JPS63294796A - タンパク質の再賦活化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は、タンパク質の再賦活化方法に関し、特に、
例式は遺伝子工学的手法に基づき微生物により産生され
たタンパク質であって、その立体構造が天然型タンパク
質と異なるために生理活性を有さないタンパク質のよう
な、その立体構造の故に生理活性を有さないタンパク質
の再賦活化方法に関する。

［従来技術及びその欠点］ 組換えＤＮＡ技術は、生体由来のペプチド又はタンパク
質をどで、微量成分として単離することが著しく困難で
あった物質を、微生物などを用いて大量に調製すること
を可能にした。しかし、細菌等を用いて発現された異種
タンパク質は、しばしば、宿主細胞内で変性した沈殿物
として、生物学的に不活性な状態で存在することが知ら
れている、これは、タンパク質の一次構造は組換えＤＮ
Ａに由来する天然型の正しい構造となっているが、その
立体構造が生物学的に正しい特定の構造とはなっていな
いことが原因と考えられている。

このような、その立体構造の故に生理活性を有さないタ
ンパク質の活性を回復させる方法として、特開Ｉｖ１５
９−１６１３２１号には、沈殿した不活性なタンパク質
を強力な変性剤を用いて可溶化し、この可溶化液を希釈
し、あるいは弱い変性溶液と置換することにより活性型
として回収することが開示されている。

しかしながら、このような方法は、タンパク質溶液の容
量の著しい増加をもたらし、また、活性回復のために著
しく長い時間を要するという欠点を有する。

［発明が解決しようとする問題点］ この発明の目的は、その立体構造の故に生理活性を有さ
ないタンパク質を再賦活化する方法であって、従来の方
法に比べて短時間で行なうことができ、かつ、タンパク
質溶液の容量をそれほど増加させることなく行なうこと
ができる方法を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本願発明者らは、鋭意研究の結果、その立体構造の故に
生理活性を有さないタンパク質にプロティンジスルフィ
ドイソメラーゼを作用させることにより、タンパク質の
活性を復活させる。すなわち、タンパク質を再賦活化す
ることができることを見出し、この発明を完成した。

すなわち、この発明は、生理活性を有するタンパク質と
同一の一次構造を有するが異なる立体構造を有するため
に不活化されたタンパク質にプロティンジスルフィドイ
ソメラーゼを作用させることから成るタンパク質の再賦
活化方法を提供する。

［発明の効果］ この発明の方法によると、その立体構造が天然型のもの
と異なるために生理活性を有さないタンパク質を従来方
法よりも短時間内に効果的に再賦活化することができる
。また、従来方法に比べ、タンパク質溶液の容量の増加
がはるかに少ない、この発明により、遺伝子工学的手法
に基づき微生物により産生されたタンパク質であつて、
その立体構造が天然型と異なるために生理活性を有さな
いものを短時間内に効率良く再賦活化できるので、この
発明は、遺伝子工学的手法の商業的実施に大きな恩恵を
もたらすものと信じられる。

［発明の詳細な説明］ この発明の方法に用いられるプロティンジスルフィドイ
ソメラーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｌｓ
ｏｍｅｒａｓｅ、　［ＥＣ５，３，４、ｌ］は肝臓や膵
臓のミクロゾーム画分に存在することが見出された酵素
であって、還元型タンパク質のジスルフィド結合の形成
及びその他のタンパク質のジスルフィド結合の再形成を
触媒する（　Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ、　Ｒ，Ｆ、　、　
Ｅｐｓｔｅｉｎ、　　Ｃ，Ｊ、　　＆　　Ａｎｆｉｎｓ
ｅｎ、　　Ｃ，Ｂ、、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈ
ｅｗ。

２３８．６２８−６３５　（１９６３）；　Ｇｉｖｏｌ
　Ｄ、、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ、　Ｒ。

Ｆ、、　　ａｎｄ　　Ａｎｆｉｎｇｅｎ　　Ｃ，Ｂ、、
　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、　　２３９゜コ
１１４．　　（１９６４）；　　Ｆｒｅｅｄｍａｎ、　
　Ｒ，Ｂ、　　ａｎｄ　　旧１１ｓｏｎ。

Ｄ、　　Ａ、　　（１９８０）、　　”Ｔｈｅ　　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　Ｐｏ５ｔ−ｔｒａｎｓｌ
ａｔｉｏｎａｌ　　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｏｆ
　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｖｏｌ。

１、　ｐｐ１６７−２１２．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ）、プロティンジスルフィドイソメラーゼは、後
述の実施例に記載する、ＬａｍｂｅｒｔとＦｒｅｅｄｍ
ａｎの方法（Ｂｉｏｃｈｅ＊、　Ｊ。

２１３２２５−２３４　（１９８３））に従い調装する
ことができる。なお、グリタチオニンシュリントランス
ヒドロゲナーゼ及びチオールプロティンジスルフィドオ
キシトレダクターゼ（ＥＣ１，８，４，２）（Ｃａｒｍ
ｉｃｈａｅｌＤ、　Ｆ、　Ｍａｒｉｎ　Ｊ、　Ｅ、及び
Ｄｉｘｏｎ　Ｊ、　Ｅ、、　Ｊ、　Ｂ、　Ｃ。

２５２、７１６３−７１６７　（１９７７）；　Ｃｈａ
ｎｄｌｅｒ、　Ｍ、Ｌ、及びＶａｒａｎｄａｎｉ、　　
Ｐ、　　Ｔ、、　　Ｂｉｏｃｈｉ＠、　　Ｂｉｏｐｈｙ
＋、　　Ａｃｔａ。

３９７、３０７−３１７　（１９７５）は、この発明で
使用するプロティンジスルフィドイソメラーゼと同一酵
素とみなし５、これらの使用は本発明に包含される。

この発明、の方法により再賦活化することができるタン
パク質は、その−次構造は活性型のタンパク質と同一で
あるが、ジスルフィド結合が正常でないためにその立体
構造が活性型の立体構造とは異なるが故に生理活性を有
さないものであればどのようなタンパク質でもよい、こ
のようなものの例として１組換えＤＮＡ法により微生物
により産生される種々のタンパク質及びポリペプチド、
例えばウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、インシュリン
、ツマトメ９２０１組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー、パイプリットブラスミノーゲンアクチベーター、イ
ンターフェロン、カルシトニン、Ｂ型肝炎ウィルスやポ
リオウィルス由来のタンパク質、並びにリンホトキシン
、γ−インターフェロン、インターロイキン２及び顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子等のようなリンホカ
インを挙げることができる。

この発明の方法では、不活性タンパク質にプロティンジ
スルフィドイソメラーゼを作用させる。この場合、プロ
ティンジスルフィドイソメラーゼの量は特に限定されな
いが、通常、タンパク買１■ｇ当たり２５μｇないし２
．５會ｇ単位である。

タンパク質にプロティンジスルフィドイソメラーゼを作
用させる態様は、プロティンジスルフィドイソメラーゼ
を緩衝液に溶解させた溶液なタンパク質に加えてもよい
し、後にさらに詳述するように、タンパク質を適当な変
性剤を用いて可溶化した後、そのタンパク買溶液にプロ
ティンジスルフィドイソメラーゼを加えてもよい０反応
温度は０ないし４５℃が好ましく、また１反応時間は１
時間ないし５時間が適当である。

上述したように、不活性な不溶性のタンパク質にプロテ
ィンジスルフィドイソメラーゼを直接作用させることも
できるが、先ず、タンパク質を弱い変性溶液に溶解し、
さらにスルフヒドリル化合物の存在下においてプロティ
ンジスルフィドイソメラーゼを作用させることが好まし
い０弱い変性溶液としては０．５ト４Ｍ塩酸グアニジン
溶液及び１〜８Ｍ尿素溶液が好ましく、変性溶液に溶解
される不活性なタンパク質の濃度は０．１ｍｇ／ｍｌな
いし１０膳ｇ／■ｌ程度が適当である。また、スルフヒ
ドリル化合物としてはβ−メルカプトエタノール。

還元型グルタチオン、及びシスティンが好ましい、スル
フヒドリル化合物は反応溶液全体に対し０．０１％ない
し０．１　％の終濃度となるように加えることが好まし
い。

［９１明の実施例コ 以下の実施例では、組換えＤＮＡ法により大ｎ＊によっ
て産生された不溶性の不活性ヒトウロキナーゼを再賦活
化した。

Ａ二二ＬＺＺ五土Ｚヱ上ヱヱ）５ニエＬ１１ウシノ肝臓
から、　ＬａｍｂｅｒｔとＦｒｅｅｔｓａｎの方法によ
りプロティンジスルフィドイソメラーゼを調製した。す
なわち、ウシ肝臓を、　ＴｒｉｔｏｎＸ〜１（１０を含
むリン８＃緩衝液中でホモジナイズしたものを遠心分離
し、上清を回収し、これを５４℃で１５分Ｍ熱処理する
ことにより不溶性となるタンパク質を遠心除去した。続
いて硫酸アンモニウムにょる塩析画分をカルボキシメチ
ル−セファデックス（ファルマシア社製）カラムに通じ
、非受着画分をさらにジエチルアミノエ′チルーセファ
セルカラム（７アル７シア社製）にて分画することによ
って精製されたプロティンジスルフィドイソメラーゼを
得た。

ヒトプロウロキナーゼの抽出及びプロティンジスルフィ
ドイソメラーゼによる ヒトプロウロキナーゼをコードする遺伝子を含むプラス
ミドであるｐＨ１ＵＴ４Ｌを含有するヒトウロキナーゼ
産生大腸菌である大腸菌に−１２、ＪＭ１０３／ｐＨＵ
Ｔ４Ｌ　（特開昭６ｌ−１８１３７７）を、０．２駕酵
母エキスを含む５００■ｌのＭ９培地にて３７℃、６時
間培養後、遠心分離により集菌した。

得られた菌を１０ｍ１のｏ、ｉｍトリス塩酸縛緩衝液ｐ
）１８．０）に懸濁し、１０分間の超音波処理にて国体
を破砕し、遠心分離にて菌体破砕物とともに顆粒状態に
なつたヒトプロウロキナーゼを回収した。

このようにして得られたヒトプロウロキナーゼを含む顆
粒に０．ＩＭ）−リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）１０ｍ
１．８　Ｍ塩酸グアニジン１０ｍ１を加え、室温で１時
間放置した。この可溶化液を２ｍＭ還元型グルタチオン
、０．２ｍＭ酸化歴グルタチオン、　　１　　ａｌｌＥ
ＤＴＡｔ含ｔｒＯ，ＩＭト’）　Ｘ塩ＨＩＩＩＩＷｔｌ
ｌ（ｐＨ８，Ｄ）　テ塩ｍグアニジンがＩＭになるまで
希釈した。この状態において、プロティンジスルフィド
イソメラーゼを５０ＪＬｇ／騰Ｉ又は５００　ｇ　ｇ／
ｍｌの濃度になるように添加し、２５℃で５時間放置し
た。一方、比較のため、プロティンジスルフィドイソメ
ラーゼに代えて５００　ａｇ／■ｌのウシ血清アルブミ
ンを加えたものについても試験した。

ヒトウロキナーゼの再賦活化 ウロキナーゼの活性は次のようにして測定した。　０．
０１Ｘ丁ｒｉＬｏｎ　Ｘ−１００及びプラスミンｌＩＬ
ｇを含む０．Ｉ　Ｉｌｌ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）を調製し。

検定試料１０ＩＬ＋を加えた。３７°Ｃにて１５分間反
応させ、終了後氷冷し、大豆トリブシニンヒビター溶液
（５１Ｌｇ／ｇりをｌｐｌ加えた６次にウロキナーゼ活
性測定用合成基質、Ｓ−２４４４の０．２ｍＭ溶液７０
０　ｇｔ＋を加え３７℃にて３００分間反応せた。

反応終了後直ちに氷冷し酢酸１００ｐｌを加えた。

４０５ｎ＋＋＋の吸光度を測定し、標準ウロキナーゼ（
例えば国立衛生試験所の国際標準ウロキナーゼ）と比較
し、活性を検定した。

ヒトウロキナーゼの活性をプロティンジスルフィドイソ
メラーゼ又はウシ血清アルブミン添加後１時間毎に測定
した結果が図に示されている。

同図中、黒丸は５００　ｇ　ｇ／ｍｌのプロティンジス
ルフィドイソメラーゼを加えた場合の結果を、三角は５
００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを加えた場合の結
果を、白丸は無添加の場合の結果をそれぞれ示す、第１
図から明らかなように、プロティンジスルフィドイソメ
ラーゼを加えた場合には、他の場合よりもウロキナーゼ
活性の回復速度が有意に大きく、また、ウシ血清アルブ
ミンを加えた場合よりも有意に大きいのでこの効果は単
にタンパク質が存在することによってもたらされるもの
ではないことがわかる。

また、プロティンジスルフィドイソメラーゼを５０．ｇ
／■ｌ又は５００　ｐｇ／＋ｓｌ加えて５時間反応させ
た後のウロキナーゼ活性を測定し、無添加の場合の活性
を１００とした相対値が以下の表に示されている。この
表から、ウロキナーゼの活性はプロティンジスルフィド
イソメラーゼ濃度に依存して回復しており、プロティン
ジスルフィドイソメラーゼがウロキナーゼの活性回復に
有効に作用していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

図は、この発明の方法及び対照方法によるヒロウロキナ
ーゼ活性回復の経時変化を示すグラフである。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）生理活性を有するタンパク質と同一の一次構造を
   有するが異なる立体構造を有するために生理活性を有さ
   ないタンパク質にプロテインジスルフィドイソメラーゼ
   を作用させることから成るタンパク質の再賦活化方法。
2. （２）プロテインジスルフィドイソメラーゼを作用させ
   る前にタンパク質を変性溶液に溶解し、かつスルフヒド
   リル化合物を添加する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。
3. （３）変性溶液が塩酸グアニジン溶液又は尿素溶液であ
   る特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. （４）スルフヒドリル化合物がβ−メルカプトエタノー
   ル、還元型グルタチオン、ジチオスレイトール又はシス
   テインである特許請求の範囲第２項又は第３項記載の方
   法。
5. （５）賦活化されたタンパク質が遺伝子工学的手法に基
   づき微生物により産生されたウロキナーゼである特許請
   求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の方
   法。