JPS6226298A - ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法 - Google Patents
ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法Info
- Publication number
- JPS6226298A JPS6226298A JP15989686A JP15989686A JPS6226298A JP S6226298 A JPS6226298 A JP S6226298A JP 15989686 A JP15989686 A JP 15989686A JP 15989686 A JP15989686 A JP 15989686A JP S6226298 A JPS6226298 A JP S6226298A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- thioredoxin
- oxidized
- protein
- reduced
- dithiol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野コ
蛋白質の臨界的な特徴は活性位置を造りだすあるコンフ
ォメーション（立体構造）への折り畳み（ｆｏｌｄｉｎ
ｇ）又は所望の生物活性を現すことが出来るようにする
構造的な特徴である。蛋白質が生体内で合成される際に
、全くこれらは天然（ｎａｔｉｖｅ）の折り曲げられた
蛋白質の定義構造特性を有していない。正しい天然のコ
ンフォメーション（立体構造）の発見はある程度は試行
錯誤による。しかし、比較的速い生体内での蛋白質の折
り畳みは比較的少ない中間体種しか伴わない折り畳みの
経路があることを意味するものである。全体的にいえば
折り畳み工程は天然の形聾のより大きな熱力学的な安定
性によって動かされる。
ォメーション（立体構造）への折り畳み（ｆｏｌｄｉｎ
ｇ）又は所望の生物活性を現すことが出来るようにする
構造的な特徴である。蛋白質が生体内で合成される際に
、全くこれらは天然（ｎａｔｉｖｅ）の折り曲げられた
蛋白質の定義構造特性を有していない。正しい天然のコ
ンフォメーション（立体構造）の発見はある程度は試行
錯誤による。しかし、比較的速い生体内での蛋白質の折
り畳みは比較的少ない中間体種しか伴わない折り畳みの
経路があることを意味するものである。全体的にいえば
折り畳み工程は天然の形聾のより大きな熱力学的な安定
性によって動かされる。
正常な条件下ては生体内での折り畳みは非常に迅速にお
きる。細菌では典型的には再折り畳みが数分間でおきる
。特定の合成された蛋白質の量をかなり増幅することを
可能とする組替え技術のｎ近の発達からすると、蛋白質
の折り畳みは遅いものである。これは折り畳みされてい
ないか又は部分的に折り畳みされた蛋白質を含有する包
接体を屡々生しる。
きる。細菌では典型的には再折り畳みが数分間でおきる
。特定の合成された蛋白質の量をかなり増幅することを
可能とする組替え技術のｎ近の発達からすると、蛋白質
の折り畳みは遅いものである。これは折り畳みされてい
ないか又は部分的に折り畳みされた蛋白質を含有する包
接体を屡々生しる。
ジスルフィド架橋（ジスルフィド蛋白Ｍ）を含有する蛋
白質に対しては、この問題はＭｉ替え宿主として一般的
に使用されている例えば大腸菌等の細菌がジスルフィド
形へのスルフィヒドリル酸１ヒの工程に適合していない
ので特に厳しいものとなる。
白質に対しては、この問題はＭｉ替え宿主として一般的
に使用されている例えば大腸菌等の細菌がジスルフィド
形へのスルフィヒドリル酸１ヒの工程に適合していない
ので特に厳しいものとなる。
ジスルフィド蛋白質の再折り畳みについての多くの研究
によって、折り畳み工程というものは、特定の複数のジ
スルフィドの連続的な形成（即ちジスルフィド連＠）の
−っであることが明らかになった。反応速度論的には全
体の工程の効率はこの連鎖段階によって制限される。こ
の工程を触媒する低分子量のチオール類（２口ちシステ
ィン、グルタチオン）を使用する幾つかの研究は酸化さ
れた、そして還元されたチオール化合物の最適濃度を定
義した。観測される速度は空気酸化と比較して非常に改
良されるがその様な条件は産業的な規模の方法ζこλ１
しては末だ多くの望まれろ事項が残されている。そのよ
うな工程はほとほとの時間及び蛋白濃度における適度の
収率な得ることが要求される。従って、蛋白質折り畳み
工程に於ける目標は反応の速度を増加させるのみならず
、収率を犠牲にすることなく大きな蛋白濃度を使用する
こと：こよって蛋白質を効果的に折り畳みすることであ
る。
によって、折り畳み工程というものは、特定の複数のジ
スルフィドの連続的な形成（即ちジスルフィド連＠）の
−っであることが明らかになった。反応速度論的には全
体の工程の効率はこの連鎖段階によって制限される。こ
の工程を触媒する低分子量のチオール類（２口ちシステ
ィン、グルタチオン）を使用する幾つかの研究は酸化さ
れた、そして還元されたチオール化合物の最適濃度を定
義した。観測される速度は空気酸化と比較して非常に改
良されるがその様な条件は産業的な規模の方法ζこλ１
しては末だ多くの望まれろ事項が残されている。そのよ
うな工程はほとほとの時間及び蛋白濃度における適度の
収率な得ることが要求される。従って、蛋白質折り畳み
工程に於ける目標は反応の速度を増加させるのみならず
、収率を犠牲にすることなく大きな蛋白濃度を使用する
こと：こよって蛋白質を効果的に折り畳みすることであ
る。
最も商業的に１要なジスルフィド結合含有蛋白質は、イ
ンシュリンである。米国特許４，４２１，６８５はＡ鎖
のＳ〜スルホン化形態及びＢ鎖のＳスルホン化形態が特
定の条件下でチオール還元剤と反応させられ、インシュ
リンを形成するインシュリン製造方法を開示している。
ンシュリンである。米国特許４，４２１，６８５はＡ鎖
のＳ〜スルホン化形態及びＢ鎖のＳスルホン化形態が特
定の条件下でチオール還元剤と反応させられ、インシュ
リンを形成するインシュリン製造方法を開示している。
ここに開示されるチオール還元剤はジチオスレイトール
（ＤＴＴ）及びジチオエリスリトール（ＤＴＥ）である
。
（ＤＴＴ）及びジチオエリスリトール（ＤＴＥ）である
。
刊替え蛋白質の再折り畏みにおけるＳ−スルホン１ヒ潰
白賞の使用は一般的な産業上用いられろ方法である（米
国特許４，４２１，６８５を参！！！ ）。スルホン化
蛋白質の使用は沢白ＫＭ製の間のより大きな溶解度を可
能とし、そしてスルフヒドリル基を保護する。限られた
量のレダクタントの存在下では再折り畳みは効率的で蛋
白質チオスホネートは混合ジスルフィド中間体として作
用する。記載された方法の殆とはレダクタントとしてＤ
Ｔ Ｔ、グルタチオン又はβ−メルカプトエタノール
を使用する。
白賞の使用は一般的な産業上用いられろ方法である（米
国特許４，４２１，６８５を参！！！ ）。スルホン化
蛋白質の使用は沢白ＫＭ製の間のより大きな溶解度を可
能とし、そしてスルフヒドリル基を保護する。限られた
量のレダクタントの存在下では再折り畳みは効率的で蛋
白質チオスホネートは混合ジスルフィド中間体として作
用する。記載された方法の殆とはレダクタントとしてＤ
Ｔ Ｔ、グルタチオン又はβ−メルカプトエタノール
を使用する。
［問題を解決する手段］
本発明はジスルフィド架橋を含有する蛋白質を折り畳む
改良方法に関する。蛋白質又は蛋白質の部分が構築され
た微生物によって造りだされる組替え［ｌＮＡ工程によ
って本方法は特に有用性を有する。本発明方法は、折り
畳まれていない還元されていた蛋白質を、有効な蛋白質
折り畳み量の酸化されたチオレドキシン又は酸化された
チオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン様のジ
チオールペプチドの単独又はこれと酸素又はチオレドキ
シンレダクターゼ再生系との組合わせと反応させ、１斤
り畳まれた蛋白質を製造することからなる。
改良方法に関する。蛋白質又は蛋白質の部分が構築され
た微生物によって造りだされる組替え［ｌＮＡ工程によ
って本方法は特に有用性を有する。本発明方法は、折り
畳まれていない還元されていた蛋白質を、有効な蛋白質
折り畳み量の酸化されたチオレドキシン又は酸化された
チオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン様のジ
チオールペプチドの単独又はこれと酸素又はチオレドキ
シンレダクターゼ再生系との組合わせと反応させ、１斤
り畳まれた蛋白質を製造することからなる。
本発明方法はまた不正確なジスルフィド結合が形成され
ているスクランブル化された蛋白質（蛋白質は折り畳み
されているが間違ったコンフォメーションで折り畳まれ
ており、一部分のみが活性であるにすぎないもの）を、
有効な濃度の酸化された及び還元されたチオレドキシン
又は酸化されたチオレドキシン及びジチオスレイト−ル
なとの化学的な還元剤と反応させることからなる方法に
も関する。
ているスクランブル化された蛋白質（蛋白質は折り畳み
されているが間違ったコンフォメーションで折り畳まれ
ており、一部分のみが活性であるにすぎないもの）を、
有効な濃度の酸化された及び還元されたチオレドキシン
又は酸化されたチオレドキシン及びジチオスレイト−ル
なとの化学的な還元剤と反応させることからなる方法に
も関する。
ジスルフィド架橋を含有する折り畳まれていない蛋白質
は折り畳みされていない、還元された蛋白質を蛋白質折
り畳み有効量の酸化されたチオレドキシン又は酸化され
たチオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン様の
ジチオールペプチドの単独、又はこれと酸素、又はチオ
レドキシンレダクターゼ再生系の組合わせと反応させる
ことによって効果的に折り丹むことができる。スクラン
ブル化された蛋白質はこれらを蛋白質を斤り畏み有効量
の還元されたチオレドキシン又は還元されたチオレドキ
シンに由来するか又はチオレドキシン様のジチオールペ
プチドの単独又はこれと酸化されたチオレドキシン叉は
酸化されたチオレドキシンに由来するか又はチオレドキ
シン様のジチオールペプチドとの知合わせと反応させる
ことによって正しく折り畳みすることが出来る。
は折り畳みされていない、還元された蛋白質を蛋白質折
