JP2003169675A - 新規ジスルフィド酸化還元酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓデータベースから取り出した情報をもとに、Ｙｎｅ
Ｎ遺伝子及びＹｋｖＶ遺伝子をそれぞれＰＣＲ法にて増
幅し、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅ
ｎｓｉｓ発現分泌ベクターに組み込み、形質転換した。
形質転換体を培養し、培地画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り、タンパク質ＹｎｅＮ及びＹｋｖＶがそれぞれ検出さ
れた。 【効果】 上記遺伝子産物であるこれらのタンパク質
は、すぐれたジスルフィド酸化還元活性を示すことが新
たに確認され、各種の生理活性物質を活性化することが
できるものと期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ジスルフィド酸化
還元活性を有するタンパク質、及び組換ＤＮＡ技術によ
る該タンパク質の製造及び該タンパク質の利用に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡ技術は、生体由来のペプチ
ド又はタンパク質などで、微量成分として単離すること
が著しく困難であった物質を、微生物などを用いて大量
に調製することを可能にした。しかしながら、細菌等を
宿主とした組換え異種タンパク質生産系において生産さ
れた異種タンパク質が本来の生理活性を持たない、とい
う事態がしばしば起こることが大きな問題となってい
る。このことの大きな原因のひとつに、タンパク質の一
次構造（アミノ酸配列）は、組換えＤＮＡの塩基配列に
由来する正しい構造（配列）となっているものの、その
立体構造が正しい構造をとっていないことがあげられ
る。タンパク質の立体構造の形成・保持、および、それ
に伴う生理活性の発現にきわめて重要な役割を果してい
るのは、タンパク質分子内および分子間のジスルフィド
結合である。このジスルフィド結合に不備があるため、
すなわち、ジスルフィド結合を欠いていたり、形成され
たジスルフィド結合の位置が本来のあるべき位置とは異
なっているために、タンパク質が正しい立体構造を取れ
ず、したがって、そのタンパク質が本来持つはずの生理
活性の低下、もしくは、消失が起こることが知られてい
る。

【０００３】ジスルフィド結合の形成・開裂は、２つの
システイン残基の単純な酸化還元反応であり、適当な酸
化還元条件の下でどちら向きにも非酵素的に起こすこと
ができる。したがって、上記のような生理活性を持たな
いタンパク質のジスルフィド結合の不備を修正すること
により生理活性を持つタンパク質に変換する方法とし
て、化学的な酸化還元反応を利用する方法も知られてい
る。しかしながら、こうした方法では、組換えＤＮＡ技
術により生産されたタンパク質、中でも、多数のジスル
フィド結合を持つタンパク質に対しては、実用的な速度
と効率でジスルフィド結合を形成させることは不可能で
ある。そのため、当業者において広く試みられている方
法は、ＰＤＩ（プロテインジスルフィドイソメラーゼ）
やＤｓｂＡなどのジスルフィド酸化還元活性を有するタ
ンパク質を作用させる方法（特開昭６３−２９４７９６
号、特開平５−３３６９８６号等）である。さらにま
た、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子を宿主生物に導入し、目的とする組換え
タンパク質とジスルフィド酸化還元活性を有するタンパ
ク質を一緒に発現させて正しいジスルフィド結合を有す
るタンパク質を製造する方法も知られている。（特開２
０００−８３６７０号、特表２００１−５１４４９０号
等）

【０００４】ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパ
ク質として既に知られている主要なものとしては、真核
細胞生物のプロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤ
Ｉ）（ヒト由来（Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ ｅｔ ａ
ｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．６．６４３〜６４９、（１９８
７）；特許２８０３０８９号）、ラット由来（Ｅｄｍａ
ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１７， ２６７
〜２７０，（１９８５））、及び、酵母由来（Ｍｉｚｕ
ｎａｇａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０８、８４６〜８
５１，（１９９０）；特開平４−１９７１７６）等）、
大腸菌のＤｓｂＡ（ＥＭＢＯＪ，１１，５５〜６２，
（１９９２）；Ｃｅｌｌ，６７，５８１〜５８９、（１
９９１））を始めとするＤｓｂファミリーなどを挙げる
ことができる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】以上のように、ＰＤＩ
を始めとするジスルフィド酸化還元活性を有するタンパ
ク質は、組換えＤＮＡ技術により生産されたタンパク質
のジスルフィド結合の修正、および、そのことによる非
活性型タンパク質の活性型タンパク質への変換に利用さ
れている。しかしながら、ジスルフィド酸化還元活性を
有するタンパク質には、それぞれ特異性があるために、
宿主や目的とするタンパク質などが異なる条件のもとで
は、既知のジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク
質のいずれを用いても、ジスルフィド結合の修正がうま
くいかず、充分な活性を持つタンパク質が得られない場
合がしばしばある。

