JPH02200180A - タンパク質の精製法 - Google Patents

タンパク質の精製法

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JPH02200180A
JPH02200180A JP1259873A JP25987389A JPH02200180A JP H02200180 A JPH02200180 A JP H02200180A JP 1259873 A JP1259873 A JP 1259873A JP 25987389 A JP25987389 A JP 25987389A JP H02200180 A JPH02200180 A JP H02200180A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト成長ホルモン、ヒトプロティンＣおよび凝固因子■
等を包含する、多数の、ヒトおよびその他の哺乳動物タ
ンパクが、これらのタンパクをコードしているＤＮＡで
宿主細胞をトランスフェクトし、その組換え細胞をタン
パクの発現に適切な条件下で増殖させることによって、
これらの細胞中で生産されている。グリンネル等（Ｇｒ
ｉｎｎｅｌｌ　ｅｔａｌ）は、バイオテクノロジー（Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　５：　１１８９−１１９
２（１９８７）に、ヒト腎細胞による組換えヒトプロテ
ィンＣ（ＨＰＣ）の発現を記載している。このタンパク
は細胞によって細胞培養培地に分泌され、培養培地およ
びその他の成分、例えば細胞排泄物、細胞残骸およびタ
ンパクまたは同様に培地に集積されるその他の物質等か
ら分離されなければならない。また、タンパクの生物学
的活性は保持されねばならないので、回収条件を、タン
パクの生物学的活性を保持し、同時に、培地中の不純物
からタンパクを効果的に分離するような、穏やかな条件
としなければならない。
純度はしばしば、考慮しなければならない重要事項であ
り、とりわけ医薬への応用のためには重要である。
細胞培養培地から生物学的に活性な形態のタンパクを回
収するには、多数の問題がある。例えば、所望のタンパ
クを、該タンパクを伴っているかもしれないホモローガ
スな生物学的に不活性なタンパクの様な、細胞培養培地
中の、他の非常に類似しているタンパクから分離しなけ
ればならない。
回収方法によって、高レベルの純度を有する生物学的に
活性な形態のタンパクを得るべきである。
ジョーンズ等（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ）は、米国特許
第４゜５１２．９２２号に宿主細胞の細胞質から屈折力
のあるタンパク（宿主細胞内で不溶性顆粒タンパクを形
成する輸送されないタンパク）を回収するための方法を
記載している。変性−再生タンパクの回収系を記載して
いる関連特許には、米国特許第４．５９９．１９７号、
第４．５１８．５２６号および第４．５１１．５０３号
がある。
ラウシュおよびメング（Ｒａｕｓｈ　ａｎｄ　Ｍｅｎｇ
）の米国特許第４．６７７．１９６号は、屈折体の形態
でもある、宿主細胞からのへテロジニアスな（ｈｅｔｅ
ｒｏｇａｎｏｕｓ）タンパクの回収を記載している。
ハング等（Ｈｕｎｇ　ｅｔ　ａＪ）の米国特許第４．７
３４゜３６２号は、タンパクを変性させ、次いで、再生
させて所望の生成物を得ることを含む、宿主細胞から組
換え屈折タンパクを回収するための方法を記載している
。
ヒト凝固因子■の回収および精製は、ブローズおよびマ
ジエラス（Ｂｒｏｓｅ　ａｎｄ　Ｍａｊｅｒｕｓ）によ
ってザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｉ旦５　：　１２４２−
１２４７（１９８０）に記載されている。彼らは、まず
、クエン酸バリウムにタンパクを吸着させ、クロマトグ
ラフィーによって分離することからなる方法を使用し、
ヒト血漿から約３０％の収率で因子■を精製した。
ビタミンに依存性タンパクは、止血の維持に関連のある
種類のタンパクである。ビタミンにへの依存は、タンパ
クの生合成の間に起こる。ヒトプロティンＣ（ＨＰＣ）
は、止血の維持に重要な役割を果たすビタミンに依存性
血漿糖タンパクである。
エズモン（ｃ，Ｔ、Ｅｓｍｏｎ）のサイエンス（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ）２３５　：　ｌ　３４８−１３５２（１９８
７）。
ＨＰＣにカルシウムイオン（ｃａ”つが結合すると、蛍
光放射分光学によって測定し得るＲＰＣの構造上の変化
を生じる。ジョンソン等（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔ　ａｌ）
のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、）、２５８　：　５５５４
５５６０（ｉ９８３）。構造変化は、アガロースゲル電
気泳動の様な電気的分野においてタンパクの移動パター
ンの相違によって測定される様な表面の荷電分布の変化
をもたらす。ステン７０（Ｓｔｅｎｆｌｏ、Ｊ、）のジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５１：３５５−３６３（１
９７６）。
本発明は、宿主細胞によって産生されたか、またはタン
パクをコードしているＤＮＡでトランスフオームまたは
トランスフェクトされた後の宿主細胞によって産生され
た、排出ビタミンに依存性タンパクを細胞培養培地から
回収および精製する方法を提供するものである。ビタミ
ンに依存性タンパクは、カルシウムイオンまたはバリウ
ムイオンの様な２価陽イオンと結合し、その結果、タン
パクの構造が変化したりタンパクの表面荷電が変化した
りする。本発明では、これらの変化を利用し、２価陽イ
オンの存在下で、種々の基質へのタンパクの結合親和性
を制御する。この方法は、タンパクのイオン的に変化し
た結合親和性に基づいてタンパクを分離するために、通
常のクロマトグラフィーを使用する。
本発明方法では、タンパクを含んでいる細胞培養培地を
キレート剤で処理し、内生の２価陽イオンを除去する。
培地を、これが強い親和性を有するイオン交換樹脂と接
触させる。次いで、タンパクに結合し、タンパク−陽イ
オン複合体として溶離する２価陽イオンを含有する溶液
で樹脂からタンパクを溶離する。次に、このタンパク−
陽イオン複合体を、陽イオンと結合する固定化キレート
剤を有する樹脂と接触させる。キレート樹脂は選択的に
陽イオンと結合し、この樹脂からタンパクのみが溶離す
る。次に、更に精製するために、タンパクを第２のイオ
ン交換樹脂と接触させる。タンパクを第２の陽イオン含
有バッファーで処理スると、タンパク−陽イオン複合体
が形成し、この複合体を疎水性樹脂と接触させる。タン
パク−陽イオン複合体は、疎水性樹脂に強く結合する。
次いで、樹脂と結合しているタンパクを、陽イオンと結
合するキレート剤で処理し、疎水性樹脂から高純度のタ
ンパクを溶出することができる。タンパクとタンパク−
陽イオン複合体間の結合差を利用し、各工程において９
０％以上の収率で、実質上純粋な生物学的に活性なタン
パクを回収するための、効率的でタンパクを変性させな
°い方法とすることができる。
第１図は、２価陽イオン結合タンパクの精製について本
発明方法を説明するフローチャートを示す。
第２図は、ＮａＣＱグラジェントを使用する、ファルマ
シア・モノＱ　（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　ＭｏｎｏＱ）
イオン交換樹脂からのヒトプロティンＣの溶出プロファ
イルを示す。
第３図は、ＣａＣＱ２グラジェントを使用する、ファル
マシア・モノＱイオン交換樹脂からのヒトプロティンＣ
の溶出プロファイルを示す。
第４図は、ＣａＣＱ２溶離バッファーおよび高ＮａＣ１
２／（ソファ−の両者を使用する、ファルマシア・７フ
ースト７　ａ　−Ｑ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆａｓｔ
　Ｆｌｏｗ　Ｑ）イオン交換樹脂からのヒトプロティン
Ｃの溶出プロファイルを示す。
ＨＰＣおよびその他のビタミンに依存性タンパクの大部
分は、Ｃａ”の様な２価陽イオンと結合する。タンパク
の結合部位の大部分は、修飾されたグルタミン酸残基で
あるらしい。オーリン等（Ｏｈｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、
１９８８、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６３　：　７
４１１−７４１７゜グルタミン酸残基が修飾される反応
は、ガンマカルボキシル化であり、これは、ミクロソー
ム酵素、ビタミンに依存性カルボキシラーゼによって行
われる翻訳後修飾である。ガンマカルボキシル化グルタ
メート（Ｇｌａ残基と呼ばれる）は、ビタミンに依存性
タンパクの生物学的活性に必要である。例えば、ＨＰＣ
の場合、タンパクを生物学的に活性（例えば、抗血栓活
性）にするために、ＲＰＣタンパク配列の最初の９個の
連続したグルタメート残基を、ガンマカルボキシル化に
よって修飾しなければならない。
ＲＰＣの場合、これらのＧｌａ残基は、Ｃａ”＋に対す
る結合部位の大部分を構成する。エスモン等（Ｎ、Ｌ、
