JP5763920B2

JP5763920B2 - 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法

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Publication number: JP5763920B2
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Inventors: 修小田原; 輝明武居
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Description

本発明は、組換えブレビバチルス属細菌を使用した、組換え蛋白質の製造方法に関する。

ブレビバチルス属細菌を宿主とした組換え蛋白質の生産は種々の異種蛋白質の製造に用いられている（非特許文献１）。菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量の向上および培養時の菌体の高密度化のために種々の培養条件の検討が行われており、その結果、培地の主な炭素源として、グルコース、ショ糖、グリセリン等が通常使用されている。しかしグルコースと同じ単糖でありながら、分泌生産量の向上および菌体の高密度化の為にフルクトースが好適な炭素源として使用されることはこれまで知られていない。

これは、フルクトースがグルコースと比較してアミノ酸共存下での渇変速度が早い（非特許文献２）ため、培養上清が着色しやすいことが原因であると考えられる。特に分泌発現系であるブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の生産では、そのフルクトースに由来する着色物質が発現した組換え蛋白質に結合し、着色物が結合した蛋白質は目的物由来不純物として精製工程で除去する必要がある。これら不純物の発生は、目的物の収率を大きく下げる結果となると共に、その近似する性質により除去が困難となるため、フルクトースの主たる炭素源としての使用を妨げているものと推察される。

このように、ブレビバチルス属細菌を宿主とした組換え蛋白質の生産は種々の培養条件検討行われているにも関わらず、従来の条件では、発現させる組換え蛋白質によっては、高分泌発現に至らず、他の宿主ベクター系に対する優位性を見出すことができない場合があった。

ところで、遺伝子組換え技術を用いて生産される蛋白質医薬品の内、抗体医薬品は急速にその需要を拡大している。抗体医薬品は、約１５０ｋＤａの糖蛋白質として、主にＣＨＯ培養細胞を用いて生産される。

抗体医薬品の製造には、抗体結合能を有するアフィニティークロマトグラフィーが一般に使用されており、最も良く利用されているのが、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬなどの蛋白質を適当な樹脂に固定化した担体によるクロマトグラフィーである。これらの精製用担体のリガンドとして用いる蛋白質の中で特によく利用されているのがプロテインＡである。

一方で、蛋白質をリガンドとするアフィニティー担体は、医薬品製造用資材として高い品質が求められている。蛋白質リガンド自体も、蛋白質医薬品と同等レベルの品質を要求され、それらを原料とするアフィニティー担体の安価供給ができない状況となっている。これらアフィニティー担体が抗体医薬品製造コストに占める割合は大きく、抗体医薬品のコスト低減に大きな足かせとなっている。よって、これらリガンド蛋白質を高品質で安価に調達する方法が望まれていた。

本発明者らは、これまでに、プロテインＡの部分配列を安定、大量に生産する技術を確立するため、ブレビバチルス属細菌を宿主に使い、プロテインＡの部分配列を効率良く培養液中へ大量に分泌発現、そして安定に蓄積させ、容易に高純度で分離回収できることを見いだしている（特許文献１）。

また、遺伝子組換え技術を用いて生産される組換え蛋白質の内、インスリン等の生理活性蛋白質もその需要を拡大している。そのような生理活性蛋白質の一つとしてネコプロインスリンが存在する。これまで精製されたネコプロインスリンは市場に出回っておらず、ネコの糖尿病診断時におけるプロインスリン測定の信頼性が低く、ネコの糖尿病の早期発見を妨げてきた。また、糖尿病の治療薬としても他種のインスリンが使用されており、ネコのインスリンの原料としてもネコプロインスリンの工業的製法の開発が望まれてきた。そこで、近年、ネコプロインスリンの製法として、大腸菌でネコプロインスリンを発現する技術が構築されたが、その培養の際に大腸菌内で封入体を形成している（非特許文献３）。培養の際に封入体を形成すると精製工程への負荷が大きくなり、その結果製品の高価格化へと繋がる。そのため、分泌発現系でのネコプロインスリンの経済的な製造方法の実現が強く望まれている。

ＷＯ２００６／００４０６７

蛋白質核酸酵素 Feb;37(3 Suppl):258-68, (1992) 「食品の変色とその化学」p248-249,(1967) ,光琳書院(東京) Domestic Animal Endocrinology, 30:28-37, (2006)

本発明は組換えブレビバチルス属細菌を用いて、組換え蛋白質を製造する際に、従来の技術より菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量の向上および培養時の菌体の高密度化を達成し、より安価に組換え蛋白質を調製することのできる、工業化規模にスケールアップ可能なブレビバチルス属細菌の新規な培養条件の提供を課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、驚くべきことに、炭素源としてこれまで褐変のしやすさから、使用が避けられてきたフルクトースを用いて培養をおこなうことで、菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量が向上し、培養時の菌体も高密度化することも見いだし、本発明を完成した。

