JP2000256393A - タンパク質の活性化方法及び該装置 - Google Patents
タンパク質の活性化方法及び該装置Info
- Publication number
- JP2000256393A JP2000256393A JP11055715A JP5571599A JP2000256393A JP 2000256393 A JP2000256393 A JP 2000256393A JP 11055715 A JP11055715 A JP 11055715A JP 5571599 A JP5571599 A JP 5571599A JP 2000256393 A JP2000256393 A JP 2000256393A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- cells
- produced
- biologically
- inactive state
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 生物学的に不活性な状態で生産されたタ
ンパク質（非天然型タンパク質）を、生物の培養細胞と
接触させることにより、生物学的に活性のあるタンパク
質（天然型タンパク質）に変換させることを特徴とする
タンパク質の活性化方法。 【効果】 非天然型タンパク質を活性を有する天然型タ
ンパク質に効率的に変換することができるので、例えば
形質転換体培養物を活性化処理することにより、目的と
する天然型タンパク質の収量を更に高めることができ
る。
ンパク質（非天然型タンパク質）を、生物の培養細胞と
接触させることにより、生物学的に活性のあるタンパク
質（天然型タンパク質）に変換させることを特徴とする
タンパク質の活性化方法。 【効果】 非天然型タンパク質を活性を有する天然型タ
ンパク質に効率的に変換することができるので、例えば
形質転換体培養物を活性化処理することにより、目的と
する天然型タンパク質の収量を更に高めることができ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、正常な生物活性を
有する天然型（native）タンパク質が、その立体構造が
生物学的に天然型とは異なった高次構造となっているた
め、あるいはその他の理由により生物学的に不活性な非
天然型（non-native）の状態になっているとき、この生
物学的に不活性な状態で生産されたタンパク質を活性を
有する天然型（native）タンパク質に変換する方法に関
するものである。
有する天然型（native）タンパク質が、その立体構造が
生物学的に天然型とは異なった高次構造となっているた
め、あるいはその他の理由により生物学的に不活性な非
天然型（non-native）の状態になっているとき、この生
物学的に不活性な状態で生産されたタンパク質を活性を
有する天然型（native）タンパク質に変換する方法に関
するものである。
【０００２】本発明は、例えば正常な立体構造をとって
いれば生物活性を有しているタンパク質が、何等かの理
由により生物学的に不活性な状態になっていたものを生
物学的に活性のあるタンパク質に変換する方法及び該装
置に関するものである。更に詳細には、例えば、遺伝子
工学的手法に基づいて、形質転換微生物で生産されたタ
ンパク質の場合、天然型タンパク質とその立体構造が異
なって生産されたことによって生物学的に不活性な状態
になっていたタンパク質を活性化する方法に関するもの
である。
いれば生物活性を有しているタンパク質が、何等かの理
由により生物学的に不活性な状態になっていたものを生
物学的に活性のあるタンパク質に変換する方法及び該装
置に関するものである。更に詳細には、例えば、遺伝子
工学的手法に基づいて、形質転換微生物で生産されたタ
ンパク質の場合、天然型タンパク質とその立体構造が異
なって生産されたことによって生物学的に不活性な状態
になっていたタンパク質を活性化する方法に関するもの
である。
【０００３】
【従来の技術】生物由来の酵素、サイトカインの様な生
物活性を有するペプチド及びタンパク質は遺伝子工学的
手法を適用することにより微生物、動植物の培養細胞を
用いて大量に製造することが可能となった。しかし、細
菌等を宿主として用いて発現された異種タンパク質は、
しばしば宿主細胞内で変性し、沈殿物として生物学的に
不活性な状態で存在することが知られている。また、細
胞外に分泌生産されたとしても同様に生物学的に不活性
な状態にあるペプチドやタンパク質の存在も知られてい
る。これは、タンパク質の一次構造が天然型の正しい構
造をとってはいるが、その立体構造が生物学的に正しく
構築されていない為、生物活性を有する構造になってい
ないことが原因のひとつと考えられている。
物活性を有するペプチド及びタンパク質は遺伝子工学的
手法を適用することにより微生物、動植物の培養細胞を
用いて大量に製造することが可能となった。しかし、細
菌等を宿主として用いて発現された異種タンパク質は、
しばしば宿主細胞内で変性し、沈殿物として生物学的に
不活性な状態で存在することが知られている。また、細
胞外に分泌生産されたとしても同様に生物学的に不活性
な状態にあるペプチドやタンパク質の存在も知られてい
る。これは、タンパク質の一次構造が天然型の正しい構
造をとってはいるが、その立体構造が生物学的に正しく
構築されていない為、生物活性を有する構造になってい
ないことが原因のひとつと考えられている。
【０００４】また、化学合成されたポリペプチドや細胞
抽出液中（Cell free系）で生合成されたタンパク質も
しばしば正しい立体構造をとることが出来ず、例えば、
ジスルフィド結合を欠く比較的折り畳みの少ない不活性
な構造をとっていることが知られている。
抽出液中（Cell free系）で生合成されたタンパク質も
しばしば正しい立体構造をとることが出来ず、例えば、
ジスルフィド結合を欠く比較的折り畳みの少ない不活性
な構造をとっていることが知られている。
【０００５】ジスルフィド結合が不完全なことが原因で
正しい立体構造がとれず、生物学的に不活性な状態のタ
ンパク質の活性を回復させる方法として、特開昭５９−
１６１３２１号公報には、沈殿した不活性なタンパク質
を強力な変性剤を用いて可溶化し、この可溶化液を希釈
し、あるいは弱い変性溶液と置換することにより活性型
とし、生物学的に活性のあるタンパク質に換え回収する
方法が開示されている。しかしながら、この方法は、タ
ンパク質溶液の容量の著しい増加をもたらすこと、ま
た、活性化するために長時間を要する等の欠点を有して
いる。また、この方法は種々のタンパク質を活性化する
上で共通する一般原理を導くことがむつかしく、対象と
するタンパク質毎に活性化の条件を試行錯誤の上見出す
ことが必要で、多くの努力を払わなければならないのが
現実であって、充分に満足できる方法は未だ開発されて
いない。
正しい立体構造がとれず、生物学的に不活性な状態のタ
ンパク質の活性を回復させる方法として、特開昭５９−
１６１３２１号公報には、沈殿した不活性なタンパク質
を強力な変性剤を用いて可溶化し、この可溶化液を希釈
し、あるいは弱い変性溶液と置換することにより活性型
とし、生物学的に活性のあるタンパク質に換え回収する
方法が開示されている。しかしながら、この方法は、タ
ンパク質溶液の容量の著しい増加をもたらすこと、ま
た、活性化するために長時間を要する等の欠点を有して
いる。また、この方法は種々のタンパク質を活性化する
上で共通する一般原理を導くことがむつかしく、対象と
するタンパク質毎に活性化の条件を試行錯誤の上見出す
ことが必要で、多くの努力を払わなければならないのが
現実であって、充分に満足できる方法は未だ開発されて
いない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】タンパク質の生産にお
いて、その生産収量を上げるために、例えば組換えＤＮ
Ａ技術においては、シグナルペプチドの改変等遺伝子の
改良や形質転換体の培養方法の改良等によって目的タン
パク質の生産量を高める方策が従来より行われている。
これに対して本発明者らは、このようにいわば直接的に
タンパク質の収量を上げるのではなく、生産され培養物
中に混在する非活性型のタンパク質を活性型に変換する
ことにより目的タンパク質の収量を上げるいわば間接的
な方法に改めて着目したものであって、本発明の目的
は、活性のある立体構造がとれていないあるいはその他
すべての理由によって生物学的に活性を持たない（不活
性化された）タンパク質を活性化する方法であって、提
案されあるいは実施されてきた方法と比べると極めて容
易にかつ短時間で生物学的に活性のあるタンパク質に変
換することが出来るタンパク質の活性化方法および該装
置を提供することである。
いて、その生産収量を上げるために、例えば組換えＤＮ
Ａ技術においては、シグナルペプチドの改変等遺伝子の
