JP2004187625A - 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 - Google Patents
新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004187625A JP2004187625A JP2002362120A JP2002362120A JP2004187625A JP 2004187625 A JP2004187625 A JP 2004187625A JP 2002362120 A JP2002362120 A JP 2002362120A JP 2002362120 A JP2002362120 A JP 2002362120A JP 2004187625 A JP2004187625 A JP 2004187625A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- cata
- amino acid
- dna
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】Brevibacillus choshinensis由来の新規遺伝子ｃａｔＡのクローニングに成功し、その塩基配列も決定された。本遺伝子は、ジスルフィド酸化還元活性を有する新規タンパク質ＣａｔＡをコードする遺伝子を含んでおり、これを導入した形質転換体も作製され、発現が確認された。
【効果】生理活性を示さないタンパク質にＣａｔＡを作用させると、該タンパク質が活性化され、また、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ及びＣａｔＡをコードするＤＮＡの双方を含有する形質転換体によれば、生理活性を有する組換えタンパク質が製造される。
【選択図】 なし
【効果】生理活性を示さないタンパク質にＣａｔＡを作用させると、該タンパク質が活性化され、また、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ及びＣａｔＡをコードするＤＮＡの双方を含有する形質転換体によれば、生理活性を有する組換えタンパク質が製造される。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ジスルフィド酸化還元酵素およびそれをコードする遺伝子、及び、該酵素を用いた活性型タンパク質の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換え技術は、生体由来のペプチド又はタンパク質などで、微量成分として単離することが著しく困難であった物質を、微生物や動物細胞などを用いて大量に生産することを可能にした。しかしながら、遺伝子組換え技術を用いて生産されたタンパク質が、天然型のタンパク質が有している本来の生理活性を示さないことが、しばしばあり、大きな問題になっている。
【０００３】
このことの大きな原因のひとつとして考えられているのは、遺伝子組換え技術を用いて生産されたタンパク質は、一次構造（アミノ酸配列）こそ天然の生理活性を有するタンパク質と同じ正しい構造（配列）を有しているものの、その立体構造が生理活性を有する本来の立体構造と異なってしまうことである。
【０００４】
タンパク質の立体構造の形成・保持、および、それに伴う生理活性の発現にきわめて重要な役割を果しているのは、タンパク質分子内および／または分子間のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合である。遺伝子組換え技術を用いて生産されたタンパク質には、このジスルフィド結合に不備があること、すなわち、本来あるべきジスルフィド結合が形成されていなかったり、または、分子内および／または分子間のシステイン残基間で本来とは異なった位置のジスルフィド結合が形成されたりすることが多い。そのため、遺伝子組換えにより生産されたタンパク質の立体構造が、生理活性を有する本来のタンパク質の構造と異なってしまうか、さらに場合によっては、タンパク質の不溶性の凝集塊が生成されることが知られている。そして、このことにより、そのタンパク質が本来有するはずの生理活性の低下または消失が起こると考えられている。
【０００５】
また、化学合成されたポリペプチドや細胞抽出液中（Ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ系）を用いて生産されたタンパク質についても、ジスルフィド結合を欠く比較的折り畳みの少ない構造をとっているなど、本来の正しい立体構造を有していない場合が多く、そのために生理活性を示さないことが、しばしばあることが知られている。
【０００６】
ジスルフィド結合の形成・開裂は、２つのシステイン残基の単純な酸化還元反応である。したがって、適当な酸化還元条件の下でいずれの方向にも非酵素的に起こすことができる。そのため化学的な酸化還元反応により、ジスルフィド結合に不備があるタンパク質を正しいジスルフィド結合を持つタンパク質に変換する方法も知られている。しかしながら、こうした化学的な酸化還元反応による方法では、遺伝子組換え技術により生産されたタンパク質、特に、多数のジスルフィド結合を持つタンパク質に対して実用的な効率で、正確なジスルフィド結合を形成させることは不可能である。
【０００７】
そのため、生理活性を示さないタンパク質のジスルフィド結合を修正することにより生理活性を有するタンパク質を得るために、当業者において広く試みられている方法は、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質（以下、「ジスルフィド酸化還元酵素」と称する場合がある。）を作用させる方法である。たとえば、ジスルフィド酸化還元酵素としてチオレドキシンを用いた方法（例えば、非特許文献１参照）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を用いた方法（例えば、特許文献１参照）などが知られている。また、ジスルフィド酸化還元酵素をコードするＤＮＡを宿主生物に導入し、目的とする遺伝子組換えタンパク質とジスルフィド酸化還元酵素を同時に発現させることにより、正しいジスルフィド結合を有するタンパク質を製造する方法も知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００８】
ジスルフィド酸化還元酵素として知られている主要なものには、チオレドキシン、ヒトＰＤＩ（例えば、非特許文献２、特許文献３参照）、および、大腸菌由来のＤｓｂ（例えば、非特許文献３、同４参照）を始めとするＤｓｂファミリーなどがある。さらに枯草菌（Bacillus subtilis）由来のものとしてＢｄｂ（例えば、非特許文献５参照）などが知られている。
【０００９】
これらのジスルフィド酸化還元酵素は、共通する特徴としてチオレドキシンモチーフ（Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ）（Ｃはシステイン残基、Ｘは任意のアミノ酸残基）と呼ばれるアミノ酸配列を有することが知られている。このチオレドキシンモチーフはジスルフィド酸化還元反応における活性部位とされている（例えば、非特許文献６参照）。さらにまた、既知のジスルフィド酸化還元酵素は、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を持つタンパク質として生体内で合成されることが知られている。
【００１０】
【非特許文献１】
Pigiet V. P. and Schuster B.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7643-7647, (1986)
【００１１】
【特許文献１】
特開昭６３−２９４７９６号公報
【００１２】
【特許文献２】
特開平１１−７５８７９号公報
【００１３】
【非特許文献２】
Rapilajaniemi et al., EMBO J. 6, 643-649, (1987)
【００１４】
【特許文献３】
特許２８０３０８９号
【００１５】
【非特許文献３】
EMBO J., 11、 55-62, (1992)
【００１６】
【非特許文献４】
Cell, 67, 581-589, (1991)
【００１７】
【非特許文献５】
Ｂｏｌｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２４５３１−２４５３８（１９９９）
【００１８】
【非特許文献６】
曽根道夫、伊藤維昭，蛋白質・核酸・酵素，43， 1-10, (1998)
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、チオレドキシン、ＰＤＩを始めとするジスルフィド酸化還元酵素は、生理活性を示さないタンパク質の活性化に利用されている。しかしながら、生理活性を示さないタンパク質の種類によっては、これまでに知られているジスルフィド酸化還元酵素のいずれを用いても活性化することができない場合も多かった。このことの原因のひとつとして、ジスルフィド酸化還元酵素には、それぞれ基質特異性があり、ジスルフィド酸化還元酵素ごとに作用可能なタンパク質が異なっていることが挙げられる。
【００２０】
したがって、生理活性を示さない種々のタンパク質に対しても、ジスルフィド酸化還元酵素を用いた活性化を可能とするために、さらに新規なジスルフィド酸化還元酵素の提供が求められていた。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、以上のような課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えタンパク質生産における宿主として有効利用されているブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinesis）に着目し、そのゲノムからジスルフィド酸化還元活性を有すると推測される新規タンパク質遺伝子を見出しｃａｔＡと命名した。その塩基配列を配列番号２に示し、その配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００２２】
さらに、本発明者らは、上記した本発明に係る新規遺伝子ｃａｔＡの塩基配列（配列番号２）の内、該遺伝子に対応するタンパク質の分泌シグナル配列を除いた成熟部分をコードしていると推定した塩基配列（配列番号４）を有するＤＮＡを挿入した発現ベクターを構築し、さらに、該発現ベクターでブレビバチルス・チョウシネンシスを形質転換した。さらに、該形質転換体を培養することにより該ＤＮＡを大量発現させ、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡ（配列番号３）を得た。
【００２３】
さらに、本発明者らは、この新規タンパク質ＣａｔＡに対して、インスリンを用いたジスルフィド酸化還元活性の測定を行い、その結果、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡがジスルフィド酸化還元活性を有することを確認した。
【００２４】
またさらに、本発明者らは、この新規タンパク質ＣａｔＡを不活性型ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）に作用させることにより活性型ｈＥＧＦを得、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡが、不活性型タンパク質の活性化に利用可能であることを示した。
【００２５】
またさらに、本発明者らは、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主として、ＣａｔＡをコードするＤＮＡとｈＥＧＦをコードするＤＮＡを共発現させ、その結果、活性型組換えｈＥＧＦの生産量が増大することを確認し、本発明のタンパク質ＣａｔＡは、他の遺伝子組換えタンパク質と共発現させることにより生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の生産量を増加させることに利用可能であることを実証した。以上により、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に付いて詳述する。
本発明のジスルフィド酸化還元活性を有する新規タンパク質ＣａｔＡのアミノ酸配列を配列番号３に例示する。このアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するものは報告されておらず、したがって、本発明のタンパク質ＣａｔＡは新規タンパク質である。
【００２７】
さらに、配列番号３に記載のアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもジスルフィド酸化還元活性を有する限り、全て本発明のジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質ＣａｔＡに包含される。ここで「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸残基の種類やタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置によっても異なるが、前記配列番号３のアミノ酸配列全体に対し、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００２８】
