスミドの塩基配列のレベルにおい
てどのような内容のものであるかは現在のところ不明で
あり、またこの変異原処理によって原プラスミドも前記
諸性質は保存されていてもその塩基配列のレベルでは変
化が生じているかも知れないが、現在の技術水準におい
て本発明を特定するに当ってこれらの不明点を明確にす
る必要はないうえその実益もない。従って、本発明によ
るプラスミドは、前記した原プラスミドの属性が保存さ
れていると共に変異による前記の性質を獲得したところ
の分泌発現プラスミドとして定義することができる。な
お、原プラスミド（および本発明プラスミド）について
の「プロモーターに対応するＤＮＡ遺伝子」および「シ
グナル配列に対応するＤＮＡ遺伝子」というときの「対
応する」ということは、塩基配列が全く同一である場合
の外に、遺伝情報」−等価のその改変体を包含するもの
である。

上記したところから、本発明による分泌発現プラスミド
は原プラスミドによって特定ないし特定することが一般
に可能であり、また便利なことでもある。従って、たと
えば、本発明分泌発現プラスミドの原プラスミドのうち
シグナル遺伝子と外来性遺伝子との直結に関して格別の
配慮をしていないものの具体例としてはｐＹＫ２８３　
（特開昭６０−３０６８７号公報参照）を挙げることが
でき、またこれら両遺伝子の直結に関して配慮した本発
明分泌発現プラスミドの原プラスミドの具体例として、
たとえば、ｐＴＡ５２９　（特開昭６０−３０６８７号
公報参照）　、ｐＴＡ１５２９　（特開昭６１−１４９
０８７号公報参照）、ｐＴＡ１５２９−Ｅｃｏ　（特開
昭６１−１４９０８７号公報参照）　、ｐＴＡ２５３２
　（特開昭６］−１５２２９７号公報参照）、等が挙げ
られる。これら後者のプラスミドは前者のｐＹＫ２８Ｂ
から上記関連公報記載の方法に従って容易に作成するこ
とができ、一方ｐＹＫ２８３はＥ、ｃｏｌｉｋ１２ｃ６
００　（Ｔ）ＹＫ２８３）として微工研条寄第５５６号
として寄託されている。

プラスミドの作製 本発明による分泌発現プラスミドは、前記のような原プ
ラスミドを変異原処理に付すことによって作製すること
ができる。

変異原処理は、原プラスミドを導入した菌体の調製ない
し用意、この菌体の変異原処理、および変異株の選択な
らびに、必要な場合に、選択された変異株からの変異プ
ラスミドの回収、からなることがふつうである。

このような内容の変異処理そのものは公知であって、た
とえば、底置「微生物学実験法」　（講談社１９７９年
刊）第２８９−２９４頁、その他を参照することができ
る。具体的には、たとえば、変異原として紫外線、エチ
ルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ′　−二トロー
Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、亜硝酸等で原プラ
スミド含有菌株を処理し、処理菌株を変異プラスミド含
有菌株のみが増殖しうるような培地で培養するが、ある
いは無機燐を含有しかつ変異プラスミド含有菌株のコロ
ニーが特定の色を呈するような培地（たとえば無機燐添
加ＥＭＢプレート）で培養することによって、変異プラ
スミド含有菌株を回収し、目的変異プラスミドをそれを
含む菌体としてではなくてプラスミドそのものとして欲
しいときは、さらに回収菌体から目的プラスミドを抽出
する。

なお、本発明プラスミドの好ましい実施態様がシグナル
遺伝子と外来性遺伝子とが直結しつるように仕込まれた
ものであることは前記したところであるが、そのような
プラスミドは本発明者らは共同研究者の開発した方法（
特開昭６０−３０６８７号公報参照）によって有利に調
製することができる。その方法は、シグナル配列の作用
による外来性遺伝子由来タンパクの細胞外分泌を行わせ
るべく、シグナル遺伝子にそこへの外来性遺伝子の組込
みを用意にするための制限酵素認識／切断部位を創出す
るという点に特徴を有するものであり、この部位を創出
するに当ってＤＮＡ塩基対からなるコドンには縮重があ
るということを巧みに利用したものである。

創出された制限酵素認識／切断部位を該制限酵素で切断
すれば、その切断部位がシグナル遺伝子Ｄ’ＮＡの下流
側末端に接して存在する場合は、該制限酵素切断端と相
補性の端部を上流側に形成させた外来性遺伝子を用意し
てこれを上記切断端においてシグナル遺伝子と結合させ
ることによって、シグナル遺伝子の下流側に外来性遺伝
子を直結させることができる。シグナル遺伝子の切断部
位が該遺伝子の下流側末端より上流側に存在する場合は
、該遺伝子の該切断部位より下流側の部分を合成して外
来性遺伝子の上流側に結合した断片を用意して上記と同
じに結合を行えば、一旦切断されたシグナル遺伝子がＤ
ＮＡの両鏡について復元されると共にその下流側に外来
性遺伝子が直結された構造が実現される。