【０００６】そのため、宿主や目的とするタンパク質な
どが異なる様々な条件のもとでも、ジスルフィド酸化還
元活性を有するタンパク質を作用させることによりジス
ルフィド結合の修正を可能にするため、新規なジスルフ
ィド酸化還元活性を有するクンパク質の提供が必要とさ
れていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記した当業
界の要請に応える目的でなされたものであって、本発明
者らは各方面から検討の結果、各種のゲノムシーケンス
データが公開されている点に着目した。

【０００８】近年、様々なゲノム解析プロジェクトが進
展し、その結果、様々な生物種のゲノムシーケンスデー
タが明らかにされてきている。そのことにより、ゲノム
解析プロジェクトの成果として公開された様々な生物種
のゲノムシーケンスデータ、特にゲノムシーケンスデー
タから得られた遺伝子（タンパク質コード領域（ＣＤ
Ｓ））の塩基配列データを翻訳したアミノ酸配列データ
の中から、特定の機能を有すると推定される遺伝子、も
しくはタンパク質を見出すこととした。

【０００９】そこで、本発明者らは、特に枯草菌（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に着目し、枯草菌１
６８株のゲノムシーケンスデータ（Ｆ．Ｋｕｎｓｔ ｅ
ｔａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９〜２５６
（１９９７））から得られた遺伝子（タンパク質コード
領域（ＣＤＳ））の塩基配列を翻訳したアミノ酸配列デ
ータ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌ
ｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ
／）において公開されている。）から、ジスルフィド酸
化還元活性を有する可能性があるタンパク質を見出すこ
とにした。そして、その結果、ＹｎｅＮ（ＳｕｂｔｉＬ
ｉｓｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＢＧ１３
４５１）とＹｋｖＶ（ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ Ａｃｃｅｓ
ｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：ＢＧ１３３２４）の２種類のタ
ンパク質を、ジスルフィド酸化還元活性を有する可能性
があるタンパク質として見出すのに成功した。

【００１０】すなわち本発明者らは、枯草菌のゲノムデ
ータベースから取り出した情報をもとに、ジスルフィド
酸化還元活性を有するタンパク質との関連が推測される
遺伝子ＹｎｅＮ、ＹｋｖＶを見出し、これらをＰＣＲ法
にて増幅して、ブレビバチルス属細菌発現分泌ベクター
に組み込み、形質転換した。そして形質転換体を培養
し、得られたタンパク質について、インシュリンを用い
て活性測定を行った結果、これらの遺伝子産物であるタ
ンパク質ＹｎｅＮ、ＹｋｖＶは、いずれもチオール−ジ
スルフィド オキシドレダクターゼ（ｔｈｉｏｌ−ｄｉ
ｓｕｌｆｉｄｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）活性を
示すことを確認し、これらの遺伝子がブレビバチルス属
細菌において正しく分泌発現することを確認し、本発明
を完成した。

【００１１】すなわち本発明は、タンパク質ＹｎｅＮ、
ＹｋｖＶがジスルフィド酸化還元活性という新しい機能
を有することを新規に見出し、それを確認、実証し、こ
の新規有用知見に基づき更に検討、研究の結果、遂に完
成されたものである。以下、本発明について詳述する。

【００１２】

【発明の実施の形態】既述したように、タンパク質Ｙｎ
ｅＮ及びＹｋｖＶのアミノ酸配列自体、および、該タン
パク質遺伝子の塩基配列自体は、Ｓｕｂｔｉｌｉｓｔ
（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．
ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／）においてＹｎｅＮ（Ｓｕ
ｂｔｉＬｉｓｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：
ＢＧ１３４５１）、および、ＹｋｖＶ（ＳｕｂｔｉＬｉ
ｓｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＢＧ１３３
２４）として公開されている。ＹｎｅＮのアミノ酸配列
を配列番号１に、ＹｎｅＮをコードするＤＮＡの塩基配
列を配列番号２に、また、ＹｋｖＶのアミノ酸配列を配
列番号３に、ＹｋｖＶをコードするＤＮＡの塩基配列を
配列番号４にそれぞれ示す。なお、配列番号１、２、
３、４に示す配列は、それぞれ図１、２、３、４にも示
した。