上記の特定のアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列から成るポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性である。又、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００２９】
また、本発明のタンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４に例示する。この塩基配列と４０％以上の相同性を有するものは報告されておらず、したがって、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは新規ＤＮＡである。さらに配列番号３に記載のアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであっても、そのコードしているタンパク質がジスルフィド酸化還元活性を有する限り、全て本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに包含される。ここで「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」の意味は、上記した本発明のタンパク質についての場合と同様である。
【００３０】
また、本発明のタンパク質ＣａｔＡをコードする遺伝子のＤＮＡは、上記したように、配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡを指すほか、あるいは、このＤＮＡの全塩基配列またはその一部から作製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを指すものである。
【００３１】
なお、本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることが出来る。
【００３２】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al, (1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３３】
さらに本発明の新規タンパク質ＣａｔＡは、当業者に公知の標準的な遺伝子組換え技術を適宜選択し、組み合わせて用いることにより得ることができる。たとえばモレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル第２版（Sambrooket al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)）に記載の方法を用いて行うことができる。
【００３４】
本発明のタンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡは、例えば、後述の実施例１に示すようにしてブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから、例えば配列番号４で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、上記ＤＮＡ断片をプライマーとして用いるＰＣＲ法により、調製することができる。または、その塩基配列を元に、当業者に公知の核酸化学合成法などにより、本発明のタンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡを得ることもできるが、これらに限定されない。なお、配列番号１、２、３、４に示す配列は、それぞれ図７、８、９、１０にも示した。
【００３５】
ＣａｔＡをコードするＤＮＡの発現に用いる宿主は、ＣａｔＡをコードするＤＮＡの発現が可能なものであるならば特に限定されない。宿主としては、細菌や酵母、カビ、動物細胞などのいずれであっても利用可能であるが、好ましくは細菌であり、より好ましくはブレビバチルス属細菌である。特に好ましい宿主としてBrevibacillus choshinensis HPD31（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３）や、その変異株であるBrevibacillus choshinensis HPD31-S5（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）を挙げることができる。
【００３６】
ＣａｔＡをコードするＤＮＡを挿入するベクターは、宿主中で複製可能であるものならば特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主とする場合には、特に好ましいベクターとしてｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）やｐＮＣＭＯ２（Yashiro et al, Protein Expression and Purification 23, 113-120 (2001)）を挙げることができる。
【００３７】
ベクターにＣａｔＡをコードするＤＮＡを挿入するには、例えば、精製されたＣａｔＡをコードする塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。また、ＣａｔＡをコードするＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であることから、ベクターには、プロモーター、ＣａｔＡをコードするＤＮＡのほか、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでもよい。
【００３８】
宿主への発現ベクターの導入方法も、特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主とする場合には、特に好ましい形質転換方法としてエレクトロポレーション法（Takagi et al, Agric. Biol. Chem.,53, 3099-3100 (1989)）を例示することできる。
【００３９】
ＣａｔＡをコードするＤＮＡの発現に用いる宿主の培養方法も、ＣａｔＡをコードするＤＮＡの発現が可能なものであるならば特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主として使用する場合には、特に好ましい条件として、下記の実施例で用いたＴＭＮ培地、３０℃、２〜４日間を例示することができる。
【００４０】
さらに、発現されたＣａｔＡの単離、精製を行う場合には、当業者に公知の方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより行うことができる。たとえば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を適宜、単独または組み合わせて用いることにより可能である。
【００４１】
本発明のジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質ＣａｔＡを作用させることによる生理活性を示さないタンパク質の活性化方法において、該方法が適用可能な生理活性を示さないタンパク質としては、遺伝子組換え技術により生産された種々のタンパク質、ペプチド合成機によって化学的に合成された種々のポリペプチド、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成系により合成された種々のタンパク質、及び、そ（れら）の含有物などを例示することができる。また、遺伝子組換え技術により生産されるタンパク質としては、同タンパク質自体のほか、同生産培養物（形質転換体培養物）全体、同生産培養物から分別、分取した生物学的に不活性なタンパク質、及び、そ（れら）の含有物などを例として挙げることができる。
【００４２】
さらに、本発明のタンパク質の活性化方法において、タンパク質に作用させるＣａｔＡの量は特に限定されない。タンパク質にＣａｔＡを作用させる態様は、ＣａｔＡを緩衝液に溶解させた溶液をタンパク質に加えてもよいし、タンパク質を適当な変性剤を用いて可溶化した後、そのタンパク質溶液にＣａｔＡを加えてもよい。反応温度は０〜４０℃が好ましく、また、反応時間は１〜５時間が適当である。
【００４３】
また、本発明のＣａｔＡを生理活性を示さないタンパク質に直接作用させることもできるが、不溶性のタンパク質に作用させる場合には、まず、タンパク質を還元変性溶液に溶解し、さらにジスルフィド化合物の存在下においてＣａｔＡを作用させることが好ましい。還元変性溶液としては、０．１〜０．２Ｍジチオスレイトール、１〜６Ｍ塩酸グアニジン溶液、若しくは１〜８Ｍ尿素溶液が好ましく、変性溶液に溶解される生理活性を示さないタンパク質の濃度は０．１〜４０ｍｇ／ｍｌ程度が適当である。また、ジスルフィド化合物としては酸化型グルタチオン、もしくは酸化型ジチオスレイトールが好ましい。ジスルフィド化合物は反応溶液全体のスルフヒドリル化合物のモル濃度を上回る濃度で加える必要がある。
【００４４】
さらに、ＣａｔＡを生理活性を示さないタンパク質に反応させる際、ＣａｔＡをＭＦ膜等で閉じた空間に固定化し緩衝液等で溶解させたタンパク質溶液を通過させることによって接触させてもよいし、また疎水性の多孔性樹脂であるＨＰ−２０（三菱化学社製）の様な担体にＣａｔＡを吸着させることによって固定化し、固定化カラムとし、この固定化カラムにタンパク質溶液を供給することによってＣａｔＡと接触させてもよい。
【００４５】
また、本発明のタンパク質ＣａｔＡを、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡを共発現させることにより、生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の生産量を増加させることに用いることが可能である。この場合、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡの共発現を行う好ましい方法は、実施例に示したようにＣａｔＡをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡ、それぞれを含有する別の発現ベクターにより同時に形質転換された宿主を用いて共発現する方法である。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１：新規遺伝子ｃａｔＡのクローン化）
Brevibacillus choshinensis HPD31-S5（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）を５ｍｌＴＭＮ，３０℃，４日間という条件下で培養した。ＴＭＮ培地は、ＴＭ培地にネオマイシンを５０μｌ／ｍｌの濃度に添加した培地である。ＴＭ培地の組成は、ポリペプトン１％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％、グルコース１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ｐＨ７．０である。培養終了後、培養液を室温で遠心（８０００回転、３０分）し、集菌した。次に、集めた菌体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で２回洗浄後、フェノール層に分離調製することにより、Brevibacillus choshinensis HPD31-S5の染色体ＤＮＡを調製した。
【００４８】
さらに、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質をコードしていると推測される枯草菌のｙｎｅＮ及びBacillus haloduransのＢＨ１５２２両遺伝子の塩基配列を参考にしてプライマーを設計し、上記で得たBrevibacillus choshinensis HPD31-S5の染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、約１８０ｂｐの増幅産物を得た。使用したプライマーは、次のとおり。
【００４９】
ＢｂＶＭ２（ｆｏｒｗａｒｄプライマー）：５’−ＣＡＴＫＴＴＴＧＧＲＣＫＷＣＤＴＧＧＴＧ−３’（配列番号５：図１１）
ＢｂＶＭ４（ｂａｃｋｗａｒｄプライマー）：５’−ＧＴＣＲＡＫＶＡＶＡＡＹＳＧＧＤＡＡＳＧＴ−３’（配列番号６：図１２）
（上記配列中、Ｒは、ＡまたはＧ、Ｙは、ＣまたはＴ、Ｗは、ＡまたはＴ、Ｓは、ＧまたはＣ、Ｋは、ＧまたはＴ、Ｄは、ＡまたはＧまたはＴ、Ｖは、ＡまたはＣまたはＧ、をそれぞれ表す。また、ｆｏｒｗａｒｄプライマーＢｂＶＭ２は、枯草菌ｙｎｅＮ遺伝子ＯＲＦの１９２番目から２１２番目の塩基配列に対応し、ｂａｃｋｗａｒｄプライマーＢｂＶＭ４は同じく３５５番目から３７５番目の配列に対応する。）
【００５０】
また、ＰＣＲは、１．９５℃ ９分、２．９４℃ ３０秒、３．４０℃ ６０秒、４．７２℃ ９０秒、５．６０℃ １０分：２から４は４０サイクルの条件で行った。
【００５１】
さらに、このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化ｐＢＲ３２２にクローン化し、塩基配列を解読したところ、ｙｎｅＮ及びＢＨ１５２２両遺伝子との類似性から、ＰＣＲ産物が目的遺伝子の部分配列であることが確認された。次に、増幅産物をプローブにしてＰｓｔＩ消化ブレビス染色体のサザン解析を行い、約２．５ｋｂｐ断片中に目的遺伝子が含まれることを示す結果を得た。そこで増幅産物の内部配列から以下の２本のプライマーを設計した。