り畳み有効量の酸化されたチオレドキシン又は酸化され
たチオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン様の
ジチオールペプチドの単独、又はこれと酸素、又はチオ
レドキシンレダクターゼ再生系の組合わせと反応させる
ことによって効果的に折り丹むことができる。スクラン
ブル化された蛋白質はこれらを蛋白質を斤り畏み有効量
の還元されたチオレドキシン又は還元されたチオレドキ
シンに由来するか又はチオレドキシン様のジチオールペ
プチドの単独又はこれと酸化されたチオレドキシン叉は
酸化されたチオレドキシンに由来するか又はチオレドキ
シン様のジチオールペプチドとの知合わせと反応させる
ことによって正しく折り畳みすることが出来る。
折り畳まれていないか、又はスクランブル化された蛋白
質は、粗細胞抽出物中にあるか又は＋Ｕ＊胞抽出物、例
えば組替え微生物から部分的に積装され得る。
質は、粗細胞抽出物中にあるか又は＋Ｕ＊胞抽出物、例
えば組替え微生物から部分的に積装され得る。
本発明方法において使用できるチオレドキシン又はチオ
レドキシンに由来するか又はチオレドキシン様のジチオ
ールペプチドの一つの濃度は約５〜約５００μ口の範囲
である。酸化された笹傷の細菌のチオし・トキシンに対
する最適の１度は少なくとも５００１１Ｍのようであり
、還元されたチオレドキシンに対しては１０μＭである
。チオレドキシン又はチオレドキシンに由来するか又は
チオレドキシン様のジチオールペプチドの正確な水・茗
は、本発明の属する蛋白質の技術の熟達者によって特定
の蛋白質によって容易に確認することが出来る。
レドキシンに由来するか又はチオレドキシン様のジチオ
ールペプチドの一つの濃度は約５〜約５００μ口の範囲
である。酸化された笹傷の細菌のチオし・トキシンに対
する最適の１度は少なくとも５００１１Ｍのようであり
、還元されたチオレドキシンに対しては１０μＭである
。チオレドキシン又はチオレドキシンに由来するか又は
チオレドキシン様のジチオールペプチドの正確な水・茗
は、本発明の属する蛋白質の技術の熟達者によって特定
の蛋白質によって容易に確認することが出来る。
５〜５００μＭの１度におけるチオレドキシンは変性及
び還元された牛すい臓ＲＮａｓｅ（２２〜１６０７ｚわ
の再折り畳みを触媒し、酵素活性の定量的な回復を与え
る。再折り畳みの速度はおよそ空気酸化の１５倍大きい
。チオレドキシンの場合は５０％活性が１００μ曾て３
０時間後回復し、５００μＭで８時間後に回復し、これ
に対し空気酸化を使用する時は１２０時間を要する。チ
オレドキシンは酸化されたジチオスレイトールよりも１
０００倍効果的である。ノＩＭ濃度におけるチオレドキ
シンは酸化されたＯＴＴのｍＭ１１度と同じ再折り畳み
の反応速度を生じる。 ＤＴＴ （２０ｍＭ）及び種々
の濃度のチオレドキシンを試料に°加えた時に、活性の
外観に於ける追加的な増加があった。
び還元された牛すい臓ＲＮａｓｅ（２２〜１６０７ｚわ
の再折り畳みを触媒し、酵素活性の定量的な回復を与え
る。再折り畳みの速度はおよそ空気酸化の１５倍大きい
。チオレドキシンの場合は５０％活性が１００μ曾て３
０時間後回復し、５００μＭで８時間後に回復し、これ
に対し空気酸化を使用する時は１２０時間を要する。チ
オレドキシンは酸化されたジチオスレイトールよりも１
０００倍効果的である。ノＩＭ濃度におけるチオレドキ
シンは酸化されたＯＴＴのｍＭ１１度と同じ再折り畳み
の反応速度を生じる。 ＤＴＴ （２０ｍＭ）及び種々
の濃度のチオレドキシンを試料に°加えた時に、活性の
外観に於ける追加的な増加があった。
この増加は全てのチオレドキシン濃度に対し一定で、こ
の効果が相乗的であることを示唆している。
の効果が相乗的であることを示唆している。
１００μＮチオレドキシンの存在下におけるＲＮａｓｅ
の５０％再活性化に要求される時間（Ｔ １７２）は酸
素の添加によって３倍減少した。１００μＭチオレドキ
シン及び空気に対するＴ Ｉ／２は２３時間である。酸
素を添加したときにはＴ Ｉ／２は８時間に縮まった。
の５０％再活性化に要求される時間（Ｔ １７２）は酸
素の添加によって３倍減少した。１００μＭチオレドキ
シン及び空気に対するＴ Ｉ／２は２３時間である。酸
素を添加したときにはＴ Ｉ／２は８時間に縮まった。
これは空気存在下における５００μＭチオレドキシンの
Ｔｌ／２に匹敵する。チオレドキシンの有効濃度は酸素
の添加によって５倍（ファクターが５だけ）減少した。
Ｔｌ／２に匹敵する。チオレドキシンの有効濃度は酸素
の添加によって５倍（ファクターが５だけ）減少した。
チオレドキシンが存在しない場合は酸素効果は生しない
。チオレドキシンなして再折り畳みの初Ｕ増加があるが
回復した活性は５時間後１２％に於て水平となる。
。チオレドキシンなして再折り畳みの初Ｕ増加があるが
回復した活性は５時間後１２％に於て水平となる。
チオレドキシンレダクターゼ及びニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド誘導体、例えばＮＡＤＰ＋く酸化形）
の再生系の存在下ではｌＯμＮチオレドキシンてＲＮａ
ｓｅの再折り畳みの増加があった。チオレドキシンレダ
クターゼと０．１または１．０の何れかのｌ１１ＭのＮ
ＡＤＰ十の場合、Ｔｌ／２は２３時間から５〜６時間に
減少した。
ンジヌクレオチド誘導体、例えばＮＡＤＰ＋く酸化形）
の再生系の存在下ではｌＯμＮチオレドキシンてＲＮａ
ｓｅの再折り畳みの増加があった。チオレドキシンレダ
クターゼと０．１または１．０の何れかのｌ１１ＭのＮ
ＡＤＰ十の場合、Ｔｌ／２は２３時間から５〜６時間に
減少した。
チオレドキシンは効果的にスクランブル化された不活性
のりボヌクレアーゼをｐＨ７，４に於てジスルフィド結
合の再配置を効果的に触媒し、活性酵素の定量的な回復
を生じる。１０μ−の濃度における還元されたチオレド
キシンはＴ１７２８時間を有していた。スクランブル化
されたりボヌクレアーゼを再活性化するための最適の条
件はそれぞれ１０：１の比率の酸化及び還元チオレドキ
シンの混合物からなっていた。１００μＭ、１５０μＭ
及び２００μＭのチオレドキシンのＩＯ：Ｉの酸化形削
還元形の比におけるＴ１７２の値はそれぞれ５．２、及
び１．５時間であった。スクランブル化されたりボヌク
レアーゼを再活性化するのに空気単独又はＤＴＴ単独も
有効でなく、３０χ未満の回収であった。
のりボヌクレアーゼをｐＨ７，４に於てジスルフィド結
合の再配置を効果的に触媒し、活性酵素の定量的な回復
を生じる。１０μ−の濃度における還元されたチオレド
キシンはＴ１７２８時間を有していた。スクランブル化
されたりボヌクレアーゼを再活性化するための最適の条
件はそれぞれ１０：１の比率の酸化及び還元チオレドキ
シンの混合物からなっていた。１００μＭ、１５０μＭ
及び２００μＭのチオレドキシンのＩＯ：Ｉの酸化形削
還元形の比におけるＴ１７２の値はそれぞれ５．２、及
び１．５時間であった。スクランブル化されたりボヌク
レアーゼを再活性化するのに空気単独又はＤＴＴ単独も
有効でなく、３０χ未満の回収であった。
チオレドキシンはへルマンズ試薬なとの有機化合物又は
種々の蛋白質中などて天然に存在するジスルフィドを還
元する能力を有している低分子量のジチオール蛋白質で
ある（ホルムグレンニー。
種々の蛋白質中などて天然に存在するジスルフィドを還
元する能力を有している低分子量のジチオール蛋白質で
ある（ホルムグレンニー。
［１９８１コトレンズ イン バイオケミカルサイエン
ス６、２６−２９）。本発明の範囲内のチオレドキシン
及びチオレドキシンに由来するが又はチオレドキシン様
のジチオールペプチドは次の化合物によって例示される
。
ス６、２６−２９）。本発明の範囲内のチオレドキシン
及びチオレドキシンに由来するが又はチオレドキシン様
のジチオールペプチドは次の化合物によって例示される
。
（１）大腸菌から単離されたチオレドキシン（ローレン
ト ティー、シー０、モー７ イー、シー、及びレイチ
ャード ビー［＋９６４］ Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、、 ２３９゜（２）他の°源から単離されたチオレ
ドキシン類、例えば酵母から単離されるチオレドキシン
（ポリキュー ジー、ビー０、パルデステン ニー、及
びレイチャード ビー−［１９７０］ Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ、 ２４５゜２３６２−２３７９） ：
シフ ／ バクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒ−
ｉｕｍ） （グリーソン エフ、ケー、及びホルムグレ
ンニー、［１９８３］ ｒチオレドキシン様、ストラフ
チャーアンドファンクション」 ［ビー、ガダール編］
Ｅｄｉｔｉｏｎｓ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ ｄｅ ｌａ ＲｅｃｈｅｒｃｈｅＳｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｑｕｅ） ：ラット（ｒａｔ） （グエララ ジエ
ー。
ト ティー、シー０、モー７ イー、シー、及びレイチ
ャード ビー［＋９６４］ Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅ
ｍ、、 ２３９゜（２）他の°源から単離されたチオレ
ドキシン類、例えば酵母から単離されるチオレドキシン
（ポリキュー ジー、ビー０、パルデステン ニー、及
びレイチャード ビー−［１９７０］ Ｊ、 Ｂｉｏｌ
、 Ｃｈｅｍ、 ２４５゜２３６２−２３７９） ：
シフ ／ バクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒ−
ｉｕｍ） （グリーソン エフ、ケー、及びホルムグレ
ンニー、［１９８３］ ｒチオレドキシン様、ストラフ
チャーアンドファンクション」 ［ビー、ガダール編］
Ｅｄｉｔｉｏｎｓ ｄｕ Ｃｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ ｄｅ ｌａ ＲｅｃｈｅｒｃｈｅＳｃｉｅｎｔｉ
ｆｉｑｕｅ） ：ラット（ｒａｔ） （グエララ ジエ
ー。
、モー７ イー、シー、及びワード ディー、エムエヌ
