JPS6336781A - 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は高純度組織性プラスミノーゲン活性化因子（以
下ｔＰＡと略称する）の製法に関する。

ｔＰＡは血栓に対し強い新和性を有し、かつ優れた血栓
溶解活性を有する物質であることから、血栓症治療剤と
して有用なものである。

〈従来技術〉 近年、最も重要な血栓症治療法は、酵累学的に循環系か
ら血栓を除去する方法と考えられている。

上記目的で現在実用化されている物質には、ウロキナー
ゼとストレプトキナーゼがある。

これ等の血栓溶解剤は、血中ならびにフィブリン結合の
プラスミノーゲンを活性化し、全身的線溶活性化を起こ
すが、゛出血傾向を示すとの欠点がある。

そこで、副作用の少ない新しい血栓溶解剤としてｔＰＡ
が最近着目をあびている。

即ち、ｔＰＡは全身性にブイプリノーゲン量やα２−ア
ンチプラスミン量を変化させることなく線溶活性を示す
ことが知られるに至った。このことは、ウロキナーゼや
ストレプトキナーゼにより惹起される出血傾向を回避で
きることを示すものである。

ｔＰＡの生理的役割に大きな関心が寄せられているにも
かかわらず、これまで本物質の実用化の進展が極めてゆ
るやかであった主な理由は、本酵素が哺乳動物の組織に
極めて微量しか含まれていす高純度のｔＰＡを大量に製
することが困難であったことにある。

即ち、ｔＰＡは哺乳動物、例えば、牛、豚、等の各種臓
器組織中に、又人由来のｔＰＡは人の正常組織、例えば
、血管、腎臓、子宮などに極く微量存在し、これらのう
ち豚心臓と大子宮には比較的多く存在するとされている
。

そして、これら組織から医薬として使用可能な量のｔＰ
Ａを分離精製することは、もともと含量が少ないこと及
び夾雑蛋白質の関係から多大の困難さがあった。

従って、実用的な観点から有利にｔＰＡを製する目的で
、遺伝子組換え技術又は組織培養法を利用することも考
えられている。

即ち、人メラノーマ細胞及びヒ）ｔＰＡ遺伝子を持つベ
クターを挿入した大腸菌、酵母、動物細胞等の培養液が
らｔＰＡを分離精製することにより、ｔＰＡを製する方
法も検討されている。

いずれにしろ、これら方法で得られる粗ｔＰＡ画分は各
種蛋白等との共存下にあり、医薬として使用する高純度
ｔＰＡを得るためには各種手段にて精製するのが必須要
件である。

従来ｔＰＡの精製法としては、モノクロチール抗体、フ
ィブリン等の特異リガントを使用する方法（バイオキミ
、バイオフィシ、アクタ８３０．１〜１０　（＋９８５
））にイオン交換クロマトグラフィー法（バイオキミ、
バイオフィシ、アクタ５８０．１４０〜１５３　（１９
７９）　　同７１９，３１８〜３２Ｂ　（１９Ｂ２）、
及びジャーナル、バイオロジカル、ケミストリ　２５６
？Ｏ３５〜７０４１（１９８１）　、　）及びゲル濾過
等を組合せる方法が挙げられる。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、これ等の方法は、ｔＰＡの収率が低いこ
と、数段階のクロマトグラフィー処理をしなければなら
ないこと、長時間を要すること等実用的観点からして満
足出来るものではない。

従って、より優れたｔＰＡの精製法が望まれていた。

〈発明の構成〉 本発明は優れたｔＰＡの精製方法を提供するものである
０本発明方法に付される原材料としては、ｔＰＡを含有
する人又は動物等の組織を荒処理して得た両分組織培養
細胞又は遺伝子組換のものが使用される。