【００１３】そして本発明は、これらのアミノ酸配列を
有するタンパク質ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶにジスルフィ
ド酸化還元活性という新しい機能があることをはじめて
見出した点に特徴を有するものである。さらに、配列番
号１および３に記載のアミノ酸配列の１または複数のア
ミノ酸残基が置換、欠失、付加、および／または挿入さ
れたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもジスル
フィド酸化還元活性を有する限り、全て本発明のジスル
フィド酸化還元活性を有するタンパク質ＹｎｅＮおよび
ＹｋｖＶに包含される。したがって、本発明に係るジス
ルフィド酸化還元活性を有するタンパク質には、チオー
ル−ジスルフィド オキシドレダクターゼも包含され
る。

【００１４】さらに、本発明のタンパク質ＹｎｅＮおよ
びＹｋｖＶは、当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ技
術を適宜、選訳し、組み合わせて用いることにより得る
ことができる。

【００１５】枯草菌１６８株（Ｍａｒｂｕｒｇ１６８）
からのＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ遣伝子のクローニング
は、当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を適宜選
択し用いることにより行うことができる。たとえばモレ
キュラークローニング；ア ラボラトリーマニュアル第
２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８９））に記載の方
法を用いて行うことができる。

【００１６】ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ遺伝子の発現に用
いる宿主は、ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ遺伝子の発現が可
能なものであるならば特に限定されない。宿主として
は、細菌や酵母、カビ、動物細胞などのいずれであって
も利用可能であるが、好ましくは細菌であり、より好ま
しくはブレビバチルス属細菌である。特に好ましい宿主
としてブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacil
lus chosinensis）ＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０
８７）や、その変異株で実施例で使用したブレビバチル
ス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６２３）を挙げることができる。

【００１７】ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ遺伝子の発現に用
いるベクターもＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ遺伝子の発規が
可能なものであるならば特に限定されないが、ブレビバ
チルス属細菌を宿主とする場合には、特に好ましいベク
ターとしてｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８
号）やｐＮＣＭＯ２（Ｋ．Ｙａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２３，１１３〜１２０
（２００１））を挙げることができる。

【００１８】さらに、ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶを保持す
るベクターおよび形質転換体の作製も、当業者に公知の
組換えＤＮＡ技術を適宜選択し用いる用いることにより
行うことができる。たとえばモレキュラークローニン
グ：ア ラボラトリーマニュアル第２版（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））に記載の方法を用いて行う
ことができる。ブレビバチルス属細菌を宿主とする場合
には、特に好ましい形質転換方法としてエレクトロポレ
ーション法（Ｔａｋａｇｉ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ａｇ
ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９〜３１
００（１９８９））を挙げることができる。

【００１９】ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ遺伝子の発現に用
いる宿主の培養方法も、ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ遺伝子
の発現が可能なものであるならば特に限定されないが、
ブレビバチルス属細菌を宿主として使用する場合には、
特に好ましい条件としてＴＭＮ培地、３０℃、２日間を
挙げることができる。

【００２０】さらに、発現されたＹｎｅＮおよびＹｋｖ
Ｖの単離、精製を行う場合には、当業者に公知の方法を
適宜、単独または組み合わせて用いることにより行うこ
とができる。たとえば、硫安塩析法、有機溶煤沈澱法、
イオン交換体などによる吸着処理法、イオン交換クロマ
トグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、電気泳動法などを適宜、単独
または組み合わせて用いることにより行うことができ
る。

【００２１】本発明において、枯草菌ＹｋｖＶ、Ｙｎｅ
Ｎ遺伝子の塩基配列はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓデータベー
スにより公開されており、プライマーもその配列が後記
するように開示されているので、枯草菌から染色体ＤＮ
Ａを採取し、これをテンプレートとしてＰＣＲを行うこ
とにより当業者であれば何人もこれらの遺伝子を増幅す
ることができる。また、得られたＰＣＲ増幅産物を結合
する発現ベクターも既に明らかにされているので、発現
プラスミドの作製も適宜実施可能である。