、［＋９８３１同上；Ｔ４バクテリオファージ（ソデル
バーグＢ−０、スジョペルグＢ−Ｍ、ゾンネルスタムＵ
８、及びブランテンＣ−１［１９７１Ｄ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。
、［＋９８３１同上；Ｔ４バクテリオファージ（ソデル
バーグＢ−０、スジョペルグＢ−Ｍ、ゾンネルスタムＵ
８、及びブランテンＣ−１［１９７１Ｄ Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ７５．５８２７−５８
３０）（３）上記実施例２に記載されるような、無傷の
チオレドキシンの開裂によって製造されるペプチドを表
しているチオレドキシン由来のジチオールペプチド。こ
のクラスの一つのチオレドキシン由来ペプチドの例は大
腸菌からのチオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂
によって製造される １〜３７の残基を含有する断片（
ｆ！ＩＩＩちＴ ｌ−３７）である。
３０）（３）上記実施例２に記載されるような、無傷の
チオレドキシンの開裂によって製造されるペプチドを表
しているチオレドキシン由来のジチオールペプチド。こ
のクラスの一つのチオレドキシン由来ペプチドの例は大
腸菌からのチオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂
によって製造される １〜３７の残基を含有する断片（
ｆ！ＩＩＩちＴ ｌ−３７）である。
これらのチオレドキシンに由来する及びチオレドキシン
様のジチオールペプチドの重要な特徴はこれらがレドッ
クス活性のペプチド配列、Ｃｙｓ−Ｘ−Ｙ−（ｙｓ−Ｌ
ｙｓ （式中Ｘ及びＹは２０個のアミノ酸の任意のもの
でありうる）を含んでいることである。例えは、大腸菌
チオレドキシンからのレドックス活性ペプチド配列はＣ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ （Ｃｙｓ＝シ
スティン、Ｇ１ン＝グリシン、Ｐ「０＝プロリン、Ｌｙ
ｓ＝リジン）である。
様のジチオールペプチドの重要な特徴はこれらがレドッ
クス活性のペプチド配列、Ｃｙｓ−Ｘ−Ｙ−（ｙｓ−Ｌ
ｙｓ （式中Ｘ及びＹは２０個のアミノ酸の任意のもの
でありうる）を含んでいることである。例えは、大腸菌
チオレドキシンからのレドックス活性ペプチド配列はＣ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ （Ｃｙｓ＝シ
スティン、Ｇ１ン＝グリシン、Ｐ「０＝プロリン、Ｌｙ
ｓ＝リジン）である。
（４）蛋白ジスルフィドの還元を触媒する固有の能力を
有するチオレドキシン様のジチオールペプチド。これら
のチオレドキシン様のジチオールペプチドは一般的にレ
ドックス活性ジスルフィドを形成する一対のシスティン
残基を含有する特性を一般的に有しているであろう。こ
の例には上に開示されたレドックス活性ペプチド配列を
含んでいる天然源から由来するか又は合成的に構成され
たペプチドを含んでいる。例えば大腸菌チオレドキシン
中のＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ又は他の
Ｔ４バクテリオファージに対してコードされているよう
な他のチオレドキシンからの類似の配列、 Ｃｙｓ−Ｖ
ａｉＴｙｒ−ＣｙＳ （Ｃｙｓ＝システィン、ｖａ１＝
バリン、Ｔｙｒ＝チロシン）（ソダーバーグＢ−０、ス
ジョベルグＢ−Ｍ、ゾンネルスタムＵ、及びブラーデン
Ｃ−１［＋９７８］Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 ＩＪＳＡ、 ７５．５８２７−５８３０
）。
有するチオレドキシン様のジチオールペプチド。これら
のチオレドキシン様のジチオールペプチドは一般的にレ
ドックス活性ジスルフィドを形成する一対のシスティン
残基を含有する特性を一般的に有しているであろう。こ
の例には上に開示されたレドックス活性ペプチド配列を
含んでいる天然源から由来するか又は合成的に構成され
たペプチドを含んでいる。例えば大腸菌チオレドキシン
中のＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ又は他の
Ｔ４バクテリオファージに対してコードされているよう
な他のチオレドキシンからの類似の配列、 Ｃｙｓ−Ｖ
ａｉＴｙｒ−ＣｙＳ （Ｃｙｓ＝システィン、ｖａ１＝
バリン、Ｔｙｒ＝チロシン）（ソダーバーグＢ−０、ス
ジョベルグＢ−Ｍ、ゾンネルスタムＵ、及びブラーデン
Ｃ−１［＋９７８］Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 ＩＪＳＡ、 ７５．５８２７−５８３０
）。
他のチオレドキシン様のペプチドには固有のチオレドキ
シン様活性を有しているプロチオエン類と呼ばれる種子
蛋白質類が含まれる。（ワダケー１、ブヒャナン ビー
、ビー、 ［＋９８３］ ｒチオレドキシン類、構造及
び機能」［ガダル ビー、編コＥｄｉｔｉｏｎｓｄｕ
Ｃｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ＩａＲｅｃｈ
ｅｒｃｈｅ ５ｃｉｅｎｔｉｆ−ｉｑｕｅ）。
シン様活性を有しているプロチオエン類と呼ばれる種子
蛋白質類が含まれる。（ワダケー１、ブヒャナン ビー
、ビー、 ［＋９８３］ ｒチオレドキシン類、構造及
び機能」［ガダル ビー、編コＥｄｉｔｉｏｎｓｄｕ
Ｃｅｎｔｒｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ＩａＲｅｃｈ
ｅｒｃｈｅ ５ｃｉｅｎｔｉｆ−ｉｑｕｅ）。
ジスルフィド架橋を含有する蛋白質の例はインシュリン
、プロインシュリン、牛すい臓リボヌクレアーゼ（ＲＮ
ａｓｅ）、リゾチーム、牛すい臓トリプシンインヒビタ
ー、インターフェロン、レンニン、プラスミノゲンアク
チベーター、プロラクチン、人α−１トリプシンインヒ
ビター、ファクター■なとである。
、プロインシュリン、牛すい臓リボヌクレアーゼ（ＲＮ
ａｓｅ）、リゾチーム、牛すい臓トリプシンインヒビタ
ー、インターフェロン、レンニン、プラスミノゲンアク
チベーター、プロラクチン、人α−１トリプシンインヒ
ビター、ファクター■なとである。
上の蛋白質及び他のジスルフィド架橋含有蛋白質はここ
に開示される発明において出発物質としてそれらのＳ−
スルホン化形態で使用することが出来る。Ｓ−スルホン
化形態の蛋白質が使用されるときには還元されたチオレ
ドキシンが折り畳み工程に加えられる。
に開示される発明において出発物質としてそれらのＳ−
スルホン化形態で使用することが出来る。Ｓ−スルホン
化形態の蛋白質が使用されるときには還元されたチオレ
ドキシンが折り畳み工程に加えられる。
下に開示された実施例に於ける物質及び方法は以下の通
りである。
りである。
■
牛すい臓リボヌクレアーゼＡ （ＲＮａｓｅ）、シチジ
ン−２’：３’−環状モノホスフェート及び酸化された
及び還元されたジチオスレイトール（ＤＴＴ）はミズリ
ー州セントルイスのシグマから得た。３−（Ｎ−モルホ
リン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ナトリウム塩は
カリホルニア州すンジエゴ、カルビオケムからのＵｌｔ
ｒｏ１等級であった。セファデックスＧ−２５−４０も
シグマから得た。すべての他の化学物質は試薬等級であ
った。
ン−２’：３’−環状モノホスフェート及び酸化された
及び還元されたジチオスレイトール（ＤＴＴ）はミズリ
ー州セントルイスのシグマから得た。３−（Ｎ−モルホ
リン）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ナトリウム塩は
カリホルニア州すンジエゴ、カルビオケムからのＵｌｔ
ｒｏ１等級であった。セファデックスＧ−２５−４０も
シグマから得た。すべての他の化学物質は試薬等級であ
った。
チオレドキシンを市販の大腸菌から大腸菌菌株Ｂ （Ｍ
Ｎミネアポリスのグレインプロセッシングコーポレーシ
ョン）から、又は標準の手順によって生育される大ＩＩ
Ｉ菌の一般的な菌株の幾つかのものの任意のものから（
ビギエット ブイ、及びコンシー アール、アール、［
１９７？］ Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５２゜
２３６７−２３７２）のいずれかから精製した。蛋白質
はイオン交換及び分子ふるいカラム上でのクロマトグラ
フィを含む標準の手順を用いて精製した（ウィリアムス
シー、エッチ９、ザネッティ ジー０、アルスコツト
エル、ディー、及びマッファリスター ジエー、ケー
、［＋９８７］ Ｊ、 Ｒｉｏｔ、 Ｃｈｅｍ、 ２
４２゜５２２６−５２３１ ；マックエボイ エム３、
ランフ シー１、ルン シー、ニー、及びビジット ブ
イ、 ［１９８＋１ Ｊ。
Ｎミネアポリスのグレインプロセッシングコーポレーシ
ョン）から、又は標準の手順によって生育される大ＩＩ
Ｉ菌の一般的な菌株の幾つかのものの任意のものから（
ビギエット ブイ、及びコンシー アール、アール、［
１９７？］ Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５２゜
２３６７−２３７２）のいずれかから精製した。蛋白質
はイオン交換及び分子ふるいカラム上でのクロマトグラ
フィを含む標準の手順を用いて精製した（ウィリアムス
シー、エッチ９、ザネッティ ジー０、アルスコツト
エル、ディー、及びマッファリスター ジエー、ケー
、［＋９８７］ Ｊ、 Ｒｉｏｔ、 Ｃｈｅｍ、 ２
４２゜５２２６−５２３１ ；マックエボイ エム３、
ランフ シー１、ルン シー、ニー、及びビジット ブ
イ、 ［１９８＋１ Ｊ。
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 ２５６．６６４６−６６５０
）。
）。
チオレドキシン蛋白質を上記マツクエンボイ等によって
記載されるような定量的ロケットイミュノＭ気泳動を用
いて免疫的に検定した。
記載されるような定量的ロケットイミュノＭ気泳動を用
いて免疫的に検定した。
１ボ し −ゼ ゛
天然のりボヌクレアーゼの酵素濃度を２７７．５ｎｍに