改良や形質転換体の培養方法の改良等によって目的タン
パク質の生産量を高める方策が従来より行われている。
これに対して本発明者らは、このようにいわば直接的に
タンパク質の収量を上げるのではなく、生産され培養物
中に混在する非活性型のタンパク質を活性型に変換する
ことにより目的タンパク質の収量を上げるいわば間接的
な方法に改めて着目したものであって、本発明の目的
は、活性のある立体構造がとれていないあるいはその他
すべての理由によって生物学的に活性を持たない（不活
性化された）タンパク質を活性化する方法であって、提
案されあるいは実施されてきた方法と比べると極めて容
易にかつ短時間で生物学的に活性のあるタンパク質に変
換することが出来るタンパク質の活性化方法および該装
置を提供することである。
【０００７】また、本発明は生物学的に不活性な状態で
生産したタンパク質が例えばジスルフィド結合のかけ違
いで起こる場合において、生物学的に活性のあるタンパ
ク質と不活性な状態で生産したタンパク質を含む溶液か
ら、生物学的に不活性な状態で生産したタンパク質を特
異的に凝集、沈殿させ回収することを特徴とする該タン
パク質の分別、分取方法を提供するものである。もちろ
ん、このようにして分別、分取した不活性タンパク質
も、上記した活性化方法により活性化することができ
る。
生産したタンパク質が例えばジスルフィド結合のかけ違
いで起こる場合において、生物学的に活性のあるタンパ
ク質と不活性な状態で生産したタンパク質を含む溶液か
ら、生物学的に不活性な状態で生産したタンパク質を特
異的に凝集、沈殿させ回収することを特徴とする該タン
パク質の分別、分取方法を提供するものである。もちろ
ん、このようにして分別、分取した不活性タンパク質
も、上記した活性化方法により活性化することができ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するためになされたものであって、本発明者らは、鋭
意研究の結果、正常な立体構造をとれていないがために
生物学的な活性を有していないタンパク質（多量体ＥＧ
Ｆ）をブレビバチルス属細菌の培養細胞の懸濁液中でイ
ンキュベートしたところ、立体構造が正常化して生物活
性が回復して活性型（native）ＥＧＦに変換されること
をはじめて見出した。そして更に検討の結果、遂に完成
されたものである。
成するためになされたものであって、本発明者らは、鋭
意研究の結果、正常な立体構造をとれていないがために
生物学的な活性を有していないタンパク質（多量体ＥＧ
Ｆ）をブレビバチルス属細菌の培養細胞の懸濁液中でイ
ンキュベートしたところ、立体構造が正常化して生物活
性が回復して活性型（native）ＥＧＦに変換されること
をはじめて見出した。そして更に検討の結果、遂に完成
されたものである。
【０００９】すなわち本発明は、生物学的に不活性な状
態で生産されたタンパク質を、生物の培養細胞と接触さ
せることにより、生物学的に活性のあるタンパク質に変
換させることを特徴とするタンパク質の活性化方法に関
するものであって、立体構造が生物学的に正しくないと
いう理由に限らずその他すべての理由によりともかくそ
の詳細なメカニズムは問わず、生物学的な活性を有して
いない非天然型(non-native)タンパク質をすべて活性化
して、細胞との接触という極めて簡便な操作により天然
型(native)タンパク質に変換するきわめて効率的、工業
的な方法を提供するものである。以下、本発明について
詳述する。
態で生産されたタンパク質を、生物の培養細胞と接触さ
せることにより、生物学的に活性のあるタンパク質に変
換させることを特徴とするタンパク質の活性化方法に関
するものであって、立体構造が生物学的に正しくないと
いう理由に限らずその他すべての理由によりともかくそ
の詳細なメカニズムは問わず、生物学的な活性を有して
いない非天然型(non-native)タンパク質をすべて活性化
して、細胞との接触という極めて簡便な操作により天然
型(native)タンパク質に変換するきわめて効率的、工業
的な方法を提供するものである。以下、本発明について
詳述する。
【００１０】（１）本発明に用いられる生物の培養細胞
は、動物細胞ではヒト腎臓癌組織由来のヒト株化細胞、
マウスミエローマ細胞、各種ハイブリドーマ細胞等が使
用できる。植物細胞では、タバコ細胞、イネ培養細胞等
が使用できる。微生物の細胞では、原核生物細胞を有す
る大腸菌属細菌、バチルス属細菌、ブレビバチルス属
（Brevibacillus）細菌等が使用出来、また、真核細胞
を有する、サッカロミセス属（Saccharomyces属）酵
母、ピチア属（Pichia属）酵母、アスペルギルス属（As
pergillus属）の糸状菌等が利用出来る。
は、動物細胞ではヒト腎臓癌組織由来のヒト株化細胞、
マウスミエローマ細胞、各種ハイブリドーマ細胞等が使
用できる。植物細胞では、タバコ細胞、イネ培養細胞等
が使用できる。微生物の細胞では、原核生物細胞を有す
る大腸菌属細菌、バチルス属細菌、ブレビバチルス属
（Brevibacillus）細菌等が使用出来、また、真核細胞
を有する、サッカロミセス属（Saccharomyces属）酵
母、ピチア属（Pichia属）酵母、アスペルギルス属（As
pergillus属）の糸状菌等が利用出来る。
【００１１】以上のような培養細胞が適宜使用出来る
が、特に、工業的に実施するためには、大量に培養可能
な細胞であることが好ましく、例えば、好気的条件下で
の培養条件が好ましい、糸状菌、酵母、細菌の細胞がよ
り好ましい。特に、工業的な大量培養法が確立している
大腸菌属、Bacillus属、Brevibacillus属、酵母類がよ
り好ましく適用できる。Brevibacillus属の中でも培養
液中にタンパク質分解酵素を生産しないBrevibacillus
choshinensis HPD31（なお、この菌株はバチルス・ブレ
ビスＨ１０２（Bacillus brevis H102）ＦＥＲＭ ＢＰ
−１０８７として寄託を継続中である。また、この菌株
はバチルス・ブレビスHPD31（Bacillus brevis HPD31）
と同一菌株である。インターナショナル ジャーナル
オブ システマティック バクテリオロジー（Internat
ional Journal of Systematic Bacteriology）、第４６
巻、第９３９〜９４６頁（１９９６）において分類学的
位置の変更があった。）の菌体を使用することにより生
物学的に活性を有しないタンパク質が変換され、正常な
立体構造を有する活性化されたタンパク質となり、反応
中に分解を受けることなく蓄積するため非常に効率よく
本発明方法を実施出来る。更に、培地中にタンパク質分
解酵素が存在しない為、培養物をそのまま、または、遠
心分離等によって集めた菌体をそのまま利用しても、被
活性化タンパク質が分解を受けることに配慮する必要が
ない等非常に有利に使用可能である。
が、特に、工業的に実施するためには、大量に培養可能
な細胞であることが好ましく、例えば、好気的条件下で
の培養条件が好ましい、糸状菌、酵母、細菌の細胞がよ
り好ましい。特に、工業的な大量培養法が確立している
大腸菌属、Bacillus属、Brevibacillus属、酵母類がよ
り好ましく適用できる。Brevibacillus属の中でも培養
液中にタンパク質分解酵素を生産しないBrevibacillus
choshinensis HPD31（なお、この菌株はバチルス・ブレ
ビスＨ１０２（Bacillus brevis H102）ＦＥＲＭ ＢＰ
−１０８７として寄託を継続中である。また、この菌株
はバチルス・ブレビスHPD31（Bacillus brevis HPD31）
と同一菌株である。インターナショナル ジャーナル
オブ システマティック バクテリオロジー（Internat
ional Journal of Systematic Bacteriology）、第４６
巻、第９３９〜９４６頁（１９９６）において分類学的
位置の変更があった。）の菌体を使用することにより生
物学的に活性を有しないタンパク質が変換され、正常な
立体構造を有する活性化されたタンパク質となり、反応
中に分解を受けることなく蓄積するため非常に効率よく
本発明方法を実施出来る。更に、培地中にタンパク質分
解酵素が存在しない為、培養物をそのまま、または、遠
心分離等によって集めた菌体をそのまま利用しても、被
活性化タンパク質が分解を受けることに配慮する必要が
ない等非常に有利に使用可能である。
【００１２】（２）培養方法は、細胞の属、種によって
異なっているが、一般的な生物の培養法によって培養
し、増殖する培地であれば如何なるものでもよい。例え
ば、液体振とう培養法、寒天平板培養法、固体培養法、
通気攪拌培養法等で増殖させた培養細胞等何れの方法に
よって収獲された培養細胞でも利用できる。培養後の細
胞は、細胞を含んだ培養物そのままでもよいし、また、
培養液を遠心分離法やＭＦ膜等で濾過することによって