これら原材料を本発明のヘパリン−セファロースクロマ
トグラフィーに付すには、通常、前処理を施すのが好ま
しい。

豚心臓を例として説明すれば、下記の通りである。

豚心臓に蒸留水を加え、ホモゲナイズし、不溶性画分を
集め、親水性有機溶媒（例えばアセトン）で脂肪分を抽
出除去し、脱脂肪組織の粉末を集める。低温下（約４℃
以下）で脱脂肪組織を６−アミツヘキサンカルポン酸の
存在下リン酸ナトリウム緩衝液中でホモゲナイズし、遠
沈分離により不溶分を集める６次いで酢酸カリ水溶液で
抽出する０次いで硫酸アンモニウム飽和溶液で処理した
不溶物を食塩及びＴｗｅｅｎ　８０を含有するｐＨ８，
５のリン酸ナトリウム緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ　Ａ）に溶
解し、次いでＰＨを７．０に調整した後、更にＢｕｆｆ
ｅｒＡで透析し、最後に若干の沈殿物を除去した溶液を
精製に付す組成物として使用する。

本発明を実施するには、上記の如くして調整した組成物
をＢｕｆｆｅｒ　Ａで事前に平衡化したヘパリン−セフ
ァロースカラムクロマトグラフィーに付せばよい。溶出
液としては、適量のアプロチニン及びヘパリンを含有す
る　５ｕｆｆｅｒ　　Ａ　溶液及びＢｕｆｆｅｒ　Ａ単
独溶液が使用される。溶出方法は初めチオシアンカリ濃
度及びＰＨの複合勾配法で行い次いでＢｕｆｆｅｒ　Ａ
で流出させればよい。

かかる精製処理を施した後、活性画分を集め限外濾過を
行えば極めて高収率、高純度のｔＰＡ濃縮物が製しうる
。

なお、医薬として使用するに値するｔＰＡを製するには
、上記方法で得たｔＰＡｇ縮物をゲル濾過等に処すれば
よい。

例えば、ｔＰＡｃｔＩｉｌｉ物を、適量の食塩と↑ｗｅ
ｅｎ８０を含有する炭酸水素アンモニウムで平衡化した
トヨパールＨＷ−５５Ｓカラムでクロマトグラフィーを
行い、活性化画分を東め次いで例えばＰＭ−１０メンプ
ランの限外濾過に付せばよい。

〈発明の効果〉 本発明方法によれば、高純度のｔＰＡを高収率で製しう
る。即ち、硫酸アンモニウム析出物を原料として使用し
た従来方法、例えば、フィブリン吸着による精製法では
原料の５０倍純度であるのに対しくバイオキミ、バイオ
フィシ、アクタ７１９゜３１８〜３２Ｂ　（１９８２）
）本発明方法では１３０倍と極めて優れたものとなり、
かつ又硫酸アンモニウム析出物からの通算収率は９０％
と高収率であった。この精製法は、原料において夾雑蛋
白分が本発明の原料と比べはるかに少ないメラノーマ細
胞のｔＰＡを、モノクナール抗体−セファロースを用い
て精製したときの値１５５倍、（バイオキミ、バイオフ
ィシ、アクタ８３０．１〜１０　（１！３８５））と近
似するものである。

又、ヘパリン−セファロースカラムはｔｐＡ精製に２０
回以上使用した後でも未だ充分に機能することが確認さ
れ、経済的に廉価なものといえる。

勿論本発明の精製法はメラノーマ細胞培養から得られる
ｔＰＡの精製にも適用できるものである。

更に述べれば、本発明の精製法で得たｔＰＡは５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動で調べた結果
では、−木の蛋白バンド（分子量：　［１７０００）と
高純度−末鎖ｔＰＡであることが確認された。

以下実施例にて本発明を説明する。

実施例 １、使用材料 ―ヘパリンーセファロース　ＣＬ−６Ｂ（ファルマシア
　ファイン　ケミカル社製：スウェーデン） Ｏトヨパール　ＨＷ−５５３ （東洋ソーダ社製二日本） ・ヒト　フィブリノーゲン （カビ社製：スウェーデン） ・アプロチニン（トラシロール） （バイエル社製：仏） ・ヘパリン （フナイ製薬社製） ・ヒトプラスミノーゲン （ミドリ十字社製） Ｏトロンビン （持田製薬社製） ゆ牛血清アルブミン及び大豆トリプシンインヒビター （ベーリンガー、マンハイム、山之内社製）２、分析方
法 ・ｔＰＡの線溶活性 フィブリン−寒天プレートを用いるＡｌｋｊａｅｒｓｉ
ｇらの方法を次のように変更して測定した。