【００５２】
Ｂｂ−ＯＸＲＥ２−５’：５’−ＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＧＴＣＣ−３’（配列番号７：図１３）
Ｂｂ−ＯＸＲＥ２−３’：５’−ＣＣＴＧＡＴＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣ−３’（配列番号８：図１４）
【００５３】
制限酵素ＰｓｔＩで消化したBrevibacillus choshinensis HPD31-S5の染色体ＤＮＡをアガロース電気泳動にかけ、ゲルから２．６ｋｂｐの大きさに相当するバンドを切りだし、ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎを行った。このｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡをテンプレートとし、上記の２本のプライマーを用いてＰＣＲを行い、２．６ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。さらに、この産物の塩基配列を解読し、目的遺伝子の全長が含まれることを確認した。この５３１ｂｐのジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質をコードしていると推測される新規遺伝子をｃａｔＡと命名した。遺伝子ｃａｔＡの塩基配列を配列番号２（図８）に示す。また遺伝子ｃａｔＡの塩基配列から推定されるｃａｔＡに対応するタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１（図７）に示す。この１７７アミノ残基のタンパク質において、チオレドキシンモチーフは７３−７６位に存在している。
【００５４】
（実施例２：ＣａｔＡの遺伝子組換え法による生産）
さらに、この新規遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質において、１−２６位までが分泌シグナル配列であり、２７番目のアラニン以降が成熟体である、と推定し、以下に示すように成熟体であると推定した部分について遺伝子組換えによる生産を試みた。ただし、実際に該タンパク質がブレビバチルス・チョウシネンシスにおいて分泌タンパク質であるのか、さらに、分泌されるとして、その分泌シグナル切断箇所がアラニンの前であるのか、という点に関しては今後をまたねばならない。
【００５５】
実施例１で得た新規遺伝子ｃａｔＡの塩基配列を基に下記の２本のプライマーを作製し、Brevibacillus choshinensis HPD31-S5の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲを行い、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の成熟体と推定した２７位のアラニン以降をコードする遺伝子を増幅した。ＰＣＲは９５℃で１分、５４℃で１分、７２℃で１分のサイクルを２６回繰り返すことにより行った。
【００５６】
Ｐｒｉｍｅｒ １（ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＧＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＧＴＡＧＣＡＧＡＧＧＴＣ−３’（配列番号９：図１５）
Ｐｒｉｍｅｒ ２（ｂａｃｋｗａｒｄ）：５’−ＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１０：図１６）
また、発現ベクターにクローニングを行うために、Ｐｒｉｍｅｒ １にはＰｓｔＩサイト（ＣＴＧＣＡＧ）を、Ｐｒｉｍｅｒ ２にはＢａｍＨＩサイト（ＧＧＡＴＣＣ）を設けた。
【００５７】
次に、上記で得たＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化後、同じ酵素で処理した発現ベクターｐＮＣＭＯ２（Yashiro et al, Protein Expression and Purification 23, 113-120 (2001)）に結合し、発現プラスミドｐＮＣｃａｔＡを得た。発現ベクターｐＮＣｃａｔＡの構築方法及び構造を図１に示す。
【００５８】
このｐＮＣｃａｔＡにおいて、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質のアミノ酸配列の２７位のアラニン以降をコードするＤＮＡが、ｐＮＣＭＯ２が含有するブレビス細胞壁タンパク質の分泌シグナル配列につながることになる。したがってＨＰＤ３１−Ｓ５から分泌されたＣａｔＡは、アラニンの前で分泌シグナル配列が切り離されるため、分泌生産されたタンパク質のＮ末端はアラニンになると予想される。
【００５９】
さらに、この発現プラスミドｐＮＣｃａｔＡをエレクトロポレーション法（Takagi et al, Agric. Biol.Chem., 53, 3099-3100(1989)）によりBrevibacillus choshinensis HPD31-S5（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）に導入した。得られた形質転換体をBrevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCcatAと命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９１２４として寄託した。
【００６０】
そして、この形質転換体Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCcatA（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１２４）を３０℃下、ＴＭＮ培地３ｍｌ中で２日間培養した。培養終了後、培養液を室温で遠心（８０００回転、３０分）し、上清４μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示す。このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果が示すように、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の２７位以降のアミノ酸残基の分子量約１７ｋＤａに相当する位置に染色バンドが存在しており、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の２７位以降のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（塩基配列を配列番号４（図１０）に示す。）の発現、および、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の２７位以降のアミノ酸配列を有するタンパク質である本発明の新規タンパク質ＣａｔＡの分泌生産が確認された。また分泌生産されたＣａｔＡのＮ末端分析を行いＮ末端がアラニンであることを確認した。以上により得られたＣａｔＡのアミノ酸配列を配列番号３（図９）に示す。なお、図２（ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す図面代用写真）において、１は宿主菌の培養上清の結果、２は宿主菌を形質転換した形質転換体の培養上清の結果をそれぞれ示すものである。
【００６１】
（実施例３：ＣａｔＡの活性測定）
さらに、以下の手順に従って、上記実施例２で得た本発明の新規タンパク質ＣａｔＡを用いて、インスリンのシステイン残基の酸化還元によるジスルフィド結合形成・開裂反応を行い、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡのジスルフィド酸化還元活性を評価した。
【００６２】
ＣａｔＡの酵素標品の調製は以下の手順で行った。実施例２で作製した形質転換体Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCcatA（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１２４）を５ｍｌＴＭＮ培地，３０℃，４日間という条件下で培養した。培養終了後、培養液を室温で遠心（８０００回転、３０分）し、その上清１００μｌをＣａｔＡの酵素標品とした。
【００６３】
酵素反応を起こさせるインスリンを溶解させた基質溶液は以下のように調製した。まず２５ｍｇのインスリンを２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０に溶かし、次いで１規定ＨＣｌを加えてｐＨ２〜３とした後、直ちに１規定ＮａＯＨを加えてｐＨを元の８．０に戻した。その後、水を加えて全量を２．５ｍｌとし、１０倍濃度のストック溶液とした。活性測定の際はこのストック溶液を２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈して用いた。
【００６４】
上記で調製したインスリンを溶解させた基質溶液５００μｌを分光光度計用ガラスキュベットに入れ、さらに上記で得たＣａｔＡの酵素標品１００μｌと０．１Ｍ ＤＴＴ５μｌを加えて２５℃下で反応させた。反応の経過はＯ．Ｄ．６５０での、反応液の濁度変化の観測によって追跡した。なお対照としてｐＮＣＭＯ２の溶液を用いた。測定結果を図３に示す。
【００６５】
図３の測定結果が示すように、ＣａｔＡの添加により反応液の濁度の上昇が認められた。このことはＣａｔＡの添加によりインスリン分子内、もしくはインスリン分子間にジスルフィド結合が形成され、その結果、インスリン分子同士による凝集が生じたためであると考えられる。
この結果は、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡがジスルフィド酸化還元活性を有することを示している。
【００６６】
（実施例４：ＣａｔＡを用いた生理活性を示さないｈＥＧＦの生理活性を有するｈＥＧＦへの変換）
（１）不活性型組換えヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）の調製
ｈＥＧＦ発現プラスミドを保持するBrevibacillus choshinensisは、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）を高生産するが、生産されたｈＥＧＦの一部が、ｈＥＧＦ分子間でジスルフィド結合を形成することにより多量体化することが宮内らにより報告されている（Miyauchi et al, Journal of Industrial Microbiologyand Biotechnology, 21, 208〜214, (1998)）。この多量体ｈＥＧＦは、ｈＥＧＦが本来有する生理活性を持たない不活性型ｈＥＧＦであることが知られており、また、同文献において多量体ｈＥＧＦを培養液から分取する方法についても報告されている。そこで、不活性型ｈＥＧＦである多量体ｈＥＧＦを同文献の記載に基づき、下記の方法により調製した。
【００６７】
上記文献に記載のヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）発現プラスミドｐＨＴ１１０ ＥＧＦを保持するBrevibacillus choshinensis HPD31-S5を同文献記載の培養条件で６５時間液体培養し、遠心分離により培養上清を回収した。ついで、上清液を６Ｍ塩酸でｐＨ３．０に調整することにより、多量体ｈＥＧＦを特異的に凝集させ、この沈殿を遠心分離で回収した。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の緩衝液で沈殿を溶解後、再度６Ｍ塩酸でｐＨ３．０に調整し、沈殿を遠心分離し回収した。さらに、沈殿を蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整後、凍結乾燥し、不活性型ｈＥＧＦである多量体ｈＥＧＦを調整した。
【００６８】
（２）不活性型ｈＥＧＦの活性型ｈＥＧＦへの変換
上記の方法によって調製した不活性型ｈＥＧＦを用い、以下の手順でＣａｔＡによる不活性型タンパク質の活性化を試験した。まず、不活性型ｈＥＧＦ溶液（５ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ６．０）にエリスロマイシンとクロラムフェニコールをそれぞれ１００μｇ／ｍｌ、ネオマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、さらに１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を加えてｈＥＧＦの濃度が２ｍｇ／ｍｌとなる溶液を調製した。この溶液を酵素反応の反応基質とした。
【００６９】
評価するサンプル溶液は次のように調製した。また宿主菌株には、Brevibacillus choshinensis HPD31を用いた。ＣａｔＡ発現ベクターｐＮＣｃａｔＡを保持するＨＰＤ３１、ｐＮＣＭＯ２を保持するＨＰＤ３１及びプラスミドを保持しないＨＰＤ３１、以上３種類のＨＰＤ３１を、プラスミドを保持するＨＰＤ３１についてはＴＭ＋ネオマイシン培地で、保持しないＨＰＤ３１の場合は薬剤を含まないＴＭ培地で２日間培養した。培養終了後、それぞれの培養液を、同じ培養液の遠心上清を適量添加することによって希釈し、Ｏ．Ｄ．６６０＝２に調整した。この希釈液をサンプル溶液とした。
