JPH07100032B2 - 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 - Google Patents
高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法Info
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- JPH07100032B2 JPH07100032B2 JP61178490A JP17849086A JPH07100032B2 JP H07100032 B2 JPH07100032 B2 JP H07100032B2 JP 61178490 A JP61178490 A JP 61178490A JP 17849086 A JP17849086 A JP 17849086A JP H07100032 B2 JPH07100032 B2 JP H07100032B2
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- plasminogen activator
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は高純度組織性プラスミノーゲン活性化因子（以
下tPAと略称する）の製法に関する。
下tPAと略称する）の製法に関する。
tPAは血栓に対し強い新和性を有し、かつ優れた血栓溶
解活性を有する物質であることから、血栓症治療剤とし
て有用なものである。
解活性を有する物質であることから、血栓症治療剤とし
て有用なものである。
＜従来技術＞ 近年、最も重要な血栓症治療法は、酵素学的に循環系か
ら血栓を除去する方法と考えられている。
ら血栓を除去する方法と考えられている。
上記目的で現在実用化されている物質には、ウロキナー
ゼとストレプトキナーゼがある。
ゼとストレプトキナーゼがある。
これ等の血栓溶解剤は、血中ならびにフィブリン結合の
プラスミノーゲンを活性化し、全身的線溶活性化を起こ
すが、出血傾向を示すとの欠点がある。
プラスミノーゲンを活性化し、全身的線溶活性化を起こ
すが、出血傾向を示すとの欠点がある。
そこで、副作用の少ない新しい血栓溶解剤としてtPAが
最近着目をあびている。
最近着目をあびている。
即ち、tPAは全身性にフィブリノーゲン量やα２−アン
チプラスミン量を変化させることなく線溶活性を示すこ
とが知られるに至った。このことは、ウロキナーゼやス
トレプトキナーゼにより惹起される出血傾向を回避でき
ることを示すものである。
チプラスミン量を変化させることなく線溶活性を示すこ
とが知られるに至った。このことは、ウロキナーゼやス
トレプトキナーゼにより惹起される出血傾向を回避でき
ることを示すものである。
tPAの生理的役割に大きな関心が寄せられているにもか
かわらず、これまで本物質の実用化の進展が極めてゆる
やかであった主な理由は、本酵素が哺乳動物の組織に極
めて微量しか含まれていず高純度のtPAを大量に製する
ことが困難であったことにある。
かわらず、これまで本物質の実用化の進展が極めてゆる
やかであった主な理由は、本酵素が哺乳動物の組織に極
めて微量しか含まれていず高純度のtPAを大量に製する
ことが困難であったことにある。
即ち、tPAは哺乳動物、例えば、牛、豚、等の各種臓器
組織中に、又人由来のtPAは人の正常組織、例えば、血
管、腎臓、子宮などに極く微量存在し、これらのうち豚
心臓と人子宮には比較的多く存在するとされている。
組織中に、又人由来のtPAは人の正常組織、例えば、血
管、腎臓、子宮などに極く微量存在し、これらのうち豚
心臓と人子宮には比較的多く存在するとされている。
そして、これら組織から医薬として使用可能な量のtPA
を分離精製することは、もともと含量が少ないこと及び
夾雑蛋白質の関係から多大の困難さがあった。
を分離精製することは、もともと含量が少ないこと及び
夾雑蛋白質の関係から多大の困難さがあった。
従って、実用的な観点から有利にtPAを製する目的で、
遺伝子組換え技術又は組織培養法を利用することも考え
られている。
遺伝子組換え技術又は組織培養法を利用することも考え
られている。
即ち、人メラノーマ細胞及びヒトtPA遺伝子を持つベク
ターを挿入した大腸菌、酵母、動物細胞等の培養液がら
tPAを分離精製することにより、tPAを製する方法も検討
されている。
ターを挿入した大腸菌、酵母、動物細胞等の培養液がら
tPAを分離精製することにより、tPAを製する方法も検討
されている。