Ｅｓｍｏｎ　ａｔ　ａｌ）のジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）
、２５８：５５４８−５５５３（１９８３）。ジョンソ
ン等（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ）のジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５８　：　５５
５４−５５６０（１９８３）；オーリンおよびステシフ
０−（Ｏｈｌｉｎ　ａｎｄ　５ｔｅｎｆｌｏ）のジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６２　
：　Ｉ　３７９８１３８０４（１９８７）；およびスタ
ーンズ等（Ｓｔｅａｒｎｓ　ｅｔ　ａｌ）のジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２６９　：　
８２６−８３２（１９８６）によって記載された様に、
ＨＰＣの軽鎖およびＨＰＣの重鎖には、表皮細胞成長因
子様領域で形成される高親和ｔ！ｊ：Ｃａ”＋結合部位
がある。
Ｉ（ＰＣタンパクの表面荷電分布の変化は、Ｃａ２＋に
よる９個のＧｌａ残基の中和（１残基当たり２［の負の
荷電）に起因し、その結果、正味１８＃の負の荷電を失
う。Ｃａ”結合によって起こるＨＰＣの表面荷電分布の
変化は、構造変化の結果でもある。構造におけるこの変
化は、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性クロ
マトグラフィーで使用される樹脂の様な通常の樹脂に対
するその結合プロファイルに影響する。より具体的には
、この変化は通常のイオン交換クロマトグラフィー樹脂
を「偽親和性」樹脂として作用させる。
本発明の方法は、高比活性のタンパクから低比活性のタ
ンパクを選択的に分離することができる。
この選択性は、タンパクに存在するＧｌａ残基の数に基
づく。例えば、樹脂に対するＧｌａ含有タンパクの親和
性の高さに基づき、低比活性のタンパク（即ち、より少
ないＧｌａ残基を何するタンパク）を、より高比活性の
タンパク（即ち、多、数のＧｌａ残基を有するタンパク
）から分離することができる。
より多数のＧｌａ残基を有するタンパクは、カルシウム
の様な２ｆｉｌｌｉ陽イオンと複合体形成して、より明
白な構造的および電気的変化を示し、２価陽イオンを含
有する溶離バッファーが使用される場合、これらの高活
性タンパクは、カラムから、より容易に溶離するであろ
う。この選択性は非常に有効かつ有用である。多数のほ
にゅう動物セルラインは、全てのＧｌａ残基の存在を欠
いているため、完全に生物学的に活性な組換えビタミン
に依存性タンパクを発現することができない。本発明の
方法は、完全に活性なビタミンに依存性タンパクを、そ
れより低活性の形態の同一のタンパクから分離すること
ができる。この方法は、簡単であり、経済的であり、い
ずれの生化学研究室によっても容易に組み立てられる。
本発明は、偽親和性樹脂として通常のクロマトグラフィ
ー樹脂（イオン交換または疎水性の様な）を使用するこ
とを基礎とする。低濃度の２価陽イオン、とりわけ（ａ
　Ｒ＋の存在または非存在は、通常のクロマトグラフィ
ー樹脂におけるＲＰＣの溶離プロファイルに影響する。
この現象は、全てのビタミンに依存性タンパクおよび／
またはペプチド、および（ａ　２　＋結合タンパク、ペ
プチドまたは巨大分子を包含する全ての２価陽イオン結
合タンパクに及ぶかもしれない。Ｃａ”は、既知のビタ
ミンに依存性タンパクに結合させるための、生理学的に
非常に豊富なエフェクター２価金属イオンなので、これ
を以下の大部分の試験について使用する。しかしながら
、Ｃａ”を、ストロンチウム（Ｓｒ”つむよびバリウム
（Ｂａ”つの様な他の２価陽イオンで置き換えてもよい
。これらの金属イオンによっても同じ結果が得られる。
本発明方法は、例えばヒトプロティンＣ（ＲＰＣ）、因
子江、因子ｘ１因子■、因子■、ヒトプロティン５（Ｈ
ＰＳ）、グａティン２．骨Ｇｌａタンパクおよび骨マト
リックスＧｌａタンパクを包含する、産生される全ての
ビタミンに依存性タンパクに有効である。この方法は、
ＲＰＣの様なビタミンに依存性タンパク酵素原、および
活性化プロティンＣ（ＡＰＣ）の様な対応する活性化形
の血漿プロテアーゼの両者に有効である。
本明細書記載の発明はまた、微生物（宿主細胞）中で発
現した後に宿主細胞から細胞培養培地に分泌されるヘテ
ロローガスな組換えタンパクの単離、精製、再活性化お
よび使用に有用な方法に関するものである。本発明の目
的のために、分泌されたタンパクを「排出タンパク」と
呼ぶ。本明細書記載の発明は更に、非形質転換セルライ
ン中で産生された排出タンパクの単離、精製、再活性化
および使用に関するものである。
組換えＤＮＡ法を使用して宿主微生物に外来のタンパク
を産生させる場合、その様なタンパクはしばしば「ヘテ
ロローガスなタンパク」または１組換えタンパク」と呼
ばれる。本発明において、　「タンパク」なる語句は、
２価陽イオン結合ポリペプチドおよびタンパクの全てを
包含するものとする。
「ヘテロローガス」および「組換え」なる語句は、２価
陽イオンと結合する、宿主微生物によって分泌されるタ
ンパクを意味するために互換的に使用される。
まず、周知の標準的組換えＤＮＡ法によって、タンパク
をクローニングする。ＨＰＣのクローニングは、ベック
マン等（Ｂｅｃｋｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ）によって、ヌ
クレイツク・アシッズ・リサーチＱＪｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）１３　：　５２３３（１９
８５）に記載された。ヒト腎２９３細胞による組換えＨ
ＰＣ（ｆＨＰＣ）の発現は、グリンネル等（Ｇｒｉｎｎ
ａｌｌ　ｅＬａｌ）によってバイオテクノロジー（Ｂｉ
ｏｔｅｃｂｎｏｌｏｇｙ）５　：１１８９−１１９２（
１９８７）に記載された。
培養培地を集め、所望により、冷室温（約４°Ｃ）にて
約２０，０ＯＯＧで約２０分間遠心して、細胞残骸を除
去する。上清はタンパクを含有している。遠心後、ベン
ズアミジンの様なプロテアーゼ阻害剤、およびＥＤＴＡ
またはＥＧＴＡの様なキレート剤を、全ての２価陽イオ
ンを除去するのに十分な濃度で培地に加えることができ
る（第１図、第１−２工程参照）。
次いで、培地を陰イオン性４級または３級アミンベース
の樹脂の様なイオン交換樹脂と接触させる（第１図、第
３工程）。市販品として入手し得る好適な樹脂の幾つか
の例には、ファルマシア・ファースト７０−Ｑ（Ｆ　Ｆ
　Ｑ）およびモノＱ１およびシグマ社製ＱＡＥ−Ａ５０
−１２０およびＤＥＡＥ３級／４級アミンがある。本発
明の１態様では、樹脂をカラムに入れることができる。
しかしながら、培地が通過し、適切なイオン交換を保証
する十分な樹脂表面積と接触し得る限り、樹脂をベツド
またはその他の形状とすることもできる。この工程は、
冷室温（８〜１０℃）で行う。
まず、少量のプロテアーゼ阻害剤、キレート剤、および
、所望により、１価の塩を含有している中性ｐＩ（のバ
ッファー溶液で樹脂を平衡化する。
Ｃａ”“と反応しない限り、いずれの中性バッファーを
使用してもよいが、例えば、リン酸バッファーはＣａ”
＋と不溶性複合体を形成するので使用することができな
い。好ましい平衡化バッファー溶液は、約２０ｍＭトリ
スバッファー、２ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭベンズアミジン
およびＯ，１５ＭＮａＣｌ２を含有し、約７．４のｐＨ
を有する。次いで、受容器（例えば、カラム）に樹脂を
充填する。
ベツドボリュームは、タンパクのための結合部位を与え
るのに十分とすべきである。次に、既にプロテアーゼ阻
害剤およびキレート剤で処理された培養培地をカラムに
負荷する。タンパク結合が最もよ〈起こるように流速を
調節する。ＲＰＣの場合、直線状流速を１時間当たり、
約４０−８０センチメートルとすべきである。
次いで、負荷されたカラムを、１価の塩（例えば、Ｎａ
ＣＱまｔ；はＫＣｌ２）、プロテアーゼ阻害剤（例えば
、ベンズアミジン）およびキレート剤（例えば、ＥＤＴ
Ａ）を含有する、カラム容量の約３倍またはそれ以上の
量の中性バッファー（例えば、トリスバッファー、ｐＨ
７，４）で洗浄する。所望により、塩およびプロテアー
ゼ阻害剤を含有する、カラム容量の約２倍量の中性バッ
ファーで２回目の洗浄を行ってもよい。所望のタンパク
は樹脂に対して高い親和性を有するので、これらのタン
パクは、この時点で、イオン性樹脂に強く結合している
。細胞培養培地中のその他のタンパクおよび不純物の大
部分は洗い流されている。カラムからタンパクを取り出
すために、２価陽イオン、好ましくはカルシウム（ｃａ
”つを含有している「溶離」バッファーを使用する（第
１図、第４工程）。カルシウムイオンは、タンパクに選
択的に結合し、Ｃａ−タンパク複合体を形成するであろ
う。この複合体は樹脂に対して低い親和性を有し、従っ
て、Ｃａ−タンパク複合体は、溶出液に含まれるであろ
う。溶離バッファーは、中性バッファー（例えば、トリ
ス）１．１価の塩（例えば、ＮａＣ（＋）、カルシウム
塩（例えば、ＣａＣＬ）およびプロテアーゼ阻害剤（例
えば、ベンズアミジン）の組み合わせであってよい。好
