JP2014064589A - ブレビバチルス属細菌を用いたプロテインa様蛋白質の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】プロテインA様蛋白質の遺伝子組換え技術を用いた生産は、大腸菌、枯草菌などの宿主が使用されているが生産性の低さにより高価格の大きな原因となっている。従って大腸菌や枯草菌以外の組換えDNA技術を用いたプロテインA様蛋白質の安価で大量な生産を可能にする技術の早急な確立が強く望まれている。本発明は、プロテインA様蛋白質の大量生産方法であり、組換えブレビバチルス属細菌により該蛋白質を培養液中へ大量に分泌発現させ、培養液中からその蓄積された該プロテインA様蛋白質を分離回収することからなる方法などを提供する。
【選択図】なし
Description
(1)本発明は、プロテインA様蛋白質またはその部分的配列をコードするDNA配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを含む、DNA配列を提供する。
(3)本発明は、前記DNA配列を含む、発現ベクターを提供する。
(4)本発明は、前記発現ベクターを含む、ブレビバチルス属細菌形質転換体を提供する。
(6)本発明は、前記形質転換体を培養すること、および該形質転換体によって分泌生産されるプロテインA様蛋白質、またはその部分的配列を有する蛋白質を回収することを含む、プロテインA様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質の製造方法を提供する。
(7)本発明は、前記製造方法によってプロテインA様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を製造すること、および該プロテイン様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を適当な基材に固定化すること、を含む、イムノグロブリン吸着担体の製造方法を提供する。
プロテインAは、前述のように、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウスによって生産される細胞壁蛋白質の1種であり、例えば、図1(配列番号2)にて示されるアミノ酸配列からなるスタフィロコッカス・アウレウス・コワン(Cowan)I株(JCM2179)由来のもの(非特許文献2)、図2(配列番号4)にて示されるアミノ酸配列からなるもの(非特許文献6、Finck-Barbancon,V.ら FEMS Microbiol. Lett. 1992. 91:1-8))、Woods46株由来のもの(非特許文献3)、8325−4株由来のもの(非特許文献3)、および既にクローニングされているプラスミドDNAすなわちpSP1やpSP3等(非特許文献7)にコードされているspa遺伝子産物等を指す。
Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して公衆が利用可能である。
プロテインA様蛋白質の「部分的配列」とは、上記プロテインA様蛋白質を構成するアミノ酸配列の任意の一部分から構成されるものであって、かつ、イムノグロブリン結合活性を有する蛋白質を指し、具体的には、例えば、プロテインAから先述のシグナル配列Sおよび細胞壁結合ドメインXの一部を除いて得られる、配列番号8の24番目のAla以降で示されるアミノ酸配列(実施例1の「SPA」に対応。図3および4、配列番号7および8参照。)、および、プロテインAから先述のシグナル配列Sおよび細胞壁結合ドメインXの全部を除いて得られる、配列番号19の31番目のAla以降で示されるアミノ酸配列(実施例5の「SPA’」に対応。図7および8、配列番号18および19参照。)のそれぞれが、プロテインA様蛋白質の「部分的配列」に対応する。
本発明に用いられる、プロテインA様蛋白質をコードするDNA配列は、そのDNA配列を翻訳したアミノ酸配列が、プロテインA様蛋白質を構成するものであればいずれでも良い。そのようなDNA配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション(以下、PCRと略す)法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり(Nucleic acids Res.1984. 12:4359)、さらに、DNAライブラリーから得ることもできる。当該DNA配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、ブレビバチルス属内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来のDNA配列と同一である必要性は無い。
本発明の「発現ベクター」は、プロテインA様蛋白質またはその部分的配列をコードするDNA配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを含む。当該プロモーターは、ブレビバチルス属細菌で機能しうるものであればいかなるものでも良いが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属(Streptomyces)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)等細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なプロモーターが好ましく、ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質middle wall protein(MWP)、同蛋白質であるouter wallprotein(OWP)(非特許文献10)または、ブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31細胞壁蛋白質HWP(Ebisu. Sら. J. Bacteriol. 1990. 172:1312-1320)をコードする遺伝子のプロモーターがより好ましい。実施例では、実施例1に示すブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質MWPのP5プロモーター領域「MWP−P5」(図3、4、配列番号7、8参照)、および、実施例5に示すブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質MWPのP2プロモーター領域「MWP−P2」(図7、8、配列番号18、19参照)のそれぞれが、「ブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーター」に対応する。
61:669-676)、pNU100(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989,30:75-80)、pNU211(J.
