SU973129A1 - Способ получени претромбина 1 - Google Patents
Способ получени претромбина 1 Download PDFInfo
- Publication number
- SU973129A1 SU973129A1 SU813307071A SU3307071A SU973129A1 SU 973129 A1 SU973129 A1 SU 973129A1 SU 813307071 A SU813307071 A SU 813307071A SU 3307071 A SU3307071 A SU 3307071A SU 973129 A1 SU973129 A1 SU 973129A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- thrombin
- tris
- pretrombin
- concentration
- hydrolyzate
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
(S) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕТРОМБИНА 1
Изобретение относитс к медицине и быть применено дл диагностики состо ни противосвертывапщей системы , а таюхе дл активации ее функции с целью профилактики заболеваний сердечно-сосудистой и других систем, осло хненных тромботйческими влени ми .
Известен способ получени претромбина 1 путем осаждени протромбиноврго комплекса из крови, гидролиза его тромбином с последующей хроматографической очисткой гидролизатаЩ
Однако известный способ обеспечивает низкий выход целевого продукта 20-25%j и, кроме того, способ длителен и трудоемок ( требует 29-33 ч и не позвол ет получить высокоочищенный продукт.
Цель изобретени - увеличение выхода и чистоты целевого продукта.
Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени претромбина 1 путем осаждени протромбинового комплекса из плазмы крови, гидролиза его тромбином,, с последующей хроматографической очисткой гидролизата , гидролиз протромбинового комплекса осуществл ют в среде, содержащей этилендиаминтетраацетат натри и трис-буфер, хроматографическую очист10 ку гидролизата осуществл ют на сорбенте гепарин-сёфароза и элюируют целевой продукт в линейном градиенте хлорида натри с концентрацией 0,05-1,5 М в трис-ацетатном буфере при рН 6,06 ,2 и концентрации хлорида кальци 2,-2,6 ммоль.
Пример 1. Протромбиновый комплекс получают осаждением его из
20 плазгш быка на цитрате бари , последующей элюцией, фракционированием сульфатом аммони и изозлектрическим осаждением. 3 . 9 Берут 20 мг протромбинового конплекса ( 2000 NIH ед. на 1 мг белка) и инкубируют с 30IV/ 1Н ед. тромбина (2000N1H ед. на 1 мг белка; в 0,05 М Трис-НС буфере, рН 7,, содержащем 1 ммоль ЭДТЛ-натриевой соли 15 мин при (соотношение фермента и субстрата по единицам активности 1:1300/. Реакционную смесь диализуют против 0,02 М трис-ацетатного буфера рН 6,0, содержащего 0,05 М NaCI 15 ч Затем в диализат добавл ют 0, М раст вор r.aCI до конечной концентрации 2,5 ммоль и нанос т в объеме 6 мл на колонку с гепарингсефарозой. (1х40 см) уравновешенную 0,02 ммоль трис-ацетат ным буфером, рН 6,0, содержащим 0,05 М NlaCI и 2,5 ммоль CaCI. Пер|вую элюцию провод т тем же буфером в объеме 60 мл. Затем провод т градиентную элюцию, использу дл создани линейного градиента ионной силы следующие растворы: 100 мл 0,02 М трис-ацетатного бубера, рН 6,0, содер жащего 0,05 М МаС1 и 2,5 мН СаС1 и 100 мл того же бусйера, содержащего 1,5 М NaCI. В ;элюируемых фракци х анализируют содержание белка и свертывающую активность. Со свободным объе/юм колонки выход т несв завшиес белки ( 20 ), среди которых обнаруживают фрагмент 1 протромбина с молекул рной .массой 25000, отщепл емый от молекулы протромбина тромбином в процессе гидролиза. Градиентной элюцией получают три белковых компонента . Первый компонент, содержащий 70 нанесенного белка, элюируетс 0,45 М SlaCI. Молекул рна масса компонента определена равной бОООО. Компонент идентифицирован как претромбин 1. При концентрации NaCI О,.64 М элюируют второй компонент, содержащий 5 нанесенного белка с молекул рной массой 50000, не про вл ющий характерных ...-- ,. 