DK176090B1 - Fremgangsmåde til oprensning af proteiner - Google Patents

Description

DK 176090 B1 FIG.!

Oprensningsstrømningsskema Cellekultur-supematant indeholdende protein

1. Tilsæt 4 mM EDT A

2. Tilsæt 5 mM benzamidin 3. Påfør ionbytterhaipiks 4. Eluer med 10 mM CaCl2

Eluat - indeholdende Ca-proteinkompleks 5. Påfør eluat til chelatiseringsharpiks 6. Eluer med buffer 7. Eluatet strømmer direkte ind i ionbytterharpiksen 8. Eluat fra ionbytterharpiks med en saltgradient -►- Eluat indeholdende protein

9. Tilsæt CaCI2 til en s*ut-koncentration på 10 mM

10. Påfør hydrofonisk harpiks i 1. Eluer med EDTA

Eluat --—-- indeholdende protein (i) Analyser med SDS: PAGE chromatografi eller specifik aktivitet: samlet proteingenvinding: > 65%. Proteinrenhed: > 98%.

y r DK 176090 B1

Et stort antal humane og andre mammale proteiner, herunder f.eks. humant væksthormon, humant protein C og størkningsfaktor VII, er blevet produceret i værtsceller ved transfektion af disse celler med DNA, der koder for disse < proteiner, og dyrkning af rekombinantcellerne under gunstige betingelser for 5 ekspression af proteinet. Grinnell et al. beskriver ekspressionen af rekombi-nant human protein C (HPC) i humane nyreceller i Biotechnology. 5:1189-1192 (1987). Proteinerne udskilles af cellerne i celledyrkningsmediet, og må adskilles fra dyrkningsmediet og de andre komponenter, såsom cellespildprodukter, cellerester og proteiner eller andet materiale, som også er samlet i 10 mediet. Desuden må proteinets biologiske aktivitet bevares, så udvindingsbe-tingelseme må være milde nok til at bevare den biologiske aktivitet af proteinet, men samtidig grundige nok til effektivt at separere proteinet fra kontami-nanter i mediet. Renhed er ofte en vigtig overvejelse, især til farmaceutiske anvendelser.

15

Udvinding af proteiner i biologisk aktiv form fra et celledyrkningsmedium byder på en række problemer. F.eks. må det ønskede protein separeres fra andre nært beslægtede proteiner i celledyrkningsmediet, såsom homologe, biologisk inaktive proteiner, der kan være forbundet med proteinet. Udvin-20 dingsprocessen kan give den biologisk aktive form af proteinet med en høj renhedsgrad.

Jones et al. beskriver en metode til udvinding af refraktile proteiner (ikke-eksporterede proteiner, som danner uopløselige proteingranuler inden for 25 værtscellen) fra cytoplasmaet af en værtscelle i US patentskrift nr. j 4 512 922. Beslægtede patenter, som beskriver proteinudvindingssystemer baseret på denaturering og genfoldning, omfatter US patentskrifteme nr. 4 j ^ 599197; 4 518 526 og 4 511 503. j 30 Raush og Meng beskriver i US patentskrift nr. 4 677 196 udvinding af heterogene proteiner fra en værtscelle, hvilke proteiner også foreligger i form af refraktile legemer.

i 2 DK 176090 B1

Hung et al beskriver i US patentskrift nr. 4 734 262 en proces til udvinding af rekombinante refraktile proteiner fra en værtscelle, som involverer denaturering af proteinet og efterfølgende renaturering til opnåelse af det ønskede produkt. J

5

Udvinding og rensning af human koagulationsfaktor VII er beskrevet af Brose og Majerus i The Journal of Biological Chemistry. 255:1242-1247 (1980). De oprensede faktor VII fra humant plasma med et udbytte på ca. 30% under anvendelse af en proces, som involverede at proteinerne først absorberedes 10 til bariumcitrat og derefter separeredes ved kromatografi.

Vitamin K-afhængige proteiner er en klasse proteiner, der er involveret i opretholdelse af hæmostase. Afhængighed af vitamin K optræder under biosyntesen af proteinerne. Humanprotein C (HPC) er et vitamin K-afhængigt 15 plasmaglycoprotein, som spiller en central rolle i opretholdelse af hæmostase. C.T. Esmon, Science. 235:1348-1352 (1987).

Bindingen af calciumioner (Ca2+) til HPC forårsager en konformationel ændring i HPC, som kan måles ved fluorescensemmissionsspektroskopi. John-20 son et al., J. Biol. Chem.. 258:5554-5560 (1983). Den konformationelle ændring resulterer i en ændring i overfladeladingsfordeling som målt ved en forskel i vandringsmønsteret for proteinet i et elektrisk felt, såsom ved agarose-gelelektroforese. Stenflo, J., J. Biol. Chem.. 251:355-363 (1976).

25 Opfindelsen tilvejebringer en rensningsfremgangsmåde, hvorved et eksepor-teret vitamin-K-afhængigt protein, som er produceret af en værtscelle, eller produceret af en værtscelle efter transformation eller transfektion med DNA, der koder for proteinet, udvindes fra celledyrkningsmediet og renses. Vita- ^ min-K-afhængige proteiner binder divalente kationer, såsom calcium- eller 30 bariumioner, hvilket resulterer i konformationelle ændringer i proteinet, og ændring af overfladeladningerne på proteinet. Disse ændringer udnyttes ifølge den foreliggende fremgangsmåde til at kontrollere bindingsaffiniteten af proteinerne til forskellige substrater under tilstedeværelse af divalente katio- DK 176090 B1

3 I

i ner. Fremgangsmåden benytter konventionel kromatografi til separation af proteinerne baseret på den ionisk ændrede bindingsaffinitet af proteinerne.

' Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til 5 udvinding og oprensning af vitamin-K-afhængige proteiner fra et celledyrkningsmedium af celler, som producerer vitamin-K-afhængige proteiner, hvilket celledyrkningsmedium indeholder former af de ønskede vitamin-K-afhængige proteiner, som har forskelligt γ-carboxyglutamat indhold og dermed specifik aktivitet, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man: 10 a. fjerner divalente kationer fra mediet; b. bringer mediet i kontakt med en proteinbindende ionbytterharpiks under sådanne betingelser, at proteinet bindes til harpiksen; c. behandler det harpiksbundne protein med en divalent kation un- 15 der egnede betingelser til dannelse af et kation-protein-kompleks og derved til dissociering af det vitamin-K-afhængige protein med høj specifik aktivitet fra harpiksen, mens man efterlader det vitamin-K-afhængige protein med lavere specifik aktivitet bundet til harpiksen; og 20 d. behandler harpiks dissocieret kation-protein-komplekset under egnede betingelser til fjernelse af kationen og opnåelse af frit, biologisk aktivt protein.

Ifølge et andet aspekt tilvejebringer opfindelsen en fremgangsmåde til rens-25 ning af vitamin-K-afhængigt protein med høj specificitet fra et celledyrkningsmedium af transformerede celler, der producerer rekombinante vitamin-K-afhængige proteiner, hvilket celledyrkningsmedium indeholder former af det ønskede K-afhængige protein, som har forskelligt γ-carboxyglutamat indhold og dermed specifik aktivitet, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man: a. kombinerer celledyrkningsmediet indeholdende proteinerne med et chelatiserende middel, som er tilstrækkeligt til at fjerne endogene divalente kationer fra mediet; 30 4 DK 176090 B1 b. bringer blandingen fra (a) i kontakt med et ionbyttermateriale under egnede betingelser til fremkaldelse af binding af proteinerne til ionbyttermaterialet; > 5 c. bringer det proteinbundne ionbyttermateriale fra (b) i kontakt med en kilde til divalente kationer under egnede betingelser til dannelse af et kation-protein-kompleks og derved dissociering af det vitamin-K-afhængige protein med høj specifik aktivitet fra 10 harpiksen, mens man efterlader det vitamin-K-afhængige protein med lavere specifik aktivitet bundet til harpiksen; d. bringer det dissocierede kation-protein-kompleks dannet i (c) i kontakt med et chelatiserende materiale under egnede betingel- 15 ser til fjernelse af kationeme fra komplekset og derved opnå frit protein; e. renser det i (d) opnåede protein ved at bringe proteinet i kontakt med et andet ionbyttermateriale under egnede betingelser til 20 fremkaldelse af binding af proteinet til ionbyttermaterialet; f. bringer det proteinbundne ionbyttermateriale fra (e) i kontakt med et monovalent salt under egnede betingelser til dissociering af proteinet fra ionbyttermaterialet; 25 g. bringer det i (f) opnåede protein i kontakt med en divalent kation, som er tilstrækkelig til at danne et kation-protein-kompleks; h. bringer det i (g) opnåede kation-protein-kompleks i kontakt med 30 et hydrophobt materiale under egnede betingelser til fremkaldel se af binding af kation-protein-komplekset til det hydrophobe materiale; og 5 DK 176090 B1 i. bringer et chelatiserende middel i kontakt med det proteinbundne hydrophobe materiale fra (h) under egnede betingelser til fjernelse af kationeme fra kation-protein-komplekset og derved dissocierer proteinet fra det hydrophobe materiale.