即ち、本発明が提供するのは、組換えブレビバチルス属細菌を用いて、組換え蛋白質を製造する際に、炭素源としてフルクトースを用いて培養することを特徴とする、組換え蛋白質の製造方法である。

本発明によれば、組換えブレビバチルス属細菌を用いた組換え淡白質の製造において、菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量が向上し、培養時の菌体も高密度化し、結果、従来の３倍以上の組換え蛋白質の生産性を達成することができる。

本発明の実施例２に係るプロテインＡの部分配列（ＳＰＡ’）発現ベクター（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）を示す図である。本発明の実施例２に係るプロテインＡ（ＳＰＡ’）の部分配列発現ベクター（Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０）のプロモーター配列、シャインダルガノ配列、シグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡ配列を示す図である。

本発明は、組換えブレビバチルス属細菌を用いて組換え蛋白質を生産する際に炭素源としてフルクトースを用いることで、高分泌発現、および／または、培養時の菌体の高密度化を達成するものである。以下、本発明について詳しく説明する。

組換えブレビバチルス属細菌とは、組換え蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを宿主であるブレビバチルス属細菌に形質転換して得られる細菌を指す。

組換え蛋白質をコードするＤＮＡとは、そのＤＮＡが有する塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、目的とする組換え蛋白質を構成するものであればいずれでも良い。そのようなＤＮＡ配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり（Nucleic acids Res., 1984, 12:4359）、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。

当該ＤＮＡ配列は、コドンが縮重コドンで置換されていても良く、ブレビバチルス属内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来のＤＮＡ配列と同一である必要性は無い。

発現ベクターは、組換え蛋白質またはその部分的配列をコードするＤＮＡ配列、およびその配列に作動可能に連結されたブレビバチルス属細菌で機能しうるプロモーターを含む。当該プロモーターは、ブレビバチルス属細菌で機能しうるものであればいかなるものでも良いが、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なプロモーターが好ましい。ブレビバチルス属細菌細胞壁蛋白質である、middle wall protein（ＭＷＰ）やouter wall protein（ＯＷＰ）(Udaka, S.ら. Method Enzymol., 1993, 217:23-33)、または、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１細胞壁蛋白質ＨＷＰ（J. Bacteriol., 1990, 172:1312-1320）をコードする遺伝子のプロモーターがより好ましい。

また、発現ベクターは、該プロモーターの下流に、ブレビバチルス属細菌で機能しうるシャインダルガノ配列（SD配列）及びシグナル配列をさらに含むのが好ましい。発現ベクターは、所望によりマーカー配列を含んでもよい。

上記のプロモーターに続くSD配列は、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属、コリネバクテリウム属等細菌由来でブレビバチルス属細菌内にて作動可能なSD配列が好ましく、前記ＭＷＰ、ＯＷＰ、または、ＨＷＰをコードする遺伝子の上流に存在するSD配列がより好ましい。

上記のSD配列に続く、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、以下の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡであれば特に制限は無く、ブレビバチルス・ブレビス内で翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。分泌シグナルペプチドとしては、例えば、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトミセス属（Streptomyces)、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等細菌由来で、ブレビバチルス属細菌内にて作動可能な分泌シグナルペプチドが好ましく、前記ＭＷＰ、ＯＷＰまたは、ＨＷＰの分泌シグナルペプチドがより好ましい。

また従来の分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列を改良したものでも構わない。例えば、ＭＷＰのシグナルペプチド、Met-Lys-Lys-Val-Val-Asn-Ser-Val-Leu-Ala-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Pro-Met-Ala-Phe-Ala（配列番号１）を、Met-Lys-Lys-Arg-Arg-Val-Val-Asn-Ser-Val-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Ala-Ser-Ala-Leu-Ala-Leu-Thr-Val-Ala-Pro-Met-Ala-Phe-Ala（配列番号２）の下線部のように塩基性や疎水性アミノ酸残基など付加した分泌シグナルペプチドでも構わない。また従来からブレビバチルス属の分泌蛋白質において使われている分泌シグナルペプチドでも構わない。さらに発現しようとする組換え蛋白質が本来有するシグナルペプチドでも構わない。

上記のプロモーター、SD配列、および分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、ブレビバチルス属細菌から得ることができる。好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス４７株（FERM BP-1223）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（FERM BP-2308）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５株（FERM BP-1664）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（FERM BP-1087）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株（FERM BP-6623）、またはブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（FERM BP-4573）の染色体ＤＮＡを鋳型として、公知のＰＣＲ法で特異的に増やすことにより取得できる。