1 . .. .. свойств претромбина 1 и тромбина и идентифицированный как фактор X. При увеличении концентрации NaCI до 0,9 М элюируетс третий компонент, содержа;ИЙ следовые количества тромбина 0,1 W1H ед. на 1 мл элюата/. Из 20 мг тромбинового гидролизата протромбина получают 14 мг претромбина 1, гомогенного при электрофореза б геле полиакриламида, с молекул ной массой 60000, не обладающего фибриноген-свертывающей , эстеразной, фиб ринолитической и протромбиновой ак294 тивност ми. Претромбин 1 медленно (в течение часа генерирует тромбин . -. ( ед/мг в присутствии фактора j/2 ед/мгЛ Полученные препарыты претромбина 1 про вл ют высокую физиологическую активность, возбужда функциюпротивосвертывающей системы при внутривенном введении крысам в концентрации 0,5 мг/кг веса тела. В табл. 1 показано изменение биохиммческих .показателей состо ни противосвертывающей системы после внутривенного введени претромбина 1 (0,5 мг/кг веса; . Таким образом, претромбин 1, введенный внутривенно крысам в концентрации 0,5..мг/кг веса, уже на 1-ой мин опыта вызывает статистически достоверное увеличение суммарной фибринолитической активности ( СФЛ) на Зб% и неферментативного фибринолиза ( НФJ, отражающего уровень комплексных соединений гепарина с белками крови и биогенными аминами, на 41. Выброс гепарина в кровоток вл етс важнейй|им этапом эффекторной реакции противосвертывающей системы. Таким образом претромбин 1, при внутривенном введении kpыcaм в низкой дозе 0,5 мг/кг веса активирует функцию противосвертывающей системы, что говорит о хорошем качестве препарата. Пример 2. Протромбиновый комплекс получают как в примере 1. Затем берут Г протромбинового комплекса С ПООО N1H ед. .на 1 мг белка) и инкубируют с 30 N1H ед. (2000 N1H ед. на 1 Мг белка) тромбина в 0,05 М трисYICI буфере, рН 7,4, содержащем , 1 даль ЭДТА-натриевой соли, 20 мин при 37°С, Соотношение фермента и субстрата по единицам активности 1:2000. Последующие операции провод т как в примере 1. Получают 21 мг претромби гомогенного при электрофорезе в геле полиакриламида, с молекул рной массой 63000, не обладающего йибриноген-свертывающей , эстеразной (по ТАМЭ и БАМЭ), фибринолитической и протромбинопой активностью. Претромбин 1 генерирует тромбин ( ед„/мг; в течение часа в присутствии фактора XQJ (2 ед./мг. Препарат претромбина 1 про вл ет высокую физиологическую активность при анализе методом перфузии гуморально изолированного, но с сохраненными нервными св з ми с организмом каротидного синуса кролика. В табл. 2 показано изменение биохимичес59
ких показателей состо ни противосвертывающей системы после перфузии каротндного син«са кролика претромбином 1 (0,07мг/мл в объеме 20 мл).
Таким образом/при перфузии пре .тромбином 1, полученным-в примере 2. изолированного каротидного синуса , . кролика происходит активаци противосвертываощей системы, характеризующа с статистически достоверным увелишением к мин опыта времени рекальцификации плазмы на 31% суммарной фибринолитической активности на 36%, неферментативного фибринолиза - на . Высокий антикоагул нтны фон, создаваемый комплексйыми соединени ми гепарина, сохран етс на 10-ой мин опыта.
Изложенные данные свидетельствуют о том, что претромбин 1, взаимодей136 ,2±10,7 (6)
MiM/yi/
со,01
Р 3k,6±},2 (6) М±п/и/
0,02
Р
296
ству с хеморецепторами только одной из рецепторных зон противосвертывающей системы, в очень малых концентраци х (О,07 мг/мл) вызывает рефлекторный ответ этой системы, создающий высокий антикоагул нтный и фибринолиТический фон и предотвращающий угрозу тромбообразовани при провокации тромбиногенеза.
Предлагаемый спосоо позвол ет по ,лучить целевой продукт за 10-12 ч против ч известным способом. Выход претромбина составл ет 65-75% по сравнению-с известным 20-251. Претромбин 1, полученный предлагаемым способом, свободен от примеси диизопропилфторфосфат-тромбина , который обладает физиологической активно cтью .
Таблица 1
Таблица 2
131,2t5,8 (6) 0,001
132,01: 9,0 (6) 0,01
раствором Рингера-Локка.