Biochem., 1992, 112:488-491)、pNU211R2L5(特開平7−170984号公報)、pNH301(Shiga. Y.ら. Appl. Environ. Microbiol. 1992. 58:525-531.)、pNH326、pNH400(Ishihara. Tら、1995. J. Bacteriol, 177:745-749)、pHT210(特開平6−133782号公報)、pHT110R2L5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42:358-363)、または大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるpNCO2(特開2002−238569号公報)が使用可能であるが、これらに限定されることはない。また、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターとシャインダルガノ配列と目的蛋白質をコードするDNA配列とを含んだ発現ベクター、または、それらの各配列を含む遺伝子断片を染色体中へ直接組み込み、発現させる方法(特開平9−135693号公報)を用いても良い。そのような方法は、枯草菌や酵母で既に用いられている公知な方法である。
本発明はまた、上記発現ベクターで形質転換されている、ブレビバチルス属細菌形質転換体を提供する。
ブレビバチルス属細菌を含めた微生物において異種蛋白質を高発現させた場合、正しくフォールディングされずに不活性型の蛋白質を形成することが多く、特にジスルフィド結合の多い蛋白質を高発現させた場合、細胞内外にて不溶性化することも多い。一方で、目的蛋白質を発現させる際、シャペロン蛋白質やジスルフィド結合異性化酵素および/またはプロリン異性化酵素などを作用させることによって、目的蛋白質の不溶性化や分泌効率の低下を抑えられることが知られている。広く試みられている方法は、PDI(プロテインジスルフィドイソメラーゼ)および/またはDsbAなどのジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質を作用させる方法(特開昭63−294796号公報、特開平5−336986号公報)である。
本発明において用いられるブレビバチルス属細菌の宿主細胞の形質転換は、公知のTakahahiらの方法(Takahashi. Wら. J. Bacteriol. 1983. 156:1130-1134)や、Takagiらの方法(Takagi. H.ら.1989. Agric. Biol. Chem, 53:3099-3100)、またはOkamotoらの方法(Okamoto. A.ら1997. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:202-203) により実施することができる。
fluoride (AEBSF)、Antipain、Chymostatin、Leupeptin、Pepstatin A、Phosphoramidon、Aprotinin、Ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA)、および/または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。
本発明の実施形態によれば、形質転換されたブレビバチルス属細菌を培養することにより、プロテインA様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質は、菌体外、すなわち培養上清中に大量に蓄積されるので、培養上清中から活性型の当該蛋白質を採取、精製することが出来る。また菌体内、及び菌表層に残った当該蛋白質も、公知の方法、例えば超音波やフレンチプレス、アルカリやSDS処理などを利用した方法により菌を破砕し抽出出来る。得られた当該蛋白質は、公知の蛋白質精製方法、例えば硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムなどを用いた塩析、エタノールやアセトン等による濃縮、及び、ゲル濾過、イオン交換、ハイドロキシアパタイト、当該蛋白質のもつ抗体結合活性を利用した各種クロマトグラフィーおよび/または、当該蛋白質が有する親和性を利用したクロマトグラフィーなどを用いて、効果的に精製することができる。