ましい溶離パン７アーは、２０ｍＭトリス、０．１５　
　ＮａＣ（２，１０ｍＭ　ＣａＣＱ２および５ｍＭベン
ズアミジンを含有し、約７．４のｐＨを有する。タンパ
クは、カラム容量の２倍の溶離剤で溶出する。タンパク
の約９０パーセント（９０％）は、カラム容量の２倍の
終わりまでに溶出される。この工程後のタンパクの回収
は、約８０−９０％である。
次に、タンパクを含有している溶出液を、固定化キレー
ト剤を含有する樹脂で処理し、第２のイオン交換樹脂と
接触させる（第１図、第５〜７エ程）。これらの２種類
の樹脂を含有しているカラムまたはベツドを、所望によ
り、縦列に組み立て、キレートカラムからの溶出液を直
接イオン交換カラムに流入させてもよい。別法として、
キレートカラムからの溶出液を集め、次いで、イオン交
換カラムに負荷させてもよい。固定化ＥＤＴＡを有する
チエレックス１００　（ｃｈｅｌｅｘ１００Ｘバイオラ
ド（Ｂｉｏｒａｄ））の様な、固定化キレート剤を有す
る樹脂を含有している市販のキレートカラムを使用する
ことができる。このカラムの目的は、タンパクからカル
シウムを除去することである。イオン交換樹脂は、最初
の工程で使用したイオン交換樹脂と同じタイプとするこ
とができる。この工程では、まず、低濃度の塩を含有し
ている中性ｐ）（のバッファー（例えば、トリスバッフ
ァー）で洗浄することによって、両樹脂を平衡化させる
。カラムの容量は試料の容量に依存する。キレートカラ
ムのベツド容量は、好ましくは、試料２００＋＋ｏ２当
たり約２０ｍＱとするべきであり、イオン交換カラムの
ベツド容量は、好ましくは、タンパク０．５−１．０グ
ラム当たり約５０１１１１２とするべきである。両力ラ
ムは、結合していないカルシウムを除去し、更にタンパ
クを精製するのに十分な流速で流すべきである。この工
程も、冷室温で行うことができる。好ましい方法では、
最初の工程からの溶出液を、直列に連結したカラムに負
荷する。次に、負荷したキレートカラムを、キレートカ
ラム容量に基づき、カラム容量の２倍量の、低濃度の塩
を有する中性ｐＨのバッファーで洗浄する。液体が溶出
したら、キレートカラムの連結をはずすことかでさる。
この時点で、タンパクは、イオン交換カラムに結合して
いる。タンパクは低い塩濃度でイオン交換カラムに結合
し、より高い塩濃度で溶離するということがわかってい
る。従って、タンパクを溶出するためには、塩グラジェ
ントを含有している一連のバッファーでカラムを処理す
ればよい（第１図、第８工程および第２図参照）。例え
ば、ｐＨ７，４のトリスバッフブーおよび１ＭＮａｃＩ
２からなるバッファーを、このバッファーを０−５０％
含有している一連の溶液をカラム容量の約２０倍以上使
用して、カラムと接触させることができる。タンパクは
、約２７％バッファーを含有している溶液で溶離し始め
、約３０％バッファーで最大に溶離する。グラジェント
の代わりに高い塩濃度のバッファーを使用しても、タン
パクを溶離させることができる（例えば、約０６４〜ｌ
　Ｍ　ＮａＣｌ２）。キシエルおよびデイビー（Ｋｉｓ
ｉｅｌ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｅ）のメンズ・イン・エンザ
イモロジ−（Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
８旦、：　３２０−３３２（１９８１）の記載に従い、
分光学を使用して２８０ｎｍにおける吸収を測定し、光
学密度の変化を調べることによって、溶出をモニターす
る。この時点で、タンパクの回収は９０％以上である。
次いで、溶出液からタンパク不純物を除去することによ
ってタンパクを濃縮および精製するために、タンパク含
有溶出画分を疎水性樹脂と接触させる。フェニルスペロ
ースの様な疎水性樹脂を使用することができる。市販品
として入手し得る樹脂には、フェニルスペロースＨＲ５
１５およびフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（両者トモ
ファルマシア製）がある。疎水性樹脂をまず、１価の塩
および２価陽イオンを含有していることもある中性バッ
ファーで平衡化する。好ましい平衡化バッファーは、約
７．４のｐＨを有する２０ｍＭトリス、１ＭＮａＣＱお
よび１０ｍＭ　ＣａＣＱｚである。
この工程では、前工程から溶出されたタンパク含有画分
を、約１０　ｍＭ　ＣａＣＱｘを含有しているパンファ
ーの様な第２の２価陽イオンで処理し、疎水性樹脂に負
荷し、平衡化バッファーで洗浄する（第１図、第９−１
０工程）。ビタミンに依存性タンパクは、Ｃａ”の非存
在下でフェニルスベロースの様な疎水性樹脂に弱く結合
するが、Ｃａ２“の存在下では樹脂に対して高い親和性
を有し、そのため、ＥＤＴＡの様なキレート剤を含有し
ている溶液によって樹脂から溶離され得るということが
わかった。中性バッファー、低濃度の１価の塩およびキ
レート剤を含有している溶離バッファーを用いてタンパ
クを溶離することができる。好ましい溶離バッファーは
、約２０ｍＭトリス、０．１５ＭＮａＣｌ２および１ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４）を含有する。
この方法によるタンパクの純度は、ＳＤＳ：ＰへＧＥク
ロマトグラフィーによって調べると、９８％より高い。
ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２２７　：　６８０−６８５（１９７４）。グリ
ン不ル等（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ）のバイオテ
クノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５　：　ｌ
　１８９　１１９２（１９８７）に記載の機能分析によ
って調べた結果、タンパクは１００％の生物学的活性を
も保持している。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はいかなる意味においてもこれらの実施例によっ
て限定されるものではない。
実施例１　陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによ
るＲＰＣの分離 以下の試験のために、４級アミンベ・−スの強陰イオン
交換樹脂（即ち、ファースト７０−Ｑ　マｆ−はモノー
Ｑ１ファルマシア社製）を使用する。評判のよい会社か
らの４級アミンベースの樹脂ヲ使用するべきである（例
えば、ＱＡＥ−Ａ５０−１２０、シグマ社製）。ＲＰＣ
はＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ングマ社）の様
な３級アミンベースの樹脂にも結合するので、これらの
樹脂を使用しても同じ結果を得ることができる。
この結果から、ＨＰＣはＣａ”の非存在下で陰イオン交
換樹脂に結合することがわかる。
物質： カラム：　　　　　ファルマシア・モノ−Ｑ１Ｒ５１５ 器具：　　　　　　　ＮａＣ（ｌグラジェントを流すた
めのファルマシアＦＰＬＣ ＬＣＣ−５００システム バフ７７　　Ａ：　　　２０ｍＭトリス、ｐＨ７，４，
０，１５Ｍ　ＮａＣＱ １０バッファーＢ：　　２０ｍＭトリス、ｐＨ７，４、
ＭＮａｃＱ 流速：　　　　　　　Ｉ　ｍｒＩＪ分 ＮａＣＱグラジェント：２０分間でｏ−１ｏｏ％バッフ
ァーＢ 製造業者の指示に従い、カラムを条件設定した。
次いで、カラム（ベツド容量１　ｍＱ）をバッファーＡ
で平衡化した。バッファーＡ８．５１Ａｆ２中、血漿Ｈ
ＰＣ６＋＋＋９を含有している試料をカラムに負荷し、
ＮａＣＱグラジェントの開始前にカラムをバッファーＡ
（カラム容量の３倍量、３吋）で洗浄した。第２図に示
される様に、全てのＨＰＣが樹脂に結合した。ＨＰＣの
濃度は、キシエルおよびデイビーのメソッズ・イン・エ
ンザイモロジ−８０、３２０−３３２（１９８１）の記
載に従い、２８０ｒ＋ｍにおける吸収を測定することに
よって光学密度よりモニターした。
ＲＰＣが、２ｍＭ　ＣａＣＱｚを含有しているバッファ
ーＡ中にある場合、ＨＰＣはモノーＱカラムに結合しな
いということがわかった。２ｍＭＣａＣＱ２は、細胞培
養培地またはヒ）・血漿中に通常存在しているものであ
る。ＲＰ　Ｃは、２０ｍＭトリス（ｐＨ７，４）中に０
．４ＭＮａＣＱを含有して（、する溶液でモノーＱ樹脂
から溶離することかわかった。
ＨＰ　Ｃを溶離するのに必要なＮａＣＱの量は、ｐＨに
依存する。例えば、ｐＨが低いほど、必要なＮａＣＱ濃
度は高く、ｐＨが高いほど、必要なＮａＣＱ濃度は低い
。
実施例２　低濃度のＣａＣＱ２による陰イオン交換カラ
ムからのＨＰＣの溶離 以下の試験は、実施例１に記載のファルマシア・モノー
Ｑカラムおよび同一のプロトコールを使用する。
物質： カラム：　　　　　ファルマシア・モノ−Ｑ。
Ｒ５１５ 器具：　　　　　　ファルマシアＦＰＬＣＬＣＣバッフ
ァーＡ：　　２０ｍＭトリス、ｐＨ７，４，０，１５Ｍ
　ＮａＣｌ２ バｙ７ｙ　　Ｂ：　　　２０ｍＭトリス、ｐＨ７，４，
０，１５Ｍ　ＮａＣＱ、３０ｍＭ ＣａＣＱ。
流速：　　　　　　　ｌ　ｍＱ１分 ＮａＣｆ２グラジェント＝２分間で０−５０％バッファ
Ｂ カラムをバッファーＡで平衡化した。Ｃａ”＋グラジェ
ントの展開前に、バッファーＡ０．７ｍＱに溶解したＨ
ＰＣｏ、６＋ｌ１ｇを含有している試料をバッファーＡ
といっしょにカラムに負荷した。２０ｎ＋Ｍトリス、ｐ
Ｈ７，４，０−１５ＮａＣＱ中、６−９ｍＭ　ＣａＣＱ
２のグラジェントで、ＨＰＣを溶離した。第３図に示し
た結果は、漸増濃度のＣａＣＱ。
でＨＰＣが溶離することを示している。
キシエルおよびデイビーのメソッズ・イン・エンサイモ
ロジー１旦：　３２０−３３２（１９８１）の記載に従
い、２８０ｎｍにおける吸収を測定して光学密度を調べ
ることによって、ＨＰＣを定量した。
実施例３　陰イオン交換カラムからのＨＰＣの溶離に対
する２価金属陽イオンの特異性実施例２の記載と同様に
して試験を組み立て、実施した。これによって、バッフ
ァーＡまたはバッファ　−Ｃ中、種々の濃度のＣａＣＱ
２で、ＨＰＣがインクラティック溶離し得ることがわか
った。バッフｙ−Ａ：２０ｍＭトリス、ｐＨ７，４，０
，１５ＭＮａＣｆｆ バッファーＣ：　２０ｍＭ　トリス、ｐＨ７，４結果を
第１表に示す。
簾土嚢 １０ｍＭ　ＣａＣＱ２　　　　　＋ ９５％ １０ｍＭ　　ＣａＣＱ２ ＋　　　　　　０％ １０ｍＭ　ＭｇＣｌ２２　　　　＋ ２０％ このデータから、同濃度の塩化マグネシウム（ＭｇＣＱ
ｚ）はＣａＣＱ２よりずっと効果が低いので、ＨＰＣの
溶離におけるＣａ”＋の２価陽イオン効果はイオン特異
的であることがわかった。
ＣａＣＱ、を含有しているバッファーのイオン強度も重
要である。０．１５Ｍ　ＮａＣＱの非存在下では、１０
ｍＭ　ＣａＣＱ２のＣａＣＱ２は、モノーＱカラムから
のＲＰＣの溶離に有効ではなかった。
実施例４　モノーＱカラムからＲＰＣを溶離するために
０．４ＭＮａＣＱの代わりにｌｏｍＭＣａＣＱ２を使用
することの選択性 ｒＨＰＣ３，３１１９／ｍＱを発現しているヒト腎２９
３細胞からの２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）調整培地（グ
リンネル等（Ｇｉｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８
７）　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５：１１８９−
１１９２））を使用し、陰イオン交換カラムを使用する
１工程で２４０倍の精製が達成されたことがわかった。
製造業者の指示に従い、ファルマシア・ファースト７０
−Ｑ（ＦＦＱ）樹脂１０ｃｌ＋１２を適切に調製した。
次いで、ＦＦＱ樹脂を、２０ｍＭトリス、０．１５ＭＮ
ａＣｌ２．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭベンズアミジン（
ｐＨ７，４）を含有するバッファー溶液で平衡化した。
３．３μｇ／ｍＱ　ｒＨＰ　Ｃを含有している２％ＦＣ
５調整培地３．３リットルに、ＥＤＴＡおよびベンズア
ミジンをそれぞれ、４＋ａＭおよび５ｍＭの終濃度まで
加えた。この培養培地を、２０ｃｍ、ｈ″Ｉの直線状流
速でＦＦＱカラム（３Ｘ１６　ｃｍ）に通した。カラム
を、まず、２０ｍＭトリス、０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、２
ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭベンズアミジン（ｐＨ７，４）
を含有する溶液３００ｍ（１（カラムＶ量の３倍量）で
、次に、２０ｍＭトリス、０゜１５Ｍ　ＮａＣＱ、２ｍ
Ｍベンズアミジン（ｐＨ７，４）を含有する溶液３０　
ＯｍＱＣカラム容量の３倍）、次いで、２０ｍＭトリス
、０．１５ＭＮａＣα、２ｍＭベンズアミジン、１０　
ｍＭ　ＣａＣＱｘ（Ｊ）Ｈ７−４）を含有している溶液
３００ｍＱで洗浄した。次いで、カラムを更に、２０ｍ
Ｍトリス、０．４Ｍ　ＮａＣＱ。
２ｍＭベンズアミジン（ｐＨ７，４）を含有する溶液で
溶離した。実施例２の記載と同様にして、０Ｄ２８゜を
測定することによって、ＨＰＣの量を調べた。グリンネ
ル等によって記載された方法（Ｇｉｎｎｅｌｌ　ｅｔ　
ａｌ、、（１９８７）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
５：１１８９−ＩＩ９２）に従い、ＨＰＣの比活性を以
下の様にして調べたコまず、ＮＰＣを固定化トロンボモ
ジュリントロンビン複合体（エスモン博士（Ｄｒ、Ｃ，
Ｔ、Ｅｓｍｏｎ。
Ｏｋｌａｈｏｍａ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）から入手）で活性化した。活
性化プロティンＣ（ＡＰＣ）のアミド分解活性を、トリ
ペプチド基質Ｓ−２２３８（ヘレナ（Ｈｅｌｅｎａ））
の加水分解によって測定した。ＲＰＣの抗凝固活性を、
ヘレナからの試薬を使用し、活性化された部分トロンボ
グラスチン時間（ＡＰＴＴ）の延長によって調べた。Ｈ
ＰＣの比活性の単位の検定および定義は、グリンネル等
によって記載されたものである。・結果を第４図および
以下の第２表に示す。
第２表 この試験からの結果は、ｒＨＰＣの純度は出発物質の０
．２５％から約５８％に上昇（計２３２倍の上昇）した
ことをはっきり示した。０．４ＭＮａＣＱでｒＨＰＣを
溶離する「従来」法を使用して比較すると、この段階で
のｒＨＰＣの純度はわずか７％である（計２８倍の上昇
）。従って、本発明の方法は、更に８．３倍の精製を与
える。
実施例５　陰イオン交換クロマトグラフィーからのタン
パクの溶離は、Ｃａ”＋結合タンパクおよびビタミンに
依存性タンパクに特異的である。
この実施例では、非Ｃａ２＋結合および非ビタミンに依
存性の２種類のタンパクを使用しＩ；。両タンパクは通
常、実施例１で特定された条件下、即ち、２０ｍＭトリ
ス、０．１５Ｍ　ＮａＣ１２（ｐＨ７，４）でファルマ
シア・七ノーＱカラムＪこ結合する。使用した２種類の
タンパクは、グルコースオキシダーゼおよびアミログル
コシダーゼ（それぞれ、＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉ
ｇｅｒ　Ｃａｖ、　＃　Ｇ　２１３３およびＡ３４２３
、シグマ社製）であった。２種類のタンパク各々につい
て実施例１および２に記載の試験を繰り返した。結果を
第３表に示す。
第３表 濃度 ＨＰＣ９ｍＭ　　　　　　　　Ｏ，４０５１１Ｍ６　　
非タンパク不純物の除去のための「偽親和ｊ法の選択性 ｒＨＰＣを発現しているヒト腎２９３細胞からの調整培
養培地をこの試験に使用した。グリン不ル等（Ｇｉｎｎ
ｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８７）　Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　５：１１８９−１１９２））。培養培地
に、８０内毒素単位／蛯（ａｎｇ内毒素／ｍｆ２）で内
毒素（リボ多糖Ａ）を含をさせた。内毒素は、負に荷電
した、ダラム陰性菌の外皮由来のリポ多糖のヘテロロー
ガスな分子である。
総タンパク濃度の代わりに内毒素濃度を測定する以外は
実施例４の記載に従って、試験を行った。
ウィツトエイカー・バイオプロダクツ（Ｗｈｉｔｔａｋ
ｅｒＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）からの内毒素検定キット
を使用し、内毒素濃度を測定した。計４Ｘ１０’内毒素
単位で出発し、１０ｍＭ　ＣａＣＱ２．２０ｍＭ）リス
、０゜１５Ｍ　ＮａＣＱ、ｐＨ７，４で溶離されたｒＨ
ＰＣビークで、５．７ＸＩＯ’内毒素単位が回収された
。
これは、ｌ工程の精製後、出発培養培地から計９８．５
％の内毒素が除去されたことを示す。
実施例７　汚染微生物の除去のための「偽親和」法の選
択性 実施例６の記載と同様にして、試験を行った。
５ＸｌＯ１０ｐｈｉ−ＸＩ　７４フアージ（ＡＴＣＣ番
号１３７０６−５ｉｎ　ｓｉｅｍｅｒ−ｃ−ｂｌ）を、
ｒＨＰＣを発現しているヒト腎２９３ｍ胞からの調整培
養培地に導入した。次いで、この培地をＦＦＱカラムに
通した。ｒＨＰＣを含有しているＣ　ａＣ（２１溶出画
分中には１ＸＩＯ’ｐｈｉ−Ｘ１７４７７−ジが１１収
されただけであったが、０．４ＭＮａＣｌ２溶出画分中
には２−３Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｐｈｉ−Ｘ　１７４フアージが
回収された。これらの結果は、ＣａＣｌ１２溶離（「偽
親和」法）が０−４Ｍ　ＮａＣＱ溶離（従来法）より２
０−３０倍の選択性を与えることを示している。
実施例８　組換えヒトプロティン５（ＨＰＳ）の精製 Ａ、ＡＶ１２細胞によって産生されたｒＨＰ　Ｓの精製 ＨＰＳは、１１Ｇｌａ残基を有しているビタミンに依存
性タンパクである。シリアン（Ｓｙｒｉａｎ）ハムスタ
ーＡＶ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９５９５．１９８
７年１１月２４日受託）を、実質上、ヨーロッパ特許出
願ＥＰ−Ａ　　０２４７８４３号（１９８７年２月１２
日公開）の教示に従って構築されたプラスミドｐｓｈＤ
で常法通り形質転換することによって、ＨＰＳを含有し
ている調整培養培地を得、以下の試験に使用した。
ｒＨＰＳを含有しているこの培養培地を使用し、実施例
１に記載の方法を再び行った。「従来」法（実施例７に
記載）を使用し、２０ｍＭ）リス、０゜３３Ｍ　ＮａＣ
ＱＣｐＨ７，４）の溶液を用いて、ファルマシアＦＦＱ
カラムからｒＨＰＳを溶離した。
次に、ｒＨＰ　Ｓを含有している培養培地について、実
施例２に記載のＣａＣＱｚ溶離法を使用した。次いで、
「偽親和」法を使用し、２０ｍＭトリス、０．１５ＭＮ
ａＣｌ２．３．５ｎ＋Ｍ　ＣａＣｆｆｚ（ｐＨ７−４）
の溶液を用いてＦＦＱカラムからｒＨＰｓを溶離した。
８．２９３細胞によって産生された高比活性ｒＨＰＳの
精製 ヒト腎２９３細胞をプラスミドｐｓｈＤで常法通り形質
転換し、次に血清不含の培地で細胞を培養することによ
って、更にｒＨＰｓを得た。実質上、実施例１の教示に
従い、ｒＨＰＳ培養培地をファルマシア・ファーストア
ローＱ樹脂に加え、その後、バッファーＡで洗浄した。
次いで、溶離バッファーが２０ｍＭトリス、０．１５Ｍ
　ＮａＣＱ、３゜ＯｍＭ　ＣａＣ１２ｚ（ｐＨ７，４）
を含有している以外、実施例２に記載のＣａＣＱ２溶離
法を、ＨＰＳ培養培地について行った。カラム容量の約
３倍量を集め、次いで、２０＋ｎＭトリス、ｐＨ７，４
，９，５ＭＮａＣＱを含有しているバッファーでカラム
を溶離した。両溶離バッファーからの溶出ｒＨＰＳの生
物学的活性を、マーム等の検定方法（Ｍａｌｍ　ｅｔａ
ｌ（１９８７）Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６５：
３９−４５）を使用して試験した。
血清不含の培地で増殖させたＡＶ１２−形質転換細胞か
ら得たｒＨＰＳ（実施例８Ａと同様）を、更にファルマ
シア・ファースト７０−Ｑ樹脂に負荷した。次に、実質
上、上の２９３由来のｒＨＰＳのための記載と同様にし
て、ＡＶ１２由来のｒＨＰｓを、３．ＯｍＭ　ＣａＣ（
１，、次いで、０．５ＭＮａＣＱで溶離した。次に、マ
ーム等の方法によって、生物学的活性を検定した。
２９３由来のｒＨＰｓの全機能活性の９７％が、２０ｍ
Ｍトリス、０．１５Ｍ　ＮａＣＱ、３．０ｍＭＣａＣＱ
ｔＣｐＨ７，４）の溶液で溶離され（ｃａＣＱ、両分）
、２９３由来のｒＨＰＳの機能活性の残りの３％が、２
０ｍＭトリス、０．５ＭＮａＣ＜２の溶液（ｐＨ７，４
）で溶離された（ＮａＣＱ画分）。しかしながら、ＡＶ
１２由来のｒＨＰＳの全機能活性の４３％のみが、Ｃａ
ＣＱｚ画分に溶出され、ＡＶ１２由来のｒＨＰ　Ｓの機
能活性の５３％がＮａＣ（２画分に溶出された。
実施例９の記載と同様にして、ｒＨＰＳのＣａＣＱｘお
よびＮａＣＱ両画分中のＧｌａ含有量およびベーターヒ
ドロキンアスパルテート含有量を測定した。ＣａＣＱ、
およびＮａＣＱ画分からのｒＨＰＳ分子は、ベーターヒ
ドロキシアスパルテート含有量、分子量（還元および非
還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ）ＢよびＮ−末端タンパク配列に
相違を示さなかった。しかしながら、ＮａＣＱ画分から
の分子はＣａＣＱ、画分からの分子より２個少ないＧｌ
ａ残基を有しているので、この２両分からのｒＨＰｓ分
子は、Ｇｌａ含有量が異なった。これは、２９３細胞由
来の非常に機能的なｒＨＰ　Ｓに比較して、ＡＶ１２細
胞由来のｒＨＰＳの比活性が低い（約５０％低い）理由
である。
この試験は、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用す
る溶出ｒＨＰＳの「偽親和」法（ｃａＣ１２゜画分）に
よって、高比活性ｒＨＰＳ（高Ｇｌａ含有量）から低比
活性ｒＨＰＳ（低Ｇｌａ含有量）を選択的に分離し得る
ことを示す。
実施例９　高比活性を有するｒＨＰｃは、低比活性ｒＨ
ＰＣから分離し得る。
ヒトグロトロンビンタンパクは、生物学的活性に必須で
ある１０個のＧｌａ残基を有している。ボロウスキー等
（Ｂｏｒｏｖｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、、２６０：９２５８−９２６４（１９８５））。
２または４１ｍ１のＧｌａ残基を欠損しているヒトプロ
トロンビンの天然の変異体は、その生物学的活性の、そ
れぞれ６６％および５％のみを保持している。計ｌＯ個
のＧｌａ残基の内、２個のＧｌａを欠損しているプロト
ロンビンは、３０％以上の活性の低下を生じるので、完
全な活性のためには全てのＧｌａ残基の存在が必須であ
る。
不純な培養培地で測定した時、１部分のみ活性である（
血漿ＨＰＣ標準品に比較すると、３〇−６０％の抗凝固
活性）ｒＨＰＣを、実質上、米国特許比［１２９，０２
８号（１９８７年１２月４日出願）の教示に従って構築
されたプラスミドｐ４−１４でシリアンハムスターＡＶ
１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９５９５）を形質転換す
ることによって得た。実施例４のＨＰＣのための記載と
同様にして、活性を測定した。この培養培地からのｒＨ
ＰＣを、実施例４に記載の方法によって、吸着させ、溶
離した。
培養培地中の全出発ｒＨＰＣの４５パーセントが、２０
ｍＭトリス、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ２．ｌ　ＯｍＭＣａ
　ＣＱ　ｚの溶液（ｐＨ７，４）で溶離され（ｃａ　Ｃ
（２２画分）、２０％が２０ｍＭトリス、０−４Ｍ　Ｎ
ａＣ１２（ｐＨ７，４）で溶離された（ＮａＣＩ２画分
）。ＣａＣｌ２２画分およびＮａＣＱ画分中のｒＨＰＣ
の抗凝固活性は、血症ＨＰＣ標準品に比較すると、それ
ぞれ１００％および２５％であった。ＣａＣｌ２２画分
およびＮａＣＱ画分の両者におけるｒＨＰＣ中のＧｌａ
含有量およびベーターヒドロキシアスパルテート含有量
を、クワンダおよびカタヤマに記載の方法（Ｋｕｗａｎ
ｄａ　ａｎｄ　Ｋａｔａｙａｍａ、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、、１３１：１７３−１７９（１９８３））の
改良法を使用して測定した。即ち、アミノ酸分析の前に
ミニエール（ｍｉｎｉｅｒｔ）パルプを備えたテフロン
バイアルを用いで、タンパクのアルカリ加水分解を行っ
た。（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）。
Ｃａｔ、＃　１４００５．１０１３０）。２．５Ｎ　Ｎ
ａＯＨ中のタンパク試料を注ぎ、つオータース・ピコタ
ッグ・ウオーク・ステーション（Ｗａｔｅｒｓ　ｐｉｃ
ｏｔａｇ　ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を使用し、ミニエ
ールパルプを介してＮ、を通した。クワンダおよびカタ
ヤマの記載に従い、１１０°Ｃで２０時間加水分解した
後、加水分解物を中和し、抽出し、０−フタルアルデヒ
ド／エタンチオールで誘導体化した。以下の条件下でＨ
ＰＬＣ分析を行った： カラム： ヌクレオシル５３Ｂ（４，６Ｘ５０Ｘマチエレイーナゲ
ル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ））インクラティッ
ク溶離：２０ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ４−３０
，５０％アセチルニトリル中 流速：１．５ｍ（１／分 以下の溶離時間を得た： アミノＭ 溶離時間 Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　９．５分１０Ａｓｐ　
　　　　　　　　　１３分エリスローベーター０Ｈ−ａ
ｓｐ２０分スレオ−ベーター０Ｈ−ａｓｐ３４分 Ｇｌａ　　　　　　　　　　　　４４分システィン酸　
　　　　　　　　　５３分ＣａＣｌ２．画分およびＮａ
ＣＱ画分は、ｒＨＰＣ１モル当たり、それぞれ９および
６．５モルのＧｌａを含有していることがわかった。
存在しているＧ１ａ残基の数は、他のビタミンに依存性
タンパクについて文献で報告されたことによって予想さ
れるように、ｒＨＰＣの生物学的活性と非常によく相関
している。ポロウスキー等（Ｂｏｒｏｗｓｋｉ　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ａ、、２６０：９２
５８−９２６４（１９８５））。ＣａＣｆｆ、画分およ
びＮａＣＱ画分間のｒＨＰＣ中Ｇｌａ含有量の相違以外
に、ベーターヒドロキシアスパルテート含有量、分子量
（還元および非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ）およびＮ−末端
タンパク配列に相違は検出されなかった。Ｎ−末端タン
パク配列分析は、ＰＴＨ−アミノ酸分折用オンラインＨ
ＰＬＣシステム（モデル１２０Ａ）を備えたアプライド
・バイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍ）・モデル４７０Ａ気相シークエネーターを用い、自
動エドマン・デグラデーションケミストリーによって行
われｔ二。
この試験から、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
を使用するｒＨＰＣの溶離の「偽親和」法（ｃａＣＱ　
、両分）は、高比活性ｒＨＰＣ（高Ｇｌａ含有量）から
低比活性ｒＨＰＣ（低Ｇｌａ含有量）を選択的に分離し
得ることがわかった。
実施例１０　　陰イオン交換カラムからの活性化ヒトプ
ロティンＣ（ＡＰＣ）の溶離 ＲＰＣは、活性セリンプロテアーゼ、活性化ヒトプロテ
ィンＣ（ＡＰＣ）の酵素原形態である。ＨＰＣとＡＰＣ
間の分子上の唯一の相違は、ＡＰＣがＨＰＣの重鎖のＮ
−末端の１２−アミノ酸ペプチドを欠如していることで
ある。即ち、ＡＰＣとＨＰＣのＧｌａ含有量には相違が
ない。
ｒＡＰＣは、グリンネル等（Ｇｉｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａ
ｌ、、（１９８７）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５
：１１８９−１１９２））の記載に従い、固定化された
トロンボモジュリン−トロンビン複合体を用い、ｒＨＰ
Ｃから製造された。実施例１および２に記載の試験プロ
トコールを、ｒＡＰＣについて再び行った。ファルマシ
ア・モノーＱカラムからのｒＡＰＣの溶離プロファイル
の結果は、ｒＨＰＣの結果と同じであった。「偽親和」
法または「従来」法について、ｒＡＰＣの溶離のために
必要なＣａＣＱ、またはＮａＣＱの量は、ｒＨＰＣの量
に一致した。
実施例１１　　疎水性カラムクロマトグラフィー生化学
の研究において使用される最も一般的な通常のタイプの
３種類のカラムクロマトグラフィーは、イオン交換、疎
水性／逆相およびサイズ排除である。前者２タイプは、
問題の生化学的化合物の表面電荷分布に依存するが、サ
イズ排除クロマトグラフィーは依存しない。そのため、
「偽親和」ビタミンに依存性タンパクが、「偽親和」法
を使用するこのタイプのカラムで分離され得ることを説
明するために、疎水性カラムクロマトグラフィーを使用
した。
疎水性側鎖は固定担体に結合され、疎水性カラム樹脂を
作り出す。これを説明するために、フェニル基を使用し
た。種々の長さの脂肪族炭化水素のような、その他の疎
水性側鎖を使用してもよい。
フェニルスペロースＨＲ５１５およびフェニルセファロ
ースＣＬ−４Ｂ（両者ともファルマシア製）のために、
２種類のタイプの固定担体を使用した。
（ａ）物質： カラム：ファルマシアーフェニルスベロースＲ５１５ バッフｙ−Ａ：２０ｍＭトリス、２Ｍ　ＮａＣＱ、　ｐ
Ｈ７，４バッファーＢ：２０ｍＭトリス、０．１５Ｍ　
ＮａＣｌ２．　ｐＨ７，４バッファーＣ：２０１ＴＩＭ
トリス、２Ｍ　ＮａＣｆｆ。
１０ｍＭ　ＣａＣ＜２ｚ、ｐＨ７，４ バッ’７ｙ−Ｄ：２０ｍＭトリス、Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣ
Ｑ。
ｌＱｍＭ　ＣａＣＱｘ、ｐＨ７，４ 流速：０．５ｍ１２／分 クロマトグラフイーシステム：ファルマシアＦＰＬＣＬ
ＣＣ〜５００システム 製造業者の指示に従ってカラムを調製し、次いで、パン
ファーＡで平衡化した。ｒＨＰＣ１ｍｇをバッファーＡ
に溶解し、次にカラムに負荷した。タンパクの濃度を、
２８０ｎｍでの光学密度を測定することによってモニタ
ーした。ｒＨＰＣは、カラムに結合しなかった。０−１
００％バッファーＢのグラジェント（４０分間）では、
それ以上の物質が溶離されなかった。ｒＨＰＣをバッフ
ァーＣに溶解し、カラムに負荷した。全てのｒＨＰＣが
フェニルスペロース力ラムに結合した。バッファーＡと
０間の唯一の相違は、バッファーＣがｌＯｍＭＣａＣＱ
、を含有しでいることである。０−１００％バッファ一
りのグラジェントを４０分で展開した。ｒＨＰＣは、６
０％バッファ一りおよび４０％バッファーＣ，または２
０ｍＭトリス、０．９ＭＮａＣＱ、　　ｌ　ＯｍＭ　Ｃ
ａＣｌ２２（１）８７．４）で溶離された。
従って、このことから、ｒＨＰＣは、低濃度のＣａ”″
の存在下で疎水性樹脂に対して、より高い親和性を有し
ていることがわかる。
フェニルセファロースカラムを使用し、試験を繰り返し
た： （ｂ）ジ： カラム：７アルマシア・フェニルセファロースＣＬ−４
Ｂ　　Ｏ，５Ｘ５ｃｍ 流速：　０．５ｍ　ｌ／分 子ＨＰＣは、バッフ７−Ａ（２ＱｍＭトリス、２ＭＮａ
ＣＱ１ｐＨ７，４）、まｔ二は２０ｍＭ）リス、ＩＭＮ
ａＣＱ、ｌ　ＯｍＭ　ＣａＣ（２２（ｐＨ７，４）のい
ずれかで、カラムに１００％結合することがわかった。
しかしながら、ｒＨＰＣは、２０ｍＭトリス、ＩＭ　Ｎ
ａＣＱ、ｐＨ７，４の溶液中ではカラムに結合しなかっ
た。
実施例１２　細胞培養培地からｒＨＰＣを精製するだめ
の「偽親和」クロマトグラフィーの使用以下の構成は、
ある一連の条件および変数についての精製体系の例であ
る。
以下の工程を全て、冷室温（８−１０°Ｃ）で行つｔこ
。
ＩＮ］エ　陰イオン交換ファースト・７０−Ｑカラム ｒＨＰＣを５μｇ／＋＋＋Ｑで発現している２９３細胞
からの血清不合調整培養培地を使用した。血清不合培養
培地は、インシュリン、トランスフェリンのタンパク／
ペプチド補足物を含有した。ｒＨＰＣの濃度は通常、調
整培養培地中、総タンパクの１０−１５％であった。フ
ァルマシア・ファースト７０−Ｑ樹脂（ＦＦＱ）を、製
造業者の指示に従い、ＩＮＨＣＱおよび１ＮＮａＯＨで
洗浄した。
次に、樹脂をｌＯ１０Ｘ２０カラムに充填した。培養培
地５００リツトル当たり、１リツトルのＦＦＱ樹脂が必
要であった。カラムを充填し、２０ｍＭトリス、ｌ　Ｍ
　ＮａＣＱＣｐＨ７，４）を使用し、・１２０ｃｍ、ｈ
”の速度で流した。カラムを、２０ｍＭトリス、０．１
５Ｍ　ＮａＣＱ、２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２ｍＭベンズ
アミジン（ｐＨ７，４）の溶液で平衡化した。
０．２Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４）および１Ｍベンズア
ミジンの溶液を、ｒＨＰＣを含有している培養培地に加
え、それぞれ４ｍＭおよび５ｍＭの終濃度とした。次に
、培養培地を８０　ｃｍ、ｈ−’の流速でＦＦＱカラム
に負荷した。
次いで、ＦＦＱカラムを、カラム容量の最小３倍量の、
２０ｍＭトリス、Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣＱ、２ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ、５ｍＭベンズアミシフ（ｐＨ７，４）を含有して
いる溶液で洗浄しｔ；。ＦＦＱカラムを更に、最小３倍
カラム容量の、２０ｍＭトリス、０．１５ＭＮａＣｌ２
．５ｍＭベンズアミジン（ｐＨ７゜４）を含有している
溶液で洗浄した。ｒＨＰＣを、２０ｍＭトリス、０．１
５Ｍ　ＮａＣＱ、ｌ　ＯｍＭＣａＣＱ２．５ｍＭベンズ
アミジン（ｐＨ７，４）の溶液で溶離した。流速は、５
ｃｍ、ｈ−’であった。ブラッド７オードのタンパク試
薬（Ｍ、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（’１９７６）Ａｎａｌ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、７２：２４８−２５４）またはグリンネ
ル等の記載のＥＬＩＳＡ検定（Ｇｉｎｎｅｌｌ　ｅｔ　
ａｌ、、（１９８７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５
：１１８９−１１９２））でｒＨＰＣを検出した。ｒＨ
ＰＣは、この溶離バッファーによって、カラム容量の２
倍目の始めに溶出した。ｒＨＰＣの９０％は、カラム容
量の半分で溶離した。
工程２　ファーストアローＱカラムと直列のチエレック
ス１００カラム チエレックス１００カラム（パイオーラド）を使用し、
工程ｌからのｒＨＰＣ中のＣａ”を除去した。
この工程では、通常の方法でＦＦＱを流した。チエレッ
クス！００樹脂（３００ｄ）を、製造業者の指示に従い
、ＩＮ　ＮａＯＨＨｚＯＩＮ　ＨＣＱ−Ｈ２Ｏで洗浄し
た。樹脂を３−３−２Ｘ４０カラムに充填し、１Ｍトリ
ス（ｐＨ７，４）の溶液で洗浄した。
カラムを、２０ｍＭトリス、０．１５Ｍ　ＮａＣＣ（ｐ
Ｈ７，４）を含有している平衡化バッファーで平衡化し
た。１Ｍトリス洗液は、チエレックス１００をｐＨ７，
４に迅速に平衡化するのに必要であった。ＦＦＱカラム
（３，２Ｘ２５ｃｍ）を工程ｌの記載の様にして洗浄し
、２０ｍＭトリス、０．１５ＭＮａＣＱＣｐＨ７、４）
の溶液で平衡化した。このチエレックス１００カラムを
ＦＦＱカラムと直列につなぎ、工程１からのｒＨＰｃを
含有している溶出液が、まず、チエレックス１００、次
にＦＦＱを通るようにした。
工程ｌからのｒＨＰＣの全てが負荷された後、カラムを
平衡化バッファー１．５リツトルで洗浄した。次いで、
チエレックス１００カラムをＦＦＱからはずした。
ＦＦＱを平衡化バッファー６００蛯で更に洗浄した。次
に、ＦＦＱを、２０ｍＭトリス、０，２５Ｍ　ＮａＣ（
２（ｐＨ７，４）の溶液６００ｍ１２で洗浄した。
この時点では、ｒＨＰＣは全く溶離されなかった。
ｒＨＰＣを、２０ｍＭトリス、０．４Ｍ　ＮａＣＱＣｐ
Ｈ７，４）の高い塩溶液でＦＦＱから溶離した。２８０
ｄｍでの吸収をモニターすることによって、ｒＨＰＣを
検出した。この工程からのｒＨＰＣの収率は、９０−９
５％であった。
工程３　疎水性フェニルセファロース樹脂フェニルセフ
ァロースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア）の３−３−２Ｘ４
０カラムを充填し、次いで、以下の溶液をそれぞれカラ
ム容量の３倍量を用い、２０ｃＩ１１．ｈ−’の流速で
洗浄した：５０％メタノール；　Ｈ，Ｏ；　１％酢酸；
　Ｈ，Ｏ；　０．ＩＭ　ＮａＯＨ；Ｈ２Ｏ。
次いで、カラムを、２０ｍＭトリス、１ＭＮａＣＱ１１
０ｍＭ　ＣａＣｆｆｚ（ｐＨ７−４）を含有している平
衡化バッファーで平衡化した。工程２からのｒＨＰＣを
、２０ｍＭトリス、２Ｍ　ＮａＣＱ、２０ｍＭ　ＣａＣ
ＱｘＣｐＨ７−４）を含有している溶液（等容量）で希
釈し、カラムを通した。
カラムを平衡化バッファー１リツトルで更に洗浄した。
ｒＨＰＣを、２０ｍＭトリス、０．１５ＭＮａＣＱ１１
ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４）の溶液で溶離しに。
この工程でのｒＨＰＣの回収は、約８５％であった。５
ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定するか（ラエムリ（Ｌａｅ
ｍｍｌ　ｉ、（１９７４）Ｎａｔｕｒｅ、２２７：６８
０−６８５）または実施例４の記載の比活性によって測
定した純度は９８％より大きかった。この工程後、内毒
素の濃度は、１０分の１に低下した。
当業者は、通常の実験を使用し、本明細書記載の特定物
質および方法に対する多数の等価物を認めるか、または
確認することができるであろう。
この様な等価物は、本発明の範囲内であると思われ、本
明細書特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、２価陽イオン結合タンパクの精製について本
発明方法を説明するフローチャートであり、第２図は、
ＮａＣＱグラジェントを使用する、ファルマシア・モノ
Ｑ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｍｏｎｏｄ）イオン交換樹
脂からのヒトプロティンＣの溶出プロファイルであり、
第３図は、ＣａＣ１２ｘグラジエントを使用スる、ファ
ルマシア・モノロイオン交換樹脂からのヒトプロティン
Ｃの溶出プロファイルであり、第４図は、ＣａＣ（２２
溶離バツフアーおよび高ＮａＣＱバッファーの両者を使
用する、ファルマシア・ファーストフｏ　−Ｑ　（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　Ｑ）イオン交換
樹脂からのヒトプロティンＣの溶出プロファイルである
。 特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニ 代　理　人　弁理士　責　山　　葆　ほか１名ＳＤＳ　
：　ＰＡＧＥクロマトグラフィーまたは比活性による分
析累積タンパク回収率、〉６５％　タンパクの純度：〉
９８％ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、２ Ｓ豪（而） ＦＩＧ、４ き遺 （ｍｌ）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、組換え２価陽イオン結合性タンパクを産生する形質
    転換細胞の細胞培養培地から２価陽イオン結合性タンパ
    クを回収および精製するための方法であって、 （ａ）培地から２価陽イオンを除去し、 （ｂ）培地を、タンパクが樹脂に結合する様な条件下で
    タンパク結合性イオン交換樹脂と接触させ、（ｃ）樹脂
    結合タンパクを、陽イオン−タンパク複合体を形成させ
    それによって樹脂からタンパクを遊離させるのに適した
    条件下で２価陽イオンで処理し、 （ｄ）陽イオン−タンパク複合体を、陽イオンを除去し
    、遊離の、生物学的に活性なタンパクを得るのに適した
    条件下で処理することからなる方法。 ２、２価陽イオン結合性タンパクがビタミンＫ依存性タ
    ンパクからなる請求項１に記載の方法。 ３、ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化されたヒトプ
    ロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒトプロテ
    インＳからなる群から選択される請求項２に記載の方法
    。 ４、（ａ）における２価陽イオンの除去が、培地にキレ
    ート剤を加えることからなる請求項１に記載の方法。 ５、２価陽イオンがカルシウムイオン、バリウムイオン
    およびストロンチウムイオンからなる群から選択される
    請求項１に記載の方法。 ６、タンパク結合性イオン交換樹脂が陰イオン性アミン
    ベースのイオン交換樹脂からなる請求項１に記載の方法
    。 ７、（ｄ）における陽イオン−タンパク複合体の処理が
    、キレート剤を複合体と混合することからなる請求項１
    に記載の方法。 ８、組換え２価陽イオン結合性タンパクを産生する形質
    転換細胞の細胞培養培地から２価陽イオン結合性タンパ
    クを精製するための方法であって、（ａ）タンパクを含
    有している細胞培養培地を、該培地由来の内生の２価陽
    イオンを除去するのに十分なキレート剤と合し、 （ｂ）（ａ）からの混合物を、タンパクをイオン交換物
    質に結合させるのに適した条件下でイオン交換物質と接
    触させ、 （ｃ）（ｂ）からのタンパク結合イオン交換物質を、陽
    イオン−タンパク複合体を形成させそれによってイオン
    交換物質からタンパクを遊離させるのに適した条件下で
    ２価陽イオン供給源と接触させ、（ｄ）（ｃ）で生成し
    た陽イオン−タンパク複合体を、複合体から陽イオンを
    除去しそれによって遊離のタンパクを得るのに適した条
    件下でキレート物質と接触させ、 （ｅ）（ｄ）で得たタンパクを、タンパクをイオン交換
    物質に結合させるのに適した条件下でタンパクと第２の
    イオン交換物質を接触させることによって精製し、 （ｆ）（ｅ）からのタンパク結合イオン交換物質を、イ
    オン交換物質からタンパクを遊離させるのに適した条件
    下で１価の塩と接触させ、 （ｇ）（ｆ）で得たタンパクを、陽イオン−タンパク複
    合体を形成させるのに十分な２価陽イオンと接触させ、 （ｈ）（ｇ）で得た陽イオン−タンパク複合体を、陽イ
    オン−タンパク複合体を疎水性物質に結合させるのに適
    した条件下で疎水性物質と接触させ、（ｉ）（ｈ）のタ
    ンパク結合疎水性物質を、陽イオン−タンパク複合体か
    ら陽イオンを除去しそれによって疎水性物質からタンパ
    クを遊離させるのに適した条件下でキレート剤と接触さ
    せることからなる方法。 ９、２価陽イオンがカルシウムイオン、バリウムイオン
    、ストロンチウムイオンからなる群から選択される請求
    項８に記載の方法。 １０、タンパクがビタミンＫ依存性タンパクからなる請
    求項８に記載の方法。 １１、ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化されたヒト
    プロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒトプロ
    テインＳからなる群から選択される請求項１０に記載の
    方法。 １２、キレート剤がＥＤＴＡからなる請求項８に記載の
    方法。 １３、（ｂ）のイオン交換物質が陰イオン性アミンベー
    スのイオン交換樹脂からなる請求項８に記載の方法。 １４、イオン交換樹脂をカラムに充填する請求項１３に
    記載の方法。 １５、（ｄ）のキレート物質が、ＥＤＴＡが固定化され
    た樹脂からなる請求項８に記載の方法。 １６、（ｅ）のイオン交換物質が陰イオン性アミンベー
    スのイオン交換樹脂からなる請求項８に記載の方法。 １７、（ｆ）の１価の塩が約０．４Ｍ〜約１．０Ｍの濃
    度を有する塩化ナトリウムからなる請求項８に記載の方
    法。 １８、（ｈ）の疎水性物質がフェニルスペロース樹脂お
    よびフェニルセファロース樹脂からなる群から選択され
    る請求項８に記載の方法。 １９、組換２価カルシウム結合性タンパクを産生する形
    質転換細胞の細胞培養培地に含有されている低比活性２
    価カルシウム結合性タンパクから高比活性２価カルシウ
    ム結合性タンパクを分離するための方法であって、 （ａ）タンパクを含有している細胞培養培地を、培地か
    ら内生のカルシウムを除去するのに十分な量のＥＤＴＡ
    と合し、 （ｂ）（ａ）で得た混合物を、タンパクをイオン交換樹
    脂に結合させるのに適した条件下でイオン交換樹脂と接
    触させ、 （ｃ）（ｂ）におけるタンパク結合イオン交換樹脂を、
    カルシウム−タンパク複合体を形成させそれによってイ
    オン交換物質からタンパクを遊離させるのに適した条件
    下でカルシウムイオン供給源と接触させ、 （ｄ）（ｃ）で生成したカルシウム−タンパク複合体を
    、複合体からカルシウムイオンを除去しそれによって遊
    離のタンパクを得るのに適した条件下でＥＤＴＡが固定
    化された樹脂物質と接触させ、（ｅ）（ｄ）で得たタン
    パクを、タンパクをイオン交換樹脂に結合させるのに適
    した条件下でタンパクと第２のイオン交換樹脂を接触さ
    せることによって精製し、 （ｆ）（ｅ）からのタンパク結合イオン交換物質を、イ
    オン交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件
    下で１価の塩と接触させ、 （ｇ）（ｆ）で得たタンパクを、カルシウム−タンパク
    複合体を形成させるのに十分なカルシウムイオン供給源
    と接触させ、 （ｈ）（ｇ）で得たカルシウム−タンパク複合体を、カ
    ルシウム−タンパク複合体を疎水性樹脂に結合させるの
    に適した条件下で疎水性樹脂と接触させ、（ｉ）（ｈ）
    のタンパク結合疎水性物質を、カルシウム−タンパク複
    合体からカルシウムを除去しそれによって疎水性樹脂か
    ら高比活性タンパクを選択的に遊離させるのに十分な量
    のＥＤＴＡと接触させることからなる方法。 ２０、カルシウム結合性タンパクがビタミンＫ依存性タ
    ンパクからなる請求項１９に記載の方法。 ２１、ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化されたヒト
    プロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒトプロ
    テインＳからなる群から選択される請求項２０に記載の
    方法。 ２２、（ｂ）のイオン交換樹脂が陰イオン性アミンベー
    スの樹脂からなる請求項１９に記載の方法。 ２３、（ｇ）の疎水性樹脂がフェニルスペロースおよび
    フェニルセファロースからなる群から選択される請求項
    １９に記載の方法。 ２４、（ｆ）の１価の塩が約０．４〜約１．０Ｍの濃度
    を有する塩化ナトリウムからなる請求項１９に記載の方
    法。 ２５、２価陽イオン結合性タンパクを産生する細胞の細
    胞培養培地から２価陽イオン結合性タンパクを回収およ
    び精製するための方法であって、（ａ）培地から２価陽
    イオンを除去し、 （ｂ）培地を、タンパクが樹脂に結合する様な条件下で
    タンパク結合性イオン交換樹脂と接触させ、（ｃ）樹脂
    結合タンパクを、陽イオン−タンパク複合体を形成させ
    それによって樹脂からタンパクを遊離させるのに適した
    条件下で２価陽イオンで処理し、 （ｄ）陽イオン−タンパク複合体を、陽イオンを除去し
    、遊離の、生物学的に活性なタンパクを得るのに適した
    条件下で処理することからなる方法。 ２６、２価陽イオン結合性タンパクがビタミンＫ依存性
    タンパクからなる請求項２５に記載の方法。 ２７、タンパクがヒトプロテインＣ、ヒトプロテインＣ
    酵素原およびヒトプロテインＳからなる群から選択され
    る請求項２６に記載の方法。 ２８、２価陽イオン結合性タンパクを産生する細胞の細
    胞培養培地から２価陽イオン結合性タンパクを精製する
    ための方法であって、 （ａ）タンパクを含有している細胞培養培地を、培地か
    ら内生の２価陽イオンを除去するのに十分なキレート剤
    と合し、 （ｂ）（ａ）からの混合物を、タンパクをイオン交換物
    質に結合させるのに適した条件下でイオン交換物質と接
    触させ、 （ｃ）（ｂ）からのタンパク結合イオン交換物質を、陽
    イオン−タンパク複合体を形成させそれによってイオン
    交換物質からタンパクを遊離させるのに適した条件下で
    ２価陽イオン供給源と接触させ、（ｄ）（ｃ）で生成し
    た陽イオン−タンパク複合体を、複合体から陽イオンを
    除去しそれによって遊離のタンパクを得るのに適した条
    件下でキレート物質と接触させ、 （ｅ）（ｄ）で得たタンパクを、タンパクをイオン交換
    物質に結合させるのに適した条件下でタンパクと第２の
    イオン交換物質を接触させることによって精製し、 （ｆ）（ｅ）からのタンパク結合イオン交換物質を、イ
    オン交換物質からタンパクを遊離させるのに適した条件
    下で１価の塩と接触させ、 （ｇ）（ｆ）で得たタンパクを、陽イオン−タンパク複
    合体を形成させるのに十分な２価陽イオンと接触させ、 （ｈ）（ｇ）で得た陽イオン−タンパク複合体を、陽イ
    オン−タンパク複合体を疎水性物質に結合させるのに適
    した条件下で疎水性物質と接触させ、（ｉ）（ｈ）のタ
    ンパク結合疎水性物質を、陽イオン−タンパク複合体か
    ら陽イオンを除去しそれによって疎水性物質からタンパ
    クを遊離させるのに適した条件下でキレート剤と接触さ
    せることからなる方法。 ２９、２価陽イオンがカルシウムイオン、バリウムイオ
    ン、ストロンチウムイオンからなる群から選択される請
    求項２８に記載の方法。 ３０、タンパクがビタミンＫ依存性タンパクからなる請
    求項２８に記載の方法。 ３１、タンパクが、活性化されたヒトプロテインＣ、ヒ
    トプロテインＣ酵素原およびヒトプロテインＳからなる
    群から選択される請求項３０に記載の方法。 ３２、２価カルシウム結合性タンパクを産生する細胞の
    細胞培養培地に含有されている低比活性２価カルシウム
    結合性タンパクから高比活性２価カルシウム結合性タン
    パクを分離するための方法であって、 （ａ）タンパクを含有している細胞培養培地を、培地か
    ら内生のカルシウムを除去するのに十分な量のＥＤＴＡ
    と合し、 （ｂ）（ａ）で得た混合物を、タンパクをイオン交換樹
    脂に結合させるのに適した条件下でイオン交換樹脂と接
    触させ、 （ｃ）（ｂ）におけるタンパク結合イオン交換樹脂を、
    カルシウム−タンパク複合体を形成させそれによってイ
    オン交換物質からタンパクを遊離させるのに適した条件
    下でカルシウムイオン供給源と接触させ、 （ｄ）（ｃ）で生成したカルシウム−タンパク複合体を
    、複合体からカルシウムイオンを除去しそれによって遊
    離のタンパクを得るのに適した条件下でＥＤＴＡが固定
    化された樹脂物質と接触させ、（ｅ）（ｄ）で得たタン
    パクを、タンパクをイオン交換樹脂に結合させるのに適
    した条件下でタンパクと第２のイオン交換樹脂を接触さ
    せることによって精製し、 （ｆ）（ｅ）からのタンパク結合イオン交換物質を、イ
    オン交換樹脂からタンパクを遊離させるのに適した条件
    下で１価の塩と接触させ、 （ｇ）（ｆ）で得たタンパクを、カルシウム−タンパク
    複合体を形成させるのに十分なカルシウムイオン供給源
    と接触させ、 （ｈ）（ｇ）で得たカルシウム−タンパク複合体を、カ
    ルシウム−タンパク複合体を疎水性樹脂に結合させるの
    に適した条件下で疎水性樹脂と接触させ、（ｉ）（ｈ）
    のタンパク結合疎水性物質を、カルシウム−タンパク複
    合体からカルシウムを除去しそれによって疎水性樹脂か
    ら高比活性タンパクを選択的に遊離させるのに十分な量
    のＥＤＴＡと接触させることからなる方法。 ３３、カルシウム結合性タンパクがビタミンＫ依存性タ
    ンパクからなる請求項３２に記載の方法。 ３４、ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化されたヒト
    プロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒトプロ
    テインＳからなる群から選択される請求項３３に記載の
    方法。 ３５、２価陽イオン結合性タンパクの試料から非タンパ
    ク性不純物を除去するための方法であって、（ａ）試料
    から２価陽イオンを除去し、 （ｂ）試料を、タンパクが樹脂に結合する様な条件下で
    タンパク結合性イオン交換樹脂と接触させ、（ｃ）樹脂
    結合タンパクを、陽イオン−タンパク複合体を形成させ
    それによって樹脂からタンパクを遊離させるのに適した
    条件下で２価陽イオンで処理し、 （ｄ）陽イオン−タンパク複合体を、陽イオンを除去し
    、遊離の、生物学的に活性なタンパクを得るのに適した
    条件下で処理することからなる方法。 ３６、２価陽イオン結合性タンパクがビタミンＫ依存性
    タンパクからなる請求項３５に記載の方法。 ３７、ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化されたヒト
    プロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒトプロ
    テインＳからなる群から選択される請求項３６に記載の
    方法。 ３８、非タンパク性不純物が細菌内毒素である請求項３
    ５に記載の方法。 ３９、２価陽イオン結合性タンパクの試料からウィルス
    不純物を除去するための方法であって、（ａ）試料から
    ２価陽イオンを除去し、 （ｂ）試料を、タンパクが樹脂に結合する様な条件下で
    タンパク結合性イオン交換樹脂と接触させ、（ｃ）樹脂
    結合タンパクを、陽イオン−タンパク複合体を形成させ
    それによって樹脂からタンパクを遊離させるのに適した
    条件下で２価陽イオンで処理し、 （ｄ）陽イオン−タンパク複合体を、陽イオンを除去し
    、遊離の、生物学的に活性なタンパクを得るのに適した
    条件下で処理することからなる方法。 ４０、２価陽イオン結合性タンパクがビタミンＫ依存性
    タンパクからなる請求項３９に記載の方法。 ４１、ビタミンＫ依存性タンパクが、活性化されたヒト
    プロテインＣ、ヒトプロテインＣ酵素原およびヒトプロ
    テインＳからなる群から選択される請求項４０に記載の
    方法。
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