フィブリンプレートを作るため薬品類を、０．１Ｍ塩化
ナトリウムを含むｐＨ８，０の０．１Ｍホウｌ！＋１２
緩衝液に溶解した。

Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　（２０μｓ／ｍ２）
を含む１％（ｗ／ｖ）ヒトフィブリノーゲン溶液の５ｍ
９を室温下５ｍＲの０．９％（Ｗハ）寒天溶液と混和し
、その後５０μＱのトロンビン（１００ＮＩＨｕｎｉｔ
ｓ／ｍＱ、）を加え凝固させた。

４°Ｃで３０分間プレート（直径８．５ｃｍ、厚さ２　
ｍｍ）放首後、直径３ｍｍのステンレス管を用いフィブ
リンゲルからｌＯμβのウェルを切りとった。

ｔＰＡ定量のためｌＯμｌのｔＰＡサンプルをウェルに
入れた。活性は３７℃、１８ｈｒインキユベーシヨン後
の溶解部の面積で表わした０国際単位（１０）は５０〜
４００ｏ＋ｍ２の溶解面積を示す濃度の対照検事ウロキ
ナーゼの面積に対するＩＵの標準対数プロットから算出
した。ウロキナーゼおよびｔＰＡは０．２５％（ｗ／ｖ
）ゼラチンを含むｐＨ７，３１７）　０．１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液に溶解および／又は希釈した。

プラスミノーゲンを含まないフィブリノーゲンは、上記
プレートを熱しく　１　ｈｒ、８０°Ｃ）調整した。プ
ラスミノーゲンの消失は次のアッセイで確認した（ウロ
キナーゼ、１００１０．’　１８ｈｒ、３７℃インキュ
ベーション）。

各精製ステップのｔＰＡ比活性は、　Ｗａ　Ｉ　Ｉ　ｅ
ｎらの方法に基づき血栓溶解時間によりチエツクした。

−ｔ　ＰＡのアミド水解活性 ＨＤ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉ
　ｔｉｄｅ（Ｓ−２２８８）を基質として用い測定した
。ｔ　−Ｆ　Ａ　　（２００１Ｕ／ｍρ）を０．Ｉ　Ｍ
　ＮａＣ１を含む　ｐＨ８，４の　０．Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣ：、９　Ｈ街液、　０．００１％（ｖ／ｖ）Ｔ
ｗｅｅｎ　８０およびＳ−２２８８とインキュベートし
た。そして遊離してくるＰ−ニトロアニリンに対する分
子吸光係数は！０，５００１ｉｔｅｒｓ／ｍｏｌ／ｗｉ
ｎである。

・電気泳動操作 ５ＯＳ−ポリアクリルアミド　ゲル電気泳動は、Ｗｅｂ
ｅｒ　ａｎｄ　０ｓｂｏｒｎの方法に従い８％（ｗ／ｖ
）ゲルを用い行った。分子量算出曲線は次の蛋白の非還
元および還元状態に基づいた。：ヒトプラスミノーゲン
（９２，０００）、牛血清アルブミン（８８，０００）
、大豆トリプシンインヒビター　（２１，５００）ｔＰ
Ａの電気泳動−酵素的分析は、Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉ
ｐｅｘｎｏ　ａｎｄ　Ｒｅ１ｃｈの方法をＴｉ５ｓｏｔ
らの変法に従った。

・蛋白量決定 カラムフラクションの蛋白濃度は２８０ｎｍの吸光度で
測定した。比活性計算のための蛋白濃度は対照に牛血清
アルブミンを用いるＬｏｖｒｙらの方法で測定した。

・アミノ酸組成の決定 アミノ酸分析にはＰＩＧＯ−ＴＡＣＴ−アミノ酸分析装
着（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｏ、）を用いた。蛋白サンプル（
０，５〜１０μｇ）を６ＭＨＧ９．で１１０℃２０ｈ「
真空下で加水分解した。加水分解物を凍結乾燥し、メタ
ノール／トリエチルアミン／水／　ｐｈｅｎｙｌｉｓｏ
ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（７００／１００／１００／１
００）の混合物２０μβと室温下２０分間インキュベー
トした。凍結乾爆後サンプルを１００μβのメタノール
／水／トリエチルアミン（１００／１００１５０）に溶
解し、５μρをＰＩＣＯ−ＴＡＧカラムに注入した。