本発明におけるプロテイン様蛋白質またはその部分的配列からなる蛋白質を固定する「基材」としては、活性炭、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機基材、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子、または樹脂、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機基材、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラス、さらには、これらの組み合わせによって得られうる有機−有機、有機−無機などの複合基材が代表例として挙げられるが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。好ましくは、該基材は水、ナイロン6、ナイロン6,6、ナイロン11、ポリエチレン、ポリ(塩化ビニリデン)、ポリ(塩化ビニル)、ポリ(酢酸ビニル)、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、スチレン−ジビニルベンゼン、ポリ(トリフルオロエチレン)、ポリ(クロロトリフィルオロエチレン)、ポリ(テレフタル酸エチレン)、ポリプロピレン、ポリ(アクリル酸メチル)、ポリアクリル酸エステル、ポリ(メタクリル酸メチル)、ポリメタクリル酸エステル、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアミドなどの合成高分子化合物からなる群より選択される。基材の形状としては、球状、粒状、平膜状、繊維状、中空糸状等いずれも有効に用いられるが、吸着性能面から球状または粒状がより好ましく用いられる。水不溶性多孔質体が球状または粒状である場合、平均粒径は約5μmから1000μmであることが好ましく、より好ましくは約20〜800μm、最も好ましくは約30〜600μmである。
スタフィロコッカス・アウレウス ATCC6538P株由来のプロテインAをコードするDNA配列のクローニング
スタフィロコッカス・アウレウスATCC6538P株を、T2液体培地(ポリペプトン
1%、イーストエキストラクト 0.2%、グルコース1%、魚肉エキス0.5%、pH7.0)で37℃一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により回収後、10mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)で2度洗浄した。菌体を同緩衝液に懸濁後、1%SDSで溶菌し、60℃にて30分間加熱後、フェノール抽出及びエタノール沈殿等の定法により全ゲノムDNAを抽出した。
ブレビバチルス属細菌によるプロテインAの発現試験
実施例1にて得られた形質転換体、及びその対照となるベクターpNH301のみを有するブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31−OK株のそれぞれを、生産培地3YC(ポリペプトンS3%、酵母エキス0.5%、グルコース3%、MgSO4・7H2O 0.01%、CaCl2・7H2O 0.01%、MnSO4・4H2O 0.001%、FeSO4・7H2O 0.001%、ZnSO4・7H2O 0.0001% pH7.0)にネオマイシン60mg/Lを添加した培地にて、30℃で、好気的条件下、3日間培養を行った。培養液は遠心分離(10,000rpm、4℃、5分間)により菌体を除去した後、定法により、10−20%グラジエントゲルを用いた還元条件下でのSDS−PAGEに供した。電気泳動後、ゲルをCBB染色することにより、SPAのバンドを検出した(図5)。SDS−PAGEによる解析の結果、その培養上清液中に大量のSPAを確認することが出来た。
ブレビバチルス属細菌により生産されたプロテインAの抗体結合能の測定
実施例1で得られた形質転換体により生産されたSPAが抗体結合能を有するか確認するため、マウス抗ヒトIgG抗体及びアルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用いて結合試験を行った。
ブレビバチルス発現ベクターpNK3260の構築
pNH326(Ishihara. Tら、1995. J. Bacteriol, 177:745-749)に含まれるMWPのP5プロモーターをMWPのP2プロモーターに変換して、ブレビバチルス発現ベクターpNK3260を以下のように構築した。
スタフィロコッカス・アウレウス・コワンI株(JCM2179)由来のプロテインAをコードするDNA配列のクローニング
実施例1と同様に、スタフィロコッカス・アウレウス・コワンI株(JCM2179)から全ゲノムDNAを抽出した。次に、プロテインA遺伝子のDNA配列情報(非特許文献2)を基に、2つのオリゴヌクレオチドプライマー5'- TTGCTCCCATGGCTTTCGCTGCGCAACACGATGAAGCTCAACAA-3' (配列番号16)と5'-CGGGATCCCTATTTTGGTGCTTGAGCATCGTTTAGCTTTTTAGCTTCTGCTAAAATTTTC-3'(配列番号17)を調製した。上記のゲノムDNAを鋳型とし、これら2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行い、プロテインAからシグナルシーケンス(Sドメイン)及び細胞壁結合ドメイン(Xドメイン)を除いた部分(これ以降SPA’と称する)をコードするDNA断片(約0.9kbp)を増幅した。得られたDNA断片は、制限酵素NcoI及びBamHIにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。
