JP2013524799A - 組換えトロンビンの生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
非特許文献16は、大腸菌(Escherichia coli)におけるプレトロンビン−2の発現方法を、これに続く可溶化および折り畳みのための工程とともに開示している。折り畳まれた天然プレトロンビン−2の低い生成物収量が達成されたに過ぎない。真核生物発現系で達成される収量と比較して、非特許文献16に記載された方法は不利であることが分かる。非特許文献16に記載されている方法では、Triton(登録商標)X−100またはBrij(登録商標)−58などの界面活性剤が用いられる。
本発明は、上記の欠点を克服する折り畳まれたプレトロンビンおよびトロンビンの生産方法を提供するという目的に基づく。
本明細書において、本方法は、折り畳まれたプレトロンビンおよびトロンビンを高収量かつ高純度で生産することを可能としなければならない。本方法は好ましくは原核生物発現系を用いるべきである。
驚くことにこの目的は特許請求の範囲に記載される方法によって達成される。
本発明は、折り畳まれたプレトロンビンまたはその誘導体を生産する方法であって、折り畳まれていないプレトロンビンまたはその誘導体を含む封入体が、少なくとも1種のカオトロピック化合物および少なくとも1種の有機ジスルフィド化合物を含む可溶化バッファー中で可溶化される方法を提供する。
R−SH + GSSG → R−S−S−G + GSH
RSSGは混合ジスルフィドと呼ばれる。RSSGはポリペプチドのさらなるシステインと反応し、結果として、2つのシステイン間にジスルフィド結合が得られる。
R−S−S−G + HS−R’ → R−S−S−R’ + GSH
グルタチオンは、サイトゾル内で酵素的に還元型(GSH)で維持される。従って、サイトゾル内で「還元状態」であるとみなされる。この状態は可溶化バッファー中で確立され、その結果、それが含むジスルフィド化合物は上記の反応に従ってジスルフィド結合の形成を触媒する。GSSGは、例えば10mM〜0.5Mの濃度で用いられる。
本発明の好ましい実施形態では、可溶化バッファーはTrisバッファーである。本発明の好ましい実施形態では、封入体内のタンパク質の−SH基と混合ジスルフィドを形成し得る試薬はGSSGであり、カオトロピック物質はグアニジニウム塩酸塩である。
本発明の好ましい実施形態では、折り畳み補助剤はアルギニンおよびグリセロールから選択される。タンパク質の折り畳みを促進する化合物は一般に、「折り畳み補助剤」として使用可能である。このような化合物は当業者に公知である。このような化合物は種々の方式で折り畳みを補助することができる。アルギニンは不適切な折り畳みの中間体を脱安定化し、これによりこれらは少なくとも部分的に折り畳みが再び解かれ(熱力学的閉塞状態から)、従って、再び適切に折り畳まれ得ると仮定される。他方、グリセロールは通常、タンパク質を安定化する。折り畳み補助剤を用いない方法に比べて、本発明の方法において折り畳まれたプレトロンビンの絶対収量を5%超、特に10%超または20%超(折り畳みに用いたプレトロンビンの総量に基づく)高める化合物が折り畳み補助剤として特に好適である。
復元は好ましくは、6〜12の間、特に7〜11の間のpHで行われる。
a)原核細胞での組換えプレトロンビンの発現およびプレトロンビン含有封入体の単離、
b)少なくとも1種のカオトロピック物質、および封入体中のタンパク質の−SH基と混合ジスルフィドを形成し得るジスルフィド化合物を含む好適な可溶化バッファーと封入体との混合、
c)過剰なジスルフィドの除去、
d)少なくとも1種の還元剤、折り畳み補助剤、および二価の陽イオンを含む好適な界面活性剤非含有バッファー中での復元、
e)復元されたプレトロンビンの精製、
f)活性型への切断、および
g)トロンビンおよび/またはα−トロンビンの単離および精製。
rh−プレトロンビン−2の発現に用いる細菌宿主大腸菌JM108(DSMZ 5585;F− thiΔ(lac−proAB) end A1 gyrA96 relA1 phx hsdR17 supE44 recA)はプロリン栄養要求性であり、この栄養要求性はpSCIL048と呼ばれるプラスミドを用いることで無効となった。プラスミドpSCIL048はプラスミドpSCIL008に基づくものである(国際公開第05/061716号参照)。この株はチアミンを合成できない(Vieira & Messing, 1982 Gene. Oct;19(3):259−68)。プレトロンビン−2はpSCIL048上にあるtacプロモーターの制御下で発現される。ここで用いたベクターpSCIL048は、カナマイシン耐性を有する高コピープラスミドである。発現は定義された無機塩培地で行い、IPTGの添加により誘導される。プレトロンビン−2はサイトゾル内に封入体(IB)の形態で堆積する。
実施例2:細胞の破壊と封入体(IB)の調製
目的タンパク質プレトロンビン−2の発現はIBの形態で起こる。細胞の破壊とIBの調製は標準プロトコールに従って行い、実験室規模でおよそ200gのバイオマスまで増やすことができる。
実施例3:可溶化と復元
本発明の至適化された復元プロトコールで、混合ジスルフィドに基づいて再折り畳みを行った。
実施例4:プレトロンビン−2の精製
ダイアフィルトレーションの手段による交換の際には比較的高い収量損失が起こったことから、代わりに硫酸アンモニウムを添加した(好ましくは、終濃度1.15M)。沈殿を遠心分離の手段により分離し、上清をHICカラム(好ましくは、フェニルセファロースHP、GEヘルスケア社)に適用し、次いで、所望のバッファーにてプレトロンビンを溶出させた。
実施例5:プレトロンビンの活性化
プレトロンビン−2の活性化によるα−トロンビンの獲得は、プレトロンビン−2のA鎖とB鎖の間(Arg320−Ile321)のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテアーゼ、エカリンを用いて行った。このようにして形成されたトロンビンから、その固有のN末端の自己触媒的切り離しによりα−トロンビンが形成される。この切断条件は、最小可能エカリン要求で最大切断収率が達成されるように選択した。これに関して、振動インキュベーターにて、37℃、600rpmにて24時間内に、1Uのエカリンで、2,000μgのプレトロンビン−2(0.5〜0.8mg/ml)が切断された。反応は、EDTAを終濃度25mMとなるように添加することにより停止させた。切断後、沈殿したタンパク質が見られたので、この溶液を濾過(0.2μm)した後に、クロマトグラフィーによる精製を行った。切断収率は、沈殿の量によって、70%〜90%の間であった。
実施例6:α−トロンビンの精製
濾過したエカリン切断バッチをクロマトグラフィー精製のための出発材料として用いた。この精製の目的は、宿主細胞タンパク質の分離の他、とりわけ、切断されていないプレトロンビン−2の、およびα−トロンビンの自己触媒的切断産物の除去であった。エカリン切断の際、プレトロンビン−2は95%を超える純度で存在する。切断産物の除去のより良い検討のために、これらを、切断バッチを37℃でさらに24時間インキュベートすることにより濃縮した。
結果:
大腸菌においてrh−トロンビンを生産するための本発明の方法では、文献に記載されている収率を顕著に超えている。例えば、真核生物発現系における天然プレトロンビン−2に関して文献に記載されている生成物収量は25〜200mg/l発酵培地の間である(非特許文献14、15)。
Claims (13)
- 折り畳まれたプレトロンビンまたはその誘導体を生産する方法であって、折り畳まれていないプレトロンビンまたはその誘導体を含む封入体が、少なくとも1種のカオトロピック化合物および少なくとも1種の有機ジスルフィド化合物を含む可溶化バッファー中で可溶化され、続いて、可溶化されたプレトロンビンまたはその誘導体が少なくとも1種の還元剤、少なくとも1種の折り畳み補助剤、および二価の陽イオンを含む復元バッファー中で復元され、可溶化バッファーおよび復元バッファーは共に界面活性剤を含まない方法。
- ジスルフィド化合物がグルタチオンジスルフィドである、請求項1に記載の方法。
- カオトロピック化合物がグアニジニウム塩、特に、グアニジニウム塩酸塩およびグアニジニウムチオシアン酸塩、ヨウ化物、バリウム塩、チオシアン酸塩、尿素および過塩素酸塩から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 封入体が原核細胞におけるプレトロンビンまたはその誘導体の組換え発現によって得られたものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 還元剤が有機モノスルフィドである、請求項1に記載の方法。
- 折り畳み補助剤がアルギニンおよびグリセロールから選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 折り畳みがパルス復元法で行われる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 復元されたプレトロンビンまたは誘導体がクロマトグラフィーにより精製される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 精製が疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)により行われる、請求項8に記載の方法。
- トロンビンおよびα−トロンビンの少なくともいずれか一方、またはそれらの誘導体を生産する方法であって、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法に従って生産された復元プレトロンビンが、特にエカリンを用いた酵素的タンパク質分解によりトロンビンおよびα−トロンビンの少なくともいずれか一方、またはそれらの誘導体に変換される方法。
- トロンビンおよびα−トロンビンの少なくともいずれか一方、またはそれらの誘導体がタンパク質分解後にクロマトグラフィーにより精製される、請求項10に記載の方法。
- 精製が疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)により行われる、請求項11に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法により得られる、折り畳まれたプレトロンビン、折り畳まれたトロンビンおよび折り畳まれたα−トロンビンの少なくともいずれか一方、またはそれらの誘導体を含む溶液。
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