いずれにしろ、これら方法で得られる粗tPA画分は各種
蛋白等との共存下にあり、医薬として使用する高純度tP
Aを得るためには各種手段にて精製するのが必須要件で
ある。
蛋白等との共存下にあり、医薬として使用する高純度tP
Aを得るためには各種手段にて精製するのが必須要件で
ある。
従来tPAの精製法としては、モノクロナール抗体、フィ
ブリン等の特異リガントを使用する方法（バイオキミ．
バイオフィジ．アクタ830、１〜10（1985））にイオン
交換クロマトグラフィー法（バイオキミ．バイオフィ
ジ．アクタ580、140〜153（1979）同719、318〜328（19
82）、及びジャーナル．バイオロジカル．ケミストリ25
67035〜7041（1981）、）及びゲル濾過等を組合せる方
法が挙げられる。
ブリン等の特異リガントを使用する方法（バイオキミ．
バイオフィジ．アクタ830、１〜10（1985））にイオン
交換クロマトグラフィー法（バイオキミ．バイオフィ
ジ．アクタ580、140〜153（1979）同719、318〜328（19
82）、及びジャーナル．バイオロジカル．ケミストリ25
67035〜7041（1981）、）及びゲル濾過等を組合せる方
法が挙げられる。
＜発明が解決しようとする問題点＞ しかしながら、これ等の方法は、tPAの収率が低いこ
と、数段階のクロマトグラフィー処理をしなければなら
ないこと、長時間を要すること等実用的観点からして満
足出来るものではない。
と、数段階のクロマトグラフィー処理をしなければなら
ないこと、長時間を要すること等実用的観点からして満
足出来るものではない。
従って、より優れたtPAの精製法が望まれていた。
＜発明の構成＞ 本発明は優れたtPAの精製方法を提供するものである。
本発明方法に付される原材料としては、tPAを含有する
人又は動物等の組織を荒処理して得た画分組織培養細胞
又は遺伝子組換のものが使用される。
本発明方法に付される原材料としては、tPAを含有する
人又は動物等の組織を荒処理して得た画分組織培養細胞
又は遺伝子組換のものが使用される。
これら原材料の本発明のヘパリン−セファロ−スクロマ
トグラフィーに付すには、通常、前処理を施すのが好ま
しい。
トグラフィーに付すには、通常、前処理を施すのが好ま
しい。
豚心臓を例として説明すれば、下記の通りである。
豚心臓に蒸留水を加え、ホモゲナイズし、不溶性画分を
集め、親水性有機溶媒（例えばアセトン）で脂肪分を抽
出除去し、脱脂肪組織の粉末を集める。低温下（約４℃
以下）で脱脂肪組織を６−アミノヘキサンカルボン酸の
存在下リン酸ナトリウム緩衝液中でオモゲナイズし、遠
沈分離により不溶分を集める。次いで酢酸カリ水溶液で
抽出する。次いで硫酸アンモニウム飽和溶液で処理した
不溶物を食塩及びTween80を含有するpH6.5のリン酸ナト
リウム緩衝液（Buffer A）に溶解し、次いでpHを7.0に
調整した後、更にBuffer Aで透析し、最後に若干の沈殿
物を除去した溶液を精製に付す組成物として使用する。
集め、親水性有機溶媒（例えばアセトン）で脂肪分を抽
出除去し、脱脂肪組織の粉末を集める。低温下（約４℃
以下）で脱脂肪組織を６−アミノヘキサンカルボン酸の
存在下リン酸ナトリウム緩衝液中でオモゲナイズし、遠
沈分離により不溶分を集める。次いで酢酸カリ水溶液で
抽出する。次いで硫酸アンモニウム飽和溶液で処理した
不溶物を食塩及びTween80を含有するpH6.5のリン酸ナト
リウム緩衝液（Buffer A）に溶解し、次いでpHを7.0に
調整した後、更にBuffer Aで透析し、最後に若干の沈殿
物を除去した溶液を精製に付す組成物として使用する。
本発明を実施するには、上記の如くして調整した組成物
をBuffer Aで事前に平衡化したヘパリン−セファロース
カラムクロマトグラフィーに付せばよい。溶出液として
は，適量のアプロチニン及びヘパリンを含有する。Buff
er A溶液及びBuffer A単独溶液が使用される。溶出方法
は初めチオシアンカリ濃度及びpHの複合勾配法で行い次
いでBuffer Aで流出させればよい。
をBuffer Aで事前に平衡化したヘパリン−セファロース
カラムクロマトグラフィーに付せばよい。溶出液として
は，適量のアプロチニン及びヘパリンを含有する。Buff
er A溶液及びBuffer A単独溶液が使用される。溶出方法
は初めチオシアンカリ濃度及びpHの複合勾配法で行い次
いでBuffer Aで流出させればよい。
かかる精製処理を施した後、活性画分を集め限外濾過を
行えば極めて高収率、高純度のtPA濃縮物が製しうる。
行えば極めて高収率、高純度のtPA濃縮物が製しうる。