【００２２】そのうえ宿主菌ブレビバチルス・チョウシ
ネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５、および同ＨＰＤ３１は、い
ずれも、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３、ＦＥＲＭ ＢＰ−
１０８７として既に寄託されているので、上記発現プラ
スミドをこれらの宿主に導入して形質転換することも、
当業者であれば通常実施できることである。そして、得
られた形質転換体は、上記したところにしたがって、こ
れを培養し、培養物を処理することにより、タンパク質
ＹｎｅＮ、ＹｋｖＶを容易に取得することができ、本明
細書の記載によれば、本発明を容易に実施することがで
きる。

【００２３】タンパク質ＹｎｅＮ、ＹｋｖＶは、後記す
る実施例からも明らかなように、ジスルフィド酸化還元
活性という新規にして有用な機能を有することを、本発
明者らが、今回、はじめて見出したものであり、本タン
パク質のチオール−ジスルフィド（ＳＨ−Ｓ・Ｓ）酸化
還元活性を利用して、ジスルフィド結合の形成・開裂を
行うことにより、各種生理活性物質の活性化あるいは不
活性化を自由にコントロールすることができる。

【００２４】例えば、ジスルフィド結合は、ペプチド鎖
の三次元結合、つまりタンパク質の立体構造に深く関与
していることが多く、ジスルフィド結合の形成・開裂を
コントロールすることにより、生理活性物質を活性化さ
せたり、ある時期まであるいはある生体部位に到達する
までは、安定性の高い不活性体としておき、必要な場合
にこれを活性化して本来の所望する作用を行わせたりす
ることが自由にできることとなり、インシュリンやＨ鎖
とＬ鎖の間にＳＳ結合を有する免疫グロブリンその他各
種の生理活性物質の活性化及び／又は不活性化が可能と
なる。もちろん、これらのタンパク質は、チオール−ジ
スルフィド オキシドレダクターゼ酵素又は同酵素活性
を有するタンパク質自体として、研究用試薬、工業用酵
素剤等としても利用できることはいうまでもない。

【００２５】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれらのみに限定されるものではな
い。

【００２６】

【実施例１】Ｓｕｂｔｉｌｉｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅ
ｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉ
ｓｔ／）において公開されている、枯草菌１６８株（Ｍ
ａｒｂｕｒｇ １６８）のゲノムに含まれる約４，００
０の遺伝子（タンパク質コード領域（ＣＤＳ））の塩基
配列データ（Ｆ．Ｋｕｎｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ
ｕｒｅ、３９０、２４９−２５６（１９９７））を翻訳
したアミノ酸配列データに対して、アミノ酸配列のＮ末
端にシグナル配列と思われるアミノ酸配列を持つこと等
を指標としてタンパク質（アミノ酸配列データ）の検索
を鋭意行った。その結果、１７０アミノ残基のＹｎｅＮ
（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂ
ｅｒ：ＢＧ１３４５１）と１６５アミノ酸残基のＹｋｖ
Ｖ（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｔ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍ
ｂｅｒ：ＢＧ１３３２４）の２種類のタンパク質を、ジ
スルフィド酸化還元活性を有する可能性があるタンパク
質として見出した。

【００２７】これらのタンパク質の内、ＹｎｅＮ（配列
番号１：図１）では、１６番目のグリシン以降がＹｎｅ
Ｎの成熟体であり、１〜１５位が分泌シグナル配列と推
定された。しかしながら、これは現時点における推定で
あって、実際にＹｎｅＮタンパク質が枯草菌において分
泌タンパク質であるのか、さらに、分泌されるとして、
その分泌シグナル切断箇所がグリシンの前であるのか、
という点に関しては不明である。一方、ＹｋｖＶ（配列
番号２：図２）では１〜２６位を分泌シグナル配列と推
定した。ＹｋｖＶも枯草菌の菌体内において、どのよう
なシグナル切断を受けるのか不明であるが、第一に、グ
ラム陽性菌の分泌シグナル配列は通例２０から３０個の
アミノ酸から成るが、グルタミン酸の前で切れるとする
とアミノ酸数は２６個となり、適正値となる。第二に、
シグナル切断はアラニン−Ｘ−アラニンという配列の後
で起こる例が圧倒的に多いが、ＹｋｖＶの場合、グルタ
ミン酸はアラニン−グルタミン−アラニンの次に来るア
ミノ酸であることから１〜２６位が分泌シグナル配列で
あると推定した。これらは、いずれも、現時点において
は推定であって、その詳細は今後の研究にまたねばなら
ない。