３、精製操作 脱脂肪操作 豚心臓を屠殺場から入手し一８０℃で貯蔵した。

ＩＫｇの凍結組織を３リツトルの蒸溜水と臀ａｒｉｎｇ
ミキサーでホモゲナイズした。　１０，０００　Ｘ　ｇ
、２０　ｌ１ｉｎの遠沈により不溶性画分を集め、−２
０″Ｃにしたアセトン３．５リツトルに懸濁させた。懸
濁液を０℃、１５ｍ１ｎ　ＪＳ’２拌しブッフナー・ロ
ートで岨過した。アセトン処理を４回繰返した。癌過物
を粉砕し、室温で１時間大型性紙上で乾燥して脱脂肪粉
末を約２００ｇ得た。これを−８０°Ｃに貯蔵した。

以後の全ステップは４℃で行った。

抽出及び硫酸アンモニウムによる分別 脱脂肪組織（２００ｇ）を２０＋＊Ｍ　Ｓ−７ミノヘキ
サンカルポン酸と０．１Ｍ食塩を含むＯ，ＩＮリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，３）　１，５００ｍ９．でホ
モゲナイズし、１．５時間攪拌した。上清を　ｔｏ、ｏ
ｏｏ　ｘ　ｇ、２０分遠沈処理し除去した。残留物を２
βの０．４５Ｍ酢酸カリ　（ｐＨ４，２）で−晩抽出し
た。　　ｉｏ、ｏｏｏ　ｘｇ、２０　ｗｉｎ遠沈後、残
留物を　１，０００　ｍｌｌの０．３Ｍ酢酸カリで３ｈ
ｒ再抽出し遠沈した。硫酸アンモニウムを攪拌下５５％
飽和（３５１ｇ／β）に達するまでゆっくり加えた。−
晩攪拌後、沈殿物を１０，０００　Ｘｇ、　２０　ｌｌ
１ｉｎ遠沈により集めた。そして０．０８８食塩と０．
０５％（ｗ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　８０を含むｐＨ８，５
の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｂｕｆｆｅｒ　Ａ
）　８００ｍＲに溶解した。それには７０ＫＩｔｌのア
プロチニン／ｒｎ２が含まれ、又、ｐＨは　ＬＭ　Ｎａ
０）１により　７．０に調整された。　３０ａ＋ｉｎ攪
拌後、溶液をｂｕｆｆｅｒ　Ａで一夜透析した。透析物
を２０，０００　Ｘ　ｇ、２０ｍ１ｎ遠沈し、少量の不
溶物を除去した。

ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフ
ィー 前記透析物（８００Ｊ）をｂｕｆｆｅｒ　Ａで事前に平
衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−８Ｂカラム（２
，５Ｘ　１４ｃ＋ａ）に流した。カラムを２０　ＫＩＵ
アプロチニン／ｄおよび５０ｕｎｉｔｓヘパリフ　／　
ｒｒｒ　ｌを含むｂｕｆｆｅｒＡｌβで洗い出し、その
後流出液が２８０ｎｍの吸収を示さなくなるまでｂｕｆ
ｆｅｒ　、Ａを流した。溶出は最初チオシアンカリウム
濃度とＰＨの複合勾配で行い（混合槽；２２０Ｊ　ｂｕ
ｆｆｅｒ　Ａ：受槽；２２０　ｒｔｒ（ｌ　０．ＩＭリ
ン酸ｂｕｆｆｅｒ、　ｐＨ７，５，１，２Ｍチオシアン
カリウムと０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む）、続いて
後者のｂｕｆｆｅｒで行った。活性フラクションを集め
ＰＨ−１０メンプランの限外目通を行い約３ｆｆｌＱま
で濃縮した。