於て測定した吸光度９８００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて測
定した（ハングトン アール、アール１、ハメス ジー
。
於て測定した吸光度９８００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて測
定した（ハングトン アール、アール１、ハメス ジー
。
ジー、及びシュシーラーカ エッチ、ニー、 ［１９７
４］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３： ３４２１−３
４３１） ａ完全に還元した酵素の濃度は９２００Ｍ−
ｌ ｃｍ−１の吸光係数を用いて２７５ｎｍに於て測定
した（アンフィンセン シー、ビー１、ハーバ−イー８
、セラ エム、及びホワイト エフ。
４］Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３： ３４２１−３
４３１） ａ完全に還元した酵素の濃度は９２００Ｍ−
ｌ ｃｍ−１の吸光係数を用いて２７５ｎｍに於て測定
した（アンフィンセン シー、ビー１、ハーバ−イー８
、セラ エム、及びホワイト エフ。
エッチ、 ｊｒ、［１９６１］ Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
４７： １３０９−１３１５）。
Ｒ１１ａｓｅの活性はタックらの手順にしたがって測定
した（クック イー、エム１、マシアス ニー、ビー、
及びラビン ビー、アール、［１９６０コ３ｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｊ。
した（クック イー、エム１、マシアス ニー、ビー、
及びラビン ビー、アール、［１９６０コ３ｉｏｃｈｅ
ｍ、 Ｊ。
７４： ２３４−２３８）。最終的な検定混合物はＯ，
１ＭのＭＯＰＳ、 ｐＨ７，０，７ｍＭのシチジン−２
’ ：３’−環状モノホスフェート及び１０〜３０７１
ｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡからなっていた。２９１ ｎ
ｍにおけるシチジン−２’：３’−環状モノホスフェー
トの２５℃における加水分解での吸光係数の増加をモニ
ターした。
１ＭのＭＯＰＳ、 ｐＨ７，０，７ｍＭのシチジン−２
’ ：３’−環状モノホスフェート及び１０〜３０７１
ｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡからなっていた。２９１ ｎ
ｍにおけるシチジン−２’：３’−環状モノホスフェー
トの２５℃における加水分解での吸光係数の増加をモニ
ターした。
以下は最良の態様を含む本発明の詳細な説明する実施例
である。これらの実施例は制限するものとは解釈されな
い。全ての溶媒混合物比率は他に記載がなければ容量に
よる。
である。これらの実施例は制限するものとは解釈されな
い。全ての溶媒混合物比率は他に記載がなければ容量に
よる。
実施例１ 変性化及び再折り畳み
ＲＮａｓｅの還元及び変性をＯ，１５ＭのＤＴＴ及び６
ＭのグアニジンＩＣ＋を含有する１、５ｍｌの０．１Ｍ
）リス／ＩＩｃＩ中の天然のままの酵素３０ ｍｇ−夜
培養によって実施した。還元したＲＮａｓｅを過剰のＤ
ＴＴ及びグアニジンＨＣＩから、１ｃｍ ｘ ２４ ｃ
ｍセファデックスＧ２５スーパーファインカラムを用い
０．０１ Ｎの１１αで平衡化させ、展開させたカラム
クロマトグラフィによって分離したくルドルフ アール
、及びファックスアイ、［＋９８３］ Ｈｏｐｐｅ−５
ｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ。
ＭのグアニジンＩＣ＋を含有する１、５ｍｌの０．１Ｍ
）リス／ＩＩｃＩ中の天然のままの酵素３０ ｍｇ−夜
培養によって実施した。還元したＲＮａｓｅを過剰のＤ
ＴＴ及びグアニジンＨＣＩから、１ｃｍ ｘ ２４ ｃ
ｍセファデックスＧ２５スーパーファインカラムを用い
０．０１ Ｎの１１αで平衡化させ、展開させたカラム
クロマトグラフィによって分離したくルドルフ アール
、及びファックスアイ、［＋９８３］ Ｈｏｐｐｅ−５
ｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ。
３６４、８１３−８２０）。０．３ｍｌのフラクション
を集め、２８０ｎｍに於ける吸光係数をモニターした。
を集め、２８０ｎｍに於ける吸光係数をモニターした。
ＲＮａｓｅ Ａを含有しているフラクションを集め濃度
を測定し、物質を一２０°Ｃに冷凍したアルゴン下で貯
蔵した。
を測定し、物質を一２０°Ｃに冷凍したアルゴン下で貯
蔵した。
ＲＮａｓｅ Ａの再酸化を還元した酵素を０．１ Ｍ）
リス、ｐＨ７，４中で、種々の量のチオレドキシン及び
／又は酸化されたＤＴＴを含有しているＩｍＨのＥＤＴ
Ａで希釈することによって開始した。種々の時間点で一
部分を検定し、再折り畳みの割合を計算した。結果は以
下の通りである。
リス、ｐＨ７，４中で、種々の量のチオレドキシン及び
／又は酸化されたＤＴＴを含有しているＩｍＨのＥＤＴ
Ａで希釈することによって開始した。種々の時間点で一
部分を検定し、再折り畳みの割合を計算した。結果は以
下の通りである。
チオレドキシン、酸化されたＤＴＴ及び両方の混合物は
ＲＮａｓｅの再折り畳みの速度を、空気酸化と比べて増
加させた。ＲＮａｓｅ（３５０μｇ／ｍｌ）の５０χ再
活性１ヒを得るのに要する時間（Ｔ ｌ／２）は空気酸
化と比較しておよそ１５倍減少した。２０μ閂チオレド
キシンに対する５５時間、５０μ旧こ対する ４５時間
、１００μ旧こ対する３５時間及び５００μ旧こ対する
８時間と比較して空気酸化のＴ ｌ／２は１２０時間で
あった。
ＲＮａｓｅの再折り畳みの速度を、空気酸化と比べて増
加させた。ＲＮａｓｅ（３５０μｇ／ｍｌ）の５０χ再
活性１ヒを得るのに要する時間（Ｔ ｌ／２）は空気酸
化と比較しておよそ１５倍減少した。２０μ閂チオレド
キシンに対する５５時間、５０μ旧こ対する ４５時間
、１００μ旧こ対する３５時間及び５００μ旧こ対する
８時間と比較して空気酸化のＴ ｌ／２は１２０時間で
あった。
チオレドキシンを用いると１０ｏｚのＲＮａｓｅ活性が
３０〜９０時間後に回復したが、空気酸化は少なくとも
２００時間を要した。
３０〜９０時間後に回復したが、空気酸化は少なくとも
２００時間を要した。
チオレドキシンのより低い濃度に於てＲＮａｓｅの再活
性化に於ける１０〜２０時間の間の遅れがあった。
性化に於ける１０〜２０時間の間の遅れがあった。
この遅れは酸化されたＤＴＴ存在下では観測されなかっ
た。もっともらしい説明はＤＴＴがある種の初期の反応
速度論段階においてより効果的であって多分ジスルフィ
ドの酸化はずっとより大きいチオレドキシン分子に対し
接近不可能であるということである。
た。もっともらしい説明はＤＴＴがある種の初期の反応
速度論段階においてより効果的であって多分ジスルフィ
ドの酸化はずっとより大きいチオレドキシン分子に対し
接近不可能であるということである。
酸化されたＤＴＴをオキシダントとして使用したとき、
同様の結果が得られた。２０ ｍＭ ＤＴＴに対するＴ
ｌ／２は７０時間である一方５０μＭのＤＴＴに対し
てはこれは４０時間、そして１００μＭのものに対して
は３０時間であった。この値は２０．５０及び１００μ
Ｍの濃度におけるチオレドキシンのものに匹敵する。チ
オレドキシンは従って酸化されたＤＴＴよりも＋０００
倍より効果的である。８０ｍＭより大きな濃度において
酸化されたＤＴＴを使用しても再折り畳みの速度におけ
る増加は観測されなかった。これらの濃度に於て酸化さ
れたＤＴＴは非常には可溶性ではなく、反応混合物は飽
和されているかもしれない。
同様の結果が得られた。２０ ｍＭ ＤＴＴに対するＴ
ｌ／２は７０時間である一方５０μＭのＤＴＴに対し
てはこれは４０時間、そして１００μＭのものに対して
は３０時間であった。この値は２０．５０及び１００μ
Ｍの濃度におけるチオレドキシンのものに匹敵する。チ
オレドキシンは従って酸化されたＤＴＴよりも＋０００
倍より効果的である。８０ｍＭより大きな濃度において
酸化されたＤＴＴを使用しても再折り畳みの速度におけ
る増加は観測されなかった。これらの濃度に於て酸化さ
れたＤＴＴは非常には可溶性ではなく、反応混合物は飽
和されているかもしれない。
チオレドキシン及び酸化されたＤＴＴの混合物は何れか
の成分よりもより効果的で、遅れた相は観測されない。
の成分よりもより効果的で、遅れた相は観測されない。
２０ＩＩＭのチオレドキシン濃度におい １７
Ｔ＋、２Ｃ，ｔ２０゜、。。。、。８イ、。工１．１４
□。１．。４、 ｉい。
Ｔ＋、２Ｃ，ｔ２０゜、。。。、。８イ、。工１．１４
□。１．。４、 ｉい。
まとめると、低い濃度（即ち２０μＭ）に於てチオレド
キシンはＤＴＴよりもより効果的である。両方の混合物
は何れかの成分屯独よりもより効果的である。チオレド
キシンの全ての濃度においてＴＩ／２は２０ｍＭの酸化
されたＤＴＴの添加で平均１０時間だＣｊ減少する。こ
のこのはＤＴＴ及びチオレドキシンがことなるジスルフ
ィドの酸化に影響を与えているかもしれないことを示唆
する。ＤＴＴ又はチオレドキシンの何れかの濃度が増加
するにつれ、試料の間の差異は無くなる。
キシンはＤＴＴよりもより効果的である。両方の混合物
は何れかの成分屯独よりもより効果的である。チオレド
キシンの全ての濃度においてＴＩ／２は２０ｍＭの酸化
されたＤＴＴの添加で平均１０時間だＣｊ減少する。こ
のこのはＤＴＴ及びチオレドキシンがことなるジスルフ
ィドの酸化に影響を与えているかもしれないことを示唆
する。ＤＴＴ又はチオレドキシンの何れかの濃度が増加
するにつれ、試料の間の差異は無くなる。
実施例２ ＲＮａｓｅを再折り畳みするためのチオ
レドキシン及び酸素の使用 ＲＮａｓｅのリナチュシーション（変性したものを元に
戻すこと）は０．１ Ｍ）リス、ｐＨ７゜５中の還元さ
れた酵素を］ ｍＭ ＥＤＴＡで最終濃度３４０μｇ／
ｍｌに希釈することによって開始される。酸化されたチ
オレドキシン（１００μＭ）を試料の半分に加えた。全
ての試料は室温に於て常に攪拌し、酸素の連続的な流れ
を試料の上に走らせた。対照試料は空気に暴露させた。
レドキシン及び酸素の使用 ＲＮａｓｅのリナチュシーション（変性したものを元に
戻すこと）は０．１ Ｍ）リス、ｐＨ７゜５中の還元さ
れた酵素を］ ｍＭ ＥＤＴＡで最終濃度３４０μｇ／
ｍｌに希釈することによって開始される。酸化されたチ
オレドキシン（１００μＭ）を試料の半分に加えた。全
ての試料は室温に於て常に攪拌し、酸素の連続的な流れ
を試料の上に走らせた。対照試料は空気に暴露させた。
種々の時間に於て一部分を除きＲＮａｓｅ活性に対し検
定し、再活性化の％を計算した。
定し、再活性化の％を計算した。
１００１１Ｍチオレドキシンの存在下に於けるＲＮａｓ
ｅの５０γ再活性化に要求されろ時間（Ｔ Ｉ／２）は
酸素の添加によって３倍減少した。］ＯＯノＪ、Ｍチオ
レドキシン及び空気に対するＴ１／２は２３時間であっ
た。
ｅの５０γ再活性化に要求されろ時間（Ｔ Ｉ／２）は
酸素の添加によって３倍減少した。］ＯＯノＪ、Ｍチオ
レドキシン及び空気に対するＴ１／２は２３時間であっ
た。
酸素の添加がある場合にはＴ１７２は８時間に低められ
た。これは空気の存在下の５００μＭのチオレドキシン
のＴ Ｉ／２に匹敵する。チオレドキシンの有効濃度は
酸素の添加により５倍だけ減少し得る。酸素効果はチオ
レドキシン非存在下に於ては起こらない。チオレドキシ
ンなしの再折り畳み速度の増加に於て初期増加があるが
回復した活性は５時間後に１２七こ於て平となる。
た。これは空気の存在下の５００μＭのチオレドキシン
のＴ Ｉ／２に匹敵する。チオレドキシンの有効濃度は
酸素の添加により５倍だけ減少し得る。酸素効果はチオ
レドキシン非存在下に於ては起こらない。チオレドキシ
ンなしの再折り畳み速度の増加に於て初期増加があるが
回復した活性は５時間後に１２七こ於て平となる。
実施例３ ＲＮａｓｅを再折り畳みするためのチオ
レドキシン及びチオレドキシンレダクターゼの使用 チオレドキシンレダクターゼはｌＭＣ０（ス工−デンの
ストックホルム）から得るか、又はビジエツト及びコン
シーの手順（ビジエツト ブイ、及びコンシー アール
、アール、［１９７７コＪ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−２
５２、６３６７−６３７２）に従って単離した。ＮＡＤ
Ｐ電よシグマ（ミズリー州セントルイス）から得た。
レドキシン及びチオレドキシンレダクターゼの使用 チオレドキシンレダクターゼはｌＭＣ０（ス工−デンの
ストックホルム）から得るか、又はビジエツト及びコン
シーの手順（ビジエツト ブイ、及びコンシー アール
、アール、［１９７７コＪ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ−２
５２、６３６７−６３７２）に従って単離した。ＮＡＤ
Ｐ電よシグマ（ミズリー州セントルイス）から得た。
ＲＮａｓｅの再折り畳みは各々ＩｍＭのＥ［１ｌＴＡを
含有している０、１Ｍ）リス、ｐＨ７，５又は０．０５
Ｍ）リス、ｐＨり、−０中の変性リボヌクレアーゼを
希釈することによって開始した。再生系は触媒量のチオ
レドキシンレダクターゼ及び過剰く１〜１０ｍＭ）のＮ
ＡＤＰ”からなっていた。チオレドキシン濃度は１１０
０ｐ＋こ於て一定のままであった。一部分を種々の時間
において除いてＲＮａｓｅ活性について検定した。
含有している０、１Ｍ）リス、ｐＨ７，５又は０．０５
Ｍ）リス、ｐＨり、−０中の変性リボヌクレアーゼを
希釈することによって開始した。再生系は触媒量のチオ
レドキシンレダクターゼ及び過剰く１〜１０ｍＭ）のＮ
ＡＤＰ”からなっていた。チオレドキシン濃度は１１０
０ｐ＋こ於て一定のままであった。一部分を種々の時間
において除いてＲＮａｓｅ活性について検定した。
上記のチオレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤＰ＋の再
生系の存在下では１００μＭチオレドキシンではＲＮａ
ｓｅの再折り畳み速度の増加があった。チオレドキシン
レダクターゼ、及び０．１若しくは０．１ｍＭの何れか
のＮＡＤＰ十の場合においては７１７２は２３時間から
５〜６時間に減少した。
生系の存在下では１００μＭチオレドキシンではＲＮａ
ｓｅの再折り畳み速度の増加があった。チオレドキシン
レダクターゼ、及び０．１若しくは０．１ｍＭの何れか
のＮＡＤＰ十の場合においては７１７２は２３時間から
５〜６時間に減少した。
造
大腸菌チオレドキシン試料を水中で１２時間４°Ｃで透
析した。５ｍｌを乾燥し、７０χ蟻酸中に再！ｔ！！：
濁した。シアノゲンブロマイド（シグマケミカル）を７
０１蟻酸中に溶解し、５０倍モル過剰のメチオニン中の
チオレドキシンに加えた。溶液を窒素でパージし、室温
において暗所で２４時間培養した。開裂反応の完了に於
て漕法を窒素下で乾燥し、酢酸ナトリウム緩衝）α中で
再懸濁し、ｐ Ｈ８、５に水酸化アンモニウムで調整し
た。
析した。５ｍｌを乾燥し、７０χ蟻酸中に再！ｔ！！：
濁した。シアノゲンブロマイド（シグマケミカル）を７
０１蟻酸中に溶解し、５０倍モル過剰のメチオニン中の
チオレドキシンに加えた。溶液を窒素でパージし、室温
において暗所で２４時間培養した。開裂反応の完了に於
て漕法を窒素下で乾燥し、酢酸ナトリウム緩衝）α中で
再懸濁し、ｐ Ｈ８、５に水酸化アンモニウムで調整し
た。
試料をベックマンモデル４２１装置（カリホルニア州フ
ラートンのベックマンインストラメンツインコーボレー
テッドの商標）に取り付けられたウォーター１８ｍボン
ダパックＣ−１８カラム（マサチューセッツミルホード
のウォータースアソシェーツインコーボシーテッ）・の
商標）上に装填し、２１４μｍでモニターした。用いた
溶媒系は０．１！）リフルオロ酢酸（緩衝液Ａ）及びア
セトニトリル中の０．０８％ ）リフルオロ酢酸（緩衝
液Ｂ）であった。
ラートンのベックマンインストラメンツインコーボレー
テッドの商標）に取り付けられたウォーター１８ｍボン
ダパックＣ−１８カラム（マサチューセッツミルホード
のウォータースアソシェーツインコーボシーテッ）・の
商標）上に装填し、２１４μｍでモニターした。用いた
溶媒系は０．１！）リフルオロ酢酸（緩衝液Ａ）及びア
セトニトリル中の０．０８％ ）リフルオロ酢酸（緩衝
液Ｂ）であった。
Ｏｚ〜６ｏｚのＢの勾配物を３分間使用して２ｍ１／分
の流速においてペプチドを分離した。
の流速においてペプチドを分離した。
チオレドキシンはＣＮＢｒによって二つの断片、Ｔ１−
３７及びＴ ３８１０８に開裂し４４％及び５１％の緩
衝液Ｂで夫々溶離した。アミノ酸分析は両方のペプチド
の組成を同定し確認した（ホルムグレンニー。
３７及びＴ ３８１０８に開裂し４４％及び５１％の緩
衝液Ｂで夫々溶離した。アミノ酸分析は両方のペプチド
の組成を同定し確認した（ホルムグレンニー。
及びレイチャード ビー、［１９６７］ Ｅｕｒ、 Ｊ
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
、 Ｂｉｏｃｈｅｍ。
２、１８７−１９６）。Ｔ ｌ−３７は酵素の活性位置
を含んでいた。回収した二つのペプチドは出発物質の６
９χに当るものであった。未反応のチオレドキシンは損
失１２〜１５％に当り、）ＩＰＬｃ分離の為に追加的な
損失が生じた。
を含んでいた。回収した二つのペプチドは出発物質の６
９χに当るものであった。未反応のチオレドキシンは損
失１２〜１５％に当り、）ＩＰＬｃ分離の為に追加的な
損失が生じた。
（ｂ）トリプシン開裂によるＴ ｌ９−３８の製造上記
の）ＩＰＬｃ分離の後、Ｔ ｌ−３７を集め、乾燥し、
酢酸ナトリウム緩衝液中に懸濁し、ＮＨ４ＯＨてｐ １
１８ 、０に調整した。トリプシン（シグマケミカル）
の一部分をペプチド濃度１％（讐／−）に於ける培養に
加えた。反応混合物を３７℃で１時間培養した。トリプ
シン断片の分離はシアノゲンブロマイド断片についての
ようにＨＰＬＣで行った。
の）ＩＰＬｃ分離の後、Ｔ ｌ−３７を集め、乾燥し、
酢酸ナトリウム緩衝液中に懸濁し、ＮＨ４ＯＨてｐ １
１８ 、０に調整した。トリプシン（シグマケミカル）
の一部分をペプチド濃度１％（讐／−）に於ける培養に
加えた。反応混合物を３７℃で１時間培養した。トリプ
シン断片の分離はシアノゲンブロマイド断片についての
ようにＨＰＬＣで行った。
Ｔ Ｉ−３’ｆペプチドのトリプシン消化は二つのペプ
チド、即ちＴ ４−１８及びＴ ｌ９−３６を生成し、
これらは夫々ｍ上液８３１！及び４５ｚで溶離して、Ｈ
ＰＬＣによって分割された。アミノ酸分析は３ＨのＢに
於て溶離する種が１５のアミノ酸を含み、活性位置のペ
プチドであるＴ ｌ９−３６に対応することを明らかに
した。９０ｎモルのＴ ＋−３ｖの培養はＩＩＰＬＣに
よる分離の後８０ｎモルのＴ ｌ９−３８を生成し、収
率が８８％であった・ 実施例５ 実施例１．２及び３のチオレドキシンを実施例４で得た
チオレドキシン断片Ｔ ｌ−３７又はＴ ｌ９−３８と
置き換えることによって、本質的に同じ結果が得られた
。
チド、即ちＴ ４−１８及びＴ ｌ９−３６を生成し、
これらは夫々ｍ上液８３１！及び４５ｚで溶離して、Ｈ
ＰＬＣによって分割された。アミノ酸分析は３ＨのＢに
於て溶離する種が１５のアミノ酸を含み、活性位置のペ
プチドであるＴ ｌ９−３６に対応することを明らかに
した。９０ｎモルのＴ ＋−３ｖの培養はＩＩＰＬＣに
よる分離の後８０ｎモルのＴ ｌ９−３８を生成し、収
率が８８％であった・ 実施例５ 実施例１．２及び３のチオレドキシンを実施例４で得た
チオレドキシン断片Ｔ ｌ−３７又はＴ ｌ９−３８と
置き換えることによって、本質的に同じ結果が得られた
。
実施例６
米国特許４，４２１，６８５の実施例に於けるＤＴＴ又
はＯＴεの代りに、酸化されたチオレドキシン又は酸化
されたチオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン
様のジチオールペプチドを単独で又は酸素又はチオレド
キシンレダクターゼ再生系と組合わせたものと置き換え
ると所望のインシュリンの収率の改良が得られた。
はＯＴεの代りに、酸化されたチオレドキシン又は酸化
されたチオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン
様のジチオールペプチドを単独で又は酸素又はチオレド
キシンレダクターゼ再生系と組合わせたものと置き換え
ると所望のインシュリンの収率の改良が得られた。
実施例７
実施例１．２．３、又は５の牛すい臓リボヌクレアーゼ
を任意のジスルフィド蛋白質又はＳ−スルホン化ジスル
フィド蛋白質と置き換えることによって匹敵する有益な
蛋白質折り畳み結果が得られた。
を任意のジスルフィド蛋白質又はＳ−スルホン化ジスル
フィド蛋白質と置き換えることによって匹敵する有益な
蛋白質折り畳み結果が得られた。
実施例日
ジスルフィド架橋が還元されている折り畳まれていない
蛋白質を蛋白質折り畳み有効量の酸化されたチオレドキ
シン又は酸化されたチオレドキシンに由来するか又はチ
オレドキシン様のジチオールペプチド及びジチオスレイ
トール及びジチオエリスリトールからなる群から選ばれ
るチオール還元剤からなる混合物と反応させると上記蛋
白質の強められた折り畳みが得られた。
蛋白質を蛋白質折り畳み有効量の酸化されたチオレドキ
シン又は酸化されたチオレドキシンに由来するか又はチ
オレドキシン様のジチオールペプチド及びジチオスレイ
トール及びジチオエリスリトールからなる群から選ばれ
るチオール還元剤からなる混合物と反応させると上記蛋
白質の強められた折り畳みが得られた。
実施例９
折り畳まれていないＳ−スルホン化ジスルフィド蛋白質
を蛋白質折り畳み有効量の還元されたチオレドキシン又
は還元されたチオレドキシンに由来するか又はチオレド
キシン様のジチオールペプチド及びチオール還元剤、例
えばジチオスレイトール又はジチオエリスリトールから
なる混合物と反応させると上記蛋白質の強められた折り
畳みが得られた。
を蛋白質折り畳み有効量の還元されたチオレドキシン又
は還元されたチオレドキシンに由来するか又はチオレド
キシン様のジチオールペプチド及びチオール還元剤、例
えばジチオスレイトール又はジチオエリスリトールから
なる混合物と反応させると上記蛋白質の強められた折り
畳みが得られた。
スクランブル化されたＲＮａｓｅを上記のように単離し
た還元されたそして変性されたＲＮａｓｅの変性条件下
での酸化によって造りだした。セファデックスＧ−２５
カラムからのプールしたフラクションをグアニジンＨＣ
Ｉ中で６Ｍとし、ｐ）Ｉを固体トリスで８．６に調整し
た。つぎに酸素を数分間泡立てて通し、試料を室温で３
〜４日間光から保護して培養した。エルマン（エルマン
ジー、エル、［１９５９］ Ａｒｃｈ。
た還元されたそして変性されたＲＮａｓｅの変性条件下
での酸化によって造りだした。セファデックスＧ−２５
カラムからのプールしたフラクションをグアニジンＨＣ
Ｉ中で６Ｍとし、ｐ）Ｉを固体トリスで８．６に調整し
た。つぎに酸素を数分間泡立てて通し、試料を室温で３
〜４日間光から保護して培養した。エルマン（エルマン
ジー、エル、［１９５９］ Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ８２：Ｔｏ−７
７）の方法によって測定される有利チオールの量は、Ｒ
Ｎａｓｅモル当り０．０５モル未満であった。活性は約
５χで、再折り畳みされたＲＮａｓｅの殆どが不正確で
不活性な形態であることを示している。
７）の方法によって測定される有利チオールの量は、Ｒ
Ｎａｓｅモル当り０．０５モル未満であった。活性は約
５χで、再折り畳みされたＲＮａｓｅの殆どが不正確で
不活性な形態であることを示している。
スクランブル化されたＲＮａｓｅの再活性化を不活性Ｒ
Ｎａｓｅを０．１Ｍ）リス、１ｌＨ７，４中に於て、添
加前に３０分間還元されたＤＴＴて予備培養された種々
の量の酸化されたチオレドキシンを含有している１ｍＭ
ＥＤＴＡて希釈することによって開始した。種々の時間
点において小部分を検定し、再活性化の％を前に記載し
たように天然（ｎａｔｉｖｅ）なＲＮａｓｅての特異活
性の比較によって計算した。
Ｎａｓｅを０．１Ｍ）リス、１ｌＨ７，４中に於て、添
加前に３０分間還元されたＤＴＴて予備培養された種々
の量の酸化されたチオレドキシンを含有している１ｍＭ
ＥＤＴＡて希釈することによって開始した。種々の時間
点において小部分を検定し、再活性化の％を前に記載し
たように天然（ｎａｔｉｖｅ）なＲＮａｓｅての特異活
性の比較によって計算した。
チオレドキシンは効果的にスクランブル化された活性Ｒ
Ｎａｓｅ中のジスルフィド結合の再配列化をｐ Ｉ＋
７ 、４に於て触媒し、活性酵素の定員的な回復を生し
る。酸化されたチオレドキシンを還元されたＤＴＴで予
備還元することは、この酸化された基質を用いる再活性
化を刺激するのに要求された。
Ｎａｓｅ中のジスルフィド結合の再配列化をｐ Ｉ＋
７ 、４に於て触媒し、活性酵素の定員的な回復を生し
る。酸化されたチオレドキシンを還元されたＤＴＴで予
備還元することは、この酸化された基質を用いる再活性
化を刺激するのに要求された。
１００μＭチオレドキシンに於てＤＴＴの最適水準は１
０μ閂であった。より高い水準の［ｌＴＴは恐らく蛋白
チオールジスルフィドバランスを還元形にシフトさせる
ことによって再活性化を抑制した。還元されたＤＴＴに
対する酸化されたチオレドキシンの最適はＩＯ：Ｉてあ
った。この比率が一定のままであるとき、そしてチオレ
ドキシン濃度が増加されるとき、再活性化の速度の増加
が観られた。１５０μ台及び２００μＭチオレドキシン
に対するＴ＋／２の時間は夫々２時間及び１５時間であ
って、１００μ−に対する５時間と対比される。１１０
０７ｚチオレドキシン及び１０μＭ ＤＴＴを用いるＴ
１７２は五時間であり、還元されたＲＮａｓｅの再折
り畳みにおけるチオレドキシンを使用する２７時間と対
比される。１０μＭの濃度における還元されたチオレド
キシンはスクランブル化されたＲＮａｓｅ中のジスルフ
ィド結合の再配列を触媒するのにも効果的で、ＴＩ／２
が８時間である。
０μ閂であった。より高い水準の［ｌＴＴは恐らく蛋白
チオールジスルフィドバランスを還元形にシフトさせる
ことによって再活性化を抑制した。還元されたＤＴＴに
対する酸化されたチオレドキシンの最適はＩＯ：Ｉてあ
った。この比率が一定のままであるとき、そしてチオレ
ドキシン濃度が増加されるとき、再活性化の速度の増加
が観られた。１５０μ台及び２００μＭチオレドキシン
に対するＴ＋／２の時間は夫々２時間及び１５時間であ
って、１００μ−に対する５時間と対比される。１１０
０７ｚチオレドキシン及び１０μＭ ＤＴＴを用いるＴ
１７２は五時間であり、還元されたＲＮａｓｅの再折
り畳みにおけるチオレドキシンを使用する２７時間と対
比される。１０μＭの濃度における還元されたチオレド
キシンはスクランブル化されたＲＮａｓｅ中のジスルフ
ィド結合の再配列を触媒するのにも効果的で、ＴＩ／２
が８時間である。
空気又はＤＴＴ単独の何れもこの再活性化反応に効果的
でなく、同じ時間に於けるチオレドキシンでの再活性化
７５％と比較して１０時間後に空気で１５％活性にすぎ
ず、ＤＴＴで３０χ活性にしかすぎなかった。
でなく、同じ時間に於けるチオレドキシンでの再活性化
７５％と比較して１０時間後に空気で１５％活性にすぎ
ず、ＤＴＴで３０χ活性にしかすぎなかった。
還元されたチオレドキシン又は還元されたチオレドキシ
ンに由来するか又はチオレドキシン様のジチオールペプ
チドの効果的な蛋白折り畳み量は約５〜２０μＭである
。また還元された、そして酸化されたチオレドキシンの
効果的な蛋白質折り畳み有効量は有利には還元された形
態の酸化された形態に対する比率約１＝１〜約１：２０
に於て保持される。
ンに由来するか又はチオレドキシン様のジチオールペプ
チドの効果的な蛋白折り畳み量は約５〜２０μＭである
。また還元された、そして酸化されたチオレドキシンの
効果的な蛋白質折り畳み有効量は有利には還元された形
態の酸化された形態に対する比率約１＝１〜約１：２０
に於て保持される。
還元されたチオレドキシンは酸化されたチオレドキシン
及びＤＴＴを折り畳み混合物中に於て上記のように予備
培養することによって形成される。
及びＤＴＴを折り畳み混合物中に於て上記のように予備
培養することによって形成される。
チオレドキシンはｐＨ８，０においてスルボン化された
ＲＮａｓｅの再折り畳みを効果的に触媒し、活性ＲＮａ
ｓｅの定量的な回復を生じる。スルボン化されたＲＮａ
ｓｅはサンハウザー及びシュラーガ−（サンバウザティ
ー、ダブり二一、及びシュラーガー エッチ・ニー・［
１９８５］ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４： ７６
８１−７６８８）の方法によって製造された。還元され
たチオレドキシンが要求され、最適条件はチオレドキシ
ンの蛋白質チオスルホネート類に対するｌ：１のモル比
てあった（チオレドキシンのＲＮａｓｅに対する８：１
のモル比）。この比率り月：２のチオレドキシン対蛋白
質チオスルホネートに減少されたとき、再活性化の速度
及びＲＮａｓｅ活性の最終収率の両方が減少した。１：
ｌの比率に於てはＴ Ｉ７２ （活性の５ｏｚ回復に要
求される時間）は３．５時間でＲＮａＳｅの最終収率は
１００＄であった。チオレドキシンが二倍減少されたと
きにはＴ Ｉ／２は８時間増加し、ＲＮａｓｅ活性の増
加は僅か６５Ｘてあった。１：２０のチオレドキシン対
蛋白質チオスルホネートの比率においては、対照より以
上の再活性化が観測されなかった。
ＲＮａｓｅの再折り畳みを効果的に触媒し、活性ＲＮａ
ｓｅの定量的な回復を生じる。スルボン化されたＲＮａ
ｓｅはサンハウザー及びシュラーガ−（サンバウザティ
ー、ダブり二一、及びシュラーガー エッチ・ニー・［
１９８５］ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４： ７６
８１−７６８８）の方法によって製造された。還元され
たチオレドキシンが要求され、最適条件はチオレドキシ
ンの蛋白質チオスルホネート類に対するｌ：１のモル比
てあった（チオレドキシンのＲＮａｓｅに対する８：１
のモル比）。この比率り月：２のチオレドキシン対蛋白
質チオスルホネートに減少されたとき、再活性化の速度
及びＲＮａｓｅ活性の最終収率の両方が減少した。１：
ｌの比率に於てはＴ Ｉ７２ （活性の５ｏｚ回復に要
求される時間）は３．５時間でＲＮａＳｅの最終収率は
１００＄であった。チオレドキシンが二倍減少されたと
きにはＴ Ｉ／２は８時間増加し、ＲＮａｓｅ活性の増
加は僅か６５Ｘてあった。１：２０のチオレドキシン対
蛋白質チオスルホネートの比率においては、対照より以
上の再活性化が観測されなかった。
実施例１２
実施例１１のチオレドキシンを実施例４て得たチオレド
キシン断片Ｔ ｌ−３７又はＴ １９−３６又は他のチ
オレドキシンに由来するが又はチオレドキシン様のジチ
オールペプチドの還元形のものと賀き換えることによっ
て、本質的に同し結果が得られる。
キシン断片Ｔ ｌ−３７又はＴ １９−３６又は他のチ
オレドキシンに由来するが又はチオレドキシン様のジチ
オールペプチドの還元形のものと賀き換えることによっ
て、本質的に同し結果が得られる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、還元されていたジスルフィド架橋を含有する折り畳
まれていない蛋白質を折り畳むインビトロの方法であっ
て、上記折り畳まれていない還元された蛋白質を蛋白質
折り畳み有効量の酸化されたチオレドキシン又は酸化さ
れたチオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン様
のジチオールペプチドの単独又はこれと酸素又はチオレ
ドキシンレダクターゼ再生系との組合わせと反応させる
ことからなる方法。 ２、酸化されたチオレドキシン又は酸化されたチオレド
キシンに由来するか又はチオレドキシン様のチオールペ
プチドの上記蛋白質折り畳み有効量が約５μＭ〜約５０
０μＭである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、上記ジスルフィド架橋含有蛋白質がインシュリン、
プロインシュリン、牛すい臓リボヌクレアーゼ（ＲＮａ
ｓｅ）、リゾチーム、牛すい臓トリプシンインヒビター
、インターフェロン、レンニン、プラスミノゲンアクチ
ベーター、プロラクチン、人α−１−トリプシンインヒ
ビター及びファクターVIIIからなる群から選ばれる特許
請求の範囲第１項に記載の方法。 ４、上記蛋白質含有ジスルフィド架橋がＳ−スルホン化
形態であって、チオレドキシン又はチオレドキシンに由
来するか、又はチオレドキシン様のジチオールペプチド
が還元形である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、上記ジスルフィド架橋を含有する蛋白質がインシュ
リン又はプロインシュリンである特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 ６、上記チオレドキシンに由来するジチオールペプチド
が大腸菌チオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂に
よって製造される１〜３７の残基を含有する断片である
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７、上記チオレドキシンに由来するジチオールペプチド
が大腸菌チオレドキシンのシアノゲンブロマイドの開裂
によって製造される１〜３７の残基のトリプシン消化に
よって造られる１９〜３６の残基を含有する断片である
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ８、上記チオレドキシンレダクターゼ再生系がチオレド
キシンレダクターゼ及びニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド誘導体からなる特許請求の範囲第１項に記載の
方法。 ９、上記ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド誘導体
がＮＡＤＰ＾＋の酸化形である特許請求の範囲第８項に
記載の方法。 １０、上記チオレドキシンに由来するか又はチオレドキ
シン様のジチオールペプチドが、レドックス活性ペプチ
ド配列Ｃｙｓ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（ここでＸ及び
Ｙは２０個のアミノ酸の任意のものでありうる）を含む
特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １１、上記レドックス活性ペプチド配列がＣｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓである特許請求の範囲第１
０項に記載の方法。 １２、上記ジスルフィド架橋を含有する蛋白質が、粗細
胞抽出物中にあるか、粗細胞抽出物から部分的に精製さ
れる特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １３、上記細胞が組替え微生物である特許請求の範囲第
１２項に記載の方法。 １４、間違ったジスルフィド架橋を含有するスクランブ
ル化された蛋白質を再折り畳みするインビトロの方法で
あって、上記スクランブル化された蛋白質を蛋白質折り
畳み有効量の還元されたチオレドキシン又は還元された
チオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン様のジ
チオールペプチドの単独又はこれと酸化されたチオレド
キシン又は酸化されたチオレドキシンに由来するか又は
チオレドキシン様のジチオールペプチドとの組合わせと
反応させることからなる方法。 １５、還元されたチオレドキシン又は還元されたチオレ
ドキシンに由来するか、又はチオレドキシン様のジチオ
ールペプチドの上記蛋白質折り畳み有効量が約５μＭ〜
約２０μＭである特許請求の範囲第１４項に記載の方法
。 １６、還元された又は酸化されたチオレドキシンの上記
蛋白質折り畳み有効量が、還元された形態の酸化された
形態に対する比、約１：１〜約１：２０に保持されつ特
許請求の範囲第１４項に記載の方法。 １７、上記還元されたチオレドキシンが折り畳み混合物
中に於て酸化されたチオレドキシン及びＤＴＴ（ジチオ
スレイトール）を予備培養することによって形成される
特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 １８、上記ジスルフィド架橋を含有する蛋白質がインシ
ュリン又はプロインシュリンである特許請求の範囲第１
４項に記載の方法。 １９、上記チオレドキシンに由来するジチオールペプチ
ドが大腸菌チオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂
によって製造される１〜３７の残基を含有する断片であ
る特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 ２０、上記チオレドキシンに由来するジチオールペプチ
ドが大腸菌チオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂
によって製造される１〜３７の残基のトリプシン消化に
よって造られる１９〜３６の残基を含有する断片である
特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 ２１、上記チオレドキシに由来するか又はチオレドキシ
ン様のジチオールペプチドが、レドックス活性ペプチド
配列Ｃｙｓ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（ここでＸ及びＹ
は２０個のアミノ酸の任意のものでありうる）を含む特
許請求の範囲第１４項に記載の方法。 ２２、上記レドックス活性ペプチド配列がＣｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓである特許請求の範囲第２
１項に記載の方法。 ２３、上記ジスルフィド架橋を含有する蛋白質が、粗細
胞抽出物中か、粗細胞抽出物からの部分的な精製物中の
ものである特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 ２４、上記細胞が組替え微生物である特許請求の範囲第
２３項に記載の方法。 ２５、ジスルフィド架橋が還元されている折り畳まれて
いない蛋白質を折り畳むインビトロの方法において、上
記折り畳まれていない還元された蛋白質を蛋白質折り畳
み有効量の酸化されたチオレドキシン又は酸化されたチ
オレドキシンに由来するか又はチオレドキシン様のジチ
オールペプチド及びチオール酸化剤からなる混合物と反
応させることからなる方法。 ２６、上記チオール酸化剤が酸化されたジチオスレイト
ール又は酸化されたジチオエリスリトールである特許請
求の範囲第２５項に記載の方法。 ２７、酸化されたチオレドキシン又は酸化されたチオレ
ドキシンに由来するか、又はチオレドキシン様のジチオ
ールペプチドの上記蛋白質折り畳み有効量が約５μＭ〜
約５００μＭである特許請求の範囲第２５項に記載の方
法。 ２８、上記ジスルフィド架橋を含有する蛋白質がインシ
ュリン、プロインシュリン、牛すい臓リボヌクレアーゼ
（ＲＮａｓｅ）、リゾチーム、牛すい臓トリプシンイン
ヒビター、インターフェロン、レンニン、プラスミノゲ
ンアクチベーター、プロラクチン、人α−１トリプシン
インヒビター及びファクターVIIIからなる群から選ばれ
る特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ２９、ジスルフィド架橋を含有する上記蛋白質がＳ−ス
ルホン化形態であつて、チオレドキシン又はチオレドキ
シンに由来するか、又はチオレドキシン様のジチオール
ペプチドが還元形である特許請求の範囲第２５項に記載
の方法。 ３０、ジスルフィド架橋を含有する上記蛋白質がインシ
ュリン又はプロインシュリンである特許請求の範囲第２
５項に記載の方法。 ３１、上記チオレドキシンに由来するジチオールペプチ
ドが大腸菌チオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂
によって製造される１〜３７の残基を含有する断片であ
る特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ３２、上記チオレドキシンに由来するジチオールペプチ
ドが大腸菌チオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂
によって製造される１〜３７の残基のトリプシン消化に
よって造られる１９〜３６の残基を含有する断片である
特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ３３、上記チオレドキシに由来するか又はチオレドキシ
ン様のジチオールペプチドが、レドックス活性ペプチド
配列Ｃｙｓ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（ここでＸ及びＹ
は２０個のアミノ酸の任意のものでありうる）を含む特
許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ３４、上記レドックス活性ペプチド配列がＣｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓである特許請求の範囲第３
３項に記載の方法。 ３５、上記ジスルフィド架橋を含有する蛋白質が、粗細
胞抽出物中か、粗細胞抽出物からの部分的な精製物中の
ものである特許請求の範囲第２５項に記載の方法。 ３６、上記細胞が組替え微生物である特許請求の範囲第
３５項に記載の方法。 ３７、間違ったジスルフィド架橋を含有するスクランブ
ル化された蛋白質を再折り畳みするインビトロの方法で
あって、上記スクランブル化された蛋白質を、蛋白質折
り畳み有効量の還元されたチオレドキシン又は還元され
たチオレドキシンに由来するか又はチオレドキシン様の
ジチオールペプチド及びチオール酸化剤からなる混合物
と反応させることからなる方法。 ３８、上記チオール酸化剤が酸化されたジチオスレイト
ール又は酸化されたジチオエリスリトールである特許請
求の範囲第３７項に記載の方法。 ３９、還元されたチオレドキシン又は還元されたチオレ
ドキシンに由来するか、又はチオレドキシン様のジチオ
ールペプチドの上記蛋白質折り畳み有効量が約５μＭ〜
約２０μＭである特許請求の範囲第３７項に記載の方法
。 ４０、還元された及び酸化されたチオレドキシンの上記
蛋白質折り畳み有効量が、還元された形態の酸化された
形態に対する比、約１：１〜約１：２２に保持される特
許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ４１、上記還元されたチオレドキシンが折り畳み混合物
中に於て酸化されたチオレドキシン及びＤＴＴ（ジチオ
スレイトール）を予備培養することによって形成される
特許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ４２、上記ジスルフィド架橋を含有する蛋白質がインシ
ュリン又はプロインシュリンである特許請求の範囲第３
７項に記載の方法。 ４３、上記チオレドキシンに由来するジチオールペプチ
ドが大腸菌チオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂
によって製造される１〜３７の残基を含有する断片であ
る特許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ４４、上記チオレドキシンに由来するジチオールペプチ
ドが大腸菌チオレドキシンのシアノゲンブロマイド開裂
によって製造される１〜３７の残基のトリプシン消化に
よって造られる１９〜３６の残基を含有する断片である
特許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ４５、上記チオレドキシに由来するか又はチオレドキシ
ン様のジチオールペプチドが、レドックス活性ペプチド
配列Ｃｙｓ−Ｘ−Ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（ここでＸ及びＹ
は２０個のアミノ酸の任意のものでありうる）を含む特
許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ４６、上記レドックス活性ペプチド配列がＣｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓである特許請求の範囲第４
５項に記載の方法。 ４７、上記ジスルフィド架橋を含有する蛋白質が、粗細
胞抽出物中か、粗細胞抽出物からの部分的な精製物中の
ものである特許請求の範囲第３７項に記載の方法。 ４８、上記細胞が組替え微生物である特許請求の範囲第
４７項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75384885A | 1985-07-11 | 1985-07-11 | |
| US753848 | 1985-07-11 | ||
| US812162 | 1985-12-23 | ||
| US859595 | 1986-05-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6226298A true JPS6226298A (ja) | 1987-02-04 |
Family
ID=25032406
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15989686A Pending JPS6226298A (ja) | 1985-07-11 | 1986-07-09 | ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6226298A (ja) |
-
1986
- 1986-07-09 JP JP15989686A patent/JPS6226298A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5077392A (en) | Process for activation of recombinant protein produced by prokaryotes | |
| US8633300B2 (en) | Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine | |
| Martinez et al. | Expression of recombinant human phenylalanine hydroxylase as fusion protein in Escherichia coli circumvents proteolytic degradation by host cell proteases. Isolation and characterization of the wild-type enzyme | |
| Pigiet et al. | Thioredoxin-catalyzed refolding of disulfide-containing proteins. | |
| JPH0728745B2 (ja) | 原核生物中で発現させることにより、遺伝子工学的に製造したジスルフィド結合を含有する異種の真核蛋白質を活性化する方法 | |
| EP0246279B1 (en) | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms | |
| JP5290753B2 (ja) | 二量体及び多量体ＦＶＩＩａ化合物 | |
| US20070009506A1 (en) | Methods for production of recombinant urokinase | |
| Joly et al. | Protein folding activities of Escherichia coli protein disulfide isomerase | |
| JP2004508050A5 (ja) | ||
| Lundström-Ljung et al. | Glutaredoxin accelerates glutathione-dependent folding of reduced ribonuclease A together with protein disulfide-isomerase | |
| US4904602A (en) | Thioredoxin shufflease and use thereof | |
| NO309153B1 (no) | Fremgangsmåte for ökning ved sekresjon av disulfidbrodannede proteiner | |
| EP0208539A2 (en) | Folding disulfide-cross-linkable proteins | |
| White Jr | [54] Reduction and reoxidation at disulfide bonds | |
| Fickenscher et al. | Limited proteolysis of inactive tetrameric chloroplast NADP-malate dehydrogenase produces active dimers | |
| JP3070935B2 (ja) | 変性組換え融合蛋白質のバイオ触媒的な正確な鎖フオールデイングのための方法 | |
| US5290690A (en) | Methods and means for controlling the stability of proteins | |
| JPS6226298A (ja) | ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法 | |
| US4894340A (en) | Microbial sulfhydryl oxidase and method | |
| US6531294B1 (en) | Preparation of pancreatic procarboxypeptidase B, isoforms and muteins thereof and their use | |
| Kuehl et al. | Tryptophanyl transfer ribonucleic acid synthetase of Escherichia coli. Character of required thiol group and structure of thiol peptides. | |
| JP2877253B2 (ja) | 融合タンパク質の選択的切断方法 | |
| EP3221449B1 (en) | Process for refolding recombinant chymotrypsin | |
| WO2004094344A2 (en) | Methods for production of recombinant urokinase |