5

Ifølge en foretrukken udførelseform af den foreliggende fremgangsmåde behandles celledyrkningsmediet, som indeholder det ønskede vitamin-K-afhængige protein, med et chelatiserende middel til fjernelse af endogene divalente kationer. Mediet bringes i kontakt med en ionbytterharpiks, for hvil-10 ken det har en stærk affinitet. Det vitamin-K-afhængige protein med høj specifik aktivitet elueres derefter fra harpiksen med en opløsning indeholdende divalente kationer, som bindes til proteinet, hvorved dette elueres som et protein-kation-kompleks. Vitamin-K-afhængig proteinet med lavere specifik aktivitet forbliver bundet til harpiksen. Det eluerede protein-kation-kompleks brin-15 ges derefter i kontakt med en harpiks, som indeholder et immobiliseret chela-tiseringsmiddel, der binder kationen. Chelatiseringsharpiksen binder fortrinsvis kationen, og proteinet alene elueres fra denne harpiks. Proteinet bringes derefter i kontakt med en anden ionbytterharpiks til yderligere rensning. Proteinet behandles med en anden kation-holdig puffer under dannelse 20 af et protein-kation-kompleks, og komplekset bringes i kontakt med en hy-drophob harpiks. Protein-kation-komplekset bindes stærkt til den hydrophobe harpiks. Den proteinbundne harpiks kan derefter behandles med et chelatise-ringsmiddel, som binder kationen, og protein med høj renhedsgrad kan derefter elueres fra den hydrophobe harpiks. Bindingsdifferencen mellem proteinet 25 og protein-kation-komplekset kan udnyttes til tilvejebringelse af en effektiv, ikke-denaturerende fremgangsmåde til udvinding af i det væsentlige rent, biologisk aktivt protein med udbytter på over 90% i hvert trin.

Fig. 1 viser et strømningsskema, der afbilder den omhandlede fremgangs-30 måde til rensning af et protein, som binder divalente kationer.

Fig. 2 viser elueringsprofilen for humant protein C fra en Pharmacia MonoQ ionbytterharpiks under anvendelse af en NaCl-gradient.

6 DK 176090 B1

Fig. 3 viser elueringsprofilen for humant protein C fra en Pharmacia Mono Q ion bytterharpiks under anvendelse af CaC^-gradient.

5 Fig. 4 viser elueringsprofilerne for humant protein C fra en Pharmacia Fast Flow Q ionbytterharpiks under anvendelse af både en CaC^-elueringspuffer og en puffer med højt indhold af NaCI.

HPC og de fleste andre vitamin-K-afhængige proteiner, binder divalente kat-10 ioner, såsom Ca2+. Det antages at størstedelen af bindingssites på proteinerne er modificerede glutaminsyrerester. Ohlin et al., 1988, J. Biol. Chem.. 263:7411-7417. Reaktionen, hvorved glutaminsyreresteme modificeres, er gamma-carboxylering, som er en post-translationel modifikation, der udføres af et mikrosomelt enzym, vitamin-K-afhængig carboxylase. De gamma-15 carboxylerede glutamater (kaldt Gla-rester) er nødvendige for biologisk aktivitet af vitamin-K-afhængige proteiner. I tilfælde af HPC skal de første ni efter hinanden følgende glutamatrester i HPC-proteinsekvensen f.eks. modificeres ved gammacarboxylering, hvis proteinet skal være biologisk aktivt (f.eks. have antitrombotisk aktivitet).

20

For HPC danner disse Gla-rester de fleste bindingssites for Ca2+. N. L. esmon et al., J. Biol. Chem.. 258:5548-5553 (1983). Der findes et Ca2+-bindingssite med høj affinitet, som dannes mellem det epidermale vækstfaktorlignende domæne i den lette kæde af HPC og den tunge kæde af HPC 25 som beskrevet af Johnson et al., i J. Biol. Chem.. 258:5554-5560 (1983); Ohlin og Stenflo, J. Biol. Chem.. 262:13798-13804 (1987); og Stearns et al., J.

Biol. Chem.. 269:826-832 (1986). Ændringen i overfladeladningsfordeling på HPC-proteinet skyldes neutralisering af de ni Gla-rester (2 negative ændringer pr. rest) med Ca2+, hvilket resulterer i et nettotab af 18 negative ladnin-30 ger. Ændringen i overfladeladningsfordeling i HPC forårsaget af Ca2+-binding kunne også være et resultat af konformationelle ændringer. Denne ændring i konformation påvirker dets bindingsprofil til konventionelle harpikser, såsom de der anvendes i ionbytterkromatografi og hydrophobkromatografi. Nærme- 7 DK 176090 B1 re bestemt får denne ændring konventionelle ionbytterkromatografiharpikser til at opføre sig som "pseudo-affinitef-harpikser.

Den omhandlede fremgangsmåde kan selektivt separere protein med lav 5 specifik aktivitet fra protein med høj specifik aktivitet. Denne selektivitet er baseret på antallet af Gla-rester, som er til stede på proteinet. F.eks. kan proteiner med lav specifik aktivitet (dvs. proteiner med færre Gla-rester) separeres fra proteiner med højere specifik aktivitet (dvs. proteiner med et højt antal Gla-rester) baseret på den højere affinitet af Gla-holdige proteiner for harpik-10 sen. Proteiner med et højere antal af Gla-rester vil vise mere udtalte konfor-mationelle og elektriske ændringer ved kompleksbinding med en divalent kation, såsom calcium, og disse proteiner med høj aktivitet vil derfor elueres lettere fra søjlen, når der anvendes en elueringspuffer indeholdende divalente kationer. Denne selektivitet er ekstrem kraftig og nyttig. Mange mammale 15 cellelinier er ikke i stand til at udtrykke fuldt biologisk aktive, rekombinante vitamin-K-afhængige proteiner som følge af manglende tilstedeværelse af alle Gla-resteme. Den omhandlede fremgangsmåde kan separerede fuldt aktive vitamin-K-afhængige proteiner fra mindre aktive former af det samme protein. Denne fremgangsmåde er simpel, prisbillig, og er let at sætte op af 20 ethvert biokemisk laboratorium.

Opfindelsen er baseret på anvendelsen af konventionelle kromatografiharpikser (såsom ionbytter- eller hydrophobe harpikser) som pseudo-affinitet-harpikser. Tilstedeværelsen eller fravær af en lav koncentration af en divalent 25 kation, specifikt Ca2\ påvirker elueringsprofilen for HPC på konventionelle kromatografiharpikser. Dette fænomen kan udstrækkes til alle vitamin-K-afhængige proteiner og/eller peptider, og potentielt til alle proteiner, der binder divalente kationer, herunder Ca2+-bindende proteiner, peptider eller ma-kromolekyler. Da Ca2+ er den fysiologisk mest udbredte divalente metalionef-30 fektor for binding til de kendte vitamin-K-afhængige proteiner, anvendes det til de fleste af de følgende forsøg. Imidertid kan andre divalente kationer, såsom strontium (Sr2*) og barium (Ba2+) sættes i stedet for Ca2+. Disse metalioner giver de samme resultater.

---^- η DK 176090 B1 8

Den omhandlede fremgangsmåde er effektiv for alle vitamin-K-afhængige proteiner, hvordan de end er produceret, herunder f.eks. humant protein C (HPC), faktor IX, faktor X, faktor il, faktor VII, humant protein S (HPS), prote-5 in Z, knogle-Gla-protein og knoglematrix-Gla-protein. Den omhandlede fremgangsmåde er effektiv for både vitamin-K-afhængige proteinzymogener, såsom HPC, og for de tilsvarende aktiverede former af serumproteaser, såsom aktiveret protein C (APC).