トヨパールＨＷ−５５Ｓカラムクロマトによるゲル目通 Ｈｍ物（３，３ｄ）を０．２５　Ｍ　ＮａＣＱと０．０
１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む１Ｍ炭酸水素アンモニウム
で平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓカラム（２，５Ｘ
　９０ｃｍ）でクロマトグラフィーを行った。活性フラ
クションを集めＰＭ−１０メンプランの限外濾過で約３
　Ｊまで濃縮した。溶液を０．Ｏ１％Ｔ賛ｅｅｎ８０を
含む０．２５ＭＮａＣβで透析し一８０℃に貯蔵した。

４、実験結果 ・ｔＰＡの精製結果は表−１に要約される。

表−１ 上表から明らかな如く、固定相ヘパリンに対するｔＰＡ
の吸着が最も効果的である。

なお、ヘパリン−セファロース０Ｌ−ｆＩＢカラム処理
は、２５ｍ、Ｑ／時間で行い、先述した如く流出液が２
８０ｎｍの吸収を示さなくまるまで流出操作を１５０区
分に分けて行い、Ｎｏ、５８〜９５の各両分４．１ｍｌ
を集めた。

上記以外の両分にはｌ　、　８００ｍｇの蛋白が含まれ
ていたが、ｔＰＡ活性は１％以下であった。

ｔＰＡの最大活性はチオシアンカリの１．０モル溶液の
溶出において認められた。

又この操作で、原料混在蛋白の大部分とｔＰＡは分離で
きた。さらに硫酸アンモニウム析出物に含まれる阻害物
質とも分離でき、本ステップは高い収率（１０４％）を
示すことが判明した。

争ヘパリンーセファロースＣＬ−８Ｂカラムから溶出し
たｔＰＡをトヨパールＨＷ−５５Ｓのゲル濾過により更
に精製して４．５００１０／ｍρ以上の活性を示すフラ
クションを集め限外濾過により濃縮した。得られた物質
は２２２，０００　ＩＵ／ｍｇの活性を示し、全工程を
通じての収率は９０％以上であった。プラスミノーゲン
を含まないフィブリンプレートでは蛋白分解活性は検出
されなかった。

・ｔＰＡの同定 精製酵素を還元したサンプルとしないサンプルを５ＯＳ
−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけた。還元し
たｔＰＡ、しないｔＰＡ共に分子量は８７，０００であ
り、これはＷａ　Ｉ　Ｉ　ｅｎらにより得られた豚心臓
ｔＰＡのそれ（Ｅｉ４，０００）とほぼ一致した。

非還元ｔＰＡの活性をプラスミノーゲン−リッチ−フィ
ブリン・アガロースで酵素学的に検出した結果６０．０
００〜７０，０００　Ｗｒ部分に単一バンドが観察され
た０以上の結果から木精製法により天然型（−末鎖ボリ
ペプチド）ｔＰＡを完全な形で得られることが判明した
。

一本鎖ｔＰＡをＷａｌｌｅｎ　ｅｔ　ａｌ　（７）記載
に従いプラスミン−セファロースで処理し、　Ｓ−２２
８８を用いｔＰＡのアミド水解活性を調べた。　Ｌｉｎ
ｅ％ｔｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットにより求めたＫｍ
値は一本鎖ｔＰＡ１．８ｍＭであった。又、ｔＰＡのア
ミド水解活性は１０４ｔＭのジイソプロビルフルオロフ
ァスフェートにより完全に抑制された。

ｔＰＡとｕＰＡの顕著な差異は、ｔＰＡの方がフィブリ
ンに対し高い親和性を示す点である。既に述べたように
フィブリン−セファロースに対する精製ｔＰＡの親和性
を調べたところ、ｔＰＡは完全にカラムに吸着し、　２
．５　Ｍチオシアンカリウムで溶出された。

Ｔａｂｌｅ　ＩＩには精ｉｔ　ＰＡのアミノ酸組成を示
した。それはＷａｌｌｅｒ＋　ｅｔ　ａｌにより豚心臓
から得たｔＰＡのアミノ醜分析値と良く一致した。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 組織性プラスミノーゲン活性化因子を含有する組成物を
   ヘパリン−セファロースアフィニティークロマトグラフ
   で処理することを特徴とする高純度組織性プラスミノー
   ゲン活性化因子の製法。