なお、医薬として使用するに値するtPAを製するには、
上記方法で得たtPA濃縮物をゲル濾過等に処すればよ
い。
上記方法で得たtPA濃縮物をゲル濾過等に処すればよ
い。
例えば、tPA濃縮物を、適量の食塩とTween80を含有する
炭酸水素アンモニウムで平衡化したトヨパールHW−55S
カラムでクロマトグラフィーを行い、活性化画分を集め
次いで例えばPM−10メンブランの限外濾過に付せばよ
い。
炭酸水素アンモニウムで平衡化したトヨパールHW−55S
カラムでクロマトグラフィーを行い、活性化画分を集め
次いで例えばPM−10メンブランの限外濾過に付せばよ
い。
＜発明の効果＞ 本発明方法によれば、高純度のtPAを高収率で製しう
る。即ち、硫酸アンモニウム析出物を原料として使用し
た従来方法、例えば、フィブリン吸着による精製法では
原料の50倍純度であるのに対し（バイオキミ．バイオフ
ィジ．アクタ719.318〜328（1982））本発明方法では13
0倍と極めて優れたものとなり、かつ又硫酸アンモニウ
ム析出物からの通算収率は90％と高収率であった。この
精製法は、原料において夾雑蛋白分が本発明の原料と比
べはるかに少ないメラノーマ細胞のtPAを、モノクナー
ル抗体−セファロースを用いて精製したときの値155
倍、（バイオキミ．バイオフィジ．アクタ830.1〜10（1
985））と近似するものである。
る。即ち、硫酸アンモニウム析出物を原料として使用し
た従来方法、例えば、フィブリン吸着による精製法では
原料の50倍純度であるのに対し（バイオキミ．バイオフ
ィジ．アクタ719.318〜328（1982））本発明方法では13
0倍と極めて優れたものとなり、かつ又硫酸アンモニウ
ム析出物からの通算収率は90％と高収率であった。この
精製法は、原料において夾雑蛋白分が本発明の原料と比
べはるかに少ないメラノーマ細胞のtPAを、モノクナー
ル抗体−セファロースを用いて精製したときの値155
倍、（バイオキミ．バイオフィジ．アクタ830.1〜10（1
985））と近似するものである。
又、ヘパリン−セファロースカラムはtPA精製に20回以
上使用した後でも未だ充分に機能することが確認され、
経済的に廉価なものといえる。勿論本発明の精製法はメ
ラノーマ細胞培養から得られるtPAの精製にも適用でき
るものである。
上使用した後でも未だ充分に機能することが確認され、
経済的に廉価なものといえる。勿論本発明の精製法はメ
ラノーマ細胞培養から得られるtPAの精製にも適用でき
るものである。
更に述べれば、本発明の精製法で得たtPAはSDS−ポリア
クリルアミドゲルを用いた電気泳動で調べた結果では、
一本の蛋白バンド（分子量:67000）と高純度一本鎖tPA
であることが確認された。
クリルアミドゲルを用いた電気泳動で調べた結果では、
一本の蛋白バンド（分子量:67000）と高純度一本鎖tPA
であることが確認された。
以下実施例にて本発明を説明する。
実施例 1.使用材料 ヘパリン−セファロース CL−6B （ファルマシア ファイン ケミカル社製：スウェーデ
ン） トヨパール HW−55S （東洋ソーダ社製：日本） ヒト フィブリノーゲン （カビ社製：スウェーデン） アプロチニン（トラシロール） （バイエル社製：仏） ヘパリン （フナイ製薬社製） ヒトプラスミノーゲン （ミドリ十字社製） トロンビン （持田製薬社製） 牛血清アルブミン及び大豆トリプシンインヒビター （ベーリンガー．マンハイム．山之内社製） 2.分析方法 tPAの線溶活性 フィブリン−寒天プレートを用いるAlkjaersigらの方法
を次のように変更して測定した。
ン） トヨパール HW−55S （東洋ソーダ社製：日本） ヒト フィブリノーゲン （カビ社製：スウェーデン） アプロチニン（トラシロール） （バイエル社製：仏） ヘパリン （フナイ製薬社製） ヒトプラスミノーゲン （ミドリ十字社製） トロンビン （持田製薬社製） 牛血清アルブミン及び大豆トリプシンインヒビター （ベーリンガー．マンハイム．山之内社製） 2.分析方法 tPAの線溶活性 フィブリン−寒天プレートを用いるAlkjaersigらの方法
を次のように変更して測定した。
フィブリンプレートを作るため薬品類を、0.1M塩化ナト
リウムを含むpH8.0の0.1Mホウ酸緩衝液に溶解した。
リウムを含むpH8.0の0.1Mホウ酸緩衝液に溶解した。
Glu−plasminogen（20μg/ml）を含む１％（w/v）ヒト
フィブリノーゲン溶液の5mlを室温下5mlの0.9％（w/v）
寒天溶液と混和し、その後50μのトロンビン（100NIH