実験例 ］、　原プラスミドの調製 ｐ　Ｔ　Ｆ　６７−２　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ’　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　９７、＋４３３＜１９１１５
））　　（第１図Ａ）をＥｃｏＲＩおよび５ｓｔｌで消
化して得られた断片（１６００ｂｐ断片）およびｐＴＦ
６７−２を５ｓｔＩおよびＳｍａｌで消化して得られた
断片（４５３ｏ　ｂ　ｐ断片）と、ｐＹＫ２８３　（Ｅ
、ｃｏ　１　ｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＹＫ２８３）と
して微工研に寄託。

微工研条寄第５５６号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−５５６）］
　　（第１図Ｂ）をＴｈａＩおよびＥｃｏＲＩ処理して
得られた断片（２１０ｂｐ断片）とを７４ＤＮＡリガー
ゼで処理したのち、ｐＹＫ２８３−Ｌａｃ　［Ｅ、ｃｏ
ｌｔ　　ＸＡ３５（ｐＹＫ２８３−　Ｌａｃ）として微
工研ニ寄託。

微工研菌寄第　８７８０号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８７８０
））（第１図Ｃ）を得た。

なお、第１図中Ａの塩基配列中の５ＴＯＰの下の★印は
ストップコドンを示し、ＳＤの下の★はシャインーダル
ガーノ（Ｓ、　Ｄ、　）配列を示す。

また、β−ｇａｌはβ−ガラクトシダーゼを示す。

２、　変異処理 Ｅ　　ｃｏｌｔ　　ＸＡ３５（ｐＹＫ２８３−Ｌａｃ）
を、坂ロコルベン中アンピシリン２０γを添加したＬ−
Ｂ培地１００ｍ１で一夜振盪培養した。ついで、ここで
得られた菌体１０８個を、 Ｋ２ＨＰｏ４７ｇ／リットル、Ｋ　Ｈ２０Ｐ　４２　ｇ
／リットルを添加したＥＭＢ寒天プレートに塗布した。

ついで、１．ｍｇ／ｍｌのＮＴＧ水溶液に浸した濾紙（
約１ｃｍＸ１ｃｍ）をプレートの中心に置き、約２４時
間にわたって３７℃で培養を行った。上記と同様にして
５０枚のプレートを作成し、同様に培養を行つた。そし
て、プレート上に出現してきた黒色を呈するコロニー２
個のうち、１個につ□　　　いてプラスミドの調製を常
法に従って行った。このプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　　
ＸＡ３５に導入し、生成トランスフォーマントを無機燐
（Ｐｉ）著量を含有するＥＭＢプレート上でのコロニー
の形成を確認した。このプレート上でβ−ガラクトシダ
ーゼ（β−ｇａ　１）活性のあるものは黒いコロニ一を
形成する。従ってＰｉが多く存在するプレート上で黒い
コロニーを形成するものはアルカリ性ホスファターゼ由
来プロモーターが、Ｐｉが著量存在しても、その活性の
抑制を受けることなく働くように変異されたものである
と考えることができる。

なお、宿主Ｅ、　　　ｃｏｌｔ　　ＸＡ３５は、１ａｃ
Ｚが欠失していてβ−ｇａｌを産生することができない
。しかし、宿主も共に変異処理を受けているから、宿主
の方が変異してβ−ｇａｌを産生するようになっている
とも考えられる。

そこで、」二記のようにして得られた変異処理菌株から
変異していると思われるプラスミドを抽出し、これを変
異処理に付していないＥ、ｃｏｌｔＸＡ３５へ導入し、
生成トランスフォーマントについてβ−ｇａｌ産生能を
調べることによって、変性処理菌株についてみられたβ
−ｇａｌ活性がプラスミドみの変異によって生じている
ことを確認した。

【図面の簡単な説明】

図は、プラスミドりＹＫ２８３−Ｌａｃ構築のフローチ
ャートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターに対
   応するＤＮＡ遺伝子およびシグナル配列に対応するＤＮ
   Ａ遺伝子を具備しかつ予定した宿主細胞内で増殖可能な
   プラスミドであって、このプラスミドのプロモーター活
   性を抑制する量の無機燐が存在する条件下でもその活性
   に抑制がかからないように変異された分泌発現プラスミ
   ド。 ２、シグナル配列に対応するＤＮＡ遺伝子と所望の外来
   性タンパクないしペプチドをコードするＤＮＡ遺伝子と
   が直結し得るように仕組れた、特許請求の範囲第１項記
   載の分泌発現プラスミド。