発現ベクターにおいては、上記の任意のプロモーターと、上記の任意のSD配列、上記の任意のシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、該組換え蛋白質をコードするＤＮＡとが、ブレビバチルス属細菌内において作動可能に連結されていることが好ましい。

ベクターとしては、プラスミドベクターが好ましい。ブレビバチルス属細菌の遺伝子の発現に有用なプラスミドベクターとして具体的には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、またはｐＨＹ５００(特開平２−３１６８２号公報)、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１(J. Bacteriol. 1987. 1239-1245)、ｐＮＵ２００(鵜高重三、日本農芸化学会誌1987. 61: 669-676)、ｐＮＵ１００(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30:75-80)、ｐＮＵ２１１(J. Biochem., 1992, 112:488-491)、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５(特開平７−１７０９８４号公報)、ｐＮＨ３０１（Appl. Environ. Microbiol., 1992. 58:525-531.）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（J. Bacteriol., 1995. 177:745-749）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５(Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 42:358-363)、または大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）が使用可能であるが、これらに限定されることはない。

上記プラスミドベクターは文献情報を元に、当業者が作製することが可能である。また、ブレビバチルス属細菌で機能するプロモーターとSD配列と目的蛋白質をコードするＤＮＡとを含んだ発現ベクター、または、それらの各塩基配列を含む遺伝子断片を染色体中へ直接組み込み、発現させる方法（特開平９−１３５６９３号公報）を用いても良い。そのような方法は、枯草菌や酵母で既に用いられている公知な方法をブレビバチルス属細菌にも転用できる。

組換え蛋白質を分泌形態で生産する場合、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの上流にブレビバチルス属で機能するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを付加または連結することが好ましい。

形質転換体を得るために用いる宿主細胞としては、任意のブレビバチルス属細菌を使用し得る。ブレビバチルス属細菌は、限定されないが、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・ブレビス、ブレビバチルス・セントロポラス、ブレビバチルス・チョウシネンシス、ブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー等を含む。

好ましくは、ブレビバチルス属細菌が、ブレビバチルス・ブレビス４７株（FERM BP-1223）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（FERM BP-2308）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５株（FERM BP-1664）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（JCM8975）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（FERM BP-1087）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株（FERM BP-6623）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（FERM BP-4573）およびブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Takara社製）からなる群より選択される。特に上記のブレビバチルス・ブレビス４７株、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株やブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−Ｓ株が適している。

ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７５）は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒351-0198埼玉県和光市広沢2-1）より入手することが出来る。

生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株や高発現株のような変異株を使用しても良い。具体的に挙げれば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（FERM BP-4573）や、同様にブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来の芽胞形成能および、プロテアーゼ変異株である、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Takara社製）、および、ヒト唾液アミラーゼ高生産株として取得されたブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（FERM BP-2308）が使用できる。また前記ブレビバチルス属細菌群に含まれるいずれかの株の変異体を使用してもよい。

本発明において用いられるブレビバチルス属細菌の宿主細胞の形質転換は、公知のTakahashiらの方法（J. Bacteriol., 1983, 156:1130-1134）や、Takagiらの方法（Agric. Biol. Chem., 1989, 53:3099-3100）、またはOkamotoらの方法(Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, 61:202-203) により実施することができる。

ブレビバチルス属細菌を含めた微生物において異種蛋白質を高発現させた場合、正しくフォールディングされずに不活性型の蛋白質を形成することが多く、特にジスルフィド結合の多い蛋白質を高発現させた場合、細胞内外にて不溶化することも多い。一方で、目的蛋白質を発現させる際、シャペロン蛋白質やジスルフィド結合異性化酵素および／またはプロリン異性化酵素などを作用させることによって、目的蛋白質の不溶化や分泌効率の低下を抑えられることが知られている。広く試みられている方法は、ＰＤＩ（プロテインジスルフィドイソメラーゼ）および／またはＤｓｂＡなどのジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質を作用させる方法（特開昭６３−２９４７９６号公報、特開平５−３３６９８６号公報）である。

さらに、ジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を宿主生物に導入し、目的蛋白質とジスルフィド酸化還元活性を有する蛋白質とを同時に発現させて正しいジスルフィド結合を有する蛋白質を生産する方法も知られている（特開２０００−８３６７０号公報、特表２００１−５１４４９０号公報等）。

本発明による組換え蛋白質またはその部分配列からなる蛋白質の発現の場合も、過度な蛋白質合成が行われることによる宿主細胞への負担を軽減し、蛋白質分泌をスムーズに行わせるために、当該蛋白質発現の際、数種類のシャペロン蛋白質、ジスルフィド結合酸化還元酵素、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を同時発現させることも可能である。