【００２８】

【実施例２】ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ遺伝子のクローニ
ング

【００２９】（１）ＹｎｅＮ遺伝子のクローニングと発
現 実施例１で得られたＹｎｅＮ遺伝子の塩基配列を基に下
記の２本のプライマーＢｓｙｎｅＮ５ＰｓｔおよびＢｓ
ｙｎｅＮ３Ｋｐｎを作製し、枯草菌１６８株（Ｍａｒｂ
ｕｒｇ １６８）の染色体ＤＮＡをテンプレートとした
ＰＣＲを行い、ＹｎｅＮをコードする遺伝子を増幅し
た。なお、枯草菌１６８株は理化学研究所微生物系統保
存施設（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ
ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＪＣＭ）より入手したＪ
ＣＭ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＪＣＭ１４
６５を使用した。また、ＰＣＲは、９４℃で３０秒、５
７℃で１分、７２℃で１分３０秒のサイクルを３０回繰
り返すことにより行った。ＢｓｙｎｅＮ５Ｐｓｔ（ｆｏ
ｒｗａｒｄ）：５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＣ
ＧＧＧＡＴＧＧＡＡＴ−３’（配列番号５：図５） ＢｓｙｎｅＮ３Ｋｐｎ（ｂａｃｋｗａｒｄ）：５’−Ｇ
ＧＧＧＴＡＣＣＴＡＡＴＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴ−
３’（配列番号６：図６） また、発現ベクターにクローニングを行うために、Ｂｓ
ｙｎｅＮ５ＰｓｔプライマーにはＰｓｔＩサイト（ＣＴ
ＧＣＡＧ）を、ＢｓｙｎｅＮ３ＫｐｎプライマーにはＫ
ｐｎＩサイト（ＧＧＴＡＣＣ）を設けた。

【００３０】さらに上記で得たＰＣＲ増幅産物をＰｓｔ
ＩとＫｐｎＩで消化した後、同じ酵素で処理した発現ベ
クターｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）に
結合し、発現プラスミドｐＮＹｎｅＮを得た。このｐＮ
ＹｎｅＮにおいてＹｎｅＮは、アミノ酸配列１６位のグ
リシン以降がアラニンを介してｐＮＹ３０１が含有する
ブレビス細胞壁タンパク質の分泌シグナル配列につなが
ることになる。したがってＨＰＤ３１−Ｓ５株から分泌
されたＹｎｅＮのＮ末端アミノ酸はアラニンになると予
想される。

【００３１】構築したｐＮＹｎｅＮは、エレクトロポレ
ーション法（Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．， Ａｇ
ｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，３０９９〜３１
００（１９８９））によりブレビバチルス・チョウシネ
ンシスＨＰＤ３１−Ｓ５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２
３）に導入した。

【００３２】さらに、この形質転換体を３０℃下、ＴＭ
Ｎ培地３ｍｌ中で２日間培養した。培養終了後、培養液
を室温で遠心（８０００回転、３０分）し、上清１０μ
ｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結
果（図９）に示されているとおり、ＹｎｅＮの１６位以
降のアミノ酸残基の分子量約１７ｋＤａに相当する位置
に染色バンドが存在しておりＹｎｅＮ遺伝子の発現、お
よび分泌生産が確認された。

【００３３】（２）ＹｋｖＶ遺伝子のクローニングと発
現 実施例１で得られたＹｋｖＶ遺伝子の塩基配列をもとに
下記の２本のプライマーＭ１およびＭ２を作製し、枯草
菌１６８株染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを
行った。なお、ＰＣＲは、９５℃で１分、５４℃で１
分、７２℃で１分のサイクルを２６回繰り返すことによ
り行った。 Ｍ１（ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧ
ＣＴＩＴＣＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣ
ＴＧＴＴＣＣＣＧＣＴ−３’（配列番号７：図７） Ｍ２（ｂａｃｋｗａｒｄ）：５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴ
ＴＴＣＴＴＣＣＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＧＴ
ＴＣＣＧＣ−３’ （配列番号８：図８） また、Ｍ１プライマーには、発現ベクターにクローニン
グを行うためにＮｃｏＩサイト（ＣＣＡＴＧＧ）を設
け、さらにその後に８塩基（ＣＴＴＴＣＧＣＴ）ベクタ
ー上の配列が続いた後に、ＹｋｖＶの成熱体部分に相当
すると推定した塩基配列がつながるように設計した。一
方、Ｍ２プライマーには、やはり発現ベクターにクロー
ニングを行うためにＨｉｎｄIIIサイト（ＡＡＧＣＴ
Ｔ）を設けた。

