JPH0824594B2 - 遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフイド結合を含有する真核蛋白質を原核における発現後に活性化する方法 - Google Patents
遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフイド結合を含有する真核蛋白質を原核における発現後に活性化する方法Info
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- JPH0824594B2 JPH0824594B2 JP3079762A JP7976291A JPH0824594B2 JP H0824594 B2 JPH0824594 B2 JP H0824594B2 JP 3079762 A JP3079762 A JP 3079762A JP 7976291 A JP7976291 A JP 7976291A JP H0824594 B2 JPH0824594 B2 JP H0824594B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的に製造し
た、ジスルフィド結合を含有する真核蛋白質を原核にお
ける発現後に活性化する方法に関する。
た、ジスルフィド結合を含有する真核蛋白質を原核にお
ける発現後に活性化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】異種蛋白質を原核において発現する際
に、しばしばこれらの蛋白質は宿主細胞中で不活性難溶
性凝集体（所謂“屈折小体：refractile bodies”）を
形成し、更に該凝集体は宿主細胞の蛋白質により不純化
されている。そのような“屈折小体”の形成は、発現の
際に発生する細胞中の高い蛋白質濃度の結果であると推
測される。細胞中で大量の酵素を形成する際に、酵素の
集合により不溶性で高分子の、たいていの場合不活性な
粒子になることは知られている。それ故、そのような蛋
白質を例えば治療の目的に使用できるようにする前に、
それを精製しかつその活性形に変換しなければならな
い。
に、しばしばこれらの蛋白質は宿主細胞中で不活性難溶
性凝集体（所謂“屈折小体：refractile bodies”）を
形成し、更に該凝集体は宿主細胞の蛋白質により不純化
されている。そのような“屈折小体”の形成は、発現の
際に発生する細胞中の高い蛋白質濃度の結果であると推
測される。細胞中で大量の酵素を形成する際に、酵素の
集合により不溶性で高分子の、たいていの場合不活性な
粒子になることは知られている。それ故、そのような蛋
白質を例えば治療の目的に使用できるようにする前に、
それを精製しかつその活性形に変換しなければならな
い。
【０００３】公知の方法によれば、凝集体として存在す
るこのような蛋白質の再活性化は数工程で行なうことが
できる［例えばR. Jaenicke著、“Federation of Bioch
emical Societies”、Vol.５２（１９７９）、１８７〜
１９８；R. Rudolph et al.、“Biochemistry”、１８
（１９７９）、５５７２〜５５７５参照］：第一工程で
は、可溶化を、強力な変性剤、例えばグアニジン−ヒド
ロクロリド又は尿素を高濃度で添加するか又は強酸性因
子、例えばグリシン／リン酸混合物の添加により達成す
る。他の助剤として、還元性ＳＨ−試薬（例えばジチオ
エリトリトール、ＤＴＥ）及びＥＤＡＴが例えばＬＤＨ
の復元の際に有用であることが判明した。蛋白質が宿主
細胞の蛋白質により不純化されている場合、次の工程と
して公知の常法で、例えばゲル−又はイオン交換クロマ
トグラフィにより精製を行なう。引続いて、強く稀釈し
て、変性剤の濃度を低くする。その際に、グアニジン−
ヒドロクロリドを使用する場合には、０．５モル／ｌを
下廻る数値に稀釈する。遊離ＳＨ−基を有する酵素の場
合、ＳＨ−基を保護する因子の添加が有利であると明ら
かになった［例えばR. Jaenicke、“Journal Polymer S
cience"、Part Ｃ１６（１９６７）、２１４３〜２１６
０参照］。
るこのような蛋白質の再活性化は数工程で行なうことが
できる［例えばR. Jaenicke著、“Federation of Bioch
emical Societies”、Vol.５２（１９７９）、１８７〜
１９８；R. Rudolph et al.、“Biochemistry”、１８
（１９７９）、５５７２〜５５７５参照］：第一工程で
は、可溶化を、強力な変性剤、例えばグアニジン−ヒド
ロクロリド又は尿素を高濃度で添加するか又は強酸性因
子、例えばグリシン／リン酸混合物の添加により達成す
る。他の助剤として、還元性ＳＨ−試薬（例えばジチオ
エリトリトール、ＤＴＥ）及びＥＤＡＴが例えばＬＤＨ
の復元の際に有用であることが判明した。蛋白質が宿主
細胞の蛋白質により不純化されている場合、次の工程と
して公知の常法で、例えばゲル−又はイオン交換クロマ
トグラフィにより精製を行なう。引続いて、強く稀釈し
て、変性剤の濃度を低くする。その際に、グアニジン−
ヒドロクロリドを使用する場合には、０．５モル／ｌを
下廻る数値に稀釈する。遊離ＳＨ−基を有する酵素の場
合、ＳＨ−基を保護する因子の添加が有利であると明ら
かになった［例えばR. Jaenicke、“Journal Polymer S
cience"、Part Ｃ１６（１９６７）、２１４３〜２１６
０参照］。
【０００４】ヨーロッパ公開特許第０１１４５０６号明
細書には、細菌培養物からの数種の異種発現産物を単
離、精製及び再活性化する方法が記載され、再活性化に
当っては、強力な変性剤中の“屈折小体”の溶液をａ）
直接弱い変性剤中の溶液に変換し、その後ジスルフィド
結合を再形成するための酸化作用をする条件にもたらす
か、ｂ）蛋白質をスルホン化し、その後弱い変性剤中の
溶液に変換しかつＳ−スルホネート基をスルフヒドリル
試薬でその還元型及び酸化型で、例えばＧＳＨ／ＧＳＳ
Ｇを用いて−Ｓ−Ｓ−基に変換するかあるいはｃ）弱い
変性剤中の溶液を直接スルフヒドリル試薬、例えばＧＳ
Ｈ／ＧＳＳＧを用いて処理する。前記の問題が起こる代
表的な例はｔ−ＰＡである。
細書には、細菌培養物からの数種の異種発現産物を単
離、精製及び再活性化する方法が記載され、再活性化に
当っては、強力な変性剤中の“屈折小体”の溶液をａ）
直接弱い変性剤中の溶液に変換し、その後ジスルフィド
結合を再形成するための酸化作用をする条件にもたらす
か、ｂ）蛋白質をスルホン化し、その後弱い変性剤中の
溶液に変換しかつＳ−スルホネート基をスルフヒドリル
試薬でその還元型及び酸化型で、例えばＧＳＨ／ＧＳＳ
Ｇを用いて−Ｓ−Ｓ−基に変換するかあるいはｃ）弱い
変性剤中の溶液を直接スルフヒドリル試薬、例えばＧＳ
Ｈ／ＧＳＳＧを用いて処理する。前記の問題が起こる代
表的な例はｔ−ＰＡである。
【０００５】凝固した血液の蛋白質基質の主成分は重合
体のフイブリンである。この蛋白質基質は、所謂プラス
ミノゲンアクチベーター、例えばｔ−ＰＡ（組織プラス
ミノゲンアクチベーター）による活性化を介してプラス
ミノゲンから形成されるプラスミンにより溶解される。
天然産又は真核から遺伝子工学的に得られるｔ−ＰＡ
（プラスミノゲンをプラスミンに接触的に活性化する）
の酵素活性は、フイブリン又はフイブリン分解生成物
（ＦＳＰ）の不存在では非常に低いが、これらの刺激物
質の存在においては著しく高まり得る（１０倍以上）。
所謂この活性の刺激可能性は、ウロキナーゼ又はストレ
プトキナーゼのような他の公知のプラスミノゲンアクチ
ベーターに比べてｔ−ＰＡの決定的な利点である［例え
ばM.Hoylaerts et al.“J. Biol. Chem.”、２５７（１
９８２）、２９１２〜２０１９；Nieuwenhiuzen et a
l.,“Biochemica et Biophysica Acta”、７５５（１９
８３）、５３１〜５３３参照］。それ故、BrCN分解生成
物による刺激可能性の係数は文献にいくつか挙げられて
おり、３５倍までである。
体のフイブリンである。この蛋白質基質は、所謂プラス
ミノゲンアクチベーター、例えばｔ−ＰＡ（組織プラス
ミノゲンアクチベーター）による活性化を介してプラス
ミノゲンから形成されるプラスミンにより溶解される。
天然産又は真核から遺伝子工学的に得られるｔ−ＰＡ
（プラスミノゲンをプラスミンに接触的に活性化する）
の酵素活性は、フイブリン又はフイブリン分解生成物
（ＦＳＰ）の不存在では非常に低いが、これらの刺激物
質の存在においては著しく高まり得る（１０倍以上）。
所謂この活性の刺激可能性は、ウロキナーゼ又はストレ
プトキナーゼのような他の公知のプラスミノゲンアクチ
ベーターに比べてｔ−ＰＡの決定的な利点である［例え
ばM.Hoylaerts et al.“J. Biol. Chem.”、２５７（１
９８２）、２９１２〜２０１９；Nieuwenhiuzen et a
l.,“Biochemica et Biophysica Acta”、７５５（１９
８３）、５３１〜５３３参照］。それ故、BrCN分解生成
物による刺激可能性の係数は文献にいくつか挙げられて
おり、３５倍までである。
【０００６】糖付加されていないｔ−ＰＡ様生成物は、
遺伝子操作した原核生物（ｃ−ＤＮＡの導入後）でも形
成されるが、そのような生成物には、真核生物からのｔ
−ＰＡの活性の刺激可能性は付与されない。このこと
は、原核細胞中のレドックス条件が遺伝子が由来する真
核細胞とは、初めから不活性生成物が形成される（この
ことは例えば、天然活性分子が含有する多数のＳ−Ｓ結
合が誤って結合しているかあるいは全く形成されていな
いということに帰因し得るようである）というように異
なっていることに帰因すると考えられる。しかしｔ−Ｐ
Ａを治療で使用するには酵素活性それ自体が必要である
ばかりでなく、その刺激可能性も必要である。真核蛋白
質の活性を正しく形成するように、原核細胞が好適な条
件を調節しないのであろうという事実が他の物質に関し
て“The EMBOJournal”、４、Ｎｏ．３（１９８５）７
７５〜７８０ で指摘されている。
遺伝子操作した原核生物（ｃ−ＤＮＡの導入後）でも形
成されるが、そのような生成物には、真核生物からのｔ
−ＰＡの活性の刺激可能性は付与されない。このこと
は、原核細胞中のレドックス条件が遺伝子が由来する真
核細胞とは、初めから不活性生成物が形成される（この
ことは例えば、天然活性分子が含有する多数のＳ−Ｓ結
合が誤って結合しているかあるいは全く形成されていな
いということに帰因し得るようである）というように異
なっていることに帰因すると考えられる。しかしｔ−Ｐ
Ａを治療で使用するには酵素活性それ自体が必要である
ばかりでなく、その刺激可能性も必要である。真核蛋白
質の活性を正しく形成するように、原核細胞が好適な条
件を調節しないのであろうという事実が他の物質に関し
て“The EMBOJournal”、４、Ｎｏ．３（１９８５）７
７５〜７８０ で指摘されている。
【０００７】ヨーロッパ公開特許第００９３６３９号明
細書ではｔ−ＰＡの再活性化のために、Ｅ．コリ（Col
i）から得られた細胞ペレットをグアニジン−ヒドロク
ロリド６モル／ｌ中に懸濁させ、超音波で処理し、恒温
保持し、引続いてトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、塩
化ナトリウム、ＥＤＴＡ及びツイーン（Tween）８０か
らの溶液に対して４時間透析する。透析後に遠心分離す
ると、その際に上澄み中にプラスミノゲンアクチベータ
ー活性が認められる。このように復元したｔ−ＰＡは蛋
白質分解作用において活性であるが、J.H. Verheijen
著、“Thromb. Haemostas.”、４８、（３）、２６０〜
２６９（１９８２年）に記載の方法による、フイブリン
のＢｒＣＮ−分解生成物（BrCN−FSP）による測定可能
な刺激可能性を示さない。
細書ではｔ−ＰＡの再活性化のために、Ｅ．コリ（Col
i）から得られた細胞ペレットをグアニジン−ヒドロク
ロリド６モル／ｌ中に懸濁させ、超音波で処理し、恒温
保持し、引続いてトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、塩
化ナトリウム、ＥＤＴＡ及びツイーン（Tween）８０か
らの溶液に対して４時間透析する。透析後に遠心分離す
ると、その際に上澄み中にプラスミノゲンアクチベータ
ー活性が認められる。このように復元したｔ−ＰＡは蛋
白質分解作用において活性であるが、J.H. Verheijen
著、“Thromb. Haemostas.”、４８、（３）、２６０〜
２６９（１９８２年）に記載の方法による、フイブリン
のＢｒＣＮ−分解生成物（BrCN−FSP）による測定可能
な刺激可能性を示さない。
【０００８】変性蛋白質の再活性化に関しては、技術水
準から一般的に適用し得る方法は公知ではなく、このこ
とは特にｔ−ＰＡに該当する。それというのもこの天然
蛋白質は非常に複雑な構造を有するからであり、これは
１個の遊離チオール基と１７個のＳ−Ｓ結合を有し、こ
れは理論的に２．２×１０20種類の異なる方法で結合可
能であり、その際にたった１個の構造が天然の状態に相
当する。ｔ−ＰＡを再活性化するための技術水準から公
知の方法は蛋白質分解作用を有するｔ−ＰＡに案内する
が、測定可能な刺激可能性はもたらさない。刺激可能な
ｔ−ＰＡを生ぜしめる活性法は公知ではない。
準から一般的に適用し得る方法は公知ではなく、このこ
とは特にｔ−ＰＡに該当する。それというのもこの天然
蛋白質は非常に複雑な構造を有するからであり、これは
１個の遊離チオール基と１７個のＳ−Ｓ結合を有し、こ
れは理論的に２．２×１０20種類の異なる方法で結合可
能であり、その際にたった１個の構造が天然の状態に相
当する。ｔ−ＰＡを再活性化するための技術水準から公
知の方法は蛋白質分解作用を有するｔ−ＰＡに案内する
が、測定可能な刺激可能性はもたらさない。刺激可能な
ｔ−ＰＡを生ぜしめる活性法は公知ではない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】それ故本発明の課題
は、遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフィド結
合を有する真核蛋白質を原核において発現後に完全に活
性化する方法を開示することであり、この課題は本発明
の目的により解決される。
は、遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフィド結
合を有する真核蛋白質を原核において発現後に完全に活
性化する方法を開示することであり、この課題は本発明
の目的により解決される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、請求項
１により、細胞を砕解し、変性及び還元条件下に可溶化
しかつＧＳＨ／ＧＳＳＧの存在において酸化条件下に活
性化（復元）することにより、遺伝子工学的に製造し
た、異種の、ジスルフィド結合を有する真核蛋白質を原
核生物において発現後に活性化する方法であり、活性化
工程においてｐＨ値９〜１２、ＧＳＨ濃度０．１〜２０
ミリモル／ｌ、ＧＳＳＧ濃度０．０１〜３ミリモル／ｌ
でかつ変性作用をしない濃度の変性剤を用いて作業する
ことを特徴とする。
１により、細胞を砕解し、変性及び還元条件下に可溶化
しかつＧＳＨ／ＧＳＳＧの存在において酸化条件下に活
性化（復元）することにより、遺伝子工学的に製造し
た、異種の、ジスルフィド結合を有する真核蛋白質を原
核生物において発現後に活性化する方法であり、活性化
工程においてｐＨ値９〜１２、ＧＳＨ濃度０．１〜２０
ミリモル／ｌ、ＧＳＳＧ濃度０．０１〜３ミリモル／ｌ
でかつ変性作用をしない濃度の変性剤を用いて作業する
ことを特徴とする。
【００１１】この方法の優れた実施形は特許請求の範囲
に記載されている。
に記載されている。
【００１２】一般に変性剤としては、酸化条件下に活性
化するのに常用の変性剤又はアルギニンを使用すること
ができ、公知の変性剤のうちグアニジン−ヒドロクロリ
ド又は尿素もしくはその誘導体を使用すると優れてい
る。更にアルギニンが好適であることが明らかになっ
た。更に、これらの変性剤の混合物を使用することがで
きる。またこの活性化工程を異種蛋白質の存在において
実施すると有利であり、一般に、そのようなものとして
は蛋白質分解作用をしない各異種蛋白質が好適であり、
殊に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を例えば１〜３ｍｇ／
ｍｌの量で使用する。ＢＳＡの添加は蛋白質の収率及び
安定性を僅かに高める（これは恐らく表面変性及び／又
は蛋白質分解から保護されることによる）。
化するのに常用の変性剤又はアルギニンを使用すること
ができ、公知の変性剤のうちグアニジン−ヒドロクロリ
ド又は尿素もしくはその誘導体を使用すると優れてい
る。更にアルギニンが好適であることが明らかになっ
た。更に、これらの変性剤の混合物を使用することがで
きる。またこの活性化工程を異種蛋白質の存在において
実施すると有利であり、一般に、そのようなものとして
は蛋白質分解作用をしない各異種蛋白質が好適であり、
殊に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を例えば１〜３ｍｇ／
ｍｌの量で使用する。ＢＳＡの添加は蛋白質の収率及び
安定性を僅かに高める（これは恐らく表面変性及び／又
は蛋白質分解から保護されることによる）。
【００１３】他の方法条件は、再活性化工程に関して技
術水準から公知のかつ常用の条件に相応してよい。活性
化（恒温保持）時間は殊に室温で２０〜４８時間であ
る。活性の半減期は還元型（ＧＳＨ）及び酸化型（ＧＳ
ＳＧ）グルタチオン０．５ミリモル／ｌの存在において
２０℃で約１０〜１５時間である。一般に、再酸化条件
下により長く恒温保持する際に（４８時間）、CNBr-FSP
による刺激可能性は低減する。活性化工程をEDTAの存在
において実施すると有利であり、その際に最も有利な濃
度はEDTA約１ミリモル／ｌである。
術水準から公知のかつ常用の条件に相応してよい。活性
化（恒温保持）時間は殊に室温で２０〜４８時間であ
る。活性の半減期は還元型（ＧＳＨ）及び酸化型（ＧＳ
ＳＧ）グルタチオン０．５ミリモル／ｌの存在において
２０℃で約１０〜１５時間である。一般に、再酸化条件
下により長く恒温保持する際に（４８時間）、CNBr-FSP
による刺激可能性は低減する。活性化工程をEDTAの存在
において実施すると有利であり、その際に最も有利な濃
度はEDTA約１ミリモル／ｌである。
【００１４】活性化工程（再酸化／活性化）の前後の方
法工程、例えば細胞の砕解、可溶化（可溶化／還元）及
び場合により活性化工程に先立つ及び／又は後続の１回
又は数回の精製操作は技術水準、例えばヨーロッパ公開
特許第０１１４５０６号明細書、同第００９３６１９号
明細書からこの種の方法に関して知られていて常用の方
法により実施することができるが、収率及び活性化につ
いて最適である結果のためには、本明細書で詳説する方
法実施形１個又は数個を考慮して個々のあるいはすべて
の方法工程を実施すると有利であり得る。特に、本発明
による活性化工程を砕解後に得られた混合物中で予め変
性及び／又は還元をせずに実施することも可能である
が、収率は低い。発現は原核生物中で、殊にＰ．プチダ
（putida）、特にE.コリ(coli)中で実施する。しかし本
発明方法は、他の原核生物（例えばバチリ：Bacilli）
で発現する場合にも同様に好適である。
法工程、例えば細胞の砕解、可溶化（可溶化／還元）及
び場合により活性化工程に先立つ及び／又は後続の１回
又は数回の精製操作は技術水準、例えばヨーロッパ公開
特許第０１１４５０６号明細書、同第００９３６１９号
明細書からこの種の方法に関して知られていて常用の方
法により実施することができるが、収率及び活性化につ
いて最適である結果のためには、本明細書で詳説する方
法実施形１個又は数個を考慮して個々のあるいはすべて
の方法工程を実施すると有利であり得る。特に、本発明
による活性化工程を砕解後に得られた混合物中で予め変
性及び／又は還元をせずに実施することも可能である
が、収率は低い。発現は原核生物中で、殊にＰ．プチダ
（putida）、特にE.コリ(coli)中で実施する。しかし本
発明方法は、他の原核生物（例えばバチリ：Bacilli）
で発現する場合にも同様に好適である。
【００１５】例えば、細胞の砕解は、常法で、例えば超
音波、高圧分散又はリゾチームにより実施することがで
き、殊に例えば０．１モル／ｌ トリス−ＨＣｌのよう
な、懸濁媒体として中性乃至弱酸性のｐＨ値の調節に好
適な緩衝液中で実施する。細胞の砕解後に、不溶成分
（“屈折小体”）を任意の方法で、殊により高いｇ値と
より長い遠心時間で遠心分離するか濾過することにより
分離する。ｔ−ＰＡを妨害しないが、異種の細胞蛋白質
をできる限り溶解する剤、例えば水、リン酸塩緩衝液を
用いて、場合によりトリトンのような穏やかな界面活性
剤の添加下に洗浄した後で、沈殿（ペレット）を可溶化
（可溶化／還元）にもたらす。殊に、可溶化はアルカリ
性ｐＨ範囲で、特にｐＨ８．６±０．４でかつメルカプ
タン基からの還元剤と変性剤の存在において行なう。
音波、高圧分散又はリゾチームにより実施することがで
き、殊に例えば０．１モル／ｌ トリス−ＨＣｌのよう
な、懸濁媒体として中性乃至弱酸性のｐＨ値の調節に好
適な緩衝液中で実施する。細胞の砕解後に、不溶成分
（“屈折小体”）を任意の方法で、殊により高いｇ値と
より長い遠心時間で遠心分離するか濾過することにより
分離する。ｔ−ＰＡを妨害しないが、異種の細胞蛋白質
をできる限り溶解する剤、例えば水、リン酸塩緩衝液を
用いて、場合によりトリトンのような穏やかな界面活性
剤の添加下に洗浄した後で、沈殿（ペレット）を可溶化
（可溶化／還元）にもたらす。殊に、可溶化はアルカリ
性ｐＨ範囲で、特にｐＨ８．６±０．４でかつメルカプ
タン基からの還元剤と変性剤の存在において行なう。
【００１６】変性剤としては、可溶化に関して技術水
準、例えばヨーロッパ公開特許第０１１４５０６号明細
書から公知の常用の変性剤、特にグアニジン−ヒドロク
ロリド又は尿素を使用することができる。グアニジン−
ヒドロクロリドの濃度は有利に約６モル／ｌ、尿素のそ
れは約８モル／ｌである。一般式Ｉの化合物も同様に使
用することができる。
準、例えばヨーロッパ公開特許第０１１４５０６号明細
書から公知の常用の変性剤、特にグアニジン−ヒドロク
ロリド又は尿素を使用することができる。グアニジン−
ヒドロクロリドの濃度は有利に約６モル／ｌ、尿素のそ
れは約８モル／ｌである。一般式Ｉの化合物も同様に使
用することができる。
【００１７】メルカプタン基からの還元剤としては、例
えば還元型グルタチオン（ＧＳＨ）又は２−メルカプト
エタノールを例えば濃度約５０〜４００ミリモル／ｌで
及び／又は特にＤＴＥ（ジチオエリトリトール）もしく
はＤＴＴ（ジチオトレイトール）を例えば濃度約８０〜
４００ミリモル／ｌで使用することができる。可溶化は
室温で１〜３時間、殊に２時間（恒温保持）行なうと有
利である。還元剤の空中酸素による酸化を回避するため
には、ＥＤＴＡを添加すると有利である。可溶化／還元
と共に、可溶化工程は精製化効果をも有している。それ
というのもｔ−ＰＡと免疫学的に交叉反応しない物質
（異種蛋白質）の大部分は溶解しないからである。
えば還元型グルタチオン（ＧＳＨ）又は２−メルカプト
エタノールを例えば濃度約５０〜４００ミリモル／ｌで
及び／又は特にＤＴＥ（ジチオエリトリトール）もしく
はＤＴＴ（ジチオトレイトール）を例えば濃度約８０〜
４００ミリモル／ｌで使用することができる。可溶化は
室温で１〜３時間、殊に２時間（恒温保持）行なうと有
利である。還元剤の空中酸素による酸化を回避するため
には、ＥＤＴＡを添加すると有利である。可溶化／還元
と共に、可溶化工程は精製化効果をも有している。それ
というのもｔ−ＰＡと免疫学的に交叉反応しない物質
（異種蛋白質）の大部分は溶解しないからである。
【００１８】可溶化の後かつ活性化工程の前に、公知で
常用の精製工程を導入することができ、精製法として
は、例えば滅菌溶離クロマトグラフィ（SEC:Sterische
Ausschluβchromatographie)（グアニジン−ヒドロクロ
リド又は尿素の存在において）又はイオン交換体（尿素
又はその誘導体の存在において）が該当し、非特異的な
再酸化は還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の
添加により又はｐＨ４．５により回避することができる
［例えばR． Rudolph,“Biochem. Soc. Transaction
s”、１３（１９８５）、３０８〜３１１］。先行する
可溶化工程でＤＴＥを使用する場合には、ＤＴＥを精製
工程で分離しなければならない。その精製は、例えばセ
ファデックス（Sephadex）Ｇ１００を介してグアニジン
−ヒドロクロリド及び還元剤、例えばＧＳＨの存在にお
いてｐＨ１〜４でＳＥＣにより行なうかあるいは０．０
１モル／ｌＨＣｌ又は０．１モル／ｌ酢酸中セファデッ
クスＧ２５を介して脱塩して分離することにより行なう
ことができる。変性剤／還元剤の分離は場合により同じ
溶液に対して透析することによっても可能である。
常用の精製工程を導入することができ、精製法として
は、例えば滅菌溶離クロマトグラフィ（SEC:Sterische
Ausschluβchromatographie)（グアニジン−ヒドロクロ
リド又は尿素の存在において）又はイオン交換体（尿素
又はその誘導体の存在において）が該当し、非特異的な
再酸化は還元剤（例えば２−メルカプトエタノール）の
添加により又はｐＨ４．５により回避することができる
［例えばR． Rudolph,“Biochem. Soc. Transaction
s”、１３（１９８５）、３０８〜３１１］。先行する
可溶化工程でＤＴＥを使用する場合には、ＤＴＥを精製
工程で分離しなければならない。その精製は、例えばセ
ファデックス（Sephadex）Ｇ１００を介してグアニジン
−ヒドロクロリド及び還元剤、例えばＧＳＨの存在にお
いてｐＨ１〜４でＳＥＣにより行なうかあるいは０．０
１モル／ｌＨＣｌ又は０．１モル／ｌ酢酸中セファデッ
クスＧ２５を介して脱塩して分離することにより行なう
ことができる。変性剤／還元剤の分離は場合により同じ
溶液に対して透析することによっても可能である。
【００１９】もう１つの精製工程は再活性化工程に続い
て行なうことができる。一般にそのような精製は透析に
より行なうかあるいは活性化されたｔ−ＰＡの単離に引
続いて例えばＬｙｓ−セファロースを介してアフィニテ
イークロマトグラフィにより行なう。
て行なうことができる。一般にそのような精製は透析に
より行なうかあるいは活性化されたｔ−ＰＡの単離に引
続いて例えばＬｙｓ−セファロースを介してアフィニテ
イークロマトグラフィにより行なう。
【００２０】本発明の他の実施形は、遺伝子工学的に製
造した、異種の、ジスルフィド結合を含有する真核蛋白
質とグルタチオンとの混合ジスルフィド（以下ｔ−ＰＡ
ＳＳＧと略記）の形成をベースとする。これは、変性状
態で異種蛋白質の分離も、また天然蛋白質の精製も簡単
にする。チオール基を変性した後の精製は、蛋白質が空
中酸化から保護され、それ故より広いｐＨ範囲で安定で
あり、かつ実負荷（Nettoladung）の変化が精製を簡便
化するという利点を有する。特に、イオン交換体処理に
より未変性の蛋白質の分離を有利に行なうことができ
る。
造した、異種の、ジスルフィド結合を含有する真核蛋白
質とグルタチオンとの混合ジスルフィド（以下ｔ−ＰＡ
ＳＳＧと略記）の形成をベースとする。これは、変性状
態で異種蛋白質の分離も、また天然蛋白質の精製も簡単
にする。チオール基を変性した後の精製は、蛋白質が空
中酸化から保護され、それ故より広いｐＨ範囲で安定で
あり、かつ実負荷（Nettoladung）の変化が精製を簡便
化するという利点を有する。特に、イオン交換体処理に
より未変性の蛋白質の分離を有利に行なうことができ
る。
【００２１】混合ジスルフィドの形成に当って、透析
し、還元し、変性−及び還元剤から精製された蛋白質
を、変性剤を含有する、稀釈した（例えば０．２モル／
ｌ）ＧＳＳＧの溶液と一緒に恒温保持する。活性化は、
変性−及び酸化剤の分離後、ＧＳＨ濃度０．５〜５ミリ
モル／ｌのｐＨ７〜１０．５でかつ変性作用をしない濃
度の変性剤を用いて行なう。
し、還元し、変性−及び還元剤から精製された蛋白質
を、変性剤を含有する、稀釈した（例えば０．２モル／
ｌ）ＧＳＳＧの溶液と一緒に恒温保持する。活性化は、
変性−及び酸化剤の分離後、ＧＳＨ濃度０．５〜５ミリ
モル／ｌのｐＨ７〜１０．５でかつ変性作用をしない濃
度の変性剤を用いて行なう。
【００２２】他のすべての反応工程では、ＧＳＳＧと一
緒の混合ジスルフィドの形成を介して行なう蛋白質の活
性化は本発明の前記の部分の活性化に関する実施形に一
致する。この実施形では至適ｐＨは８．５であり、収率
は約２倍高くかつ活性化された蛋白質は復元緩衝液中で
長時間安定である。
緒の混合ジスルフィドの形成を介して行なう蛋白質の活
性化は本発明の前記の部分の活性化に関する実施形に一
致する。この実施形では至適ｐＨは８．５であり、収率
は約２倍高くかつ活性化された蛋白質は復元緩衝液中で
長時間安定である。
【００２３】本発明により、原核生物からのｔ−ＰＡを
活性化することができ、通常の生物学的活性の活性化ば
かりでなく、更に刺激可能性も前記の意味で達成され、
この刺激可能性は天然ｔ−ＰＡのそれを著しく上廻り、
１０倍よりも高く、５０倍上廻ることもある。
活性化することができ、通常の生物学的活性の活性化ば
かりでなく、更に刺激可能性も前記の意味で達成され、
この刺激可能性は天然ｔ−ＰＡのそれを著しく上廻り、
１０倍よりも高く、５０倍上廻ることもある。
【００２４】本発明により原核生物において発現後に活
性化することのできる他の真核蛋白質はβ−インターフ
エロンである。
性化することのできる他の真核蛋白質はβ−インターフ
エロンである。
【００２５】次の実施例により本発明を詳説するが、こ
れに限定されるものではない。特に記載のない限り、パ
ーセントは重量パーセントに関しかつ温度はセッ氏であ
る。
れに限定されるものではない。特に記載のない限り、パ
ーセントは重量パーセントに関しかつ温度はセッ氏であ
る。
【００２６】
【実施例】例 １ ａ）“屈折小体”の調製 ０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ６．５）及び２
０ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ１．５ｌ中に取ったＥ．コリ
細胞湿潤物質１００ｇを均質化し（Ultra-Turrax、１０
秒間）かつ０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加した。
３０分間室温で恒温保持後、再び均質化しかつ３℃に冷
却した。細胞の砕解は高圧分散（５５０ｋｇ／ｃｍ2）
により達成した。引続いて、０．１モル／ｌ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ６．５）及び２０ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ
３００ｍｌで後洗浄した。遠心分離（２７０００ｇ、４
℃で２時間）後、ペレットを０．１モル／ｌ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、２０ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ及
び２．５％トリトン−ｘ−１００ １．３ｌ中に取りか
つ均質化した。再び遠心分離（２７０００ｇ、４℃で３
０分間）した後で、ペレットを０．１モル／ｌ トリス
／ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、２０ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ
及び０．５％トリトン−ｘ−１００ １．３ｌ中に取り
かつ均質化した。ペレットの遠心分離（２７０００ｇ、
４℃で３０分間）と０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ６．５）及び２０ミリモル／ｌＥＤＴＡ１ｌ中で
均質化を交互に３回行なった。
０ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ１．５ｌ中に取ったＥ．コリ
細胞湿潤物質１００ｇを均質化し（Ultra-Turrax、１０
秒間）かつ０．２５ｍｇ／ｍｌリゾチームを添加した。
３０分間室温で恒温保持後、再び均質化しかつ３℃に冷
却した。細胞の砕解は高圧分散（５５０ｋｇ／ｃｍ2）
により達成した。引続いて、０．１モル／ｌ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ６．５）及び２０ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ
３００ｍｌで後洗浄した。遠心分離（２７０００ｇ、４
℃で２時間）後、ペレットを０．１モル／ｌ トリス／
ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、２０ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ及
び２．５％トリトン−ｘ−１００ １．３ｌ中に取りか
つ均質化した。再び遠心分離（２７０００ｇ、４℃で３
０分間）した後で、ペレットを０．１モル／ｌ トリス
／ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、２０ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ
及び０．５％トリトン−ｘ−１００ １．３ｌ中に取り
かつ均質化した。ペレットの遠心分離（２７０００ｇ、
４℃で３０分間）と０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ６．５）及び２０ミリモル／ｌＥＤＴＡ１ｌ中で
均質化を交互に３回行なった。
【００２７】“屈折小体”調製物のｔ−ＰＡ含量はＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、ｔ−ＰＡバンドを“ウエスタン・ブロッ
ティング”（Western-blotting）により同定及びデンシ
トメータ分析により定量化した。“屈折小体”はＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及び“ウエスタン・ブロッティング”で分子
量約６０ｋＤａの強力なｔ−ＰＡバンドを示す。“屈折
小体”の全蛋白質含量に対するｔ−ＰＡの割合は約２１
％である。
Ｓ−ＰＡＧＥ、ｔ−ＰＡバンドを“ウエスタン・ブロッ
ティング”（Western-blotting）により同定及びデンシ
トメータ分析により定量化した。“屈折小体”はＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及び“ウエスタン・ブロッティング”で分子
量約６０ｋＤａの強力なｔ−ＰＡバンドを示す。“屈折
小体”の全蛋白質含量に対するｔ−ＰＡの割合は約２１
％である。
【００２８】ｂ）“屈折小体”の可溶化／還元 “屈折小体”を、０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．６）、６モル／ｌグアニジン−ヒドロクロリド、
０．１５〜０．４モル／ｌ ＤＴＥ及び１ミリモル／ｌ
ＥＤＴＡ中の蛋白質濃度１〜５ｍｇ／ｌで２〜３時間
室温で恒温保持した。その後、不溶物質（細胞壁フラグ
メント等）を遠心分離した(例えば３５０００〜５００
００ｇ、４℃で３０分間)。上澄みのｐＨ値を濃度ＨＣ
ｌでｐＨ３に調節した。変性−及び還元剤を０．０１モ
ル／ｌ ＨＣｌに対して４℃で透析することにより分離
した。
Ｈ８．６）、６モル／ｌグアニジン−ヒドロクロリド、
０．１５〜０．４モル／ｌ ＤＴＥ及び１ミリモル／ｌ
ＥＤＴＡ中の蛋白質濃度１〜５ｍｇ／ｌで２〜３時間
室温で恒温保持した。その後、不溶物質（細胞壁フラグ
メント等）を遠心分離した(例えば３５０００〜５００
００ｇ、４℃で３０分間)。上澄みのｐＨ値を濃度ＨＣ
ｌでｐＨ３に調節した。変性−及び還元剤を０．０１モ
ル／ｌ ＨＣｌに対して４℃で透析することにより分離
した。
【００２９】ｃ）再酸化／活性化 再酸化／活性化は、０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ
（ｐＨ１０．５）、１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｇ
／ｌ ＢＳＡ、０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン、２ミ
リモル／ｌ ＧＳＨ、０．２ミリモル／ｌ ＧＳＳＧ中
で１：５０〜１：２００に稀釈することにより行なっ
た。約２０℃で１７〜２４時間活性化後、活性と、真核
からの天然グリコシル化ｔ−ＰＡの活性に比較して収率
とを測定した。
（ｐＨ１０．５）、１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｇ
／ｌ ＢＳＡ、０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン、２ミ
リモル／ｌ ＧＳＨ、０．２ミリモル／ｌ ＧＳＳＧ中
で１：５０〜１：２００に稀釈することにより行なっ
た。約２０℃で１７〜２４時間活性化後、活性と、真核
からの天然グリコシル化ｔ−ＰＡの活性に比較して収率
とを測定した。
【００３０】“屈折小体”の全蛋白質含量に対する収
率：２．５＋／−０．５％ 刺激可能性：１０＋／−５ “屈折小体”のｔ−ＰＡに対する収率：約１２％ ｄ）変性−／還元剤を分離せずに再酸化／活性化 “屈折小体”を０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ
８．６）、６モル／ｌグアニジン−ヒドロクロリド、
０．２モル／ｌ ＤＴＥ及び１ミリモル／ｌＥＤＴＡ中
で蛋白質濃度１．２５ｍｇ／ｍｌで室温で２時間恒温保
持した。その後直ちに再酸化を、０．１モル／ｌ トリ
ス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．５）、１ミリモル／ｌ ＥＤＴ
Ａ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．３モル／ｌ Ｌ−アルギ
ニン及び表に記載した量のＧＳＳＧ中で１：１００に稀
釈して開始した。付加的に、活性化バッチ中に０．０６
モル／ｌ グアニジン−ヒドロクロリド及び２ミリモル
／ｌ ＤＴＥの残留濃度が存在した。
率：２．５＋／−０．５％ 刺激可能性：１０＋／−５ “屈折小体”のｔ−ＰＡに対する収率：約１２％ ｄ）変性−／還元剤を分離せずに再酸化／活性化 “屈折小体”を０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ
８．６）、６モル／ｌグアニジン−ヒドロクロリド、
０．２モル／ｌ ＤＴＥ及び１ミリモル／ｌＥＤＴＡ中
で蛋白質濃度１．２５ｍｇ／ｍｌで室温で２時間恒温保
持した。その後直ちに再酸化を、０．１モル／ｌ トリ
ス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．５）、１ミリモル／ｌ ＥＤＴ
Ａ、１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ、０．３モル／ｌ Ｌ−アルギ
ニン及び表に記載した量のＧＳＳＧ中で１：１００に稀
釈して開始した。付加的に、活性化バッチ中に０．０６
モル／ｌ グアニジン−ヒドロクロリド及び２ミリモル
／ｌ ＤＴＥの残留濃度が存在した。
【００３１】 変性−／還元剤を分離せずに活性化する際の、ＧＳＳＧ 濃度に対する活性収率の依存性 ＧＳＳＧ 収 率′ 刺激可能性 （ミリモル／ｌ） （％） （係数） ０．２ ０ − １ ０．１３ ４．０ ５ １．４９ ７．４ ６ １．２８ ５．４ ７ １．０４ ５．８ ９ ０．９８ ５．２ １０ １．７７ １０．０ １５ ０ − ２０ ０ − ′：“屈折小体”の全蛋白質含量に対する活性ｔ−ＰＡの収率 例 ２ ＲＢ（“屈折小体”）−調製物（約５ｍｇ）を０．１モ
ル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６モル／ｌ
グアニジン−ヒドロクロリド及び０．１５〜０．２モル
／ｌ ＤＴＥ１ｍｌ中で２〜３時間室温で恒温保持し
た。その後、不溶性物質（細胞壁フラグメント等）を遠
心分離（１７０００ｇで２０分間）により分離した。変
性−及び還元剤は０．０１モル／ｌ ＨＣｌ中のセファ
デックスＧ２５（超精密）を介してゲル濾過を行なうこ
とにより除去した。その際に、試料は約５〜１０倍稀釈
した。０．０１モル／ｌ ＨＣｌ中の還元物質を−２０
℃で貯蔵した。
ル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６モル／ｌ
グアニジン−ヒドロクロリド及び０．１５〜０．２モル
／ｌ ＤＴＥ１ｍｌ中で２〜３時間室温で恒温保持し
た。その後、不溶性物質（細胞壁フラグメント等）を遠
心分離（１７０００ｇで２０分間）により分離した。変
性−及び還元剤は０．０１モル／ｌ ＨＣｌ中のセファ
デックスＧ２５（超精密）を介してゲル濾過を行なうこ
とにより除去した。その際に、試料は約５〜１０倍稀釈
した。０．０１モル／ｌ ＨＣｌ中の還元物質を−２０
℃で貯蔵した。
【００３２】例３ 次表に種々の本発明によるパラメータの、ｔ−ＰＡの活
性及び刺激可能性に対する作用を総括した。これらの再
酸化実験のために、例２により可溶化し、還元した蛋白
質を予備精製しなかった。
性及び刺激可能性に対する作用を総括した。これらの再
酸化実験のために、例２により可溶化し、還元した蛋白
質を予備精製しなかった。
【００３３】還元蛋白質（０．０１モル／ｌ ＨＣｌ
中）を“再酸化緩衝剤”中で１：１０〜１：５００に稀
釈することにより活性化した。活性化は室温で２２〜４
８時間恒温保持した後で測定した。再酸化蛋白質の活性
は、０．１モル／ｌトリス／ＨＣｌ（ｐＨ＝１０．５）
＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ＋０．５モル／ｌ Ｌ−ア
ルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＨ（還元型グルタチオン）＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ（グメタチオンジカスフィド）中の“標準再
酸化”（＝１００％）に対する。
中）を“再酸化緩衝剤”中で１：１０〜１：５００に稀
釈することにより活性化した。活性化は室温で２２〜４
８時間恒温保持した後で測定した。再酸化蛋白質の活性
は、０．１モル／ｌトリス／ＨＣｌ（ｐＨ＝１０．５）
＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ＋０．５モル／ｌ Ｌ−ア
ルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＨ（還元型グルタチオン）＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ（グメタチオンジカスフィド）中の“標準再
酸化”（＝１００％）に対する。
【００３４】刺激可能性は
【００３５】
【数１】
【００３６】から計算する［W. Nieuwenhuizen et a
l.、“Biochemica et Biophysica Acta”、７５５（１
９８３）、５３１〜５３３参照］。活性（％）及び刺激
可能性（係数）はJ. H. Verheijen、“Thromb. Haemost
as.”、４８（３）、２６６〜２６９（１９８２）によ
り測定した。
l.、“Biochemica et Biophysica Acta”、７５５（１
９８３）、５３１〜５３３参照］。活性（％）及び刺激
可能性（係数）はJ. H. Verheijen、“Thromb. Haemost
as.”、４８（３）、２６６〜２６９（１９８２）によ
り測定した。
【００３７】次の結果が得られた： １． Ｌ−アルギニン又はグアニジン−ヒドロクロリド
の添加に対する活性収率の依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．
５）＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ＋０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ中 ａ） Ｌ−アルギニン Ｌ−アルギニン 活 性 刺激可能性 （モル／ｌ） （％） （係数） ０ ４ ２．５ ０．２５ ９８ ７．５ ０．５ １００ ２１．９ ０．７５ ２７ １６．３ １．０ ２３ ３．５ この実験では、ｔ−ＰＡがＬ−アルギニンにより阻害さ
れると考えられる。それ故、高いＬ−アルギニン濃度で
の活性収率の低下は阻害に関して補正すべきである。
の添加に対する活性収率の依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．
５）＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳ
Ａ＋０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ中 ａ） Ｌ−アルギニン Ｌ−アルギニン 活 性 刺激可能性 （モル／ｌ） （％） （係数） ０ ４ ２．５ ０．２５ ９８ ７．５ ０．５ １００ ２１．９ ０．７５ ２７ １６．３ １．０ ２３ ３．５ この実験では、ｔ−ＰＡがＬ−アルギニンにより阻害さ
れると考えられる。それ故、高いＬ−アルギニン濃度で
の活性収率の低下は阻害に関して補正すべきである。
【００３８】 ２．尿素及び尿素誘導体の添加に対する活性収率の依存
性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス（ｐＨ１０．５）、 １ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ５ミリモル／ｌ ＧＳＨ、０．２ミリモル／ｌ ＧＳＳＧ中 ３．脂肪酸アミド添加に対する活性収率の依存性： 再酸化：０．１モル／ｌ トリス（ｐＨ１０．５）、 １ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ５ミリモル／ｌ ＧＳＨ、０．２ミリモル／ｌ ＧＳＳＧ中 ４．活性収率のｐＨ値に対する依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ＋１ミリモル
／ｌ ＥＤＴＡ ＋０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン中＋１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、 ＋０．５ミリモル／ｌ ＧＳ＋０．５ミリモル／ｌ Ｇ
ＳＳＧ ５．活性収率のＧＳＨ／ＧＳＳＧ濃度に対する依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ１０．
５、 ＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ ＋０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ６．再酸化する際に活性収率の蛋白質濃度（稀釈１：２
０〜１：５００）に対する依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．
５） ＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ ＋０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ、 ＋０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ ７．活性収率のＢＳＡ添加に対する依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．
５） ＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ ＋０．５モルＬ−アルギニン ＋０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ 第１図及び第２図は、標準試験において０．１モル／ｌ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ＝１０．５）＋１ミリモル／ｌ
ＥＤＴＡ＋０．５モルＬ−アルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ＋０．５ミリモル／ｌＧＳＨ＋０．５ミリモル
／ｌ ＧＳＳＧ中、室温で１７時間再酸化した後のＣＮ
Ｂｒ−ＦＳＰを含有する場合と含有しない場合の活性を
図示したものである。第１図及び第２図において、曲線
（Ａ）がＣＮＢｒ−ＦＳＰの存在における活性であり、
曲線（Ｂ）がＣＮＢｒ−ＦＳＰの不存在における活性で
ある。
性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス（ｐＨ１０．５）、 １ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ５ミリモル／ｌ ＧＳＨ、０．２ミリモル／ｌ ＧＳＳＧ中 ３．脂肪酸アミド添加に対する活性収率の依存性： 再酸化：０．１モル／ｌ トリス（ｐＨ１０．５）、 １ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ５ミリモル／ｌ ＧＳＨ、０．２ミリモル／ｌ ＧＳＳＧ中 ４．活性収率のｐＨ値に対する依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ＋１ミリモル
／ｌ ＥＤＴＡ ＋０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン中＋１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、 ＋０．５ミリモル／ｌ ＧＳ＋０．５ミリモル／ｌ Ｇ
ＳＳＧ ５．活性収率のＧＳＨ／ＧＳＳＧ濃度に対する依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ、ｐＨ１０．
５、 ＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ ＋０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン ＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ６．再酸化する際に活性収率の蛋白質濃度（稀釈１：２
０〜１：５００）に対する依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．
５） ＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ ＋０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ、 ＋０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ ７．活性収率のＢＳＡ添加に対する依存性 再酸化：０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．
５） ＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ ＋０．５モルＬ−アルギニン ＋０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ 第１図及び第２図は、標準試験において０．１モル／ｌ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ＝１０．５）＋１ミリモル／ｌ
ＥＤＴＡ＋０．５モルＬ−アルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ
ＢＳＡ＋０．５ミリモル／ｌＧＳＨ＋０．５ミリモル
／ｌ ＧＳＳＧ中、室温で１７時間再酸化した後のＣＮ
Ｂｒ−ＦＳＰを含有する場合と含有しない場合の活性を
図示したものである。第１図及び第２図において、曲線
（Ａ）がＣＮＢｒ−ＦＳＰの存在における活性であり、
曲線（Ｂ）がＣＮＢｒ−ＦＳＰの不存在における活性で
ある。
【００３９】例４（参考例） ｔ−ＰＡとグルタチオンとの混合ジスルフィドを介する
ｔ−ＰＡの活性使用する“屈折小体”は前記の例の１つ
により得た。“屈折小体”の還元は、０．１モル／ｌ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１ミリモル／ｌ ＥＤ
ＴＡ、６モル／ｌＧｄｎ／ＨＣｌ、０．２モル／ｌ Ｄ
ＴＥ中、蛋白質濃度約１ｍｇ／ｍｌで室温で２時間恒温
保持することにより行なった。
ｔ−ＰＡの活性使用する“屈折小体”は前記の例の１つ
により得た。“屈折小体”の還元は、０．１モル／ｌ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、１ミリモル／ｌ ＥＤ
ＴＡ、６モル／ｌＧｄｎ／ＨＣｌ、０．２モル／ｌ Ｄ
ＴＥ中、蛋白質濃度約１ｍｇ／ｍｌで室温で２時間恒温
保持することにより行なった。
【００４０】０．０１モル／ｌ ＨＣｌに対して透析
し、還元した蛋白質を０．１モル／ｌトリス（ｐＨ９．
３）、９モル／ｌ尿素及び０．２モル／ｌ ＧＳＳＧに
より比１：１で稀釈しかつ室温で５時間恒温保持した。
し、還元した蛋白質を０．１モル／ｌトリス（ｐＨ９．
３）、９モル／ｌ尿素及び０．２モル／ｌ ＧＳＳＧに
より比１：１で稀釈しかつ室温で５時間恒温保持した。
【００４１】濃ＨＣｌでｐＨ３の酸性にした後で、透析
を０．０１モル／ｌ ＨＣｌに対して４℃で行なった。
透析後に全蛋白質濃度は０．３３ｍｇ／ｍｌであった。
このように調整したｔ−ＰＡＳＳＧを用いて至適再活性
化条件を測定した。
を０．０１モル／ｌ ＨＣｌに対して４℃で行なった。
透析後に全蛋白質濃度は０．３３ｍｇ／ｍｌであった。
このように調整したｔ−ＰＡＳＳＧを用いて至適再活性
化条件を測定した。
【００４２】ａ）ｔ−ＰＡＳＳＧの活性化の至適ｐＨ 次の最適化実験にあるように、（１）ＧＳＳＧを使わず
かつ（２）活性を室温で１７時間恒温保持した後で測定
した。活性化は、０．１モル／ｌ トリス、１ミリモル
／ｌ ＥＤＴＡ、０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン、１
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２ミリモル／ｌ ＧＳＨ中で
１：１００に稀釈することによりｐＨ値を変えて行なっ
た。
かつ（２）活性を室温で１７時間恒温保持した後で測定
した。活性化は、０．１モル／ｌ トリス、１ミリモル
／ｌ ＥＤＴＡ、０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン、１
ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２ミリモル／ｌ ＧＳＨ中で
１：１００に稀釈することによりｐＨ値を変えて行なっ
た。
【００４３】 ｐＨ 収 率（％） 刺激可能性 ６ ０．０４ ３．３ ６．５ ０．３７ ９．５ ７ １．３５ １１．４ ７．５ ５．６６ ７．１ ８ ７．３２ ８．２ ８．５ ８．６５ ７．０ ９ ８．５９ ８．７ ９．５ ８．３２ １１．７ １０ ６．１５ １２．５ １０．５ ３．０７ １１．２ 収率は使用した蛋白質量に対する活性ｔ−ＰＡの％であ
る。
る。
【００４４】ｂ）ｔ−ＰＡＳＳＧの活性化結果の再現性 同一の活性化条件では、測定列が異なると、とりわけ標
準ｔ−ＰＡの変動により惹起される種々の収率が認めら
れる。この誤差範囲を明瞭にするために、０．１モル／
ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ミリモル／ｌ
ＥＤＴＡ、０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン、１ｍｇ／
ｍｌ ＢＳＡ及び２ミリモル／ｌ ＧＳＨ中で１：１０
０ないしは１：２００に稀釈した後のすべての活性化デ
ータを総括した。
準ｔ−ＰＡの変動により惹起される種々の収率が認めら
れる。この誤差範囲を明瞭にするために、０．１モル／
ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１ミリモル／ｌ
ＥＤＴＡ、０．５モル／ｌ Ｌ−アルギニン、１ｍｇ／
ｍｌ ＢＳＡ及び２ミリモル／ｌ ＧＳＨ中で１：１０
０ないしは１：２００に稀釈した後のすべての活性化デ
ータを総括した。
【００４５】 実 験 収 率（％） 刺激可能性 １ ８．６５ ７．０ ２ ４．４７ ９．３ ３ ４．４９ ９．７ ４ ８．５０ ６．５ ５ ３．４５ １７．２ ６ ４．３２ ８．３ ７ ３．２９ １４．０ ８ ３．５４ １３．４ ９ ５．０７ １６．４ 平均値 ５．１＋／−１．９ １１．３＋／−３．８ ｃ）活性化された蛋白質の安定性 活性化は、本例で０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ、１
ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ、０．５モル／ｌ Ｌ−アルギ
ニン、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２ミリモル／ｌＧＳＨ
中で１：２００に稀釈することにより行なった。
ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ、０．５モル／ｌ Ｌ−アルギ
ニン、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び２ミリモル／ｌＧＳＨ
中で１：２００に稀釈することにより行なった。
【００４６】 時 間 ｐＨ ９．５ （ｈ） 収 率（％） 刺激可能性 １ ０ − ６ ０．８９ １５．５ ２３ ２．４３ ２３．１ ４７ ２．８３ ２３．６ ７１ ２．６２ ２１．５ ２１５ ２．２１ ２２．６ ２３９ ２．２８ １４．３ 例５ 遺伝子工学的に製造したインターフェロン−βの活性化 “屈折小体”を前記の方法により生成した。“屈折小
体”の還元／可溶化は次のように行なった。ペレットを
９．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６モ
ル／ｌ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ及
び０．２モル／ｌＤＴＥ１０ｍｌ中２５℃で３時間恒温
保持しかつ４℃、４８０００ｇで３０分間遠心した後で
上澄みのｐＨを濃ＨＣｌで約３に調節した。引続いて、
０．０１モル／ｌ ＨＣｌ中セファデックスＧ２５Ｆを
介してゲル濾過を行なった。
体”の還元／可溶化は次のように行なった。ペレットを
９．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、６モ
ル／ｌ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ及
び０．２モル／ｌＤＴＥ１０ｍｌ中２５℃で３時間恒温
保持しかつ４℃、４８０００ｇで３０分間遠心した後で
上澄みのｐＨを濃ＨＣｌで約３に調節した。引続いて、
０．０１モル／ｌ ＨＣｌ中セファデックスＧ２５Ｆを
介してゲル濾過を行なった。
【００４７】溶出液を導電性、蛋白質濃度及び再活性能
について試験した。
について試験した。
【００４８】再酸化蛋白質の活性は、０．１モル／ｌ
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．５）、１ミリモル／ｌ Ｄ
ＥＴＡ、５ミリモル／ｌ ＧＳＨ、０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ及び０．２５モル／ｌ Ｌ−アルギニン中の
“標準活性化”（＝１００％）に対する。
トリス／ＨＣｌ（ｐＨ１０．５）、１ミリモル／ｌ Ｄ
ＥＴＡ、５ミリモル／ｌ ＧＳＨ、０．５ミリモル／ｌ
ＧＳＳＧ及び０．２５モル／ｌ Ｌ−アルギニン中の
“標準活性化”（＝１００％）に対する。
【００４９】ａ）活性収率のＬ−アルギニン添加に対す
る依存性 溶出液を０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
５）、１ミリモル／ｌＥＤＴＡ、５ミリモル／ｌ ＧＳ
Ｈ、０．５ミリモル／ｌ ＧＳＳＧにより１：５０に稀
釈しかつ０℃で２０時間活性化した。
る依存性 溶出液を０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
５）、１ミリモル／ｌＥＤＴＡ、５ミリモル／ｌ ＧＳ
Ｈ、０．５ミリモル／ｌ ＧＳＳＧにより１：５０に稀
釈しかつ０℃で２０時間活性化した。
【００５０】 活性のＬ−アルギニン−依存性 Ｌ−アルギニン（モル／ｌ） 活性（％） ０ ８ ０．２５ ８ ０．５ １５ ０．７５ １５ ｂ）活性収率の尿素添加に対する依存性 活性化溶液は前記のａ）に相当するが、０℃で１７時間
活性化した。
活性化した。
【００５１】 活性の尿素依存性 尿素（モル／ｌ） 活性（％） ０ １３ ０．５ １００ １ ２００ １．５ １００ ｃ）ホルムアミド添加に対する活性収率の依存性 ａ）と同様に活性化し、試料を０℃で１７時間活性化し
た後で試験した。
た後で試験した。
【００５２】 活性化のホルムアミド依存性 ホルムアミド（モル／ｌ） 活 性 ０ １３ １ １３ ２ １３ ３ ０ ４ ０ ｄ）レドックス緩衝剤に対する活性収率の依存性 溶出液を０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
５）、１ミリモル／ｌＥＤＴＡ及び０．２５モル／ｌ
Ｌ−アルギニン中で１：５０に稀釈しかつ試料を０℃で
１７時間活性化後に試験した。
５）、１ミリモル／ｌＥＤＴＡ及び０．２５モル／ｌ
Ｌ−アルギニン中で１：５０に稀釈しかつ試料を０℃で
１７時間活性化後に試験した。
【００５３】 活性のＧＳＨ／ＧＳＳＧ依存性 ＧＳＨ（ミリモル／ｌ） ＧＳＳＧ（ミリモル／ｌ） 活性（％） １ ０．５ ６ ５ ０．５ １３ １０ ０．５ ２５ ２０ ０．５ ２５ ５ ０．１ １３ ５ ０．５ １３ ５ １．０ １３ ５ ５ ６ ｅ）ＢＳＡ添加に対する活性収率の依存性 溶出液を０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．
５）、１ミリモル／ｌＥＤＴＡ、５ミリモル／ｌ ＧＳ
Ｈ、０．５ミリモル／ｌ ＧＳＳＧ及び０．２モル／ｌ
Ｌ−アルギニン中で１：５０に稀釈しかつ０℃で１７
時間活性化後に試験した。
５）、１ミリモル／ｌＥＤＴＡ、５ミリモル／ｌ ＧＳ
Ｈ、０．５ミリモル／ｌ ＧＳＳＧ及び０．２モル／ｌ
Ｌ−アルギニン中で１：５０に稀釈しかつ０℃で１７
時間活性化後に試験した。
【００５４】 活性のＢＳＡ依存性 ＢＳＡ（ｍｇ／ｍｌ） 活 性（％） ０ １３ １ １３ ２ ２５ ５ １３ ｆ）ｐＨに対する活性収率の依存性 溶出液を０．１モル／ｌ トリス／ＨＣｌ、１ミリモル
／ｌ ＥＤＴＡ、５ミリモル／ｌ ＧＳＨ、０．５ミリ
モル／ｌ ＧＳＳＧ及び０．２５モル／ｌ Ｌ−アルギ
ニン中で１：５０に稀釈しかつ０℃で１７時間活性化後
に試験した。 活性のｐＨ依存性 ｐＨ 活 性（％） ６．５ ０ ７．５ ６ ８．５ １３ ９．５ ５０ １０．５ １００
／ｌ ＥＤＴＡ、５ミリモル／ｌ ＧＳＨ、０．５ミリ
モル／ｌ ＧＳＳＧ及び０．２５モル／ｌ Ｌ−アルギ
ニン中で１：５０に稀釈しかつ０℃で１７時間活性化後
に試験した。 活性のｐＨ依存性 ｐＨ 活 性（％） ６．５ ０ ７．５ ６ ８．５ １３ ９．５ ５０ １０．５ １００
【図１】標準試験において０．１モル／ｌ トリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ＝１０．５）＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ＋
０．５モルＬ−アルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ＋
０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ Ｇ
ＳＳＧ中、室温で１７時間再酸化した後のＣＮＢｒ−Ｆ
ＳＰを含有する場合（曲線Ａ）と含有しない場合（曲線
Ｂ）のｔ−ＰＡ活性を図示したものである。
Ｃｌ（ｐＨ＝１０．５）＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ＋
０．５モルＬ−アルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ＋
０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ Ｇ
ＳＳＧ中、室温で１７時間再酸化した後のＣＮＢｒ−Ｆ
ＳＰを含有する場合（曲線Ａ）と含有しない場合（曲線
Ｂ）のｔ−ＰＡ活性を図示したものである。
【図２】標準試験において０．１モル／ｌ トリス／Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ＝１０．５）＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ＋
０．５モルＬ−アルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ＋
０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ Ｇ
ＳＳＧ中、室温で１７時間再酸化した後のＣＮＢｒ−Ｆ
ＳＰを含有する場合（曲線Ａ）と含有しない場合（曲線
Ｂ）のｔ−ＰＡ活性を図示したものである。
Ｃｌ（ｐＨ＝１０．５）＋１ミリモル／ｌ ＥＤＴＡ＋
０．５モルＬ−アルギニン＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ＋
０．５ミリモル／ｌ ＧＳＨ＋０．５ミリモル／ｌ Ｇ
ＳＳＧ中、室温で１７時間再酸化した後のＣＮＢｒ−Ｆ
ＳＰを含有する場合（曲線Ａ）と含有しない場合（曲線
Ｂ）のｔ−ＰＡ活性を図示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ 15/09 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:40） (72)発明者 マッテス，ラルフ ドイツ連邦共和国 Ｄ−8125 オーベルハ ウゼン アイアッハー シュトラーセ 37 (72)発明者 ルードルフ，ライナー ドイツ連邦共和国 Ｄ−8400 レーゲンス ブルク ウンテリスリンガー ヴェーク 21 (56)参考文献 特開 昭59−161321（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開122080（ＥＰ，Ａ)
Claims (21)
- 【請求項１】 遺伝子工学的に製造した、異種の、ジス
ルフイド結合を含有する真核蛋白質を原核生物中で発現
後に、細胞を砕解し、変性及び還元条件下に可溶化しか
つＧＳＨ／ＧＳＳＧの存在における酸化条件下に再活性
化することにより活性化する方法において、再活性化工
程においてｐＨ値９〜１２、ＧＳＨ濃度０．１〜２０ミ
リモル／ｌ、ＧＳＳＧ濃度０．０１〜３ミリモル／ｌで
かつ変性作用をしない濃度の変性剤を用いて作業するこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項２】 再活性化工程においてｐＨ値が９．５〜
１１であることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 再活性化工程において、ＧＳＨ濃度は
０．２〜１０ミリモル／ｌ及び／又はＧＳＳＧ濃度は
０．０５〜１ミリモル／ｌであることを特徴とする請求
項１又は２記載の方法。 - 【請求項４】 可溶化後及び再活性化前に精製を行なう
ことを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項記
載の方法。 - 【請求項５】 再活性化を変性−／還元剤を予め分離す
ることなく行ない、その際に変性／還元後の反応溶液を
再活性化緩衝剤で稀釈しかつ再活性化の際にＧＳＳＧ濃
度がＤＴＥの残留濃度を上廻ることを特徴とする請求項
１から３までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】 発現をＥ．コリ又はＰ．プチダで行なう
請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】 再活性化工程において変性剤としてアル
ギニン、グアニジン−ヒドロクロリド及び／又は一般
式： Ｒ２−ＣＯ−ＮＲＲ１ （Ｉ） ［式中Ｒ及びＲ１はＨ
又はＣ原子１〜４個を有するアルキルを表わしかつＲ２
はＨ又はＮＨＲ１又はＣ原子１〜３個を有するアルキル
を表わす］の化合物少なくとも１種を使用する請求項１
から６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項８】 アルギニン及び／又はグアニジンヒドロ
クロリドの濃度が０．１〜１．０モル／ｌである請求項
７記載の方法。 - 【請求項９】 一般式Ｉの化合物の濃度が０．５〜４モ
ル／ｌである請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 再活性化工程において蛋白質分解作用
をしない蛋白質の存在において作業する請求項１から９
までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１１】 細胞の砕解を超音波、高圧分散又はリ
ゾチームを用いて行なう請求項１から１０までのいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項１２】 砕解を稀水性緩衝液中、中性乃至弱酸
性のｐＨ値で行なう請求項１１記載の方法。 - 【請求項１３】 細胞の砕解後に不溶性成分を分離する
請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１４】 可溶化工程において、アルカリ性ｐＨ
値でメルカプト基からの還元剤の存在において及び変性
剤の存在において作業する請求項１から１３までのいず
れか１項記載の方法。 - 【請求項１５】 変性剤としてグアニジンヒドロクロリ
ド及び／又は一般式Ｉの化合物の存在において作業する
請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 グアニジンヒドロクロリドの濃度が６
モル／ｌであり、一般式Ｉの化合物の濃度が８モル／ｌ
である請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】 ＤＴＥ、β−メルカプトエタノー
ル、システイン又はＧＳＨの存在において作業する請求
項１４から１６までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１８】 精製及び還元剤、酸化剤又は変性剤の
分離は滅菌溶離クロマトグラフィ又は透析により行なう
請求項１から１７までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１９】 再活性化工程の後で透析による精製工
程を行なう請求項１から１８までのいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項２０】 遺伝子工学的に製造した真核蛋白質と
してｔ−ＰＡを使用する請求項１から１９までのいずれ
か１項記載の方法。 - 【請求項２１】 遺伝子工学的に製造した真核蛋白質と
してインターフエロンβを使用する請求項１から１９ま
でのいずれか１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19853537708 DE3537708A1 (de) | 1985-10-23 | 1985-10-23 | Verfahren zur aktivierung von t-pa nach expression in prokaryonten |
| DE3537708.9 | 1985-10-23 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61505882A Division JPH0728745B2 (ja) | 1985-10-23 | 1986-10-23 | 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法 |
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|---|---|
| JPH04218387A JPH04218387A (ja) | 1992-08-07 |
| JPH0824594B2 true JPH0824594B2 (ja) | 1996-03-13 |
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61505882A Expired - Lifetime JPH0728745B2 (ja) | 1985-10-23 | 1986-10-23 | 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法 |
| JP3079762A Expired - Lifetime JPH0824594B2 (ja) | 1985-10-23 | 1991-04-12 | 遺伝子工学的に製造した、異種の、ジスルフイド結合を含有する真核蛋白質を原核における発現後に活性化する方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61505882A Expired - Lifetime JPH0728745B2 (ja) | 1985-10-23 | 1986-10-23 | 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法 |
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| JP (2) | JPH0728745B2 (ja) |
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| DD (1) | DD260517A5 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP2581668B2 (ja) * | 1985-11-27 | 1997-02-12 | 三井東圧化学株式会社 | ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞 |
| US4777043A (en) * | 1985-12-17 | 1988-10-11 | Genentech, Inc. | Stabilized human tissue plasminogen activator compositions |
| AU621051B2 (en) * | 1987-04-28 | 1992-03-05 | Amgen, Inc. | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
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