例えば、ブレビバチルス属細菌において当該蛋白質発現時に、蛋白質のジスルフィド結合に関与し、プロテインジスルフィドイソメラーゼの類縁体と考えられている大腸菌のＤｓｂＡ（Cell, 1991, 67：582-589、EMBO. J., 1992, 11:57-62.）および／または、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥ（特開平９−１８０５５８号公報）などのシャペロン蛋白質を同時に発現させることもできる。その他、ポリペプチドの正確なジスルフィド結合に関与している酵素ＰＤＩ（特願２００１−５６７３６７号公報）、ジスルフィド酸化還元酵素（特開２００３−１６９６７５号公報）（Molecular Microbiology, 1993, 8:727-737）、および／またはジスルフィド異性化酵素のようなフォールディングを促進する酵素を当該蛋白質と同時に発現させ、更に分泌効率を向上させることもできる。

組換えブレビバチルス属細菌の培養に用いる培地は、組換え蛋白質を高効率、高収量で生産できるものであれば、フルクトースを含むことを除いて、他に特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、アミノ酸など公知の炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加してもよい。

また、必要であれば、大豆油、ラード油、界面活性剤等の消泡効果のある、または、細胞膜の物質透過性を変化させ、菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量の向上が期待される化合物を添加してもよい。界面活性剤の使用は、本発明の効果を増強する場合があり好ましい。界面活性剤としては、組換えブレビバチルス属細菌の生育および／または組換え蛋白質生産に悪影響を及ぼさない限り、特に制限されないが、好ましくはポリオキシアルキレングリコール系の界面活性剤である。

栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されても良い。

さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的蛋白質の分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加しても良い。プロテアーゼ阻害剤としては、例えば、Phenylmethane sulfonyl fluoride(ＰＭＳＦ)、Benzamidine、4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride(ＡＥＢＳＦ)、Antipain、Chymostatin、Leupeptin、Pepstatin A、Phosphoramidon、Aprotinin、Ethylenediaminetetra acetic acid(ＥＤＴＡ)、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤等を挙げることができる。

菌体当たりの組換え蛋白質の分泌生産量の向上と達成する、および／または培養時の菌体の高密度化を達成するために添加される、フルクトースの添加方法としては、初発濃度は１％以上、または、９％以下が好ましく、より好ましくは、初発１から９％である。また、更に好ましくは、培養途中にフルクトース濃度が９％以下、特には４％以下となるように適時フルクトースの追加を行う。フルクトースの追加方法には分割または連続添加があげられる。このような方法として、例えば培養開始後６時間目以降にフルクトースの追加を行う方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。

抗体結合性蛋白質とは、抗体によって抗原として認識される蛋白質をいうのではなく、抗体の抗原認識部位以外の部分（例えば、Ｆｃ部分）と結合可能な蛋白質である。抗体の抗原認識部位とは異なる部位と結合し得る蛋白質であれば、その構造は特に限定されない。このような蛋白質としては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬなどが挙げられる。

プロテインＡとは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウスによって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、約４２，０００の分子量を有するタンパク質である。その構造は７つの機能ドメイン（アミノ末端からシグナル配列Ｓ、イムノグロブリン結合ドメインＥ、イムノグロブリン結合ドメインＤ，イムノグロブリン結合ドメインＡ、イムノグロブリン結合ドメインＢ、イムノグロブリン結合ドメインＣ、スタフィロコッカス・アウレウス細菌細胞壁結合ドメインＸ）から構成されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80:697-701、Gene, 1987, 58:283-295、J. Bio. Chem., 1984, 259:1695-1702）。

このプロテインＡのイムノグロブリン結合ドメインに対する相対親和性は、ｐＨ、スタフィロコッカス・アウレウス菌株種（Infec. Immun., 1987, 55:843-847）、またイムノグロブリンのクラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）及びサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）などの多くの因子に依存することが知られ、特にイムノグロブリンのクラスではヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ４及びマウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ，マウスＩｇＧ３のＦｃ部分と強い結合を示す。

プロテインＧとは、グループＣ及びＧのストレプトコッカス属細菌（Streptococcus）によって生産される細胞壁蛋白質の１種であり、約５９，０００の分子量を有する蛋白質である。その構造はその構造は５つの機能ドメイン（アミノ末端から、シグナル配列ＳＳ、配列ＡおよびＢの繰り返しによるアルブミン結合ドメイン、配列ＣおよびＤの繰り返しによるイムノグロブリン結合ドメイン、細胞壁貫通ドメインＷ、細胞膜貫通ドメインＭ）から構成されている。

このプロテインＧのイムノグロブリン結合ドメインは、プロテインＡのそれと比較して、広範に哺乳動物ＩｇＧのＦｃ部分と結合を示す（J. Immunol., 1984, 133:969-974、J. Biol. Chem., 1991, 266:399-405）。