10 I en udførelsesform er den heri beskrevne opfindelse rettet på fremgangsmåder, som er nyttige til isolering, rensning, reaktivering og anvendelse af heterologe rekombinantproteiner, som efter ekspression i mikroorganismer (værtsceller), udskilles fra værtscellen i celledyrkningsmediet. I forbindelse med den foreliggende opfindelse refereres der til udskilte proteiner som 15 "eksporterede proteiner". I en anden udførelsesform er den foreliggende opfindelse rettet på isolering, rensning, reaktivering og anvendelse af eksporterede proteiner, som produceres i ikke-transformerede cellelinier.

Når rekombinant-DNA-teknologi anvendes til at inducere værtsmikroorga-20 nismer til at producere fremmede proteiner, refereres der ofte til sådanne proteiner som "heterologe proteiner" eller "rekombinantproteiner". Ifølge den foreliggende opfindelse skal der ved udtrykket "protein" forstås alle polypep-tider og proteiner, som binder divalente kationer. Udtrykkene "heterolog" og "rekombinant" anvendes vilkårligt for at betegne et protein, som udskilles af 25 en værtmikroorganisme, som binder en divalent kation.

Først klones proteinet ifølge velkendte standardrekombinant-DNA-fremgangsmåder. Koloningen af HPC er beskrevet af Beckmann et al. i Nucleic Acids research, 13:5233 (1985). Ekspressionen af rekombinant HPC 30 (rHPC) med humane nyre-293-celler er beskrevet af Grinnell et al. i Biotechnology. 5:1189-1192 (1987).

9 DK 176090 B1

Dyrkningsmediet opsamles og centrifugeres eventuelt ved 20.000 gange g i ca. 20 minutter i kølig luft (ved ca. 4 °C) til fjernelse af cellerester. Supema-tanten indeholder proteinet. Efter centrifugering kan en proteaseinhibitor, såsom benzamidin, og et chelatiserende middel, såsom EDTA eller EGTA, sæt-5 tes til mediet i en koncentration, der er tilstrækkelig til at fjerne alle divalente kationer (se fig. 1, trin 1 til 2). Mediet kan derefter bringes i kontakt med en ionbytterharpiks, såsom en anionisk kvatemær eller tertiær amin-baseret harpiks (fig. 1, trin 3). Nogle eksempler på tilgængelige egnede kommercielle harpikser omfatter Pharmacia Fast Flow Q (FFQ) og mono Q, og QAE-A50-10 120 og DEAE tertiær/kvatemær amin fra Sigma. Ifølge en udførelsesform af opfindelsen kan harpiksen være indeholdt i en søjle. Imidertid kan harpiksen også være i et leje eller en anden konfiguration, så længe mediet er i stand til at filtrere gennem og komme i kontakt med et tilstrækkeligt harpiksoverfladeareal til at sikre tilstrækkelig ionbytning. Dette trin udføres ved kølig stuetem-15 peratur (mellem 8 og 10 °C).

Harpiksen kan først ækvilibreres med en pufferopløsning med en neutral pH indeholdende en mindre mængde proteaseinhibitor, chelatiseringsmiddel og eventuelt et monovalent salt. Enhver neutral puffer kan anvendes, forudsat at 20 den ikke reagerer med Ca2+; f.eks. danner phosphatpuffer et uopløseligt kompleks med Ca2+, og kan således ikke anvendes. En foretrukket ækvilibre-ringspufferopløsning kan indeholde ca. 20 mmol trispuffer, 2 mmol EDTA, 2 mmol benxamidin og 0,15 mol NaCI og har et pH på ca. 7,4. Beholderen (f.eks. en søjle) kan derefter pakkes med harpiksen. Lejets volumen bør væ-25 re tilstrækkeligt til at tilvejebringe bindingssites for proteinet. Dyrkningsmediet, som allerede er behandlet med en proteaseinhibitor og et chelatiserende middel, hældes derefter på søjlen. Strømningshastigheden indstilles, således at maksimal proteinbinding optræder. I tilfælde af HPC bør den lineære strømningshastighed være ca. 40 til 80 cm pr. time.

Den påfyldte søjle kan derefter vaskes med ca. 3 eller flere søjlevolumina af en neutral puffer (f.eks. trispuffer, pH 7,4), som indeholder et monovalent salt (f.eks. NaCI eller KCI), en proteaseinhibitor (f.eks. benzamidin) og et chelati- 30 10 DK 176090 B1 serende middel (f.eks. EDTA). Der kan eventuelt gennemføres en anden vask med ca. 2 søjlevolumina neutral puffer indeholdende et salt og protea-seinhibitor. På dette tidspunkt er det ønskede protein bundet tæt til den io-niske harpiks, idet disse proteiner har en høj affinitet for harpiksen. De fleste 5 andre proteiner og kontaminanter i celledyrkningsmediet er vasket bort. Til fjernelse af proteinet fra søjlen anvendes en elueringspuffer indeholdende den divalente kation, fortrinsvis calcium (Ca2+) (fig. 1 trin 4). Calciumionerne vil fortrinsvis bindes til proteinet under dannelse af et Ca-protein-kompleks.

Dette kompleks har en lav affinitet for harpiksen, hvorved Ca-protein-10 komplekset vil være indeholdt i eluatet. Elueringspufferen kan være en kombination af en neutral puffer (f.eks. tris), et monovalent salt (f.eks. NaCI), et calciumsalt (f.eks. CaCI2) og en proteaseinhibitor (f.eks. benzamidin). En foretrukket elueringspuffer kan indeholde 20 mmol tris, 0,15 NaCI, 10 mmol CaCI2 og 5mmol benzamidin og har et pH på ca. 7,4. Proteinet elueres med 15 det andet søjlevolumen af eluenten. Ca. 90% af proteinet er elueret ved afslutningen af det andet søjlevolumen. Proteinudvinding efter dette trin er ca. 80-90%.

Det proteinholdige eluat kan derefter behandles med en harpiks indeholden-20 de et immobiliseret chelatiseringsmiddel, og derefter bringes i kontakt med en anden ionbytterharpiks (fig. 1, trin 5-7). Søjler eller lejer indeholdende disse to harpikser kan eventuelt være sat op i tandem, således at eluatet fra chelatiseringssøjlen strømmer direkte ind i ionbyttersøjlen. Alternativt kan eluatet fra chelatiseringssøjlen derefter opsamles og hældes på ionbyttersøj-25 len. En kommerciel chelatiseringssøjle indeholdende en harpiks med et immobiliseret chelatiseringsmiddel kan anvendes, såsom Chelex 100 (Biorad), som indeholder immobiliseret EDTA. Formålet med denne søjle er at fjerne calcium fra proteinet, lonbytterharpiksen kan være samme type som ionbyt-terharpiksen der anvendes i det første trin. I dette trin ækvilibreres begge 30 harpikser først ved vask med en neutral puffer (f.eks. trispuffer) indeholdende en lav koncentration af salt. Søjlernes kapacitet er afhængig af prøvens volumen. Lejevolumenet af chelatiseringssøjlen skal fortrinsvis være 20 ml for hver 200 ml prøve; og lejevolumen for ionbyttersøjlen skal fortrinsvis være 11 DK 176090 B1 ca. 50 ml for hver 0,5 til 1,0 g protein. Begge søjler bør opereres ved en strømningshastighed, der er tilstrækkelig til at fjerne ubundet calcium og endvidere rense proteinet. Dette trin kan også udføres ved kølig stuetemperatur. Ved en foretrukket fremgangsmåde hældes eluatet fra det første trin på 5 tandem-forbundne søjler. Den fyldte chelatiseringssøjle kan derefter vaskes med to søjlevolumina, baseret på chelatiseringssøjlevolumenet, af en puffer med neutral pH indeholdende en lav koncentration af salt. Når først væsken er elueret, kan chelatiseringssøjlen frakobles. Pådette tidspunkt er proteinet bundet til ionbyttersøjlen. Det har vist sig, at proteinet vil bindes til ionbytter-10 søjlen ved lave saltkoncentrationer og eluere ved højere saltkoncentrationer.