細胞を集め、そのまま使用してもよいが、種々の緩衝液
で洗浄して使用してもよい。集めた菌体は、凍結乾燥
し、必要なときに緩衝液に懸濁し使用することができる
し、凍結保存用の緩衝液に懸濁し、凍結保存し、同様必
要なとき解凍し使用してもよい。上述のように、本発明
に使用する培養細胞は培養液、遠心等で集菌した細胞、
凍結乾燥した細胞、凍結乾燥細胞を適当な緩衝液に懸濁
した状態の細胞、培養細胞を凍結保存し解凍した後の懸
濁細胞等のいずれでもよいが、非破砕(非破壊)細胞とし
て使用する。
異なっているが、一般的な生物の培養法によって培養
し、増殖する培地であれば如何なるものでもよい。例え
ば、液体振とう培養法、寒天平板培養法、固体培養法、
通気攪拌培養法等で増殖させた培養細胞等何れの方法に
よって収獲された培養細胞でも利用できる。培養後の細
胞は、細胞を含んだ培養物そのままでもよいし、また、
培養液を遠心分離法やＭＦ膜等で濾過することによって
細胞を集め、そのまま使用してもよいが、種々の緩衝液
で洗浄して使用してもよい。集めた菌体は、凍結乾燥
し、必要なときに緩衝液に懸濁し使用することができる
し、凍結保存用の緩衝液に懸濁し、凍結保存し、同様必
要なとき解凍し使用してもよい。上述のように、本発明
に使用する培養細胞は培養液、遠心等で集菌した細胞、
凍結乾燥した細胞、凍結乾燥細胞を適当な緩衝液に懸濁
した状態の細胞、培養細胞を凍結保存し解凍した後の懸
濁細胞等のいずれでもよいが、非破砕(非破壊)細胞とし
て使用する。
【００１３】（３）被活性化タンパク質としては、ペプ
チド合成機によって化学的に合成された種々のポリペプ
チド、ウサギ網状赤血球抽出液を用いたin vitroタンパ
ク質合成系により合成された種々のタンパク質、組換え
ＤＮＡ技術により生産された種々のタンパク質やそ（れ
ら）の含有物等の例がある。また、組換えＤＮＡ技術に
より生産されるタンパク質としては、同タンパク質自体
のほか、同生産培養物（形質転換体培養物）全体、同生
産培養物から分別、分取した生物学的に不活性なタンパ
ク質、そ（れら）の含有物等が挙げられる。
チド合成機によって化学的に合成された種々のポリペプ
チド、ウサギ網状赤血球抽出液を用いたin vitroタンパ
ク質合成系により合成された種々のタンパク質、組換え
ＤＮＡ技術により生産された種々のタンパク質やそ（れ
ら）の含有物等の例がある。また、組換えＤＮＡ技術に
より生産されるタンパク質としては、同タンパク質自体
のほか、同生産培養物（形質転換体培養物）全体、同生
産培養物から分別、分取した生物学的に不活性なタンパ
ク質、そ（れら）の含有物等が挙げられる。
【００１４】このようなものの例としては、酵素、ホル
モン、サイトカイン、リンホカイン、受容体その他があ
り、更に具体的な例として、ウロキナーゼ、インシュリ
ン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、エリスロポ
イエチン、インターロイキン受容体等及び種々の成長因
子、成長因子に類するタンパク質としては上皮細胞成長
因子やインシュリン様成長因子、免疫グロブリン、一本
鎖抗体などが挙げられる。特に、大腸菌を宿主として組
換えＤＮＡ技術により生産されるタンパク質のあるもの
は大量に生産されるが、タンパク質本来の立体構造が構
成できずに菌体内に不溶性の顆粒として存在する例が数
多く知られている。
モン、サイトカイン、リンホカイン、受容体その他があ
り、更に具体的な例として、ウロキナーゼ、インシュリ
ン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、エリスロポ
イエチン、インターロイキン受容体等及び種々の成長因
子、成長因子に類するタンパク質としては上皮細胞成長
因子やインシュリン様成長因子、免疫グロブリン、一本
鎖抗体などが挙げられる。特に、大腸菌を宿主として組
換えＤＮＡ技術により生産されるタンパク質のあるもの
は大量に生産されるが、タンパク質本来の立体構造が構
成できずに菌体内に不溶性の顆粒として存在する例が数
多く知られている。
【００１５】また、菌体外に分泌される組換えタンパク
質の場合でもその種類により菌体外で不溶化したり、本
来の構造が構成できないことにより、タンパク質同士が
会合し高分子状態で生産される場合もある。これらのタ
ンパク質は通常ジスルフィド結合が正常に架けられてお
らず、間違えた結合をしている為、タンパク質の一次構
造は同じであるが、立体構造が異なるために生物活性を
有していないものである。本発明は上記のような被活性
化タンパク質を培養細胞と接触させることにより正常な
ジスルフィド結合に戻し、生物学的に活性のあるタンパ
ク質にすること、すなわち、生物学的に不活性な状態で
生産したタンパク質を活性化する方法に関するものであ
る。
質の場合でもその種類により菌体外で不溶化したり、本
来の構造が構成できないことにより、タンパク質同士が
会合し高分子状態で生産される場合もある。これらのタ
ンパク質は通常ジスルフィド結合が正常に架けられてお
らず、間違えた結合をしている為、タンパク質の一次構
造は同じであるが、立体構造が異なるために生物活性を
有していないものである。本発明は上記のような被活性
化タンパク質を培養細胞と接触させることにより正常な
ジスルフィド結合に戻し、生物学的に活性のあるタンパ
ク質にすること、すなわち、生物学的に不活性な状態で
生産したタンパク質を活性化する方法に関するものであ
る。
【００１６】（４）本発明を実施するには、被活性化タ
ンパク質と細胞とを接触させればよい。生物学的に不活
性な状態で生産されたタンパク質と生物の培養細胞との
接触は、細胞菌体自体のほか、培養菌体を含む培養物、
洗浄細胞、固定化細胞、凍結乾燥細胞、そ（れら）の懸
濁物等のうちいずれかの１以上の選択された細胞を該タ
ンパク質に接触させることからなるものである。本発明
に係る活性化の詳細なメカニズムは今後の研究にまたね
ばならないが、ジスルフィド結合が正常化することがひ
とつの原因と考えられる。
ンパク質と細胞とを接触させればよい。生物学的に不活
性な状態で生産されたタンパク質と生物の培養細胞との
接触は、細胞菌体自体のほか、培養菌体を含む培養物、
洗浄細胞、固定化細胞、凍結乾燥細胞、そ（れら）の懸
濁物等のうちいずれかの１以上の選択された細胞を該タ
ンパク質に接触させることからなるものである。本発明
に係る活性化の詳細なメカニズムは今後の研究にまたね
ばならないが、ジスルフィド結合が正常化することがひ
とつの原因と考えられる。
【００１７】本発明のタンパク質の活性化の方法におい
て、生物学的に不活性な状態で生産したタンパク質に接
触させる培養細胞の量、接触の形態は適宜最良の方法を
選択することが出来る。例えば、培養細胞に原核細胞を
有する微生物を使用する場合、微生物の細胞を適当な緩
衝液、例えばトリス塩酸緩衝液に懸濁後、過剰量を不活
性な状態で生産したタンパク質に加え、よく混合し、好
ましくは１５〜６０℃、より好ましくは２５〜４５℃で
１〜２時間反応させることで生物学的に不活性な状態で
生産されたタンパク質が活性化される。
て、生物学的に不活性な状態で生産したタンパク質に接
触させる培養細胞の量、接触の形態は適宜最良の方法を
選択することが出来る。例えば、培養細胞に原核細胞を
有する微生物を使用する場合、微生物の細胞を適当な緩
衝液、例えばトリス塩酸緩衝液に懸濁後、過剰量を不活
性な状態で生産したタンパク質に加え、よく混合し、好
ましくは１５〜６０℃、より好ましくは２５〜４５℃で
１〜２時間反応させることで生物学的に不活性な状態で
生産されたタンパク質が活性化される。
【００１８】反応させる際、微生物の細胞をＭＦ膜等で
閉じた空間に固定化し緩衝液等で溶解させたタンパク質
溶液を通過させることによって接触させてもよいし、ま
た疎水性の多孔性樹脂であるＨＰ−２０（三菱化学社
製）の様な担体に菌体を吸着させることによって固定化
し、固定化カラムとし、この固定化カラムにタンパク質
溶液を供給することによって微生物の細胞と接触させて
もよい。
閉じた空間に固定化し緩衝液等で溶解させたタンパク質
溶液を通過させることによって接触させてもよいし、ま
た疎水性の多孔性樹脂であるＨＰ−２０（三菱化学社
製）の様な担体に菌体を吸着させることによって固定化
し、固定化カラムとし、この固定化カラムにタンパク質
溶液を供給することによって微生物の細胞と接触させて
もよい。
【００１９】本発明に係る活性化装置は、上記した工程
を具体的に実現するものであって、培養細胞をＭＦ膜や
不溶性の担体に固定化し、ポンプ等の溶液供給装置によ
りタンパク質溶液をこの固定化細胞に供給し、接触させ
ることにより生物学的に不活性な状態で生産されたタン
パク質の活性化装置である。本装置において、細胞の固
定は、上記によるほか、従来より行われている酵素、各
種蛋白質、微生物の担体への固定化技術が適宜利用可能
である。すなわち、無機又は有機、天然又は合成、高分