プロテインＬとは、ペプトストレプトコッカス・マグニウス（Peptostreptococcus magnus）によって生産される蛋白質の１種であり、約７９，０００の分子量を有する蛋白質である。その構造は６つの機能ドメイン（アミノ末端から、シグナル配列ＳＳ、アミノ末端ドメインＡ、イムノグロブリン結合ドメインＢの５回繰り返し、機能不明ドメインＣの２回繰り返し、細胞壁貫通ドメインＷ、細胞膜貫通ドメインＭ）から構成されている。

このプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインはイムノグロブリンのκ軽鎖と結合を示す。（J. Biol. Chem., 1989, 264:19740-19746、J. Biol. Chem., 1992, 267:12820-12825）。

プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬの「部分配列」とは、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬを構成するアミノ酸配列の任意の一部分から構成されるものであって、かつ、抗体結合活性を有する蛋白質を指し、具体的には、例えば、プロテインＡから先述のシグナル配列Ｓおよび細胞壁結合ドメインＸを除いて得られる、配列番号９の３１番目のＡｌａ以降で示されるアミノ酸配列（実施例１の「ＳＰＡ’」に対応。図１および２、配列番号８および９参照。）が、プロテインＡの「部分配列」に対応する。また、複数個あるイムノグロブリン結合ドメインを１つまたは複数個取り除いた抗体結合活性を有するペプチドも、抗体結合活性を有する限り、「部分配列」に含まれる。

プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬの「機能的変異体およびそれらの連結配列」とはプロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインの少なくとも一つを、抗体結合活性を保持した状態でアミノ酸置換、挿入、欠失処理を行い、薬剤、酵素、熱、ｐH等の物理化学的環境因子に対する感受性を変化させた抗体結合性蛋白質および、それらをホモ又はヘテロに連結した構成体をいう。その組み合わせ、連結数は、限定されない。例えば、プロテインＡのＣドメインの２９番目のＧｌｙをＡｌａに改変し５連結した配列（実施例６の「Ｃ−Ｇ２９Ａ」に対応する。配列番号１０参照。）が、上記「機能的変異体およびそれらの連結配列」として例示される。

生理活性蛋白質とは、医薬活性成分として用いられる蛋白質であり、具体的には、ペプチドホルモン、サイトカイン、成長因子、造血因子、酵素、およびこれらの前駆体等が挙げられる。

ペプチドホルモンとは生体内外の情報に応じて動物組織の内分泌細胞によって生産・分泌され、血流によって標的細胞へ輸送され外来性のシグナルとして標的細胞の活性を調節するペプチドである。ペプチドホルモンまたはその前駆体として、インスリン、プロインスリン、または、プレプロインスリン、特にはネコインスリン、ネコプロインスリン、または、ネコプレプロインスリンが例示できる。

インスリンとは膵臓Ｂ細胞の粗面小胞体で生合成前駆体であるプロインスリンとして合成され、インスリンに転換後、Ｂ顆粒内に貯蔵され、分泌刺激に応じて血中に放出されるペプチドホルモンである。

ネコプロインスリンとはネコのインスリンの生合成前駆体である。

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。本実施では、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。 (1) T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning/A Laboratory Manual）」、第２版（1989）、Cold Spring Harbor Laboratory 刊（米国）。 (2) 村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（1996）、丸善株式会社刊。また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。

（実施例１）ブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０の構築
ｐＮＨ３２６（J. Bacteriol., 1995, 177:745-749）に含まれるＭＷＰのＰ５プロモーターをＭＷＰのＰ２プロモーターに変換して、ブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０を以下のように構築した。まず、ｐＮＨ３２６を鋳型として、配列番号３および４に示した塩基配列を有する２つのオリゴヌクレオチドプライマーPrimer-1およびPrimer-2を用いてＰＣＲを行い、ｐＮＨ３２６のうちＭＷＰのＰ５プロモーターを除く部分を増幅し、その末端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIIIとで消化した。次に、配列番号５に示した塩基配列を有するＭＷＰのＰ２プロモーターを含む２本鎖ＤＮＡ断片を定法に従い調製し、その末端を制限酵素ＭｕｎＩおよびＨｉｎｄIIIで消化した。これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ｐＮＫ３２６０を構築した。