【００７０】
調製した基質溶液とサンプル溶液を用いて以下の手順で活性測定を行った。９９μｌの基質溶液に１００μｌのサンプル溶液と２００ｍＭ還元型グルタチオン１μｌを加え、３５℃下で反応をスタートさせた。反応開始後１，３，６，１２時間後に反応液を遠心し、その上清５０μｌと、メルカプトエタノールを含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液５０μｌを混合、７０℃で１０分間加熱後、その２０μｌを使いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。なお、図４（ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す図面代用写真）において、横軸の１，２，３，４はそれぞれ反応開始後１，３，６，１２時間後の反応液を示す。
【００７１】
図４が示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ＣａｔＡを含有するサンプル溶液を添加した反応液において活性型ｈＥＧＦの分子量に相当するバンドが得られ、そのバンドは反応時間の経過とともに濃くなっている。したがって、本発明のタンパク質ＣａｔＡは、生理活性を示さないタンパク質に作用させることにより、該タンパク質を、生理活性を有するタンパク質に変換する機能を有することが実証された。
【００７２】
（実施例５：ｈＥＧＦとＣａｔＡの共発現による活性型ｈＥＧＦ生産量の変化）
さらに、ｈＥＧＦ発現プラスミドｐＨＴ１１０ ＥＧＦとＣａｔＡ発現プラスミドｐＮＣｃａｔＡを同一宿主中に導入し、ｈＥＧＦ生産に及ぼすＣａｔＡ共発現の効果を検討した。宿主にはBrevibacillus choshinensis HPD31-S5を用いた。また、宿主の形質転換は、発現プラスミドｐＨＴ１１０ ＥＧＦ及びｐＮＣｃａｔＡを１対１の割合で混合した後、エレクトロポレーション法により宿主に発現プラスミドを導入することにより行った。形質転換後、２ＳＬＥＮプレート培地に菌体を塗布した。２ＳＬＥＮ培地は、２ＳＬ培地にｐＨＴ１１０ ＥＧＦの耐性マーカーであるエリスロマイシンを１０μｌ／ｍｌの濃度に、ｐＮＣｃａｔＡの耐性マーカーであるネオマイシンを５０μｌ／ｍｌの濃度に添加した培地である。２ＳＬ培地の組成は、ポリペプトンＳ ４％、酵母エキス（ラルマン）０．５％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ｐＨ７．２である。この菌体を塗布した２ＳＬＥＮ培地を２日間３０℃の条件下に置き菌体の培養を行った。出現したコロニーを構成する形質転換体は、ｐＨＴ１１０ ＥＧＦとｐＮＣｃａｔＡの両方のプラスミドを保持していた。培養終了後、培養上清を還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色と抗ｈＥＧＦ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色を行った結果を図５（図面代用写真）に、抗ｈＥＧＦ抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果を図６（図面代用写真）にそれぞれ示す。
【００７３】
さらに、上清中の活性型ｈＥＧＦ量を知るために、別途ＨＰＬＣによる定量分析を行った。ＨＰＬＣの分析結果は、コントロールの平均が０．４１ｇ／ｌに対してＣａｔＡを共発現したものは０．６５ｇ／ｌという値だった。すなわち共発現によって約６０％の促進効果が認められた。
【００７４】
上記の実験の結果により、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡは、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他の遺伝子組換えタンパク質をコードするＤＮＡを共発現させることにより、生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の生産量を増加させる機能を有することが実証された。
【００７５】
以上の実験の結果により、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡは、ジスルフィド酸化還元活性を有すること、さらに、生理活性を示さないタンパク質に作用させることにより、該生理活性を示さないタンパク質を、生理活性を有するタンパク質に変換することに利用可能であること、またさらに、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡは、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他の遺伝子組換えタンパク質をコードするＤＮＡを共発現させることにより、生理活性を有する組換えタンパク質の生産量を増加させる機能を有することが実証された。
【００７６】
【発明の効果】
本発明は、ブレビバチルス属細菌由来のジスルフィド酸化還元活性を有する新規タンパク質ＣａｔＡ及び該タンパク質をコードするＤＮＡ、さらに該酵素を用いた生理活性を示さないタンパク質の活性化方法を提供する。本発明のタンパク質ＣａｔＡはジスルフィド酸化還元活性を有するため、生理活性を示さないタンパク質に作用させることにより、該生理活性を示さないタンパク質の活性化に利用可能である。さらに、本発明のタンパク質ＣａｔＡは、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他の遺伝子組換えタンパク質をコードするＤＮＡを共発現させることにより、生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の生産量を増加させる、ことに利用可能である。
【００７７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡの発現ベクターｐＮＣｃａｔＡの構築方法及び構造を示す図。
【図２】発現ベクターｐＮＣｃａｔＡに組み込まれた本発明の新規タンパク質ＣａｔＡの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図面代用写真。
【図３】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡのインスリンを用いた活性測定試験の結果を示す図。
【図４】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡを用いた活性型ｈＥＧＦの生成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図面代用写真。
【図５】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡとｈＥＧＦをコードするＤＮＡの共発現を行った培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色を行った結果を示す図面代用写真。
【図６】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡとｈＥＧＦをコードするＤＮＡの共発現を行った培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＥＧＦ抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果を示す図面代用写真。
【図７】遺伝子ｃａｔＡの塩基配列から推定される発現タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図８】本発明に係る遺伝子ｃａｔＡの塩基配列（配列番号２）を示す。
【図９】本発明に係るジスルフィド酸化還元活性を有する新規タンパク質ＣａｔＡのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図１０】遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の２７位以降のアミノ酸配列（すなわち、新規タンパク質ＣａｔＡのアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号４）を示す。
【図１１】プライマーＢｂＶＭ２の塩基配列（配列番号５）を示す。
【図１２】プライマーＢｂＶＭ２の塩基配列（配列番号６）を示す。
【図１３】プライマーＢｂ−ＯＸＲＥ２−５’の塩基配列（配列番号７）を示す。
【図１４】プライマーＢｂ−ＯＸＲＥ２−３’の塩基配列（配列番号８）を示す。
【図１５】プライマーＰｒｉｍｅｒ １（ｆｏｒｗａｒｄ）の塩基配列（配列番号９）を示す。
【図１６】プライマーＰｒｉｍｅｒ ２（ｂａｃｋｗａｒｄ）の塩基配列（配列番号１０）を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規ジスルフィド酸化還元酵素およびそれをコードする遺伝子、及び、該酵素を用いた活性型タンパク質の生産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
遺伝子組換え技術は、生体由来のペプチド又はタンパク質などで、微量成分として単離することが著しく困難であった物質を、微生物や動物細胞などを用いて大量に生産することを可能にした。しかしながら、遺伝子組換え技術を用いて生産されたタンパク質が、天然型のタンパク質が有している本来の生理活性を示さないことが、しばしばあり、大きな問題になっている。
【０００３】
このことの大きな原因のひとつとして考えられているのは、遺伝子組換え技術を用いて生産されたタンパク質は、一次構造（アミノ酸配列）こそ天然の生理活性を有するタンパク質と同じ正しい構造（配列）を有しているものの、その立体構造が生理活性を有する本来の立体構造と異なってしまうことである。
【０００４】
タンパク質の立体構造の形成・保持、および、それに伴う生理活性の発現にきわめて重要な役割を果しているのは、タンパク質分子内および／または分子間のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合である。遺伝子組換え技術を用いて生産されたタンパク質には、このジスルフィド結合に不備があること、すなわち、本来あるべきジスルフィド結合が形成されていなかったり、または、分子内および／または分子間のシステイン残基間で本来とは異なった位置のジスルフィド結合が形成されたりすることが多い。そのため、遺伝子組換えにより生産されたタンパク質の立体構造が、生理活性を有する本来のタンパク質の構造と異なってしまうか、さらに場合によっては、タンパク質の不溶性の凝集塊が生成されることが知られている。そして、このことにより、そのタンパク質が本来有するはずの生理活性の低下または消失が起こると考えられている。
【０００５】
また、化学合成されたポリペプチドや細胞抽出液中（Ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ系）を用いて生産されたタンパク質についても、ジスルフィド結合を欠く比較的折り畳みの少ない構造をとっているなど、本来の正しい立体構造を有していない場合が多く、そのために生理活性を示さないことが、しばしばあることが知られている。
【０００６】
ジスルフィド結合の形成・開裂は、２つのシステイン残基の単純な酸化還元反応である。したがって、適当な酸化還元条件の下でいずれの方向にも非酵素的に起こすことができる。そのため化学的な酸化還元反応により、ジスルフィド結合に不備があるタンパク質を正しいジスルフィド結合を持つタンパク質に変換する方法も知られている。しかしながら、こうした化学的な酸化還元反応による方法では、遺伝子組換え技術により生産されたタンパク質、特に、多数のジスルフィド結合を持つタンパク質に対して実用的な効率で、正確なジスルフィド結合を形成させることは不可能である。
【０００７】
そのため、生理活性を示さないタンパク質のジスルフィド結合を修正することにより生理活性を有するタンパク質を得るために、当業者において広く試みられている方法は、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質（以下、「ジスルフィド酸化還元酵素」と称する場合がある。）を作用させる方法である。たとえば、ジスルフィド酸化還元酵素としてチオレドキシンを用いた方法（例えば、非特許文献１参照）、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を用いた方法（例えば、特許文献１参照）などが知られている。また、ジスルフィド酸化還元酵素をコードするＤＮＡを宿主生物に導入し、目的とする遺伝子組換えタンパク質とジスルフィド酸化還元酵素を同時に発現させることにより、正しいジスルフィド結合を有するタンパク質を製造する方法も知られている（例えば、特許文献２参照）。
【０００８】
ジスルフィド酸化還元酵素として知られている主要なものには、チオレドキシン、ヒトＰＤＩ（例えば、非特許文献２、特許文献３参照）、および、大腸菌由来のＤｓｂ（例えば、非特許文献３、同４参照）を始めとするＤｓｂファミリーなどがある。さらに枯草菌（Bacillus subtilis）由来のものとしてＢｄｂ（例えば、非特許文献５参照）などが知られている。
【０００９】