Claims (1)
- Формула изобретениСпособ получени претромбина 1 путем осаждёНй протромбинового комплек са из Илйэмы крови, гидролиза его тромбином с последующей хроматографической очисткой гидролизата, о т ii и ч а ю с тем, что, с целью увеличени выхода и чистоты целевого продукта, гидролиз протромбинового комплекса осуществл ют в среде содержащей этилендиаминтетраацетат натри и трис-б1а0ер, хроматогра8Продолжение табл. 2фическую очистку гидролизата осуществл ют на сорбенте гепарин-сёфароза И элйируют целевой продукт а линейном градиенте хлорида натри с концентрацией 0,05-1,5 М в трис-ацетатном буфере при рН 6,0-6,2 и концентрации хлорида кальци 2,4-2,6 ммоль.Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе1, Heldebrant С.Н., Butkowsk R.I. Bajaj S.P., Mann K.G. The activation of prothrombln. - I. Biol. Chem., 1973, V. 2W, p. 71A9-7163.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU813307071A SU973129A1 (ru) | 1981-03-27 | 1981-03-27 | Способ получени претромбина 1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU813307071A SU973129A1 (ru) | 1981-03-27 | 1981-03-27 | Способ получени претромбина 1 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU973129A1 true SU973129A1 (ru) | 1982-11-15 |
Family
ID=20965291
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU813307071A SU973129A1 (ru) | 1981-03-27 | 1981-03-27 | Способ получени претромбина 1 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU973129A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0256522A2 (de) * | 1986-08-16 | 1988-02-24 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung einer prothrombin-armen Präparation Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren, sowie ein danach erhältliches Mittel |
-
1981
- 1981-03-27 SU SU813307071A patent/SU973129A1/ru active
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0256522A2 (de) * | 1986-08-16 | 1988-02-24 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung einer prothrombin-armen Präparation Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren, sowie ein danach erhältliches Mittel |
EP0256522A3 (de) * | 1986-08-16 | 1989-02-01 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung einer prothrombin-armen Präparation Vitamin K-abhängiger Gerinnungsfaktoren, sowie ein danach erhältliches Mittel |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US3920625A (en) | Isolation of coagulation factors from biological material using cross linked sulfated, sulfonated carbohydrates | |
CN102812039B (zh) | 缀合蛋白质 | |
US6005082A (en) | Process for purification of factor VIII | |
US4022758A (en) | Isolation of coagulation factors I and VIII from biological material | |
US5872099A (en) | High molecular and low molecular fractions of von Willebrand Factor | |
US5831026A (en) | Process for purifying factor VIII | |
US3943245A (en) | Purification of plasminogen | |
JPS59137417A (ja) | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 | |
US4348315A (en) | Process in purification and concentration of the factor VIII-complex | |
US6063909A (en) | Preparation of factor IX | |
JPH1059866A (ja) | 血液凝固第vii因子及び/もしくは活性化血液凝固第vii因子の製造方法 | |
US4623718A (en) | Novel composition of matter of antithrombin III bound to a heparin fragment | |
SU973129A1 (ru) | Способ получени претромбина 1 | |
KR20100028042A (ko) | 폰 빌리브란트 인자 프로펩티드로부터 성숙한 폰 빌리브란트 인자를 제조하는 방법 | |
JPS63108000A (ja) | 第8因子の精製方法 | |
JP2778086B2 (ja) | 第x▲iii▼因子のアフイニテイクロマトグラフイーによる精製法 | |
EP0229026A2 (en) | Therapeutic blood product, means and methods of preparing same | |
GB2051103A (en) | Heparin fractions | |
JP2739232B2 (ja) | 生物学的親和性を有するセルロースゲルの使用方法 | |
EP0151996A2 (en) | Process for the Preparation of a double-chain plasminogen activator | |
DiScipio et al. | The fractionation of human plasma proteins: II. The purification of human complement proteins C3, C3u, and C5 by application of affinity chromatography | |
JPH1059867A (ja) | 血液凝固第vii因子の活性化方法及び該方法に基づく活性化血液凝固第vii因子の製造方法 | |
US4308204A (en) | Process for preparing the third component of the complement from human blood plasma | |
JP3195439B2 (ja) | 第xiii因子の精製方法 | |
JPH07291999A (ja) | 血小板安定化因子ix−フラグメント、その製造方法及びこれを含有する薬剤 |