Til eluering af proteinet kan søjlen derfor behandles med en serie puffere indeholdende en saltgradient (se fig. 1, trin 8 og fig. 2). F.eks. kan en puffer bestående af trispuffer med pH 7,4 og 1 mol NaCI bringes i kontakt med søjlen under anvendelse af en serie opløsninger indeholdende mellem 0 og 15 50% af denne puffer over ca. 20 søjlevolumina. Proteinet begynder at eluere med opløsningen indeholdende ca. 27% puffer, og topværdien nås ved ca.

30% puffer. Proteinet kan også elueres under anvendelse af puffere med høj saltkoncentration i stedet for en gradient (f.eks. ca. 0,4 til 1 mol NaCI). Elue-ringen følges ved måling af ændringen i optisk densitet under anvendelse af 20 spektroskopi til måling af absorbans ved 280 nm som beskrevet af Kisiel og Davie i Meth. in Enzvmoloav. 80:320:332 (1981). På dette tidspunkt er proteinudvindingen mere end 90%.

De proteinholdige eluatfraktioner bringes derefter i kontakt med en hy-25 drophob harpiks med henblik på at koncentrere og rense proteinet ved fjernelse af proteinkontaminanter fra eluatet. En hydrophob harpiks, såsom phe-nylsuperose, kan anvendes. Kommercielt tilgængelige harpikser omfatter phenylsuperose på HR5/5 og phenylsepharose CL-4B, begge fra Pharmacia.

Den hydrophobe harpiks kan først ækvilibreres med en neutral puffer even-30 tuelt indeholdende et monovalent salt og en divalent kation. En foretrukket ækvilibrering'spuffer er 20 mM tris, 1 M NaCI og 10 mM CaCl2, med et pH på ca. 7,4.

12 DK 176090 B1 I dette trin behandles den proteinholdige fraktion, som er elueret fra det foregående trin, med en anden divalent kation, såsom en puffer indeholdende ca.

10 mM CaCb, og hældes på den hydrophobe harpiks og vaskes med ækvi-libreringspufferen (fig. 1, trin 9-10). Det har vist sig, at vitamin-K-afhængige 5 proteiner bindes svagt til hydrophobe harpikser, såsom phenylsuperose, i fravær af Ca2+; men har en høj affinitet for harpiksen under tilstedeværelse af Ca2\ og således kan elueres fra harpiksen med en opløsning indeholdende et chelatiseringsmiddel, såsom EDTA. Proteinet kan elueres med en elue-ringspuffer indeholdende en neutral puffer, en lav koncentration af monova-10 lent salt og et chelatiseringsmiddel. En foretrukket elueringspuffer kan indeholde ca. 20 mM tris, 0,15 M NaCI og 1 mM EDTA (pH 7,4).

Renheden af proteinet under anvendelse af denne fremgangsmåde er større end 98% bestemt ved SDSiPAGE-kromatografi. Laemmli, Nature. 227:680-15 685 (1974). Proteinet bibeholder også 100% biologisk aktivitet bestemt ved funktionelle assays, som beskrevet af Grinnell et al., i Biotechnology. 5:1189-1192 (1987).

Eksempler 1 til 7, 8A og 10 til 12 illustrerer generelt den fremgangsmåde, 20 som anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse. Eksempler 8B og 9 illustrerer specifikt den adskillelse af et vitamin-K-afhængigt protein med høj specifik aktivitet fra et lavere specifikt aktivitets vitamin-K-afhængigt protein ifølge den foreliggende opfindelse.

25 Opfindelsen belyses yderligere ved hjælp af de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Separering af HPC under anvendelse af anionbvttersøilekromatoarafi 30

En kvaternær ammonium-baseret stærk anionbytterharpiks (dvs. Fast Flow Q eller Mono-Q fra Pharmacia) anvendes til de følgende forsøg. Kvaternær ammonium-baseret harpiks fra ethvert anset kommercielt firma kan anven 13 DK 176090 B1 des (f.eks. QAE-A50-120 fra Sigma). Da HPC også bindes til tertiære ammonium-baserede harpikser, såsom DEAE-sepharose CL-6B (Sigma), kan disse harpikser også anvendes til opnåelse af de samme resultater.

5 Resultaterne viser, at HPC bindes til anionbytterharpiksen i fravær af Ca2+.

Materialer: Søjle: Pharmacia Mono-Q, HR5/5 10 Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500 system til at gennem køre NaCI gradienten

Puffer A: 20 mMTris, pH 7,4, 0,1 M NaCI

10 Puffer B: 20 mM Tris, pH 7,4,1 M NaCI

Strømningshastighed: 1 ml/min 15 NaCI gradient: 0-100% puffer B i 20 minutter Søjlen blev konditioneret som foreslået af producenten. Søjlen (lejevolumen 1 ml) blev derefter ækvilibreret med puffer A. En prøve indeholdende 6 mg plasma-HPC i 8,5 ml puffer A blev anbragt på søjlen, og søjlen blev vasket med tre søjlevolumina (3 ml) af puffer A forud for påbegyndelsen af NaCI-20 gradienten. Som vist i fig. 2 blev alt HPC bundet til harpiksen. Koncentrationen af HPC blev fulgt ved optisk densitetsmåling ved en måling af absorbans ved 280 nm som beskrevet af Kisiel and Davie i Meth. in Enzvmoloav. 80:320-332(1981).

25 Det viste sig, at hvis HPC er i puffer A indeholdende 2 mM CaCI2, vil HPC ikke bindes til mono-Q-søjlen. 2 mM CaCI2 er, hvad der typisk er tilstede i celledyrkningsmedier eller i humant plasma. HPC viste sig at eluere fra mo-no-Q harpiks med en opløsning indeholdende 0,4 M NaCI i 20 mM tris, (pH 7,4). Mængden af NaCI, der er nødvendig for at eluere HPC, er pH-30 afhængig. Jo lavere pH jo højere er f.eks. koncentrationen af NaCI, der er krævet, og jo højere pH jo lavere er koncentrationen af NaCI, der kræves.

14 DK 176090 B1 EKSEMPEL 2

Eluerinq af HPC fra en anionbvttersøile med en lav koncentration af CaCI? 5 Det følgende forsøg anvender Pharmacia Mono-Q søjlen og den samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1.

Materialer: Søjle: Pharmacia Mono-Q HR 5/5 10 Instrument: Pharmacia FPLC LCC-500

Puffer: 20 mM Tris, pH 7,4, 0,1 M NaCI

Puffer B: 20 mM Tris, pH 7,4, 0,1 NaCI, 30 mM CaCI2 strømningshastighed: 1 ml/min NaCI-gradient: 0-50% puffer B i 2 minutter 15 Søjlen blev ækvilibreret med puffer A. En prøve indeholdende 0,6 mg HPC opløst i 0,7 ml puffer A blev anbragt på søjlen med puffer A forud for frembringelsen af Ca2+-gradienten. HPC blev elueret med en gradient af 6-9 mM CaCI2 i 20 mM tris pH 7,4, 0,15 NaCI. Resultaterne, der vises i fig. 3, viser at 20 HPC elueres med stigende koncentrationer af CaCI2.

Mængden af HPC blev bestemt gennem bestemmelse af optisk densitet ved måling af absorbans ved 280 nm som beskrevet af Kisiel og Davies i Meth. in Enzvmoloav. 80:320-332 (1981).

25 EKSEMPEL 3

Specificitet af divalente metalkationer for eluerinq af HPC fra en anionbvttersøile 30

Forsøg blev sat op og gennemført som beskrevet i eksempel 2. Det viste sig at HPC kan elueres isokratisk med varierende koncentrationer af CaCI2 i puffer A eller puffer C.

15 DK 176090 B1

Puffer A: 20 mMTris, pH 7,4, 0,15 M NaCI Puffer C: 20 mM Tris, pH 7,4 5 Resultaterne er vist i tabel I.

TABEL I

Divalent kation Puffer A Puffer B Udbytte af HPC

10 5 mM CaCb + - 80% 10mMCaCI2 + - 95% 10 mM CaCI2 - + 0% 10 mM MgCI2 + - 20% 15

Data indikerede, at den divalente kationeffekt af Ca2+ ved eluering af HPC er ion-specifik, idet magnesiumchlorid (MgCI2) i den samme koncentration er meget mindre effektiv end CaCI2.