これらのジスルフィド酸化還元酵素は、共通する特徴としてチオレドキシンモチーフ（Ｃ−Ｘ−Ｘ−Ｃ）（Ｃはシステイン残基、Ｘは任意のアミノ酸残基）と呼ばれるアミノ酸配列を有することが知られている。このチオレドキシンモチーフはジスルフィド酸化還元反応における活性部位とされている（例えば、非特許文献６参照）。さらにまた、既知のジスルフィド酸化還元酵素は、Ｎ末端側に分泌シグナル配列を持つタンパク質として生体内で合成されることが知られている。
【００１０】
【非特許文献１】
Pigiet V. P. and Schuster B.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 7643-7647, (1986)
【００１１】
【特許文献１】
特開昭６３−２９４７９６号公報
【００１２】
【特許文献２】
特開平１１−７５８７９号公報
【００１３】
【非特許文献２】
Rapilajaniemi et al., EMBO J. 6, 643-649, (1987)
【００１４】
【特許文献３】
特許２８０３０８９号
【００１５】
【非特許文献３】
EMBO J., 11、 55-62, (1992)
【００１６】
【非特許文献４】
Cell, 67, 581-589, (1991)
【００１７】
【非特許文献５】
Ｂｏｌｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，２４５３１−２４５３８（１９９９）
【００１８】
【非特許文献６】
曽根道夫、伊藤維昭，蛋白質・核酸・酵素，43， 1-10, (1998)
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】
以上のように、チオレドキシン、ＰＤＩを始めとするジスルフィド酸化還元酵素は、生理活性を示さないタンパク質の活性化に利用されている。しかしながら、生理活性を示さないタンパク質の種類によっては、これまでに知られているジスルフィド酸化還元酵素のいずれを用いても活性化することができない場合も多かった。このことの原因のひとつとして、ジスルフィド酸化還元酵素には、それぞれ基質特異性があり、ジスルフィド酸化還元酵素ごとに作用可能なタンパク質が異なっていることが挙げられる。
【００２０】
したがって、生理活性を示さない種々のタンパク質に対しても、ジスルフィド酸化還元酵素を用いた活性化を可能とするために、さらに新規なジスルフィド酸化還元酵素の提供が求められていた。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、以上のような課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えタンパク質生産における宿主として有効利用されているブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinesis）に着目し、そのゲノムからジスルフィド酸化還元活性を有すると推測される新規タンパク質遺伝子を見出しｃａｔＡと命名した。その塩基配列を配列番号２に示し、その配列から推定されるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００２２】
さらに、本発明者らは、上記した本発明に係る新規遺伝子ｃａｔＡの塩基配列（配列番号２）の内、該遺伝子に対応するタンパク質の分泌シグナル配列を除いた成熟部分をコードしていると推定した塩基配列（配列番号４）を有するＤＮＡを挿入した発現ベクターを構築し、さらに、該発現ベクターでブレビバチルス・チョウシネンシスを形質転換した。さらに、該形質転換体を培養することにより該ＤＮＡを大量発現させ、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡ（配列番号３）を得た。
【００２３】
さらに、本発明者らは、この新規タンパク質ＣａｔＡに対して、インスリンを用いたジスルフィド酸化還元活性の測定を行い、その結果、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡがジスルフィド酸化還元活性を有することを確認した。
【００２４】
またさらに、本発明者らは、この新規タンパク質ＣａｔＡを不活性型ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）に作用させることにより活性型ｈＥＧＦを得、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡが、不活性型タンパク質の活性化に利用可能であることを示した。
【００２５】
またさらに、本発明者らは、ブレビバチルス・チョウシネンシスを宿主として、ＣａｔＡをコードするＤＮＡとｈＥＧＦをコードするＤＮＡを共発現させ、その結果、活性型組換えｈＥＧＦの生産量が増大することを確認し、本発明のタンパク質ＣａｔＡは、他の遺伝子組換えタンパク質と共発現させることにより生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の生産量を増加させることに利用可能であることを実証した。以上により、本発明者らは本発明を完成するに至った。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明に付いて詳述する。
本発明のジスルフィド酸化還元活性を有する新規タンパク質ＣａｔＡのアミノ酸配列を配列番号３に例示する。このアミノ酸配列と４０％以上の相同性を有するものは報告されておらず、したがって、本発明のタンパク質ＣａｔＡは新規タンパク質である。
【００２７】
さらに、配列番号３に記載のアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもジスルフィド酸化還元活性を有する限り、全て本発明のジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質ＣａｔＡに包含される。ここで「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、アミノ酸残基の種類やタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置によっても異なるが、前記配列番号３のアミノ酸配列全体に対し、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を意味する。
【００２８】
上記の特定のアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列から成るポリペプチドは、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法、及びＰＣＲ法等の当業者に周知の方法を適宜組み合わせて、容易に作成することが可能である。
尚、その際に、実質的に同等の機能を有するためには、当該ポリペプチドを構成するアミノ酸のうち、同族アミノ酸（極性・非極性アミノ酸、疎水性・親水性アミノ酸、陽性・陰性荷電アミノ酸、芳香族アミノ酸など）同士の置換が可能性である。又、実質的に同等の機能の維持のためには、本発明の各ポリペプチドに含まれる機能ドメイン内のアミノ酸は保持されることが望ましい。
【００２９】
また、本発明のタンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号４に例示する。この塩基配列と４０％以上の相同性を有するものは報告されておらず、したがって、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは新規ＤＮＡである。さらに配列番号３に記載のアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであっても、そのコードしているタンパク質がジスルフィド酸化還元活性を有する限り、全て本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに包含される。ここで「１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列」の意味は、上記した本発明のタンパク質についての場合と同様である。
【００３０】
また、本発明のタンパク質ＣａｔＡをコードする遺伝子のＤＮＡは、上記したように、配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡを指すほか、あるいは、このＤＮＡの全塩基配列またはその一部から作製したプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを指すものである。
【００３１】
なお、本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることが出来る。
【００３２】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al, (1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３３】
さらに本発明の新規タンパク質ＣａｔＡは、当業者に公知の標準的な遺伝子組換え技術を適宜選択し、組み合わせて用いることにより得ることができる。たとえばモレキュラークローニング：ア ラボラトリーマニュアル第２版（Sambrooket al, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)）に記載の方法を用いて行うことができる。
【００３４】
本発明のタンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡは、例えば、後述の実施例１に示すようにしてブレビバチルス・チョウシネンシスのゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、このライブラリーから、例えば配列番号４で表される塩基配列の一部を有するＤＮＡ断片をプローブとして用いるハイブリダイゼーション法や、上記ＤＮＡ断片をプライマーとして用いるＰＣＲ法により、調製することができる。または、その塩基配列を元に、当業者に公知の核酸化学合成法などにより、本発明のタンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡを得ることもできるが、これらに限定されない。なお、配列番号１、２、３、４に示す配列は、それぞれ図７、８、９、１０にも示した。
【００３５】
ＣａｔＡをコードするＤＮＡの発現に用いる宿主は、ＣａｔＡをコードするＤＮＡの発現が可能なものであるならば特に限定されない。宿主としては、細菌や酵母、カビ、動物細胞などのいずれであっても利用可能であるが、好ましくは細菌であり、より好ましくはブレビバチルス属細菌である。特に好ましい宿主としてBrevibacillus choshinensis HPD31（ＦＥＲＭ ＢＰ−６８６３）や、その変異株であるBrevibacillus choshinensis HPD31-S5（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）を挙げることができる。
【００３６】
ＣａｔＡをコードするＤＮＡを挿入するベクターは、宿主中で複製可能であるものならば特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主とする場合には、特に好ましいベクターとしてｐＮＹ３０１（特開平１０−２９５３７８号）やｐＮＣＭＯ２（Yashiro et al, Protein Expression and Purification 23, 113-120 (2001)）を挙げることができる。
【００３７】
ベクターにＣａｔＡをコードするＤＮＡを挿入するには、例えば、精製されたＣａｔＡをコードする塩基配列を含むＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。また、ＣａｔＡをコードするＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要であることから、ベクターには、プロモーター、ＣａｔＡをコードするＤＮＡのほか、ターミネーター、リボソーム結合配列などを組み込んでもよい。
【００３８】
宿主への発現ベクターの導入方法も、特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主とする場合には、特に好ましい形質転換方法としてエレクトロポレーション法（Takagi et al, Agric. Biol. Chem.,53, 3099-3100 (1989)）を例示することできる。
【００３９】
ＣａｔＡをコードするＤＮＡの発現に用いる宿主の培養方法も、ＣａｔＡをコードするＤＮＡの発現が可能なものであるならば特に限定されないが、ブレビバチルス属細菌を宿主として使用する場合には、特に好ましい条件として、下記の実施例で用いたＴＭＮ培地、３０℃、２〜４日間を例示することができる。
【００４０】
さらに、発現されたＣａｔＡの単離、精製を行う場合には、当業者に公知の方法を適宜、単独または組み合わせて用いることにより行うことができる。たとえば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を適宜、単独または組み合わせて用いることにより可能である。
【００４１】
本発明のジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質ＣａｔＡを作用させることによる生理活性を示さないタンパク質の活性化方法において、該方法が適用可能な生理活性を示さないタンパク質としては、遺伝子組換え技術により生産された種々のタンパク質、ペプチド合成機によって化学的に合成された種々のポリペプチド、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質合成系により合成された種々のタンパク質、及び、そ（れら）の含有物などを例示することができる。また、遺伝子組換え技術により生産されるタンパク質としては、同タンパク質自体のほか、同生産培養物（形質転換体培養物）全体、同生産培養物から分別、分取した生物学的に不活性なタンパク質、及び、そ（れら）の含有物などを例として挙げることができる。
【００４２】
さらに、本発明のタンパク質の活性化方法において、タンパク質に作用させるＣａｔＡの量は特に限定されない。タンパク質にＣａｔＡを作用させる態様は、ＣａｔＡを緩衝液に溶解させた溶液をタンパク質に加えてもよいし、タンパク質を適当な変性剤を用いて可溶化した後、そのタンパク質溶液にＣａｔＡを加えてもよい。反応温度は０〜４０℃が好ましく、また、反応時間は１〜５時間が適当である。
【００４３】
また、本発明のＣａｔＡを生理活性を示さないタンパク質に直接作用させることもできるが、不溶性のタンパク質に作用させる場合には、まず、タンパク質を還元変性溶液に溶解し、さらにジスルフィド化合物の存在下においてＣａｔＡを作用させることが好ましい。還元変性溶液としては、０．１〜０．２Ｍジチオスレイトール、１〜６Ｍ塩酸グアニジン溶液、若しくは１〜８Ｍ尿素溶液が好ましく、変性溶液に溶解される生理活性を示さないタンパク質の濃度は０．１〜４０ｍｇ／ｍｌ程度が適当である。また、ジスルフィド化合物としては酸化型グルタチオン、もしくは酸化型ジチオスレイトールが好ましい。ジスルフィド化合物は反応溶液全体のスルフヒドリル化合物のモル濃度を上回る濃度で加える必要がある。
【００４４】
さらに、ＣａｔＡを生理活性を示さないタンパク質に反応させる際、ＣａｔＡをＭＦ膜等で閉じた空間に固定化し緩衝液等で溶解させたタンパク質溶液を通過させることによって接触させてもよいし、また疎水性の多孔性樹脂であるＨＰ−２０（三菱化学社製）の様な担体にＣａｔＡを吸着させることによって固定化し、固定化カラムとし、この固定化カラムにタンパク質溶液を供給することによってＣａｔＡと接触させてもよい。
【００４５】
また、本発明のタンパク質ＣａｔＡを、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡを共発現させることにより、生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の生産量を増加させることに用いることが可能である。この場合、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡの共発現を行う好ましい方法は、実施例に示したようにＣａｔＡをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡ、それぞれを含有する別の発現ベクターにより同時に形質転換された宿主を用いて共発現する方法である。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１：新規遺伝子ｃａｔＡのクローン化）
Brevibacillus choshinensis HPD31-S5（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）を５ｍｌＴＭＮ，３０℃，４日間という条件下で培養した。ＴＭＮ培地は、ＴＭ培地にネオマイシンを５０μｌ／ｍｌの濃度に添加した培地である。ＴＭ培地の組成は、ポリペプトン１％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．２％、グルコース１％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ｐＨ７．０である。培養終了後、培養液を室温で遠心（８０００回転、３０分）し、集菌した。次に、集めた菌体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で２回洗浄後、フェノール層に分離調製することにより、Brevibacillus choshinensis HPD31-S5の染色体ＤＮＡを調製した。
【００４８】
さらに、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質をコードしていると推測される枯草菌のｙｎｅＮ及びBacillus haloduransのＢＨ１５２２両遺伝子の塩基配列を参考にしてプライマーを設計し、上記で得たBrevibacillus choshinensis HPD31-S5の染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを行い、約１８０ｂｐの増幅産物を得た。使用したプライマーは、次のとおり。
【００４９】
ＢｂＶＭ２（ｆｏｒｗａｒｄプライマー）：５’−ＣＡＴＫＴＴＴＧＧＲＣＫＷＣＤＴＧＧＴＧ−３’（配列番号５：図１１）
ＢｂＶＭ４（ｂａｃｋｗａｒｄプライマー）：５’−ＧＴＣＲＡＫＶＡＶＡＡＹＳＧＧＤＡＡＳＧＴ−３’（配列番号６：図１２）
（上記配列中、Ｒは、ＡまたはＧ、Ｙは、ＣまたはＴ、Ｗは、ＡまたはＴ、Ｓは、ＧまたはＣ、Ｋは、ＧまたはＴ、Ｄは、ＡまたはＧまたはＴ、Ｖは、ＡまたはＣまたはＧ、をそれぞれ表す。また、ｆｏｒｗａｒｄプライマーＢｂＶＭ２は、枯草菌ｙｎｅＮ遺伝子ＯＲＦの１９２番目から２１２番目の塩基配列に対応し、ｂａｃｋｗａｒｄプライマーＢｂＶＭ４は同じく３５５番目から３７５番目の配列に対応する。）
【００５０】
また、ＰＣＲは、１．９５℃ ９分、２．９４℃ ３０秒、３．４０℃ ６０秒、４．７２℃ ９０秒、５．６０℃ １０分：２から４は４０サイクルの条件で行った。
【００５１】
さらに、このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化ｐＢＲ３２２にクローン化し、塩基配列を解読したところ、ｙｎｅＮ及びＢＨ１５２２両遺伝子との類似性から、ＰＣＲ産物が目的遺伝子の部分配列であることが確認された。次に、増幅産物をプローブにしてＰｓｔＩ消化ブレビス染色体のサザン解析を行い、約２．５ｋｂｐ断片中に目的遺伝子が含まれることを示す結果を得た。そこで増幅産物の内部配列から以下の２本のプライマーを設計した。
【００５２】
Ｂｂ−ＯＸＲＥ２−５’：５’−ＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＡＧＴＣＣ−３’（配列番号７：図１３）
Ｂｂ−ＯＸＲＥ２−３’：５’−ＣＣＴＧＡＴＣＴＴＴＧＴＡＣＴＴＣＴＣＧＴＡＣ−３’（配列番号８：図１４）
【００５３】
制限酵素ＰｓｔＩで消化したBrevibacillus choshinensis HPD31-S5の染色体ＤＮＡをアガロース電気泳動にかけ、ゲルから２．６ｋｂｐの大きさに相当するバンドを切りだし、ｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｉｏｎを行った。このｓｅｌｆ−ｌｉｇａｔｅｄ ＤＮＡをテンプレートとし、上記の２本のプライマーを用いてＰＣＲを行い、２．６ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。さらに、この産物の塩基配列を解読し、目的遺伝子の全長が含まれることを確認した。この５３１ｂｐのジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質をコードしていると推測される新規遺伝子をｃａｔＡと命名した。遺伝子ｃａｔＡの塩基配列を配列番号２（図８）に示す。また遺伝子ｃａｔＡの塩基配列から推定されるｃａｔＡに対応するタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１（図７）に示す。この１７７アミノ残基のタンパク質において、チオレドキシンモチーフは７３−７６位に存在している。
【００５４】
（実施例２：ＣａｔＡの遺伝子組換え法による生産）
さらに、この新規遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質において、１−２６位までが分泌シグナル配列であり、２７番目のアラニン以降が成熟体である、と推定し、以下に示すように成熟体であると推定した部分について遺伝子組換えによる生産を試みた。ただし、実際に該タンパク質がブレビバチルス・チョウシネンシスにおいて分泌タンパク質であるのか、さらに、分泌されるとして、その分泌シグナル切断箇所がアラニンの前であるのか、という点に関しては今後をまたねばならない。
【００５５】
実施例１で得た新規遺伝子ｃａｔＡの塩基配列を基に下記の２本のプライマーを作製し、Brevibacillus choshinensis HPD31-S5の染色体ＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲを行い、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の成熟体と推定した２７位のアラニン以降をコードする遺伝子を増幅した。ＰＣＲは９５℃で１分、５４℃で１分、７２℃で１分のサイクルを２６回繰り返すことにより行った。
【００５６】
Ｐｒｉｍｅｒ １（ｆｏｒｗａｒｄ）：５’−ＧＧＴＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＧＴＡＧＣＡＧＡＧＧＴＣ−３’（配列番号９：図１５）
Ｐｒｉｍｅｒ ２（ｂａｃｋｗａｒｄ）：５’−ＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡＧＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１０：図１６）
また、発現ベクターにクローニングを行うために、Ｐｒｉｍｅｒ １にはＰｓｔＩサイト（ＣＴＧＣＡＧ）を、Ｐｒｉｍｅｒ ２にはＢａｍＨＩサイト（ＧＧＡＴＣＣ）を設けた。
【００５７】
次に、上記で得たＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化後、同じ酵素で処理した発現ベクターｐＮＣＭＯ２（Yashiro et al, Protein Expression and Purification 23, 113-120 (2001)）に結合し、発現プラスミドｐＮＣｃａｔＡを得た。発現ベクターｐＮＣｃａｔＡの構築方法及び構造を図１に示す。
【００５８】
このｐＮＣｃａｔＡにおいて、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質のアミノ酸配列の２７位のアラニン以降をコードするＤＮＡが、ｐＮＣＭＯ２が含有するブレビス細胞壁タンパク質の分泌シグナル配列につながることになる。したがってＨＰＤ３１−Ｓ５から分泌されたＣａｔＡは、アラニンの前で分泌シグナル配列が切り離されるため、分泌生産されたタンパク質のＮ末端はアラニンになると予想される。
【００５９】
さらに、この発現プラスミドｐＮＣｃａｔＡをエレクトロポレーション法（Takagi et al, Agric. Biol.Chem., 53, 3099-3100(1989)）によりBrevibacillus choshinensis HPD31-S5（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６２３）に導入した。得られた形質転換体をBrevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCcatAと命名し、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９１２４として寄託した。
【００６０】
そして、この形質転換体Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCcatA（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１２４）を３０℃下、ＴＭＮ培地３ｍｌ中で２日間培養した。培養終了後、培養液を室温で遠心（８０００回転、３０分）し、上清４μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示す。このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果が示すように、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の２７位以降のアミノ酸残基の分子量約１７ｋＤａに相当する位置に染色バンドが存在しており、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の２７位以降のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（塩基配列を配列番号４（図１０）に示す。）の発現、および、遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の２７位以降のアミノ酸配列を有するタンパク質である本発明の新規タンパク質ＣａｔＡの分泌生産が確認された。また分泌生産されたＣａｔＡのＮ末端分析を行いＮ末端がアラニンであることを確認した。以上により得られたＣａｔＡのアミノ酸配列を配列番号３（図９）に示す。なお、図２（ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す図面代用写真）において、１は宿主菌の培養上清の結果、２は宿主菌を形質転換した形質転換体の培養上清の結果をそれぞれ示すものである。
【００６１】
（実施例３：ＣａｔＡの活性測定）
さらに、以下の手順に従って、上記実施例２で得た本発明の新規タンパク質ＣａｔＡを用いて、インスリンのシステイン残基の酸化還元によるジスルフィド結合形成・開裂反応を行い、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡのジスルフィド酸化還元活性を評価した。
【００６２】
ＣａｔＡの酵素標品の調製は以下の手順で行った。実施例２で作製した形質転換体Brevibacillus choshinensis HPD31-S5/pNCcatA（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１２４）を５ｍｌＴＭＮ培地，３０℃，４日間という条件下で培養した。培養終了後、培養液を室温で遠心（８０００回転、３０分）し、その上清１００μｌをＣａｔＡの酵素標品とした。
【００６３】
酵素反応を起こさせるインスリンを溶解させた基質溶液は以下のように調製した。まず２５ｍｇのインスリンを２ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０に溶かし、次いで１規定ＨＣｌを加えてｐＨ２〜３とした後、直ちに１規定ＮａＯＨを加えてｐＨを元の８．０に戻した。その後、水を加えて全量を２．５ｍｌとし、１０倍濃度のストック溶液とした。活性測定の際はこのストック溶液を２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１０倍に希釈して用いた。
【００６４】
上記で調製したインスリンを溶解させた基質溶液５００μｌを分光光度計用ガラスキュベットに入れ、さらに上記で得たＣａｔＡの酵素標品１００μｌと０．１Ｍ ＤＴＴ５μｌを加えて２５℃下で反応させた。反応の経過はＯ．Ｄ．６５０での、反応液の濁度変化の観測によって追跡した。なお対照としてｐＮＣＭＯ２の溶液を用いた。測定結果を図３に示す。
【００６５】
図３の測定結果が示すように、ＣａｔＡの添加により反応液の濁度の上昇が認められた。このことはＣａｔＡの添加によりインスリン分子内、もしくはインスリン分子間にジスルフィド結合が形成され、その結果、インスリン分子同士による凝集が生じたためであると考えられる。
この結果は、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡがジスルフィド酸化還元活性を有することを示している。
【００６６】
（実施例４：ＣａｔＡを用いた生理活性を示さないｈＥＧＦの生理活性を有するｈＥＧＦへの変換）
（１）不活性型組換えヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）の調製
ｈＥＧＦ発現プラスミドを保持するBrevibacillus choshinensisは、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）を高生産するが、生産されたｈＥＧＦの一部が、ｈＥＧＦ分子間でジスルフィド結合を形成することにより多量体化することが宮内らにより報告されている（Miyauchi et al, Journal of Industrial Microbiologyand Biotechnology, 21, 208〜214, (1998)）。この多量体ｈＥＧＦは、ｈＥＧＦが本来有する生理活性を持たない不活性型ｈＥＧＦであることが知られており、また、同文献において多量体ｈＥＧＦを培養液から分取する方法についても報告されている。そこで、不活性型ｈＥＧＦである多量体ｈＥＧＦを同文献の記載に基づき、下記の方法により調製した。
【００６７】
上記文献に記載のヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）発現プラスミドｐＨＴ１１０ ＥＧＦを保持するBrevibacillus choshinensis HPD31-S5を同文献記載の培養条件で６５時間液体培養し、遠心分離により培養上清を回収した。ついで、上清液を６Ｍ塩酸でｐＨ３．０に調整することにより、多量体ｈＥＧＦを特異的に凝集させ、この沈殿を遠心分離で回収した。０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の緩衝液で沈殿を溶解後、再度６Ｍ塩酸でｐＨ３．０に調整し、沈殿を遠心分離し回収した。さらに、沈殿を蒸留水に懸濁し、水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．０に調整後、凍結乾燥し、不活性型ｈＥＧＦである多量体ｈＥＧＦを調整した。
【００６８】
（２）不活性型ｈＥＧＦの活性型ｈＥＧＦへの変換
上記の方法によって調製した不活性型ｈＥＧＦを用い、以下の手順でＣａｔＡによる不活性型タンパク質の活性化を試験した。まず、不活性型ｈＥＧＦ溶液（５ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ６．０）にエリスロマイシンとクロラムフェニコールをそれぞれ１００μｇ／ｍｌ、ネオマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、さらに１００ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を加えてｈＥＧＦの濃度が２ｍｇ／ｍｌとなる溶液を調製した。この溶液を酵素反応の反応基質とした。
【００６９】
評価するサンプル溶液は次のように調製した。また宿主菌株には、Brevibacillus choshinensis HPD31を用いた。ＣａｔＡ発現ベクターｐＮＣｃａｔＡを保持するＨＰＤ３１、ｐＮＣＭＯ２を保持するＨＰＤ３１及びプラスミドを保持しないＨＰＤ３１、以上３種類のＨＰＤ３１を、プラスミドを保持するＨＰＤ３１についてはＴＭ＋ネオマイシン培地で、保持しないＨＰＤ３１の場合は薬剤を含まないＴＭ培地で２日間培養した。培養終了後、それぞれの培養液を、同じ培養液の遠心上清を適量添加することによって希釈し、Ｏ．Ｄ．６６０＝２に調整した。この希釈液をサンプル溶液とした。
【００７０】
調製した基質溶液とサンプル溶液を用いて以下の手順で活性測定を行った。９９μｌの基質溶液に１００μｌのサンプル溶液と２００ｍＭ還元型グルタチオン１μｌを加え、３５℃下で反応をスタートさせた。反応開始後１，３，６，１２時間後に反応液を遠心し、その上清５０μｌと、メルカプトエタノールを含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液５０μｌを混合、７０℃で１０分間加熱後、その２０μｌを使いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図４に示す。なお、図４（ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す図面代用写真）において、横軸の１，２，３，４はそれぞれ反応開始後１，３，６，１２時間後の反応液を示す。
【００７１】
図４が示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ＣａｔＡを含有するサンプル溶液を添加した反応液において活性型ｈＥＧＦの分子量に相当するバンドが得られ、そのバンドは反応時間の経過とともに濃くなっている。したがって、本発明のタンパク質ＣａｔＡは、生理活性を示さないタンパク質に作用させることにより、該タンパク質を、生理活性を有するタンパク質に変換する機能を有することが実証された。
【００７２】
（実施例５：ｈＥＧＦとＣａｔＡの共発現による活性型ｈＥＧＦ生産量の変化）
さらに、ｈＥＧＦ発現プラスミドｐＨＴ１１０ ＥＧＦとＣａｔＡ発現プラスミドｐＮＣｃａｔＡを同一宿主中に導入し、ｈＥＧＦ生産に及ぼすＣａｔＡ共発現の効果を検討した。宿主にはBrevibacillus choshinensis HPD31-S5を用いた。また、宿主の形質転換は、発現プラスミドｐＨＴ１１０ ＥＧＦ及びｐＮＣｃａｔＡを１対１の割合で混合した後、エレクトロポレーション法により宿主に発現プラスミドを導入することにより行った。形質転換後、２ＳＬＥＮプレート培地に菌体を塗布した。２ＳＬＥＮ培地は、２ＳＬ培地にｐＨＴ１１０ ＥＧＦの耐性マーカーであるエリスロマイシンを１０μｌ／ｍｌの濃度に、ｐＮＣｃａｔＡの耐性マーカーであるネオマイシンを５０μｌ／ｍｌの濃度に添加した培地である。２ＳＬ培地の組成は、ポリペプトンＳ ４％、酵母エキス（ラルマン）０．５％、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ ０．００１％、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．００１％、ｐＨ７．２である。この菌体を塗布した２ＳＬＥＮ培地を２日間３０℃の条件下に置き菌体の培養を行った。出現したコロニーを構成する形質転換体は、ｐＨＴ１１０ ＥＧＦとｐＮＣｃａｔＡの両方のプラスミドを保持していた。培養終了後、培養上清を還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色と抗ｈＥＧＦ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して、ＣＢＢ（クマシーブリリアントブルー）染色を行った結果を図５（図面代用写真）に、抗ｈＥＧＦ抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果を図６（図面代用写真）にそれぞれ示す。
【００７３】
さらに、上清中の活性型ｈＥＧＦ量を知るために、別途ＨＰＬＣによる定量分析を行った。ＨＰＬＣの分析結果は、コントロールの平均が０．４１ｇ／ｌに対してＣａｔＡを共発現したものは０．６５ｇ／ｌという値だった。すなわち共発現によって約６０％の促進効果が認められた。
【００７４】
上記の実験の結果により、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡは、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他の遺伝子組換えタンパク質をコードするＤＮＡを共発現させることにより、生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の生産量を増加させる機能を有することが実証された。
【００７５】
以上の実験の結果により、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡは、ジスルフィド酸化還元活性を有すること、さらに、生理活性を示さないタンパク質に作用させることにより、該生理活性を示さないタンパク質を、生理活性を有するタンパク質に変換することに利用可能であること、またさらに、本発明の新規タンパク質ＣａｔＡは、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他の遺伝子組換えタンパク質をコードするＤＮＡを共発現させることにより、生理活性を有する組換えタンパク質の生産量を増加させる機能を有することが実証された。
【００７６】
【発明の効果】
本発明は、ブレビバチルス属細菌由来のジスルフィド酸化還元活性を有する新規タンパク質ＣａｔＡ及び該タンパク質をコードするＤＮＡ、さらに該酵素を用いた生理活性を示さないタンパク質の活性化方法を提供する。本発明のタンパク質ＣａｔＡはジスルフィド酸化還元活性を有するため、生理活性を示さないタンパク質に作用させることにより、該生理活性を示さないタンパク質の活性化に利用可能である。さらに、本発明のタンパク質ＣａｔＡは、ＣａｔＡをコードするＤＮＡと他の遺伝子組換えタンパク質をコードするＤＮＡを共発現させることにより、生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の生産量を増加させる、ことに利用可能である。
【００７７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡの発現ベクターｐＮＣｃａｔＡの構築方法及び構造を示す図。
【図２】発現ベクターｐＮＣｃａｔＡに組み込まれた本発明の新規タンパク質ＣａｔＡの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図面代用写真。
【図３】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡのインスリンを用いた活性測定試験の結果を示す図。
【図４】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡを用いた活性型ｈＥＧＦの生成を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの図面代用写真。
【図５】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡとｈＥＧＦをコードするＤＮＡの共発現を行った培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色を行った結果を示す図面代用写真。
【図６】本発明の新規タンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡとｈＥＧＦをコードするＤＮＡの共発現を行った培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、抗ＥＧＦ抗体を用いたウェスタンブロットを行った結果を示す図面代用写真。
【図７】遺伝子ｃａｔＡの塩基配列から推定される発現タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図８】本発明に係る遺伝子ｃａｔＡの塩基配列（配列番号２）を示す。
【図９】本発明に係るジスルフィド酸化還元活性を有する新規タンパク質ＣａｔＡのアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図１０】遺伝子ｃａｔＡに対応するタンパク質の２７位以降のアミノ酸配列（すなわち、新規タンパク質ＣａｔＡのアミノ酸配列）をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号４）を示す。
【図１１】プライマーＢｂＶＭ２の塩基配列（配列番号５）を示す。
【図１２】プライマーＢｂＶＭ２の塩基配列（配列番号６）を示す。
【図１３】プライマーＢｂ−ＯＸＲＥ２−５’の塩基配列（配列番号７）を示す。
【図１４】プライマーＢｂ−ＯＸＲＥ２−３’の塩基配列（配列番号８）を示す。
【図１５】プライマーＰｒｉｍｅｒ １（ｆｏｒｗａｒｄ）の塩基配列（配列番号９）を示す。
【図１６】プライマーＰｒｉｍｅｒ ２（ｂａｃｋｗａｒｄ）の塩基配列（配列番号１０）を示す。
Claims (8)
- 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質ＣａｔＡ。
（ａ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質。 - 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、付加、もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質。 - 以下の（Ａ）または（Ｂ）に示すＤＮＡである請求項２に記載の遺伝子のＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号４に示す塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号４に示す塩基配列またはその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - タンパク質ＣａｔＡをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにより形質転換してなる形質転換体、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）ＨＰＤ３１−Ｓ５／ｐＮＣｃａｔＡ（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１２４）。
- ＣａｔＡをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにより宿主を形質転換した形質転換体を培養し、培養物からＣａｔＡを回収することを特徴とする、ジスルフィド酸化還元活性を有するタンパク質ＣａｔＡの製造方法。
- 生理活性を示さないタンパク質にＣａｔＡを作用させること、を特徴とするタンパク質の活性化方法。
- 遺伝子組換えタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクター、及び、ＣａｔＡをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターにより、宿主を形質転換し、該宿主を培養することにより、該遺伝子組換えタンパク質をコードするＤＮＡとＣａｔＡをコードするＤＮＡを同時に発現させ該遺伝子組換えタンパク質を回収すること、を特徴とする生理活性を有する遺伝子組換えタンパク質の製造方法。
- 遺伝子組換え宿主が、ブレビバチルス・チョウシネンシス（Brevibacillus choshinensis）である請求項５または７に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002362120A JP4252299B2 (ja) | 2002-12-13 | 2002-12-13 | 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002362120A JP4252299B2 (ja) | 2002-12-13 | 2002-12-13 | 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004187625A true JP2004187625A (ja) | 2004-07-08 |
| JP4252299B2 JP4252299B2 (ja) | 2009-04-08 |
Family
ID=32760662
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002362120A Expired - Fee Related JP4252299B2 (ja) | 2002-12-13 | 2002-12-13 | 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4252299B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024005059A1 (ja) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 標的分子の還元方法、還元装置、及び、電極 |
-
2002
- 2002-12-13 JP JP2002362120A patent/JP4252299B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024005059A1 (ja) * | 2022-06-30 | 2024-01-04 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 標的分子の還元方法、還元装置、及び、電極 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4252299B2 (ja) | 2009-04-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blum et al. | DnaK-mediated alterations in human growth hormone protein inclusion bodies | |
| KR101299417B1 (ko) | 카복시-말단 아미드화 펩티드를 제조하는 방법 | |
| JP2686090B2 (ja) | 新規融合蛋白質およびその精製方法 | |
| JP5398004B2 (ja) | 改変型グルコース脱水素酵素遺伝子 | |
| JP2803089B2 (ja) | ポリペプチドおよびその製造法 | |
| KR20000068934A (ko) | 개선된 발현 벡터 | |
| JP5224572B2 (ja) | デキストラン生成酵素遺伝子、デキストラン生成酵素およびその製造方法、デキストランの製造方法 | |
| JPH11514530A (ja) | （２．５―ｄｋｇ）リダクターゼの各種改良型変異体 | |
| JPH0956383A (ja) | 変異型ウリカーゼ、変異型ウリカーゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び変異型ウリカーゼの製造法 | |
| TWI282370B (en) | Improved method for the recombinant production of polypeptides | |
| JPH1175876A (ja) | 新規な微生物トランスグルタミナーゼの製造法 | |
| RU2144957C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPINS07, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЧЕЛОВЕКА | |
| JP2000504561A (ja) | Ｉｌ―１６活性のあるポリペプチド類、その製造方法およびその使用 | |
| KR20210089699A (ko) | 산화성 세포질을 갖는 대장균 균주 | |
| JP4252299B2 (ja) | 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 | |
| KR0161656B1 (ko) | 글루카곤의 생산방법 | |
| WO1988005816A1 (en) | Polypeptide | |
| RU2441072C1 (ru) | ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА | |
| RU2337964C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pAS-2, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ПРОИНСУЛИНА Aspart ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BAS2 - ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА Aspart | |
| RU2426780C2 (ru) | ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК p6E-tTF, КОДИРУЮЩАЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ И ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ДОМЕНЫ ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА И ШТАММ E.coli BL21[DE3]/p6E-tTF-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО ТКАНЕВОГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА | |
| JPH08103278A (ja) | 活性型ヒトａｌｔの製造方法 | |
| RU2729357C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pF267, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ ПОЛИПЕПТИД, СОДЕРЖАЩИЙ ПРОИНСУЛИН ЛИЗПРО, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО ПОЛИПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО ПРОИНСУЛИН ЛИЗПРО | |
| US7829687B2 (en) | Artificial disulfide isomerases and uses thereof | |
| CN117756925A (zh) | 一种重组弹性蛋白Pro.ELP及其制备方法和应用 | |
| JP3173619B2 (ja) | ピログルタミルアミノペプチダーゼの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051018 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20051208 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080701 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080821 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081028 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081212 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090120 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090121 |
|
| R150 | Certificate of patent (=grant) or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120130 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150130 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |