JPS62143684A - チオレドキシンシヤツフルア−ゼとその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はチオレドキシンシャツフルアーゼとその使用に
間する。

［先行技術及び問題点］ ジスルフィド結合を含有するタンパクが微生物中でつく
られる時、これらは活性に必要な臨界的でかつ正しいジ
スルフィド結合を欠いた還元型でつくられる。細胞破壊
時に、これらのタンパクは非自然的コンホーメーション
のため、しばしば不溶性であり、天然のでない正しくな
いジスルフィド対合をもっている。これらのタンパクを
正確に折りたたむために種々の方法が用いられた。これ
らは概して全ジスルフィ１この還元に続いて制御された
酸化反応の実施を要する。この制御された酸化反応は、
タンパクチオール類をジスルフィドに酸化的に転化する
ため、並びに必要な交換反応を可能とするために、適当
な酸化環境を提供しなければならない。効果的なジスル
フィド交換を促進する条件は、酸化と還元との間のバラ
ンスを要求し、天然の即ち正しいジスルフィド類のもの
の方がより大きな熱力学的安定性を有するということが
天然の構造を達成する原動力である。ジスルフィド形成
のためには酸化に向かわせるのが必要なことと、ジスル
フィド交換に適した酸化還元環境があることとの間のバ
ランスを取る必要の結果として、高すぎるか低すぎるか
する酸化環境のために天然のタンパクの収量が低下する
。間違って折りたたまれたタンパクの例は、望ましくな
いジスルフィド異性体類（すなわち間違ったジスルフィ
ド対合をもつもの）、又は所望のタンパク生成物のオリ
ゴマーを形成する分子間ジスルフィド対合をもつ分子を
含む。

ジスルフィド結合を含んだ商業的に最も重要なタンパク
はインシュリンである。合衆国特許第４゜４２１．６８
５号は、インシュリンを生成させるための特定的な条件
下にＳ−スルホン化型のＡ鎖とＳ−スルホン化型の８鎖
をチオール還元剤と反応させる場合のインシュリンの製
法を明らかにしている。この特許で明らかにされたチオ
ール還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）とジチオ
エリスリトール（ＤＴＥ）である。

［問題点を解決する手段］ 本発明は、タンパクを折りたたむための天然の生物学的
過程を模倣したタンパク酵素を利用して・・いる。本明
細書でチオレドキシンシャツフルアーゼと命名された酵
素は、再折りたたみ過程を経るタンパク中でジスルフィ
ド゛の交換を触媒する役［１を果たす単一の反応性チオ
ールをもつものとして特性づけられる。グルタチオンと
ジチオスレイトールのようなチオール類、イドソベンゼ
ンのような有機酸化剤、又は酸素を含めた一般に使用さ
れる種々の酸化剤が、いずれも酸化／再折りたたみ過程
で消費されるのと異なり、チオレドキシンシャツフルア
ーゼは真の触媒に予期されるとおり、再循環されるので
有利である。また、チオレドキシンシャツフルアーゼは
非消費型触媒であるため、使用モル量が少なく、その量
は再折りたたみを受けるタンパク量のほんの一部にすぎ
ない。後者の点は経済的配慮のためばかりでなく、再折
りたたみ済み最終生成物からチオレドキシンシャツフル
アーゼを除くための配慮にとっても重要である。

本発明はまた、チオレドキシンシャツフルアーゼを暗号
化した雑種遺伝子の遺伝的構築と、チオレドキシンシャ
ツフルアーゼの製法に関する。更に本発明は、折りたた
まれていない還元済みタンパクや、正しくないジスルフ
ィド結合が形成されてしまったスクランブルドプロテイ
ン（すなわちタンパクが間違ったコンホーメーションに
折りたたまれて、一部しか活性のないもの）の接触的再
折りたたみのために、チオレドキシンシャツフルアーゼ
を使用することに関する。なおも本発明は、粗製細胞抽
出液中の組替え型タンパクの接触的再折りたたみへのチ
オレドキシンシャツフルアーゼの使用に関する。

チオレドキシンシャツフルアーゼによる再折りたたみが
可能なジスルフィド架橋を含んでいるタンパクの例は、
インシュリン、プロインシュリン、牛すい臓リボヌクレ
アーゼ（ＲＮａｓｅ）、リゾチーム、牛すい液トリプシ
ンインヒビター、インターフェロン、レンニンくキモシ
ン）、プラズミノゲンアクチベーター、プロラクチン、
ヒトα−１トリプシンインヒビター、因子（ファクター
）■等である。

上のタンパクや、ジスルフィド架橋を含んだ他のタンパ
ク類は、本明細書で開示された発明の出発材料として、
Ｓ−スルホン化型で使用できる。Ｓ−スルホン化型のタ
ンパクを使用する時は、折りたたみ過程に還元型チオレ
ドキシンシャツフルアーゼを加える。

チオレドキシンシャツフルアーゼは、以下の特性をもつ
酵素、すなわち（ａ）単一の反応性チオール基を含有し
、（ｂ）再折りたたみ過程を経るタンパク中のジスルフ
ィドの交換を触媒し、かつ（ｃ）酸化／再折りたたみ過
程で消費されない酵素、を定義した総称である。

本明細書に特定的に例示されているのは、大腸菌チオレ
ドキシン遺伝子をコドン３５で変異させて、システィン
（ＴＧＣ）を、他の１９アミノ酸、すなわちアラニン、
アルキニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミ
ン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシ
ン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン
、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チ
ロシン、及びバリンの任意のものを暗号化したコト′ン
に変更５する時につくられるチオレドキシンシャツフル
アーゼである。この変更は、ジチオールチオレドキシン
化合物をチオレドキシンシャツフルアーゼとして言及さ
れているモノチオール化合物に変更するものである。

大腸菌チオレドキシン遺伝子を大腸菌チオレドキシンシ
ャツフルアーゼ遺伝子に変更するには、部位指向性変異
誘発（ねらい撃ち突然変異）が用いられる。この方法は
、Ｃｙｓ３５　（ＴＧＣ）に対応するコドンから別のア
ミノ酸を暗号化した配列への変更を必要としたくここで
挙げる例では、Ｃｙｓ３５を５ｅｒ３５へ変更した）。

この変異誘発手順を達成するために、クローン化したチ
オレドキシン遺伝子（遺伝的指定はＴＲＸ）を周知の一
本鎖ＤＮＡファージ門Ｐ１９に再クローン化した。　大
腸菌給源の代わりに下記のような他のチオレドキシン、
チオレドキシンから誘導された、又はチオレドキシン様
の遺伝子給源も使用できる。

チオレドキシンシャツフルアーゼを暗号化した雑種遺伝
子のクローン化は、標準手順により、大腸菌３９８１菌
株［ラン・シー・エイ（Ｌｕｎｎ、　Ｃ，Ａ、）、カス
シュΦニス（Ｋａｔｈｊｕ、　Ｓ、）、ウオーレス・ビ
ー・ジェイ（Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｂ、Ｊ、）、クシュナ
ーφニスφアール（Ｋｕｓｈｎｅｒ、　Ｓ、Ｒ，）、及
びビジエツト・ヴイ（Ｐｉｇｉｅｔ、　Ｖ、０１９８４
年）Ｊ９口ｉｏ１．ｃｈｅｎ＋、　２５９巻１０４６９
−１０４７４頁］と指定された周知の大腸菌菌株からプ
ラスミドｐＢＨＫ８を単離すること乞こよって開始され
た。ｐ−Ｂ）ｌＫ８　ＤＮＡをＫｐｎ　Ｉ及びＰｖｕＩ
Ｉで開裂し、ＭＰ１９複製型ＤＮＡを制限酵素Ｋｐｎ　
Ｉ及び旧ｎｃｌｌで開裂した。

ＤＮＡ試料を混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで再結合さ
せた。ＤＮＡをコンピテント大腸菌Ｊ旧０３に形質転換
し、細胞を栄養寒天プレート上に広げた。乳糖を利用で
きない組替え型ファージ（白色プラーク）を増殖し、一
本鎖ファージＯＮへを調製して、アガロースゲル電気泳
動で調べた。チオレドキシン遺伝子を含有する組替え型
を、挿入されたＤＮＡの大きさ（２，８キロベース）と
ＤＮＡシークエンシングによって確認した。チオレドキ
シン遺伝子を含有する組替え型ファージをＴＲＸ　４と
呼ぶ。チオレドキシン遺伝子のヌクレオチド配列は、ウ
ォーレス・ビー・シェイ（Ｗａｌｌａｃｅ、　Ｂ、Ｊ、
）及びクシュナー・ニスφアール（Ｋｕｓｈｎｅｒ、　
Ｓ、Ｒ，）　Ｇｅｎｅ　３２巻３９９−４０８頁に明ら
かにされている。この配列は、この文献への参照により
、本明細書に取り入れられている。

チオレドキシンシャツフルアーゼ遺伝子は、オリゴヌク
レオチド指向性変異誘発（ねらい撃ち突然変異）［シラ
ー・エム・ジェイ（Ｚｏｌｌｅｒ、　Ｍ、Ｊ、）及びス
ミス・エム（Ｓｍｉｔｈ、Ｍ、）（１９８３年）　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１００巻４６８
−５００頁コによって大腸菌チオレドキシン遺伝子から
構築された。

システィン残基３５（すなわち下の下線のコドンＡＧＣ
）の領域中の相補的配列に対応する２７塩基のオリゴヌ
クレオチド５’−ＴＧＧ　ＴＧＣＧＧＴ　ＣＣＧ　Ｉ　
ＡＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣＧＣＣヲ一本鎖本領Ｘ　［ｌＮ
Ａニア　ニー　ルＬ／、クレノフＤＮＡポリメラーセに
より生体外で引き伸ばした。重合混合物は大腸菌−重鎖
結合タンパク及びＴ４　ＤＮＡリガーゼも含有した。Ｄ
ＮＡをコンピテントＪ旧０３細胞に形質転換した。

コドン３５の塩基変更（即ちＴＧＣから八ＧＣへ）′を
含む組替クローンの確認は、イｊｘ飾タンパクの配列に
対応するコドン３５を延長した放飼性オリゴヌクレオチ
ド（５’−ＣＧＧＴ　ＣＣＧ　ＩＩＧ−にへへへＡＴ）
とのディファレンシャルＤＮＡハイブリット形成法（ｄ
ｌｆｆｅｒｅｎ＋、１ａｌＤＮＡ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａ
Ｎｏｎ）により行なった。二本鎖ＤＮＡの高い融解温度
が２０クローン中２クローンで観察された。これら２チ
オレドキシン誘導体クローンの一方（ＴＲＸ　３５１）
は、同種クローンを確保するためリブラーク単離され、
一本領ＤＮＡが調製された。

チオレドキシンから誘導された遺伝子のジデオキシシー
フェンシングはコドン３５でＴＧＣからＡＧＣへの塩基
１個の変更を確証した。

ＴＲＸ　３５１遺伝子生成物（チオレドキシンシャツフ
ルアーゼと命名）は、標準手１１１ｉを使用し、チオレ
ドキシンシャツフルアーゼ遺伝子（ＴＲＸ　３５１）を
含有する旧３ファージで感染させた細胞培養基から造り
得る。

チオレドキシンシャツフルアーゼ遺伝子を標準手順でプ
ラスミドベクターに移し得る。クレノフボリメラーゼに
よるＴＲＸ　３５１　ＤＮＡへの旧３シークエンジング
ブライマー［ニューイングランド・バイオラブ（マサチ
ューセッツ州ビバリー）］の延長で造られる二本鎖ＤＮ
Ａは、ＴＲＸ　　３５１遺伝子を含む制限断片（にｐｎ
　Ｉ　／Ｐｓｔ　Ｉ　）を除去できる。例えば、Ｋｐｎ
■とＦ’ｓｔ　Ｉで消化させたｐＵｃ＋８をＴＲＸ　３
５１のＫｐｎｌ／Ｐｓｔ　Ｉ断片と混合し、Ｔ４　ＤＮ
Ａリガーゼて再結合させた。組替え型クローンは、ＤＮ
Ａ混合物によるコンピテント細胞の形質転換とアンピシ
リン耐性コロニーの選択で得られた。制限酵素による消
化は、２．８キロベースのＤＮＡ断片の挿入を確証した
。

チオレドキシン類はエルマン試薬の様な典型的な有機化
合物中のジスルフィドや、種々のタンパク中に天然に存
在するジスルフィド類に対し還元能力をもった低分子量
ジチオールタンパクである［ホルムグレン・エイ（Ｈｏ
１ｍｇｒｅｎ＋　Ａ、）（１９８１年）　Ｔｒｅｎｄｓ
　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ　０
巻２６−３９頁］。

チオレドキシン遺伝子及びチオレドキシンシャツフルア
ーゼ給源として使用できるチオレドキシンとチオレドキ
シンから誘導された、又はチオレドキシン様のジチオー
ルペプチド類は、次の化合物類により例示される。

（１）大腸菌から単離されたチオレドキシン［ローレン
ト・ティー・シー（Ｌａｕｒｅｎｔ、　Ｔ、Ｃ，）、ム
ーブ・イー・シー（Ｍｏｏｒｅ、　Ｅ、Ｃ９）及びレイ
チャードψビー（Ｒｅｔｃｈａｒｄ、　Ｐ、）（１９６
４年）　Ｊ、　Ｂｔｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２３９巻３４３
６−３４４５頁］。

（２）他の給源から単離されたチオレドキシン類。

例えば酵母から［ボーク・ジー舎ピー（Ｐｏｒｑｕｅ、
　Ｇ。

Ｐ、）、ボールデステンφエイ（Ｂａｌｄｅｓｔｅｎ、
　Ａ、）及びレイチャード・ビー（１９７０年）　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４５巻２３６２−２３７９
頁］；シアノバクテリウム（ｃｙａｎｏｂａｃ−ｔｅｒ
ｉｕｍ）から［グリースン・エフ・ケイ（Ｇｌｅａｓｏ
ｎ。

Ｆ、に、）及びホルムグレン・エイ　（１９８３年）「
チオレドキシン類、その構造と機能」（ピア・ガダル編
）Ｅｄｉｔｉｏｎｓ　　ｄｅ　　Ｃｅｎｔｒｅ　　Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　　ｒｌｅ　　Ｉａ　　Ｒｅｃｈｅｒｃｈ
ｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅｌ：ラットから［ゲラｊａ
ジェイ（Ｇｕｅｒａｒａ、　Ｊ、）、ムーブ・イー・シ
ー及びウォード・ディ・エヌエム　（Ｗａｒｄ、　Ｄ、
　ＮＭ、）（１９８３年）前掲］；Ｔ４バクテリオファ
ージから［ソダーバーグ・ビーオー（Ｓｏｄｅｒｂｅｒ
ｇ、　Ｒ−０）、ショーベリ・ビーエム（Ｓｊｏｂｅｒ
ｇ、　Ｂ−Ｍ）、ソナースタム・ニー（Ｓｏｎｎｅｒ−
ｓｔａｍ、　Ｕ、）及びブランデン・シーアイ（Ｂｒａ
ｎｄｅｎ。

Ｃ−１）　（１９７８年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　７５巻５Ｂ２７−５
８３０頁］。

（３）下記のように無傷のチオレドキシン類の開裂によ
り造られるペプチド類を代表したチオレドキシン誘導ジ
チオールペプチド類。この部類のチオレドキシン誘導ペ
プチド類の一例は、大腸菌からのチオレドキシンの臭化
シアン開裂により造られる残基１−３７（すなわちＴｌ
−３７）を含有する断片である。これらのチオレドキシ
ン誘導ジチオールペプチド類の重要な特徴は、レドック
ス活性ペプチド配列のＣｙｓ−Ｘ４−Ｃｙｓ−Ｌｙｓを
含有することである（ここて×とＹは独立に２０アミノ
酸の任意のものでありうる）。例えば、大腸菌チオレド
キシンからのレドックス活性ペプチド配列は、Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ　（ｃｙｓ＝システィ
ン、ＧＩｙ＝グリシン、Ｐｒｏ＝プロリン、Ｌｙｓ＝リ
シン）である。

（４）タンパクジスルフィドの還元を触媒する固有の能
力をもつチオレドキシン様ジチオールペプチド類。これ
らのチオトド−１１シン様ジＪオールペプチド類は、概
してしドックス活性ジスルフィドを形成する一対のシス
ティン残基な含む特徴をもつ。この例は大腸菌チオレド
キシン中と同じ配列のＣｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
−Ｌｙｓ又はＴ４バクテリオファージで暗号化された他
のチオレドキシンからの類似配列Ｃｙｓ−Ｖａｔ−Ｔｙ
ｒ−Ｃｙｓ　（ｃｙｓ＝システィン、■ａ１＝バリン、
Ｔｙｒ＝チロシン）を含んだ、天然給源から誘導又は合
成的に構築されたペプチド類を含む［ソダーバーグ・ビ
ーオー、ショーベリ・ビーエム、ソナースタム・ニー及
びブランデン・シーアイ（１９７８年）　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５巻５
８２７−５８３０頁］。他のチオレドキシン様ペプチド
類は、固有のチオレドキシン様活性をもつプロチオエン
類と呼ばれる種子タンパクの部類を包含する［ワダ・ケ
イ（Ｗａｄａ、　Ｋ、）及びブキャナン・ビー・ビー（
Ｂｕｃｈａｎａｎ、　Ｂ、Ｂ、）（１９８３年）「チオ
レドキシン類。

その構造と機能」（ヒ０−ｈ゛り６編）Ｅｄｉｔｉｏｎ
ｓ　ｄｅ　Ｃｅｎｔｒｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｄｅ　Ｉ
ａ　Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｑｕｅ］
。

チオレドキシン遺伝子とチオレドキシンシャツフルアー
ゼのもう一つの給源はエドマン・ジエイ・シー（Ｅｄｍ
ａｒ＋、　Ｊ、Ｃ０）、エリス・エル（Ｅｌｌｉｓ、Ｌ
、）、ブラッチャー・アール・ダブリュー（Ｂｒａｃｈ
ｅｒ、　Ｒ。

Ｖ、）、ロス−７−ルーＺイ（ＲＯｔｈ、ＲｏＡ、）及
ヒラツタ−・ダブリュー争ジエイ（Ｒｕｔｔｅｒ、’　
Ｗ、Ｊ、）（１９’８５年）　Ｎａｔｕｒｅ　３１７巻
２６７−２７０頁で開示のタンパクジスルフィドイソメ
ラーゼである。

ジスルフィド架橋を含有する折畳まれていないタンパク
は、タンパク折畳有効量の酸化チオレドキシンシャツフ
ルアーゼを、それのみ、又は酸素かジチオスレイトール
のような化学酸化剤と組合わせて、折畳まれていない還
元済みタンパクと反応させて効果的に折畳まれる。

本発明方法に使用できるチオレドキシンシャツフルアー
ゼの濃度は、約３ないし約５０μＭの範囲にある。最適
濃度は少なくとも５μＭと考えられる。

チオレドキシンシャツフルアーゼの正確な水準は、２１
一 本発明を有するタンパク技術の当業者により、特定タン
パクについて容易に決定できると認識すべきである。

濃度５μ台のチオレドキシンシャツフルアーゼは、還元
済みの変性された牛すい臓ＲＮａｓｅ（２３μＭ）の再
折り畳みを触媒し、酵素活性の定量的な回収を生ずる。

反応は、個々のタンパクについて最適化されるが、約７
．０ないし約１１．ＯのｐＨ範囲で実施できる。ｐＨが
約７．０ないし約９．０の範囲にあるのが好ましい。再
折り畳み率は空気より著しく大きく、２０−酸化ＤＴＴ
のそれに比肩する。チオレドキシンシャツフルアーゼの
場合、５０％活性が５１時間後に回復されるのに対し、
酸化１）ＴＴを使用すると５０時間である。酸化剤とし
て空気のみの存在下でＲＮａｓｅの復元（ｒｅｎａｔｓ
ｕｒａｔｉｏｎ）率は測定不能なほど遅く、５０時間後
の回復は僅か２０％活性にすぎない。

チオレドキシンシャツフルアーゼの存在下におけるＲＮ
ａｓｅの５０％再活性化に要する時間（Ｔ１７２）は、
酸素及び／又は酸化ＤＴＴのような酸化剤の添加によっ
て（空気の存在下におりる再折畳みに対して）−２２＋
。

４倍ないし８倍減少しろる。窒素下におけるチオレドキ
シンシャツフルアーゼ５μＭでのＴＩ／２は８０時間で
あった。この値は空気の添加によって５０時間に、また
酸素の添加によって２１時間に低下した。チオレドキシ
ンシャツフルアーゼの不在下では、酸素のみではＲＮａ
ｓｅの限定的な再折り畳みしか触媒できず、回復した活
性は３０時間後に最大限３０％までしか達しない。酸化
ＤＴＴでも、同じ強化的効果が観察された。窒素下に５
７１ＭチオレドキシンシャツフルアーゼのＴ１７２は、
２０　ｍＭ酸化［ＩＴＴの添加と共に８０時間から２０
時間へ減少した。酸化ＤＴＴのみの存在下（すなわち窒
素下）におけるＴ１７２は５６時間であった。５μＭチ
オレドキシンシヤツフルアーゼの最良のＴ１７２である
１１時間は、酸素の存在下に２０　ｍ■酸化ＤＴＴの組
合わせを用いて得られた。

２０　ｍＭ　ＤＴＴを添加した５μＭ濃度のチオレドキ
シンシャツフルアーゼは、変性・還元済みＲＮａｓｅの
再折り畳みにおいて、１００μＭチオレドキシンと同程
度に有効である。空気の存在下に、酸化ＤＴＴを加えた
チオレドキシンシャツフルアーゼのＴＩ／２は、チオレ
ドキシンの２０時間に対して１８時間であった。

［材料及び方法］ 材料：牛すい臓リボヌクレアーゼＡ　（ＲＮａｓｅ）及
びシメチジン−２’：３’−環式一燐酸をシグマ社（ミ
ズーリ州セントルイス）から入手した。チオレドキシン
は、ランくい」ｎｎ）らの手順［（１９８４年）Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９巻＋０４６９−１０４
７４頁］によって大腸菌ＳＫ３９８１から精製された。

３−（Ｎ−モルホリン）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）ナトリウムは、カルバイオケム社（カリフォルニア
州すンディエゴ）からのウルトロール等級であった。セ
ファデックスＧ−２５−５０もシグマ社から得た。他の
使用薬品はすべて試薬等級であった。

チオレドキシンシャツフルアーゼ検定：　１３，７００
Ｍ１　ｃ「１０モル吸光係数を使用し、２８０　ｎｍて
の吸光度によってタンパク濃度を測定した［ホルムグレ
ン・エイ及びレイチャート・ピー（１４１６７年）Ｅｕ
ｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２巻１８７−１９６頁
コ。タンパク濃度は、マツケボイらが記述しているうさ
ぎ抗チオレドキシンを使用する定量的ロケット免疫検定
によっても測定された［マツケボイ・エム（ＭＣＥＶＯ
！Ｉｆ　ｔＭ、）、ランフ・シー（Ｌａｎｔｚ、　Ｃ，
）、ラン・シー・エイ（いｊｎｎ、　Ｃ，Ａ、）及びビ
ジエツト・ヴ−？　−（Ｐｉｇｉｅｔ。

Ｖ、）（１９８１年）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
　２５６巻６６４６−６６５０頁コ。

抗チオレドキシン親和カラムは、ショーベり及びホルム
グレンの記述のとおり、硫酸アンモニウム沈殿のくり返
して単離された免疫グロブリンフラクションを使用して
つくられた［ショーベリ・ビー・エム及びホルムグレン
・エイ（１９７３年）　Ｂｉｏ−ｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　Ａｃｔａ　３１５巻＋７６−１８０頁］。抗
体カラムは均質なチオレドキシン試料を使用して、ゲル
１Ｔ１１当たり約１　ｍｇのチオレドキシンを保持した
。

チオレドキシン３５１の親和精製：旧３　ＴＲＸ　３５
１で感染させた大腸菌ＪＭ１０３　Ａｌ７９の静止相細
胞培養基から得られる培地１リツトルにジチオスレイト
ール０．０４　ｎ＋Ｍを加え、室温で数時間培養した。

固定化された抗チオレドキシンを添加し、試料を一夜４
℃で絶えずかきまぜた。次に試料を３ｘｌＯｃｍのカラ
ムに注ぎ、抗チオレドキシンーセファロースの全部をカ
ラムに充填した。次に、今度は培地をカラムに通した。

最後に、団トリス（ｐＨ７，４）で、２８０ｎｍでの吸
光度が０．０３未満になり、非特異的に結合されたタン
パクの除去が確実になるまで、カラムを完全に洗った。

チオレドキシンシャツフルアーゼをＯ，１Ｍ酢酸（ｐＨ
２，２）でカラムから溶離した。１Ｍ重炭酸アンモニウ
ムの添加により０．７１フラクシヨンを直ちに中和した
。フラクションを２８０　ｒｖでの吸光度でタンパクに
ついて監視した。一つの大きなピークと小さめのショル
ダーピークが定常的に観察された。これらのフラクショ
ンを一緒にし、ＶＭＩＯフィルターを付けたアミコン・
スターセル（アミコン社、マサチューセッツ州ダンバー
ス）を使用して、窒素下に濃縮した。試料を希釈し濃縮
することによって緩衝液を５０ｍＭ）リス、３　ｍＭ　
ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４）と交換した。試料を４℃で保存
した。

ＲＮａｓｅ　Ａの濃度と活性：天然ＲＮａｓｅ及びスク
ランブルドＲＮａｓｅの酵素濃度は、２７７．５　ｎｍ
で測定される９、８００　Ｍｉｃｍ−’の吸光係数を用
いて決定された［ハントガン・アール・アール（ｆｌａ
ｎｔｇａｎ、　Ｒ，Ｒ，）、ヘイムズ修ジー・ジー（ｌ
ｌａｍｍｅｓ、　Ｇ、Ｇ、’）及びシェラガ・エッチ・
エイ（Ｓｃｈｅｒａｇａ、　Ｈ，Ａ、）（１９７４年）
Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３巻３４２１−３４３
１頁］。完全に還元された酵素の濃度は、９，２００　
Ｍｌｃｍ−１の吸光度係数を用いて、２７５　ｎｍで測
定された［アンフィンセン′・シー・ビー（Ａｎｆｉｎ
ｓｅｎ、　Ｃ，Ｂ、）、ハーバ−・イー（Ｈａ−ｂｅｒ
、　Ｅ、）、シーラ・エム（Ｓｅｌａ、　Ｍ、）及びホ
ワイト・エフ・エッチ・ジュニア（Ｗｈｉｔｅ、　Ｆ、
１１．　Ｊｒ、）（１９６１年）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　４７巻＋３０９
−１３１５頁］。

ＲＮａｓｅ　Ａの活性はクルツクらの手順によって決定
された［クルツク・イー拳エム（ｃｒｏｏｋ、　Ｅ、Ｍ
、）、マチアス・エイ・ビー（Ｍａｔｈｉａｓ、　Ａ、
Ｐ、）及びラビン・ビー・アール（ｔ＋ａｂｉｎ、　Ｂ
、Ｒ，）（１９６０年）ＢｉｏｃｈｅｍＪ、７４巻２３
４−２３８頁］。最終検定混合物は、Ｏ，１Ｍ閂０ＰＳ
（ｐＨ７，０）、７　ｍＭシチジン−２’：３’−環式
−燐酸、及び１０−３０Ｍｇ／ｍｌ　ＲＮａｓｅ　Ａか
らなっていた。シチジン−２゛：３”−環式−燐酸を２
５℃で加水分解する時の２９１　ｎｍでの吸光度の増加
は、ＲＮａｓｅ活性の尺度として監視された。

還元変性済みＲＮａｓｅ＾の復元及び再折り畳み：ＲＮ
ａｓｅの還元及び変性は、０．１５Ｍ　ＩＩＴＴ及び６
ＭグアニジンＭＣＩを含有するＯ、ＩＭ＋−リス／ＩＩ
ＣＩ（ｐＨ８，６）１．５ｍｌ中で天然酵素３０　ｍｙ
、を−夜培養することによって行なわれた。０．０ＩＮ
　ＩＩｃＩで平衡化され展開される１ｘ２４　ｃｍセフ
ァデックスＧ　−２５：ｔｌｌ　ｒ！１粒子カラムを使
用するカラムクロマトグラフィにより、還元ＲＮａｓｅ
を過剰のＤＴＴ及びグアニジンＩＩｃＩから分離した。

ＲＮａｓｅ　Ａを含有するフラクションを一緒にし、濃
度を２７５　ｎｍでの吸光度によって決定し、−２０℃
に冷凍したアルゴン下にフラクションを保存した。

種々量のチオレドキシンシャツフルアーゼ又はチオレド
キシンを含有するｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡで、Ｏ，１Ｍ）リ
ス（ｐＨ７，４又は９．０〉中の還元酵素を希釈するこ
とによって、ＲＮａＳｅ　Ａの再酸化を開始した。種々
の時間にアリコートを分析し、天然の非変性化ＲＮａｓ
ｅと特異活性（すなわちＲＮａｓｅタンパクｍｇ当たり
のシチジン−２’　：３’−環式−燐酸の加水分解）と
の比較によって再折り畳み率を計算した。

スクランブルドＲＮａｓｅの復元と再折り畳み：前節の
記述のとおりに単離された還元変性ＲＮａｓｅを変性条
件下に酸化させてスクランブルドＲＮａｓｅをつくった
。セファデックスＧ−２５カラムからの一緒にしたフラ
クションをグアニジンＩＩｃＩ中間とし、固体トリスで
ｐｕを８．６に調製した。次に酸素を数分間吹込み、試
料を光から保護して室温で３−４日培養した。エルマン
の方法［エルマン・ジー・エル（Ｅｌｌｍａｎ、　Ｇ、
Ｌ、）（１９５９年）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｔｏ−ｐｈｙｓ　８２巻Ｔｏ−７７頁コで測定され
る遊離チオールの量は、ＲＮａｓｅモル当たり０．０５
モル未満であった。

活性は約５％であり、再折り畳みＲＮａｓｅの大部分は
正しくない・不活性型のものであった。

スクランブルドＲＮａｓｅの再活性化は、種々量のチオ
レドキシンシャツフルアーゼ及びｌ又は還元ＤＴＴを含
有する１　ｍＭ　ＥＤＴＡで、０．１Ｍ）リス（ｐＨ７
，４）中の不活性ＲＮａｓｅを希釈することによって行
なわれた。種々の時間にアリコートを検定し、記述のと
おりに特異活性と天然ＲＮａｓｅとの比較によって再活
性化率を計算した。

チオレドキシン断片Ｔｌ−３’ｌ及びＴｌ９−３６　：
（ａ）臭化シアン開裂によるＴｌ−３７の生産大腸菌チ
オレドキシン試料を４℃の水中で１２時間透析した。５
１を乾燥し、７０％ぎ酸中に再懸濁した。臭化シアン（
シグマケミカル社）を７０％ぎ酸に溶解し、５０倍モル
過剰のメチオニン中のチオレドキシンに添加ｐた。溶液
を窒素でパージし、室温の暗黒中で２４時間培養した。

開裂反応が完了したら溶液を窒素下に乾燥し、酢酸ナト
リウム緩衝液に再懸濁し、水酸化アンモニウムでＰ）＋
　８．！５に調整した。

２１４　ｎｍで監視されるベックマンモデル４２１シス
テム（ベックマンインスッルメント社、カリフォルニア
州フラートン、の商標名）に取り付けたウォータースμ
ｍボンダパックＣ−１８カラム（ウォータース・アソシ
エーツ社、マサチューセッツ州ミルフォード、の商標名
）に試料を装填した。使用溶媒系は、０．１％トリフル
オロ酢酸（緩衝液Ａ）及びアセトニトリル中のＯ、ＯＲ
％トリフルオロ酢酸（緩衝液Ｂ）であった。３０分にわ
たり０％から６０％Ｂの勾配を使用して、毎分２ｍｌの
流量でペプチドを分離した。

チオレドキシンをＣＮＢｒでＴｌ−３７とＴ３Ｂ−１０
８の２断片に開裂し、それぞれ４４％及び５１％緩衝液
Ｂで溶離した。アミノ酸分析で両ペプチドの組成を確認
した［ホルムグレン・エイ及びレイチャート・ビー（１
９６７年）　　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　２
巻＋８７−１９６頁］。

Ｔｌ−３７は酵素の活性部位を含有した。回収された両
ペプチドは出発材料の６９％を占めた。未反応チオレド
キシンは損失の１２−１５％を占めたが、他の損失はＨ
ＰＬＣ分離によるものであろう。

（ｂ）トリプシン開裂によるＴｌ９−３１１の生産上記
のＨＰＬＣ分離後、Ｔ　Ｉ　−，３１を蓄え、乾燥し、
酢酸ナトリウム緩衝液に再懸濁し、ＮＨ４ＯＨでｐＨ８
，０に調整した。トリプシン（シグマケミカル社）のア
リコートをペプチド濃度の１％（Ｗ／Ｗ）で培養物に添
加した。反応混合物を３７℃で１時間培養した。

トリプシン断片の分離は、臭化シアン断片の場合のよう
にＨＰＬＣで行なった。

Ｔｌ−３７ペブチドのトリプシン消化は、Ｔ４−１８及
びＴｌ９−３６の２ペプチドを生じた。これらをＨＰ　
Ｌ　Ｃで分割し、それぞれ３１％及び４５％の緩衝液Ｂ
で溶離した。アミノ酸分析は、３１％Ｂで溶離する種カ
月５アミノ酸を含有し、活性部位ペプチドＴｌ９−３［
１に相当することを示した。Ｔｌ−３７９０ナノモルを
培養すると、ＨＰＬＣで分離後、Ｔｌ９−３６８０ナノ
モルを生じ、収率８８％であった。

以下は、本発明の生成物及び本発明実施の最良の態様を
含めた手順を示す実施例である。これらの実施例は限定
的に考えられてはならない。他に注意がなければ、百分
率はすべて重量、溶媒混合物割合はすべて容量による。

実施例１　細菌菌株及びファージ系の維持成長プラスミ
ドｐｎｌｌＫＢを含有する大腸菌ＳＫ３９８１菌株を既
述（ランら）のとおりに構築した。これは、６１６０４
合衆国イリソイ州ビオリア、合衆国農務省北部研究所の
永久保存施設から入手できる。寄託は１９８５年１１月
８日になされ、受託施設での呼出し番号はＮＲＲＬ　Ｂ
−１８０２７である。大腸菌ＪＭ１０３菌株とファージ
ＭＰ１９はニューイングランド・バイオラブから得られ
た。これらの細菌菌株はＶＴ培地く酵母エキス５ｇ／ｌ
、バクトドリブトン１０　ｇ／Ｉ、ＮａＣｌ　５ｇ／ｌ
）で生育させた。培地にＳＫ３９８１の生育のためアン
ピシリン５０　ｍｇ／ｌを補った。

実施例２　ファージＤＮＡの増殖と単離旧３から誘導さ
れる組替え型ファージ材料の調製とファージＤＮＡの単
離は、既述の手順［メッシング・ジエイ（Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ、Ｊ−）（１９８３年）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎ−ｚ
ｙｍｏｌ、　１０１巻２０−７８頁］を使用して行なわ
れた。

実施例３　合成オリゴヌクレオチドの調製合成オリゴヌ
クレオチド類はアプライド・バイオシステムズ（カリフ
ォルニア州フォスター）の３８０Ａ　ＤＮＡ合成機によ
る自動合成を用いて調製した。

実施例４　大腸菌細胞のＤＮＡ形質転換ＤＮＡ形質転換
にコンピテントな大腸菌Ｊ旧０３は、一般に使用される
手順［コーエン・ニス・エヌ（ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、）
、チャン・エイ・シー・ピー（ｃｈａｎｇ。

Ａ、Ｃ，Ｐ、）及びスー・エル（ｔｌｓｕ、　Ｌ−）（
１９７２年）　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　６９巻２１
１０−２１１４頁コにより既述のとおりに調製された。

ヘテロ二本鎖組替えファージＤＮＡ（６０ｎｇ）をコン
ピテントＪＭ１０３０．２　ｍｌに加え、０℃に１５分
保持した。細胞を４２℃で２分間パルス処理し、０．７
％バクト寒天とＪＭ］０３の一夜培養基０．２　ｉｆと
を含有するＹＴブロス３１に２０μｍを添加した。混合
物をＹＴ寒天プレー）（ＶＴブロスに１．５％バクト寒
天を加えたもの）に広げ、プレートを３７℃で一夜培養
した。

実施例５　制限酵素による消化 制限酵素はずへて、ベテスダ研究所（メリーランド州ゲ
イサーズバーグ）又はニューイングランド−バイオラブ
から購入した。培養条件はメーカー推薦のものであった
。

実施例６　　ＤＮＡ断片のライゲーション（連結）ＤＮ
Ａ連結（ライゲーション）反応物（２０μｍ）は６０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、Ｉｎ　ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２．１　ｍＭジチオスレイトール、５０℃Ｍ　ＡＴＩ
’、　２０　ｎＭ　ＤＮＡターミニ、及びＴ４　ＤＮＡ
リガーゼにニューイングランド・バイオラブ）　２０単
位を含有した。培養は１４℃、４時間であった。

実施例？　　ＤＮＡシークエンシング チオレドキシン及びチオレドキシン誘導体のＤＮＡシー
フェンシングは、ハイデツカ−らの連鎖停止法［ハイデ
ツカ−・ジー（Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ、　Ｇ、）、スプリ
ング・ジエイ（Ｍｅｓｓｉｎｇｌ　、１−）及びグロー
ネンボーン・ビー（Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、　Ｂ、）（
１９８０年）　Ｇｅｎｅ　１０巻６８−７３頁］によっ
て行なった。シーフェンシング反応をプライムするのに
オリゴヌクレオチド　５′ＡＴＴＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧ
ＡＣを使用した。

実施例日　チオレドキシン遺伝子を含有する組替え型Ｍ
Ｐ＋９の単離 にｐｎｌ及びＰｖｕ　ＩＩで消化させたプラスミＦ”ｐ
ＢＩＩＫ８と、Ｋｐｎ　Ｉ及びＨｉ　ｎｃ　ＩＩで消化
させたＭＰ＋９のライゲーションは、実施例６に記述さ
れたとおりに行なわれた。ＤＮＡを実施例４に述へたよ
うにコンピテントＪＭ１０３に形質転換したが、但しＹ
ＴプレートはＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシト
とＸｇａｌ（５−プロモートクロロ−３−インドリル−
βーＤーガラクトシＦ、シグマ社）を含有した。ＤＮＡ
挿入物を含有する組替え型ファージは透明なプラークを
つくったが、ＭＰ＋９ファージは青色プラークを生じた
。透明プラークをＹＴアブロス中Ｊ旧０３　２　ｍｌに
加え、一本領ＤＮＡを既述のようにつくった［スプリン
グ・ジェイ（１９８３年）　Ｍｅｌ．ｌ＋ｏｒ１ｓ　Ｅ
ｎｚｙｎ＋ｏ１．　１０１巻２０−７８頁］。大きなＩ
ＩＮ八挿へ物を含有するクローンは、アガロースゲル電
気泳動を使用して、そのより遅い移動度から確認された
。これらのクローンがチオレドキシン遺伝子を含有する
ことは、ジデオキシ連鎖停止法による一本鎖ＤＮＡのシ
ーフェンシングによって確認された。

実施例９　一対の不一致塩基対合を含んでいるヘテロ二
本鎖ＤＮＡの形成 ２７塩基オリゴヌクレオチド５’−ＴＧＧ　ＴＧＣ　Ｇ
ＧＴ　ＣＣＧＡＧＣ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　ＡＴＣ　ＧＣＣ
をマニアチスらの記述のように１４ポリヌクレオチドキ
ナーゼとＡＴＰでキナーゼ処理した［マニアチス・チー
／　−（Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．）、フリッシュ・イ
ー・エフ（Ｆｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．）及びサムプル
ツク・ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ＋　Ｊ．）（１９８２
年）「分子クローン化Ｊ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ）（実験室マニュアル）コールドスプリング
ハーバ−研究所にューヨーク州コールドスプリングハー
バ−）］。チオレドキシン遺伝子のアンチセンス鎖を含
有する、−３６− Ｍｌｇえ型ファージＤＮＡを二本鎖ＤＮＡ形成の基質と
して使用した。

２Ｏｎ＋Ｍ）リス−１（ｃＩ（ｐｌ（　７．５）、７　
ｍＭ　ＭｇＣ１２、１　ｍＭジチオスレイトール、５０
　ｍＭ　ＮａＣｌ、ファージＤＮＡ０、４μｇ５オリゴ
ヌクレオチド１０　ｎｇを含有する混合物（６０μｍ）
を６８℃に１５分、次に３７℃に１０分加熱し、０℃に
置いた。以下の添加を行なった。ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ，　ｄＴＴＰ，　ｄＧＴＰを０．２　ｍＭまて
：　ＡＴＰを１　ｍＭまで；ＤＮＡポリメラーゼ■クレ
ノフにューイングランドバイオラブ）４単位；大腸菌一
本鎖結合タンパク（ファーマシア、ニューシャーシー州
ビスキャタウェー）　０．５７１ｇ；　Ｔ４　ＤＮＡリ
ガーゼにューイングランド・バイオラブ）２０単位。混
合物を１４℃で４時間培養した。ＤＮＡをＪ旧０３コン
ピテント細胞に形質転換し、実施例４で述べたようにプ
レートした。

実施例１Ｏ　　ニトロセルロースフィルター上のディフ
ァレンシャルＤＮＡハイブリッド形成へテロ二本鎖ＤＮ
Ａでの細胞形質転換から得られる個々のクローンからフ
ァージＤＮＡを調製した。

それぞれ約０．３μｇをニトロセルロースシート（シュ
ライチャーφアンド・シュニル社、ニューハンプシャー
州キーン）に置き、シートを６８℃で２時間焼いた。フ
ィルターを５　ｍｌ（７）６Ｘ　ＳＳＣ　（ＩＸ　ＳＳ
Ｃ＝０、’１５Ｍ　ＮａＣＩ，　０．０１５Ｍクエン酸
ナトリウム、ＩｍＭＥＤＴＡ）及びＩＯＸデンハート液
（１００Ｘ　−　２χ牛血清アルブミン、２χフイコー
ル、２χポリビニル、ピロリドン）中で２３℃、１５分
間ハイブリッド事前形成させた。６Ｘ　ＳＳＣ　＋　Ｉ
ＯＸデンハート液中で５ｘ１０６　８２Ｐ−ｃｐｍ　（
１０８　ｃｐｍ／７ｚ　ｇ）オリゴヌクレオチド（５’
−’ａ２Ｐ−ＣＧＧＴ　ＣＣＧ　ＡＧＣ　ＡＡＡ　ＡＴ
）を含有するハイブリッド形成液５ｍｌの入った蜜月可
能な袋にフィルターを入れた。ハイブリット′形成は２
３℃、１時間であフた。

フィルターを２３℃で１５分、ｌ’ｉＸ　ＳＳＣで３回
洗った。

フィルターヲ４２℃で５分間、５０　ｍｌ　６Ｘ　ＳＳ
Ｃ１１回洗い、２時間オートラジオグラフィ処理した。

次にフィルターを５０　ｍｌ　６Ｘ　ＳＳＣで６０℃で
５分洗い、−夜オートラジオグラフィ処理した。６０℃
並びに４２℃でハイブリッド形成を示したクローンを、
更にシーフェンシングによって分析した。

実施例１１　一本領ファージｐＤＮＡからの二本鎖ＤＮ
Ａの形成と制限 組替え復旧３ファージ中の遺伝子構築物は、増殖とタン
パク生産のためプラスミドに移すことができる。実施例
９に述べたものと同じ技術が、二本鎖ＤＮＡの形成に使
用できる。この遺伝子の脇にある部位の制限開裂を使用
して、適当なプラスミドへのライゲーションのため二本
鎖断片を得ることができる。例えば、我々はチオレドキ
シンシャツフルアーゼ遺伝子をプラスミドρ１Ｊｃ１Ｂ
にューイングランド・バイオラブ）へ移した。

実施例１２　　チオレドキシン遺伝子給源からチオレド
キシンシャツフルアーゼ遺伝子を得 るための一般的プロトコル チオレドキシン遺伝子給源からチオレドキシンシャツフ
ルアーゼ遺伝子をつくりだすために、オリゴヌクレオチ
ド指向性変異誘発（ねらい撃ち突然変異）を使用できる
。我々は、Ｃｙｓ３５をセリンと置き換えた例を示した
。コドン３５での任意のアミノ酸置換で生ずるこの位置
の他の変更も、これらの手法で達成できる。また、遺伝
子の他のコドンを変更して、異なるｐＨやイオン条件で
活性のあるシャツフルアーゼ分子を生しさせるにも、こ
れらの手法を使用できる。チオレドキシンシャツフルア
ーゼの基本的基準は、化合物が単一の反応性チオールを
含有し、かつそれが再折り畳み過程を経過するタンパク
中でジスルフィドの交換を触媒することである。

実施例１３　　還元済み変性ＲＮａｓｅの再折り畳みに
対するチオレドキシンシャツフルアーゼの影響 ｐＨ９，０（０，１Ｍ　）リス、１．０　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ）で、チオレドキシンシャツフルアーゼ又はチオレド
キシンシャツフルアーゼと酸化ＤＴＴとの混合物は空気
酸化のみに比較して、ＲＮａｓｅ再折り畳再折度を高め
た。

チオレドキシンシャツフルアーゼの存在は、２倍再折り
畳み速度を高めた。空気による５０％再活性化の時間は
９時間であり、チオレドキシンシャツフルアーゼでは、
わずか４−５時間である。酸化ＤＴＴ（５ｍＭ）の添加
は、このｐＨではチオレドキシンシャツフルアーゼによ
る再折り畳み速度に影響しなかった。これらの条件下に
チオレドキシンシャツフルアーゼは還元済み変性リボヌ
クレアーゼの再折り畳みて、チオレドキシンより３０倍
効果があった。

ｐＨ７，４（０，１Ｍ）リス、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で
は、チオレドキシンシャツフルアーゼは空気酸化に比べ
て再折り畳み速度を著しく高めた。５μＭチオレドキシ
ンシヤツフルアーゼでの５０％再活性化時間は５１時間
であるが、空気の存在下での５０％再活性化の時間は、
酸化剤無添加でのＲＮａｓｅ復元速度が遅いため決定で
きなかった。

５μＭチオレドキシンシヤツフルアーゼによるＲＮａｓ
ｅ再活性化の効率は、２０　ｍＭ酸化ＤＴＴを使用して
観察される効率に比肩していた。空気の存在下における
２０　ｍＭ酸化ＤＴＴでの５０％再活性化の時間は５６
時間であった。同様に、酸素の存在下に５μ阿チオレド
キシンシヤツフルアーゼの７１７２は２１時間であり、
２０　ｍＭ酸化ＤＴＴでは２６時間であった。

最大限の活性を得るためには、チオレドキシンシャツフ
ルアーゼは酸化剤の存在を必要とする。

酸化剤として酸素を使用する時は、５０％再活性化時間
は、空気に比へ、５１時間から２１時間に低下した。酸
化ＤＴＴのような化学酸化剤も使用できる。

空気の存在下に、酸化ＤＴＴ（２０ｍＭ）を伴ったチオ
レドキシンシャツフルアーゼ（５ＭＭ）は、２０時間後
にＲＮａｓｅの５０％再活性化を生じた。同様に、酸素
の存在下にＤＴＴを伴ったチオレドキシンシャツフルア
ーゼのＴ１７２は１１時間であり、これに比べ個々に使
用されるＤＴＴ又は酸素では２０ないし２５時間であっ
た。

２０　ｍＭ　ＤＴＴの存在下に５μ台チオレドキシンシ
ャツフルアーゼで触媒されるＲＮａｓｅの再折り畳みは
、１００μＭチオレドキシンで観察されるものに比肩し
ていた。空気の存在下に、チオレＩ・キシンシャツフル
アーゼとＤＴＴでは、ＲＮａｓｅの５０％再活性化は１
８時間後に得られた。酸素の存在下に、ＤＴＴを伴った
チオレドキシンシャツフルアーゼのＴ１／２は１１時間
であった。

ｐＨ７，４で、チオレドキシンシャツフルアーゼは酸化
ＤＴＴより５　、０００倍効果があった。酸化ＤＴＴの
存左下にチオレドキシンシャツフルアーゼはチオレドキ
シンより少なくとも２０倍効果があった。

実施例１４ 合衆国特許第４，４２１，６８５号の実施例で、ＤＴＴ
又はＤ’ＴＥの代わりにチオレドキシンシャツフルアー
ゼを、それのみ又は酸素と組合わせて使用して、所望の
インシュリンの改良された収量が得られる。

実施例１５ 上に例示された牛すい臓リボヌクレアーゼの代わりに任
意のジスルフィドタンパク又はＳ−スルホン化ジスルフ
ィドタンパクを使用して、比肩し得る有益なタンパク折
り畳み結果が得られる。

実施例１６ ジスルフイド架橋が還元されているが折りたたまれてい
ないタンパクを、タンパク折り畳み有効量のチオレドキ
シンシャツフルアーゼとチオール還元剤、例えばジチオ
スレイトール又はジチオエリスリトールとを含む混合物
と反応させると、このタンパクの強化された折り畳みが
得られる。

実施例１７ タンパク折り畳み有効量のチオレドキシンシャツフルア
ーゼとチオール還元剤、例えばジチオスレイトール又は
ジチオエリスリト−ルとを含む混合物に、折りたたまれ
ていないＳ−スルホン化ジスルフィドタンパクを反応さ
せると、このタンパクの強化された折り畳みが得られる
。

実施例１８ ｐＨ８，５（０，１Ｍ）リス、１．０　ｍＭ　ＥＤＴＡ
）で、チオレドキシンシャツフルアーゼは空気酸化のみ
に比べ、スクランブルト’ＲＮａｓｅの再活性化率を高
めた。１０時間後、５μ閃チオレドキシンシャツフルア
ーゼの存在下ζこＲＮａｓｅの２５％再活性化があり、
ｌＯｕ門チオレドキシンシャツフルアーゼでは、再活性
化は５０％であった。チオレドキシンシャツフルアーゼ
が存在しないと、５時間後の回復したＲＮａｓｅ活性は
１０％であり、１０時間でもそれ以上の活性増加は見ら
れなかった。

実施例１９　　チオレドキシンシャツフルアーゼによる
スルホン化ＲＮａｓｅの再折り畳み チオレドキシンシャツフルアーゼは、ｐＨ７，５でスル
ホン化ＲＮａｓｅの再折り畳みを効果的に触媒し、活性
ＲＮａｓｅの定量的回復を生じた。スルホン化ＲＮａｓ
ｅはタンハウザー及びシェラガの方法によって調製した
［タンハウザー・ティー・ダブリュー（Ｔｈａｎｎｈｏ
ｕ’ｓｅｒ、　Ｔ、Ｗ、）及びシエラガ・エッチ・エイ
（ＳｃＭｒａ’ｇａ、　Ｈ，Ａ、）（１９８５年）旧ｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４巻？＋３８＋−７６８８頁）
。還元チオレドキシンシャツフルアーゼが必要であり、
最適条件はチオレドキシンとタンパクチオスルホネート
とのｌ＝１モル比（チオレドキシンとＲＮａｓｅとの８
＝１モル比）であった。比がチオレドキシンとタンパク
チオスルホネートとの１＝２に減少したとき、再活性化
速度もＲＮａｓｅ活性化の最終収率も低下した。ｌ：ｌ
の比でＴ１７２（５０％の活性回収に要する時間）は３
．５時間であり、ＲＮａｓｅの最終収率は８０％であっ
た。チオレドキシンが半分に減ると、Ｔ１７２は２２時
間に増加し、ＲＮａｓｅ活性の回収はわずか６０％であ
った。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、以下の特性をもつ酵素チオレドキシンシャッフルア
   ーゼ。 （ａ）単一の反応性チオール基を含有する。 （ｂ）再折りたたみ過程を経るタンパク中のジサルファ
   イド交換を触媒する。 （ｃ）酸化／再折りたたみ過程で消費されない。 ２、チオレドキシン遺伝子からつくられる、特許請求の
   範囲第１項によるチオレドキシンシャッフルアーゼ。 ３、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）チオ
   レドキシン遺伝子からつくられる、特許請求の範囲第２
   項によるチオレドキシンシャッフルアーゼ。 ４、ジチオール化合物の暗号の代わりにモノチオール化
   合物の暗号へ大腸菌チオレドキシン遺伝子を変更するこ
   とによって、この遺伝子からつくられる、特許請求の範
   囲第３項によるチオレドキシンシャッフルアーゼ。 ５、大腸菌チオレドキシン遺伝子が大腸菌ＳＫ３９８１
   菌株から誘導され、この微生物からのチオレドキシン遺
   伝子が、Ｃｙｓ３５（ＴＧＣ）に対応するコドンがアミ
   ノ酸セリンの暗号のコドンに変るよう変異化されている
   、特許請求の範囲第４項によるチオレドキシンシャッフ
   ルアーゼ。 ６、ジチオール化合物の暗号の代わりにモノチオール化
   合物の暗号へのチオレドキシン遺伝子の変更を含む、以
   下の特性をもつ酵素チオレドキシンシャッフルアーゼの
   製法。 （ａ）単一の反応性チオール基を含有する。 （ｂ）再折りたたみ過程を経るタンパク中のジサルファ
   イド交換を触媒する。 （ｃ）酸化／再折りたたみ過程で消費されない。 ７、ジチオール化合物の暗号の配列からモノチオール化
   合物の暗号の配列への変更が、部位指向性変異誘発（ｓ
   ｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）
   によって行なわれる、特許請求の範囲第６項による方法
   。 ８、部位指向性変異誘発がジチオールアミノ酸の暗号の
   コドンからモノチオールアミノ酸の暗号のコドンへの変
   更を行なうものである、特許請求の範囲第７項による方
   法。 ９、部位指向性変異誘発が、システインの暗号のコドン
   から他の１９のアミノ酸の任意のものの暗号のコドンへ
   の変更を行なうものである、特許請求の範囲第８項によ
   る方法。 １０、暗号の変更がセリンの暗号のコドンへの変更であ
   る、特許請求の範囲第９項による方法。 １１、コドン変更が大腸菌から得られるチオレドキシン
   遺伝子のコドン３５について行なわれる、特許請求の範
   囲第１０項による方法。 １２、ジスルフィド架橋を含有する折りたたまれていな
   い還元済みタンパクを、次の特性、すなわち （ａ）単一の反応性チオール基を含有する；（ｂ）再折
   りたたみ過程を経るタンパク中のジサルファイド交換を
   触媒する； （ｃ）酸化／再折りたたみ過程で消費されない；という
   特性をもつタンパク折りたたみ有効量のチオレドキシン
   シャッフルアーゼと、それのみ又は酸素と組合わせて反
   応させることからなる、この折りたたまれていない還元
   されたジスフフィド架橋を含むタンパクを折りたたむた
   めの生体外方法。 １３、酸化チオレドキシンシャッフルアーゼのタンパク
   折りたたみ有効量が約３μＭないし約５０μＭである、
   特許請求の範囲第１２項による方法。 １４、方法が約７．０ないし約１１．０のｐＨで行なわ
   れる、特許請求の範囲第１２項による方法。 １５、ジスルフィド架橋を含有するタンパクがインシュ
   リン、プロインシュリン、牛すい臓リボヌクレアーゼ（
   ＲＮａｓｅ）、リゾチーム、牛すい液トリプシンインヒ
   ビター、インターフェロン、レンニン（キモシン）、プ
   ラズミノゲンアクチベーター、プロラクチン、ヒトα−
   １トリプシンインヒビター、及びファクター（因子）V
   IIIからなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１２項
   による方法。 １６、ジスルフィド架橋を含有するタンパクがＳ−スル
   ホン化型であり、チオレドキシンシャッフルアーゼが還
   元型である、特許請求の範囲第１２項による方法。 １７、ジスルフィド架橋を含有するタンパクがインシュ
   リン又はプロインシュリンである、特許請求の範囲第１
   ２項による方法。 １８、タンパクがスクランブルドプロテイン（ｓｃ−ｒ
   ａｍｂｌｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ）である、特許請求の範
   囲第１２項による方法。 １９、タンパクが粗製細胞抽出液中の組替え型タンパク
   である、特許請求の範囲１２項による方法。 ２０、折りたたまれていない還元型タンパクに、タンパ
   ク折りたたみ有効量のチオレドキシンシャッフルアーゼ
   とチオール酸化剤とを含む混合物を反応させることを含
   む、ジスルフィド架橋が還元されており、折りたたまれ
   ていないタンパクを折りたたむための生体外方法。 ２１、チオール酸化剤が酸化されたジチオスレイトール
   又はジチオエリスリトールである、特許請求の範囲第２
   ０項による方法。 ２２、チオレドキシンシャッフルアーゼのタンパク折り
   たたみ有効量が約３μＭないし約５０μＭである、特許
   請求の範囲第２０項による方法。 ２３、方法が約７．０ないし約１１．０のｐＨで行なわ
   れる、特許請求の範囲第２０項による方法。 ２４、ジスルフィド架橋を含有するタンパクがインシュ
   リン、プロインシュリン、牛すい臓リボヌクレアーゼ（
   ＲＮａｓｅ）、リゾチーム、牛すい液トリプシンインヒ
   ビター、インターフェロン、レンニン（キモシン）、プ
   ラズミノゲンアクチベーター、プロラクチン、ヒトα−
   １トリプシンインヒビター、及びファクター（因子）V
   IIIからなる群から選ばれる、特許請求の範囲第２０項
   による方法。 ２５、ジスルフィド架橋を含有するタンパクがＳ−スル
   ホン化型であり、チオレドキシンシャッフルアーゼが還
   元型である、特許請求の範囲第２０項による方法。 ２６、ジスルフィド架橋を含有するタンパクがインシュ
   リン又はプロインシュリンである、特許請求の範囲第２
   ０項による方法。 ２７、このタンパクがスクランブルドプロテインである
   、特許請求の範囲第２０項による方法。 ２８、タンパクが粗製細胞抽出液中の組替え型タンパク
   である、特許請求の範囲第２０項による方法。 ２９、チオレドキシンシャッフルアーゼが、ジチオール
   化合物の暗号のコドンがモノチオール化合物の暗号化の
   コドンに変更された場合の変異化大腸菌チオレドキシン
   遺伝子として特性づけられる、特許請求の範囲第１２項
   による方法。 ３０、システインの暗号コドンが他の１９のアミノ酸の
   任意のものの暗号のコドンに変更された、特許請求の範
   囲第２９項による方法。 ３１、暗号変更がセリンに対する暗号のコドンにへの変
   更である、特許請求の範囲第３０項による方法。 ３２、コドンの変更がコドン３５で行なわれる、特許請
   求の範囲第３１項による方法。