子又は低分子、生物系又は非生物系等各種担体を用い、
共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法等による従来
既知の固定化技術が適宜利用可能である。
を具体的に実現するものであって、培養細胞をＭＦ膜や
不溶性の担体に固定化し、ポンプ等の溶液供給装置によ
りタンパク質溶液をこの固定化細胞に供給し、接触させ
ることにより生物学的に不活性な状態で生産されたタン
パク質の活性化装置である。本装置において、細胞の固
定は、上記によるほか、従来より行われている酵素、各
種蛋白質、微生物の担体への固定化技術が適宜利用可能
である。すなわち、無機又は有機、天然又は合成、高分
子又は低分子、生物系又は非生物系等各種担体を用い、
共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法等による従来
既知の固定化技術が適宜利用可能である。
【００２０】例えば担体としては、アガロース、セルロ
ース、デキストラン、セファローズ、セファデックス等
の多糖類（誘導体）、ポリアクリルアミドゲル、ポリス
チレン等の合成高分子物質、（多孔質）ガラス、（多孔
質）セラミックス、活性炭、シリカゲル、アルミナ、粘
土鉱物等の無機ないしセラミックス系物質が適宜利用さ
れる。これらの担体は、そのまま、あるいは臭化シア
ン、水素化シアノホウ素等で処理したり、架橋剤や縮合
試薬で処理したりして、常法にしたがって細胞との固定
化を更に推進せしめてもよい。
ース、デキストラン、セファローズ、セファデックス等
の多糖類（誘導体）、ポリアクリルアミドゲル、ポリス
チレン等の合成高分子物質、（多孔質）ガラス、（多孔
質）セラミックス、活性炭、シリカゲル、アルミナ、粘
土鉱物等の無機ないしセラミックス系物質が適宜利用さ
れる。これらの担体は、そのまま、あるいは臭化シア
ン、水素化シアノホウ素等で処理したり、架橋剤や縮合
試薬で処理したりして、常法にしたがって細胞との固定
化を更に推進せしめてもよい。
【００２１】また、培養細胞と生物学的に不活性な状態
で生産されたタンパク質でジスルフィド結合の架け違い
等によって不活性化されているタンパク質と接触、反応
させるときに、還元型グルタチオンやシステインのよう
なスルフヒドリル基を持つ化合物を０．１〜５０ｍＭ添
加するとより有効に本発明の効果を向上させることが可
能である。
で生産されたタンパク質でジスルフィド結合の架け違い
等によって不活性化されているタンパク質と接触、反応
させるときに、還元型グルタチオンやシステインのよう
なスルフヒドリル基を持つ化合物を０．１〜５０ｍＭ添
加するとより有効に本発明の効果を向上させることが可
能である。
【００２２】更にまた、被活性化タンパク質が単離され
ておらず、天然型(native)タンパク質と非天然型(non-n
ative)タンパク質とが混在している場合において、本発
明は、生物学的に活性のあるタンパク質と不活性な状態
で生産したタンパク質を含む溶液を、生物学的に活性の
あるタンパク質の等電点以下のｐＨに調製することによ
り、生物学的に不活性な状態で生産したタンパク質を特
異的に凝集、沈殿させ回収することを特徴とする該タン
パク質の分別、分取方法を提供するものであって、この
方法によれば、目的とする活性タンパク質を精製するこ
とができることはもちろんのこと、回収した不活性タン
パク質は被活性化タンパク質として使用することができ
る。
ておらず、天然型(native)タンパク質と非天然型(non-n
ative)タンパク質とが混在している場合において、本発
明は、生物学的に活性のあるタンパク質と不活性な状態
で生産したタンパク質を含む溶液を、生物学的に活性の
あるタンパク質の等電点以下のｐＨに調製することによ
り、生物学的に不活性な状態で生産したタンパク質を特
異的に凝集、沈殿させ回収することを特徴とする該タン
パク質の分別、分取方法を提供するものであって、この
方法によれば、目的とする活性タンパク質を精製するこ
とができることはもちろんのこと、回収した不活性タン
パク質は被活性化タンパク質として使用することができ
る。
【００２３】本発明に係る上記分別、分取方法の１例と
して生物学的に不活性な状態のタンパク質がジスルフィ
ド結合のかけ違いで起こる場合において、該タンパク質
が組換え上皮細胞成長因子であることを特徴とする分
別、分取方法、及び生物学的に不活性な状態で生産され
た組換え上皮細胞成長因子を含む溶液をｐＨ３に調整す
ることにより凝集、沈殿させ回収することを特徴とする
分別、分取方法が挙げられる。
して生物学的に不活性な状態のタンパク質がジスルフィ
ド結合のかけ違いで起こる場合において、該タンパク質
が組換え上皮細胞成長因子であることを特徴とする分
別、分取方法、及び生物学的に不活性な状態で生産され
た組換え上皮細胞成長因子を含む溶液をｐＨ３に調整す
ることにより凝集、沈殿させ回収することを特徴とする
分別、分取方法が挙げられる。
【００２４】以下本発明を実施例により更に詳しく説明
するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限
定されるものではない。
するが、これは例示的なものであり、本発明はこれに限
定されるものではない。
【００２５】
【実施例１：培養細胞の調製】（１）大腸菌菌体の調製 大腸菌（Escherichia coli）ＪＭ１０９（宝酒造
（株））をポリペプトン４ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ブ
ドウ糖２ｇ、水１００ｍｌ（ｐＨ７．０）の液体培地で
３０℃、２４時間振とう培養し、遠心分離にて集菌し、
得られた菌体を４％ポリペプトン溶液１００ｍｌに懸濁
する。
（株））をポリペプトン４ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ブ
ドウ糖２ｇ、水１００ｍｌ（ｐＨ７．０）の液体培地で
３０℃、２４時間振とう培養し、遠心分離にて集菌し、
得られた菌体を４％ポリペプトン溶液１００ｍｌに懸濁
する。
【００２６】（２）枯草菌菌体の調製 枯草菌（Bacillus subtilis）ＩＦＯ１３７１９をポリ
ペプトン４ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ブドウ糖２ｇ、水
１００ｍｌ（ｐＨ７．０）の液体培地で３０℃、２４時
間振とう培養し、遠心分離にて集菌し、得られた菌体を
４％ポリペプトン溶液１００ｍｌに懸濁する。
ペプトン４ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ブドウ糖２ｇ、水
１００ｍｌ（ｐＨ７．０）の液体培地で３０℃、２４時
間振とう培養し、遠心分離にて集菌し、得られた菌体を
４％ポリペプトン溶液１００ｍｌに懸濁する。
【００２７】（３）ブレビバチルス チョーシネンシス
菌体の調製 ブレビバチルス チョーシネンシス（Brevibacillus ch
oshinensis）ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）
をポリペプトン４ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ブドウ糖２
ｇ、水１００ｍｌ（ｐＨ７．０）の液体培地で３０℃、
２４時間振とう培養し、遠心分離にて集菌し、得られた
菌体を４％ポリペプトン溶液１００ｍｌに懸濁する。
菌体の調製 ブレビバチルス チョーシネンシス（Brevibacillus ch
oshinensis）ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８７）
をポリペプトン４ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ブドウ糖２
ｇ、水１００ｍｌ（ｐＨ７．０）の液体培地で３０℃、
２４時間振とう培養し、遠心分離にて集菌し、得られた
菌体を４％ポリペプトン溶液１００ｍｌに懸濁する。
【００２８】（４）酵母菌体の調製 サッカロミセス セレビシア（Saccharomyces cerevisi
ae）ＩＦＯ１０２１７をペプトン１ｇ、酵母エキス０．
５ｇ、ブドウ糖４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、水１００ｍｌ（ｐＨ７．０）の
液体培地で３０℃、２４時間振とう培養し、遠心分離に
て集菌し、得られた菌体を１％ペプトン溶液１００ｍｌ
に懸濁する。
ae）ＩＦＯ１０２１７をペプトン１ｇ、酵母エキス０．
５ｇ、ブドウ糖４ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ
4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、水１００ｍｌ（ｐＨ７．０）の