（実施例２）スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（JCM2179）由来のプロテインＡをコードするＤＮＡ配列のクローニング
スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（JCM2179）を、Ｔ２液体培地（ポリペプトン１％、イーストエキストラクト０．２％、グルコース１％、魚肉エキス０．５％、ｐＨ７．０）で３７℃一晩振とう培養した。得られた培養液から菌体を遠心分離により回収後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２度洗浄した。菌体を同緩衝液に懸濁後、１％ＳＤＳで溶菌し、６０℃にて３０分間加熱後、フェノール抽出及びエタノール沈殿等の定法により全ゲノムＤＮＡを抽出した。なお、スタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（JCM2179）は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室（ＪＣＭ）（〒351-0198埼玉県和光市広沢2-1）より入手することが出来る。

次に、プロテインＡ遺伝子のＤＮＡ配列情報（Shuttleworth, H. Lら.Gene, 1987, 58:283-295.）を基に、配列番号６及び７に示した塩基配列を有する２つのオリゴヌクレオチドプライマーPrimer-3およびPrimer-4を調製した。上記のスタフィロコッカス・アウレウス・コワンＩ株（JCM2179）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、これら２つのオリゴヌクレオチドプライマーPrimer-3およびPrimer-4を用いてＰＣＲを行い、プロテインＡからシグナルシーケンス（Ｓドメイン）及び細胞壁結合ドメイン（Ｘドメイン）を除いた部分（これ以降ＳＰＡ’と称する）をコードするＤＮＡ断片（約０．９ｋｂｐ）を増幅した。得られたＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化した後、アガロースゲルより分離回収した。

一方、参考例１で構築したブレビバチルス発現ベクターｐＮＫ３２６０もまた同様に制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩにより消化後、精製回収してアルカリフォスファターゼ処理により脱リン酸化処理を行った。

制限酵素処理後の、ＳＰＡ’をコードする上記ＤＮＡ断片と上記発現ベクターｐＮＫ３２６０とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、図１に示すＳＰＡ’発現プラスミドＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を構築した。図２には、Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０に含まれるプロモーター、SD配列、シグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡを示した。配列番号８に示した塩基配列は、Ｓｐａ’−ｐＮＫ３２６０に含まれるプロモーター、SD配列、シグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡを示し、配列番号９はシグナルペプチドおよびプロテインＡ（ＳＰＡ’）をコードするＤＮＡがコードするアミノ酸配列を示す。

図１および図２において、「ＭＷＰ−Ｐ２」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーター領域、「ＳＤＭ」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＳＤ配列、「ＳＰ’」はブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのシグナルペプチド配列を一部改変した改変型シグナルペプチド配列、「ｓｐａ’」はＳＰＡ’をコードするＤＮＡ配列、「Ｎｍ」はネオマイシン耐性遺伝子コード領域、「Ｒｅｐ／ｐＵＢ１１０」はベクターｐＮＫ３２６０の複製開始点を意味する。また図２において、「Ｐ２−３５」および「Ｐ２−１０」は、それぞれ、ブレビバチルス・ブレビス細胞壁蛋白質ＭＷＰのＰ２プロモーターの−３５領域および−１０領域を意味する。

公知の方法により、このＳｐａ’−ｐＮＫ３２６０を用いてブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（FERM BP-4573）の形質転換を行った。

（比較例１）グルコースを炭素源とした組換え蛋白質の生産１
実施例２にて得られた形質転換体を、３ＹＣ培地（ポリペプトンＳ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、ＣａＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％ｐＨ７．０）のグルコース濃度を１、３、９％にした培地にアデカノールＬＧ１０９（株式会社アデカ製）を５００ｐｐｍ添加し、３０℃の好気的条件下で培養した。培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換え蛋白質ＳＰＡ’の濃度を分析した。その結果、グルコース濃度１％で０．３ｇ／Ｌ、３％で０．９ｇ／Ｌ、９％で０．７ｇ／Ｌであった。

同様に培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６６０ｎｍでの濁度を分析した。その結果、グルコース濃度１％で１７、３％で２４、９％で１６であった。

（実施例３）フルクトースを炭素源とした組換え蛋白質の生産１
培地の炭素源をグルコースからフルクトース１、３、９％に変更した以外は比較例１と同様に、実施例２にて得られた形質転換体を培養した。培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換え蛋白質ＳＰＡ’の濃度を分析した。その結果、フルクトース濃度１％で０．６ｇ／Ｌ、３％で１．１ｇ／Ｌ、９％で０．９ｇ／Ｌといずれの濃度でもグルコースを添加するよりも高濃度であった。結果を表１に示した。

同様に、培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６６０ｎｍでの濁度を分析した。その結果、フルクトース濃度１％で１７、３％で２９、９％で１９といずれの濃度でもグルコースを添加するよりも同等以上であった。結果を表１に示した。

（比較例２）グルコースを炭素源とした組換え蛋白質の生産２
実施例２にて得られた形質転換体を、３ＹＣ培地（ポリペプトンＳ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ_２Ｏ０．０１％、ＣａＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％ｐＨ７．０）にディスホームＣＣ−１１８（株式会社日本油脂製）を５００ｐｐｍ添加し、３０℃の好気的条件下で培養した。培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換え蛋白質ＳＰＡ’の濃度を分析した。その結果１．３ｇ／Ｌであった。

同様に培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６６０ｎｍでの濁度を分析した。その結果、２３であった。

（実施例４）フルクトースを炭素源とした組換え蛋白質の生産２
実施例２にて得られた形質転換体を、３ＹＣ２培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、フルクトース２％、リン酸塩０．３％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％ｐＨ７．０）にディスホームＣＣ−１１８を７５０ｐｐｍ添加し、３０℃の好気的条件下でｐＨを７．０から７．８に制御しながら培養した。培養３０時間目にフルクトースを２％追加した。

培養開始から、５８時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換え蛋白質ＳＰＡ’濃度を測定したところ、２．６ｇ／Ｌであった。

同様に、培養開始から、５８時間後に培養液を１０ｍＬ採取し、遠心分離（３,０００ｒｐｍ、室温、２０分間）の後上清を除去し、十分乾燥後、乾燥菌体重量を分析した結果、１０．０ｇ／Ｌであった。

（実施例５）フルクトースを炭素源とした組換え蛋白質の生産３
実施例２にて得られた形質転換体を、３ＹＣ３培地（ペプトン１％、酵母エキス０．５％、フルクトース４％、リン酸塩０．３％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％ｐＨ７．０、培養開始後６時間目から４８時間目にかけてフルクトース４％分を連続添加）にディスホームＣＣ−１１８を７５０ｐｐｍ添加し、３０℃の好気的条件下でｐＨを７．０から７．８に制御しながら培養した。

培養開始から、７２時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換え蛋白質ＳＰＡ‘濃度を測定した。その結果、５．０ｇ／Ｌであり、新規な手法で培養を実施することで、比較例２で示したグルコースを用いる従来の培養方法での１．３ｇ／Ｌと比較して約４倍に組換え蛋白質の分泌量が増加することがわかった。結果を表２に示した。

同様に培養開始から、７２時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６６０ｎｍでの濁度を分析した。その結果、４５であり、新規な手法で培養することで、比較例２で示したグルコースを用いる従来の培養法での２３と比較して約２倍と培養終了時の菌体密度が大幅に増加することが分かった。結果を表２に示した。

さらに、同様に、培養開始から、７２時間後に培養液を１０ｍＬ採取し、遠心分離（３,０００ｒｐｍ、室温、２０分間）の後上清を除去し、十分乾燥後、乾燥菌体重量を分析した。その結果、１５．２ｇ／Ｌであった。

（実施例６）プロテイン・BR>`のＣドメインの機能的変異体の５連結体を発現した形質転換体の調製
プロテインＡのＣドメインの２９番目のＧｌｙをＡｌａに改変し５連結したタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０、以下Ｃ−Ｇ２９Ａとする。）から逆翻訳を行い、該タンパク質をコードするＤＮＡ配列を設計した。該タンパク質のコドン使用頻度が、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株で大量に発現している細胞表層タンパク質であるＨＷＰ（J. Bacteriol.,172, p.1312-1320, 1990）のコドン使用頻度に近くなるように、かつ、５個の各ドメインをコードする塩基配列の配列同一性が低くなるように考慮して、コドンを分配した。また、５連結ドメインをコードする配列の５’側にＰｓｔＩ、および、３’側にＸｂａIの制限酵素認識部位を作製した。作製したＤＮＡ断片の配列を配列番号１１に記した。作製したＤＮＡ断片をＰｓｔＩおよびＸｂａI（ともにTakara社製）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分画、精製した。一方、ブレビバチルス属細菌用のプラスミドベクターであるｐＮＣＭＯ２（Takara社製）を、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩにより消化後、精製回収した。両者を混合後、Ligation High（TOYOBO社製）を用いて連結して、プラスミドベクターｐＮＣＭＯ２−Ｃ−Ｇ２９Ａを構築した。前記操作により得られたプラスミドベクターを用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Takara社製）の形質転換を行った。

（比較例３）グルコースを炭素源とした組換え蛋白質の生産３
実施例６にて得られた形質転換体を、３ＹＣ培地（ポリペプトンＳ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ_２Ｏ０．０１％、ＣａＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％ｐＨ７．０）にて、３０℃の好気的条件下で培養した。培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａの濃度を分析した。その結果１．４ｇ／Ｌであった。

同様に培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６６０ｎｍでの濁度を分析した。その結果、２６であった。

（実施例７）フルクトースを炭素源とした組換え蛋白質の生産４
培地の炭素源をグルコースからフルクトース３％に変更した以外は比較例２と同様に、実施例６にて得られた形質転換体を培養した。培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の組換え蛋白質Ｃ−Ｇ２９Ａの濃度を分析した。その結果、比較例３に示したグルコースで培養した場合に、１．４ｇ／Ｌであったのに対し、２．２ｇ／Ｌであった。結果を表３に示した。

同様に培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、分光光度計を用いて６６０ｎｍでの濁度を分析した。その結果、比較例３に示したグルコースで培養した場合に、２６であったのに対し、３１であった。結果を表３に示した。

（実施例８）ネコプロインスリン融合蛋白質を発現する形質転換体の調製
（非特許文献３）に示されたネコプロインスリンのアミノ酸配列とプロテインＡのＥ，Ｄドメインから、ネコプロインスリン融合蛋白質のアミノ酸配列を設計した（配列番号１２）。コドン使用率を考慮して、配列番号１３に示した塩基配列からなるネコプロインスリン融合蛋白質遺伝子を作成した。作成したＤＮＡ断片をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ（ともにTakara社製）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分画、精製した。一方、ブレビバチルス属細菌用のプラスミドベクターであるｐＮＨ３２６をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩにより消化後、精製回収した。両者を混合後、Ligation High（TOYOBO社製）を用いて連結して、プラスミドベクターｐＮＨ３２６ＥＤＣＩＰを構築した。前記操作により得られたプラスミドベクターを用いて、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株の形質転換体を調製した。

（比較例４）グルコースを炭素源とした組換え蛋白質の生産４
実施例８にて得られた形質転換体を、３ＹＣ培地（ポリペプトンＳ３％、酵母エキス０．５％、グルコース３％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ_２Ｏ０．０１％、ＣａＣｌ₂・７Ｈ₂Ｏ０．０１％、ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００１％、ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０００１％ｐＨ７．０）にディスホームＣＣ−１１８を５００ｐｐｍ添加し、３０℃の好気的条件下で培養した。培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで培養上清中のネコプロインスリン融合蛋白質の濃度を解析した。

（実施例９）フルクトースを炭素源とした組換え蛋白質の生産５
培地の炭素源をグルコースからフルクトース３％に変更した以外は比較例３と同様に、実施例８にて得られた形質転換体を培養した。培養開始から、４８時間後に培養液を採取し、遠心分離（１０,０００ｒｐｍ、４℃、５分間）により菌体を除去した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで培養上清中のネコプロインスリン融合蛋白質の濃度をChemiDoc XRSシステム（Bio-Rad社）により解析した。その結果、比較例４に示したグルコースで培養した場合の約２倍の生産量が確認された。結果を表４に示した。

以上の結果から、本発明のフルクトースを炭素源に用いた組換えブレビバチルス属の組換え蛋白質の製造によれば、組換え蛋白質の生産性を向上させることができることが明らかになった。更にプロテインＡに関しては、フルクトースを炭素源に用いて、フルクトースの添加量と添加方法を適切に選択することにより、従来報告されていた約４倍となる生産性を達成でき、従来問題となっていた低生産性の問題を解決できることが明らかになった。

Claims

組換えブレビバチルス属細菌を用いて、組換え蛋白質を製造する際に、炭素源としてフルクトースを用いて培養し、フルクトースの初発濃度を１〜９％とし、フルクトース濃度を９％以下となるよう追加添加することを特徴とする、組換え蛋白質の製造方法。
フルクトース濃度を４％以下となるよう追加添加することを特徴とする、請求項１に記載の組換え蛋白質の製造方法。
フルクトースの追加添加方法が間欠または連続であることを特徴とする、請求項１または２に記載の組換え蛋白質の製造方法。
組換え蛋白質が抗体結合性蛋白質である、請求項１から３のいずれかに記載の組換え蛋白質の製造方法。
抗体結合性蛋白質が、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、抗体結合活性を有するそれらの部分配列、それらの機能的変異体およびそれらの連結体からなる群から選択される１以上の蛋白質であることを特徴とする請求項４に記載の組換え蛋白質の製造方法。
組換え蛋白質が生理活性蛋白質誘導体である、請求項１から３のいずれかに記載の組換え蛋白質の製造方法。
生理活性蛋白質が、ペプチドホルモンまたはその前駆体である、請求項６に記載の組換え蛋白質の製造方法。
ペプチドホルモンまたはその前駆体が、インスリン、プロインスリン、または、プレプロインスリンである、請求項７に記載の組換え蛋白質の製造方法。
インスリン、プロインスリン、または、プレプロインスリンが、ネコインスリン、ネコプロインスリン、または、ネコプレプロインスリンである、請求項８に記載の組換え蛋白質の製造方法。