【００３４】さらに、上記で得たＰＣＲ産物をＮｃｏＩ
とＨｉｎｄIIIで消化後、同じ酵素で処理した発現ベク
ターｐＮＣＭＯ２（Ｋ．Ｙａｓｈｉｒｏ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，２３，１１３〜１２０
（２００１））に結合し、発現プラスミドｐＮＣＹｋｖ
Ｖを得た。このｐＮＣＹｋｖＶにおいて、ＹｋｖＶのア
ミノ酸配列の２７位のグルタミン酸以降が、ｐＮＣＭＯ
２が含有するブレビス細胞壁タンパク質の分泌シグナル
配列につながることになる。したがってＨＰＤ３１−Ｓ
５株から分泌されたＹｋｖＶタンパク質は、グルタミン
酸の前でブレビス細胞壁タンパク質の分泌シグナル配列
が切り離されるため、分泌生産されたＹｋｖＶのＮ末端
はグルタミン酸になると予想される。さらに、ｐＮＣＹ
ｋｖＶはエレクトロポレーション法によってブレビバチ
ルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５株（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６２３）に導入した。

【００３５】さらに、この発現プラスミドｐＮＣＹｋｖ
Ｖを導入した形質転換体を２日間、３０℃下、ＴＭＮ培
地３ｍｌ中で培養した。培養終了後、培養液を室温で遠
心（８０００回転、３０分）し、上清１０μｌをＳＤＳ
−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（図１
０）に示されているとおり、ＹｋｖＶの２７位以降のア
ミノ酸残基の分子量約１５ｋＤａに相当する位置に染色
バンドが存在しており、ＹｋｖＶ遺伝子の発現、および
分泌生産が確認された。

【００３６】

【実施例３】ＹｎｅＮ、ＹｋｖＶの活性測定 さらに以下の手順に従って、インシュリンのシステイン
残基の酸化還元によるジスルフィド結合形成・開裂反応
に、実施例１で得た組換えＹｎｅＮおよびＹｋｖＶを、
それぞれ用いることにより、ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶの
ジスルフィド酸化還元活性を評価した。

【００３７】まずＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ、それぞれの
酵素標品の調製は以下の手順で行った。ＹｎｅＮおよび
ＹｋｖＶ、それぞれのタンパク質を発現するブレビバチ
ルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ５株の形質転換
体を５ｍｌＴＭＮ、３０℃、２日間という条件下で培養
した。培養終了後、培養液を室温で遠心（８０００回
転、３０分）し、その上清をＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ、
それぞれの酵素標品とした。

【００３８】酵素反応を起こさせるインシュリンを溶解
させた基質溶液は以下のように調製した。まず２５ｍｇ
のインシュリンを２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０に溶かし、次いで１規定ＨＣｌを加えて
ｐＨ２〜３とした後、直ちに１規定ＮａＯＨを加えてｐ
Ｈを元の８．０に戻した。その後、水を加えて全量を
２．５ｍｌとし、１０倍濃度のストック溶液とした。活
性測定の際はこのストック溶液を２ｍＭ ＥＤＴＡを含
む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈
して用いた。上記で調製したインシュリンを溶解させた
基質溶液５００μｌを分光光度計用ガラスキュベットに
入れ、さらに上記で得たＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ、それ
ぞれの酵素標品１００μｌと０．１Ｍ ＤＴＴ５μｌを
加えて２５℃下で反応させた。反応の経過はＯ．Ｄ．６
５０での、反応液の濁度変化の観測によって追跡した。
なお、対照としてブレビバチルス・チョウシネンシスＨ
ＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＹ３０１をＴＭＮ培地を用いて３
０℃で２日間培養した培養上清を用いた。

【００３９】そして、測定結果（図１１）が示すよう
に、ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ、それぞれの添加により反
応液の濁度の上昇が認められた。このことはＹｎｅＮお
よびＹｋｖＶ、それぞれの添加によりインシュリン分子
内、もしくはインシュリン分子間にジスルフィド結合が
形成され、その結果、インシュリン分子同士による凝集
が生じたためであると考えられる。以上により、本発明
のタンパク質ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶは、ともにジスル
フィド酸化還元活性を有することが実証された。

【００４０】

【発明の効果】本発明は、枯草菌由来のジスルフィド酸
化還元活性を有するタンパク質ＹｎｅＮおよびＹｋｖＶ
を提供する。本発明のタンパク質ＹｎｅＮおよびＹｋｖ
Ｖは、ジスルフィド酸化還元活性を有し、したがって、
生理活性を示さないタンパク質に作用して、ジスルフィ
ド結合を修正することにより、生理活性を有するタンパ
ク質に変換することに利用可能であると期待される。

【００４１】

【配列表】 <110> Higeta Shoyu Co., Ltd. <120> Novel Disulfide Oxidoreductase <130> 6542 <141> 2001-12-4 <160> 8 <210> 1 <211> 170 <212> PRT <213> Bucillus subtilis <400> 1 Met Leu Lys Lys Trp Leu Ala Gly Ile Leu Leu Ile Met Leu Val Gly 5 10 15 Tyr Thr Gly Trp Asn Leu Tyr Gln Thr Tyr Ser Lys Lys Glu Val Gly 20 25 30 Ile Gln Glu Gly Gln Gln Ala Prc Asp Phe Ser Leu Lys Thr Leu Ser 35 40 45 Gly Glu Lys Ser Ser Leu Gln Asp Ala Lys Gly Lys Lys Val Leu Leu 50 55 60 Asn Phe Trp Ala Thr Trp Cys Lys Pro Cys Arg Gln Glu Met Pro Ala 65 70 75 80 Met Glu Lys Leu Gln Lys Glu Tyr Ala Asp Lys Leu Ala Val Val Ala 85 90 95 Val Asn Phe Thr Ser Ala Glu Lys Ser Glu Lys Gln Val Arg Ala Phe 100 105 110 Ala Asp Thr Tyr Asp Leu Thr Phe Pro Ile Leu Ile Asp Lys Lys Gly 115 120 125 Ile Asn Ala Asp Tyr Asn Val Met Ser Tyr Pro Thr Thr Tyr Ile Leu 130 135 140 Asp Glu Lys Gly Val Ile Gln Asp Ile His Val Gly Thr Met Thr Lys 145 150 155 160 Lys Glu Met Glu Gln Lys Leu Asp Leu Asp 165 170 <210> 2 <211> 510 <212> DNA <213> Bucillus subtilis <400> 2 atgctgaaaa aatggctcgc agggatcctg cttatcatgc tagtcggtta tacgggatgg 60 aatttatatc aaacatacag caaaaaagaa gtcggaattc aagaggggca acaagcacct 120 gatttttctt tgaaaacgct atcaggagag aaaagctctt tacaggatgc aaaaggcaaa 180 aaagtgctgc tcaatttttg ggcaacttgg tgtaagccgt gccgtcagga aatgcctgcg 240 atggaaaagc tgcaaaaaga gtacgccgac aaacttgcgg ttgttgcggt aaatttcact 300 tcagctgaga aaagtgagaa acaggtccga gcgtttgctg atacttatga cttaacgttc 360 cccattctga ttgataaaaa agggatcaat gctgactata acgtgatgtc atatccaacg 420 acatatatct tagatgaaaa aggtgttatc caagacatac atgttggcac catgacaaaa 480 aaagaaatgg aacaaaaact ggatcttgat 510 <210> 3 <211> 165 <212> PRT <213> Bucillus subtilis <400> 3 Met Leu Thr Lys Arg Leu Leu Thr Ile Tyr Ile Met Leu Leu Gly Leu 5 10 15 Ile Ala Trp Phe Pro Gly Ala Ala Gln Ala Glu Glu Lys Gln Pro Ala 20 25 30 Val Pro Ala Val Phe Leu Met Lys Thr Ile Glu Gly Glu Asp Ile Ser 35 40 45 Ile Pro Asn Lys Gly Gln Lys Thr Ile Leu His Phe Trp Thr Ser Trp 50 55 60 Cys Pro Pro Cys Lys Lys Glu Leu Pro Gln Phe Gln Ser Phe Tyr Asp 65 70 75 80 Ala His Pro Ser Asp Ser Val Lys Leu Val Thr Val Asn Leu Val Asn 85 90 95 Ser Glu Gln Asn Gln Gln Val Val Glu Asp Phe Ile Lys Ala Asn Lys 100 105 110 Leu Thr Phe Pro Ile Val Leu Asp Ser Lys Gly Glu Leu Met Lys Glu 115 120 125 Tyr His Ile Ile Thr Ile Pro Thr Ser Phe Leu Leu Asn Glu Lys Gly 130 135 140 Glu Ile Glu Lys Thr Lys Ile Gly Pro Met Thr Ala Glu Gln Leu Lys 145 150 155 160 Glu Trp Thr Glu Glu 165 <210> 4 <211> 495 <212> DNA <213> Bucillus subtilis <400> 4 atgttgacga agcgcttgct tactatatac attatgttat tagggttgat tgcatggttt 60 ccaggtgcgg cacaagctga ggaaaaacag cctgctgttc ccgctgtttt tcttatgaaa 120 acgatagaag gggaggacat ctcgattccg aataaagggc aaaaaacaat tctccatttt 180 tggacgtcat ggtgcccgcc ctgcaaaaag gagcttccac agtttcaatc gttttatgat 240 gcccatccat ccgacagtgt aaagctggta acggtgaatt tagtgaattc ggaacaaaat 300 cagcaagtcg ttgaagactt tattaaagca aacaagctga cgtttccgat tgtccttgac 360 tcaaaagggg aattgatgaa ggagtatcat atcatcacga tcccaacatc atttttgctg 420 aatgaaaagg gagaaattga aaaaacaaaa attggcccga tgacagcgga acaactgaag 480 gaatggacgg aagaa 495 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 ggctgcaggt tatacgggat ggaat 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ggggtaccta atcaagatcc agttt 25 <210> 7 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 catgccatgg ctttcgctga ggaaaaacag cctgctgttc ccgct 45 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 cccaagcttt tcttccgtcc attccttcag ttgttccgc 39

【図面の簡単な説明】

【図１】タンパク質ＹｎｅＮのアミノ酸配列を示す。

【図２】タンパク質ＹｎｅＮのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子ｙｎｅＮの塩基配列を示す。

【図３】タンパク質ＹｋｖＶのアミノ酸配列を示す。

【図４】タンパク質ＹｋｖＶのアミノ酸配列をコードす
る遺伝子ｙｋｖＶの塩基配列を示す。

【図５】プライマーＢｓｙｎｅＮ５Ｐｓｔを示す。

【図６】プライマーＢｓｙｎｅＮ３Ｋｐｎを示す。

【図７】プライマーＭ１（ｆｏｒｗａｒｄ）を示す。

【図８】プライマーＭ２（ｂａｃｋｗａｒｄ）を示す。

【図９】Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１−
Ｓ５株を宿主としたＹｎｅＮの分泌発現を示す電気泳動
図（写真）であって、発現プラスミドｐＮＹｎｅＮを含
む形質転換体を３ｍｌＴＭＮ培地で２日間培養後遠心
し、上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。１，ｐ
ＮＹ３０１（ネガティブコントロール）；２〜１０，ｐ
ＮＹｎｅＮ矢印は発現したＹｎｅＮを示す（図面代用写
真）。

【図１０】Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ ＨＰＤ３１
−Ｓ５株を宿主としたＹｋｖＶの発現を示す電気泳動図
（写真）であって、発現プラスミドｐＮＣＹｋｖＮを含
む形質転換体を３ｍｌＴＭＮ培地で２日間培養後遠心
し、上清１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。Ｍ，分
子量マーカー；Ｃ，ｐＮＣＭＯ２（ネガティブコントロ
ール）（図面代用写真）。

【図１１】反応液の濁度測定結果を示す。

フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA08 CA03 CA05 DA05 HA01 4B050 CC01 CC03 DD02 LL05

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配
   列を有し、かつジスルフィド酸化還元活性を有するタン
   パク質であるＹｎｅＮ。 （ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有する
   タンパク質。 （ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列におい
   て、１または複数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、
   もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配
   列を有し、かつ、ジスルフィド酸化還元活性を有するタ
   ンパク質であるＹｋｖＶ。 （ａ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有する
   タンパク質。 （ｂ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列におい
   て、１または複数のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、
   もしくは挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
3. 【請求項３】 枯草菌由来の請求項１または２に記載の
   ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１から３のいずれかに記載のタン
   パク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤ
   ＮＡ断片を含むベクターにより形質転換されたブレビバ
   チルス属細菌を用いることを特徴とする、請求項１から
   ３のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。