液体培地で３０℃、２４時間振とう培養し、遠心分離に
て集菌し、得られた菌体を１％ペプトン溶液１００ｍｌ
に懸濁する。
【００２９】
【実施例２：不活性な状態で生産したタンパク質の分
別、分取方法】（１）不活性な状態で生産したヒト組換
え上皮細胞成長因子（ｈ−ｒＥＧＦ）の調製 ミヤウチ（Miyauchi）らの作製したヒト組換え上皮細胞
成長因子遺伝子を含むプラスミドｐＨＴ１１０ＥＧＦ
（ジャーナル オブ インダストリアル マイクロバイ
オロジー アンド バイオテクノロジー（Journal of I
ndustrial Microbiology and Biotechnology）、第２１
巻、第２０８〜２１４頁（１９９８））を保有するブレ
ビバチルス チョーシネンシスＨＰＤ３１を同文献記載
の培養条件で６５時間液体培養し、遠心分離により、上
澄みを回収した。それを６Ｍ塩酸でｐＨ３．０に調整
し、不活性な状態で生産したヒト組換え上皮細胞成長因
子を特異的に凝集させ、この沈殿を遠心分離で回収し
た。０．１Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の緩衝液で
沈殿を溶解後、再度６Ｍ塩酸でｐＨ３．０に調整し、沈
殿を遠心分離し回収した。更に、沈殿を蒸留水に懸濁
し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整後、凍結
乾燥し、不活性なヒト組換え上皮細胞成長因子（ｈ−ｒ
ＥＧＦ）を調整した。本不活性化ヒト組換え上皮細胞成
長因子はＥＧＦ分子中のシステイン残基が近傍のＥＧＦ
同志のＣｙｓが分子間でＳ−Ｓ結合を形成することによ
って生じたと推定される（ＥＧＦ生産培養上清のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ／Western Blot法分析による）多量体ＥＧＦ
であり、これは非天然型（non-native)EGFである。
別、分取方法】（１）不活性な状態で生産したヒト組換
え上皮細胞成長因子（ｈ−ｒＥＧＦ）の調製 ミヤウチ（Miyauchi）らの作製したヒト組換え上皮細胞
成長因子遺伝子を含むプラスミドｐＨＴ１１０ＥＧＦ
（ジャーナル オブ インダストリアル マイクロバイ
オロジー アンド バイオテクノロジー（Journal of I
ndustrial Microbiology and Biotechnology）、第２１
巻、第２０８〜２１４頁（１９９８））を保有するブレ
ビバチルス チョーシネンシスＨＰＤ３１を同文献記載
の培養条件で６５時間液体培養し、遠心分離により、上
澄みを回収した。それを６Ｍ塩酸でｐＨ３．０に調整
し、不活性な状態で生産したヒト組換え上皮細胞成長因
子を特異的に凝集させ、この沈殿を遠心分離で回収し
た。０．１Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の緩衝液で
沈殿を溶解後、再度６Ｍ塩酸でｐＨ３．０に調整し、沈
殿を遠心分離し回収した。更に、沈殿を蒸留水に懸濁
し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整後、凍結
乾燥し、不活性なヒト組換え上皮細胞成長因子（ｈ−ｒ
ＥＧＦ）を調整した。本不活性化ヒト組換え上皮細胞成
長因子はＥＧＦ分子中のシステイン残基が近傍のＥＧＦ
同志のＣｙｓが分子間でＳ−Ｓ結合を形成することによ
って生じたと推定される（ＥＧＦ生産培養上清のＳＤＳ
−ＰＡＧＥ／Western Blot法分析による）多量体ＥＧＦ
であり、これは非天然型（non-native)EGFである。
【００３０】
【実施例３：不活性化タンパク質の活性化】（１）不活
性組換えヒト上皮細胞成長因子（ｈ−ｒＥＧＦ）のブレ
ビバチルスチョーシネンシス菌体による活性化 実施例２−（１）で得られた不活性ヒト組換え上皮細胞
成長因子を溶解した溶液（乾燥物３．６ｍｇ／ｍｌ最終
濃度）に、Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（最終濃
度０．１Ｍ）、還元型グルタチオン（２ｍＭ最終濃度）
及びブレビバチルス チョーシネンシス菌体懸濁液を添
加し、最終液量を２００μｌとし３０℃で保温した後、
不活性型である多量体ＥＧＦから活性型である天然型Ｅ
ＧＦへの変換を経時的に調べた。多量体ＥＧＦから天然
型ＥＧＦへの変換はＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬ
Ｃ分析の条件は、メルク社製リクロスフェアー１００、
ＲＰ−１８カラム（４×１２５ｍｍ）を使用し、０．１
％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの２５％から
３４％への濃度勾配で行った。流速は１．０ｍｌ／分、
検出は２８０ｎｍで行った。標準ｈＥＧＦの溶出時間に
出現するピークの面積の増加を天然型ＥＧＦへの変換量
とした。多量体ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換を図１
に時間（分、横軸）と天然型ＥＧＦ生成量（ｍｇ／ｍ
ｌ、縦軸）の関係で示す。変換反応液にブレビバチルス
チョーシネンシス菌体懸濁液５０μｌ（▲）、２０μ
ｌ（△）、５μｌ（●）添加した場合と無添加の対照
（○）の結果を示した。ブレビバチルス チョーシネン
シス菌体を加えた場合、天然型ＥＧＦの出現が促進さ
れ、その変換量はブレビバチルス チョーシネンシス菌
体濃度が高くなるに依存し増加した。
性組換えヒト上皮細胞成長因子（ｈ−ｒＥＧＦ）のブレ
ビバチルスチョーシネンシス菌体による活性化 実施例２−（１）で得られた不活性ヒト組換え上皮細胞
成長因子を溶解した溶液（乾燥物３．６ｍｇ／ｍｌ最終
濃度）に、Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（最終濃
度０．１Ｍ）、還元型グルタチオン（２ｍＭ最終濃度）
及びブレビバチルス チョーシネンシス菌体懸濁液を添
加し、最終液量を２００μｌとし３０℃で保温した後、
不活性型である多量体ＥＧＦから活性型である天然型Ｅ
ＧＦへの変換を経時的に調べた。多量体ＥＧＦから天然
型ＥＧＦへの変換はＨＰＬＣを用いて定量した。ＨＰＬ
Ｃ分析の条件は、メルク社製リクロスフェアー１００、
ＲＰ−１８カラム（４×１２５ｍｍ）を使用し、０．１
％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの２５％から
３４％への濃度勾配で行った。流速は１．０ｍｌ／分、
検出は２８０ｎｍで行った。標準ｈＥＧＦの溶出時間に
出現するピークの面積の増加を天然型ＥＧＦへの変換量
とした。多量体ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換を図１
に時間（分、横軸）と天然型ＥＧＦ生成量（ｍｇ／ｍ
ｌ、縦軸）の関係で示す。変換反応液にブレビバチルス
チョーシネンシス菌体懸濁液５０μｌ（▲）、２０μ
ｌ（△）、５μｌ（●）添加した場合と無添加の対照
（○）の結果を示した。ブレビバチルス チョーシネン
シス菌体を加えた場合、天然型ＥＧＦの出現が促進さ
れ、その変換量はブレビバチルス チョーシネンシス菌
体濃度が高くなるに依存し増加した。
【００３１】（２）不活性組換えヒト上皮細胞成長因子
（ｈ−ｒＥＧＦ）の枯草菌菌体による活性化 実施例２−（１）で得られた不活性ヒト組換え上皮細胞
成長因子を溶解した溶液（乾燥物３．６ｍｇ／ｍｌ最終
濃度）に、Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（最終濃
度０．１Ｍ）、還元型グルタチオン（２ｍＭ最終濃度）
及び枯草菌菌体懸濁液５０μｌを添加し、最終液量を２
００μｌとし３０℃で保温した後、不活性型である多量
体ＥＧＦから活性型である天然型ＥＧＦへの変換を経時
的に調べた。多量体ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換の
定量は実施例３−（１）で示した方法で行った。多量体
ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換を図２に時間（分、横
軸）と天然型ＥＧＦ生成量（ｍｇ／ｍｌ、縦軸）の関係
で示す。変換反応液に枯草菌菌体懸濁液を添加した場合
（▲）と無添加の対照（○）の結果を示した。枯草菌菌
体を加えた場合、天然型ＥＧＦの出現が促進された。
（ｈ−ｒＥＧＦ）の枯草菌菌体による活性化 実施例２−（１）で得られた不活性ヒト組換え上皮細胞
成長因子を溶解した溶液（乾燥物３．６ｍｇ／ｍｌ最終
濃度）に、Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（最終濃
度０．１Ｍ）、還元型グルタチオン（２ｍＭ最終濃度）
及び枯草菌菌体懸濁液５０μｌを添加し、最終液量を２
００μｌとし３０℃で保温した後、不活性型である多量
体ＥＧＦから活性型である天然型ＥＧＦへの変換を経時
的に調べた。多量体ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換の
定量は実施例３−（１）で示した方法で行った。多量体
ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換を図２に時間（分、横
軸）と天然型ＥＧＦ生成量（ｍｇ／ｍｌ、縦軸）の関係
で示す。変換反応液に枯草菌菌体懸濁液を添加した場合
（▲）と無添加の対照（○）の結果を示した。枯草菌菌
体を加えた場合、天然型ＥＧＦの出現が促進された。
【００３２】（３）不活性組換えヒト上皮細胞成長因子
（ｈ−ｒＥＧＦ）の大腸菌菌体による活性化 ０．４５μｍ孔経のメンブレン（材質デュラポア）をセ
ットしたタンジェンシャルフロー型ろ過装置のミニタン
II（ミリポア社製）を固定化細胞反応装置として使用し
た。実施例２−（１）で得られた不活性ヒト組換え上皮
細胞成長因子を溶解した溶液（乾燥物３．６ｍｇ／ｍｌ
最終濃度）１００ｍｌに、１Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）緩衝液１００ｍｌ、大腸菌菌体懸濁液５０ｍｌ
を混合し、還元型グルタチオン（２ｍＭ最終濃度）を添
加した反応液１０００ｍｌを３０℃の恒温室内で固定化
細胞反応装置に１０ｍｌ／分の流速で供給した。循環液
出口の圧力を調節して透過液（再活性化液）の回収量を
調節した。透過液の回収速度を１ｍｌ／分に調節すると
同時に、大腸菌菌体のみを含まない反応液を１ｍｌ／分
の流速で循環液に加えた。透過液を経時的に回収し、多
量体ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換の定量は実施例３
−（１）で示した方法で行った。多量体ＥＧＦから天然
型ＥＧＦへの変換の経時的な変化を図３に時間（分、横
軸）と天然型ＥＧＦ生成量（ｍｇ／ｍｌ、縦軸）の関係
で示す。反応開始時に大腸菌菌体を加えた場合（▲）、
天然型ＥＧＦへの変換量は加えない場合（○）に比べて
促進され、しかも長時間にわたり、連続的に天然型ＥＧ
Ｆが回収された。
（ｈ−ｒＥＧＦ）の大腸菌菌体による活性化 ０．４５μｍ孔経のメンブレン（材質デュラポア）をセ
ットしたタンジェンシャルフロー型ろ過装置のミニタン
II（ミリポア社製）を固定化細胞反応装置として使用し
た。実施例２−（１）で得られた不活性ヒト組換え上皮
細胞成長因子を溶解した溶液（乾燥物３．６ｍｇ／ｍｌ
最終濃度）１００ｍｌに、１Ｍ Tris-ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）緩衝液１００ｍｌ、大腸菌菌体懸濁液５０ｍｌ
を混合し、還元型グルタチオン（２ｍＭ最終濃度）を添
加した反応液１０００ｍｌを３０℃の恒温室内で固定化
細胞反応装置に１０ｍｌ／分の流速で供給した。循環液
出口の圧力を調節して透過液（再活性化液）の回収量を
調節した。透過液の回収速度を１ｍｌ／分に調節すると
同時に、大腸菌菌体のみを含まない反応液を１ｍｌ／分
の流速で循環液に加えた。透過液を経時的に回収し、多
量体ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換の定量は実施例３
−（１）で示した方法で行った。多量体ＥＧＦから天然
型ＥＧＦへの変換の経時的な変化を図３に時間（分、横
軸）と天然型ＥＧＦ生成量（ｍｇ／ｍｌ、縦軸）の関係
で示す。反応開始時に大腸菌菌体を加えた場合（▲）、
天然型ＥＧＦへの変換量は加えない場合（○）に比べて
促進され、しかも長時間にわたり、連続的に天然型ＥＧ
Ｆが回収された。
【００３３】（４）不活性組換えヒト上皮細胞成長因子
（ｈ−ｒＥＧＦ）の酵母菌体による活性化 実施例２−（１）で得られた不活性ヒト組換え上皮細胞
成長因子を溶解した溶液（乾燥物３．６ｍｇ／ｍｌ最終
濃度）に、Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（最終濃
度０．１Ｍ）、還元型グルタチオン（２ｍＭ最終濃度）
及び酵母菌体懸濁液５０μｌを添加し、最終液量を２０
０μｌとし３０℃で保温した後、不活性型ＥＧＦから活
性型である天然型ＥＧＦへの変換を経時的に調べた。不
活性型ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換の量は実施例３
−（１）で示した方法で行った。不活性型ＥＧＦから天
然型ＥＧＦへの変換を図４に時間（分、横軸）と天然型
ＥＧＦ生成量（ｍｇ／ｍｌ、縦軸）の関係で示す。変換
反応液に酵母菌体懸濁液を添加した場合（▲）と無添加
の対照（○）の結果を示した。酵母菌体を加えた場合、
天然型ＥＧＦの出現が促進された。
（ｈ−ｒＥＧＦ）の酵母菌体による活性化 実施例２−（１）で得られた不活性ヒト組換え上皮細胞
成長因子を溶解した溶液（乾燥物３．６ｍｇ／ｍｌ最終
濃度）に、Tris-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液（最終濃
度０．１Ｍ）、還元型グルタチオン（２ｍＭ最終濃度）
及び酵母菌体懸濁液５０μｌを添加し、最終液量を２０
０μｌとし３０℃で保温した後、不活性型ＥＧＦから活
性型である天然型ＥＧＦへの変換を経時的に調べた。不
活性型ＥＧＦから天然型ＥＧＦへの変換の量は実施例３
−（１）で示した方法で行った。不活性型ＥＧＦから天
然型ＥＧＦへの変換を図４に時間（分、横軸）と天然型
ＥＧＦ生成量（ｍｇ／ｍｌ、縦軸）の関係で示す。変換
反応液に酵母菌体懸濁液を添加した場合（▲）と無添加
の対照（○）の結果を示した。酵母菌体を加えた場合、
天然型ＥＧＦの出現が促進された。
【００３４】
【発明の効果】本発明によれば、非活性型タンパク質を
細胞と接触させるというきわめて簡便な処理によって活
性型タンパク質に変換することができる。したがって、
本発明に係る活性化方法によれば、化学合成、生合成、
組換えＤＮＡ技術等によって生産されるタンパク質（こ
の中には非活性型タンパク質が含有されている場合が多
く、したがって、活性型タンパク質の収量は低くなり、
場合によっては皆無ということもある）において、例え
ば生産培養物を細胞と共にインキュベートすることによ
り、非活性型タンパク質を活性化することができ、その
結果、活性を有する天然型タンパク質の収量を高めるこ
とができる。
細胞と接触させるというきわめて簡便な処理によって活
性型タンパク質に変換することができる。したがって、
本発明に係る活性化方法によれば、化学合成、生合成、
組換えＤＮＡ技術等によって生産されるタンパク質（こ
の中には非活性型タンパク質が含有されている場合が多
く、したがって、活性型タンパク質の収量は低くなり、
場合によっては皆無ということもある）において、例え
ば生産培養物を細胞と共にインキュベートすることによ
り、非活性型タンパク質を活性化することができ、その
結果、活性を有する天然型タンパク質の収量を高めるこ
とができる。
【図１】ブレビバチルス チョーシネンシス菌体による
不活性型ＥＧＦから活性型(天然型)ＥＧＦへの変換を表
す図である。
不活性型ＥＧＦから活性型(天然型)ＥＧＦへの変換を表
す図である。
【図２】枯草菌菌体による不活性型ＥＧＦから活性型
(天然型)ＥＧＦへの変換を表す図である。
(天然型)ＥＧＦへの変換を表す図である。
【図３】固定化大腸菌菌体反応装置による不活性型ＥＧ
Ｆから活性型(天然型)ＥＧＦへの変換を表す図である。
Ｆから活性型(天然型)ＥＧＦへの変換を表す図である。
【図４】酵母菌体による不活性型ＥＧＦから活性型(天
然型)ＥＧＦへの変換を表す図である。
然型)ＥＧＦへの変換を表す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１１年６月１６日（１９９９．６．１
６）
６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA21 CA04 DA05 EA04 GA11 HA03 4B065 AA01X AA19X AA26X AA80X BC41 BD50 CA24 CA60 4H045 AA20 CA40 DA01 EA61 FA74
Claims (11)
- 【請求項１】 生物学的に不活性な状態で生産されたタ
ンパク質を、生物の培養細胞と接触させることにより、
生物学的に活性のあるタンパク質に変換させることを特
徴とするタンパク質の活性化方法。 - 【請求項２】 生物の培養細胞が動物細胞、植物細胞、
微生物細胞からなる１以上の選択された生物の培養細胞
であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質の活
性化方法。 - 【請求項３】 生物の培養細胞が微生物の培養細胞であ
ることを特徴とする請求項１又は２記載のタンパク質の
活性化方法。 - 【請求項４】 微生物の細胞が原核生物又は真核生物の
細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１
項に記載のタンパク質の活性化方法。 - 【請求項５】 生物学的に不活性な状態で生産されたタ
ンパク質と生物の培養細胞との接触が、培養菌体自体、
それを含む培養物、洗浄細胞、固定化細胞、凍結乾燥細
胞、そ（れら）の懸濁物等のうちいずれかの１以上の選
択された細胞を該タンパク質に接触させることを特徴と
する請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質の
活性化方法。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載の方
法によって活性化される被活性化タンパク質が、化学的
に合成されたポリペプチド、in vitroタンパク質合成系
により生物学的に合成されたタンパク質、組換えＤＮＡ
技術により生産されたタンパク質、そ（れら）の含有物
から選ばれる少なくともひとつであることを特徴とする
同項記載の方法。 - 【請求項７】 組換えＤＮＡ技術により生産されたタン
パク質が、同タンパク質自体、同生産物全体；同生産培
養物から分別、分取した生物学的に不活性なタンパク
質；そ（れら）の含有物；から選ばれる少なくともひと
つであることを特徴とする請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 培養細胞を精密濾過（ＭＦ）膜又は不溶
性担体に固定化し、ポンプ等の溶液供給装置によりタン
パク質溶液をこの固定化細胞に供給して接触させるよう
にしてなる装置であって、生物学的に不活性な状態で生
産されたタンパク質を活性化する請求項１〜７のいずれ
か１項に記載の方法を実施するための活性化装置。 - 【請求項９】 生物学的に活性のあるタンパク質と不活
性な状態で生産したタンパク質を含む溶液を、生物学的
に活性のあるタンパク質の等電点以下のｐＨに調整する
ことにより、生物学的に不活性な状態で生産したタンパ
ク質を特異的に凝集、沈殿させ回収することを特徴とす
る該タンパク質の分別、分取方法。 - 【請求項１０】 生物学的に不活性な状態のタンパク質
がジスルフィド結合のかけ違いで起こる場合において、
該タンパク質が組換え上皮細胞成長因子であることを特
徴とする請求項９に記載の分別、分取方法。 - 【請求項１１】 生物学的に不活性な状態で生産された
組換え上皮細胞成長因子を含む溶液をｐＨ３に調整する
ことにより凝集、沈殿させ回収することを特徴とする請
求項９又は１０に記載の分別、分取方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05571599A JP3734634B2 (ja) | 1999-03-03 | 1999-03-03 | タンパク質の活性化方法及び該装置 |
| DK99118029T DK1035129T3 (da) | 1999-03-03 | 1999-09-21 | En fremgangsmåde til at aktivere protein og et apparatur dertil |
| EP99118029A EP1035129B1 (en) | 1999-03-03 | 1999-09-21 | A method for activating epidermal growth factor (EGF) |
| DE69908748T DE69908748T2 (de) | 1999-03-03 | 1999-09-21 | Verfahren zur Aktivierung von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) |
| AU50133/99A AU773691B2 (en) | 1999-03-03 | 1999-09-24 | A method of activating protein and an apparatus therefor |
| US09/405,085 US6479257B1 (en) | 1999-03-03 | 1999-09-27 | Method of activating protein and an apparatus therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP05571599A JP3734634B2 (ja) | 1999-03-03 | 1999-03-03 | タンパク質の活性化方法及び該装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000256393A true JP2000256393A (ja) | 2000-09-19 |
| JP3734634B2 JP3734634B2 (ja) | 2006-01-11 |
Family
ID=13006586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP05571599A Expired - Fee Related JP3734634B2 (ja) | 1999-03-03 | 1999-03-03 | タンパク質の活性化方法及び該装置 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6479257B1 (ja) |
| EP (1) | EP1035129B1 (ja) |
| JP (1) | JP3734634B2 (ja) |
| AU (1) | AU773691B2 (ja) |
| DE (1) | DE69908748T2 (ja) |
| DK (1) | DK1035129T3 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110172433B (zh) * | 2019-05-12 | 2021-07-30 | 华中农业大学 | 一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4304857A (en) * | 1980-01-21 | 1981-12-08 | Penick & Ford, Limited | Whole cell enzyme composition containing fumed silica |
| GR79124B (ja) | 1982-12-22 | 1984-10-02 | Genentech Inc | |
| CA1339757C (en) * | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| IL86455A0 (en) * | 1987-06-01 | 1988-11-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Polypeptide and production thereof |
| US5191063A (en) * | 1989-05-02 | 1993-03-02 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Production of biologically active polypeptides by treatment with an exogenous peptide sequence |
| JP3021040B2 (ja) * | 1990-11-23 | 2000-03-15 | ヘキスト・マリオン・ルセル | 少なくとも１個の分子内ジスルフィド結合を含有する蛋白質を相当する還元された組替え蛋白質を５．０以下のｐＨで酸化することによって製造する方法 |
| SE9303784D0 (sv) * | 1993-11-16 | 1993-11-16 | Kabi Pharmacia Ab | Igf |
| JPH11505507A (ja) * | 1994-07-25 | 1999-05-21 | ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト | 組換えヒルジンまたは表皮増殖因子のようなタンパク質の折りたたみ方法 |
| AU2660397A (en) * | 1996-04-05 | 1997-10-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
| AU1818299A (en) * | 1997-12-10 | 1999-06-28 | Washington University | Anti-pathogen system and methods of use thereof |
| JPH11285398A (ja) * | 1998-04-01 | 1999-10-19 | Sekisui Chem Co Ltd | 変性タンパク質の再生方法 |