ブレビバチルス属細菌により分泌発現されたプロテインAの培養液中の挙動
実施例5にて得られた形質転換体を、生産培地3YC(ポリペプトンS3%、酵母エキス0.5%、グルコース3%、MgSO4・7H2O 0.01%、CaCl2・7H2O 0.01%、MnSO4・4H2O 0.001%、FeSO4・7H2O 0.001%、ZnSO4・7H2O 0.0001% pH7.0)にネオマイシン60mg/Lを添加した培地にて、30℃の、好気的条件下で培養した。培養開始から、24、48、72、78時間後に培養液を分取し、遠心分離(10,000rpm、4℃、5分間)により菌体を除去した後、定法により、10−20%グラジエントゲルを用いた還元条件下でのSDS−PAGEに供した。電気泳動後、ゲルをCBB染色することにより、SPA’のバンドを検出した(図9)。図9において、「レーン番号1」は分子量マーカーを、「レーン番号2」は対照として用いたRepligen社製プロテインA(rPA−50)0.52μgを、「レーン番号3」は培養開始から24時間経過後のSPA’発現ベクターSpa’−pNK3260を有するブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31−OK株の培養上清1μlを、「レーン番号4」は培養開始から48時間経過後の同培養上清1μlを、「レーン番号5」は培養開始から72時間経過後の同培養上清1μlを、「レーン番号6」は培養開始から78時間経過後の同培養上清1μlを、それぞれ泳動したレーンを示す。
図9に示したSDS−PAGEゲル中のレーン番号6において、分子量33kDa付近に見られるSPA’のバンドについて、そのN末端から10残基のアミノ酸配列を、定法に従い解析した。その結果、配列番号2に示したプロテインAのアミノ酸配列の37番目のAla以降の配列と一致し、分泌シグナル配列が正確に除去されていることが確認された。
実施例6と同様に78時間培養して得られた培養液の上清1Lを、陽イオン交換クロマトグラフィー(CM−Sepharose:アマシャムバイオサイエンス)に供し、pH7.0において0−1M塩化ナトリウムの濃度勾配により分離した。次にSPA’画分を回収し、疎水クロマトグラフィー(Phenyl−Sepharose:アマシャムバイオサイエンス)に供し、pH7.0において1−0M硫酸アンモニウムの濃度勾配により分離した。さらに、SPA’画分を回収し、ゲルろ過クロマトグラフィー(HiLoad
16/60 Superdex 75pg:アマシャムバイオサイエンス)に供し、SPA’画分を回収した。以上の精製操作により、SDS−PAGEにおいて単一バンドを示す、約100mgのSPA’を調製した。
Claims (6)
- Xドメインを含まないプロテインA様蛋白質またはその部分的配列をコードするDNA配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス(Brevibacillus)属細菌で機能しうるプロモーターを含む、DNA。
- 該プロモーターが、ブレビバチルス属細菌の細胞壁蛋白質のプロモーターであり、該プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列、およびブレビバチルス属細菌で機能しうる分泌シグナルペプチドをコードするDNAをさらに含む、請求項1に記載のDNA。
- 請求項1または2に記載のDNAを含む、発現ベクター。
- 請求項3記載の発現ベクターを含む、ブレビバチルス属細菌形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養する工程、および、該形質転換体によって分泌生産されるXドメインを含まないプロテインA様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を回収する工程を含む、蛋白質の製造方法。
- 請求項5に記載の製造方法によってXドメインを含まないプロテインA様蛋白質またはその部分的配列を有する蛋白質を製造する工程、および該蛋白質を適当な基材に固定化する工程を含む、イムノグロブリン吸着担体の製造方法。
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