units/ml）を加え凝固させた。４℃で30分間プレート
（直径8.5cm、厚さ2mm）放置後、直径3mmのステンレス
管を用いフィブリンゲルから10μのウエルを切りとっ
た。
フィブリノーゲン溶液の5mlを室温下5mlの0.9％（w/v）
寒天溶液と混和し、その後50μのトロンビン（100NIH
units/ml）を加え凝固させた。４℃で30分間プレート
（直径8.5cm、厚さ2mm）放置後、直径3mmのステンレス
管を用いフィブリンゲルから10μのウエルを切りとっ
た。
tPA定量のため10μのtPAサンプルをウエルに入れた。
活性は37℃、18hrインキュベーション後の溶解部の面積
で表わした。国際単位（IU）は50〜400mm2溶解面積を示
す濃度の対照標準ウロキナーゼの面積に対するIUの標準
対数プロットから算出した。ウロキナーゼおよびtPAは
0.25％（w/v）ゼラチンを含むpH7.3の0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液に溶解および／又は希釈した。
活性は37℃、18hrインキュベーション後の溶解部の面積
で表わした。国際単位（IU）は50〜400mm2溶解面積を示
す濃度の対照標準ウロキナーゼの面積に対するIUの標準
対数プロットから算出した。ウロキナーゼおよびtPAは
0.25％（w/v）ゼラチンを含むpH7.3の0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液に溶解および／又は希釈した。
プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンは、上記
プレートを熱し（1hr、80℃）調整した。プラスミノー
ゲンの消失は次のアッセイで確認した（ウロキナーセ、
100IU、18hr、37℃インキュベーション）。
プレートを熱し（1hr、80℃）調整した。プラスミノー
ゲンの消失は次のアッセイで確認した（ウロキナーセ、
100IU、18hr、37℃インキュベーション）。
各精製ステップのtPA比活性は、Wallenらの方法に基づ
き血栓溶解時間によりチエックした。
き血栓溶解時間によりチエックした。
tPAのアミド水解活性 HD−Ile−Pro−Arg−ｐ−nitroanilide（Ｓ−2288）を
基質として用い測定した。ｔ−PA（200IU/ml）を0.1M N
aClを含むpH8.4の0.1M Tris−HCl緩衝液、0.001％（v/
v）Tween80およびＳ−2288とインキュベートした。そし
て遊離してくるｐ−ニトロアニリンに対する分子吸光係
数は10,500liters/mol/minである。
基質として用い測定した。ｔ−PA（200IU/ml）を0.1M N
aClを含むpH8.4の0.1M Tris−HCl緩衝液、0.001％（v/
v）Tween80およびＳ−2288とインキュベートした。そし
て遊離してくるｐ−ニトロアニリンに対する分子吸光係
数は10,500liters/mol/minである。
電気泳動操作 SDS−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動は、Weber and
Osbornの方法に従い８％（w/v）ゲルを用い行った。分
子量算出曲線は次の蛋白の非還元および還元状態に基づ
いた。：ヒトプラスミノーゲン（92,000）、牛血清アル
ブミン（68,000）、大豆トリプシンインヒビター（21,5
00） tPAの電気泳動−酵素的分析は、Granelli−Pipexno and
Reichの方法をTissotらの変法に従った。
Osbornの方法に従い８％（w/v）ゲルを用い行った。分
子量算出曲線は次の蛋白の非還元および還元状態に基づ
いた。：ヒトプラスミノーゲン（92,000）、牛血清アル
ブミン（68,000）、大豆トリプシンインヒビター（21,5
00） tPAの電気泳動−酵素的分析は、Granelli−Pipexno and
Reichの方法をTissotらの変法に従った。
蛋白量決定 カラムフラクションの蛋白濃度は280nmの吸光度で測定
した。比活性計算のための蛋白濃度は対照に牛血清アル
ブミンを用いるLowryらの方法で測定した。
した。比活性計算のための蛋白濃度は対照に牛血清アル
ブミンを用いるLowryらの方法で測定した。
アミノ酸組成の決定 アミノ酸分析にはPICO−TAGTMアミノ酸分析装置（Water
s Co.）を用いた。蛋白サンプル（0.5〜10μｇ）を6M H
Clで110℃20hr真空下で加水分解した。加水分解物を凍
結乾燥し、メタノール／トリエチルアミン／水/phenyli
sothiocyanate（700/100/100/100）の混合物20μと室
温下20分間インキュベートした。凍結乾燥後サンプルを
100μのメタノール／水／トリエチルアミン（100/100
/50）に溶解し、５μをPICO−TAGカラムに注入した。
s Co.）を用いた。蛋白サンプル（0.5〜10μｇ）を6M H
Clで110℃20hr真空下で加水分解した。加水分解物を凍
結乾燥し、メタノール／トリエチルアミン／水/phenyli
sothiocyanate（700/100/100/100）の混合物20μと室
温下20分間インキュベートした。凍結乾燥後サンプルを
100μのメタノール／水／トリエチルアミン（100/100
/50）に溶解し、５μをPICO−TAGカラムに注入した。
3.精製操作 脱脂肪操作 豚心臓を屠殺場から入手し−80℃で貯蔵した。1Kgの凍
結組織を３リットルの蒸溜水とWaringミキサーでホモゲ
ナイズした。10,000×ｇ、20minの遠沈により不溶性画
分を集め、−20℃にしたアセトン3.5リットルに懸濁さ
せた。懸濁液を０℃、15min撹拌しブッフナー・ロート
で濾過した。アセトン処理を４回繰返した。濾過物を粉
砕し、室温で１時間大型濾紙上で乾燥して脱脂肪粉末を
約200g得た。これを−80℃に貯蔵した。以後の全ステッ
プは４℃で行った。
結組織を３リットルの蒸溜水とWaringミキサーでホモゲ
ナイズした。10,000×ｇ、20minの遠沈により不溶性画
分を集め、−20℃にしたアセトン3.5リットルに懸濁さ
せた。懸濁液を０℃、15min撹拌しブッフナー・ロート
で濾過した。アセトン処理を４回繰返した。濾過物を粉
砕し、室温で１時間大型濾紙上で乾燥して脱脂肪粉末を
約200g得た。これを−80℃に貯蔵した。以後の全ステッ
プは４℃で行った。
抽出及び硫酸アンモニウムによる分別 脱脂肪組織（200g）を20mM6−アミノヘキサンカルボン
酸と0.1M食塩を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
3）1,500mlでホモゲナイズし、1.5時間撹拌した。上清
を10,000×ｇ、20分遠沈処理し除去した。残留物を２
の0.45M酢酸カリ（pH4.2）で一晩抽出した。10,000×
ｇ、20min遠沈後、残留物を1,000mlの0.3M酢酸カリで3h
r再抽出し遠沈した。硫酸アンモニウムを撹拌下55％飽
和（350g/）に達するまでゆっくり加えた。一晩撹拌
後、沈殿物を10,000×g,20min遠沈により集めた。そし
て0.08M食塩と0.05％（w/v）Tween80を含むpH6.5の20mM
リン酸ナトリウム緩衝液（buffer A）800mlに溶解し
た。それには70KIUのアプロチニン/mlが含まれ、又、pH
は1M NaOHにより7.0に調整された。30min撹拌後、溶液
をbuffer Aで一夜透析した。透析物を20,000×ｇ、20mi
n遠沈し、少量の不溶物を除去した。
酸と0.1M食塩を含む0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
3）1,500mlでホモゲナイズし、1.5時間撹拌した。上清
を10,000×ｇ、20分遠沈処理し除去した。残留物を２
の0.45M酢酸カリ（pH4.2）で一晩抽出した。10,000×
ｇ、20min遠沈後、残留物を1,000mlの0.3M酢酸カリで3h
r再抽出し遠沈した。硫酸アンモニウムを撹拌下55％飽
和（350g/）に達するまでゆっくり加えた。一晩撹拌
後、沈殿物を10,000×g,20min遠沈により集めた。そし
て0.08M食塩と0.05％（w/v）Tween80を含むpH6.5の20mM
リン酸ナトリウム緩衝液（buffer A）800mlに溶解し
た。それには70KIUのアプロチニン/mlが含まれ、又、pH
は1M NaOHにより7.0に調整された。30min撹拌後、溶液
をbuffer Aで一夜透析した。透析物を20,000×ｇ、20mi
n遠沈し、少量の不溶物を除去した。
ヘパリン−セファロ−スアフィニティ−クロマトグラフ
ィー 前記透析物（800ml）をbuffer Aで事前に平衡化したヘ
パリン−セファロースCL−6Bカラム（2.5×14cm）に流
した。カラムを20KIUアプロチニン/mlおよび50unitsヘ
パリン/mlを含むbuffer A 1で洗い出し、その後流出
液が280nmの吸収を示さなくなるまでbuffer Aを流し
た。溶出は最初チオシアンカリウム濃度とpHの複合勾配
で行い（混合槽;220ml buffer A:受槽;220ml0.1Mリン酸
buffer、pH7.5、1.2Mチオシアンカリウムと0.05％Tween
80を含む）、続いて後者のbufferで行った。活性フラク
ションを集めPM−10メンブランの限外濾過を行い約3ml
まで濃縮した。
ィー 前記透析物（800ml）をbuffer Aで事前に平衡化したヘ
パリン−セファロースCL−6Bカラム（2.5×14cm）に流
した。カラムを20KIUアプロチニン/mlおよび50unitsヘ
パリン/mlを含むbuffer A 1で洗い出し、その後流出
液が280nmの吸収を示さなくなるまでbuffer Aを流し
た。溶出は最初チオシアンカリウム濃度とpHの複合勾配
で行い（混合槽;220ml buffer A:受槽;220ml0.1Mリン酸
buffer、pH7.5、1.2Mチオシアンカリウムと0.05％Tween
80を含む）、続いて後者のbufferで行った。活性フラク
ションを集めPM−10メンブランの限外濾過を行い約3ml
まで濃縮した。
トヨパールHW−55Sカラムクロマトによるゲル濾過 濃縮物（3.3ml）を0.25M NaClと0.01％Tween80を含む1M
炭酸水素アンモニウムで平衡化したトヨパールHW−55S
カラム（2.5×90cm）でクロマトグラフィーを行った。
活性フラクションを集めPM−10メンブランの限外濾過で
約3mlまで濃縮した。溶液を0.01％Tween80を含む0.25M
NaClで透析し−80℃に貯蔵した。
炭酸水素アンモニウムで平衡化したトヨパールHW−55S
カラム（2.5×90cm）でクロマトグラフィーを行った。
活性フラクションを集めPM−10メンブランの限外濾過で
約3mlまで濃縮した。溶液を0.01％Tween80を含む0.25M
NaClで透析し−80℃に貯蔵した。
4.実験結果 tPAの精製結果は表−１に要約される。
上表から明らかな如く、固定相ヘパリンに対するtPAの
吸着が最も効果的である。
吸着が最も効果的である。
なお、ヘパリン−セファロースCL−6Bカラム処理は、25
ml/時間で行い、先述した如く流出液が280nmの吸収を示
さなくなるまで流出操作を150区分に分けて行い、No.56
〜95の各画分4.1mlを集めた。
ml/時間で行い、先述した如く流出液が280nmの吸収を示
さなくなるまで流出操作を150区分に分けて行い、No.56
〜95の各画分4.1mlを集めた。
上記以外の画分には1,800mgの蛋白が含まれていたが、t
PA活性は１％以下であった。
PA活性は１％以下であった。
tPAの最大活性はチオシアンカリの1.0モル溶液の溶出に
おいて認められた。
おいて認められた。
又この操作で、原料混在蛋白の大部分とtPAは分離でき
た。さらに硫酸アンモニウム析出物に含まれる阻害物質
とも分離でき、本ステップは高い収率（104％）を示す
ことが判明した。
た。さらに硫酸アンモニウム析出物に含まれる阻害物質
とも分離でき、本ステップは高い収率（104％）を示す
ことが判明した。
ヘパリン−セファロースCL−6Bカラムから溶出したtP
AをトヨパールHW−55Sのゲル濾過により更に精製して4,
500IU/ml以上の活性を示すフラクションを集め限外濾過
により濃縮した。得られた物質は222,000IU/mgの活性を
示し、全工程を通じての収率は90％以上であった。プラ
スミノーゲンを含まないフィブリンプレートでは蛋白分
解活性は検出されなかった。
AをトヨパールHW−55Sのゲル濾過により更に精製して4,
500IU/ml以上の活性を示すフラクションを集め限外濾過
により濃縮した。得られた物質は222,000IU/mgの活性を
示し、全工程を通じての収率は90％以上であった。プラ
スミノーゲンを含まないフィブリンプレートでは蛋白分
解活性は検出されなかった。
tPAの同定 精製酵素を還元したサンプルとしないサンプルをSDS−
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。還元した
tPA、しないtPA共に分子量は67,000であり、これはWall
enらにより得られた豚心臓tPAのそれ（64,000）とほぼ
一致した。
ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。還元した
tPA、しないtPA共に分子量は67,000であり、これはWall
enらにより得られた豚心臓tPAのそれ（64,000）とほぼ
一致した。
非還元tPAの活性をプラスミノーゲン−リッチ−フィブ
リン・アガロースで酵素学的に検出した結果60.000〜7
0,000Wr部分に単一バンドが観察された。以上の結果か
ら本精製法により天然型（一本鎖ポリペプチド）tPAを
完全な形で得られることが判明した。
リン・アガロースで酵素学的に検出した結果60.000〜7
0,000Wr部分に単一バンドが観察された。以上の結果か
ら本精製法により天然型（一本鎖ポリペプチド）tPAを
完全な形で得られることが判明した。
一本鎖tPAをWallen et alの記載に従いプラスミン−セ
ファロースで処理し、Ｓ−2288を用いtPAのアミド水解
活性を調べた。Lineweaver−Burkブロットにより求めた
Km値は一本鎖tPA1.8mMであった。又、tPAのアミド水解
活性は10μＭのジイソプロピルフルオロファスフェート
により完全に抑制された。
ファロースで処理し、Ｓ−2288を用いtPAのアミド水解
活性を調べた。Lineweaver−Burkブロットにより求めた
Km値は一本鎖tPA1.8mMであった。又、tPAのアミド水解
活性は10μＭのジイソプロピルフルオロファスフェート
により完全に抑制された。
tPAとuPAの顕著な差異は、tPAの方がフィブリンに対し
高い親和性を示す点である。既に述べたようにフィブリ
ン−セファロースに対する精製tPAの親和性を調べたと
ころ、tPAは完全にカラムに吸着し、2.5Mチオシアンカ
リウムで溶出された。
高い親和性を示す点である。既に述べたようにフィブリ
ン−セファロースに対する精製tPAの親和性を調べたと
ころ、tPAは完全にカラムに吸着し、2.5Mチオシアンカ
リウムで溶出された。
Table IIには精製tPAのアミノ酸組成を示した。それはW
allen et alにより豚心臓から得たtPAのアミノ酸分析値
と良く一致した。
allen et alにより豚心臓から得たtPAのアミノ酸分析値
と良く一致した。
Claims (1)
- 【請求項１】組織性プラスミノーゲン活性化因子を含有
する組成物をヘパリン−セファロースアフィニティーク
ロマトグラフで処理することを特徴とする高純度組織性
プラスミノーゲン活性化因子の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61178490A JPH07100032B2 (ja) | 1986-07-29 | 1986-07-29 | 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61178490A JPH07100032B2 (ja) | 1986-07-29 | 1986-07-29 | 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6336781A JPS6336781A (ja) | 1988-02-17 |
| JPH07100032B2 true JPH07100032B2 (ja) | 1995-11-01 |
Family
ID=16049364
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61178490A Expired - Lifetime JPH07100032B2 (ja) | 1986-07-29 | 1986-07-29 | 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07100032B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991013976A1 (en) * | 1990-03-14 | 1991-09-19 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | Process for producing purified tissue plasminogen activator or its derivative |
| JP2894902B2 (ja) * | 1992-10-12 | 1999-05-24 | 内外化成株式会社 | 輸液用バッグの製造方法 |
-
1986
- 1986-07-29 JP JP61178490A patent/JPH07100032B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6336781A (ja) | 1988-02-17 |
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