-
1999
- 1999-03-03 JP JP05571599A patent/JP3734634B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-21 EP EP99118029A patent/EP1035129B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-21 DE DE69908748T patent/DE69908748T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-21 DK DK99118029T patent/DK1035129T3/da active
- 1999-09-24 AU AU50133/99A patent/AU773691B2/en not_active Ceased
- 1999-09-27 US US09/405,085 patent/US6479257B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69908748T2 (de) | 2003-12-24 |
| US6479257B1 (en) | 2002-11-12 |
| DE69908748D1 (de) | 2003-07-17 |
| EP1035129B1 (en) | 2003-06-11 |
| AU5013399A (en) | 2000-09-07 |
| EP1035129A1 (en) | 2000-09-13 |
| JP3734634B2 (ja) | 2006-01-11 |
| DK1035129T3 (da) | 2003-09-29 |
| AU773691B2 (en) | 2004-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1175931A1 (en) | Integration of high cell density bioreactor operation with ultra fast on-line downstream processing | |
| Hamilton et al. | Development of a mixed mode adsorption process for the direct product sequestration of an extracellular protease from microbial batch cultures | |
| JP2016063844A (ja) | ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインａ様蛋白質の生産方法 | |
| EP0789078B1 (en) | Engineered peptide synthetases and their use for the non-ribosomal production of peptides | |
| CN113025598A (zh) | 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶iii的方法及其所制备的sumo_肝素酶iii融合蛋白 | |
| CN104144939A (zh) | 柱上酶切割 | |
| KR100404273B1 (ko) | 재조합사람혈청알부민의제조방법 | |
| US4705848A (en) | Isolation of bioactive, monomeric growth hormone | |
| JPWO2015190458A1 (ja) | 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法 | |
| Hamilton et al. | Process intensification by direct product sequestration from batch fermentations: Application of a fluidised bed, multi‐bed external loop contactor | |
| JP3734634B2 (ja) | タンパク質の活性化方法及び該装置 | |
| Miyauchi et al. | Pilot scale production of a recombinant human epidermal growth factor, secreted by Bacillus brevis, using expanded bed adsorption | |
| Hochuli | Interrelations of Chemistry and Biotechnology-III. Purification techniques for biological products (Technical Report) | |
| Born et al. | An approach to integrated antibody production: coupling of fluidized bed cultivation and fluidized bed adsorption | |
| KR100618563B1 (ko) | 셀룰로오스 결합 도메인을 이용한 효모에서 재조합단백질의 제조방법 | |
| JPH06296485A (ja) | 変異バチルス・ブレビス菌 | |
| CN113493780A (zh) | 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶ii的方法及其所制备的sumo_肝素酶ii融合蛋白 | |
| JPH11113592A (ja) | Ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| US6428997B1 (en) | Aminopeptidase derived from Bacillus licheniformis and process for preparation of natural type proteins | |
| Strandberg et al. | Production of the hybrid protein staphylococcal protein A/Escherichia coli β-galactosidase with E. coli | |
| Matsusaki et al. | Purification, identification, and effective production of a peptide antibiotic produced by Lactococcus lactis IO-1 (JCM 7638) | |
| JP3809472B2 (ja) | 改変シクロデキストリン合成酵素及びその製造法並びに該酵素を用いたシクロデキストリンの製造法 | |
| KR20020014459A (ko) | 양이온성 아미노산이 부가된 융합단백질 및 이를 이용한생물공정의 개선방법 | |
| JP2000078971A (ja) | Ｄ−、ｌ−アミノ酸エステルよりオリゴペプチドを合成する新規酵素およびこれを生産する微生物 | |
| CN112980820A (zh) | 一种利用sumo融合表达系统制备重组肝素酶i的方法及其所制备的sumo_肝素酶i融合蛋白 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050308 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050428 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050628 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050824 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20050824 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051018 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051019 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081028 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111028 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |