CN102858972A - 生产重组凝血酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于生产折叠凝血酶原的方法，其中将含有未折叠的凝血酶原或其衍生物的包涵体溶解在溶解缓冲液中，该溶解缓冲液包含至少一种离液化合物和至少一种有机二硫化物化合物。本发明还涉及生产凝血酶和α-凝血酶及其衍生物的方法。本发明还涉及包含可通过根据本发明的方法生产的折叠蛋白的溶液。

Description

生产重组凝血酶的方法

技术领域

本发明提供从包涵体（inclusion body）中生产折叠的凝血酶原（prethrombin）和凝血酶的方法。本发明也提供包含可通过本发明所述的方法生产的折叠蛋白的溶液。

背景技术

凝血级联的中心酶是丝氨酸蛋白酶，其在肝脏中合成为稍微更大的无活性的前体，称为酶原。它们包括凝血酶原，凝血酶的无活性前体，其也被称为因子II。凝血酶在凝血级联和纤维蛋白溶解中起重要作用。在凝血中的重要作用使得感兴趣的凝血酶在人类医疗中得以使用。它被用作药物已有一段较长时间，例如为了尽可能迅速地愈合伤口（Zymogenetics,Inc."Annual Report on Form 10-K For the Year Ended December 31,2003"2003;Nakajima et al.Ann.Thorac.Surg.200579:1793-1794）。

除此之外，凝血酶也参与了许多其他过程。因此，其例如启动凝血酶原激活的中止以及纤维蛋白溶解的起始（Esmon&Jackson Journal ofBiological Chemistry.1974249(24):7791-7797）。此外各种各样的研究显示凝血酶参与了胚胎发育、致癌作用、血压调节、阿尔茨海默病（老年痴呆症）和伤口愈合过程（Grand et al.Biochemical Journal."1996313(2):353-368;Tsopanoglou&Maragoudakis Journal of Biological Chemistry.1999274(34):23969-23976）。因为它的高度多官能度，凝血酶是一种用于医学和生物技术使用的非常有意义的活性化合物。它被用于融合蛋白的裂解，因此被用于纯化和检测标签的除去（Jenny et al.,Protein Expression andPurification,200331(1):1-11.）。

基于其与其他蛋白酶的同源性，例如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶，凝血酶被分配到丝氨酸蛋白酶类。丝氨酸蛋白酶共有相同的催化机制。丝氨酸蛋白酶的活性中心的特征在于它们典型的催化三联体丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸盐。凝血酶由两条链组成，A链和B链，它们通过二硫桥相互连接在一起。凝血酶较短的A链没有显示出与胰脏的酶，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶共同的特征。另一方面，这些丝氨酸蛋白酶的B链，其此外有三个分子内的二硫桥，它们几乎没有不同（Bode et al.ProteinScience.19921(4):426-471.Stubbs&Bode Thrombosis Research.199369(1):1-58Stubbs&Bode Trends Biochem Sci.1995Jan;20(l):23-8.Review.Erratum in:Trends Biochem Sci 1995Mar;20(3):131）。像所有的丝氨酸蛋白酶一样，凝血酶也基本上由2个6链β-折叠片组成，其每一个卷在一起形成筒样结构。V形A链在一个通过在活性中心对侧的较大B链凹陷进去的槽内运动。

相关的酶原凝血酶原（72kDa）由Gla域、2个卷曲域以及A链和B链组成（Hiller 2003,Dissertation to obtain a sciences doctorate degree of theUniversity of Bielefeld,Butenas&Mann Biochemistry,Moscow，RussianFederation,2002,67(1):3-12）。A链和B链两条链通过二硫桥在活性蛋白中连接在一起。凝血酶原在Arg₂₇₁-Thr₂₇₂之间和Arg₃₂₀-Ile₃₂₁之间由凝血酶原复合体使其裂解。因此N端被移去，且A链和B链相互分离开。依赖于这种活化的序列，形成了各种中间产物，蛇毒凝血酶（meizothrombin）和凝血酶原-2（ et al.Journal of Biological Chemistry,1986261:4224-4228.）。

重组凝血酶（rh-凝血酶）作为一种活性化合物使用是一种适当的可供选择的方法，以替代现在市场上从牛和人类血浆中获得的产品。一方面，使用rh-凝血酶能使感染性的疾病，例如，HIV和乙型肝炎的传播风险降至最低。另一方面，在人类中几乎没有预期到免疫反应，因为它是一种和内生的α-凝血酶具有非常类似特征的活性化合物。此外，与传统的过程相比较，重组产品预期会降低相当高的费用，因为通常高细胞密度发酵过程可以达到非常高的产量。

文献中描述了在真核和原核细胞中各种重组生产α-凝血酶的方法。在大多数方法中α-凝血酶是从非活性的前体分子凝血酶原-2中获得的，凝血酶原-2在第一步色谱纯化后被金属蛋白酶蛇静脉酶（ecarin）激活（Russoet al.,1997,Protein Expr.Purif.,10(2):214-25;Yonemura et al.,2004,J.Biochem.(Tokyo),135(5):577-82;Soejima et al.,Journal of Biochemistry,2001,130(2):269-277）。例如，ZymoGenetics公司已经开发了一种在真核CHO细胞中生产rh-凝血酶的生产过程，其中凝血酶原-1被用作起始的前体分子。

在哺乳动物细胞中生产重组蛋白通常是昂贵的、耗时的，并产生中等产品产量。在已知的真核发酵过程中，达到发酵培养基中从25到140mg/l的产量。在这种情况下，目标蛋白凝血酶原-2分泌到培养基中（Russo et al.1997,Yonemura et al.2004）。

为了改善这些关键参数，原核生物的生产是可选的。

Soejima et al 2001年公开了一种在大肠杆菌（E.Coli）中表达凝血酶原-2及其随后溶解和折叠步骤的方法。只达到低产量的折叠的天然凝血酶原-2。与在真核表达系统中达到的产量相比，Soejima et al.2001描述的方法证明是不利的。在Soejima et al.,2001描述的方法中使用了洗涤剂（detergent），例如，Triton X-100或Brij-58。

JP 2002306163公开了一种生产折叠的凝血酶的方法。该方法包括，在大肠杆菌中的表达、包涵体的获得及其在增溶缓冲液中的溶解。此外，使用了洗涤剂，例如，吐温（Tween）、Brij或Triton。

发明内容

发明目的

本发明基于提供一种生产折叠的凝血酶原和凝血酶的方法的主题，该方法克服了上述的不利性。

本发明特别基于开发一种生产凝血酶原和凝血酶的主题，该方法易于实施且可达到高产量。

在这种背景下，该方法应该使生产高产量和高纯度的折叠的凝血酶原和凝血酶成为可能。该方法应该优选使用原核表达系统。

发明主题

通过根据权利要求所述的方法，令人惊讶地，达到了该目的。

本发明提供了一种生产折叠的凝血酶原或其衍生物的方法，其中包含未折叠的（non-folded）凝血酶原或其衍生物的包涵体溶解在增溶缓冲液（solubilization buffer）中，该增溶缓冲液包含至少一种离液化合物（chaotropic compound）以及至少一种有机二硫化物化合物。

根据本发明的方法用于生产和纯化人类凝血酶原。优选使用凝血酶原-2。该蛋白有309个氨基酸且分子量为35,485.5Da。其氨基酸序列如图3所示。人类凝血酶原能被裂解产生α-凝血酶，其有295个氨基酸且分子量为33,810.7Da。其序列及A链和B链如图4所示。

根据本发明，凝血酶原的衍生物也能被使用。它们是加工形式具有凝血酶样活性，特别是蛋白酶活性的衍生物。凝血酶原的衍生物是相应的前体多肽，通过蛋白酶切可以从其中获得活性的凝血酶衍生物。这些衍生物特别是那些可以通过氨基酸突变、缺失或插入或通过多肽的化学修饰获得的那些。优选地，这些衍生物的序列和野生型蛋白的同一性超过80%、超过90%或超过95%。这些衍生物每条多肽链至少有一个半胱氨酸，但是优选所有天然的半胱氨酸。本领域的技术人员能够明白根据本发明的方法通常也可以用凝血酶原的衍生物得以实施。前体肽（prepeptide）折叠和裂解后，获得凝血酶或α-凝血酶相应的衍生物。下列关于方法以及提及其凝血酶原、凝血酶和α-凝血酶的说明可以同样地应用于这些多肽的衍生物上。因此，在下面的一般性解释中，术语“凝血酶原”等同于“凝血酶原或凝血酶原的衍生物”。这同样适用于凝血酶和α-凝血酶。

在根据本发明的方法中，包涵体被增溶。包涵体（IB）是通常有缺陷的或不完全折叠的蛋白的积聚物。它们在细胞内部形成，例如细菌细胞，例如大肠杆菌，在重组蛋白过量表达的情况下。根据本发明使用的包涵体优选包含高纯度的折叠凝血酶原。这意味着它们包含至少60、至少70、至少80、至少90wt.%的凝血酶原（基于蛋白的总量）。

增溶缓冲液包含一种二硫化物化合物。该二硫化物化合物能够在包涵体中形成具有多肽的半胱氨酸的硫醇基团（-SH）的混合二硫化物。将这种二硫化物加入到溶液中。该二硫化物不指明包涵体包含的蛋白，以及可能包含二硫桥的蛋白。优选地，该二硫化物不是一种真正的肽。优选地，该二硫化物是一个低分子量的化合物。分子量，例如，低于2000g/mol或者低于1000g/mol。使用的二硫化物，例如，浓度为5mM到1M，特别是10mM到0.5M。

在本发明的优选的实施例中，该二硫化物化合物是谷胱甘肽二硫化物，谷胱甘肽（GSH），也叫γ-L-谷氨酰基-L-半胱氨酸甘氨酸，是一种假三肽（pseudo-tripeptide），其是由三个氨基酸，谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸形成的。GSH存在于原核生物和真核生物的细胞质中，并参与二硫桥的形成。它与包含二硫桥的二聚物GSSG相平衡。谷胱甘肽与半胱氨酸R-SH和R'-SH反应，其来自于两个多肽或来自于二硫化物交换反应中的一个单一的多肽：

R-SH+GSSG→R-S-S-G+GSH。

RSSG叫做混合的二硫化物。其进一步与多肽的半胱氨酸反应，所以结果在两个半胱氨酸之间获得二硫桥：

R-S-S-G+HS-R'→R-S-S-R'+GSH。

在细胞溶质中谷胱甘肽以还原形式（GSH）酶促（enzymatically）保存。因此涉及到细胞溶质中的“还原条件”。在增溶缓冲液中建立了该条件，因此其包含的二硫化物化合物按照上述反应催化二硫桥的形成。使用GSSG，例如，浓度为从10mM到0.5M。

增溶缓冲液包含至少一种离液物质。溶解水中有序（ordered）氢桥键接的化学物质叫做离液（物质）（chaotropic）。因为氢桥键接被破坏打开，所以离液物质干扰水的结构，并保证其杂乱状态（增加了熵）。其原因是阻碍对于溶剂化作用所必须的H₂O笼结构（cage structure）的形成。在氨基酸的情况下，它们减少了疏水效应并在蛋白上产生变性作用，因为蛋白折叠的驱动力是疏水氨基酸在水中聚集到一起。通常，能够在增溶缓冲液中施加疏水效应，并因此在蛋白上产生变性作用的任何物质，都可以作为离液物质使用。离液物质通常是盐或低分子量的化合物，例如脲。离液物质明显不同于洗涤剂，因为它们在分子中不包含疏水基团，例如烷基基团。通常，离液作用伴随着蛋白溶解度的增加，凝血酶原就是这样。

在本发明优选的实施例中，离液化合物选自胍盐，特别是盐酸胍和硫氰酸胍，碘化物、钡盐、硫氰酸盐、脲和高氯酸盐。

离液化合物以常规的量使用。例如，使用4到8M盐酸胍或4到9M脲。

在本发明优选的实施例中，溶解缓冲液是一种Tris缓冲液。在本发明优选的实施例中，在包涵体中能和蛋白的-SH基团形成混合的二硫化物的试剂是GSSG，且离液物质是盐酸胍。

增溶缓冲液还可包含常规的添加剂，例如EDTA或者盐。增溶缓冲液的pH值，例如，在6和11之间，优选7和10之间。增溶作用优选机械地辅助，例如利用常规的均化装置（homogenization apparatuses）或凭借超声作用。增溶后，优选将剩余的固体分离开。上清液中包含增溶的凝血酶原。

在本发明优选的实施例中，通过在原核细胞中凝血酶原的重组表达已经获得包涵体。在本发明优选的实施例中，原核宿主细胞是一种细菌，优选大肠杆菌。在本发明优选的实施例中，细菌是大肠杆菌JM108（DSMZ5585;3.3.2006），优选用来源于pSCIL008的质粒转化。

优选地，增溶作用后除去过量的二硫化物化合物。优选使用缓冲交换的方法实施试剂的除去，就是通过透析、色谱或者切向流动过滤。

在本发明优选的实施例中，增溶的凝血酶原在复性缓冲液中复性，该复性缓冲液包含至少一种还原剂（reducing agent），至少一种折叠助剂（folding assistant）和二价阳离子。在本发明优选的实施例中，在若干天内溶解物以若干个部分或连续地加入到折叠批量（folding batch）中。优选地，以“脉冲复性”（“pulse renaturing”）通过迅速稀释溶解物加入溶解物。在这种情形下，例如，在24小时的时间间隔中能完成6次脉冲（pulse）。脉冲数可以设置以致在加入增溶批量（solubilization batch）之后，尚未折叠的蛋白的浓度不是太高，因为否则会获得聚集物。例如，每一次脉冲大约0.1g/l蛋白重新转入到折叠批量中（基于加入增溶质（solubilisate）后折叠批量中的蛋白浓度）。因此，在折叠批量中达到蛋白终浓度0.6g/l。

在本发明优选的实施例中，还原剂是一种有机一硫化物。这里优选使用谷胱甘肽（GSH）。GSH/GSSG的混合物也可以被使用。

在本发明优选的实施例中，折叠助剂从精氨酸和甘油中选择。能促进蛋白折叠的化合物通常能被当作“折叠助剂”使用。这些化合物已为本领域技术人员所熟知。它们能以各种各样的方式帮助折叠。假定精氨酸扰动不正确折叠的中间产物，以致它们至少又部分展开（unfold）（从热力学的盲端），且从而能再一次被正确地折叠。另一方面，甘油通常稳定蛋白。与没有使用折叠助剂的方法比较，在根据本发明所述的方法中，增加折叠的凝血酶原的绝对产量超过5%，特别是超过10或超过20%（基于用于折叠的凝血酶原的总量）的化合物，特别适合用作折叠助剂。

复性缓冲液包含二价阳离子。优选使用钙盐，特别是氯化钙。复性缓冲液优选Tris缓冲液。

优选在pH 6和12之间实施复性，特别是7和11之间。

在优选的实施例中，生产折叠的凝血酶原或其衍生物的方法包括下面的步骤：包含未折叠凝血酶原或其衍生物的包涵体增溶（溶解）在包含至少一种离液化合物和至少一种有机二硫化物化合物的增溶缓冲液中，溶解的凝血酶原或其衍生物然后在复性缓冲液中复性，该复性缓冲液包含至少一种还原剂、至少一种折叠助剂和二价阳离子，增溶缓冲液和复性缓冲液都不包含洗涤剂。

在本发明优选的实施例中，增溶缓冲液和/或复性缓冲液因此不含有洗涤剂。根据本发明，已经发现对于增溶和/或折叠凝血酶原，洗涤剂的使用是不必须的。这是有利的，因为某些洗涤剂是相对活泼（侵入性，aggressive）的化学物质，药物产品不应该或应该只包含少量，因此必须以昂贵的方式除去。与Soejima et al.,2001的方法相比，根据本发明的方法因此是有利的，在Soejima et al.,2001的方法中使用了这些活泼的洗涤剂（Triton X-100或Brij-58）用以折叠蛋白。

优选的没有洗涤剂，不仅涉及上面提到的增溶缓冲液和复性缓冲液，而且涉及使用的所有试剂和方法步骤。换句话说，根据本发明在整个生产方法中没有使用洗涤剂，因此生产方法是无洗涤剂的。这涉及两个方面，折叠的凝血酶原的生产和来自这个折叠的凝血酶原的凝血酶的生产。

用根据本发明的方法令人惊讶地达到了高复性产率（复兴率）。例如，基于包涵体中的总凝血酶原，已使达到多达25%的复性产率成为可能。优选地，达到至少10%或至少20%的复性产率。蛋白终浓度可能是，例如，0.6g/l。优选在0.1和2g/l之间，特别高于0.3g/l，以避免在生产中大的折叠量（folding volume）。

通过实施具有增溶作用和随后的复性的根据本发明的方法，获得了折叠的凝血酶原的水溶液。该折叠的凝血酶原随后通过已知的方法进一步纯化。

根据本发明已经发现色谱纯化，特别是用疏水相互作用色谱法，特别有利于进一步的纯化。使用的柱子可以是，例如，来自GE Healthcare的苯基琼脂糖凝胶HP。优选在存在硫酸铵的情况下实施HIC色谱，优选在高盐缓冲液中浓度为1.15M。在这些条件下已经发现在通过逐级梯度的洗提（洗脱）中可达到从75到95%的产量。

优选地，不通过基于水蛭素的亲和色谱法实施纯化。优选地，在本发明的方法中没有纯化步骤是用基于水蛭素的亲和色谱法实施的。

优选地，复性的凝血酶原通过酶促蛋白水解转变为凝血酶，特别是通过小的毒液蛋白酶，优选蛇静脉蛋白酶。丝氨酸蛋白酶蛇静脉蛋白酶在凝血酶原-2的精氨酸320和异亮氨酸321位置上裂解开A和B链之间的肽键。以这种方式形成的凝血酶通过自身催化的固有N端的分离而变为α-凝血酶。在根据本发明的方法中，如果温育时间充足，从而凝血酶作为中间产物获得，且α-凝血酶作为终产物。如果自身催化的裂解不完全，获得凝血酶和α-凝血酶的混合物。在下面，术语“凝血酶”也表示这种混合物。与蛇静脉蛋白酶有类似功能的蛋白酶也可以用于蛋白酶切。优选地，使用的蛋白酶浓度小于2U/ml，优选小于1U/ml或小于0.5U/ml。

优选地，在蛋白水解后，凝血酶和/或α-凝血酶通过色谱法纯化。优选地，通过疏水相互作用色谱（HIC）实施纯化。在加工过程期间由α-凝血酶引起的自溶产物的形成被证明是关键的，在凝血酶原-2活化之后，该自溶产物在相对较长的贮藏过程中能自发地形成。通过离子交换色谱（IEX）消耗这些产物相关的杂质被证明是困难的，因为α-凝血酶的pI值和它的自溶产物（autolysis product）几乎是一样的。如果相反使用疏水相互作用色谱（HIC），观察到显著更有利的消耗（耗尽）效应。因此，根据本发明优选通过HIC对在复性后折叠的凝血酶原上以及在凝血酶原蛋白酶切后的凝血酶实施纯化。通常，通过HIC纯化在水溶液中裂解的凝血酶原或者在水溶液中的凝血酶或α-凝血酶提供了优势，其不限于从具有如权利要求1所述特征的包涵体中生产折叠的凝血酶原的本发明的具体方法。因此本发明也一般性地提供了利用HIC对包含折叠的凝血酶原或凝血酶或α-凝血酶的水溶液的纯化。

在本发明优选的实施例中，除了使用HIC纯化获得的凝血酶之外，实施了进一步的色谱纯化步骤。优选使用离子交换色谱（IEX）。通过这种手段，DNA和宿主细胞蛋白（HCP）中内毒素的含量可降至最低。

活性化合物的过滤以及随后的浓缩可以排在加工工艺的最后。然而，也可以使用其他已知的方法来另外增加凝血酶的纯度和浓度。

关于α-凝血酶储存稳定性的研究显示，添加氨基酸和盐可以抑制自溶，并同时能保证4°C下至少3个月α-凝血酶的稳定性。

在本发明优选的实施例中，根据本发明的方法包括下面的步骤：

a）在原核细胞中表达重组凝血酶原，以及分离包含凝血酶原的包涵体，

b）混合包涵体与包含至少一种离液物质和二硫化物化合物的合适的增溶缓冲液，其能与包涵体中蛋白的-SH基团形成混合的二硫化物，

c）除去过量的二硫化物，

d）在包含至少一种还原剂、折叠助剂和二价阳离子的合适的无洗涤剂的缓冲液中复性，

e）复性的凝血酶原的纯化，

f）裂解为活性形式，以及

g）分离和纯化凝血酶和/或α-凝血酶。

在本发明优选的实施例中，在步骤b）中，包涵体以1:4到1:19的比例（1g IB糊剂+4ml增溶缓冲液）与合适的缓冲液混合，该缓冲液pH在中性到碱性的范围内，包含10mM到0.5M GSSG、4到8M盐酸胍（GuaHCl）和0.1到10mM EDTA。

在本发明优选的实施例中，在步骤b）中，包涵体以1:9的比例与合适的缓冲液混合，该缓冲液pH在中性到微碱性的区域内，包含0.12M GSSG、5M盐酸胍（GuaHCl）和1mM EDTA。

在本发明优选的实施例中，在步骤c）中，通过缓冲液变化，在3到8M，优选5M盐酸胍，酸性pH（pH3.0）下，除去用于形成混合的二硫化物的过量试剂。

在本发明优选的实施例中，在步骤d）中，在合适的无洗涤剂的缓冲液中用0.01到1.0g/l蛋白（基于每次脉冲折叠批量中的蛋白浓度）实施脉冲复性，该缓冲液pH在中性到微碱性，包含0.1到3mM GSH、0.1到2M精氨酸、0.001到1M CaCl₂、0.1到50mM EDTA和1到40%甘油。

在本发明优选的实施例中，步骤d）的实施是通过在合适的无洗涤剂的缓冲液中迅速稀释0.1g/l增溶质，该缓冲液pH在中性到微碱性，包含0.75mM GSH、1M精氨酸、50mM CaCl₂、1mM EDTA和20%甘油，折叠批量中蛋白浓度以每脉冲0.1g/l增加，以每种情况24h的间隔完成6次脉冲。

本发明描述了一种在工业规模上生产凝血酶的新的原核生物方法，其与已知方法相比，凝血酶原的产量增加了若干倍，且因此显著地降低了花费和成本。特别是通过新颖的增溶和复性方法，达到了产量的增加。

附图说明

图1：显示在SDS-PAGE胶上复性后凝血酶原-2的纯度，凝血酶原-2的复性是通过脉冲复性方法实施的，直至蛋白终浓度为0.6g/l。达到复性产率直至25%。在考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE上显示了复性批量。

图2：显示通过疏水相互作用色谱（Toyopearl Butyl-650S）纯化α-凝血酶。过滤的蛇静脉蛋白酶裂解批量（4.5ml+4.5ml高盐缓冲液：2M硫酸铵、50mM磷酸缓冲液pH 6.0）在4ml HIC柱子（Tricorn 5/200）上纯化。采用20CV下直至50mM磷酸盐缓冲液pH 6.0的线性梯度，用50%高盐缓冲液和洗提液进行平衡。

图3：显示凝血酶原-2的氨基酸序列、结构和重要特性。

图4：显示α-凝血酶的氨基酸序列、结构和重要特性。

具体实施方式

实例1：rh-凝血酶原-2的表达

用于表达rh-凝血酶原-2的细菌宿主大肠杆菌JM108（DSMZ 5585;F-thiΔ(lac-proAB)end AI gyrA96relAl phx hsdRl7supE44recA）是脯氨酸营养缺陷型的，通过使用命名为pSCIL048的质粒使其中和。质粒pSCIL048基于质粒pSCIL008（见WO05061716）。这个品系不能合成硫胺（Vieira&Messing,1982Gene.Oct;19(3):259-68）。凝血酶原-2在位于pSCIL048上的tac启动子的控制下表达。这里使用的载体pSCIL048是具有卡那霉素抗性的高拷贝质粒。在规定的矿物盐培养基上实施表达，并通过添加IPTG诱导表达。凝血酶原-2以包涵体（IB）的形式沉积在细胞溶质（cytosol）中。

生物量（生物质）生产在37°C实施。该发酵的目的是为了为随后的工艺步骤获得产品和生物量。为了监测发酵过程中目标蛋白的过量表达，在诱导前后使用SDS-PAGE分析样品。一直到诱导后3个小时观察到蛋白浓度的生物量特异性增加。

实例2：细胞裂解和包涵体（IB）的制备

目标蛋白凝血酶原-2的表达以IB的形式发生。细胞的裂解和IB的制备是根据标准的协议实施的，且能在实验室规模上进行，一直到逐步发展为大约200g的生物量。

实例3：溶解和复性

根据本发明在优化的复性方案中，再折叠（重折叠）是在混合的二硫化物的基础上实施的。

为了制备混合的二硫化物，使IB以1g IB+9ml溶解缓冲液的比例均质化，溶解缓冲液具有5M GuaHCl、0.1M Tris-HCl、1mM EDTA、0.1M GSSG pH 8.5，并在RT下溶解3小时。50,000x g离心30min后，在5M GuaHCl、1mM HCl pH 3.0实施再缓冲步骤以分离出游离的GSSG/GSH混合物。

50,000x g离心30min后（可选的），在5M GuaHCl（3到8M）、1mMHCl pH 3.0（如果增溶质随后没有直接加入到折叠批量中，酸性pH是重要的）实施再缓冲步骤以分离出游离的GSSG/GSH混合物。

通过在折叠缓冲液（folding buffer）中快速稀释增溶质实施脉冲复性，折叠缓冲液为1M精氨酸、50mM Tris、50mM CaCl₂、1mM EDTA、20%甘油、0.75mM GSH pH 8.5，优选在24h的时间间隔内完成直到6次脉冲。每次脉冲0.1g/l蛋白重新转入到折叠批量中（基于加入增溶剂后折叠批量中的蛋白浓度）。在折叠罐（folding tank）中达到蛋白终浓度0.6g/l。

图1显示了复性后产物的纯度。通过这种方法，基于导入到折叠批量中的增溶质的量，可达到25%的复性产率。

实例4：凝血酶原-2的纯化

因为在使用过滤的交换期间损失了相对高的产量，因此代替加入硫酸铵（优选终浓度为1.15M）。沉淀的沉淀物通过离心分离开，且上清液应用到HIC柱上（优选苯基琼脂糖凝胶HP，GE Healthcare），从而然后在期望的缓冲液中洗提凝血酶原。

实例5：凝血酶原的激活

凝血酶原-2激活产生α-凝血酶使用丝氨酸蛋白酶蛇静脉蛋白酶实施，其特异性地裂解凝血酶原-2的A和B链之间（Arg₃₂₀-Ile₃₂₁）的肽键。来源于以这种方式形成的凝血酶，α-凝血酶是通过自催化分离的固有N端而形成的。选择裂解的条件以致用最低可能的蛇静脉蛋白酶需要而达到最高的裂解产量。

在这种情形下，在37°C、600rpm的震动温床上，2,000μg凝血酶原-2（0.5-0.8mg/ml）用1U蛇静脉蛋白酶裂解24h。通过加入EDTA至终浓度为25mM终止该反应。裂解后，观察到沉淀的蛋白，且因此在用色谱纯化之前过滤溶液（0.2μm）。裂解产率在70%和90%之间，这依赖于沉淀物的量。

实例6：α-凝血酶的纯化

过滤的蛇静脉蛋白酶裂解批量用作通过色谱纯化的起始原料。除了分开宿主细胞蛋白之外，纯化的目的是，消耗上面所有未裂解的凝血酶原-2和自催化的α-凝血酶裂解产物。在蛇静脉蛋白酶裂解时，凝血酶原-2以超过95%的纯度存在。为了更好地调查裂解产物的消耗，通过37°C温育裂解批量而再浓缩其24h。

通过离子交换色谱分离凝血酶衍生物证明是困难的，因为它们有几乎相等的pI值（pI~9）。α-凝血酶的pI值以及它的自溶产物是通过2D凝胶电泳实验确定的。除了阳离子交换材料之外，疏水相互作用色谱材料因此被测试。

图2显示在4ml HIC柱（Toyopearl Butyl-650S）上纯化的色谱。为此，应用到柱之前，4.5ml过滤的蛇静脉蛋白酶裂解批量用高盐缓冲液（2M硫酸铵、50mM磷酸盐缓冲液pH 6.0）1:1稀释。20CV下，通过线性梯度（以50%高盐缓冲液起始）至50mM磷酸缓冲液pH 6.0，实施洗脱。为了调查纯化的结果，在色谱过后直接加入PMSF到主要组分（fraction）中，直至终浓度为1mM，从而抑制进一步的自溶。总共，在主峰的α-凝血酶的产量为65%（由UV₂₈₀确定）。

结果：

根据本发明在大肠杆菌中生产rh-凝血酶原的方法中，其显著超过了文献中描述的产量。因此，文献中描述的真核表达系统中天然凝血酶原-2的产物产量为25和200mg/l发酵培养基之间（Russo et al.1997,Yonemuraet al.2004）。

相比之下，根据本发明达到的天然凝血酶原-2产量为400mg/l发酵培养基。达到了具有至少95%rp-HPIC纯度的200mg/l发酵培养基的α-凝血酶产量。而且，使用的原核表达系统比已知的真核方法更容易建立。

在由Soejima et al.,2001描述的原核方法中，复性后达到了4-7%的凝血酶原-2的折叠产量。在根据本发明提出的方法中，另一方面，获得了25%的折叠产量。使用的折叠批量的容积（volume）也得到减小（增加了折叠中的蛋白浓度）。

Claims (13)

1.用于生产折叠的凝血酶原或其衍生物的方法，其中将包含未折叠的凝血酶原或其衍生物的包涵体溶解在包含至少一种离液化合物和至少一种有机二硫化物化合物的增溶缓冲液中，并且增溶的凝血酶原或其衍生物然后在复性缓冲液中复性，所述复性缓冲液包含至少一种还原剂、至少一种折叠助剂和二价阳离子，所述增溶缓冲液和所述复性缓冲液二者都不包含洗涤剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述二硫化物化合物是谷胱甘肽二硫化物。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述离液化合物选自胍盐，特别是盐酸胍和硫氰酸胍，碘化物，钡盐，硫氰酸盐，脲和高氯酸盐。

4.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述包涵体已通过在原核细胞中重组表达凝血酶原或其衍生物而获得。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述还原剂是有机单硫化物。

6.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述折叠助剂选自精氨酸和甘油。

7.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述折叠是以脉冲复性方法实施的。

8.根据上述权利要求中至少一项所述的方法，其中所述复性的凝血酶原或其衍生物是通过色谱法纯化的。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述纯化是通过疏水相互作用色谱（HIC）实施的。

10.用于生产凝血酶和/或α-凝血酶或其衍生物的方法，其中根据权利要求1到9中的任一项生产的所述复性的凝血酶原通过酶促蛋白水解转化为凝血酶和/或α-凝血酶或其衍生物，特别是利用蛇静脉酶。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述凝血酶和/或α-凝血酶或其衍生物在蛋白水解后通过色谱法纯化。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述纯化是通过疏水相互作用色谱（HIC）实施的。

13.包含折叠的凝血酶原、折叠的凝血酶和/或折叠的α-凝血酶、或其衍生物的溶液，所述折叠的凝血酶原、折叠的凝血酶和/或折叠的α-凝血酶、或其衍生物可通过根据上述权利要求中至少一项所述的方法获得。

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