20 lonstyrken af pufferen indeholdende CaCI2 er også vigtig. I fravær af 0,15 M CaCI var CaCI2 i en koncentration på10 mM ineffektiv til eluering af HPC fra mono-Q-søjlen.

EKSEMPEL 4 25

Selektivitet ved anvendelse af 10 mM CaCI? til eluering af HPC i stedet for 0,4 M CaCI fra en Mono-Q-søile

To procent fetal kalveserum- (FCS) -konditioneret medium fra humane nyre-30 293-celler (Grinnell et al., (1987) Biotechnology, 5:1189-1192), som udtrykte 3,3 pg/ml rHPC, anvendtes til påvisning af opnåelse af 240-ganges rensning i et trin under anvendelse af en anionbyttersøjle.

16 DK 176090 B1 100 ml Pharmacia Fast Flow Q (FFQ) harpiks blev omhyggeligt fremstillet som anbefalet af producenten. FFQ-harpiksen blev derefter ækvilibreret med en pufferopløsning indeholdende 20 mM tris, 0,15 M NaCI, 2 mM EDTA, 2 mM benzamidin, (pH 7,4). EDTA og benzamidin blev sat til de 3,3 liter 2% 5 FCS-konditionerede medier indeholdende 3,3 pg/ml af rHPC til en slutkon-centration påhenholdsvis 4 mM og 5 mM. Dyrkningsmedierne blev derefter ledt gennem FFQ-søjlen (3x16 cm) ved en lineær strømningshastighed på 20 cm pr. time. Søjlen blev vasket først med 300 ml (3 søjlevolumina) af en opløsning indeholdende 20 mM tris, 0,15 M NaCI, 2 mM EDTA, 2 mM ben-10 zamidin (pH 7,4), og derefter 300 ml (3 søjlevolumina) af en opløsning indeholdende 20 mM tris, 0,15 M NaCI, 2 mM benzamidin (pH 7,4), og derefter 300 ml af en opløsning indeholdende 20 mM tris, 0,15 M NaCI, 2 mM benzamidin, 10 mM CaCl2 (pH 7,4). Søjlen blev derefter yderligere elueret med en opløsning indeholdende 20 mM tris, 0,4 M CaCI, 2 mM benzamidin (pH 15 7,4). Mængden af HPC blev bestemt ved måling af OD280 som beskrevet i eksempel 2. Specifik aktivitet af HPC blev bestemt ifølge fremgangsmåden beskrevet af Grinnell et al i Biotechnology. 5:1189-1192 (1987) som følger HPC blev først aktiveret med et immobiliseret trombomodulin-trombin-kompleks (opnået fra Dr. C. T. Esmon, Oklahoma Medical Research Founda-20 tion). Den amidolytiske aktivitet af det aktiverede protein C (APC) blev målt ved hydrolyse af et tripeptidsubstrat S-2238 (Helena). Antikoagulantaktivite-ten af HBC blev bestemt ved forlængelsen af en aktiveret partial trom-boplastintid (APTT) under anvendelse af reagenser fra Helena. Assays og definering af en enhed for den specifikke aktivitet af HPC er som beskrevet af 25 Grinnell et al. Resultaterne er vist i fig. 4 og nedenfor i tabel II.

17 DK 176090 B1

TABEL II

5 Prøve Total Total Renhed af Specifik protein rHPC rHPC aktivitet (mg) (mg) [HPC] antigen (enheder/ mg/HPC) 10 Startmedier 4422 10,9 0,25% 0,074 ubundet fraktion 4290 0,016 0,0004% 15 10 mM CaCl2 fraktion 16,2 9,4 58% 17,5

20 0,4 M

NaCl fraktion 115,2 0,12 0,1% 25 Resultaterne fra dette forsøg demonstrerer klart, at renheden af rHPC blev forøget fra 0,25% i udgangsmaterialet til ca. 58% (en total forøgelse på 232 gange)." ~ "

Ved anvendelse af den "konventionelle" metode til elu-ering af rHPC med 0,4 M NaCl er renheden af rHPC på det 30 trin til sammenligning kun 7% (en total forøgelse på 28 gange). Den foreliggende metode gav således yderligere 8,3 gange rensning.

EKSEMPEL 5 35

Eluerinq af proteiner fra anionbytterkromatografi er specifik for proteiner, der binder Ca^*, og vitamin-K-afhæn- i ^_______ i 2+ 18 DK 176090 B1 gige proteiner.

To proteiner, som ikke binder Ca og ikke er afhængige af vitamin-K, blev anvendt i dette eksempel. Begge pro-5 teiner bindes normalt til Pharmacia Mono-Q-søjlen under de i eksempel 1 specificerede betingelser, dvs. 20 mM tris, 0,15 M NaCl (pH 7,4). De to anvendte proteiner var glucose-oxidase og amyloglucosidase (Aspergillus niger Cat. # G2133 og A3423, fra Sigma). Forsøgene beskrevet i 10 eksempel 1 og 2 blev gentaget for hver af de to proteiner, og resultaterne er vist i tabel III.

TABEL III

15

Protein Koncentration af Koncentration af

CaCl2 påkrævet NaCl påkrævet for

for eluering i eluering i 20 mM

20 20 mM Tris, 0,15 M Tris (pH 7,4)

NaCl (pH 7,4)

Glucose- 25 oxidase 18 mM 0,30 m

Amyloglucosidase over 20 mM 0,36 30 HPC 9 mM 0,40 EKSEMPEL 6 35 Selektivitet af "pseudo-affinitet"-metoden til fjernelse af ikke-protein-kontaminanter 19 DK 176090 B1

Konditionerede dyrkningsmedier fra humane nyre-293-cel-ler, som udtrykker rHPC, blev anvendt til dette forsøg. Grinnell et al., Biotechnology, 5:1189-1192 (1987).

Dyrkningsmedierne indeholdt endotoxin (lipopolysaccharid 5 A) en mængde på 80 endotoxinenheder pr. ml (8 ng endo-toxin/ml). Endotoxiner er heterogene molekyler af lipopolysaccharid, som er negativt ladet, og afledet fra den ydre kappe af gramnegativ bakterier. Forsøg blev udført som beskrevet i eksempel 4, bortset fra at endotoxin-10 niveauet blev målt i stedet for den totale proteinkoncentration. Endotoxinniveauer blev målt under anvendelse af et endotoxin-assay-kit fra Whittaker Bioproducts. Ved en startværdi på ialt 4 x 10^ endotoxinenheder blev 5,7 x 4 10 endotoxinenheder udvundet i rHPC-toppen, som blev 15 elueret med 10 mM CaC^» 20 mM tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4.

Dette repræsenterer en total fjernelse af 98,5% af endo-toxinet fra udgangsdyrkningsmediet efter ettrinsrensning.

EKSEMPEL 7 20

Selektivitet af "pseudo-affinitet"-metoden til fjernelse af kontaminerende organismer

Forsøg blev udført som beskrevet i eksempel 6. 5 x 10^ 25 phi-X174 phager (ATCC number 13706-sin shiemer-c-bl) blev indført i konditioneret dyrkningsmedie fra humane nyrer-293-celler, som udtrykte rHPC. Dette medium blev derefter 5 ledt gennem FFQ-søjlen. Kun 1 x 10 phi-X174-phager blev udvundet i den CaCl9-eluerede fraktion indeholdende rHPC, 30 mens 2-3 x 10 phi-X174-phager blev udvundet i den 0,4 M NaCl-eluerede fraktion. Dette viser, at CaC^ eluering ("pseudo-affinitet”-metoden) giver 20-30 gange bedre selektivitet end 0,4 M NaCl-eluering (konventionel metode) .

35 20 DK 176090 B1 EKSEMPEL 8

Rensning af rekombinant human protein S (HPS).

5 A. Rensning af rHPC produceret af AV12-celler HPS er et vitamin K-afhængigt protein indeholdende 11 Gla-rester. Konditioneret kulturmedium indeholdende HPS blev opnået ved konventionel transformation af syrisk 10 hamster AV12-celler (ATCC nummer CRL 9595, deponeret 24.

november 1987) med plasmid pShD, som var konstrueret i væsentlig overensstemmelse med beskrivelsen i EP patentansøgning A 247 843, publiceret 12. februar 1987 og omfattet af den foreliggende beskrivelse som reference, og ^5 blev anvendt til det følgende forsøg.

Den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde blev gentaget under anvendelse af det foreliggende dyrkningsmedium indeholdende rHPS. rHPS blev elueret under anvendelse af 20 den "konventionelle" metode (beskrevet i eksempel 7) fra en Pharmacia FFQ-søjle ved en opløsning af 20 mM tris, 0,33 M NaCl, (pH 7,4). CaC^-elueringsfremgangsmåden beskrevet i eksempel 2 blev derefter anvendt til dyrkningsmediet indeholdende rHPS. rHPS blev elueret med held 25 under anvendelse af "pseudo-affinitet"-metoden fra FFQ-søjlen med en opløsning af 20 mM tris, 0,15 M NaCl, 3,5 mM CaCl2 (pH 7,4). . - - - B. Rensing af rHPS med høj specifik aktivitet og produ-30 ceret af 293-celler rHPS blev også opnået ved konventionel transformation af humane nyrer-293-celler med plasmid pShD, hvorefter cellerne blev dyrket i serumfrit medium. rHPS dyrknings-35 mediet blev sat til Pharmacia Fast Flow Q harpiks og derefter vasket med puffer A i væsentlig overensstemmelse med beskrivelsen i eksempel 1· Den i eksempel 2 beskrevne 21 DK 176090 B1

CaCl2~elueringsfremgangsmåde blev derefter anvendt til HPS-dyrkningsmediet, bortset fra at elueringspufferen indeholdt 20 mM Tris, 0,15 NaCl, 3,9 mM CaCl2 (pH 7,4).

Ca. tre søjlevolumina blev opsamlet, hvorefter søjlen 5 blev elueret ved en puffer indeholdende 20 mM Tris, pH 7,4, 0,5 M NaCl. Den biologiske aktivitet af det eluerede rHPS fra begge elueringspuffere blev derefter afprøvet under anvendelse af assaymetoden ifølge Malm, et al (1987) Eur. J, Biochem. 165:39-45 hvis indhold er 10 omfattet af den foreliggende beskrivelse som reference.

rHPS opnået fra AVI2-transformerede celler dyrket i serumfrit medium (som i eksempel 8A) blev også anbragt på Pharmacia Fast Flow Q harpiks. AVl2-afledte rHPS blev 15 derefter elueret under anvendelse af 3,0 mM CaCl2, efterfulgt af en 0,5 M NaCl-eluering, i det væsentlige som beskrevet ovenfor for det 293-afledte rHPS. Bioaktiviteter blev derefter bedømt ved fremgangsmåden ifølge Malm et al.

20 97% af den totale funktionelle aktivitet af det 293-af ledte rHPS blev elueret med en opløsning af 20 mM Tris, 0,15 NaCl, 3,0 mM CaCl2 (pH 7,4) (CaCl2-fraktion), mens de resterende 3% af den funktionelle aktivitet af de 293-25 afledte rHPS blev elueret med en opløsning af 20 mM Tris, 0,5 M NaCl (pH 7,4), (NaCl -fraktion). Imidlertid blev kun 43% af den totale funktionelle aktivitet af det AV12-" ~ afledte rHPS elueret i CaCl2~fraktionen, mens 53% af den funktionelle aktivitet af det AV12-afledte rHPS blev 30 elueret i NaCl-fraktionen.

Gla-indholdet og beta-hydroxyaspartat-indholdet blev målt i både CaCl2~ og NaCl-fraktionen af rHPS som bekrevet i eksempel 9. rHPS-molekylerne fra CaCl- og NaCl -frak-35 tionen udviste ingen forskel i beta-hydroxyaspartat-indholdet, molvægt (reduceret og ikke-reduceret SDS-PAGE) og N-terminalproteinsekvens. Imidertid adskilte rHPS- 22 DK 176090 B1 molekylerne fra de to fraktioner sig med hensyn til Gla-indehold, idet molekylet fra NaCl-fraktionen har to færre Gla-rester end molekylet fra CaCl2“fraktionen. Dette forklarer den lavere specifikke aktivitet (ca. 50% min-5 dre) af rHPS afledt fra AV12-celler i sammenligning med fuldt funktionelt rHPS afledt fra 293-celler.

Dette forsøg viste, at "pseudo-affinitet”-metoden (CaC^-fraktion) til eluering af rHPS under anvendelse af 10 anionbytterkromatografi selektivt kan separere rHPS med lav specifik aktivitet (lavt: Gla-indhold) fra rHPS med høj specifik aktivitet (højt Gla-indhold).

EKSEMPEL 9 15 rHPC med en høj specifik aktivitet kan separeres fra rHPC med lav specifik aktivitet

Human prothrombin-protein har 10 Gla-rester, som er 20 essentielle for biologisk aktivitet. Borowski et al., J.

Biol. Chem., 260:9258-9264 (1985). Naturlige varianter af human protombin, som mangler to eller fire Gla-rester bevarer kun 66 henholdsvis 5% af deres biologiske aktivitet. Da prothrombin, som mangler 2 Gla ud af et 25 total på 10 Gla, resulterer i et tab af mere end 30% aktivitet, er tilstedeværelsen af alle Gla-rester esentiel for fuld aktivitet.

rHPC, som kun var partiel aktiv (30-60% antikoagulantak-30 tivitet i sammenligning med en plasma-HPC-standard) ved måling i det rå dyrkningsmedium, blev opnået ved transformation af syrisk hamster AVl2-celler (ATCC nummer CRL 9595) med plasmid p4-14, konstrueret i væsentlig overensstemmelse med US patentansøgning nr. 129.028, indleveret 35 4. december 1987. Aktiviteten blev malt som beskrevet for HPC i eksempel 4. rHPC fra dette dyrkningsmedium blev absorberet og elueret ifølge fremgangsmåden beskrevet i 23 DK 176090 B1 eksempel 4.

45% af det totale udgangs-rHPC i dyrkningsmediet blev elueret med en opløsning af 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, 10 5 mM CaCl2 (pH 7,4) (CaCl2-fraktion), og 20% blev elueret med 20 mM Tris, 0,4 M NaCl (pH 7,4) (NaCl-fraktion). Antikuagolantaktiviteten af rHPC i CaCl2~fraktione og i NaCl-fraktionen var 100% henholdvis 25%, i sammenligning med en plasma-HPC-standard. Gla-indholdet og beta-hy-10 droxyaspartat-indholdet blev målt i rHPC i både CaCl2-fraktionen og i NaCl-fraktionen, under anvendelse af en fremgangsmåde, som var tilpasset fra fremgangsmåden beskrevet af Kuwanda og Katayama i Anal« Biochem., 131:173-179 (1983): den alkaliske hydrolyse af proteinet forud 15 for aminosyreanalysen blev gennemført i et hætteglas af teflon med miniert-ventiler. (Pierce, Cat. # 14005,10130). Proteinprøven i 2,5 N NaO blev evakueret og skyllet med N2 via miniert-ventilen under anvendelse af en Waters picotag work station. Efter 20 timers hydro-20 lyse ved 110 °C blev hydrolysatet neutraliseret, ekstraheret og derivatiseret med o-phthalaldehyd/ethanthiol som beskrevet af Kuwada og Katayama. HPLC-analysen blev udført under de følgende betingelser: 25 Søjle : Nucleosil 5SB (4,6 x 50) (Macherey-Nagel)

Isokratisk eluering: 20 mM Na citrat, pH 4,30 i 50% acetylnitril Strømningshastighed: 1,5 ml/minut.

30 De følgende elueringstider opnåedes: 35 24 DK 176090 B1

AMINOSYRER ELUERINGSTID

Ikke-sure aminosyrer 6 minutter 5 Glu 9,5 minutter 10 Asp 13 minutter erythyro-beta-OH-asp 20 minutter threo-beta-OH-asp 34 minutter

Gla 44 minutter 10 cysteinsyre 53 minutter

CaCl^-fraktionen og NaCl-fraktionen viste sig at indeholde 9 henholdsvis 6,5 mol Gla pr. mol rHPC.

15

Antallet af Gla-rester, som er til stede, stemmer godt overens med den biologiske aktivitet i rHPC som forudsagt ud fra det i litteraturen for andre vitamin-K-afhængige proteiner rapporterede. Borowski et al., J. Biol. Chem., 20 260:9258-9264 (1985). Bortset fra forskellen i Gla- indhold i rHPC fra CaC^-fraktionen henholdsvis NaCl-fraktionen, blev ingen anden forskel påvist med hensyn til beta-hydroxyaspartat-indhold, molekylvægte (reduceret og ikke-reduceret SDS-PAGE) og N-terminalproteinsekvens.

25 N-terminalproteinsekvensanalyse blev gennemført med automatiseret Edman-nedbrydningskemi på Applied Biosystem model 470A gas phase sequenator med et on-line HPLC-‘ ' system (model 120A) til analyse af PTH-aminosyrer.

30 Dette forsøg påviste, at "pseudo-affinitet"-metoden (CaC^-fraktion) til eluering af rHPC under anvendelse af anionbyttersøj lekromatografi selektivt kan separere rHPC med lav specifik aktivitet (lavt Gla-indhold) fra rHPC med høj specifik aktivitet (højt Gla indhold).

35 25 DK 176090 B1 EKSEMPEL 10

Eluering af aktiveret humant protein C (APC) fra en an-ionbyttersøjle 5 HPC er zymogenformen af den aktive serinprotease, aktiveret human protein C (APC). Den eneste molekylære forskel mellem HPC og APC er, at APC mangler et 12-amino-syrepeptid i N-terminalen af den tunge kæde i HPC. Der er 10 således ingen forskel på Gla-indholdet i APC og HPC.

rAPC blev fremstillet ud fra rHPC med immobiliseret thrombomodulin-thrombin-kompleks som beskrevet af Grin-nell et al., i Biotechnology, 5^:1189-1192 (1987). Den i 15 eksempel 1 og 2 beskrevne forsøgsprotokol blev gentaget for rAPC. Resultaterne af elueringsprofiler af rAPC fra en Pharmacia Mono-Q-søjle var identiske med profilen af rHPC. Den nødvendige mængde CaCl^ eller NaCl for eluering af rAPC for enten "pseudo-affinitet"-metoden eller den 20 "konventionelle"-metode var identisk med mængden for rHPC.

EKSEMPEL 11 25 Hydrophob søjlekromatografi

Tre af de mest almindelige konventionelle typer søjle'-' ' kromatografier, som anvendes i biokemisk forskning, er ionbytter, hydrophob/modfase og størrelses-eksklusion. De 30 førsnævnte to typer er afhængige af overfladeladningsfordelingerne på de pågældende biokemiske forbindelser, mens størrrelseseksklusionkromatografi ikke er det. Hydrophob søjlekromatografi blev derfor anvendt til illustration af, at vitamin-K-afhængige proteiner med "pseudo-affini-35 tet" kan separeres på denne søjletype under anvendelse af "pseudo-affinitet"-metoden.

26 DK 176090 B1

Hydrophobe sidekæder bindes til en fast bærer til frembringelse af hydrophobe søjleharpikser. Phenylgrupper blev anvendt til denne illustration. Andre hydrophobe sidekæder, såsom varierende længder af alifatiske carbonhy-5 drider, kan også anvendes. To forskellige typer af faste bærere blev anvendt til phenylsuperose HR 5/5 og phenyl-sepharose CL-4B, begge fra Pharmacia.

(a) Materialer: 10 Søjle : Pharmacia phenyl superose HR 5/5

Puffer A : 20 mM Tris, 2 M NaCl, pH 7,4

Puffer B : 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4

Puffer C : 20 mM Tris, 2 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4 15 Puffer D : 20 mM tris, 0,15 M NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7,4

Strømningshastighed : 0,5 ml/min.

Kromatograf i- 20 system : Pharmacia FPLC LCC-500 system Søjlen blev fremstillet som foreslået af producenten og derefter ækvilibreret med puffer A. 1 mg rHPC blev opløst i puffer A og derefter påført på søjlen. Koncentrationen 25 af protein blev fulgt ved måling af optisk densitet ved 280 nm. rHPC blev ikke bundet til søjlen. Intet yderligere materiale kunne elueres med en gradient af 0-100% puffer B på 40 minutter. rHPC blev opløst i puffer C og derefter anbragt på søjlen. Alt rHPC blev bundet til phe-30 nylsuperosesøjlen. Den eneste forskel mellem puffer A og C er at puffer C indeholdt 10 mM CaCl2· En gradient af 0-100% puffer D blev udviklet over 40 minutter. rHPC blev elueret ved 60% puffer D og 40% puffer C, eller ved 20 mM Tris, 0,9 M NaCl, 10 mM CaCl2, (pH 7,4).

Det blev således vist, at rHPC har en højere affinitet for hydrophobe harpikser under tilstedeværelse af en lav 35 27 DK 176090 B1 koncentration af Ca^+.

Forsøget blev gentaget under anvendelse af en phenylse-pharosesøjle: 5 (b) Materialer; Søjle : Pharmacia pehnyl sepharose Cl~4B 0,5 x 5 cm

Strømnings- 10 hastighed : 0,5 ml/min.

Det blev påvist, at rHPC bindes 100% til søjlan enten med puffer A (20 mM Tris, 2 M NaCl, pH 7,4) eller med en opløsning af 20 mM Tris, 1 M NaCl,-10 mM CaC^, (pH 7,4).

15 rHPC blev imidlertid ikke bundet til søjlen i en op løsning af 20 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7,4.

EKSEMPEL 12 20 Anvendelse af "pseudo-affinitef-kromatoqrafi til rens ning af rHPC fra celledyrkninqsmedier

Det følgende skema er et eksempel på et rensningsskema for et givet sæt betingelser og variabler.

25

Alle de følgende trin blev udført ved kølig stuetemperatur (8-10 °C). - - -

Trin 1 30

Anionbytter Fast Flow Q søjle

Serumfrit, konditioneret dyrkningsmedium fra 293-celler, som udtrykte rHPC med 5 Mg/ml blev anvendt. Det serumfrie 35 dyrkningsmedium indeholdt protein/peptid-supplement af insulin, transferrin. Koncentrationen af rHPC udgjorde generelt 10-15% af det totale protein i det konditioner- 28 DK 176090 B1 ede dyrkningsmedium. Pharmacia Fast Flow Q harpiks (FFQ) blev renset med 1 N HC1 og 1 N NaOH på den af producenten anbefalede måde. Harpiksen blev derefter pakket i en 10 x 20 cm søjle. For hver 500 liter dyrkningsmedium anvendtes 5 1 liter FFQ-harpiks. Søjlen blev pakket til en strøm ningshastighed på 120 cm pr. time med 20 mM Tris, 1 M NaCl, (pH 7,4). Søjlen blev ækvilibreret med en opløsning af 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, 3 mM benzamidin, (pH 7,4).

10

Opløsninger af 0,2 M EDTA, (pH 7,4) og 1 M benzamidin blev sat til dyrkningsmediet indeholdende rHPC til en slutkoncentration på 4 mM henholdsvis 5 mM. Dyrkningsmediet blev derefter tilført FFQ søjlen med en strøm-15 ningshastighed på 80 cm pr. time.

FFQ-søjlen blev derefter vasket med et minimum af 3 søjlevolumina af en opløsning indeholdende 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, 2 mM EDTA, 5 mM benzamidin, (pH 7,4). FFQ-2o søjlen blev derefter yderligere vasket med et minimum af 3 søjlevolumina af en opløsning indeholdende 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, 5 mM benzamidin, (pH 7,4). rHPC'blev elueret med en opløsning af 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, 10 mM CaC^, 5 mM benzamidin, (pH 7,4). Strømningshastigheden var 5 cm 25 pr. time. rHPC blev påvist med Bradford protein-reagens (M. Bradford, (1976) Anal. Biochem., 73:248-254) eller ELISA assay som beskrevet af Grinnell et al., Biotechno-logy, 5:1189-1192 (1987). rHPC elueredes ved begyndelsen af det andet søjlevolumen under anvendelse af denne 30 elueringspuffer. 90% rHPC blev elueret med et halvt søjlevolumen.

35 29 DK 176090 B1

Trin 2

Chelex 100 søjle i tandem med Fast Flow Q søjle 5 En Chelex 100 søjle (Bio-rad) blev anvendt til fjernelse af Ca2+ i rHPC fra trin 1. FFQ-søjlen blev drevet på konventionel måde i dette trin. Chelex 100 harpiks (300 ml) blev vasket med 1 N Na0H-H20-l N HCL-H20 som anbefalet af producenten. Harpiksen blev pakket i en 3,2 x 40 cm søjle 10 og blev vasket med en opløsning af 1 M Tris, (pH 7,4).

Søjlen blev ækvilibreret med en ækvilibreringspuffer indeholdende 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, (pH 7,4). Vask med 1 M tris var nødvendig for at opnå hurtig ækvilibrering af Chelex 100 til pH 7,4. FFQ-søjlen (3,2 x 25 cm) blev 15 renset som beskrevet i trin 1 og ækvilibreret med en opløsning af 20 mM Tris, 0,15 NaCl, (pH 7,4). Chelex 100 søjlen blev sat op i tandem med FFQ-søjlen, således at eluatet indeholdende rHPC fra trin 1 ville passere gennem Chelex 100 først og derefter gennem FFQ.

20

Efter påførsel af alt rHPC fra trin 1 blev søjlerne vasket med 1,5 liter af ækvilibreringspufferen. Chelex 100 søjlen blev derefter koblet fra FFQ-søjlen.

25 FFQ-søjlen blev yderligere vasket med 600 ml af ækvilibreringspuf feren. FFQ-søjlen blev derefter vasket med 600 ml af en opløsning af 20 mM Tris, 0,25 M NaCl, (pH 7,4)."

Intet rHPC blev elueret her. rHPC blev elueret fra FFQ med en opløsning af 20 mM Tris, 0,4 M NaCl, (pH 7,4) med 30 højt saltindhold; rHPC blev påvist ved at følge absorban-sen ved 280 nm. Udbyttet af rHPC fra dette trin var 90-95%.

35 30 DK 176090 B1

Trin 3

Hydrophob phenyl-sepharose harpiks 5 En 3,2 x 40 cm søjle af phenyl-sepharose CL-4B (Pharmacia) blev pakket og derefter vasket med 3 søjlevolumina af hver af de følgende opløsninger med en strømningshastighed på 20 cm pr. time: 50% methanol; H20; 1% eddikesyre; Η2<3; 0,1 M NaOH; H20.

10 Søjlen blev derefter aekvilibreret med en ækvilibrerings-puffer indeholdende 20 mM Tris, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, (pH 7,4). rHPC fra trin 2 blev fortyndet med samme volumen af en opløsning indeholdende 20 mM Tris, 2 M 15 NaCl, 20 mM NaCl2, (pH 7,4), og ført gennem søjlen.

Søjlen blev yderligere vasket med 1 liter ækvilibrerings-puffer. rHPC blev elueret med en opløsning af 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA, (pH 7,4).

20

Udvinding af rHPC på dette trin var ca. 85%. Renheden er større end 98% målt ved SDS-PAGE (Laemmli, (1974) Nature, 227:680-685), eller specifik aktivitet som beskrevet i eksempel 4. Niveauet af endotoxin blev reduceret 10 gange 25 efter dette trin.

Ækvivalenter ~ '

En fagmand vil kende eller kunne finde talrige ækvivalen-30 ter til de specifikke stoffer og fremgangsmåder, der her er beskrevet, udelukkende på baggrund af rutineforsøg.

Sådanne ækvivalenter betragtes som omfattet af opfindelsen og er dækket af de følgende krav.

35

Claims (16)

31 DK 176090 B1

1. Fremgangsmåde til udvinding og oprensning af vitamin-K-afhængige proteiner fra et celledyrkningsmedium af celler, som producerer vitamin-K- 5 afhængige proteiner, hvilket celledyrkningsmedium indeholder former af de ønskede vitamin-K-afhængige proteiner, som har forskelligt γ- carboxyglutamat indhold og dermed specifik aktivitet, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man: ίο a. fjerner divalente kationer fra mediet; b. bringer mediet i kontakt med en pnoteinbindende ionbytterharpiks under sådanne betingelser, at proteinet bindes til harpiksen; c. behandler det harpiksbundne protein med en divalent kation under egnede betingelser til dannelse af et kation-protein-kompleks og 15 derved til dissociering af det vitamin-K-afhængige protein med høj specifik aktivitet fra harpiksen, mens man efterlader det vitamin-K-afhængige protein med lavere specifik aktivitet bundet til harpiksen; og d. behandler harpiks dissocieret kation-protein-komplekset under egnede betingelser til fjernelse af kationen og opnåelse af frit, biologisk aktivt 20 protein.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at det vitamin-K-afhængige protein vælges blandt aktiveret humant protein C, humant protein C zymogen og humant protein S. 25

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at fjernelse af divalente kationer i (a) omfatter tilsætning af et chelatiserende middel til mediet.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at den divalente kation vælges blandt ionisk calcium, barium og strontium. 32 DK 176090 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den proteinbindende ionbytterharpiks omfatter en anionisk amin-baseret ionbytterharpiks.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at behandlingen af kation-protein-komplekset i (d) omfatter kombinering af chelatiserende middel med komplekset.

7. Fremgangsmåde til rensning af vitamin-K-afhængigt protein med hø] 10 specificitet fra et celledyrkningsmedium af transformerede celler, der producerer rekombinante vitamin-K-afhængige proteiner, hvilket celledyrkningsmedium indeholder former af det ønskede K-afhængige protein som har forskelligt γ-carboxyglutamat indhold og dermed specifik aktivitet, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man: 15 a. kombinerer celledyrkningsmediet indeholdende proteinerne med et chelatiserende middel, som er tilstrækkeligt til at fjerne endogene divalente kationer fra mediet; 20 b. bringer blandingen fra (a) i kontakt med et ionbyttermateriale under egnede betingelser til fremkaldelse af binding af proteinerne til ion byttermateria let; c. bringer det proteinbundne ionbyttermateriale fra (b) i kontakt med en 2. kilde til divalente kationer under egnede betingelser til dannelse af et kation-protein-kompleks og derved dissociering af det vitamin-K-afhængige protein med høj specifik aktivitet fra harpiksen, mens man efterlader det vitamin-K-afhængige protein med lavere specifik aktivitet bundet til harpiksen; 30 d. bringer det dissocierede kation-protein-kompleks dannet i (c) i kontakt med et chelatiserende materiale under egnede betingelser til fjernelse af kationerne fra komplekset og derved opnå frit protein; 33 DK 176090 B1 e. renser det i (d) opnåede protein ved at bringe proteinet i kontakt med et andet ionbyttermateriale under egnede betingelser til fremkaldelse af binding af proteinet til ionbyttermaterialet; 5 f. bringer det proteinbundne ionbyttermateriale fra (e) i kontakt med et monovalent salt under egnede betingelser til dissociering af proteinet fra ionbyttermaterialet; g. bringer det i (f) opnåede protein i kontakt med en divalent kation, som ίο er tilstrækkelig til at danne et kation-protein-kompleks; h. bringer det i (g) opnåede kation-protein-kompleks i kontakt med et hydrophobt materiale under egnede betingelser til fremkaldelse af binding af kation-protein-komplekset til det hydrophobe materiale; og 15 i. bringer et chelatiserende middel i kontakt med det proteinbundne hydrophobe materiale fra (h) under egnede betingelser til fjernelse af kationeme fra kation-protein-komplekset og derved dissocierer proteinet fra det hydrophobe materiale. 20

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den divalente kation vælges blandt ionisk calcium, barium og strontium.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at det 25 vitamin-K-afhængige protein vælges blandt aktiveret humant protein C, humant protein C zymogen og humant protein S.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det chelatiserende middel omfatter EDTA. 30

11. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at ionbyttermaterialet fra (b) omfatter en anionisk aminbaseret ionbytterharpiks. 34 DK 176090 B1

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at ionbytterharpiksen pakkes i en søjle.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det 5 chelatiserende materiale fra (d) omfatter en harpiks, hvorpå EDTA er immobiliseret.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at ionbyttermaterialet fra (e) omfatter en anionisk aminbaseret ionbytterharpiks. 10

15. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det monovalente salt fra (f) omfatter natriumchlorid i en koncentration på mellem ca. 0,4 M og ca. 1,0 M.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det hydrophobe materiale fra (h) vælges blandt phenylsuperoseharpiks og phenylsepharoseharpiks.